Determinarea densităţii sângelui şi plasmei - Metoda Phillips - Van Slyke

Principiul determinării. Determinarea densităţii sângelui sau plasmei se face comparativ,

faţă de o serie de soluţii de sulfat de cupru ale căror densităţi ne sunt cunoscute. Picătura
de plasmă sau sânge se acoperă cu o peliculă de proteinat de cupru care-i permite
plutirea, pentru câteva secunde, în interiorul lichidului, în momentul când densităţile celor
două lichide sunt egale.
Materiale necesare.
- sânge şi plasmă;
- flacoane cu soluţii de sulfat de cupru cu densităţi diferite;
- pipete.
Tehnica de lucru.
Se iau dopurile de la flacoanele cu sulfat de cupru şi se lasă câtva timp la temperatura
camerei. Din eprubeta cu sânge integral, se iau 2ml cu o pipetă şi se lasă să cadă în
fiecare flacon câte o picătură de sânge de la o înălţime de maximum 1cm de la suprafaţa
lichidului.
Pot exista trei situaţii:
- picătura de sânge se ridică la suprafaţa lichidului, ceea ce înseamnă că densitatea
picăturii e mai mică decât densitatea soluţiei;
- picătura de sânge coboară spre partea inferioară a flaconului, fiind, deci, cu densitate
mai mare decât a soluţiei din flacon;
- picătura de sânge pluteşte în interiorul soluţiei timp de câteva secunde până la
1/2min., deci densitatea sângelui este aceeaşi cu densitatea soluţiei din flaconul
respectiv.
La fel se procedează şi pentru determinarea densităţii plasmei. Seria de soluţii de sulfat de
cupru cu densităţi cunoscute poate fi folosită la mai multe determinări (după un timp, atât
picăturile de plasmă cât şi cele de sânge integral se vor strânge în partea inferioară a
flacoanelor). În general, soluţiile se vor schimba când depozitul de sânge sau plasmă
depăşeşte 1/4 din volumul total al soluţiei.
Rezultate. Prin această metodă, obţinem două valori: densitatea sângelui integral (DS) şi
densitatea plasmei (DP).
R.A. Phillips şi Van Slyke au construit o nomogramă cu ajutorul căreia, cunoscând
densitatea unei probe de sânge şi a plasmei, se pot obţine valorile hematocritului (Ht) în
%, a hemoglobinei (Hb) în g% şi a proteinelor totale din plasmă în g% (vezi nomograma,
(figura1.5.). Metoda permite determinarea proteinemiei şi a Hb cu erori foarte mici.
Valori de referinţă (kg/m3):
- Plasmă: 1027 cu limite între 1024-1030.
- Sânge integral: 1055-1067 -bărbaţi; 1051-1061 -femei;
Variaţiile densităţii plasmei
- Creşteri fiziologice:
 la altitudine, prin splenocontracţie, creşte numărul de eritrocite;
 în efort, prin acelaşi mecanism;
 în deshidratări, prin transpiraţie.
- Creşteri patologice:
 deshidratări - prin diaree, vomă, arsuri - se pierde apă;
 poliglobulii primare sau secundare;
 şoc - în care se produce o concentrare a eritrocitelor, ca urmare a creşterii
permeabilităţii capilare şi trecerii lichidului circulant în interstiţii.
- Scăderi fiziologice:
 la gravide, prin creşterea fracţiunii plasmatice, ca urmare a atragerii apei în vas,
sub acţiunea progesteronului şi a estrogenilor;
 ingerare masivă de lichide.
 - Scăderi patologice:
 anemii;
 posthemoragie, la câteva ore de la producerea acesteia, când lichidul interstiţial
este atras în vase, pentru compensarea pierderii de volum şi menţinerea
presiunii arteriale.
Importanţa determinării.
- determinarea densităţii sângelui integral şi a plasmei permit aprecierea rapidă, prin
nomograme, a hematocritului, a cantităţii de Hb şi a concentraţiei proteinelor
plasmatice;
- metoda Van Slyke permite diagnosticul de şoc postoperator, şoc datorat arsurilor
întinse şi şoc posthemoragic. De asemenea, ajută la stadializarea şocului şi
orientarea tratamentului în şoc, anemii, deshidratări etc.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, definiţi următorii termeni: hormon, anticoagulant,

