UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

DIN CRAIOVA

TEZA DE DOCTORAT
REZUMAT

STUDIUL HISTOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC

AL CARCINOAMELOR UROTELIALE DE
VEZICĂ URINARĂ

Doctorand: STEPAN ALEX EMILIAN

Conducător Ştiinţific:
PROF. UNIV. DR. SIMIONESCU CRISTIANA EUGENIA

CRAIOVA 2011
 CUPRINS

INTRODUCERE

PARTEA GENERALĂ (STADIUL CUNOAŞTERII)

CAPITOLUL I
CONSIDERAŢII EPIDEMIOLOGICE ŞI FACTORI DE RISC ÎN
CARCINOAMELE UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 6
I.A. Epidemiologia carcinoamelor uroteliale de vezică urinară 6
I.B. Factori de risc în carcinoamele uroteliale de vezică urinară 7
CAPITOLUL II
DATE PRIVIND MECANISMUL CARCINOGENEZEI UROTELIALE 10
CAPITOLUL III
FACTORI PROGNOSTICI ŞI SISTEME DE CLASIFICARE ALE
CARCINOAMELOR UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 26
III.A. Factori prognostici în carcinoamele uroteliale de vezică urinară 26
III.B. Sisteme de clasificare ale carcinoamelor uroteliale de vezică urinară 36
OBIECTIVELE STUDIULUI 39

PARTEA SPECIALĂ (CONTRIBUŢII PROPRII)

CAPITOLUL IV
MATERIAL ŞI METODE 40
IV.A. Materialul studiat 40
IV.B. Metode utilizate 40
CAPITOLUL V
REZULTATE 48
V.A. ANALIZA CARACTERELOR CLINICO-MORFOLOGICE ALE
CARCINOAMELOR UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 48

V.B. ANALIZA HISTOPATOLOGICĂ A CARCINOAMELOR UROTELIALE

DE VEZICĂ URINARĂ 51
V.C. ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A CARCINOAMELOR
UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 78
V.C.1. Markeri de diferenţiere epitelială tumorală 78
V.C.2. Markeri care se adresează creşterii şi proliferării celulare 83
V.C.3. Imunoexpresia unor proteine implicate în ciclul celular 87
V.C.4. Markeri specifici apoptozei tumorale 92
V.C.5. Markeri care se adresează adezivităţii celulare tumorale 93
V.C.6. Markeri care se adresează relaţiei tumoră-stromă peritumorală 97
V.C.7. Markeri care se adresează angiogenezei şi cuantificare morfometrică 99
V.C.8. Markeri care se adresează limfangiogenezei tumorale şi cuantificare
morfometrică 105
CAPITOLUL VI
DISCUŢII 111
VI.A. ANALIZA CARACTERELOR CLINICO-MORFOLOGICE ALE
CARCINOAMELOR UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 111
VI.B. ANALIZA HISTOPATOLOGICĂ A CARCINOAMELOR UROTELIALE
DE VEZICĂ URINARĂ 114
VI.C. ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A CARCINOAMELOR
UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ 128
CAPITOLUL VII
CONCLUZII 143
BIBLIOGRAFIE 146
 INTRODUCERE

Dintre tumorile maligne localizate la nivelul vezicii urinare, peste 90% sunt carcinoame
uroteliale, leziuni care se află pe locul patru între cancerele care apar la sexul masculin. Cu toate
că în peste 50% dintre cazuri leziunile sunt diagnosticate biopsic în stadii iniţiale, prognosticul
este uneori dificil de apreciat datorită heterogenităţii, multifocalităţii şi recurenţei tumorale.
Numeroase studii din literatura de specialitate au încercat să stabilească biomarkeri specifici
şi sensibili pentru evidenţierea mecanismelor biomoleculare care se desfăşoară în cadrul
carcinogenezei uroteliale. Evidenţierea relaţiilor existente între aceste mecanisme şi între căile
alternative de iniţiere şi progresie tumorală constituie încă obiective de mare importanţă ale
programelor de cercetare. De asemenea, dificultăţile de implementare practică a unor rezultate
diseminate rezidă din neomogenitatea loturilor analizate, precum şi din diferenţele
interobservatorii ale criteriilor aplicate în diverse studii. Cu toate acestea, studiile privind
imunoexpresia proteinelor cu valoare prognostică pentru carcinoamele uroteliale de vezică
urinară ridică permanent numărul de anticorpi care pot fi utili.
Studiul realizat a avut ca obiective extinderea cunoştinţelor legate de factorii histopatologici
şi imunohistochimici care intervin în carcinogeneza urotelială precum şi identificarea celor mai
specifici markeri implicaţi în invazia şi agresivitatea tumorală. De asemenea, analiza statistică a
rezultatelor obţinute a avut ca obiectiv stabilirea unul panel de anticorpi cu valoare prognostică
pentru aceste leziuni.
 DATE PRIVIND MECANISMUL CARCINOGENEZEI TUMORILOR UROTELIALE

Carcinoamele uroteliale reprezintă leziuni heterogene care se pot dezvolta pe căi

patogenice distincte [180]
Calea patogenică duală reprezintă un concept propus pentru carcinogeneza urotelială,
care se bazează pe analiza histopatologică şi biomoleculară a leziunilor. Aceasta postulează că în
cazul vezicii urinare cancerele se pot dezvolta pe două căi patogenice diferite având ca rezultat
tumori papilare sau non-papilare (plate) [91].

DOVEZI HISTOPATOLOGICE ALE CARCINOGENEZEI UROTELIALE DUALE

Majoritatea leziunilor la momentul diagnosticului sunt tumori superficiale, exofitice,
papilare, bine diferenţiate şi care nu trec de membrana bazală. Aceste tumori se află în stadiul Ta.
Analiza lor histopatologică au sugerat că apar de la nivelul uroteliului normal, trecând printr-un
stadiu intermediar reprezentat de hiperplazie asociată cu apariţia unor bogate ramificaţii
vasculare. De asemenea, aceste tumori nu sunt de obicei asociate cu leziuni de grad înalt, precum
carcinomul in situ, care este considerată o leziune de risc crescut [44]. Aceste tumori reapar
frecvent, sunt adesea multifocale, dar progresia spre stadii avansate are loc în puţine cazuri, iar
atunci când se realizează tumora este recidivantă şi trece printr-o etapă în care are un aspect
papilar.
Carcinoamele invazive sunt de obicei diagnosticate la pacienţi fără istoric de tumori
papilare. Aceste tumori pot invada tunica musculară a vezicii, întreg peretele sau structurile
adiacente. De obicei sunt slab diferenţiate şi se asociază cu CIS la nivelul ariilor peritumorale,
care în aceste cazuri este considerată leziune precursoare. Tumorile care au invadat doar lamina
propria (T1) sunt considerate „ superficiale”, însă de multe ori acestea sunt slab diferenţiate şi pot
avea mai multe alterări genetice decât tumorile care pătrund la nivelul muscularei propria [91;
100].

5
 DOVEZI GENETICE ŞI BIOMOLECULARE ALE CARCINOGENEZEI
UROTELIALE DUALE

Evenimentele moleculare şi genetice care au loc în apariţia şi evoluţia carcinoamelor

uroteliale de vezică urinară pot fi împărţite în trei mari categorii, fiecare dintre ele fiind
interconectată cu celelalte:
- alterări cromozomiale ( iniţiază procesul canceros),
- proliferarea tumorală datorată dereglării ciclului celular şi
- progresia şi metastazarea (care implică alte mecanisme complexe precum
angiogeneza, limfangiogeneza, apotoza, pierderea fenotipului celular, alterarea
matrixului extracelular) [180]

IMPORTANŢA CUNOAŞTERII CARCINOGENEZEI UROTELIALE

Carcinoamele uroteliale sunt heterogene din punct de vedere morfologic şi genetic cu
numeroase linii celulare maligne care prezintă alterări specifice fiecăreia. Este posibil astfel
dezvoltarea de la nivelul unei celule de tumori maligne distincte cu caracteristici diferite faţă de
tumora iniţială.
Prezenţa cu o frecvenţă covârşitoare a anumitor alerări genice şi biomoleculare în cazul
tumorilor aflate în stadiul non-invaziv faţă de cele invazive, demonstrază existenţa unor căi
patogenice diferite în apariţia şi dezvoltarea leziunilor.
Informaţiile acumulate despre modificările biomoleculare asociate cu carcinoamele
uroteliale papilare sau plan invazive de vezică urinară, permit o clasificare moleculară mai clară
şi mai practică. Aceste cunoştinţe pot furniza date despre prognosticul şi tratamentul pacienţilor.
Carcinomul urotelial este o tumoră în care investigarea moleculară poate deveni parte a
practicii clinice uzuale.

