Dublu test (screening prenatal trim.

I)
Articol scris in Markeri endocrini, Screening prenatal anomalii fetale pe 13 august 2009 Informatii generale In ultimii 30 ani numeroase cercetari s-au concentrat pe dezvoltarea unor investigatii neinvazive care sa evalueze riscul unei femei gravide de a da nastere unui copil cu anomalii. Riscul de sindrom Down a fost cel mai mult studiat; initial screening-ul prenatal a fost recomandat numai in cazul unei varste materne 35 ani, insa in ultimii ani specialistii in medicina materno-fetala sustin faptul ca aceasta optiune de screening trebuie oferita, printr-o informare corecta, tuturor femeilor gravide. Screening-ul prenatal in trimestrul II de sarcina se bazeaza pe faptul ca in aceasta perioada se pot efectua cele mai sigure investigatii invazive (amniocenteza). Totusi exista un beneficiu mai mare, atat pentru medici cat si pentru paciente, daca se pot obtine informatii despre sanatatea produsului de conceptie cat mai devreme in sarcina. Depistarea unor markeri serici ce pot fi determinati in primul trimestru si care au utilitate in estimarea riscului de aberatii cromozomiale ale fatului a condus la dezvoltarea investigatiei denumite dublu test1;3. Dublul test include: -determinarea markerilor serici PAPP-A si free beta-HCG; -calculul MoM (multiplu de mediana) pentru fiecare marker (se imparte valoarea obtinuta la mediana corespunzatoare varstei gestationale); -corectarea MoM in functie de covariabilele materne; -riscul biochimic de sindrom Down la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei doi markeri si a varstei materne la nastere); -riscul de trisomie 18 la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei doi markeri si a varstei materne la nastere); -riscul de trisomie 13 la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei doi markeri si a varstei materne la nastere); -calculul MoM pentru translucenta nucala (in cazul in care medicul trimitator furnizeaza laboratorului marimea translucentei nucale si lungimea cranio-caudala CRL, estimate ecografic); -vizualizarea sau non-vizualizarea osului nazal la examenul ecografic este de asemenea inclusa in algoritmul de calcul de risc prenatal; -riscul combinat de sindrom Down (risc biochimic + parametri ecografici); -risc pentru alte aneuploidii fetale (sindrom Turner, triploidie) in cazul in care medicul trimitator/pacienta informeaza laboratorul despre existenta unei sarcini anterioare cu un anumit tip de anomalie cromozomiala; -calcularea MoM corectata pentru fiecare parametru seric si a riscurilor de aneuploidii fetale la nastere este efectuata de programul LifeCycle versiunea 3.05. Markerii serici PAPP-A (proteina plasmatica asociata sarcinii) este o glicoproteina derivata din placenta. In timpul sarcinii este produsa in cantitate mare de catre trofoblast si eliberata in circulatia materna. Nivelurile serice ale acestei proteine cresc odata cu varsta gestationala, cel mai pregnant in ultima parte a sarcinii. Studii recente au demonstrat ca scaderea concentratiei PAPP-A in cursul sarcinii este asociata cu anomalii cromozomiale ale fatului: trisomie 21, 18, 13, sindrom Turner, triploidie de origine paterna (scadere usoara), triploidie de origine materna (scadere marcata). 1

Free beta-HCG subunitatea beta libera a HCG este considerat a fi un marker mai relevant decat molecula de HCG intact in trimestrul I de sarcina. In sarcinile asociate cu sindrom Down, nivelurile de free beta-HCG sunt >2 MoM. Valorile sunt de asemenea mult crescute in triploidia de origine paterna. In sindromul Turner nivelul de free beta-HCG este normal. In prezenta trisomiei 18 sau 13 precum si a triploidiei de origine materna concentratiile de free beta-HCG sunt considerabil scazute. Pentru a obtine o standardizare atat pentru varsta gestationala cat si pentru diferentele sistematice intre populatii, laboratoare si metode de lucru, valorile obtinute la markerii serici vor fi exprimate ca MoMs (multipli de mediana). MoM pentru un marker se obtine prin impartirea valorii masurate la mediana corespunzatoare varstei gestationale la care s-a efectuat determinarea, mediana ce este specifica populatiei din care face parte persoana testata si metodei de lucru utilizata in laborator4;5.