ser, fibrinogen, coagulare, hematocrit, sistem tampon.
2. Consultând un tratat medical, determinati situaţiile patologice în care presiunile
osmotică şi coloid-osmotică intervin în patologia umană.
3. Consultând un tratat medical, determinaţi situaţiile patologice în care există
modificări ale pH-ului sanguin.
 Figura 1.5. Graficul Van Slyke şi colab. (Hb - hemoglobină; Ht - hematocrit)
Punctul în care linia care uneşte scala I cu scala a III-a şi intersectează scala a II-a, arată
valoarea hemoglobinei şi hematocritului
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Notaţi valorile obţinute pentru densitatea plasmei şi a sângelui integral.

................................................................................................................................................
2. Identificaţi parametrii de care depinde densitatea sângelui integral.

................................................................................................................................................
3. Identificaţi parametrii de care depinde densitatea plasmei.

................................................................................................................................................
4. Indicaţi cum poate fi densitatea sângelui la o gravidă, în ultimul trimestru de sarcină.
Cum numiţi situaţia respectivă şi de ce apare la gravide?

................................................................................................................................................
5. Care este importanţa clinică a determinării densităţii sângelui şi a plasmei?

................................................................................................................................................
6. Notaţi valorile corecte pentru presiunea osmotică.

................................................................................................................................................
7. Notaţi valorile corecte pentru presiunea oncotică.

................................................................................................................................................
8. Notaţi valorile corecte pentru pH-ul sanguin.

................................................................................................................................................
9. Calculaţi volumul plasmatic aproximativ existent în corpul dumneavoastră.

................................................................................................................................................
10. Analizaţi densităţile plasmei la două persoane care au valori diferite ale proteinemiei,
de exemplu 5 g/dl şi 7,5 g/dl.

