Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Ghid Practic de Parazitologie PDF
Ghid Practic de Parazitologie PDF
Ghid Practic de Parazitologie PDF
(CALILAB)
GHID PRACTIC
DE
PARAZITOLOGIE MEDICALĂ
Autori
Popa Constanţa
Cuprins
Capitolul 1
Capitolul 2
Artefacte .......................................................................................83
2
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Capitolul 3
Managementul calităţii
Bibilografie
3
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Conform art. 11, alin. 3), SECŢIUNEA a 6-a, OMS 1301 din 2007 spaţiul şi condiţiile de mediu necesare
funcţionării compartimentului de microbiologie - parazitologie în cadrul laboratorului de analize medicale
sunt :
„încăpere în care pot coexista bacteriologia, virusologia şi parazitologia” ;
“pentru laboratoarele de analize medicale cu compartiment de microbiologie, spaţiu destinat sterilizării,
care trebuie să conţină minimum o autoclavă. Se recomandă utilizarea a două autoclave situate în
încăperi diferite, una destinată sterilizării materialelor infectate şi alta destinată sterilizării produselor şi
materialelor curate care urmează a fi utilizate sterile.
Când există o singură autoclavă, aceasta se va utiliza în cicluri alternative, fără a se amesteca
materialele infectate cu cele destinate a fi utilizate sterile;”
4
Ghid practic de Parazitologie Medicală
SECŢIUNEA a 7-a OMS 1301 din 2007 descrie dotarea laboratorului de analize medicale pe
compartimente de activitate; dotarea compartimentului de mecrobiologie – parazitologie este descrisă la
anexa 4 lit C.
”(3) Dotarea minimă obligatorie cu echipamente, necesară autorizării de funcţionare a laborator de
analize medicale, este prevăzută în anexele nr. 3 şi 4.
C. Microbiologie:
2. Lampă UV
3. Balanţă
4. Termostat (cu temperatură reglabilă)
5. Microscop binocular
6. Lupă de laborator
7. Frigider
8. Congelator (prevăzut cu încuietoare)
9. Baie de apă cu temperatură reglabilă
10. pH-metru sau indicator pH
11. Bec de gaz
12. Etuvă
13. Autoclavă
14. Anse bacteriologice
15. Pipete automate
16. Termometre
17. Instalaţie de apă purificată*)
18. Sistem de etalonare a inoculului pentru antibiogramă.”
În OMS 1301 din 2007 , secţiunea a 4-a, Servicii medicale efectuate în cadrul laboratorului de analize
medicale , art. 7 se precizează că:
”(1) În cadrul laboratorului de analize medicale se pot efectua analize de parazitologie, se poate
acorda consultanţă privind interpretarea rezultatelor investigaţiilor efectuate şi ale eventualelor
investigaţii ulterioare necesare.
(3) Laboratorul de analize medicale întocmeşte, menţine actualizată şi afişează lista serviciilor
medicale pe care le efectuează.”
Lista serviciilor medicale pe care le efectuează laboratorul de analize medicale în cadrul
compartimentului de microbiologie parazitologie constau în:
5
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Capitolul 2
Examenul coproparazitologic
Reprezintă examinarea materiilor fecale pentru identificarea diferitelor specii de paraziți: chiști de
protozoare, trofoziti, ouă de helminti, larve mobile.
Pentru un diagnostic corect este foarte importantă dubla examinare a probei de materii fecale:
macroscopică și microscopică.
Examenul macroscopic oferă date despre aspectul, consistența, culoarea bolului fecal precum și a
fragmentelor de paraziți sau chiar a indivizilor întregi (Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides,
proglote de Taenia spp.), date importante în anamneza pacientului.
Dupa consistență materiile fecale pot fi: formate , cu mucus și lichide.
Materiale necesare:
Coprorecoltoare cu spatulă . Coprorecoltoarele nu trebuie sa conțină mediu de transport (Carry
Blair).
Lame de microscop (de preferință cu margine mată) pentru a permite identificarea probei.
6
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Recoltarea corectă a probei se face colectând câte un fragment de materii fecale (o spatulă) din trei
locuri diferite ale bolului fecal. Proba trebuie transportată la laborator pentru examinare în cel mai scurt
timp. În cazul în care acest lucru nu este posibil, proba trebuie stocată la 2-8 grade C.
Efectuarea preparatului:
- se pune pe lamă o picătura de ser fiziologic/Lugol. Dacă este suspectată prezența trofozoiților, serul
fiziologic trebuie încălzit la 37oC.
- proba de materii fecale se omogenizează bine cu o spatulă
- Cu spatula se adaugă o cantitate mică de materii fecale în picătura de ser fiziologic/Lugol și se
amestecă foarte bine în așa fel încât preparatul să nu conțină fragmente alimentare și să fie de o
transparență care să permită citirea scrisului prin el.
- Probele prea dense nu permit o examinare corectă, deoarece fragmentele parazitare pot fi
estompate de masa de debri-uri nedigerate.
- Probele care nu au consistența corespunzătoare iar densitatea paraziților este mică pot duce la un
rezultat fals negativ.
7
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Examinarea preparatului:
- Se face la microscop (standard) utilizănd obiectivele de 10x, 40x
- Citirea lamei se face în pieptene pe orizontală și apoi pe verticală utilizându-se inițial obiectivul de
10x în așa fel încât toată suprafața lamei sa fie examinată. În cazul în care este identificat un
element posibil parazitar se comută pe obiectivul de 40x și se reglează și intensitatea luminii pentru
a putea fi observate detaliile de structura.
Rezultatul:
- Rezultatul se comunică sub forma fie POZITIV/NEGATIV fie PREZENT/ABSENT cu mențiuni
asupra speciei și a frecvenței elementului parazitar identificat.
Metode de concentrare
Sunt reacții care sunt utilizate pentru a crește acuratețea diagnosticului parazitar, deoarece utilizând
metodele de concentrare sunt puse în evidența cantități mici de elemente parazitare.
Pentru diferitele grupe de paraziți intestinali sunt utilizate metode de concentrare variate în funcție
de caracteristicile biochimice și ale ciclului biologic ale speciei respective.
Metoda flotării în soluție suprasaturată salină (Willis – Hung)
Se prepară o soluție suprasaturată de clorura de sodiu. Se introduce soluția în recipiente individuale
(cristalizoare) cu diametrul mai mare decât diagonala unei lamele. În aceste recipiente se adaugă o cantitate
(1-2g) de materii fecale, se omogenizează. Pe suprafața de lichid se pune o lamela care este lăsată să
plutească complet orizontală, timp de 40 de minute. După expirarea timpului cu ajutorul unei pense lamela
este transferată (menținându-se poziția orizontală) pe o lamă de microscop și examinată corespunzător
(obiectiv de 10x și 40x pentru detalii). Prin aceasta metodă sunt evidențiate ouăle de helminți (Ascaris,
Taenia, Trichuris, Diphyllobotrium, etc.)
Metoda formol eter
Adăugați în 10 ml formol 10% aproximativ 1g de materii fecale și amestecați până obtineți o
suspenșie relativ omogenă. Se instalează un filtru pe un tub de centrifugă (de 12 ml) și se filtrează
conținutul eprubetei cu suspensia obținută anterior până este atinsă gradația de 7 ml.
Indepărtați filtrul și aruncați conținutul lui în containerul de deșeuri cu risc biologic.
Adăugati 3 ml de eter sau eter-acetat și amestecați bine timp de un minut.
Transferați conținutul într-un tub de centrifugă și centrifugați 1 minut la 3000 r/min. Eprubeta ar trebui să
arate ca în figura următoare.
8
Ghid practic de Parazitologie Medicală
-
Metoda Baerman
Utilizați o cantitate de materii fecale 10-20g de o consistență semi-formată, nu mai vechi de 24 de
ore.
Introduce-ți o pâlnie tapetată cu hârtie de filtru într-un recipient stabil. Umpleți pâlnia cu apă
distilată incălzită la aprox.370C până aproape de limita superioară.
Introduceți materiile fecale în două straturi de tifon (10x10 cm). Sigilați preparatul cu două baghete
de lemn introduse prin colțurile tifonului și suspendați-l în lichidul din pâlnie susținându-se pe cele două
baghete.
Lăsați preparatul la 37oC (în incubator) timp de o oră sau peste noapte la temperatura camerei.
După expirarea timpului , indepărtati tifonul și scurgeți lichidul obținut păstrând sedimentul.
Mențineți recipientul în repaus pentru încă 15 minute.
Utilizați o pipeta Pasteur pentru a transfera porțiunea inferioară a sedimentului într-o cutie Petri.
Examinați sedimentul utilizând o lupă binoculară. Metoda este folosită pentru identificarea larvelor
de Strongyloides stercoralis.
Cultura pe agar
Ca o alternativă a metodei Baerman în ceea ce privește diagnosticul strongiloidozei este și
cultivarea materiilor fecale pe plăci cu agar simplu.
Materiile fecale sunt dispersate într-o zonă circulară pe placa de agar (aproximativ 2-3 cm
diametrul) și placa este stocată la temperatura camerei ferită de lumina 48 ore.
După 48 de ore este examinată pentru a observa prezența sau absența traiectelor sinusoidale
efectuate de larvele de Strongyloides stercoralis.
Metoda Ritchie
Diluați un volum de materii fecale cu 10 volume de reactiv Ritchie (100 ml formol, 9g NaCl, 900
ml AD) .
Amestecați și lăsați la sedimentat câteva secunde.
Transferați produsul obținut într-un tub de centrifugă și adaugați eterul: 1/3 eter și 2/3 amestec
(pregătit anterior).
9
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Metoda sandwich – suport solid (godeul) tapetat cu antigen specific (antigen coated microplate
well) peste care sunt adăugați anticorpii de analizat (specific human antibody) și în ultima etapă anticorpii
marcați (POD labelled anti-human antibody).
Conjugatul (anticorpii marcati - POD) este reprezentat de o fracție de imunoglobulină umană de tip
IgG conjugată cu peroxidaza. Răspunsul pozitiv este indicat de prezența culorii albastre (data de
cromogen), care se transformă în galben la adăugarea soluției de stopare. Intensitatea culorii galbene este
masurată la spectrofotometru cu o lungime de undă de 450 nm (sau diferiți în funcție de producător) și este
proporțională cu concentrația anticorpilor specifici IgG.
Microplate wells
10
Ghid practic de Parazitologie Medicală
11
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Reacția imunoenzimatică ELISA este utilizată drept metodă de screening în diagnosticarea unor
afecțiuni parazitare ca: amoebiaza (anticorpi de Entamoeba histolytica, antigen de Entamoeba histolytica),
giardioza (antigen de Giardia duodenalis), toxocaroza viscerală, echinococoza hidatică/alveolară ,
trichineloza, cisticercoza, toxoplasmoza, strongiloidoza, leishmanioza.
Western blot este o metoda de laborator utilizată pentru identificare unor proteine specifice dintr-un
amestec de proteine. Acestea sunt separate electroforetic și fixate pe o membrană nitrocelulozică (faza
solidă).
Faza solidă este reprezentată de membrana de nitroceluloză care conține extracte antigenice
separate electroforetic . Poziția proteinelor depinde de greutatea lor moleculară. Dacă proba este pozitivă,
anticorpii specifici din serul/LCR/umoarea apoasă a pacientului aderă la antigenul specific de pe
membrană.
12
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Metoda western blot este utilizată ca reacție de confirmare pentru următoarele parazitoze:
13
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri
oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).
Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in vivo, îl reprezintă
faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a
primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă
folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază).
(1) Denaturare la 94–96 °C. (2) Răcire la ~65 °C (3) Elongare la 72 °C. Linia albastră Reprezintă
matrița ADN la care primerii (sagetile roșii) se atașeaza și lanțul se extinde cu ajutorul AND polimerazei
(cercurile verde deschis) pentru a produce fragmente scurte de ADN (liniile verzi), care sunt folosite ca
matrițe în procesul de PCR.
Principalele componente ale reacţiei sunt : ADN matriţă, o ADN polimerază termostabilă, primeri
++
oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfați (dNTP), tamponul de reacţie, ioni de Mg . O reacţie PCR este
formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale: denaturarea termică
a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN), ataşarea primerilor şi polimerizarea propriu-zisă. La
terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultată este dublă faţă de
matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul urmator, astfel încât
14
Ghid practic de Parazitologie Medicală
n
numărul final de copii ADN este de 2 x y, unde y = numărul iniţial de copii, iar n = numărul de cicluri de
replicare. Este de subliniat faptul că moleculele acumulate exponenţial reprezintă copii ale matriţei care la
capete au incorporaţi primerii.
În concluzie, reacţia PCR este o metodă prin care se obţin cantităţi mari dintr-o anumită secvenţă
ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fără a fi necesară o prealabilă clonare
moleculară a acestora.
15
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Diagnosticul giardiozei
Ciclul biologic
Chisturile, forma de rezistență ale parazitului, sunt responsabile cu transmiterea acestuia. În materiile
fecale pot fi găsite ambele forme (stadii de diagnostic) . Chisturile sunt rezistente și pot supraviețui în
apa rece mai multe luni. Infecția are loc prin ingerarea chisturilor odată cu apa/hrană contaminate sau prin
infestare fecal-orală .În intestinul subțire are loc dechistarea și eliberarea trofozoiților (fiecare chist
16
Ghid practic de Parazitologie Medicală
produce 2 trofozoiți) .Trofozoiții se multiplică prin diviziune binară longitudinală ramânând în lumenul
proximal al intestinului subțire unde se află în stare liberă sau atașați de mucoasă prin discul adeziv
(ventuza) ventrală .Închistarea apare în momentul trecerii parazitului în colon. Chistul este stadiul cel mai
întâlnit în scaunele nediareice . Contaminarea directă de la om la om este posibilă și foarte probabilă
deoarece chisturile sunt infectante în momentul eliminării prin fecale.
Stadiul de diagnostic: chistul, mai rar trofozoitul.
Perioada de timp de la ingerare până la diagnostic: câteva ore.
Diagnostic:
1. Examen corpoparazitologic direct: chisturile de Giardia sunt identificate într-un preparat de materii
fecale + ser fiziologic utilizând un microscop cu obiective de 10x, respectiv 40x – pentru detalii.
2. Examenul coproparazitologic cu Lugol : evidențiază mai bine chisturile de Giardia , permițând o
identificare mai facilă a acestora, datorită faptului că în prezența Lugolului membrana chistului devine
mai refringentă.
Dezavantajul acestor două tehnici este ca dacă infestarea este foarte redusă sau chisturile sunt parțial
deteriorate, acestea pot fi ratate. De asemenea, știut este faptul, că paraziții se elimină cu intermitență,
având perioade negative alternând cu unele pozitive. De aceea un singur rezultat negativ nu prezintă
semnificație din punct de vedere diagnostic. Examenul este recomandat să fie repetat (de minimum 3
ori) la intervale de aproximativ 7-10 zile între examinări.
3. Reacția imunocromatografică: prin această metodă este pus în evidență prezența/absența antigenului
de Giardia lamblia. Reacția prezintă avantajul că detectează chiar și urmele de antigen de Giardia, iar
dacă infestația este redusă, sau chisturile distruse prezența antigenului poate fi detectată. Rezultatul
este raportat drept PREZENTE/ABSENTE antigene de Giardia duodenalis.
17
Ghid practic de Parazitologie Medicală
18
Ghid practic de Parazitologie Medicală
Diagnosticul toxoplasmozei
Ciclul biologic:
Membrii familiei Felidae (pisicile domestice și rudele lor) sunt singurele gazde definitive pentru
Toxoplasma gondii. Oochiștii nesporulați sunt eliminați în fecalele pisicii . Oochiștii sunt eliminați în
număr mare aproximativ 1-2 săptămâni. Oochiștii au nevoie de 1-5 zile în mediul extern pentru a sporula și
a deveni infectanți. Gazdele intermediare în natura (inclusiv pasări și rozătoare) sunt infectate prin prin
ingerarea solului, a plantelor sau a apei contaminate cu oochiști .Oochiștii se transformă în tachizoiți
imediat dupa ingestie. Acești tachizoiți se localizează în țesutul nervos și în cel muscular transformându-se
în chist tisular (bradizoit) Pisicile se infectează prin consumul gazdelor intermediare contaminate cu
chisturi tisulare . Pisicile se mai pot infecta și prin ingestia oochiștilor sporulați. Animalele crescute
19
Ghid practic de Parazitologie Medicală
pentru consumul uman și cele din sălbaticie pot deveni infectate cu chisturi tisulare după ingerarea
oochiștilor sporulați din mediu .Omul se poate infecta prin una din modalitățile următoare:
Consumând carne insuficient preparată termic contaminată cu chisturi tisulare .
Consumând apa sau hrana contaminată cu fecale respectiv cu probe din mediu înconjurător
contaminate (sol contaminat cu fecale, sau schimbând nisipul din lădița pisicii) ;
Transfuzii de sânge sau transplant de organe ;
Transplacentar de la mama la făt ;
În gazda umană parazitul formează chisturi tisulare, cele mai frecvente în mușchii scheletici, miocard,
creier și ochi: aceste chisturi pot persista toată viață gazdei. Diagnosticul se pune în special prin serologie;
deși chisturile tisulare pot fi observate și în produsele patologice examinate la biopsie . Diagnosticul
toxoplasmozei congenitale se pune prin identificarea ADN-ului de Toxoplasma gondii în lichidul amniotic
folosind metode de biologie moleculară (PCR) .
Diagnosticul de certitudine al toxoplasmozei este extrem de dificil de realizat mai ales în ceea privește
interpretarea lui. Fenomenul este explicat prin prezența unui mare număr de pacienți asimptomatici
(persoane sănătoase, dar cu o serologie pozitivă).
Infecția dobândită cu Toxoplasma gondii la o persoana imunocompetentă este în general asimptomatică.
În orice caz, 10-20% dintre pacienții cu o infecție acută pot dezvolta o limfadenopatie cervicală și/sau
simptome similare gripei. Cursul bolii este de obicei benign și autolimitativ. Simptomele dispar, de obicei
în decurs de câteva săptămâni până la câteva luni. În situații rare, poate apărea și afectarea oculară soldată
chiar cu pierderea vederii.
Pacienții imunodeprimați au destul de des afectare cerebrală (la nivelul sistemului nervos central),
retinocoroidite, pneumonii sau alte boli de sistem. La pacienții cu SIDA, encefalita toxoplasmică este
cauza majoră a leziunilor cerebrale masive, cauzate prin reactivarea infecțiilor cronice.
Toxoplasmoza congenitală este derivată dintr-o infecție acută (primară) dobandită de către mamă în
decursul sarcinii. Incidența și gravitatea toxoplasmozei congenitale depinde de trimestrul sarcinii în care a
avut loc infecția. Durata și momentul începerii tratamentului mamei sunt foarte importante deoarece
contribuie la reducerea sechelelor la nou născut. Sunt mulți copii nou născuți care la naștere nu prezintă
semne clinice, dar în timp pot dezvolta simptome ale toxoplasmozei congenitale.
Toxoplasmoza oculară, este una din cauzele importante ale retinocoroiditelor și poate fi rezultatul unei
infecții congenitale sau a unei infecții survenite dupa naștere. În infecțiile congenitale, pacienții sunt
asimptomatici până în a II-a sau a III-a decadă a vieții când pot dezvoltă leziunile în ochi.
Diagnosticul direct :
20
Ghid practic de Parazitologie Medicală
- Tachizoiții (trofozoiții) au aprox. 4-8µm lungime și 2-3µm lățime, cu capătul anterior turtit și cel
posterior turtit (“blunt”) , cu un nucleu mare. Pot fi gasiți în localizări multiple în corpul gazdei.
- Chistul de Toxoplasma gondii este de aprox 5-50µm diametrul. Este în mod obișnuit sferic în
țesutul cerebral și mai elongat în mușchii cardiac și scheletici.
Diagnosticul indirect :
Una din cele mai utilizate metode de screening este ELISA, fiind disponibile o varietate de kit-uri pentru
diagnosticul toxoplasmozei. Procedurile de lucru, condițiile de validare și valorile de referința diferă de la
un kit la altul în funcție de producător.
În diagnosticul toxoplasmozei este foarte important de stabilit stadiul bolii (acută sau cronică), localizarea
(oculară, ganglionară, cerebrală), precum și confirmarea supoziției prin reacțiile de confirmare disponibile
(western blot, PCR, biopșie ganglionară, etc). De asemenea este foarte important diagnosticul corect al
toxoplasmozei în cazul sarcinii. Prezența sau absența anticorpilor, interpretarea și algoritmul de diagnostic
depinzând de vârsta și evolutia sarcinii.
- Determinarea anticorpilor specifici de tip IgA, IgE sau IgM aceștia fiind markeri specifici. Un răspuns
pozitiv pentru oricare din cele trei tipuri de anticorpi generând o serie de alte reacții:
- Reacția de aviditate pentru anticorpii IgG anti-Toxoplasma gondii (cazul unei confirmări) pentru a
stabili momentul de debut al bolii (max. 20 - min. 4 săptămâni în funcție de producător)
- Confirmare western blot (IgA, IgM) – penrtru a exclude sau confirma o falsă reactivitate fată de
anticorpii specifici IgA/IgM anti Toxoplasma gondii
- Anticorpii anti-Toxoplasma gondii de tip IgM – aproximativ 1 an (uneori pot rămâne până la 24
luni postinfecție)
- Anticorpii anti-Toxoplasma gondii de tip IgA – 6-9 luni de la începutul infecției
21
Ghid practic de Parazitologie Medicală
- Western blot. Prin aceasta metodă se pun in evidență diferite benzi specifice (cu o anumită
greutate moleculară) caracteristice pentru prezența anticorpilor anti-Toxoplasma gondii. Benzile
sunt diferite in funcție de producător : 30 kDa, 31 kDa, 33 kDa, 40 kDa, 45 kDa, 150 kDa, 40 kDa
sau 20 kDa.
- Confirmare western blot (IgA, IgM, IgG) – penrtru a exclude sau confirma o falsa reactivitate față
de anticorpii specifici IgA/IgM/IgG anti Toxoplasma gondii
- PCR (clasic sau real time) permite identificarea materialului genetic de Toxoplasma gondii din
diferite produse biologice: ser, sânge, LCR, lichid amniotic, umoare apoasă. Reacția poate fi
calitativă sau cantitativă.