Estimarea varstei gestationale Este efectuata de catre programul LifeCycle pe baza valorii CRL si este exprimata in saptamani + zile; data ultimei menstruatii este introdusa de asemenea in program, insa in cazul unei discrepante intre varsta gestationala calculata pe baza CRL si cea determinata pe baza ultimei menstruatii (ca urmare a unui ciclu menstrual neregulat) este luata in considerare cea stabilita pe baza masuratorii ecografice5. Datele materne Varsta materna Riscul pentru trisomiile fetale (13, 18, 21) creste odata cu varsta mamei. Riscul initial (prior risk) pentru o anomalie fetala se refera la prevalenta la nastere a defectului respectiv, specifica unei anumite varste materne; riscul este calculat pe baza unei formule ce ia in considerare prevalentele specifice varstei in diferite populatii. De mentionat ca riscul de sindrom Turner si triploidie nu se modifica odata cu varsta mamei. Sarcini anterioare afectate de aneuploidii fetale Riscul pentru trisomii al unei femei care a avut in antecedente un fat sau un copil cu trisomie este mai mare decat riscul de varsta. Daca anomalia detectata la o sarcina anterioara a aparut de novo (ca urmare a unei nondisjunctii meiotice), riscul de varsta este ajustat cu un factor aditiv configurabil. Pentru sindromul Down factorul este pre-configurat in programul LifeCycle si este derivat din metaanaliza unor date combinate provenite de la 3983 sarcini, dintre care 28 au fost asociate cu sindrom Down (Cuckle, Arbuzova 2001). Riscul este mult mai mare in cazul in care anomalia fetala a fost mostenita; deoarece riscul este strans corelat cu modul de transmitere, programul LifeCycle nu poate furniza o estimare a riscului in acest caz4;5. Covariabile materne Fiecare MoM va fi corectat pentru fiecare din covariabilele prezentate mai jos, atunci cand sunt furnizate informatii despre acestea. Valoarea MoM va fi impartita la un factor egal cu mediana MoM pentru sarcinile neafectate asociata cu covariabila respectiva. Aceste ajustari presupun ca efectul covariabilei asupra nivelului marker-ului nu este diferit in sarcinile afectate comparativ cu cele neafectate. Greutatea materna Concentratia markerilor serici este influentata de greutatea materna. Femeile cu greutate mai mare au un volum sanguin crescut, care dilueaza concentratia analitilor. Greutatea materna este folosita pentru a ajusta matematic concentratia markerilor la diferentele in volumul sanguin. Presupunerea ca variatia MoM cu greutatea este proportional similara atat in sarcinile afectate cat si in cele neafectate este sustinuta de un studiu efectuat de Wald si Cuckle (1987) care a inclus 51 sarcini cu sindrom Down si 3000 sarcini normale. Valoarea MoM pentru o greutate data deriva printr-o analiza de regresie a femeilor care se prezinta pentru 2

invetigatii de rutina. Factorul de corectie este specific unei anumite populatii deoarece depinde de distributia greutatii intr-o populatie. Diabetul zaharat insulino-dependent Influenteaza valorile markerilor serici, de aceea programul face o ajustare corespunzatoare a MoM. Fumatul Influenteaza concentratia markerilor serici (cel mai mult reduce nivelul PAPP-A) si poate afecta performanta screening-ului. Din acest motiv, programul ajusteaza MoM in functie de statusul fumatoare/nefumatoare. Originea etnica (rasa) Exista variatii ale medianelor pentru unul sau mai multi markeri serici in functie de grupul etnic la care apartine mama, de aceea programul va tine cont de aceasta informatie. Reproducerea asistata Studiile au aratat ca nivelul markerilor serici este modificat in sarcinile obtinute prin reproducere asistata. Din acest motiv este necesar ca medicul trimitator sa furnizeze date cu privire la procedura aplicata: fertilizare in vitro (IVF), transferul intrafalopian al zigotului (ZIFT), transferul intrafalopian al gametului (GIFT), injectarea intracitoplasmatica a spermatozoizilor (ICSI) etc. De asemenea va fi precizata data extractiei si data transferului ovulului5. Riscul final (posterior risk) este estimat de catre programul LifeCycle din riscul initial si valorile markerilor serici pe baza unui model gaussian standard sau a unui model log gaussian. Astfel, pentru fiecare marker (exprimat ca MoM) se va stabili daca distributia in sarcinile afectate si cele neafectate este de tip gaussian sau log-gaussian. Pentru un singur marker, metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul de probabilitate pentru acel marker (calculat prin impartirea procentului de feti cu anomalii cromozomiale la procentul de feti normali, avand acea valoare a markerului: likelihood ratio). Pentru mai mult de un marker distributiile sunt multidimensionale si includ corelatii intre fiecare pereche de markeri. Metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul global de probabilitate derivat din distributiile multidimensionale4;5. Parametrii ecografici Translucenta nucala (NT) este definita ca grosimea maxima a spatiului subcutanat creat in mod normal in zona cervicala a fatului, unde se produce o acumulare tranzitorie de lichid, in saptamanile 11-14 de sarcina. In mod obisnuit, marimea translucentei nucale estimata ecografic in plan sagital, variaza intre 0.5 si 2 mm. Ca si in cazul celorlalti markeri, o translucenta nucala crescuta nu reprezinta in sine o anomalie fetala, aceasta modificare putand sa apara si in sarcinile normale. Totusi s-a constatat ca prezenta aneuploidiilor fetale se asociaza cu o translucenta nucala in medie crescuta fata de sarcinile normale. Astfel, studiile efectuate au aratat ca rata de detectie a sindromului Down bazata pe varsta materna si masurarea translucentei nucale este de 72-77%; aproximativ 1:20 femei prezinta o translucenta nucala crescuta si necesita investigatii ulterioare. S-a raportat o asociere a translucentei nucale crescute si cu alte aneuploidii fetale, cum ar fi trisomia 18, trisomia 13, sindromul Turner, triploidia, precum si cu alte anomalii genetice, in special defectele cardiace congenitale. Pentru masurarea cu acuratete a translucentei nucale a fost stabilita o tehnica standardizata impreuna cu programe de training si audituri pentru asigurarea calitatii; specialistii in ecografie trebuie sa fie familiarizati cu aceste date pentru obtinerea unor masuratori corecte. Varsta gestationala optima pentru masurarea NT este 11 saptamani-13 saptamani +6 zile (corespunzatoare unor valori CRL cuprinse intre 45 si 84 mm)1;4. Deoarece NT fetala creste odata cu CRL, este esential sa se ia in considerare varsta gestationala pentru a stabili daca valoarea NT este crescuta. In screening-ul defectelor fetale, riscurile individuale specifice sunt calculate prin multiplicarea riscului matern initial cu un factor care depinde de abaterea NT masurate (in mm) fata de mediana normala pentru acelasi CRL4;5. 3