………………………………………………………………………………………………..............
.
2.3. DETERMINAREA HEMATOCRITULUI
Definiţie. Etimologic, hematocrit înseamnă volumul hematiilor. Hematocritul este
fracţiunea din volumul total al sângelui, ocupată de hematii, exprimată procentual. Mai
poate fi definit ca raportul dintre plasmă şi elementele figurate ale sângelui, exprimat
procentual, ţinând cont că, în mod normal, volumul leucocitelor şi trombocitelor nu
depăşeşte 1 %. Germanii exprimă acest parametru şi în l de E/l sânge
Este un triaj obligatoriu pentru investigaţia incipientă a oricărui bolnav împreună cu
determinarea hemoglobinei şi a numărului de hematii. Este o determinare de urgenţă în
stările de şoc.
Hematocritul depinde de numărul total de eritrocite (masa eritrocitară), de volumul
eritrocitar mediu şi volumul plasmatic.
Principiul metodei. Prin centrifugarea sângelui recoltat pe anticoagulant se separă
hematiile de plasmă şi apoi se evaluează valoarea procentuală a masei de hematii.
Citirea rezultatelor. În tubul cu sânge centrifugat se
observă (figura 2.7.):
- un strat inferior: masa eritrocitară;
Plasmă - un strat mediu: leucocite şi trombocite (se
observă numai în patologie);
Leucocite
- un strat superior: plasma.
Uneori, între stratul de leucocite şi
H eritrocite, se poate observa un strat
negru – stratul Bramberger, format din
eritrocite modificate de către enzimele
Hematii leucocitare.
h În anemiile hipocrome, limita dintre leucocite şi
eritrocite este ştearsă, puţin evidentă, pentru că
eritrocitele hipocrome au greutate specifică mai mică
decât cele normocrome şi apropiată de cea a
leucocitelor.
Fig. 2.7. Tub Pentru calcularea hematocritului, se măsoară
înălţimea totală a coloanei de lichid şi se notează cu
H, apoi se măsoară înălţimea coloanei de eritrocite şi se notează cu h. Hematocritul se
calculează cu ajutorul relaţiei:
h
Hematocrit  100 [%]
H
Lucrări practice efectuate în laborator.
Determinarea hematocritului prin micrometodă. Se foloseşte echipamentul Janetzki
(sau alte echipamente similare).
Materiale necesare:
- instrumentar steril de unică folosinţă pentru puncţie venoasă sau puncţie capilară;
- centrifugă (model TH-11 Janetzki sau similară) cu un rotor special pentru a putea
cuprinde un mare număr de tuburi;
- tuburi de hematocrit (diametrul de 1 mm şi lungime de 50 mm) din sticlă subţire,
negradate, heparinate în interior;
- suport pentru păstrarea tuburilor de hematocrit între momentul recoltării şi al
centrifugării;
- riglă pentru citirea rapidă a hematocritului.
Tehnica de lucru
Se recoltează sânge capilar prin puncţionarea pulpei degetului sau sânge venos. După
umplerea tubului, capetele se închid la flacără sau cu plastilină şi se aşează în suportul de
păstrare până în momentul centrifugării. După terminarea recoltărilor, tuburile sunt aşezate
radiar pe suportul special amenajat, fixat pe rotorul centrifugii. Se centrifughează timp de
30 de secunde la 3000 rot/min, după care tuburile se scot şi se citesc cu ajutorul riglei ce
însoţeşte aparatul (figura 2.8.).
Tubul de hematocrit se pune în ghidajul A al riglei de citire şi se potriveşte cu ajutorul
butonului B, astfel ca limita inferioară a coloanei de hematii să coincidă cu linia de zero a
riglei, iar limita superioară a plasmei să coincidă cu linia de 100.
Se citeşte limita superioară a coloanei de hematii, gradaţia corespunzătoare reprezentând
valoarea hematocritului exprimată în procente.

100

A 90

80

70

60
100
50

80 40

60 30

40 20

20 10
0 0

Figura. 2.8. Riglă pentru citirea hematocritului

Corectarea rezultatelor. Corectarea rezultatelor este necesară deoarece:

- după centrifugare, printre hematii rămâne un volum de plasmă reprezentând 5% din
volumul eritrocitar;
- în cazul unui număr crescut de leucocite şi/sau trombocite este necesară scăderea
grosimii acestui strat din valoarea hematocritului;
- hematiile din sângele venos au volum mai mare decât hematiile din sângele arterial;
- utilizarea unui alt anticoagulant (în afara heparinei şi amestecului Wintrobe) poate
produce ratatinarea hematiilor.
Pentru calculul hematocritului sângelui total se va corecta hematocritul venos găsit,
conform formulei:
Ht somatic = Ht venos x 0,96 x 0,91 x 1,09 în care:
- 0,96 – factor de corecţie pentru plasma aflată printre hematii după centrifugare;
- 0,91 – factor de corecţie pentru volumul hematiei din sângele arterial faţă de hematia
din sângele venos;
- 1,09 – factor de corecţie pentru anticoagulantele care ratatinează hematiile (are
valoarea 1 pentru heparină şi amestecul Wintrobe).
- În cazul tehnicii prezentate de noi, factorul global de corecţie este 0,87.
Determinarea hematocritului se poate realiza şi prin metode moderne, cu un
analizor automat. Se determină numărul de eritrocite/litru de sânge prin măsurarea
intensităţii luminii reflectate de masa de eritrocite aflate într-un volum de sânge predefinit
si se calculeaza folosind formula hematocritului.
Erori de determinare a hematocritului. Determinarea hematocritului poate fi afectată de:
- exces de anticoagulant;
- tipul de anticoagulant;
- sângele arterial are un Ht cu 2% mai mic decât Ht din sângele venos;
- analizoarele automate pot da valori fals crescute;
- situaţii patologice care cresc (în mod fals) valoarea hematocritului: reticulocitoză,
leucocitoză mare, prezenţa de crioglobuline, macrotrombocite;
- situaţii patologice care scad (în mod fals) valoarea hematocritului: hemoliză in vitro,
autoaglutinare, microcitoză.
Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale hematocritului. Aceste valori sunt
prezentate în tabelul 2.3.