Reacția de confirmare
specifică Western Blot
T.g. IgA
22
Ghid practic de Parazitologie Medicală
(ser)
Pozitiv Pozitiv Negativ Negativ Infecție foarte recentă (6-9 Reacția de aviditate
luni) sau falsa reactivitate față pentru IgG anti-T.g.
de IgA/IgE anti-T.g. (pentru a stabili
momentul de debut al
infecției)*
Reacția de confirmare
specifică Western Blot
T.g. IgA
Reacția de confirmare
specifică Western Blot
T.g. IgA /IgM
23
Ghid practic de Parazitologie Medicală
24
Ghid practic de Parazitologie Medicală
III-lea de sarcină.
- aviditate scazută: indică probabilitatea infecției într-un interval de max. 4-20 săptămâni (în funcție
intervalul stabilit de producator). Dacă momentul de debut al sarcinii a fost stabilit în interiorul acestui
interval, medicul va trebui să interpreteze acest rezultat în funcție de contextul clinic al pacientei precum și
împreună cu metodele de confirmare existente (western blot, biologie moleculară - PCR). Valoarea
scăzută a aviditații nu trebuie interpretată individual. Există paciente care au un titru scăzut al avidității o
perioadă de timp chiar mai mare decât cea stabilită de producatorii kit-urilor de diagnostic.
- aviditate ridicată: indică probabilitatea infecției într-un interval mai mare de 4-20 săptămâni (în funcție
intervalul stabilit de producător). Dacă momentul de debut al sarcinii a fost stabilit în afara acestui interval
sarcina trebuie totuși monitorizată foarte atent pentru a putea înregistra o infecție nouă sau eventual
reactivarea unei infecții mai vechi.
25
Ghid practic de Parazitologie Medicală
26
Ghid practic de Parazitologie Medicală
27
Ghid practic de Parazitologie Medicală
1*- Dacă gravida prezintă simptome sugestive sau ecografia fetală arată modificări se recomandă
repetarea serologiei.
2* - Dacă rezultatele se mențin (anticorpii de fază acută IgA/IgE/IgM au fost fals pozitive) –
supravegherea ulterioară a sarcinii
28
Ghid practic de Parazitologie Medicală
29
Clasificarea nou născuților:
1. Caz în observație: nou născut cu IgG în scădere și IgA, IgE, IgM negativ la vârsta 30 de zile.
2. Suspiciune:
- nou născut cu/fără simptomatologie a cărui mamă a dezvoltat o toxoplasmoză recentă în
timpul sarcinii.
- nou născut simptome de boală: icter, limfadenopatie, hepatosplenomegalie, micro și
hidrocefalie, anemie, spasme, greutate redusă, prematur, corioretinita, calcificari cerebrale,
strabism, iridoiclita, anormalități în lichidul cefalorahidian – IgG pozitiv.
3. Caz confirmat:
- IgA/IgE/IgM pozitiv la copilul în vârsta de o săptămână;
- persistența sau chiar creșterea nivelului IgG;
- copil la care Toxoplasma gondii a fost confirmată intrauterin;
- copil cu PCR pozitiv identificat în lichidul amniotic în cursul sarcinii.
4. Suspiciune infirmată: IgA/IgE/IgM și IgG negative.
30
Diagnosticul ascaridiozei
Ciclu biologic:
Viermii adulți trăiesc în lumenul intestinului subțire. O femela poate produce aproximativ
200.000 ouă/zi, ouă care sunt eliminate prin fecale .Ouăle nefecundate ingerate nu sunt
infectante. Ouăle fecundate embrionează și devin infectante într-un interval cuprins între 18 zile
până la câteva săptămâni , în funcție de condițiile de mediu (optim: sol umed, cald și umbros).
După ce sunt înghițite ouăle infectante , larvele eclozează , penetrează mucoasa intestinală,
sunt transportate prin circulatia sistemică în plămâni .Larvele își continuă evoluția în plămâni
(10 pana la 14 zile), străpung peretele alveolar, urcă în arborele bronșic, faringe și sunt
înghițite . În momentul în care ajung în intestinul subțire ating stadiul de adult . Este necesară
o perioadă de 2 - 3 luni de la ingerarea ouălor infectante până la ovipoziția femelei adulte.
Viermii adulții pot supraviețui 1-2 ani.
Stadiul de diagnostic: ouă (fecundate/nefecundate), adulți (masculi si/sau femele).
Perioada necesară de la infecție până la diagnostic: aproximativ 2-3 luni.
31
Diagnostic:
1. Examen coproparazitologic direct: astfel pot fi identificate ouăle de Ascaris
lumbricoides.
2. Metode de concentrare: Formol-Eter, Kato, Willis Hung
3. Examen macroscopic al materiilor fecale. Identificarea indivizilor adulți de Ascaris
lumbricoides in proba adusă spre examinare.
4. Identificarea directă: este solicitată de către pacient în urma eliminării unui individ
adult de Ascaris lumbricoides. Pentru o identificare corectă se ține cont de criteriile
morfologice: aspect, dimensiune. Individul este examinat cu ajutorul unui
stereomicroscop. Este examinată extremitatea anterioară – cefalică - (cu butonul cefalic)
și extremitatea posterioară (la femele – dreaptă ascuțită, la masculi – întoarsă având
aspectul unui mâner de umbrelă – caracteristic nematodelor).
Ou fecundat Ou nefecundat
5. Teste serologice:
- HLG completă cu numărătorea eozinofilelor. Este foarte importantă deoarece se
înregistrează o creștere semnificativă a nivelului eozinofileleor în perioada de
migrarea perienterică parazitului.
- De asemenea cuantificarea nivelului anticorpilor anti IgE specifici pentru Ascaris
lumbricoides, Reprezintă un marker important care ușureaza diagnosticul. Nivelul
anticorpilor specifici anti-IgE Ascaris este crescut în perioada de migrare perienterică
a parazitului.
32
Diagnosticul enterobiazei
Ouăle sunt depuse în pliurile anale . AutoInfecția survine in urma transferării ouălor din zona
perinanală la gura cu ajutorul mâinilor murdare .De asemenea contaminarea este posibilă prin
transferul ouălelor de la o persoană la alta fie prin contact direct sau prin intermediul lenjeriei
contaminate. Enterobiaza poate fi contactată prin intermediul obiectelor contaminate cu ouă de
Enterobius. Uneori un număr mic de ouă poate fi inhalat. Acestea vor fi înghițite și vor urma
aceeași evoluție ca ouăle ingerate. Ulterior ingerării ouălor, larvele eclozează în intestin și
adulții se stabilesc în colon . Intervalul de timp de la ingerare până la depunerea ouălor de către
femelele adulte este de aproximativ o lună. Durata de viață a adulților este de aproximativ două
luni. Femelele gravide migrează noaptea prin anus și depun ouăle în pliurile anale . Larvele se
dezvoltă în interiorul ouălor (ouăle devin infectante) în condiții optime in 4-6 ore.
33
Retroinfecția, sau migrarea larvelor nou eclozate de pe tegumentul anal în rect are loc cu o
frecvența aleatorie.
Stadiul de diagnostic: ou, adult.
Perioada necesara de la infecție până la diagnostic: aproximativ o lună.
Diagnosticul enterobiozei se face prin identificarea directă a ouălor și/sau a indivizilor adulți de
Enterobius vermicularis prin:
1. Amprenta anală (scotch-test) este metoda de elecție deoarece ouăle sunt stocate în pliurile
anale și colectate cu ajutorul scotch-ului. Probabilitatea unui examen pozitiv crește direct
proporțional cu gradul infecției. Cu cit nivelul de infestare este mai mare cu atât posibilitatea
de identificare a ouălor prin amprenta anală este mai mare.
Pentru un examen corect trebuie ținut cont de mai multe aspecte. În primul rând recoltarea
trebuie facută dimineața înaintea toaletei locale și/sau a defecării. În momentul recoltării zona
perianală trebuie să fie ferită de aplicarea cremelor sau a talcului.
Pe dispozitivul de recoltare (bagheta) se fixează o bucată de scotch (suficient de lungă sa
poată fi ținută de ambele capete), transparent, cu partea adezivă la exterior. Cu acest
dispozitiv se tapetează pliurile anale astfel încât ouăle existente în această regiune să adere la
scotch. Ulterior scotch-ul este fixat cu suprafața adezivă pe o lamă de microscop, iar
surplusul este înlăturat.
Paleta are o parte adezivă care se aplică în pliurile anale. Paleta poate fi indepartată de capac și
examinată la microscop. Avantajul este că se reduce pericolul contaminării, iar posibilitatea de
transport sigur a probei crește.
34
Rezultatul este raportat: PREZENTE/ABSENTE ouă de Enterobius vermicularis în amprenta
anală, menționându-se și frecvența (rare, relativ frecvente, frecvente, numeroase).
Un prim rezultat negativ nu este definitiv, ținând cont de perioadele negative ale parazitului când
acesta nu se elimină. Sunt necesare cel puțin trei examene negative la interval de aproximativ o
săptămână unul de celălalt pentru a lua o decizie.
De asemenea amprenta anală (scotch test) este obligatoriu să fie recoltată în cabinete de
recoltare, de către personal medical calificat.
4. Identificarea directă: este solicitată de către pacient în urma recoltării de pe lenjeria intimă
și/sau de pat, dimineața a adulților de Enterobius vermicularis. Pentru o identificare corectă se
ține cont de criteriile morfologice, aspect, dimensiune, precum și de caracteristici etologice
(momentul eliminării-nocturn). Individul este pus pe o lamă de microscop, într-o picătura de
ser fiziologic și examinat la microscp utilizând obiectiv de maximum 10x (din cauza
dimensiunilor mari). Este examinată extremitatea anterioară- cefalică (cu alele laterale),
esofagul (rabditoid), corpul (prezența sau absența uterului hipertrofiat) și extremitatea
posterioară (la femele – dreapta ascuțită, la masculi – întoarsă, având aspectul unui mâner de
umbrelă – caracteristic nematodelor).
a.Extremitatea cefalică
b.Individ femel
35
c. Individ mascul
Diagnosticul stongiloidozei
36
Ciclul biologic al lui Strongyloides stercoralis este mult mai complex decât al altor nematode
deoarece cuprinde o alternanță de generații libere și parazite și posibilitatea de autoinfecție și de
multiplicare în corpul gazdei.
Generatiile libere: Larvele rabditoide eliminate în materiile fecale (vezi“Generațiile parazite”)
pot năpârli de două ori și se pot transforma în larve filariforme infectante (dezvoltare directă)
sau pot năpârli de patru ori și să se transforme în adulți liberi (masculi și femele) aceștia se
împerechează și produc ouă din care eclozează larvele rabditoide . Ulterior pot evolua în fie:
o nouă generatie de adulți liberi (precum la ), fie în larve filariforme infectante . Larvele
filariforme penetrează tegumentul gazdei pentru a iniția ciclul parazitar. Generațiile parazite:
Larvele filariforme existente în solul contaminat, penetrează tegumentul gazdei ,și sunt
transportate către plămâni unde pătrund în spațiile alveolare; sunt conduse apoi prin arborele
bronșic către faringe, apoi sunt înghițite și ajung în intestinul subțire . În intestinul subțire
larvele năparlesc de două ori și se transformă în femele adulte Femelele adulte se inserează în
epiteliul intestinal și produc ouă prin partenogeneză , din care eclozează larve rabditoide.