Determinarea PAPP-A impreuna cu free beta-HCG in trimestrul I de sarcina (saptamanile 1013+6 zile de sarcina) detecteaza sindromul Down in aproximativ 63% din cazuri. Daca la cei 2 parametri se adauga marimea translucentei nucale (masurata ecografic intr-un centru specializat), rata de detectie a sindromului Down poate atinge 86% (rata de rezultate fals pozitive fiind de 5%). Astfel, aceasta evaluare combinata biochimica si ecografica devine mai eficienta decat screening-ul de trimestru II (triplu test). Pentru celelalte aneuploidii fetale rata de detectie prin screening-ul combinat este de aproximativ 90%, la o rata de rezultate fals-pozitive de 1%1;3;4. Osul nazal Osul nazal fetal poate fi vizualizat ecografic in intervalul 11-13+6 saptamani de sarcina. Mai multe studii au demonstrat ca lipsa de vizualizare a osului nazal in aceasta perioada se asociaza cu un risc crescut de sindrom Down si de alte aneuploidii. Intr-un studiu care a inclus 15822 fetusi, al caror profil a fost examinat cu succes in 97.4% din cazuri, 1.4% din fetii normali au prezentat absenta osului nazal, in timp ce aceasta modificare a fost constatata la 69% dintre fetii cu sindrom Down. La fetii cu trisomie 18 osul nazal este absent in aproximativ 50% din cazuri, iar la cei cu trisomie 13 in ~ 30% din cazuri. Evaluarea osului nazal a fost inclusa in unele algoritme de screening in primul trimestru de sarcina, insa este esential ca aceasta sa fie efectuata de catre specialisti in ecografie cu experienta. Atunci cand acest parametru se adauga la screening-ul combinat rata de detectie a sindromului Down este de peste 95%, la o rata de rezultate fals-pozitive de 5%3;4. Sarcina multipla Poate rezulta prin doua mecanisme: -fertilizarea a mai mult de un ovocit: sarcini polizigote, cu feti diferiti din punct de vedere genetic; -divizarea unei singure mase embrionice cu formarea de doi sau mai multi fetusi identici din punct de vedere genetic:sarcini monozigote. In toate sarcinile polizigote fiecare embrion isi dezvolta propriul amnios, corion si placenta; in sarcinile monozigote splitarea embrionului in primele 3 zile de la fertilizare da nastere la o sarcina diamniotica dicorionica, in zilele 3-9 rezulta o sarcina diamniotica monocorionica, in zilele 9-12 se va forma o sarcina monoamniotica monocorionica, iar dupa 12 zile divizarea embrionului va genera siamezi. Screening-ul aneuploidiilor fetale in sarcinile multiple continua sa reprezinte o provocare datorita datelor limitate si utilizarii in principal a modelelor matematice. Screening-ul bazat pe parametri serici poate fi dificil de interpretat in sarcinile gemelare deoarece nivelul biomarkerilor la un fat normal poate masca rezultatele anormale la un fat afectat; din acest motiv screening-ul nu poate fi aplicat la sarcini cu mai mult de doi feti. In sarcinile dizigote riscul initial al mamei (legat de varsta) de anomalii fetale pentru fiecare geaman este acelasi ca pentru sarcina unica; din acest motiv riscul ca cel putin unul din feti sa prezinte o aneuploidie este dublu comparativ cu sarcina monofetala. Avand in vedere ca rata de dizigoti creste odata cu varsta materna, proportia de sarcini gemelare cu anomalii fetale este mai mare decat in sarcinile unice. In sarcinile monozigote riscul de anomalii cromozomiale este acelasi ca in sarcinile monofetale; in marea majoritate a cazurilor ambii feti sunt afectati. Deoarece proportia relativa de gemeni dizigoti comparativ cu cei monozigoti in populatia caucaziana este de aproximativ 2:1, prevalenta anomaliilor cromozomiale ce afecteaza cel putin un fat este de 1.6 ori mai mare decat cea corespunzatoare sarcinilor unice. In cazul sarcinilor duble este important sa se faca distinctia ecografica intre sarcinile monocorionice (monoamniotice sau diamniotice) si dicorionice. Pe baza corionicitatii se pot face estimari mai precise in legatura cu posibila afectare a unuia sau ambilor feti. Astfel, in cazul sarcinilor monocorionice ambii feti vor fi afectati, iar riscul este similar celui din sarcinile unice. Daca sarcina este dicorionica, riscul discordantei pentru o anomalie cromozomiala este aproape dublu comparativ cu sarcina unica, in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati poate fi derivat din ridicarea la patrat a riscului pentru sarcina unica. De exemplu, o femeie de 40 4