Tabelul 2.3. Valorile normale şi variaţiile fiziologice ale hematocritului

Teritoriul Efort Emoţii,
Sex Vârstă Altitudine Sarcină
circulator fizic stres
Nou
născut:
56 %
Sânge
1 lună: arterial:
Bărbaţi: 44,6 % 45 %
46  5%
Ht Ht crescut
6 luni:
crescut prin
36,2 % Sânge venos: Ht Ht scăzut prin
prin scăderea
47 % crescut hemodiluţie
contracţia pO2 în aerul
1 an:
splinei inspirat
Femei: 32 %
40  5% Sânge
4 ani: splenic:
37 % 70 – 80 %

12 ani:
40 %

Variaţii patologice ale hematocritului

- Scăderea hematocritului apare în anemii şi în situaţiile în care creşte volumul
plasmatic (hemodiluţie).
- Creşterea hematocritului apare în poliglobulii şi în situaţiile în care scade volumul
plasmatic.

Valorile extreme ale hematocritului se asociază cu stări patologice cu risc

vital:
- Ht < 20% : se asociază cu hipoxie severă care determină insuficienţă
cardiacă şi deces;
- Ht > 60%: se asociază cu creşterea accentuată a vâscozităţii sângelui,
tromboze locale şi coagularea spontană a sângelui.
Importanţa clinică a determinării hematocritului. Determinarea hematocritului se
recomandă în:
- Stări patologice în care se modifică numărul de hematii (anemii, poliglobulii).
- Stări patologice în care se modifică volemia.
- Stări post hemoragie.
- Stări de şoc.

Studiu individual

1. Consultând un dicţionar medical, cursul “Fiziologia sângelui” şi materialele

recomandate în bibliografie, vă rugăm să definiţi următorii termeni: volemie,
hipovolemie, hipervolemie, normocitemie, oligocitemie, policitemie, factor de
corecţie, coeficient, indice, raport, exprimare procentuală.
2. Ce variaţii fiziologice ale hematocritului cunoaşteţi? Cum se explică?
3. Cum influenţează numărul de hematii valoarea hematocritului?
FIŞĂ DE LUCRU ÎN LABORATOR

1. Prezentaţi principiul metodei de determinare a hematocritului.

................................................................................................................................................
2. Prezentaţi succesiunea etapelor corespunzătoare modului de lucru pentru determinarea
hematocritului prin micrometodă.

………………………………………………………………………………………….
……..............
3. Explicaţi necesitatea corectării hematocritului citit. Care sunt indicii de corecţie utilizaţi?

………………………………………………………………………………....................................
4. Care sunt valorile normale ale hematocritului?

………………………………………………………………………………....................................
5. Ce valoare are hematocritul plasmei?

………………………………………………………………………………....................................
6. Care sunt parametrii biologici de care depinde hematocritul?

………………………………………………………………………………....................................
7. Ce relaţii există între hematocrit şi vâscozitatea sângelui?

………………………………………………….……………………………...................................
8. Explicaţi variaţiile fiziologice ale hematocritului în funcţie de vârstă şi sex.

………………………………………………………………………………....................................
9. Explicaţi variaţiile hematocritului în funcţie de altitudine.

………………………………………………………………………………....................................
10. Explicaţi modificările hematocritului produse de efortul fizic.

………………………………………………………………………………....................................
11. În ce situaţii concrete recomandaţi determinarea hematocritului la un pacient?

………………………………………………………………………………....................................
12. Cum explicaţi importanţa procedurii „de luare de sânge” pacientului, aplicată foarte
frecvent în trecutul medicinei?

………………………………………………………………………………....................................