Larvele rabditoide fie sunt eliminate prin materiile fecale (vezi “Generațiile libere”), sau pot
cauza autoinfecția .In autoinfecție larvele rabditoide devin larve infectante, filariforme, care fie
pot penetra epiteliul intestinal (autoinfecție internă) sau tegumentul din zona perianală
37
(autoinfecție externă); în ambele situații larvele vor urma traseul descris mai sus, fiind
transportate succesiv în plămâni, arborele bronșic, faringe și intestinul subțire unde se
maturizează ajungând la stadiul de adulți. O altă posibilitate ar fi să disemineze în întregul corp
al gazdei. În cazul Strongyloides stercoralis autoinfecția reprezintă o explicație pentru existența
infecțiilor persistente mai mulți ani la persoane care nu au fost în zone endemice și hiperinfecțiile
la persoanele imunodeprimate.
39
Diagnosticul toxocarozei
Ciclul biologic:
Toxocara canis își completează ciclul biologic în organismul câinelui, omul intrând în ciclul
biologic accidental. Ouăle neembrionate sunt eliminate în fecalele gazdei definitive . Ouăle
embrionează și devin infectante în mediul exterior . În urma ingerarii de către câine , din
ouăle infectante larvele eclozează și penetrează peretele intestinal. În organismul câinilor tineri,
larvele migrează în plămâni, arborele bronșic și esofag: paraziții ajung în intestin și depun ouă .
La câinii adulți, pot apărea și infecții aparente, dar cel mai comun fenomen este închistarea
larvelor în țesuturi. Stadiile închistate se reactivează în organismul femelelor adulte ultima parte
a gestației și infectează transplacentar și transmamar puii în al carui intestin subțire se
dezvoltă viermi adulți . Puii sunt sursa majoră de contaminare a mediului inconjurator.
Toxocara canis poate fi transmisă și prin consumul unei gazde intermediare (mici mamifere-
iepuri- care consumă hrana infestată cu ouă, iar larvele eclozate în intestinul lor subțire,
penetrează peretele intestinal și prin circulație, ajung în diferite țesuturi unde se
închistează .Ciclul biologic este complet în momentul în care câinele consumă aceste gazde
intermediare , iar larva se transformă în intestinul subțire al câinelui într-un adult ce produce
40
ouă. Oamenii devin gazde în mod accidental infectându-se prin ingerarea ouălor infectante din
mediul înconjurător sau de la gazdele intermediare .După ingestie larvele eclozează,
penetrează peretele intestinal și sunt transportate cu ajutorul sistemului circulator în multe
țesuturi din organism (ficat, inima, plămâni, musculatura, ochi, creier) . Deși în aceste țesuturi
larvele nu depăsesc acest stadiu de dezvoltare (impas parazitar), ele pot genera reacții locale.
Cele două forme importante ale toxocarozei sunt: Larva Migrans Visceralis și Larva Migrans
Ocularis. Diagnosticul este pus de obicei utilizând serologia sau identificarea larvei in biopsia de
țesut.
Stadiul de diagnostic : prezența larvelor încapsulate în țesturi (ficat, glob ocular, creier, etc).
Diagnostic: prin punerea în evidență a anticorpilor specifici anti-Toxocara canis în sângele
pacientului prin metode de screening (ELISA) și apoi confirmarea răspunsului pozitiv prin
Western Blot în ser, LCR sau umoare apoasă în funcție de suspiciunea respectivă.
Diagnostic: în cazul suspiciunii de toxocaroza diagnosticul se pune pe baza testelor specifice.
Metoda de screening cea mai utilizată este reacția imunoenzimatica (ELISA). La ora actuală
exista multe kit-uri comerciale disponibile. Aceasta metodă pune în evidență în serul pacientului
anticorpii specifici anti-Toxocara canis. Reacția este una calitativă sau semicantitativă,
sensibilitatea și specificitatea kit-urilor fiind diferite în funcție de producător.Trebuie ținut cont
de eventualele reacții incrucișate, iar rezultatele pozitive trebuie confirmate prin reacția specifică
western blot Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV Absenti/ Prezenți anticorpi
specifici anti-Toxocara canis.
În sprijinul diagnosticului de toxocaroză acută vine reacția de aviditate anti-Toxocara canis IgG.
Aceasta este o reacție extrem de utilă deoarece permite stabilirea unui interval aproximativ de
debut al bolii (diferit în funcție de producător). De asemenea numărătoarea eozinofilelor oferă
indicii în privința stadiului de evoluție a parazitului (numărul de eozinofile este crescut în
perioada de migrare perienterică a parazitului)
Reacția de confirmare, western blot, este o reacție cu o sensibilitate și specificitate superioare
reacției ELISA. Permite confirmarea suspiciunilor de toxocaroza prin analizarea probelor atât de
ser, LCR cât și de umoare apoasă. Un răspuns pozitiv pentru o probă testată din lichid
cefalorahidian indică prezența toxocarozei cerebrale și este un factor de decizie important în ceea
ce privește conduita terapeutică viitoare. Suportul este reprezentat de benzile de nitroceluloza
impregnate cu antigene parazitare specifice (proteine cu greutati moleculare definite). În contact
cu serul/LCR aceste proteine formează complexe antigen-anticorp in pozitii specifice. Rezultatul
este raportat NEGATIV/POZITIV in funcție de prezența benzilor specifice în locurile bine
stabilite. Greutatea moleculară a benzilor și numărul lor diferă de la un producător la altul.
41
Fig.1
Fig.2
Rezultatul este considerat pozitiv în:
SER/LCR/Umoare apoasă – dacă sunt prezente 2 sau mai multe benzi LMW (low molecular
weight – benzi specifice Toxocara spp) din intervalul 24-35 kDa. HMW (high molecular weight)
sunt benzi care pot aparea și în cazul altor infecții helmintice.
42
Suspiciunile de toxocaroză oculară se recomandă a fi confirmate sau infirmate prin testarea
anticorpilor specifici anti-Toxocara canis din umoare apoasă. Greutatea moleculară, dispoziția și
numărul benzilor specifice diferă de la un producător la altul (vezi fig.2 – pozitiv în cazul
prezenței tuturor celor 3 benzi specifice: 120, 32, 26 kDa)
Măsurarea nivelului anticorpilor anti IgE specifici pentru Ascaris, precum și nivelul eozinofilelor
sunt markeri importanți în suspiciunile de toxocaroză, nivelul acestor parametri fiind ridicat pe
parcursul migrării larvelor în organismul gazdei (forma acută) .
Diagnosticul hidatidozei
Ciclul biologic:
43
Adultul de Echinococcus granulosus (3 până la 6 mm lungime) trăiește în intestinul subțire al
gazdelor definitive (câinii și alte canide). Din proglotele gravide sunt eliberate ouăle care sunt
eliminate în materiile fecale. După ingerarea acestora de către gazda intermediară (în condiții
naturale: oi, capre, porc, vite, cai, camile) oul eclozează în intestinul subțire și eliberează
oncosfera care penetrează peretele intestinal și migrează cu ajutorul sistemului circulator în
diferite organe, în special ficat și plămâni. În aceste organe oncosferele se tranformă în
chist care crește progresiv, producând protoscolecși și vezicule fiice care umplu interiorul
chistului. Gazda definitivă se infectează ingerând organe conținând chisturi sau o gazdă
intermediară infectată. După ingestie, protoscolecșii evaginează și se atașează de mucoasa
intestinală și se transformă în adulți. în 32 până la 80 de zile. Ciclul biologic este similar și la
E.multilocularis (1.2 – 3.7 mm) cu următoarele diferențe: gazdele definitive sunt vulpile, și mai
puțin câinii, pisicile, coiotii și lupii; gazdele intermediare sunt rozătoare mici; dezvoltarea larvară
(in ficat) rămâne un timp nelimitat în faza proliferativă, rezultând invazia țesuturilor
înconjurătoare.
Stadiul de diagnostic: chistul cu diferite localizări
Perioada necesară de la infecție până la diagnostic: mai mulți ani.
Diagnosticul echinococozei hidatice este dificil de realizat. Rareori există indicii specifice care
să sugereze infecția parazitară. De aceea este recomandată combinația metodelor imagistice
(ecografie, CT,RMN) cu teste de laborator. Aceste investigații aduc informații importante despre
aspectul, consistența membranelor, localizarea chistului precum și a gradului de activitate.
Dacă în urma examenului imagistic suspiciunea este menținută se impune continuarea cu teste
de laborator.
Serologie specifică: detectarea anticorpilor specifici anti-Echinococcus granulosus prin metode
de screening (ELISA, IFA, IHA) și de confirmare (Western Blot).
44
Reacția de screening – ELISA, reacția de screening cea mai larg utilizată, detectează nivelul
anticorpilor specifici anti-Echinococcus granulosus/Echinococcus multilocularis. Majoritatea
testelor comerciale existente detectează numai anticorpii de E.granulosus (sensibilitate și
specificitate>95%) dar există și truse standardizate pentru diagnosticul echinococozei alveolare
produsă de E.multilocularis (sensibilitate 93%, specificitate 98%).
Reacțiile sunt calitative sau semicantitative în funcție de producător. Rezultatele sunt exprimate
în indice de pozitivitate (IP) sau COI (indicele de cut off), valorile fiind influențate de numeroși
factori printre care o importanță deosebită o prezintă statusul imunologic al pacientului.
Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV (Prezenți/Absenți anticorpi specifici de
Echinococcus granulosus/multilocularis).
Reacția de confirmare –Western Blot, este o reacție calitativă utilizată drept confirmare pentru
probele testate în prealabil prin metoda de screening (ELISA). Reacția se poate efectua utilizând
ser și/sau LCR și prezintă o sensibiltate și specificitate mare. În funcție de producător, unele kit-
uri permit confirmarea numai a echinococozei chistice, produsă de Echinococcus granulosus,
altele ambele afecțiuni echinococoza chistică și alveolară (Echinococcus multilocularis).
Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIV – prezența/absența pe strip-ul de test a benzilor
specifice cu greutatea moleculară de 7 și/sau 26-28 kDa indică prezența anticorpilor specifici
IgG de Echinococcus în ser/LCR). Prezența benzilor intermediare, între 7 și 26-28 kDa (17, 16-
18) permite diferențierea între cele două specii: granulosus și multilocularis.
Exemple de reacții pozitive de western blot pentru Echinococcus spp.:
45
1. Diagnosticul Genului Echinococcus
- Prezența sau absența benzilor 7 și/sau 26-28 kDa
2. Diferențierea între cele două specii:
- Tipar P1 sau P2: Echinococcus granulosus (E.g.)
- Tipar P3: Echinococcus multilocularis (E.m.)
- Tipar P4 sau P5: Echinococcus multilocularis sau Echinococcus granulosus
- Se spală membrana cu ser fiziologic și se raclează energic. Din lichidul obținut se prepară
două lame :
o Una cu: o picătură preparat + o picătură de ser fiziologic
o A două: o picătură preparat + o picătură eozină
- Fluidul hidatic trebuie centrifugat 10 minute la 3000 rot/min, iar din sediment se
pregătește un preparat, lamă lamelă.
46
- Lamele se examinează la microscop cu obiective de 10x și 40x pentru detalii.
- Rezultatul se raportează menționându-se prezența sau absența protoscolecșilor și/sau a
cârligelor.