ani are un risc initial de 1:100 de a prezenta o sarcina cu sindrom Down; in cazul unei sarcini gemelare dizigote riscul ca unul din feti sa fie afectat este de 1:50 (1:100 + 1:100), in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati este de 1:10000 (1:100 x 1:100). In realitate, aceasta este o simplificare, deoarece, spre deosebire de sarcinile monocorionice care sunt intotdeauna monozigote, sarcinile dicorionice sunt dizigote in numai 90% din cazuri. In sarcinile cu doi gemeni, valorile mediane pentru markerii serici materni sunt aproape duble comparativ cu sarcinile monofetale. Daca in evaluarea riscului se utilizeaza numai translucenta nucala, rata de detectie a sindromului Down in sarcinile dicorionice este similara celei din sarcinile unice (~75% la o rata de rezultate fals pozitive de 5% per fat sau de 10% per sarcina); riscurile individuale pentru trisomia 21 sunt calculate separat pentru fiecare fat pe baza NT si a varstei materne. Un avantaj important al screening-ului pe baza NT in sarcinile dicorionice este acela ca, in cazul unei discordante pentru o anomalie cromozomiala, examenul ecografic permite identificarea corecta a fatului afectat. In cazul sarcinilor monocorionice rata rezultatelor fals pozitive la screening-ul prin NT este mai mare decat in sarcinile dicorionice 8 % per fat sau 14% per sarcina; riscul de trisomie 21 este calculat pentru fiecare fat pe baza NT si a varstei materne, dupa care riscul mediu intre cei doi feti este considerat ca fiind riscul global asociat cu sarcina respectiva4;5. Screening-ul combinat (markeri serici si NT) al sarcinilor gemelare poate identifica 85-90% din cazurile de trisomie 21 la o rata de rezultate fals pozitive dubla fata de sarcina unica (10%). Corionicitatea nu este asociata cu diferente semnificative ale valorilor markerilor serici in primul trimestru de sarcina3;4. Un studiu retrospectiv care a inclus sarcini duble a aratat ca adaugarea evaluarii osului nazal la screening-ul combinat de prim trimestru creste rata de detectie a sindromului Down la 8789%3. Programul LifeCycle nu considera sarcina dubla ca pe o covariabila pentru care este necesar sa se faca o corectie a MoMs. Deoarece toate studiile publicate indica faptul ca deviatiile standard si coeficientii de corelare in sarcinile duble, asociate sau nu cu anomalii fetale, sunt aceleasi ca pentru sarcinile monofetale programul utilizeaza acesti parametrii pentru sarcinile unice in calculul de risc pentru sarcinile gemelare5. In cazul sarcinilor cu mai mult de doi feti numai masurarea translucentei nucale poate fi utilizata pentru estimarea riscului de aneuploidii fetale3. Screening-ul efectuat in primul trimestru de sarcina ofera posibilitatea unei evaluari precoce si, in cazul unor rezultate pozitive, optiunea unui diagnostic precoce printr-un examen citogenetic efectuat din vilozitatile coriale1. Intr-un studiu multicentric efectuat in SUA care a inclus un numar foarte mare de femei gravide si care a comparat screening-ul de prim trimestru cu cel de al doilea trimestru (studiul FASTER First-and Second-Trimester Evaluation of Risk), s-a constat ca in trimestrul I rata de detectie a sindromului Down este putin mai mare in comparatie cu trimestrul II (83%, versus 81%). In Marea Britanie au fost raportate rezultate similare in urma studiului SURUSS (Serum, Urine and Ultrasound Screening Study). Rate de detectie mai mari au fost obtinute la femeile 35 ani, dar cu mai multe rezultate fals-pozitive la testele screening3. Studiul FASTER a aratat de asemenea ca pe baza screening-ului combinat din primul trimestru de sarcina pot fi identificate 78% din sarcinile complicate cu trisomie 18, 13, sindrom Turner sau triploidie, in comparatie cu o rata de detectie de 69% obtinuta pe baza screening-ului de trimestru II, la o rata de rezultate fals-pozitive de 6% si, respectiv, 8.9%2. Pe langa dublu si triplu test, mai exista o metoda de screening prenatal denumita test integrat, care combina informatiile furnizate de markerii serici efectuati in primul si in al doilea trimestru de sarcina. Odata ce toate masuratorile devin disponibile in trimestrul II, programul LifeCycle va calcula un singur risc3;5. Cu aceasta metoda rata de detectie a sindromului Down poate creste la 94-96% (conform studiilor FASTER si SURUSS), ratele variind in functie de varsta gestationala, cu o rata de 2% rezultate fals pozitive3. Pentru trisomia 18 se preconizeaza o rata de detectie de 90% cu ajutorului testului integrat, la o rata de numai 0.1% rezultate fals pozitive1. Screening-ul independent efectuat atat in primul cat si in cel de-al doilea trimestru este descurajat, deoarece rata rezultatelor fals-pozitive este inacceptabil de mare3. 5

Pregatire pacienta jeun (pe nemancate) sau postprandial; pacientele/medicii trimitatori vor completa obligatoriu fisa de calcul de risc prenatal (ce include date clinice materne si date ecografice: lungimea cranio-caudala, marimea translucentei nucale, prezenta/absenta osului nazal). Inaintea efectuarii testului pacientele trebuie sa fie obligatoriu informate asupra investigatiei dublu test, precum si asupra riscului de rezultate fals-pozitive si fals-negative5. Specimen recoltat sange venos5. Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator5. Cauze de respingere a probei specimen intens hemolizat5. Prelucrare necesara dupa recoltare se separa serul prin centrifugare5. Volum proba minim 2 mL ser5. Stabilitate proba serul separat este stabil: - pentru PAPP-A: 24 ore la 2-8C; 2 luni la -20C; - pentru free beta-HCG: 6 zile la 2-8C; timp indelungat la -20C; nu decongelati/recongelati5. Metode pentru markerii serici: metoda imunofluorimetrica (time-resolved fluoroimmunoassay); pentru marcare este utilizat europiu cu proprietati unice de fluorescenta; pentru calcul de risc: programul Wallac LifeCycleTM (Perkin Elmer) in asociere cu Elipse Screening Engine5. Valori de referinta Sunt utilizate urmatoarele cut-off-uri pentru definirea unui screening normal: Anomalie fetala Sindrom Down Trisomie 18 Trisomie 13 Cut-off (limita de risc) 1/250 1/100 1/100