6
 MOTIVAŢIA ŞI SCOPUL STUDIULUI

Studiul propune o evaluare completă şi amanunţită a procesului de carcinogeneză urotelială

de la nivelul vezicii urinare, cu ajutorul unor metode clasice de investigare, precum şi a unor
tehnici moderne precum imunohistochimia şi morfometria.
Identificarea mecanismelor complexe care se desfăşoară la nivel molecular şi a
interacţiunilor dintre ele furnizează informaţii valoroase în ceea ce priveşte apariţia, dezvoltarea
tumorală şi prognosticul pacienţilor.
În acest studiu sunt evaluaţi markerii implicaţi în diferite etape ale carcinogenezei şi
urmareşte identificarea unor posibile ţinte prognostice şi terapeutice. Cercetarea în această
direcţie este de mare actualitate şi obţinerea rezultatelor propuse poate contribui la creşterea
calităţii vieţii şi a speranţei de viaţă a pacienţilor.
Principalele obiective specifice ale studiului includ:
ƒ Extinderea cunoştinţelor legate de factorii clinici, histopatologici, imunohistochimici
şi morfometrici care intervin în carcinogeneza urotelială, în scopul aprofundării mecanismelor
acesteia;
ƒ Identificarea şi definirea a parametrilor morfologici ce caracterizează carcinoamele
uroteliale, în scopul aplicării unei terapii precoce şi diferenţiate;
ƒ Completarea parametrilor morfologici de evaluare a diagnosticului carcinoamelor
uroteliale prin posibilele ţinte moleculare identificate;
ƒ Identificarea mecanismelor şi a markerilor implicaţi în invazia şi agresivitatea
carcinoamelor uroteliale;
ƒ Identificarea celor mai specifici markeri ai prognosticului carcinoamelor invazive.

7
 MATERIAL ŞI METODE

A. MATERIALUL STUDIAT
Lotul studiat a inclus un număr de 376 carcinoame uroteliale diagnosticate în intervalul
2005-2009, în cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică al Spitalulului Clinic Judeţean de
Urgenţă Craiova. Materialul biologic uman a fost reprezentat de piese de cistectomie,
cistoprostatectomie sau de fragmente biopsice de rezecţie vezicală transureuretrală obţinute din
Clinica de Urologie a aceluiaşi spital

B. METODE UTILIZATE
După exereza tumorilor, materialul biologic a fost investigat pentru identificarea
principalilor parametri morfologici macroscopici: aspect, număr, dimensiuni, culoare,
consistenţă, cu precizarea prezenţei de modificări adiacente mucoasei tumorale, precum şi
implicarea structurilor învecinate vezicii urinare şi a ganglionilor limfatici loco-regionali..
Piesele au fost prelucrate prin metoda clasică de includere la parafină şi colorare cu
Hemalaum-Eozină, realizându-se de asemenea coloraţii speciale, precum impregnarea argentică
pentru reticulină şi coloraţia Acid Periodic Schiff, care au permis o bună încadrare a leziunilor în
funcţie de aspectul histopatologic şi evidenţierea unor trăsături caracteristice ale acestora.
Analiza histopatologică s-a realizat pe un lot de 260 de carcinoame uroteliale confirmate
microscopic şi a inclus următoarele criterii de apreciere: tipul arhitectural, gradul tumoral, tipul
histologic, invazia şi stadializarea tumorală, precum şi leziunile asociate carcinoamelor.
Analiza imunohistochimică s-a realizat pe un lot de 55 de cazuri selectate de carcinoame
primitive uroteliale papilare. Criteriile de excludere utilizate în studiul imunohistochimic au fost
reprezentate de existen a diferenţierilor scuamoase sau de orice altă natură a carcinoamelor
uroteliale, prezenţa necrozei şi a ulceraţiilor extensive la nivel tumoral şi de materialul biologic
provenit de la necropsii.
Au fost utilizate două metode pentru reacţiile imunohistochimice simple în funcţie de
cerinţele tehnice: amplificarea polimerică EnVision şi metoda complexelor streptavidină-biotină
(LSAB-HRP), developarea reacţiilor realizându-se cu DAB.

8
 În acest studiu am utilizat un panel de anticorpi redat în tabelul IV.2:
Anticorpul Clona Diluţia Demascarea Control
antigenică pozitiv
CK7 OV-TL 12/30 1:50 Citrat, pH 6 uroteliu
CK20 Ks 20.8 1:100 EDTA, pH 9 colon
34βE12 34βE12 1:50 Citrat, pH 6 amigdala
P63 4A4 1:30 Citrat, pH 6 colon
Ki67 MIB 1 1:100 EDTA, pH 9 amigdala
PCNA PC-10 1:100 Citrat, pH 6 amigdala
C-erbB-2 policlonal 1:250 Citrat, pH 6 carcinom
mamar
p16 DC-468 1:100 Citrat, pH 6 HSIL cervicala
pRB 1F8 1:75 Citrat, pH 6 adenocarcinom
colon
P53 DO-7 1:50 EDTA, pH 9 amigdala
Bcl-2 124 1:75 Citrat, pH 6 amigdala
Ecadherina NCH 38 1:50 EDTA, pH 9 glanada
mamara
CD44 DF 1485 1:80 Citrat, pH 6 splina
MMP9 2C3 1:50 Citrat, pH 6 plamân
VEGF VG1 1:100 EDTA, pH 8 rinichi
CD31 JC70A 1:50 EDTA, pH 9 vase sangvine
CD105 SN6h 1:50 Proteinaza K vase sangvine
D2-40 D2-40 1:100 Citrat, pH 6 vase limfatice
Tabel IV.2. Panelul de anticorpi utilizaţi

Pentru tehnica imunohistochimică dublă, sistemul de vizualizare EnVisionTM G/2

Doublestain System, Rabbit/Mouse DAB+/ BCIP/NBT şi contracolorare cu roşu nuclear. Pentru
cazurile în care ţinta antigenică a prezentat colocalizare tisulară s-au utilizat tehnica secvenţială
de imufluorescenţă dublă (CD105/Ki67), utilă pentru aprecierea indexului de proliferare
vasculară.
Analiza morfometrică am utilizat-o pentru cuantificarea potenţialului angiogenic (CD31,
CD105) şi limfangiogenic (D2-40) al tumorilor, utilizând metoda de cuantificare „hot spot”.
Analiza statistică a utilizat coeficienţi de corelaţie (Pearson) şi teste de comparaţie a
mediilor (testul t Student, ANOVA). Pentru aprecierea dependenţei dintre doi factori de
clasificare, au fost realizate tabele de incidenţă, care au fost interpretate cu ajutorul testului Chi
pătrat.

9
 REZULTATE

V.A. ANALIZA CLINICO-MORFOLOGICA A CARCINOAMELOR UROTELIALE

DE VEZICĂ URINARĂ

Carcinoamele uroteliale analizate au reprezentat 91,8% dintre tumorile cu localizare la

nivelul vezicii urinare (tabel V.A.1).
Majoritatea cazurilor au fost diagnosticate în decada a VI-a şi a VII-a de viaţă, vârsta medie
de diagnostic fiind de 66,1 ani (tabel V.A.3).

Vârsta 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 >70

Nr.cazuri 2 12 59 128 143 32

% 0,5 3,2 15,8 34 38 8,5

Tabel V.A.3. Repartiţia cazuisticii pe grupe de vârstă

Repartiţia cazurilor pe sexe a arătat o predominenţă netă în favoarea celui masculin,
raportul bărbaţi/femei fiind de 6,8/1 (tabel V.A.4.).

Sex M F

Nr.cazuri 328 48

% 87,2 12,8

Tabel V.A.4. Repartiţia cazuisticii pe sexe

La examinarea macroscopică a tumorilor, acestea au prezentat cel mai frecvent un aspect
exofitic, descris ca fiind conopidiform, vegetant sau polipos (fig.V.A.1). Alte tumori au avut un
aspect endofitic, cu creştere în profunzime, infiltrativ.