47
Diagnosticul teniazelor
Ciclul biologic:
Taeniaza este afecțiunea survenită în urma infecției cu adultul speciilor Taenia solium, saginata,
asiatica. Oamenii sunt numai gazde definitive pentru speciile menționate anterior. Prin materiile
fecale sunt eliminate în mediul extern ouăle sau proglotele gravide ; ouăle pot supraviețui în
mediul extern de la câteva zile la luni. Bovinele (T.saginata) și porcinele (T.solium) se infectează
ingerând vegetale contaminate cu ouă sau proglote gravide .Oncorsferele eclozează în intestinul
animalelor , penetrează peretele intestinal și migrează în musculatura striată, unde se
transformă în cisticerci. Un cisticerc poate supraviețui câțiva ani în organismul gazdei. Oamenii
se infectează ingerând carne infestată, insuficient preparată termic .În intestinul subțire al
omului cisticercul se transformă în adult în aproximativ 2 luni. Adultul poate supraviețui în
organismul gazdei umane mai mulți ani. Viermele adult se atașează de pretele intestinal cu
ajutorul scolexului restul strobilei fiind suspendată în intestinul subțire .Lungimea viermelui
adult este: Taenia saginata - de aproximativ 5m (uneori mai puțin, alteori mai mult - poate
atinge chiar și 25m); Taenia solium- 2 până 7 m. Adulții se maturizează produc proglote, care se
maturează, devin gravide se detașează de viermele adult și sunt eliminate prin materiile fecale
48
(aproximativ 6/zi). Adultul de Taenia saginata conține în mod obișnuit 1000-2000 de proglote,
în timp ce Taenia solium conține o medie de 1000 de proglote. Ouăle conținute în proglotele
mature sunt eliberate după ce proglotele sunt eliminate prin scaun. Taenia saginata produce până
la 100.000 ouă/proglot în timp ce Taenia solium până la 50.000 ouă/proglot.
49
Taenia solium Proba cu tus de India
Scolex (4 ventuze + coroana de cârlige)
Cisticercoza
50
Cisticercoza este infecția cu stadiul larvar al cestodului Taenia solium, întâlnită atât la oameni
cât și la porcine. Infecția este cauzată de ingestia ouălor eliminate prin materiile fecale de către
un purtător uman al adultului de Taenia solium . Porcinele și oamenii devin infectați prin
ingerarea proglotelor gravide sau/și a ouălor , . Oamenii se mai pot infecta prin consumul de
hrană contaminată cu fecale cu Taenia solium (autoinfecție). În ultimul rând, o persoană infectată
cu un adult de Taenia solium poate ingera ouăle produse de propriul parazit, fie prin contaminare
fecală fie prin peristaltism invers, acestea ajungând în stomac. Odată ingerate ouăle, oncosferele
sunt eliberate în intestin , , penetrează peretele intestinal și migrează către musculatura
striată, creier, ficat, și alte țesuturi unde se dezvoltă cistirecii . În cazul localizărilor cerebrale,
pot cauza daune majore, generând neurocisticercoza. Când oamenii consumă carne infestată cu
cisticerci și insuficient preparată termic, ciclul biologic al parazitului este complet . Chiștii
evaginează și se atașează de intestinul subțire prin scolex . Adultul se dezvoltă (până la 2-7 m
lungime și produce aproximativ 1000 proglote, fiecare cu 50.000 ouă/proglot) și traiește în
intestin mai mulți ani.
Diagnostic: în cazul suspiciunii de cisticercoză diagnosticul se pune pe baza testelor specifice.
Metoda de screening cea mai utilizată este reacția imunoenzimatică (ELISA). La ora actuală
există multe kit-uri comerciale disponibile. Această metodă pune în evidență în serul pacientului
anticorpii specifici anti-Taenia solium. Reacția este una calitativă sau semicantitativă,
sensibilitatea și specificitatea kit-urilor fiind diferite in funcție de producător.Trebuie ținut cont
51
de eventualele reacții încrucișate, iar rezultatele pozitive trebuie confirmate prin reacția de
confirmare specifică western blot. Rezultatele sunt raportate NEGATIV/POZITIVcu Absenți/
Prezenți anticorpi specifici anti-Taenia solium.
Reacția western blot este o reacție cu o sensibilitate și specificitate superioare reacției ELISA.
Permite confirmarea suspiciunilor de cisticercoza prin analizarea probelor atât de ser cât și de
LCR. Un răspuns pozitiv pentru o probă testată din lichid cefalorahidian indică prezența
neurocisticercozei și este un factor de decizie important în ceea ce privește conduita terapeutică
viitoare. Suportul este reprezentat de benzile de nitrocelulooza impregnate cu antigene parazitare
specifice (proteine cu greutati moleculare definite). În contact cu serul/LCR aceste proteine
formează complexe antigen-anticorp în poziții specifice. Rezultatul este raportat
NEGATIV/POZITIV în funcție de prezența benzilor specifice în locurile bine stabilite. Greutatea
moleculară a benzilor și numărul lor diferă de la un producător la altul.
52
Diagnosticul himenolepidozei
Ciclul biologic:
Hymenolepis nana
Ouăle de Hymenolepis nana sunt infectante imediat ce sunt eliberate cu proba de materii fecale și
nu rezistă în mediul exterior mai mult de 10 zile . Când omul ingerează ouăle (cu hrana sau
apa contaminate, sau de pe mâinile contaminate cu fecale), oncosferele conținute în ouă sunt
eliberate. Oncosferele (larvele hexacante)penetrează vilozitațile intestinale și dezvoltă larva
cisticercoidă .Prin ruperea vilozitatilor, larvele cisticercoide revin în lumenul intestinal, și
evaginează scolecsul , care se atașează de mucoasa intestinală și se transformă în adulți, de
obicei în zona ileonului, producând proglote gravide . Ouăle sunt eliberate prin materiile fecale
pe masură ce sunt eliberate din proglote prin porul genital, sau prin dezintegrarea proglotelor în
intestinul subțire . O variantă alternativă de Infecție este autoinfecția internă, prin care din ouă
sunt eliberați embrionii hexacanti, ce penetrează peretele vilozitaților continuând ciclul parazitar
până la eliberarea în mediul extern prin materiile fecale .Durata de viață a unui vierme adult
este de 4-6 săptămâni, dar autoinfecția permite ca infestarea să dureze și ani de zile.
53
Când ouăle sunt ingerate de către un artropod, gazda intermediară (diferite specii de gândaci și
purici pot servi drept gazda intermediară), ei se dezvoltă în cisticercoizi, care în urma ingerării
pot infecta oamenii sau rozatoarele și se transformă in adulți în intestinul subtire. O variantă
identică, H.nana var.fraterna, infectează rozatoarele și utilizeaza artropodele ca gazde
intermediare.
Ciclul biologic:
Hymenolepis diminuta
Diagnostic:
1.Examen corpoparazitologic direct: Identificarea oului de Hymenolepis nana/diminuta în
proba de materii fecale, utilizându-se ser fiziologic/Lugol. Identificarea se face utilizând un
microscop standard, iar pentru examinare obiectivele de 10x ,respectiv 40x (pentru detalii).
Hymenolepis nana - la maturitate segmentele
mature se dezintegreaza și elibereaza ouăle,
care masoară aproximativ 30-47 µm în
diametru. Oncosfera este acoperită cu un strat
extern subțire, hialin (membrana externă) și o
membrană internă, groasă cu două ingroșări
polare de unde pornesc filamente circulare
(Hymenolepis nana).
Hymenolepis nana – ou (40x)
55
2. Metode de concentrare:
- metoda Willis Hung
- metoda Ritchie
3. Identificare adultului și/sau a proglotelor în proba de materii fecale:
Hymenolepis nana (grecescul “nanos”= pitic) rareori depașește 40 mm lungime și 1 mm lățime.
Scolexul poartă un rostru retractabil înarmat cu o coroană formată dintr-un singur rând de cârlige
(23-30 la număr). Scolexul mai conține, de asemenea, și 4 ventuze. Gâtul este lung și subțire, iar
segmentele sunt mai mult late decât lungi. Strobila începe cu proglote scurte și înguste, urmate
de cele mature, adulte.
Hymenolepis diminuta – adultul măsoară 20 -60 cm lungime, proglotele sunt similare cu cele ale
Hymenolepis nana cu diferența că sunt mai mari.
56
Himenolepis diminuta - adult
57
Diagnosticul botriocefalozei
Ouăle imature sunt eliminate prin materiile fecale . Ouăle se maturează în condiții
corespunzătoare în aproximativ 18-20 zile și dezvoltă oncosferele care se vor
transforma în coracidii . După ingerarea de către un anumit crustaceu de apă dulce
(copepodul este prima gazda intermediară) coracidia se transformă în larva
procercoidă . În continuare copepodul este ingerat de a doua gazdă intermediară
Notropis stramineus , pești mici de apă dulce, larvele procercoide sunt eliberate din
copepod și migrează în musculatura peștelui unde se transformă în larve plerocercoide
(sparganum) . Larvele plerocercoide reprezintă stadiul infectant pentru om. A două
gazda intermediară poate fi ingerată de prădători mai mari de exemplu păstrăvi,
bibani . În acest caz sparganum poate migra în musculatura prădătorilor mai mari, iar
oamenii devin infestați prin consumul acestora din urmaă , carnea fiind crudă sau
58
insuficient preparată termic .După ingerare larvele plerocercoide se transformă în
adulți imaturi apoi în tenii adulte în intestinul subțire al gazdei. Adulții de
Diphyllobotrium latum se atașeaza de intestinul subțire al gazdei prin intermediul celor
două botrii (fante laterale) ale scolexului .Adulții pot atinge peste 10 m lungime, cu
mai mult de 3000 proglote. Ouăle imature sunt eliberate din proglote (peste 1000.000
ouă/zi/adult) și sunt eliminate prin fecale . Ouăle apar in fecale la 5-6 săptămâni
de la infecție. În afară de oameni multe alte mamifere pot servi drept gazdă definitivă
pentru Diphyllobotrium latum.
Diagnostic:
1. Examen coproparazitologic direct: identificarea în examenul microscopic a
ouălor de Diphyllobotrium latum utilizându-se examinarea între lamă / lamelă
cu ser fiziologic și/sau Lugol. Oul de Diphyllobotrium latum este un ou mare
având dimensiunea de 40x60 µm, cu un opercul (capac la una din extremități)
si cu un buton (“knob”) la extremitatea opusă operculului.
2. Metode de concentrare:
- Metoda Ritchie
3. Identificarea proglotelor și/sau adultului în materiile fecale:
Diphyllobotrium latum - ou
59
Diphyllobotrium latum – scolex/proglote mature
60
Diagnosticul leishmaniozei
Leishmanioza este transmisă prin înțepătura unor insecte hematofage aparținând ordinului
Diptera, subfamiliei Phlebotominae, genului Phlebotomus și/sau Luzomyia numite“sandflies”.
Există aproximativ 93 specii de sandflies dovedite stiintific ca fiind vectori pentru speciile de
Leishmania. Insecta injectează prin trompa (proboscis) în timpul prânzului hematofag) saliva
conținând stadiul infectant (promastigotele) . Promastigotele care ating locul puncției sunt
fagocitate de către macrofage unde se transformă în amastigote și: (a) ramân cantonate în
locul inoculării determinând apariția “butonului de orient”;(b) sunt incorporate în macrofage sunt
raspândite prin circulația sanguină către alte regiuni ale corpului uman afectând țesuturile
mucoase și cartilaginoase (leihmanioza cutanată diseminată/leishmanioza muco-cutanată); (c)
Infecția initial cantonată la nivel cutanat, diseminează pe cale circulatorie la nivelul organelor
interne: ficat, splină, maduvă ososă hematogenă (leishmanioza viscerală (Kala-Azar), unde se
multiplică prin diviziune directă și vor infecta alte celule (inclusiv macrofage) . Insectele
(“sandflies”) devin infectate în timpul prânzului hematofag ( , ). În corpul insectei,
61
amastigotele se transformă în promastigote în cavitatea abdominală și migrează către trompa
(proboscis) .