Pentru celelalte aneuploidii este utilizat un cut-off de 1/1002. Interpretarea rezultatelor Risc scazut: valoarea riscului calculat este sub cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc scazut nu ofera garantia absentei sindromului Down, trisomiei 18 sau 13. Risc crescut: valoarea riscului calculat depaseste cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc crescut nu stabileste diagnosticul de trisomie 21, 18 sau 13, ci impune necesitatea efectuarii unor investigatii suplimentare4;5. Limite si interferente Dublul test nu reprezinta o metoda de diagnostic. In cazul obtinerii unui risc crescut de anomalii fetale la nastere, medicul obstetrician va hotari oportunitatea efectuarii de investigatii suplimentare, inclusiv teste diagnostice cum ar fi analiza citogenetica prin prelevarea de vilozitati coriale (trimestrul I) sau amniocenteza (trimestrul II). Riscurile calculate depind de acuratetea informatiilor furnizate de pacienta/medic trimitator5. Bibliografie 1. Andrew R.MacRae, Jacob A.Canick. Maternal Prenatal Screening for Fetal Defects. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Ann M.Gronowski. Humana Press, USA, Ed. 2004, 105-120. 2. Breathnach, Fionunuala M, et al. First-and Second-Trimester Screening: Detection of Aneuploides Other Than Down Syndrome. In Obstetriics & Gynecology, September 2007, volume 110, pp 651-657. 3. Deborah A. Driscoll, Susan Gross. Prenatal Screning for Aneuploidy. In N Engl J Med 2009; 360-2556-2562. 4. Kypros H. Nicolaides. The 11-13+6 weeks Scan. Fetal Medicine Foundation, London, 2004. www.fetalmedicine.com. Reference Type: internet Communication. 5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog. 6

Triplu test (screening prenatal trim.II)

Articol scris in Markeri endocrini, Screening prenatal anomalii fetale pe 13 august 2009 Informatii generale si recomandari Screening-ul markerilor serici materni a devenit un instrument important in randul obstetricienilor, in scopul identificarii sarcinilor cu risc crescut pentru anumite anomalii fetale. Desi datele actuale considera ca primul trimestru de sarcina reprezinta o optiune de screening mai eficienta decat screening-ul prenatal in trimestrul II, acesta din urma este necesar pentru: evaluarea riscului de defect de tub neural; femeile gravide care se adreseaza mai tarziu medicului obstetrician; pentru efectuarea testului integrat, care combina informatiile furnizate de markerii serici efectuati in primul si in al doilea trimestru de sarcina. Screening-ul consta in determinarea serica a unor analiti produsi de fat si placenta; valorile obtinute pentru acesti markeri impreuna cu unele date clinice materne (varsta materna, varsta gestationala, greutate, rasa, status diabetic, fumat, numarul fetilor, reproducerea asistata) sunt folosite intr-un model matematic complex (realizat cu ajutorul unor programe speciale de calculator) pentru a furniza un risc calculat2. Laboratorul stabileste un cut-off (limita) pentru fiecare anomalie; obtinerea unui risc crescut indica faptul ca valoarea obtinuta depaseste cut-off-ul stabilit, dar nu are valoare diagnostica, ci mai degraba indica oportunitatea efectuarii unor investigatii suplimentare1;4;5. Screening-ul efectuat in trimestrul II de sarcina difera in functie de numarul markerilor investigati: triplu test (AFP, estriol, HCG) sau cvadruplu test (AFP, estriol, HCG, inhibina A). In laboratorul nostru, investigatia cunoscuta sub numele de triplu test include: -determinarea a trei markeri serici materni: AFP, free-beta HCG si estriol neconjugat; -calculul MoM (multiplu de mediana) pentru fiecare marker (se imparte valoarea obtinuta la mediana corespunzatoare varstei gestationale); -corectarea MoM in functie de covariabilele materne; -riscul de sindrom Down la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei trei markeri si a varstei materne la nastere); -riscul de defect de tub neural la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru AFP); -riscul de trisomie 18 la nastere (calculat pe baza MoM corectat pentru fiecare din cei trei markeri si a varstei materne); -risc pentru alte aneuploidii fetale (trisomie 13, sindrom Turner, triploidie) sau pentru sindromul Smith-Lemli-Opitz (SLOS) in cazul in care medicul trimitator/pacienta informeaza laboratorul despre existenta unei sarcini anterioare cu un anumit tip de anomalie fetala; 7