10
 Fig.V.A.1. Aspecte macroscopice ale carcinomului ureotelial de vezică urinară

V.B. ANALIZA HISTOPATOLOGICĂ A

CARCINOAMELOR UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ

Tipul arhitectural. Din punct de vedere al patternului general de creştere tumorală,

leziunile au fost papilare (86,1%) sau nonpapilare (13,9%) (fig.V.B.1-2).

A B

Fig. V.B.1-2 A.Carcinom urotelial papilar, x40;

B. Carcinom urotelial nonpapilar, x100; col. HE

Gradul histologic. Aspectul leziunilor în funcţie de gradul de diferenţiere tumorală a

permis încadrarea acestora în trei categorii (tabel.V.B.2, fig. V.B.3-6):

Grad de diferenţiere BD MD SD

Nr.cazuri 75 138 47

% 28,8 53 18,2

Tabel V.B.2. Distribuţia cazurilor în funcţie de gradul de diferenţiere

11
A B C

Fig. V.B.3-6. A. Carcinom urotelial , col HE, x100.

A. Bine diferenţiat; B. Moderat diferenţiat; C. Slab diferenţiat

Tipul histologic. În cadrul acestui criteriu de apreciere am analizat tipurile de diferenţiere

histologică al carcinoamelor uroteliale, cel mai frecvent întâlnite fiind ariile scuamoase (43,5%),
cu celule clare (13,9%) şi cele cu diferenţiere glandulară (4,3%) (fig.V.B.6-9 ):

Fig.V.B.6-9. A.Carcinom urotelial cu diferenţiere scuamoasă, col.HE, x100;

B. Carcinom urotelial cu celuler clare, col.PAS, x200;
C. Carcinom urotelial cu diferenţieri glandulare, col.HE, x100

Distribuţia cazurilor în funcţie de profunzimea invaziei în cazul carcinoamelor uroteliale

studiate este redată în tabelul V.B.4:

Profunzimea invaziei T1 T2 T3 T4

Nr.cazuri 128 95 34 3

% 49,3 36,6 13,1 1

Tabel V.B.4. Distribuţia cazurilor în funcţie de profunzimea invaziei

12
 Tumorile aflate în categoria T1-T2 au fost în 54,7% moderat diferenţiate, în timp ce
tumorile aflate în categoriile T3-T4 au fost slab diferenţiate în 62,1% din cazuri (fig.V.B.18-23).

A B

C D

Fig.V.B.18-23. Carcinom urotelial, col.HE, x100. A. Invazie în lamina propria (BD);

B. Invazie în musculara propria (MD); C. Invazia întregului perete (SD);
D. Invazia prostatei (SD)

Patternul de invazie. Cele 250 de cazuri analizate au fost încadrate în funcţie de paternul
invaziv într-una din următoarele categorii (tabel V.B.5)

Pattern de invazie Nodular Trabecular Infiltrativ Mixt

Nr.cazuri 69 73 73 45

% 26,5 28,1 28,1 17,3

Tabel V.B.5. Distribuţia cazurilor în funcţie de patternul de invazie

În cadrul lotului studiat, invazia vasculară a fost prezentă în 43 de cazuri, ceea ce a
reprezentat 16,5%. De asemenea, invazia perineurală a fost evidenţiată în 11 cazuri, 7 dintre
acestea fiind moderat diferenţiate (fig.V.B.29-30).

13
 A B
Fig.V.B.29-30. A. Carcinom urotelial, col.HE.
A. Invazie vasculară, x100; B. Invazie perineurală, x40

Analiza statistică (chi pătrat) a indicat o asociere înalt semnificativă a arhitecturii papilare
cu tumorile diferenţiate (p<0,001), a carcinoamelor moderat şi slab diferenţiate cu prezenţa
diferenţierilor histologice (p<0,001), precum şi a gradului de diferenţiere cu profunzimea invaziei
(p<0,001) şi a invaziei vasculare şi perineurale cu gradul înalt (p<0,05).
Modificările histopatologice aditionale tumorilor au fost reprezentate carcinomul in situ
(7 cazuri), carcinomul noninvaziv papilar de grad scăzut (3 cazuri) sau înalt (3 cazuri).
Metastazele ganglionare au fost evidenţiate în 11 cazuri, toţi ganglionii afectaţi avînd
dimensiuni sub 5cm.
Nu am întâlnit metastaze la distanţă pe lotul de 260 carcinoame uroteliale analizate.
Pe baza categoriilor T, N şi M, gruparea stadială a cazurilor a dus la următoarele rezultate
(tabel V.8.9):

Stadiul tumoral I II III IV

Nr.cazuri 128 95 26 11

% 49,3 36,6 10 4,1

Tabel V.B.8. Distribuţia cazurilor în funcţie de stadiul tumoral

14
 V.C. ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A
CARCINOAMELOR UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ

Studiul imunohistochimic a inclus 55 de cazuri de carcinom urotelial primitiv papilar fără

diferenţieri histologice (pur), fiind utilizaţi markeri care s-au adresat diferenţierii epiteliale
tumorale, creşterii şi proliferării celulare, afectării ciclului celular, apoptozei, adezivităţii
intercelulare, relaţiei tumoră-stromă peritumorală precum şi angiogenezei şi limfangiogenezei.

V.C.1. MARKERI DE DIFERENŢIERE EPITELIALĂ TUMORALĂ

Analiza diferenţierii epiteliale la nivel tumoral s-a realizat prin utilizarea CK7, CK20,
34βE12 şi p63.
• Marcajul CK 7 a fost identificat la nivel citoplasmatic în toate cazurile analizate, fără
corelaţie semnificativă cu gradul sau stadiul tumoral;
• Imunoreacţia pentru CK20 a fost identificată în toate cazurile studiate la nivel
citoplasmatic existând corelaţie statistică cu gradul tumoral (p<0,01), marcajele de peste 50%
fiind caracteristice unor carcinoame moderat şi slab diferenţiate;
• Imunoexpresia 34βE12 a fost prezentă la nivel citoplasmatic în 76,3% dintre tumorile
analizate, analiza statistică (chi pătrat) indicând corelaţii semnificative ale expresiei 34βE12 cu
gradul şi stadiul tumoral (p<0,01), numărul de celule marcate fiind superior în cazul leziunilor
moderat/slab diferenţiate cu invazie profundă.
• Imunoreacţia p63 a fost prezentă nuclear în 56,3% din cazurile analizate. Reacţia a fost
prezentă doar în cazurile unor carcinoame bine/moderat diferenţiate aflate în T1-T2a (p<0,01)
(fig.V.C.1-4).

15
 A B

C D

Fig. V.C.1-4. A. Carcinom urotelial bine diferenţiat invaziv în lamina propria, marcaj CK7,
x100; B. Carcinom urotelial moderat diferenţiat, invaziv în lamina propria, scor 3, marcaj
CK20, x100; C. Carcinom urotelial slab diferenţiat invaziv în întreg peretele vezical, scor
3, marcaj 34βE12, x200; D. Carcinom urotelial bine diferenţiat, invaziv în lamina propria,
marcaj p63, scor 3, x100

V.C.2. MARKERI CARE SE ADRESEAZĂ CREŞTERII ŞI

PROLIFERĂRII CELULARE

Creşterea şi proliferarea celulară tumorală a fost analizată cu ajutorul Ki67, PCNA şi c-

erbB2.
• Imunomarcajul Ki67 a fost prezent la nivel nuclear în 58,1% din cazurile analizate,
indexului de proliferare variind între 5% şi 62%, valorile mari fiind înregistrate în cazul
carcinoamelor moderat sau slab diferenţiate (p<0,001) aflate în categoria T3-T4 a stadiului
tumoral (p<0,001);
• Imunomarcajul PCNA a fost prezent la nivel nuclear în 80% dintre leziunile studiate, în
cazul tumorilor slab diferenţiate fiind marcate peste 50% (p<0,01);
• Marcajul imunohistochimic al c-erbB2 a fost identificat la nivel membranar în 61,8% din
leziunile analizate, în majoritatea carcinoamelor moderat/slab diferenţiate scorul fiind 3+,
existând o corelaţie semnificativă cu gradul de diferenţiere tumorală (p<0,001) şi cu expresia
factorilor de proliferare analizaţi (p<0,05) (fig.V.C.7-10).