Leishmanioza este o boală cauzată prin transmiterea de către un vector, din genul Phlebotomus
și/sau Luzomyia , a agentului cauzator, un protozoar obligat intracelular din genul Leishmania.
Infecția umană este cauzată de aproximativ 21-30 specii care afectează și alte mamifere. Acestea
includ complexul L.donovani cu 3 specii (L.donovani, L.infantum și L.chagasi), complexul
L.mexicana cu 3 specii principale (L.mexicana, L.amazonensis și L.venesuelensis), subgenul
Viannia cu 4 specii importante (L.(V.)braziliensis, L.(V.)guyanensis, L.(V.)panamensis și
L.(V.)peruviana). Speciile diferite nu pot fi diferențiate morfologic, dar diferența se poate face
prin analize izoenzimatice, metode de biologie moleculară și/ sau utilizând anticorpi
monoclonali.
62
63
Diagnostic:
1. Metode de screening: Reacția de imunofluorescență indirectă și reacția imunoenzimatică
(ELISA).
- Reacția de imunofluorescență indirectă (IIFT) prin care se pun în evidență
existența anticorpilor anti-Leishmania spp. (cel mai frecvent donovani). Pentru
examinarea preparatului este necesar un microscop cu imunofluorescență cu obiective
de 20x/40x
64
Leishmania spp. – amastigote
– Western Blot, este o reacție calitativă utilizată drept confirmare pentru probele testate
în prealabil prin metoda de screening (IIFT/ELISA). Reacția se poate efectua
utilizând ser și prezintă o sensibiltate și specificitate mare.
65
Diagnosticul malariei
Ciclul biologic:
Ciclul biologic al parazitului Plasmodium implică existența a două gazde. În timpul prânzului
hematofag, femela de țânțar din specia Anopheles inoculează în gazda umană sporozoiții de
Plasmodium . Sporozoiții infectează celulele hepatice și se transformă în schizonți , care se
rup și eliberează merozoiții .(De reținut ca în cazul speciilor de P. vivax și P.ovale poate
persista în ficat un stadiu dormant (hipnozoiți) care cauzează recăderi eliberându-se în circulația
sanguină timp de săptămâni, sau chiar ani). După această replicare inițială în ficat (schizogonie
exo-eritrocitară ), paraziții suferă o multiplicare asexuată în eritrocite (schizogonie
eritrocitară ). Merozoiții infectează hematiile . Stadiul de inel se maturizează în schizonții, a
căror distrucție duce la eliberarea merozoiților . O parte din paraziți se diferentiază în stadiile
sexuate eritrocitare (gametociții) .Stadiile sanguine ale parazitului sunt responsabile pentru
manifestările clinice ale bolii.
Gametociții masculi (microgametociții) și femeli (macrogametociții) sunt ingerați de către
femela de Anopheles în timpul prânzului hematofag . Multiplicarea paraziților în organismul
66
țânțarului este cunoscută drept ciclul sporogonic . În stomacul țânțarului, microgametociții
penetrează macrogametociții rezultând zigoții . Zigoții devin alungiți și mobili (ookineți) și
penetrează peretele abdominal al țânțarului unde se transformă în oochiști . Oochiștii se
dezvoltă, se rup și eliberează sporozoiții , care își continuă drumul către glanda salivară a
țânțarului. Inocularea sporozoiților într-o nouă gazdă umană perpetuează ciclul biologic al
malariei .
Speciile
Plasmodium Plasmodium Plasmodium Plasmodium
vivax ovale malariae falciparum
Stadiul 6-8 9 14-16 5½-7
preeritrocitar (zile)
Perioada prepatentă 11 -13 10 – 14 15 -16 9-10
Perioada de 15 (12 – 17) 17 (16 -18) sau 28 (18 -40) sau 12 (9 -14)
incubație (zile) sau până la 6 mau mult mai mult
67
– 12 luni
Ciclul eucariotic 48 50 72 48
(ore) (aproximativ)
Parazitemia/µl
(mm3) 20.000 9000 6000 20.000 –
Medie 500.000
Maximă 50.000 30.000 20.000 2.000.000
Atacul primar* Moderat pana Moderat Moderat Sever la cei
la sever neimunizati
Perioada febrilă 8 -12 8 -12 8 -10 16 -36 sau mai
(ore) mult
Recăderi ++ ++ - -
Perioada de Variabila Variabila Foarte lunga Scurta
recurență**
Durata infecției 1½-5 1½-5 3 – 50 1-2
netratate (ani)
Distribuție Raspândită în În principal în Raspândită în Africa tropicală
geografică regiunile vestul Africii zona tropicală și și alte țări din
temperate și (are prevalența subtropicală. zona tropicelor.
subtropicale. scăzută). De
Mai rar în asemenea poate
zonele apărea și în alte
tropicale. regiuni ale
Africii sub
sahariene.
*
Severitatea infecției și gradul de parazitemie sunt foarte influențate de răspunsul imun.
Chemoprofilaxia poate supresa un atac inițial de la câteva săptămâni până la câteva luni.
**
Tiparele infecțiilor și recîderilor variază mult la diferitele tulpini.
Diagnostic:
1. Gold standard-ul pentru diagnosticul malariei îl reprezintă picătura groasa și frotiul din
sângele periferic. La o examinare corectă a acestora se pun în evidență elementele
parazitare caracteristice fiecărei specii de Plasmodium. Colorațiile folosite sunt: Giemsa
și/sau Field A+B.Este o metoda de diagnostic extrem de utilă , dar care necesită condiții
speciale pentru prelevarea probei și prelucrarea ei (recoltarea corectă, fixare, colorare și
examinare cu ajutorul unui microscop standard cu obiectivul de 100x folosind ulei pentru
imersie).
Plasmodium falciparum
68
Picătura groasă – colorația Fields (obiectiv 100x)
Schizont, observat
numai în infecțiile
severe
Gametociți
pH 6,6 – 6,8
pH 7,0 – 7,2
69
70
Africa tropicală și in alte zone din regiunea
Distribuție geografică tropicală.
Obișnuit se stinge în decursul primului an
Recăderi de la primul atac.
Sunt prezenți numeroși paraziți.
Generalitati De obicei sunt identificați numai
trofozoiții și gametociții
Nu sunt mărite de volum
Hematiile gazdă FĂRĂ granulații Schuffner, dar în
celulele ce conțin trofozoiții se
observă granulațiile roșii-violet
Maurer.
Pot apărea numeroși paraziți
Apar ca inele mici și delicate (pe
Trofozoiții frotiu) sau mici fragmente
citoplasmatice cu granulații de
cromatină (picătura groasă)
Pot avea și granulații duble de
cromatină
În infecțiile severe, pot fi intâlnite
inele mărite.
Foarte rar pot fi observați. Prezența
Schizonții lor pe frotiul sanguin (de obicei
însoțiti cu cu multe inele) sunt un
indicator al infecției severe care
trebuie raportat imediat.
Daca apar, de obicei sunt mici,
conținând numai puțini merozoiți și
un singur fragment de pigment
întunecat la culoare.
În formă de banană cu capetele
Gametociții rotunde și/sau ovale
Pigmenți granulari, în special în
jurul nucleului.
71
Plasmodium malariae
72
73
In zona tropicală și subtropicală.
Distribuție geografică
Persistă mai mulți ani după atac
Recăderi
Rareori sunt mai mult de 1% din
Generalități hematii sunt infectate
De obicei sunt identificați
trofozoiții, schizonții și gametociții
Nu sunt mărite de volum
Hematiile gazda FARA granulații Schuffner sau
Maurer
Groși, compacți și dens colorați
Trofozoiții Sub forma de bandă conținând
pigment galben-maroniu (frotiu)
“Bird’s eye” – poate fi observat
ocazional (un inel citoplasmatic ce
înconjoară o granulație centrală de
cromatină).
Mici și compacți cu merozoiții
Schizonții dispuși ordonați cu un pigment
galben-maroniu abundent.
Schizonții maturi conțin până la 12
merozoiți și puțină citoplasma.
Mici,compacți, rotunzi sau ovali.
Gametociții Este dificil sa îi diferențiezi de
trofozoiții maturi.
Nucleii dispuși de obicei excentric.
Pigment galben-maroniu ușor de
observat.
74
Plasmodium vivax
75
În majoritate în regiunile temperate,
Distribuție geografică subtropicale și în zonele tropicale.
Obișnuit se stinge in 3 -5 ani de la primul
Recaderi atac.
Rareori sunt mai mult de 2% din
Generalități celule infectate
De obicei sunt identificați
trofozoiții, schizonții și gametociții
Sunt mărite de volum și capătă
Hematiile gazdă forme neregulate
Granulațiile Schuffner sunt prezente
și pot fi observate înconjurând
paraziții (picătura groasă).
Majoritatea sunt mari, neregulați ca
Trofozoiții formă (amoeboizi). In picătura
groasă citoplasma apare
fragmentată.
Granule fine de pigment apar în
citoplasmă.
Mari, rotunzi sau cu forma
Schizonții neregulată
Schizonții maturi conțin 24 sau mai
mulț merozoiți și o cantitate mică
de pigment.
Mari, rotunzi sau cu forma
Gametociții neregulată.
Pot fi observate de asemenea
granule de pigment impraștiate.
76
Plasmodium ovale
Trofozoiți tineri și
integri. Hematiile conțin
pigment James și pot
deveni ovale.
77
78
Intâlnită în special în Africa de Vest (are
Distribuție geografică prevalență scazută). Mai poate fi îtâlnită și
în alte regiuni ale africii sub-sahariene.
Puține
Recăderi
Rareori sunt mai mult de 2% din
Generalități celule infectate
De obicei sunt identificați
trofozoiții, schizonții și gametociții
Aproximativ 20 – 30% din celulele
Hematiile gazdă infectate devin ovale sau de forma
neregulată cu prelungiri franjurate.
Granulațiile Schuffner (James) sunt
prezente și observate ca înconjurând
paraziții în picatura groasă.
Mici, compacți, similari cu cei de la
Trofozoiții Plasmodium malariae.
Mai puțin pigment ca la
Plasmodium malariae.
Mici și similari cu cei de la
Schizonții Plasmodium malariae.
Schizonții maturi conțin până la 10
merozoiți.
Mici și de obicei rotunzi. Sunt
Gametociții dificil de diferențiat de trofozoiții
maturi (“late stage trophozoites”)
Nucleii de obicei excentrici
79
Plasmodium knowlesii
80
Distributie geografică Malaysia, S-E Asiei
Recăderi Puține
Generalități Parazit natural mal macacului.
Frecvent infecții mixte P.knowlesii cu
P.falciparum
Infecțiile sun foarte severe, P.knowlesii
multiplicându-se asexuat la fiecare 24
de ore cu pusee febrile zilnice.
In frotiurile sanguine sunt observați
trofozoiții, schizonții și gametociții.
Pot fi prezenți numeroși paraziți.