-calcularea MoM corectata pentru fiecare parametru seric si a riscurilor de aneuploidii fetale la nastere este efectuata de programul LifeCycle versiunea 3.03. AFP este o proteina sintetizata in principal de ficatul fetal. Concentratia AFP in cursul sarcinii creste progresiv, de la un nivel de 0.2 ng/mL pana la aproximativ 250 ng/mL in saptamana 32 de gestatie. Nivelurile (MoM) AFP sunt mai mari in sarcinile asociate cu defecte de tub neural (anencefalie, spina bifida deschisa, encefalocel) si in medie mai scazute in prezenta sindromului Down, a trisomiei 18 si a trisomiei 13. Estriolul neconjugat este produs de unitatea feto-placentara; nivelul sau in serul matern creste progresiv in cursul sarcinii si este tipic scazut in sarcinile asociate cu sindrom Down si trisomie 18. Estriolul este de asemenea scazut in sarcinile asociate cu sindrom Smith-LemliOpitz (sindrom caracterizat prin retard mintal si anomalii congenitale multiple ce are la baza un defect major in sinteza colesterolului), anencefalie fetala, sindrom Turner, hidrops fetal. Free beta-HCG subunitatea beta libera a HCG este considerat a fi un marker mai relevant decat molecula de HCG intact si in trimestrul II de sarcina. In sarcinile asociate cu sindrom Down, nivelurile de free beta-HCG sunt >2 MoM. Valorile sunt de asemenea mult crescute in triploidia de origine paterna. In sindromul Turner nivelul de free beta-HCG este normal. In prezenta trisomiei 18 sau 13 precum si a triploidiei de origine materna concentratiile de free beta-HCG sunt considerabil scazute. Pentru a obtine o standardizare atat pentru varsta gestationala cat si pentru diferentele sistematice intre populatii, laboratoare si metode de lucru, valorile obtinute la markerii serici vor fi exprimate ca MoM (multipli de mediana). MoM pentru un marker se obtine prin impartirea valorii masurate la mediana corespunzatoare varstei gestationale la care s-a efectuat determinarea, mediana ce este specifica populatiei din care face parte persoana testata si metodei de lucru utilizata in laborator4;5. Estimarea varstei gestationale Este efectuata de catre programul LifeCycle pe baza parametrilor ecografici (diametru biparietal BPD, lungimea femurului FL, circumferinta craniana HC, circumferinta abdominala, varsta gestationala medie stabilita ecografic) si este exprimata in saptamani + zile; data ultimei menstruatii este introdusa de asemenea in program, insa in cazul unei discrepante intre varsta gestationala calculata ecografic si cea determinata pe baza ultimei menstruatii (ca urmare a unui ciclu menstrual neregulat) este luata in considerare cea stabilita pe baza masuratorilor ecografice5. Datele materne Varsta materna Riscul pentru trisomiile fetale (13, 18, 21) creste odata cu varsta mamei. Riscul initial (prior risk) pentru o anomalie fetala se refera la prevalenta la nastere a defectului respectiv, specifica unei anumite varste materne; riscul este calculat pe baza unei formule ce ia in considerare prevalentele specifice varstei in diferite populatii. Pentru defectele de tub neural nu se raporteaza riscul initial, legat de varsta materna. Sarcini anterioare afectate de aneuploidii fetale sau defecte de tub neural Riscul pentru trisomii al unei femei care a avut in antecedente un fat sau un copil cu trisomie este mai mare decat riscul de varsta. Daca anomalia detectata la o sarcina anterioara a aparut de novo (ca urmare a unei nondisjunctii meiotice), riscul de varsta este ajustat cu un factor aditiv configurabil. Pentru sindromul Down factorul este pre-configurat in programul LifeCycle si este derivat din metaanaliza unor date combinate provenite de la 3983 sarcini, dintre care 28 au fost asociate cu sindrom Down (Cuckle, Arbuzova 2001). Riscul este mult mai mare in cazul in care anomalia fetala a fost mostenita; deoarece riscul este strans corelat cu modul de transmitere, programul LifeCycle nu poate furniza o estimare a riscului in acest caz4;5. La persoanele ce au prezentat in antecedente o sarcina afectata de defecte de tub neural se inregistreaza o recurenta de 2-3%. Aceasta informatie este luata in considerare in calculul riscului de defecte de tub neural. 8

Covariabile materne Fiecare MoM va fi corectat pentru fiecare din covariabilele prezentate mai jos, atunci cand sunt furnizate informatii despre acestea. Valoarea MoM va fi impartita la un factor egal cu mediana MoM pentru sarcinile neafectate asociata cu covariabila respectiva. Aceste ajustari presupun ca efectul covariabilei asupra nivelului marker-ului nu este diferit in sarcinile afectate comparativ cu cele neafectate. Greutatea materna Concentratia markerilor serici este influentata de greutatea materna. Femeile cu greutate mai mare au un volum sanguin crescut, care dilueaza concentratia analitilor. Greutatea materna este folosita pentru a ajusta matematic concentratia markerilor la diferentele in volumul sanguin. Presupunerea ca variatia MoM cu greutatea este proportional similara atat in sarcinile afectate cat si in cele neafectate este sustinuta de un studiu efectuat de Wald si Cuckle (1987) care a inclus 51 sarcini cu sindrom Down si 3000 sarcini normale. Valoarea MoM pentru o greutate data deriva printr-o analiza de regresie a femeilor care se prezinta pentru invetigatii de rutina. Factorul de corectie este specific unei anumite populatii deoarece depinde de distributia greutatii intr-o populatie. Greutatea materna este utilizata si pentru a ajusta AFP MoM in screening-ul pentru defectele de tub neural. Diabetul zaharat insulino-dependent In medie, concentratiile celor 3 markeri serici sunt mai mici la femeile diabetice. Prezenta diabetului zaharat insulino-dependent se asociaza cu un risc de de 10 ori mai mare de defecte de tub neural. Datorita acestei combinatii de risc crescut de defecte de tub neural si un nivel mai scazut de AFP seric, pentru a se asigura aceeasi rata de detectie, programul ajusteaza MoM in functie de statusul diabetic. Fumatul Fumatul influenteaza concentratia markerilor serici si poate afecta performanta screeningului. Astfel la femeile fumatoare concentratiile AFP sunt mai mari cu 5%, nivelurile de estriol sunt mai mici cu 4%, iar concentratiile de HCG sunt mai scazute cu 20%. Din acest motiv, programul ajusteaza MoM in functie de statusul fumatoare/nefumatoare1;2. Originea etnica (rasa) Exista variatii ale medianelor pentru unul sau mai multi markeri serici in functie de grupul etnic la care apartine mama, de aceea programul va tine cont de aceasta informatie. Reproducerea asistata Studiile au aratat ca nivelul markerilor serici este modificat in sarcinile obtinute prin reproducere asistata. Din acest motiv este necesar ca medicul trimitator sa furnizeze date cu privire la procedura aplicata: fertilizare in vitro (IVF), transferul intrafalopian al zigotului (ZIFT), transferul intrafalopian al gametului (GIFT), injectarea intracitoplasmatica a spermatozoizilor (ICSI) etc. De asemenea va fi precizata data extractiei si data transferului ovulului5. In mod tipic sarcinile obtinute prin fertilizare in vitro se caracterizeaza prin niveluri HCG mai mari si concentratii de estriol mai mici. Riscul final (posterior risk) este estimat de catre programul LifeCycle din riscul initial si valorile markerilor serici pe baza unui model gaussian standard sau a unui model log gaussian. Astfel, pentru fiecare marker (exprimat ca MoM) se va stabili daca distributia in sarcinile afectate si cele neafectate este de tip gaussian sau log-gaussian. Pentru un singur marker, metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul de probabilitate pentru acel marker (calculat prin impartirea procentului de feti cu anomalii cromozomiale la procentul de feti normali, avand acea valoare a markerului: likelihood ratio). Pentru mai mult de un marker distributiile sunt multidimensionale si includ corelatii intre fiecare pereche de markeri. Metoda este echivalenta multiplicarii riscului initial cu raportul global de probabilitate derivat din distributiile multidimensionale4;5. Sarcina multipla 9