16
A B C

Fig.V.C.7-10. A. Carcinom urotelial moderat diferenţiat, marcaj Ki67, IP:54% (scor 3),
x200; B. Carcinom urotelial slab diferenţiat, scor 2, marcaj PCNA, x200; C. Carcinom
urotelial slab diferenţiat, marcaj c-erbB2, scor 3+, x200

V.C.3. IMUNOEXPRESIA UNOR PROTEINE IMPLICATE ÎN CICLUL CELULAR

Alterarea ciclului celular a fost analizată prin utilizarea de anticorpi specifici principapelor
proteine implicate, precum p16, pRB, p53.
• Imunomarcajul p16 a fost observat la nivel citoplasmatic (în carcinoamele T1-T2 bine sau
moderat diferenţiate) şi/sau nuclear (în carcinoamele T2 moderat sau slab diferenţiate ) în 76,3%
din totalul leziunilor analizate), existând o corelaţie statistică semnificativă între imunoexpresia
p16 şi categoriile T1/T2-T3/T4 ale stadiului tumoral (p<0,001).
• Imunoreacţia pRb a fost identificată la nivel nuclear în 67,2% din cazuri, existând o
corelaţie înalt semnificativă între categoriile T2-T3 ale stadiului tumoral şi imunoexpresia pRb
negativă (p<0,01) sau crescută (scor 3, p<0,01).
• Imunoexpresia p53 a fost prezent la nivel nuclear în 47,2% din leziunile studiate,
marcajele de peste 50% fiind prezente în cazul carcinoamelor T2-T4 (p<0,01) (fig.V.C.12-18).

17
Fig.V.C.12-18. A. Carcinom urotelial slab diferenţiat, marcaj p16, pattern mixt citoplasmatic
şi nuclear, x200; B. Carcinom urotelial moderat diferenţiat, marcaj pRb, scor 2, x200;
C. Carcinom urotelial bine diferenţiat, marcaj p53, scor 1, x200

V.C.4. MARKERI CE SE ADRESEAZĂ APOPTOZEI TUMORALE

Apoptoza tumorală a carcinoamelor uroteliale de vezică urinară a fost analizată cu

ajutorul bcl-2.
• Imunoreacţia Bcl-2 a fost prezentă la nivel citoplasmatic în 27,2% din leziunile analizate,
cazurile pozitive fiind bine/moderat diferenţiate (p<0,05), aflate în categoriile T1-T2 ale stadiului
tumoral (fig.V.C.19).

A B

Fig.V.C.19. Marcaj bcl-2, x200. A. Carcinom urotelial bine diferenţiat, scor 3;

B. Carcinom urotelial moderat diferenţiat, scor 1

V.C.5. MARKERI CARE SE ADRESEAZĂ ADEZIVITĂŢII

CELULARE TUMORALE
Adeziunea intercelulară tumorală a fost investigată cu ajutorul E-caderinei şi CD44.
• Imunomarcajul E-caderinei a fost identificat în 83,6% dintre leziunile incluse în studiu,
cazurile negative aparţinând unor carcinoame moderat sau slab diferenţiate cu invazie în întreg
peretele vezical (p<0,001).

18
 • Imunoreacţia CD44 a fost identificată în 74,5% din cazurile analizate la nivel
membranar, fiind complet sau incomplet iar absenţa acestuia s-a observat în cazul carcinoamelor
care au invadat intreg peretele vezical (p<0,01) (fig.V.C. 20-24)

Fig.V.C. 20-24. A. Carcinom urotelial slab diferenţiat invaziv în musculară

marcaj E-caderina, scor 1, x100; B. Carcinom urotelial slab diferenţiat,
invaziv muscularis propria,marcaj CD44, scor 1, x200

V.C.6. MARKERI CARE SE ADRESEAZĂ RELAŢIEI

TUMORĂ-STROMĂ PERITUMORALĂ

Pentru analiza relaţiei dintre tumoră şi micromediul adiacent a fost utilizată MMP9.
• Imunomarcajul MMP9 a fost identificat în 29 de cazuri la nivel citoplasmatic, ceea ce a
reprezentat 52,7% din cazurile analizate, reacţia fiind prezentă în 32% din carcinoamele bine
diferenţiate şi 46%, respectv 92% din carcinoamele moderat şi slab diferenţiate. Analiza statistică
(chi pătrat) a imunoexpresiei MMP9 a indicat corelaţii semnificative ale acesteia cu gradul
(p<0,05) şi stadiul tumoral (p<0,05) (fig.V.C.27).

Fig.V.C.27. Carcinom urotelial moderat diferenţiat,

invaziv în musculară, marcaj MMP9, scor 3, x200

19
 V.C.7. MARKERI CARE SE ADRESEAZĂ ANGIOGENEZEI ŞI
CUANTIFICARE MORFOMETRICĂ
Angiogeneza tumorală a fost investigată cu ajutorul VEGF, iar cuantificarea s-a realizat
cu markeri precum CD31 şi CD105. De asemenea, evidenţiere vaselor active am utilizat reacţie
dublă de fluorescenţă CD105/Ki67.
• Imunomarcajul VEGF a fost prezent la nivel citoplasmatic în 50,9% din leziunile
analizate, marcajele de peste 50% asociindu-se cu gradul înalt (p<0,01) şi stadiul avansat
(p<0,01).
• Imunomarcajele CD31 şi CD105 au fost identificate la nivelul celulelor endoteliale în
toate cazurile analizate, fără asocieri ale MVD cu stadiul/gradul tumoral, cu densitate superioară
a vaselor la nivel peritumoral şi o specificitate superioară a CD105 pentru vasele neoformate.
• Reacţia de fluorescenţă dublă CD105/Ki67 a arătat un index de proliferare vasculară a
fost în toate cazurile analizate sub 10%, indiferent de gradul sau stadiul tumoral (fig.V.C.30-33).

A B

C D

Fig.V.C.30-33. A. Carcinom urotelial slab diferenţiat invaziv în întreg peretele, marcaj

VEGF, scor 3, x100; B. Carcinom urotelial, marcaj peritumoral CD31, x200; C. Carcinom
urotelial, marcaj peritumoral CD105, x200; D. Colocalizare CD105/Ki67 la nivelul unui
vas (Alexa 594) cu celule endoteliale aflate în activitate mitotică (Ki67/Alexa 488)

20
 V.C.8. MARKERI CARE SE ADRESEAZĂ LIMFANGIOGENEZEI TUMORALE ŞI
CUANTIFICARE MORFOMETRICĂ
Markerul utilizat pentru investigarea limfangiogenezei în carcinoamele uroteliale vezicale a
fost reprezentat de D2-40.
• Imunomarcajul D2-40 a fost identificat la nivelul vaselor limfatice din tumoră şi de la
nivelul frontului de invazie, unde LVD a avut valori superioare şi s-a asociat cu gradul înalt
(p<0,05) (fig. V.C.37.)

Fig.V.C.37. Marcaj D2-40, carcinom urotelial bine diferenţiat, x200.

A.Vase limfatice intratumorale; B. Vase limfatice peritumorale

Am constatat că în cazul Ki67, C-erbB2, p16, E-caderina, semnificaţia statistică p

referitor la cel puţin un parametru histopatologic analizat a fost foarte înalt semnificativă
(p<0,001). De asemenea marcajele 34βE12, p63, PCNA, pRb, p53, CD44, VEGF au avut o
valoare înalt semnificativă (p<0,01) , iar marcaje precum CK20, pRb, bcl-2, MMP9 şi D2-40 au
prezentat valori semnificative statistic cu cel puţin unul dintre parametrii analizaţi (p<0,05).
Pentru markerii care s-au corelat semnificativ cu gradul/stadiul tumoral şi care s-au supus
aceluiaşi sistem de cuantificare, testul ANOVA a indicat diferenţe semnificative între mediile
valorilor şi gradul/categoria T a stadiului tumoral.
Testul chi pătrat realizat între biomarkerii utilizaţi a arătat următoarele rezultate:
a) Corelaţii statistice (p<0,05) între proteinele ciclului celular şi proliferarea tumorală
(Ki67/p16 şi C-erbB2/p53)
De asemenea a existat o corelaţie semnificativă (p<0,05) între imunoexprsia Ki67 şi c-
erbB2. O astfel de corelaţie s-a identificat şi între p16 şi pRb (p<0,05).
b) Corelaţie statistică înalt semnificativă între bcl-2 şi şi Ki67 (p<0,01) şi foarte înalt
semnificativă între bcl-2 şi p53 (p<0,001).