Hematiile gazdă Nu sunt mărite de volum
Ocazional apar cu captele franjurate
Pot contine granulații neregulate
caracteristice
Trofozoiții Când sunt prezente numai stadiile
tinere de trofoziți pot fi ușor confundate
cu cele de la P.falciparum
Într-o singură celulă pot fi întâlniți mai
mulți trofozoiți. Granulații simple,
duble și uneori chiar triple de cromatină
pot fi observate (“early trophozoit”).
Citoplasma este compactă și densă,
usor amoeboidă, aspect de bandă;
pigmentație variabilă (“late
trophozoit”)
Citoplasma compactă, densă, formă
rotundă; pigmentație închisă și aspect
de bandă; forma NEAMOEBOIDĂ
(“mature trophozoite”)
Schizonții Similari cu cei de la Plasmodium
malariae cu aglutinări de pigment
închise la culoare (maron închis).
Schizonții maturi conțin până la 16
merozoiți
Gametociții Rotunzi cu pigment difuz, similar celui
de la P.malariae
În mod obișnuit umplu întreaga celulă
parazitată
81
aldolaza. Organizația Mondiala a Sănătății a stabilit ca sensibilitatea testelor rapide
trebuie să fie apropiată de 100% la o parazitemie de 100 paraziți/l.
C= banda de control (în cazul absenței ei testul este invalid și trebuie repetat)
T1 = indică prezența antigenelor specifice de Plasmodium falciparum
T2 = indica prezența antigenelor specifice de Plasmodium vivax+malariae+ovale
- Prezența benzilor poate persista și câteva zile până la săptămâni după instituirea
tratamentului. Prezența benzilor nu este indicator de reinfecție.
- În cazul unui rezultat negativ este necesară repetarea testului in 48 de ore.
82
ARTEFACTE
La examinarea de rutina a unei probe de materii fecale este necsar sa tinem cont de o
multitutide de factori: varsta pacientului, dieta acestuia, medicatia utilizata. In continuare vom
considera fiecare fctor in parte astfel:
Varsta pacientului: este un indiciu important deoarece in functie de aceasta vor fi
comunicate sau nu in raportul de analiza anumite elemente intalnite in proba pacientului. De
exemplu scaunul unui copil va contine mai multe elemente vegetale nedigerate (amidon,
celuloza), acestea ne avand o semnificatie deosebita din punct de vedere clinic, deoarece dieta
copiilor este de regula, bogata in fibre, iar tranzitul intestinal al acestora este mai rapid decat al
unui adult. Daca aceste elemente (amidon, celuloza nedigerate), apar in scaunul unui adult
imunocompetent, in cantitati demne de luat in seama (1-3 elemente/campul microscopic), acestea
indica fie tulburari de tranzit – in acest caz fiind asociate cu scaune diareice, chiar apoase, fie cu
tulburari ale florei intestinale, uneori fiind insotite si de infectia cu Helicobacter pylori.
Dieta pacientului: daca pacientul are o dieta iogata in fibre, scaunul pacientului poate
contine elemente carecteristice respectiv – amidon, celuloza, fibre vegetale, digerate si/sau
nedigerate. Daca aceste sunt prezente in cantitati mari (1-3 elemente /camp microscopic) este
bine sa fie mentionate pentru a orienta medicul clinician in diagnostic.
Medicatia: scaunul poate fi modificat de administrarea diferitelor medicamente. Un
exemplu este administrarea fierului, care genereaza scaune inchise la culoare (aproape de
culoarea negru).
In examinarea microscopica a materiilor fecale intervine frecvent confuzia diferitelor
stadii parazitare cu alte elemente de origine umana sau vegetala. Examinarea preparatelor
microscopice trebuie sa se realizeze cu o deosebita atentie intrucat aceste confuzii sunt foarte
frecvente. Pentru acest lucru se utilizeaza un microscop standard cu obiective cuprinse intre 10x
si 40x magnificatie.
Elementele de origine umana ce pot aparea frecvent in preparatele proaspete sunt: cristalele
Charcot-Leyden, celulele epiteliale, polimorfonuclearele, hematiile.
Cristalele Charcot-Leyden
83
Celule epiteliale
Este de remarcat refringenta diferita a celor doua elemente si raportul diferit intre dimensiunea
nucleului si masa citoplasmatica
PMN si hematii
Elementele de origine vegetala ce pot aparea in preparatele proaspete sunt: amidonul, celuloza,
fibrele vegetale, polenul.
84
Amidonul
85
Amidon nedigerat_ou de Enterobius vermicularis 0x
Celuloza
Aspectul cel mai frecvent intalnit la celulozei este de “batista sifonata”. Prezenta celulozei in
scaun, in absenta unui regim bogat vegetarian, indica existenta unor probleme de absobtie
si/digestie si pacientul ar trebui indrumat catre serviciul de gastroenterologie.
86
Fibrele vegetale
87
Fibre vegetale cu aspecte diferite 10x
88
Fibre vegetale versus larva de Strongyloides stercoralis 10x
Polenul
Polenul este unul din elementele vegetale cel mai polimorf. Poate avea aspecte si
dimensiuni variabile unele dintre ele foarte apropiate cu elementele parazitare. La o examinare
mai atenta se observa absenta structurilor interne sau caracteristicilor morfologice specifice
parazitului suspectat. Pentru observarea detaliilor este necesara utilizare obiectivului cu
magnificatie 40x.
Polen 20x
89
Polen 40x Ou de Taenia spp. 40x
90
Polen 40x Ou de Ascaris lumbricoides 40x
Cele doua imagini de mai sus aparent sunt identice, dar la o examinare atenta se observa ca
invelisul extern al granulei de polen prezinta spini, pe cand membrana externa a oului de Ascaris
lumbricoides este mamelonata.
Levurile
Levurile sunt prezente in materiile fecale in mod obisnuit. Ceea ce este important de luat
in seama si de comunicat este densitatea acestora. Prezenta levurilor in cantitati mari in
materiile fecale poate indica fie o recoltare si stocare incorecta a probei pana a fost
transportata la laborator (scaunul a fost recoltat inainte de 24 de ore si stocat la temperatura
camerei), fie administrarea unor medicamente (antibiotice) care pot produce un dezechilibru
de flora intestinala si de pH ce poate favoriza inmultirea aberanta a levurilor. Mentionarea
acestui amanunt este foarte importanta pentru orientarea clinicianului in diagnostic.
91
Levuri 20x
Levuri 40x
92
Levuri si chisturi de Giardia duodenalis 40x
Prezenta unui mare numar de levuri de tip Candida, in absenta unui de diferentiat cand
este vorba in special de diagnosticul giardiozei. Levurile au dimensiuni si aspect apropiat
chisturrilor de Giardia intestinalis. Pentru distingerea detaliior de structura se utilizeaza
obiectivul de 40x. In cazul levurilor refringenta este alta (mai mica decat in cazul chisturilor
de Giardia), se remarca absenta axostilului si a nucleilor.
93
94
Examen coproparazitologic (SF_40x)
95
Examen coproparazitologic (SF_40x)
96
Analiza coproparazitologica este un examen microscopic ce necesita experienta din partea
investigatorului pentru a diferentia elementele parazitare de cele non parazitare. Est necesara
examinarea in pieptene a lamei de microscop, in asa fel incat toata suprafata preparatului sa fie
observata cu mare atentie. In cazul observarii unor elemente cu aspect caracteristic, inainte de a
trage o concluzie trebuie efectuate teste de diferentiere si utilizarea obiectivelor cu magnificatie
superioara (20x, 40x) pentru a putea diferentia elementele non parazitare de cele parazitare.
Utilizarea obiectivelor cu magnificatie superioara permite observarea detaliilor de structura ale
elementului observat, diferentele de refringenta intre chisturile unor paraziti si diferite artefacte,
precum si diferentele intre dimensiunile elementelor observate.
97
Managementul calităţii
98
în judeţe – 29 de biologi în judeţele Argeş – 1, Bacău - 1,Bistriţa ăsăud – 1, Botoşani –
2, , braşov- 1, Buzău – 1, Cluj – 5, Constanţa – 1, Hunedoara – 1, Iaşi – 5, Maramureş –
2, Prahova – 2, Olt- 2, Satu Mare- 1, Sibiu- 1, Tulcea – 1, Timiş – 1 iar
în Bucureşti .- 10 biologi cu specialitatea în parazitologie medicală..
SECŢIUNEA a 9-a , art. 23, Ordinului nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor
privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale prevede că :
”(1) Organizarea controlului intern al calităţii este responsabilitatea şefului de laborator de
analize medicale. Reprezentantul legal al laboratorului de analize medicale are obligaţia de a
asigura resursele necesare îndeplinirii acestuia.
(2) Controlul intern al calităţii se efectuează zilnic, cel puţin o dată la 8 ore şi ori de câte
ori este nevoie.
(3) Rezultatele controlului intern obţinute se analizează de către specialistul responsabil de
analiza respectivă, care decide acceptarea sau rejectarea rezultatelor obţinute.”
Laboratoarele medicale care contractează analize decontate de CNAS din bugetul asigurărilor
sociale de sănătate trebuie să efectueze un număr minim de 4 participări anuale la controlul
extern al calităţii pentru a primi un punctaj - îndeplinirea criteriilor de calitate din lege -
Anexa nr. 19, Cap. II, lit. B, pct. 2, Criteriul de calitate, lit. b). – Norme metodologice de
aplicarea Contractului – Cadru de acordare a asistenţei medicale în cadrul sistemului de asigurări
sociale de sănătate.
Laboratoarele medicale care sunt sau doresc să aibă acreditarea de la Organismul Naţional de
Acreditare RENAR conform standardului SR EN ISO 15189:2013 Laboratoare medicale Cerinţe
pentru calitate şi competenţă trebuie să îndeplinească cerinţa acestui standard de la pct. 5.6.3
Comparaţii interlaboratoare , pct. 5.6.3.1 “Participare NOTA” care precizează că
99
“ Se recomandă ca laboratorul să participe la programe de comparaţie interlaboratoare, care
îndeplinesc în mod substanţial cerinţele relevante ale ISO / IEC 17043.”
Programele de comparaţie interlaboratoare “care îndeplinesc în mod substanţial cerinţele
relevante ale ISO / IEC 17043” sunt furnizate de organizatorii de control extern al calităţii –
internaţionali sau naţionali - care au implementat standardul ISO 17043:2010, sunt acreditaţi sau
în curs de acreditare de către organismul naţional de acreditare din ţara în care organizatorul
controlului extern al calităţii are sediul - în conformitate cu standardul
SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru încercările de
competenţă.
100
Participanţii sunt informaţi în instrucţiunea de utilizare a materialului de încercat că
proba poate contine şi alte elemente ca de ex. produse alimentare nedigerate (amidon,
celuloza, fibre vegetale) fara importanta în patologie şi că:
- paraziții condiționat patogeni se raportează numai dacă există minimum 7 elemente
parazitare pe câmpul microscopic.;acest număr de elemente parazitare obligatorii de
identificat este valabil numai pentru paraziții condiționat patogeni (ex. Entamoeba coli,
Blastocystis hominis).
- paraziții cu importanță în patologia umană se raportează indiferent de numărul de
elemente parazitare observate pe câmpul microscopic.
Fiecare obiect supus încercării de competenţă - materii fecale de origine umană- conţine ca
prezervant Formaldehida 10%.