Poate rezulta prin doua mecanisme: -fertilizarea a mai mult de un ovocit: sarcini polizigote, cu feti diferiti din punct de vedere genetic; -divizarea unei singure mase embrionice cu formarea de doi sau mai multi fetusi identici din punct de vedere genetic:sarcini monozigote. In toate sarcinile polizigote fiecare embrion isi dezvolta propriul amnios, corion si placenta; in sarcinile monozigote splitarea embrionului in primele 3 zile de la fertilizare da nastere la o sarcina diamniotica dicorionica, in zilele 3-9 rezulta o sarcina diamniotica monocorionica, in zilele 9-12 se va forma o sarcina monoamniotica monocorionica, iar dupa 12 zile divizarea embrionului va genera siamezi. Screening-ul aneuploidiilor fetale in sarcinile multiple continua sa reprezinte o provocare datorita datelor limitate si utilizarii in principal a modelelor matematice. Screening-ul bazat pe parametri serici poate fi dificil de interpretat in sarcinile gemelare deoarece nivelul biomarkerilor la un fat normal poate masca rezultatele anormale la un fat afectat; din acest motiv screening-ul nu poate fi aplicat la sarcini cu mai mult de doi feti. In sarcinile dizigote riscul initial al mamei (legat de varsta) de anomalii fetale pentru fiecare geaman este acelasi ca pentru sarcina unica; din acest motiv riscul ca cel putin unul din feti sa prezinte o aneuploidie este dublu comparativ cu sarcina monofetala. Avand in vedere ca rata de dizigoti creste odata cu varsta materna, proportia de sarcini gemelare cu anomalii fetale este mai mare decat in sarcinile unice. In sarcinile monozigote riscul de anomalii cromozomiale este acelasi ca in sarcinile monofetale; in marea majoritate a cazurilor ambii feti sunt afectati. Deoarece proportia relativa de gemeni dizigoti comparativ cu cei monozigoti in populatia caucaziana este de aproximativ 2:1, prevalenta anomaliilor cromozomiale ce afecteaza cel putin un fat este de 1.6 ori mai mare decat cea corespunzatoare sarcinilor unice. In cazul sarcinilor duble este important sa se faca distinctia ecografica intre sarcinile monocorionice (monoamniotice sau diamniotice) si dicorionice. Pe baza corionicitatii se pot face estimari mai precise in legatura cu posibila afectare a unuia sau ambilor feti. Astfel, in cazul sarcinilor monocorionice ambii feti vor fi afectati, iar riscul este similar celui din sarcinile unice. Daca sarcina este dicorionica, riscul discordantei pentru o anomalie cromozomiala este aproape dublu comparativ cu sarcina unica, in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati poate fi derivat din ridicarea la patrat a riscului pentru sarcina unica. De exemplu, o femeie de 40 ani are un risc initial de 1:100 de a prezenta o sarcina cu sindrom Down; in cazul unei sarcini gemelare dizigote riscul ca unul din feti sa fie afectat este de 1:50 (1:100 + 1:100), in timp ce riscul ca ambii feti sa fie afectati este de 1:10000 (1:100 x 1:100). In realitate, aceasta este o simplificare, deoarece, spre deosebire de sarcinile monocorionice care sunt intotdeauna monozigote, sarcinile dicorionice sunt dizigote in numai 90% din cazuri. In sarcinile cu doi gemeni, valorile mediane pentru markerii serici materni sunt aproape duble comparativ cu sarcinile monofetale. Atunci cand aceasta constatare este luata in considerare in modelul matematic de calculare a riscurilor, se estimeaza ca screening-ul in trimestrul II al sarcinilor gemelare poate detecta 45% dintre fetii afectati, la o rata de rezultate fals-pozitive de 5%1;2. Programul LifeCycle nu considera sarcina dubla ca pe o covariabila pentru care este necesar sa se faca o corectie a MoMs. Deoarece toate studiile publicate indica faptul ca deviatiile standard si coeficientii de corelare in sarcinile duble, asociate sau nu cu anomalii fetale, sunt aceleasi ca pentru sarcinile monofetale, programul utilizeaza acesti parametri pentru sarcinile unice in calculul de risc pentru sarcinile gemelare3. In sarcina dubla valoarea cut-off pentru screening-ul defectelor de tub neural este de 4.5-5 MoM4. Momentul testarii Triplul test poate fi efectuat intre saptamanile 14 si 21 de sarcina, totusi trebuie tinut cont de faptul ca in saptamana 14 nu este furnizat riscul pentru defectele de tub neural; perioada optima este intervalul 16-18 saptamani3;5. 10