21
 c) Corelaţii foarte înalt semnificative (p<0,001) ale Ki67 cu markeri de adezivitate
intercelulară (E-caderina, CD44) şi nesemnificative (p>0,05) cu markeri de relaţie tumoră stromă
peritumorală (MMP9). De asemenea MMP9 s-a corelat foarte înalt semnificativ cu E-caderina şi
CD44 (p<0,001).
d) Corelaţii statistice ale markerilor implicaţi în agiogeneză şi limfangiogeneză, în care
doar imunoexpresia D2-40 şi Ki67 s-au corelat înalt semnificativ (p<0,01).

22
 CAPITOLUL VI

DISCUŢII

VI.A. ANALIZA DATELOR CLINICO-MORFOLOGICE PENTRU CARCINOAMELE

UROTELIALE DE VEZICĂ URINARĂ

Carcinomul urotelial de vezică urinară este desemnat în literatura de specialitate ca fiind pe

locul patru între neoplaziile maligne care afectează sexul masculin, reprezentând de asemenea în
Europa şi SUA 5-10% dintre tumorile maligne ale bărbatului [146; 207]. Riscul de apariţie al
acestei leziuni este apreciat la 2-4%, respectiv 0,2-0,4% pentru bărbaţii şi femeile sub 75 de ani,
raportul dintre cele două sexe fiind de 3-4 ori mai mare în favoarea celui masculin [146]. Această
leziune este predominantă la bărbaţi, dar cu o incidenţă care creşte continuu în populaţia feminină
[64]. Acest studiu a analizat 376 de cazuri de carcinom urotelial de vezică urinară pe o perioadă
de 5 ani, incidenţa maximă fiind observată în anul 2009

VI.B. ANALIZA HISTOPATOLOGICĂ A CARCINOAMELOR UROTELIALE

DE VEZIZICĂ URINARĂ

Pe baza patternului ahitectural acest studiu a identificat carcinoame uroteliale papilare în

86,1% din cazuri şi nonpapilare (plate) în 13,9% din cazuri. Această împărţire a carcinoamelor
utroteliale are la bază criterii patogenice biomoleculare, histopatologice şi de prognostic. Studiile
realizate în acest sens au arătat că majoritatea leziunilor au un pattern de creştere papilar la
diagnostic şi sunt asociate cu un prognostic bun, dar rata de recidivă este ridicată [44]
În ceea ce priveşte gradul de diferenţiere tumorală în 28,8% din cazuri tumorile au fost
bine diferenţiate, în 53% din cazuri moderat diferenţiate şi în 18,2% slab diferenţiate. . Gradul
tumoral trebuie stabilit cu mare acuratete, deoarece acesta se corelează cu stadiul tumoral şi
comportamentul tumoral [56].
Studiul histopatologic al cazurilor analizate a urmărit identificarea diferenţierilor
histologice prezente în cazul carcinoamelor uroteliale. Cea mai frecventă diferenţiere a fost cea
scuamoasă, prezentă în 113 cazuri, urmată de cea cu celule clare în 36 de cazuri şi cea glandulară
în 11 cazuri, majoritatatea leziunilor având un grad de diferenţiere moderat. Carcinoamele
uroteliale de vezică urinară prezintă diferite comportamente clinice şi trăsături histopatologice,

23
care include şi capacitatea de diferenţiere către un spectru de variante histologice existând studii
care au arătat că 7-44% dintre carcinoamele uroteliale pot prezenta trăsături histopatologice mixte
[8; 115]. În astfel de cazuri tumora trebuie încadrată ca fiind urotelială, precizându-se totodată
tipul de diferenţiere prezentă şi procentul pe care îl reprezintă acea diferenţiere în cadrul
carcinomului urotelial convenţional [111].
Invazia tumorală a fost prezentă la nivelul laminei propria în 128 cazuri, la nivelul
muscularei propria în 95 de cazuri, la nivelul întregului perete vezical în 34 de cazuri şi la nivelul
ţesuturilor învecinate în 3 cazuri. Stadiul tumoral reprezintă cel mai important parametru pentru
prognosticul carcinoamelor uroteliale, depinzând de profunzimea invaziei la nivelul peretelui
vezcal [111]. Sistemul TMN defineşte ca tumori pT1, acele leziuni care ajung la nivelul laminei
propria, dar nu invadează muscularis propria [44]. Prezenţa sau absenţa invaziei la nivelul
muscularis propria este o informaţie crucială pentru luarea unei decizii terapeutice. Fibrele de la
nivelul muscularei propria sunt groase şi compacte, alcătuind numeroase fascicule înconjurate de
perimisium. Un studiu mai recent a demonstrat că în cazul pacienţilor cu masă extravezicală
observabilă macroscopic (pT3b) rata de recurenţă este ridicată, iar supravieţuirea la 5 ani
diminuează, fiind indicată raportarea substadiului [7]. Este de assemenea demonstrată importanţa
invaziei prostatei sau a veziculelor seminale pentru aprecierea prognosticului pacienţilor [38; 48].
Cu toate că nu există raporturi clare între paternul de invazie şi supravieţuire, în anumite
rapoarte s-a subliniat importanţa clinică a acestora [126]. În general, un front de invazie masiv,
compact are un prognostic mai bun decât unul tentacular [11].
În acest studiu, invazia vasculară a fost prezentă în 43 de cazuri şi invazia perineurală a
fost identificată în 11 cazuri. Marea majoritate a studiilor recomandă precizarea invaziei
vasculare şi perineurale în buletrinul histopatologic [101; 155].
Metastaza ganglionară a fost identificată în 11 cazuri în acetst studiu, Kassouf et al. arătând
că densitatea ganglionară este un factor de prognostic independent pentru supravieţuire [85].
În acest studiu, repartiţia pe stadii a fost următoarea: stadiul I 128 cazuri, stadiul II 95
cazuri, stadiul III 26 cazuri, stadiul IV 11 cazuri. De asemenea, nu au fost prezente metastaze la
distanţă de tumora primitivă. Stadiul tumoral este considerat de către toţi autorii ca fiind cel mai
important parametru histopatologic pentru prognosticul şi supravieţuirea pacienţilor.

24
 În ceea ce priveşte identificarea leziunilor adiacente tumorilor, mai mulţi autori au subliniat
importanţa identificării CIS, care face parte dintre factorii utili pentru aprecierea prognosticului
[125; 161].

VI.C. ANALIZA IMUNOHISTOCHIMICĂ A CARCINOAMELOR UROTELIALE

DE VEZICĂ URINARĂ

Biomarkerii analizaţi în cadrul acestui studiu au fost caracterizaţi în literatura de specialitate

ca reprezentativi pentru principalele mecanisme biomoleculare implicate în tumorigeneza cu
diferse localizări. Am urmărit implicarea lor apariţia şi progresia carcinoamelor uroteliale,
precum şi corelarea diversilor markeri între ei şi cu parametrii histopatologici cu valoare
prognostică recunoscută, respectiv cu gradul şi stadiul tumoral
Gradul de diferenţiere al celulelor epiteliale tumorale a fost analizat cu ajutorul
tandemului CK7-CK20, al cokteilului de citokeratine 34βE12 şi al p63. La nivelul celulelor
epiteliale există peste 20 de tipuri de filamente intermediare citoplasmatice [176]. Expresia
acestor proteine citoscheletale este dependentă de tipul şi gradul de diferenţiere celulară.
Într-un studiu realizat de Douglas C. Parker şi colab. în anul 2003, acesta a arătat că
expresia 34βE12 este crescută semnificativ în carcinoamele invazive şi metastazante, comparativ
cu cele noninvazive [42].
P63 este o biomoleculă recent descoperită, care face parte din familia p53 şi joacă un rol
esenţial în dezvoltarea normală şi stratificarea multor epitelii (mucoasă orală, gastrică,col uterin,
tegument), printre care cel urotelial [31; 92]. Rezultatele studiului sunt similare cu ale altor studii
care au încercat să elucideze rolul p63 în carcinogeneze urotelială Urist MJ et.al. a arătat în anul
2002 că p63 nu este indispensabilă pentru formarea uroteliului dar este necesară diferenţierii şi
stratificării acestuia [187].
Creşterea şi proliferarea celulară constituie un mecanism esenţial pentru progresia
tumorilor maligne. Acest mecanism a fost investigat cu ajutorul Ki67, PCNA şi c-erbB2.
• Antigenul Ki67 reprezintă o proteină non-histonică cu viaţă scurtă, exprimată în timpul
ciclului celular în fazele G1, S, G2/M , fiind un indicator al creşterii şi agresivităţii tumorale [19].