Anterior prezervării materilalul biologic furnizat de CALILAB este testat pentru a nu exista în
obiectul supus încercării de competenţă alte elemente parazitare decât cel sau cele aşteptate ca
în exemplul următor conform fisei de însoţire pentru materialul de încercat care conţine oua ale
parazitului de Taenia spp:
101
(Merck)
În anul 2014 CALILAB a distribuit ca obiecte supuse încercării de competenţă materii fecale :
- corespunzătoare celei mai frecvente situaţii - materii fecale care nu conţin elemente
parazitare – sunt absente – nivel 1 al materialului de încercat ;
- corespunzătoare celei de a doua cea mai fracventă situaţie – cei mai întâlniţi paraziţi –
materii fecale care au conţinut Giardia intestinalis , Ascaris lumbricoides , Taenia
Spp.- nivel 2 al materialului de încercat – cei mai întâlniţi paraziţi cu semnificaţie clinică
întâlniţi în materiile fecale umane în analizele de rutină effectuate de către laboratoarele
medicale pentru pacienţi distribuite conform tabelului prezentat în continuare.
102
Rezultate 89,90% 83,78% 84,47% 36% 62.61% 46,01% 82,58%
“satisfacat
oare”
103
104
Concluzia analizei graficelor radiale care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către
participanţi în rundele din lunile februarie, martie şi mai este că numărul răspunsurilor
raportate de către participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei
rezultatului raportat versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil :
Runda din luna februarie 2014 - 3% pentru Giardia Intestinalis
Runda din luna martie 2014 - 16,22% pentru absente elemente parazitare
Runda din luna mai 2014 - 15,53% pentru absente elemente parazitare
În runda din luna septembrie 2014 materialul de încercat a conţinut parazitul Ascaris
Lumbricoides.
105
Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către
participanţi în runda din luna septembrie 2014 este că:
- numai 36% dintre participanții la aceasta schema de incercari de competenta au
identificat corect parazitul Ascaris lumbricoides prezent in materialul de încercat deşi
materialul de încercat a fost omogen după cum relevă testele de omogenitate;
106
Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către
participanţi în runda din luna noiembrie 2014 este că numărul răspunsurilor raportate de către
participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei rezultatului raportat
versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil respectiv 8, 61% din rezultatele
raportate de către participanţi după examinarea obiectului supus încercării de competenţă.
Concluzia analizei graficului radial care reprezintă repartiţia rezultatelor traportate de către
participanţi în toate rundele anului 2014 este că numărul răspunsurilor raportate de către
participanţi şi evaluate ca “ nesatisfăcătoare” prin metoda echivalenţei rezultatului raportat
versus răspuns aşteptat este în limita unui procent rezonabil în :
Runda din luna februarie 2014 - 3% pentru Giardia Intestinalis
Runda din luna martie 2014 - 16,22% pentru absente elemente parazitare
Runda din luna mai 2014 - 15,53% pentru absente elemente parazitare
107
Runda din luna noiembrie 2014 – 8,61% pentru Taenia Spp.
Rezultatele globale raportate de către participanţi în runda din luna septembrie 2014 sunt încă
studiate de specaliştii CALILAB.
Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea
laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul
Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 la art. 24 precizează că :
Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea
laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în
Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007 la art. 23 precizează că:
(2) Controlul intern al calităţii se efectuează zilnic, cel puţin o dată la 8 ore şi ori de câte
ori este nevoie.
(3) Rezultatele controlului intern obţinute se analizează de către specialistul responsabil de
analiza respectivă, care decide acceptarea sau rejectarea rezultatelor obţinute „.
108
B. Instruirea specialiştilor laboratorului medical pe baza rezultatelor participărilor la
controlul extern al calităţii furnizat de un organizator naţional sau internaţional
109
indiferent de dotarea cu echipamente, calificarea şi numărul specialiştilor angajaţi, spaţiile
laboratoarelor, calibratorii, controalele interne sau metodele de măsurare şi examinare utilizate
de laboratoarele medicale astfel încât un pacient să nu fie declarat sănătos în baza unui buletin de
analiză emis de un laborator şi bolnav în baza unui alt buletin de analiză – emis de acelaşi
laborator sau un laborator diferi;
- oferă laboratoarelor medicale un mijloc de a obţine un punctaj de la CNAS tranformat în
alocarea de bani din fondul asigurărilor sociale de sănătate pentru minimum 4 participări anuale
la controlul extern al calităţii conform - Anexa nr. 19, Cap. II, lit. B, pct. 2, Criteriul de
calitate, lit. b). – Norme metodologice de aplicarea Contractului – Cadru de acordare a asistenţei
medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate;
3.Furnizorii de control extern al calităţii este cel de al treilea beneficiar al furnizării
controlului extern al calităţii ; conform standardelor , legilor şi altor documente în vigoare
aplicabile controlului extern al calităţii organizat de către furnizori pentru laboratoarele
medicale, aceştia au obligaţia să:
3.1. furnizeze scheme de încercări de competenţă la nivelul cerut de standardele aplicabile
demonstrând că cerinţele au fost implementate – cerinţa standardului de acreditare a
laboratoarelor medicale SR EN ISO 15189:2013 , pct. 5.6.3.1. Nota- „- Se recomandă ca
laboratorul să participe la programe de comparaţie interlaboratoare, care îndeplinesc în mod
substanţial cerinţele relevante ale ISO / IEC 17043.”
4. Ministerul Sănătăţii, CNAS, RENAR , alte instituţii şi autorităţi ale statului român sunt
o categorie care poate fi cel de al patrulea beneficiar al furnizării controlului extern al calităţii
datorită faptului care obţin de la organizatorii de control extern al calităţii naţionali sau
internaţionali date naţionale referitoare la laboratoarele medicale din România – printre care :
dotarea acestora cu echipamente, rezultatele globale ale participării la controlul extern al
calităţii, numărul şi calificările personalului angajat – specialiştii acestora , etc date care sunt
utile instituţiilor şi autorităţilor statului – Ministerul Sănătăţii, Casa Naţională de Asigurări de
Sănătate , altor instituţii şi autorităţi, pentru elaborarea politicilor şi programelor naţionale în
domeniul sanitar.
110
Transmiterea cu întârziere a rapoartelor de evaluare a performanţei participanţilor de
către unii furnizori de EQA – uneori şi după luni de zile -
precum şi neanalizarea rapoartelor de evaluare de către specialişti conform OMS 1301:2007
pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale care
precizează la art. 25 că “rezultatele controlului calităţii şi măsurile luate pentru îmbunătăţire se
consemnează şi se analizează după primirea fiecărui raport de evaluare a performanţelor
laboratorului de analize medicale, obţinut în urma participării la programele de evaluare
externă a calităţii “
111
Bibliografie
112
14. The reliability of diagnostic techniques in the diagnoșis and management of malaria in
the absence of a gold standard - L B Ochola, P Vounatsou, T Smith, M L H Mabaso, C R
J C Newton - Lancet Infect Dis 2006; 6: 582–88
15. Interet dagnostic immunologique par ELISA et EITB pour la conduite diagnostique et
therapeutique d’une neurocysticercose – Simac C., Michel Ph., Andriantsimahavandy A.,
Esterre Ph., Michault A. – 1994, Arch.Inst.Pasteur Madagascar, 61, 21 -27.
16. Neurocysticercosis: updated concepts about an old disease -Hector H Garcia, Oscar H
Del Brutto, for The Cysticercosis Working Group in Peru Lancet Neurol 2005; 4: 653–61
17. High Prevalence of Asymptomatic Plasmodium falciparum Infection in Gabonese Adults
- Matthias P. Dal-Bianco, Kai B. Köster, Ulrich D. Kombila, Jürgen F. J. Kun, Martin P.
Grobusch, Ghyslain Mombo Ngoma, Pierre B. Matșiegui, Christian Supan, Carmen L.
Ospina Salazar, Michel A. Missinou, Saadou Issifou, Bertrand Lell, and Peter Kremsner
Am. J. Trop. Med. Hyg., 77(5), 2007, pp. 939–942
18. Strongyloidiasis in Transplant Patients - Alison C. Roxby,Geoffrey S. Gottlieb, and Ajit
P. Limaye IMMUNOCOMPROMISED HOSTS • CID 2009:49 (1 November)
19. Strongyloides stercoralis: there but not seen - Martin Montesa,b, Charu Sawhneyb,c and
Nicolas Barrosa Current Opinion in Infectious Diseases 2010, 23:500–504
20. Use of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Dipstick Assay for Detection of
Strongyloides stercoralis Infection in Humans - H. Rogier van Doorn, Rob Koelewijn,
Henk Hofwegen, Henk Gilis, Jose C. F. M. Wetsteyn, Pieter J. Wismans, Claudine
Sarfati, Tony Vervoort, and Tom van Gool - JOURNAL OF CLINICAL
MICROBIOLOGY, Feb. 2007, Vol. 45, No. 2, p. 438–442
21. La toxocarose, une zoonose helminthique majeure – J.-F. Magnaval, L.T. Glickman, Ph.
Dorchies. Revue de Medecine Veterinaire 1994, 145: 611 – 627.
22. A collaborative study on larval secretory excretory antigens of Toxocara canis for the
immunodiagnosis of human toxocariasis with ELISA – F.Speiser, B.Gottstein – Acta
Tropica, 1984; 41: 361 – 372.
23. The Differential Agglutination Test as a Diagnostic Aid in Cases of Toxoplasmic
Lymphadenitis_
Jose G. Montoya, Andrew Berry, Fernando Rosso and Jack S. Remington JOURNAL OF
CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2007, p. 1463–1468 Vol. 45, No. 5
24. Toxoplasma gondii Infection in Pregnancy - Fabiana Maria Ruiz Lopes, Daniela Dib
Gonçalves, Regina Mitsuka-Breganó, Roberta Lemos Freire and Italmar Teodorico
Navarro - Braz J Infect Dis vol.11 no.5 Salvador Oct. 2007
25. Lymphadenopathy and Malignancy - ANDREW W. BAZEMORE, M.D., and
DOUGLAS R. SMUCKER, M.D., M.P.H.Univerșity of Cincinnati College of Medicine,
Cincinnati, Ohio American Family Phyșician December (1), 2002/volume 66, Number
11.
26. Toxoplasmosis J G Montoya, O Liesenfeld - Lancet 2004; 363: 1965–76
27. Ordinul nr. 2.071 din 16 decembrie 2008 privind aprobarea Procedurii de notificare a
schemelor de testare a competenţei pentru laboratoare de analize medicale emis de
Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în Monitorul Oficial nr. 11 din 7 ianuarie 2009
28. Ordinul nr. 1.301 din 20 iulie 2007 pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea
laboratoarelor de analize medicale emis de Ministerul Sănătăţii Publice şi publicat în
Monitorul Oficial nr. 617 din 6 septembrie 2007
113
29. Standardul SR EN ISO 15189:2013 Laboratoare medicale Cerinţe pentru calitate şi
competenţă
30. Standardul SR EN ISO CEI 17043:2010 Evaluarea conformităţii Cerinţe generale pentru
încercările de competenţă
31. Regulament specific de acreditare a furnizorilor de încercări de competenţă conform SR
EN ISO CEI 17043 din 24.10.2014
32. Norme metodologice de aplicare a Contractului – Cadru de acordare a asistenţei
medicale în cadrul sistemului de asigurări sociale de sănătate
33. ”Rolul resurselor umane în implementarea unui sistem de control al calității în
laboratoarele medicale„ Teza de doctorat - autor C. Popa, susţinută public în data de
17.10.2011 la UMF Bucureşti, Facultatea de Medicină şi Farmacie;
34. www.renar.ro.
114
115