Pregatire pacienta - jeun (pe nemancate) sau postprandial; pacientele/medicii trimitatori vor completa obligatoriu fisa de calcul de risc prenatal (care include datele clinice materne, masuratorile ecografice si varsta gestationala medie determinata ecografic). Inaintea efectuarii testului pacientele trebuie sa fie obligatoriu informate asupra investigatiei triplu test, precum si asupra riscului de rezultate fals-pozitive si fals-negative3. Specimen recoltat - sange venos3. Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator3. Volum proba minim 2 mL ser3. Cauze de respingere a probei specimen intens hemolizat3. Stabilitate proba serul separat este stabil: - pentru AFP: 7 zile la 2-8C; timp indelungat la -20C sau la -70C; - pentru estriol neconjugat: 5 zile la 2-8C; 6 luni la -20C; - pentru free beta-HCG: 6 zile la 2-8C; timp indelungat la -20C; nu decongelati/recongelati3. Metode pentru markerii serici: metoda imunofluorimetrica (time-resolved fluoroimmunoassay); pentru marcare este utilizat europiu cu proprietati unice de fluorescenta; pentru calcul de risc: programul Wallac LifeCycleTM (Perkin Elmer) in asociere cu Elipse Screening Engine3. Valori de referinta Sunt utilizate urmatoarele cut-off-uri pentru definirea unui screening normal: Anomalie fetala Sindrom Down Defect de tub neural Trisomie 18 Cut-off (limita de risc) 1/250 2.5 MoM AFP 1/100

Pentru celelalte anomalii fetale este utilizat un cut-off de 1/1003. Interpretarea rezultatelor Sindromul Down si trisomia 18 Risc scazut: valoarea riscului calculat este sub cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc scazut nu ofera garantia absentei sindromului Down sau a trisomiei 18. Rata de detectie a sindromului Down este de 63% pentru cazurile in care varsta gestationala s-a calculat pe baza datei ultimei menstruatii si de 70% pentru situatiile in care s-au luat in calcul datele ecografice. Pentru trisomia 18 se raporteaza o rata de detectie de 60-80%4;5. Risc crescut: valoarea riscului calculat depaseste cut-off-urile stabilite. Obtinerea unui risc crescut nu stabileste diagnosticul de trisomie 21 sau 18, ci impune necesitatea efectuarii unor investigatii suplimentare (amniocenteza si analiza cromozomiala). Se raporteaza o incidenta de 5% rezultate fals pozitive pentru sindromul Down si de 0.2% pentru trisomia 18. Alte explicatii pentru un risc crescut: calcularea eronata a varstei gestationale, variatii normale sau prezenta altor anomalii cromozomiale3;5. Defectele de tub neural Risc scazut: valoarea MoM calculata pentru AFP este sub cut-off-ul de 2.5 MoM AFP. Obtinerea unui risc scazut nu ofera garantia absentei defectelor de tub neural. La cut-off-ul de 2.5 MoM AFP, rata de detectie a defectelor deschise de tub neural este de aproximativ 7580%4;5. Risc crescut: valoarea MoM calculata pentru AFP depaseste cut-off-ul de 2.5 MoM AFP. Obtinerea unui risc crescut nu stabileste diagnosticul de defect deschis de tub neural ci impune necesitatea efectuarii unor investigatii suplimentare. Se raporteaza o incidenta de 3% rezultate fals pozitive. Alte explicatii pentru un risc crescut: calcularea eronata a varstei gestationale, variatii normale, sarcina multipla, anomalii cromozomiale, anomalii structurale ale placentei, defecte de perete abdominal, sangerare recenta materno-placentara. Se recomanda repetarea AFP in situatiile in care varsta gestationala este <19 saptamani, iar MoM AFP este >2.5 dar <3.5, in absenta altor cauze. Investigatiile suplimentare includ: sfat genetic, ecografie si amniocenteza pentru analiza cromozomiala si determinarea AFP in 11

lichidul amniotic. Daca dupa efectuarea acestor proceduri, nu se gaseste o explicatie pentru valorile AFP crescute, acestea indica un risc crescut de complicatii obstetricale: ruptura de membrane si nastere prematura, preeclampsie, intarzierea cresterii intrauterine si nastere de fat mort5. Limite si interferente Triplul test nu reprezinta o metoda de diagnostic. In cazul obtinerii unui risc crescut de anomalie fetala la nastere, medicul obstetrician va hotari oportunitatea efectuarii de investigatii suplimentare. inclusiv teste diagnostice cum ar fi amniocenteza si analiza citogenetica din lichidul amniotic. Riscurile calculate depind de acuratetea informatiilor furnizate de pacienta/medic trimitator1;3. Bibliografie 1. Ann M.Gronowski. Prenatal Screening for Fetal Defects. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Totowa, NJ: Humana Press, Ed. 2004, 93-99. 2. Deborah A. Driscoll, Susan Gross. Prenatal Screning for Aneuploidy. In N Engl J Med 2009; 360-2556-2562. 3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog. 4. Mayo Reference Services Publication. Communiqu. Maternal Serum Quad Screen: Review of Testing and Clinical Application. 5. Quest Diagnostics. Prenatal Screening and Diagnosis of Neural Tube Defects, Down Syndrome, and Trisomy 18. Clinical Focus.www.questdiagnostics.com. Reference Type: Internet Communication.

12