25
 Antigenul nuclear al proliferării celulare (PCNA) reprezintă un marker nuclear al
celulelor aflate în fazele G1 şi S a ciclului celular, reprezentând un cofactor al polimerazei ADN
delta, fiind de asemenea implicată în procesele de reparare ADN [186].
Există puţine studii legate de semnificaţie expresiei PCNA la nivelul uroteliului tumoral,
majoritatea autorilor preferând investgarea activităţii proliferative tumorale cu ajutorul indexului
Ki67, care are o specificitate mai mare şi care are de asemenea o valoare prognostică certă.
Protooncogena c-erbB2 (Her 2/neu) codifică o glicoproteină transmembranară
asemănătoare EGFR, care prezintă activitate tirozin-kinazică şi stimulează creşterea celulară [99].
Este confirmat faptul că în cazul carcinoamelor uroteliale amplificarea c-erbB2 este mai puţin
frecventă decât în cazul altor localizări, ceea ce semnifică faptul că supraexpresia poate avea şi
alte mecanisme biomoleculare mai puţin cunoscute, acest aspect fiind un posibil obstacol în
implementarea unui protocol imunohistochimic cu semnificaţie terapeutică [189].
Ciclul celular este reglat de o serie de proteine care acţionează pe diverse căi
biomoleculare, care în acest studiu au fost investigate prin intermediul p16, pRb şi p53.
P16 reprezintă un reglator negativ al ciclului celular care asigură controlul trecerii
celulare din faza G1 în faza S [93]. Datele din literatură arată că proteina este implicată în stadiile
iniţiale ale carcinogenezei, precum şi în progresia tumorală, unele studii demonstrând
supraexpresia proteinei la nivelul frontului de invazie [93; 165].
pRb în stare activă hipofosforilată, acţionează ca un inhibitor al progresiei celulelor din
faza G1 în faza S a ciclului celular. Datele din literatură sunt controversate în ceea ce priveşte
semnificaţia expresiei pRb în carcinoamele uroteliale dar majoritatea autorilor sunt de acord în
privinţa faptului că această proteină joacă un rol central în evoluţia leziunii. Unele studii au
raportat asocieri între alterarea expresiei RB şi reducerea ratei de supravieţuire a pacienţilor cu
carcinom invaziv la nivelul muscularei proprii [108]. Alte studii au demonstrat că alterarea
genică şi fenotipică a Rb creşte cu diminuarea gradului de diferenţiere şi cu progresia tumorală
[74; 201].
P53 este codificată de o genă prezentă la nivelul 17p13, fiind o proteină de 53kDa. Calea
p53 joacă un rol major în răspunsul la alterarea ADN-ului şi stresul oncogenic. Mutaţiile şi
supraexpresia nucleară a p53 sunt mult mai frecvente în carcinoamele uroteliale invazive de grad
înalt [120], fiind neobişnuite în tumorile TaG1/G2 [88].

26
 Moartea celulară programată (apoptoza) joacă un rol important în patologia tumorală,
pierderea răspunsului apoptotical celulelor tumorale reprezentând unul dintre mecanismele cu rol
în progresia tumorală şi în apariţia recidivelor. Datele din literatura de specialitate sunt
controversate în ceea ce priveşte semnificaţia imunomarcajului bcl-2 în carcinoamele uroteliale.
În unele studii, aşa cum este cel realizat de H Shiina şi colab. în anul 1996, evidenţierea
imunoexpresiei bcl-2 este corelată cu un fenotip mai puţin agresiv, corelându-se cu stadiul
tumoral [174].
Pierderea adeziunii intercelulare reprezintă unul dintre mecanismele prin care se
realizează progresia tumorală, fiind investigată cu ajutorul E-caderinei şi CD44
• E-cadherina este o moleculă transmembranară Ca dependentă, de natură glicoproteică,
care se află în strânsă legătură cu cateninele şi prin intermediul acestora cu citoscheletul celular
[154]. Imunoexpresia şi funcţia normală a E-cadherinei nu sunt întotdeauna în concordanţă.
Datorită alterării altor componente ale sistemului de adeziune intercelulară, precum cateninele,
funcţia E-cadherinei poate fi alterată, cu toate că expresia imunohistochimică se poate menţine.
• CD44 reprezintă o glicoproteină transmembranară implicată în adeziunea intercelulară
şi interacţia celule/matrix extracelular [14]. La nivelul uroteliului normal expresia CD44 este una
bazală, spre deosebire de carcinoame, în care celulele intermediare devin pozitive [168]. Un
astfel de pattern difuz, precum şi cazurile negative sunt considerate leziuni cu expresia CD44
aberantă asociindu-se cu un prognostic nefavorabil [168].
Relaţia tumoră-stromă peritumorală constituie unul dintre factorii determinanţi pentru
micromediul tumoral, fiind investigată cu ajutorul MMP9.
• MMP9 (gelatinaza B) reprezintă o matrixproteinază desemnată ca şi colagenază de tip
IV de 92 de kDa. Capacitatea de degradare a membranei bazale şi a matrixului extracelular este
esenţială pentru invazia locală şi diseminarea la distanţă a tumorilor primare [45]. În carcinomul
urotelial MMP9 a fost investigată, raportându-se creşteri ale expresiei şi activităţii acesteia [60].
Angiogeneza şi limfangiogeneza au fost investigate şi cuantificate cu ajutorul unor
biomarkeri specifici, precum VEGF,CD31,CD105, respectiv D2-40.
VEGF (factorul de creştere vascular endotelial) face parte dintr-o familie de factori de
creştere care constituie mediatori importanţi ai creşterii endoteliale, fiind un factor proangiogenic.
Majoritatea studiilor din literatura de specialitate consideră VEGF o potenţială ţintă terapeutică în

27
cazul tumorilor, inclusiv în cazul carcinomului urotelial, datorită corelaţiei markerului cu stadiul
şi gradul tumoral.
În acest studiu atât MVD realizată cu ajutorul CD31 şi CD105, cât şi morfologia vaselor
cuantificate nu au arătat corelaţii cu stadiul sau gradul tumoral, rezultate similare altor sudii [10;
150]. Cu toate acestea, au fost identificate vase de tip imatur cu caractere morfologice de
neoformare, despre care este demonstrat faptul că sunt implicate în progresia tumorală [21].
Reacţia de fluorescenţă dublă CD105/Ki67 a demonstrat un index de proliferare vasculară sub
10%, majoritatea vaselor marcate având o morfologie de neoformare, dar fiind inactive din punct
de vedere mitotic.
Interesul pentru agiogeneză este mare deoarece, plecând de la premisa că orice tumoare
are nevoie de noi vase pentru creştere şi dezvoltare, cuantificare acestui proces din punct de
vedere imunohistochimic la nivelul tumorii şi în jurul acesteia, poate avea relevanţă prognostică.
Podoplanina reprezintă o glicoproteină trans membranară de tip mucinic care este
exprimată şi de către vasele limfatice, fiind recunoscută de anticorpul D2-40 [83]. Există puţine
studii în literatura de specialitate care au investigat limfangiogeneza la nivelul uroteliului tumoral
iar autorii s-au raportat la rezultatele unor studii privind diverse localizări ale tumorilor [122;
203].
În literatura de specialitate sunt unele studii care au investigat legături între diversele
mecanisme biomoleculare care participă la carcinogeneza urotelială. Printre acestea se numără
cel realizat de Sangeeta Desai în 2003 care argumentază corelaţii între CK20 şi CD44, studiul
Evei Comperat din 2006, în care autoarea nu identifică astfel de corelaţii statistice între Ki67, p53
şi p63, studiul realizat în 2004 de către Shahrokh F. Shariat care invocă semnificaţie statistică
între expresia p53 şi statusul p16/pRb, precum şi cel din 2009 realizat de către Gamze Donmez în
care se sugerează o legătura statistică între imunoexpresia VEGF şi MMP9.
Comparativ cu aceste studii, în cel de faţă am identificat corelaţii statistice doar între
p16/pRb şi nu am identificat astfel de corealţii între Ki67, p53 şi p63. De asemenea în acest
studiu au fost prezente o serie de corelaţii statistice între factori de proliferare, proteine ale
ciclului celular şi ale apoptozei, precum şi între factorii de adezivitate, colagenaze şi factorii de
proliferare.

28
 CONCLUZII

Studiul efectuat asupra a 260 cazuri de carcinoame uroteliale în perioada 2005-2009 a

permis următoarele observaţii:
¾ Carcinoamele uroteliale de vezică urinară au reprezentat 91,7% din leziunile tumorale
maligne cu această localizare.
¾ Majoritatea cazurilor au fost diagnosticate în decada a VI-a şi a VII-a de viaţă, vârsta
medie de diagnostic fiind de 66,1 ani, cu o predominenţă netă în favoarea sexului
masculin, raportul bărbaţi/femei fiind de 6,8/1.
¾ Tumorile analizate au prezentat un pattern papilar în 86,1% din cazuri respectiv
nonpapilar în 13,9%, fiind mai frecvent forme moderat diferenţiate (53%).
¾ Invazia la nivelul laminei propria (pT1) a fost întâlnită în 49,3% din cazuri, majoritatea
(49,2%) fiind moderat diferenţiate.
¾ Invazia la nivelul muscularei propria (pT2) a fost prezentă în 36,6% din cazuri, din care în
1/2 internă a tunicii musculare (pT2a) 18,2% din cazuri şi 18,4% din cazuri în 1/2 externă
a peretelui vezical (pT2b), cele mai multe fiind moderat diferenţiate (65,1%)
¾ Invazia întregului peretele vezical (pT3), inclusiv în ţesutul adipos perivezical a fost
prezentă în 13,1% din cazuri, din care în 11,6% din cazuri invazia a fost identificată
microscopic (pT3a), iar în 1,5% din cazuri identificarea s-a realizat şi macroscopic
(pT3b), în 61,7% fiind vorba de carcinoame slab diferenţiate.
¾ Invazia ţesuturilor adiacente vezicale şi a organelor învecinate (pT4a) a fost prezentă în
1,1% din cazuri, fiind tumori slab diferenţiate.
¾ Invazia vasculară a fost prezentă în 16,5% din cazuri, mai frecvent în categoria tumorilor
care au invadat peretele şi ţesutul adipos perivezical.
¾ Invazia perineurală a fost evidenţiată în 4,2% din cazuri, din care 63,6 % forme moderat
diferenţiate cu invazie la nivelul jumătăţii externe a tunicii musculare.
¾ Metastazele ganglionare au fost prezente în 4,2% din cazuri, toţi ganglionii afectaţi avînd
dimensiuni sub 5cm, asociate tumorilor slab diferenţiate cu invazie la nivelul întegului
perete şi/sau a ţesutului adipos perivezical; în 9 cazuri a fost afectat un singur ganglion,
iar în 2 cazuri câte doi ganglioni.

29
 o Analiza stadiului TNM al tumorilor a indicat următoarea incidenţă: stadiul I
tumoral (T1NoMo) în 49,3% din cazuri, stadiul II tumoral (T2a,bNoMo) în 36,6% din
cazuri, stadiul III (T3a,bNoMo) ) în 10% din cazuri, stadiul IV (T4aN1,2Mo) în 4,1%
din cazuri.
¾ În cazul unor tumori moderat diferenţiate invazive în lamina propria am identificat leziuni
asociate precum reprezentate de carcinomul in situ, carcinomul noninvaziv papilar de
grad scăzut şi carcinomul noninvaziv papilar de grad înalt (CIS papilar).
¾ Recidivele tumorale, în număr de 52, au fost înregistrate la intervale cuprinse între 7 luni
şi 2 ani de la primul diagnostic, fiind tumori papilare, cu acelaşi grad de diferenţiere ca
tumora primară şi invazie în musculara propria în 67,3% de cazuri.
¾ Analiza markerilor de diferenţiere tumorală a arătat că profilul citokeratinic reprezentat de
tandemul CK20 şi 34βE12 pozitive difuz în peste 80% din celule şi negativitatea p63
sunt asociate carcinoamelor slab diferenţiate.
¾ Ki67 şi c-erbB2 implicate în proliferarea tumorală, sunt asociate cu gradul înalt şi stadiul
avansat.
¾ Dintre proteinele implicate în reglarea ciclului celular analizate, p16 şi p53 s-au corelat cu
stadiul tumoral, imunoexpresia mixtă nucleară şi citoplasmatică sau negativă pentru p16
şi scorul p53 înalt asociindu-se cu stadiul avansat.
¾ Bcl-2 s-a corelat cu gradul tumoral, existând corelaţii statistice înalte cu Ki67 şi p53, iar
pozitivitatea markerului a sugerat un prognostic favorabil.
¾ Studiul markerilor specifici adezivităţii intercelulare, E-caderina şi CD44, au arătat o
legătură strânsă între pierderea expresiei şi gradul de invazie tumorală, dovedindu-se utili
pentru aprecierea progresiei tumorale.
¾ Imunoexpresia MMP9 s-a corelat cu gradul şi stadiul tumoral, existând o legătură foarte
înalt semnificativă cu moleculele de adeziune.
¾ Dintre markerii utilizaţi pentru aprecierea şi cuantificarea angiogenezei doar VEGF s-a
asociat statistic cu gradul şi stadiul tumoral.
¾ CD105 a avut o specificitate superioară pentru vasele de neoformare, comparativ cu
CD31.

30
¾ Indexul de proliferare vasculară a avut valori sub 10% indiferent de gradul sau stadiul
tumoral, ceea ce susţine faptul că neoangiogeneza tumorală joacă un rol secundar pentru
progresia carcinoamelor uroteliale.
¾ D2-40 s-a corelat cu gradul tumoral şi nu a fost evidenţiată nici o legătură între distribuţia
intra- şi peritumorală a vaselor sangvine şi limfatice.
¾ P53 poate fi util în paneluri de anticorpi pentru a evalua rata de creştere tumorală,
existând corelaţii statistice înalte cu bcl-2 şi Ki67.
¾ 34βE12, p63 şi MMP9 au furnizat informaţii independente de alţi markeri în ceea ce
priveşte agresivitatea leziunilor.
¾ Analiza statistică a indicat Ki67, C-erbB2, p16 şi E-caderina ca fiind markerii cu cea mai
mare specificitate pentru aprecierea stadiului de progresie tumorală.

31
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
[7] Bastian PJ., Hutterer GC., Shariat SF. et al., Macroscopic, but not microscopic,
perivesical fat invasion at radical cystectomy is an adverse predictor of recurrence and
survival, BJU Int 2008, 101:450-4.
[8] Billis A., Carvalho RB., Mattos AC. et al., Tumor grade heterogeneity in urothelial
bladder carcinoma: Proposal of a system using combined numbers, Scand J Urol Nephrol
2001, 35: 275-9.
[10] Bochner BH., Cote RJ., Weidner N. et al., Angiogenesis in bladder cancer: relationship
between microvessel density and tumor prognosis, J Natl Cancer Inst 1995, 87:1603-12.
[11] Bostwick DG., Lopez-Beltran A., Bladder Biopsy Interpretation. United Pathologists
Press: Washington DC 1999.
[14] Bourguignon LY., Gunja-Smith Z., Iida N. et al., CD44v(3,8–10) is involved in
cytoskeletonmediated tumor cell migration and matrix metalloproteinase (MMP-9)
association in metastatic breast cancer cells, J Cell Physiol 1998, 176:206-15.
[19] Cattoretti G., Becker MH., Key G. et al., Monoclonal antibodies against recombinant
parts of the Ki-67 antigen (MIB1andMIB 3) detect proliferating cells inmicrowave-
processed formalin-fixed paraffin sections, J Pathol 1992, 168:357-63.
[21] Chaudhary R., Bromley M., Clarke NW. et al., Prognostic relevance of microvessel
density in cancer of the urinary bladder, Anticancer Res 1999, 19:3479-84.
[31] Comperat E., Camparo P., Haus R. et al., Immunohistochemical expression of p63, p53
and MIB-1 in urinary bladder carcinoma. A tissue microarray study of 158 cases, Virchows
Arch 2005, 8:1-6.
[38] Daneshmand S., Stein JP., Lesser T. et al., Prognosis of seminal vesicle involvement
by transitional cell carcinoma of the bladder, J Urol 2004, 3: 81-4.
[42] Douglas CP., Andrew LF., Bell J. et al., Potential Utility of Uroplakin III,
Thrombomodulin, High Molecular Weight Cytokeratin, and Cytokeratin 20 in Noninvasive,
Invasive, and Metastatic Urothelial (Transitional Cell) Carcinomas, The American Journal
of Surgical Pathology 2003, 27(1): 1-10.
[44] Eble JN., Sauter G., Epstein JI., IAE.World Health Organization classification of
tumours: pathology and genetics of tumours of the urinary system and male genital organs.
Lyon: IARC Press, 2004.

32
[45] Egeblad M., Werb Z., New functions for the matrix metalloproteinases in cancer
progression, Nat Rev Cancer 2002, 2: 161-174.
[56] Gospodarowicz MK., Henson DE., Hutter RVP., Prognostic factors in cancer, 2nd
edition, Wiley-Liss 2001, 627-36.
[60] Hara I., Miyake H., Hara S. et al., Significance of matrix metalloproteinases and tissue
inhibitors of metalloproteinase expression in the recurrence of superficial transitional cell
carcinoma of the bladder, J Urol 2001, 165: 1769-72.
[64] Hayne D., Arya M., Quinn MJ. et al., Current trends in bladder cancer in England and
Wales, J Urol 2004, 172:1051-5.
[74] Ishikawa J., Xu HJ., Hu SX. et al., 1991 Inactivation of the retinoblastoma gene in
human bladder and renal cell carcinomas, Cancer Res 1991, 51: 5736.
[83] Kaiserling E., Immunohistochemical identification of lymph vessels with D2-40 in
diagnostic pathology, Pathologe 2004, 25:362-74.
[91] Knowles MA., Molecular subtypes of bladder cancer: Jekyll and Hyde or chalk and
cheese?, Carcinogenesis 2006, 27(3):361-73.
[92] Koga F., Kawakami S., Kumagai J. et al., Impaired DNp63 expression associates with
reduced b-catenin and aggressive phenotypes of urothelial neoplasms, British Journal of
Cancer, 2003, 88: 740 -7.
[93] Kristina N., Svensson S., Landberg G., Retinoblastoma protein function and p16INK4a
expression in actinic keratosis, squamous cell carcinoma in situ and invasive squamous cell
carcinoma of the skin and links between p16INK4a expression and infiltrative behavior,
Modern Pathology 2004, 17: 1464-74.
[99] Lee J., Dull Tj., Lax T. et al., HER2 cytoplasmic domain generates normal mitogenic
and transforming signals in a chimeric receptor, EMBO J 1989, 8: 167.
[100] Lee R., Droller MJ., The natural history of bladder cancer, Implications for therapy,
Urol Clin North Am 2000, 27(1): 1-13.
[101] Leissner J., Koeppen C., Wolf HK., Prognostic significance of vascular and
perineural invasion in urothelial bladder cancer treated with radical cystectomy, J Urol
2003, 169:955-60.

33
[108] Lipponen PK., Liukkonen TJ., Reduced expression of retinoblastoma (Rb) gene
protein is related to cell proliferation and prognosis in transitional cell bladder cancer, J
Cancer Res Clin Oncol 1995, 121:44.
[111] Lopez-Beltran A., Cheng L., Stage pT1 bladder carcinoma: diagnostic criteria, pitfalls
and prognostic significance, Pathology 2003, 35: 484-91.
[115] Lopez-Beltran A., Sauter G., Gasser T. et al., In: Eble JN, Sauter G, Epstein JI, et al
(Eds): Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. Tumours of the urinary
system, Lyon, IARC Press 2004, pp 89-154.
[120] Malats N., Bustos A., Nascimento CM. et al., P53 As a Prognostic Marker for
Bladder Cancer: a Meta-Analysis and Review, Lancet Oncol 2005, 6:678-86.
[122] Mario IF., Bolenza C., Lutz T. et al., Prognostic Implications of Lymphangiogenesis
in Muscle-Invasive Transitional Cell Carcinoma of the Bladder, European Urology 2008,
53: 571-80.
[125] May M., Helke C., Nitzke T. et al., Survival rates after radical cystectomy according
to tumor stage of bladder carcinoma at first presentation, Urol Int 2004, 72: 103-11.
[126] Mazzucchelli L., Bacchi M., Studer UE. et al., Invasion depth is the most important
prognostic factor for transitional cell carcinoma in a prospective trial of radical cystectomy
and adjuvant chemotherapy, Int J Cancer 1994, 57: 15-20.
[146] Parkin DM., Bray F., Ferlay J. et al., Estimating the world cancer burden: Globocan
2000, Int J Cancer 2001, 94:153-6.
[154] Popov Z., De Medina S, Lefrere-Beldal M.A. et al., Low E-cadherin expression in
bladder cancer at the transcriptional and protein level provides prognostic information,
British Journal of Cancer 2000, 83(2): 209-14.
[155] Quek ML., Stein JP., Clark PE. et al., Microscopic and gross extravesical extension in
pathological staging of bladder cancer, J Urol 2004, 171: 640-5.
[161] Rammeh-Rommani S., Zermani R., Zouari B. et al., Prognostic value of
clinicopathologic factors in superficial bladder tumors: a retrospective analysis, Tunis Med
2005, 83: 746-749.
[168] Sangeeta D., So DL., Jimenez RE., Relationship of Cytokeratin 20 and CD44 Protein
Expression with WHO/ISUP Grade in pTa and pT1 Papillary Urothelial Neoplasia, Mod
Pathol 2000,13(12):1315-23.

34
[174] Shiina H., Igawa M., Urakami S., Honda S., Shirakawa H., Ishibe T.,
Immunohistochemical analysis of bcl-2 expression in transitional cell carcinoma of the
bladder, J Clin Pathol 1996, 49:395-9.
[176] Southgate J., Harnden P., Trejdosiewicz LK., Cytokeratin expression patterns in
normal and malignant urothelium: a review of the biological and diagnostic implications,
Histol Histopathol 1999, 24:657-64.
[180] Stephen G., Stein JP., Molecular pathways in bladder cancer, Urol Res 2004, 32: 373-
85.
[186] Tommasi S., Pfeifer GP., In vivo structure of two divergent promoters at the human
PCNA locus. Synthesis of antisense RNA and S phase-dependent binding of E2F
complexes in intron 1, J Biol Chem 1999, 274: 27829-38.
[187] Urist MJ., Di Como CJ., Lu ML. et al., Loss of p63 Expression Is Associated with
Tumor Progression in Bladder Cancer, American Journal of Pathology 2002, 161(4): 1199-
206.
[189] Vildan C., Nilay S., Fusun D. et al., No Strong Association Between HER-2/neu
Protein Overexpression and Gene Amplification in High-grade Invasive Urothelial
Carcinomas, Pathol Oncol Res 2008, 14:261-6.
[201] Xu HJ., Cairns P., Hu SX. et al., Loss of RB protein expression in primary bladder
cancer correlates with loss of heterozygosity at the RB locus and tumor progression, Int J
Cancer 1993, 53: 781.
[203] Yasuyoshi M., Shigeru K., Kojiro O. et al., Lymphangiogenesis and Angiogenesis in
Bladder Cancer: Prognostic Implications and Regulation by Vascular Endothelial Growth
Factors-A, -C, and -D, Clin Cancer Res 2006, 12(3): 800-6.
[207] Ziya K., Theresa C., Murugesan M. et al., Bladder Cancer: Epidemiology, Staging
Andgrading, and Diagnosis, Urology 2005, 66 (6A): 4-34.

35