Anatomie Patologica

Indrumar
pentru
Lucrări Practice
pentru
Facultatea
de
Moașe
și
Asistenți medicali
2019 -2020

Prof. Univ. Dr. Emil Pleşea

a
 CUPRINS
TEHNICILE HISTOLOGICE............................................................................................................... 1
PROCESAREA TISULARA ....................................................................................................................... 1
Înregistrarea fragmentelor............................................................................................................. 1
Examinarea macroscopică ............................................................................................................. 1
Fixarea ........................................................................................................................................... 2
Includerea ţesutului........................................................................................................................ 5
Secţionarea .................................................................................................................................... 7
Colorarea ....................................................................................................................................... 9
Montarea ........................................................................................................................................ 9
Decalcificarea ................................................................................................................................ 9
ARTEFACTE ÎN SECŢIUNILE HISTOLOGICE .......................................................................................... 10
Pigmentul formol-hem.................................................................................................................. 10
Înlăturarea depozitelor de mercur ............................................................................................... 11
Artefacte datorită deshidratării insuficiente ................................................................................ 11
Alcoolul pe piese la parafină ....................................................................................................... 11
Artefacte la montare..................................................................................................................... 11
PROBLEME ÎN PROCESAREA TISULARĂ............................................................................................... 11
Fragmente flotante ....................................................................................................................... 11
SECURITATEA ÎN LABORATOR ............................................................................................................ 12
Ventilarea..................................................................................................................................... 12
Fişa compuşilor chimici ............................................................................................................... 12
Îndepărtarea ţesuturilor ............................................................................................................... 12
Instrucţiuni de folosire pentru echipamente................................................................................. 13
Situaţii pericuolase posibile ......................................................................................................... 13
COLORAŢIILE MANUALE ..................................................................................................................... 14
Hematoxilina ................................................................................................................................ 14
Eozina .......................................................................................................................................... 14
COLORAŢII SPECIALE .......................................................................................................................... 15
Coloraţiile pentru mucină ............................................................................................................ 15
Coloraţiile pentru amine biogene ................................................................................................ 16
Coloraţiile pentru melanină ......................................................................................................... 17
Coloraţiile pentru pigmenţii lipocromici (lipofuscina) ................................................................ 18
Coloraţiile pentru fier (hemosiderină) ......................................................................................... 18
Coloraţiile pentru calciu .............................................................................................................. 18
Coloraţiile pentru uraţi ................................................................................................................ 19
Coloraţiile pentru grăsimi ........................................................................................................... 20
Coloraţiile pentru ţesutul conjunctiv ........................................................................................... 20
Coloraţia Giemsa ......................................................................................................................... 21
Coloraţiile pentru microorganisme.............................................................................................. 21
Coloraţia AFB (acid fast bacilli) ................................................................................................. 22
Coloraţia argentică cu methenamină Gomori ............................................................................. 22
NECROPSIA ......................................................................................................................................... 23
PROSECTURA ...................................................................................................................................... 23
SALA DE NECROPSIE .......................................................................................................................... 23
MĂSURI DE PROTECŢIE CONTRA INFECŢIILOR ..................................................................................... 24
PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE NECROPSIEI ................................................................................................ 25
DESCRIEREA ORGANELOR .................................................................................................................. 26
PROTOCOLUL DE NECROPSIE .............................................................................................................. 28
Preambulul................................................................................................................................... 28
Partea descriptivă ........................................................................................................................ 28
Diagnosticul anatomopatologic ................................................................................................... 28
Concluzii ...................................................................................................................................... 29
 Tehnicile histologice

TEHNICILE HISTOLOGICE

PROCESAREA TISULARA
Ţesuturile prelevate în scop diagnostic se procesează în laboratorul
histologic, realizându-se lame ce sunt examinate la microscop de către
anatomopatolog.
Etapele procesării tisulare, fie ele biopsii, fragmente de rezecţie
chirurgicală sau ţesuturi prelevate de la autopsie, sunt următoarele:
 Înregistrarea fragmentelor
 Examinarea macroscopică
 Fixarea
 Includerea ţesutului
 Secţionarea
 Colorarea
 Montarea
Personalul care prelucrează ţesuturile şi realizează lamele cu secţiuni, este
alcătuit din histotehnicieni.

Înregistrarea fragmentelor
Fragmentele de ţesut primite în laboratorul de patologie chirurgicală sunt
însoţite de o fişă, ce conţine datele pacientului, istoricul şi precizarea originii
ţesutului.
Fragmentele sunt înregistrate, primind un număr pentru a putea fi
identificate.

Examinarea macroscopică
Fragmentele rezecate pentru diagnostic ajung în secţia de Anatomie
Patologică şi sunt examinate de către medic, asistentul anatomopatolog şi de
rezident.
Examinarea macroscopică constă în descrierea fragmentului şi
introducerea lui, în întregime sau doar a unor părţi din acesta, într-o casetă mică
de plastic, care conţine ţesutul în timpul includerii în parafină. Initial, casetele
sunt introduse într-un fixator.
Când se suspectează malignitatea, fragentul este acoperit cu cerneală,
pentru a marca marginile acestuia.
Dacă este necesar, se pot folosi diferite culori de cerneală pentru
identificarea mai multor arii.
La secţionare şi procesare, marginile reale ale secţiunii vor fi deja
marcate.

1
 Tehnicile histologice

Fixarea
Scopul fixării este de a conserva ţesuturile permanent, păstrându-le într-o
stare cât mai apropiată de cea naturală.
Nu există un fixator ideal, dar formaldehida se apropie destul de mult de
acest deziderat.
Există o mare varietate de fixatori ce pot fi folosiţi, în funcţie de tipul de
ţesut şi de caracteristicile ce urmează a fi evidenţiate.
Folosirea de rutină a anumitor fixatori în laboratorul de Anatomie
Patologică se bazează pe:
 natura fixatorului
 tipul de ţesut
 detaliile histologice ce urmează a fi evidenţiate.
Tipuri de fixatori
Există cinci mari grupe de fixatori, clasificaţi în funcţie de mecanismul de
acţiune:
 Aldehidici
 Pe bază de mercur
 Alcoolici
 Agenţi oxidanţi
 Pe bază de saruri ai acizilor picrici.
Aldehidele
Includ formadehida (formalina) şi glutaraldehida.
Acestea fixează prin formarea unor legături încrucişate între proteine, în
special între reziduurile de lizină. Aceste legături nu modifică sever structura
proteică şi în acest fel nu se pierde reactivitatea antigenică.
Fromaldehida - Poate fi folosită pentru tehnici imunoperoxidazice.
Formalina penetrează bine ţesutul, dar relativ încet.
Soluţia standard are concentraţie de 10% în soluţie de tampon neutru.
Tamponul atenuază aciditatea care ar putea declanşa autoliza şi cauzează
precipitarea pigmentului hem-formol în ţesuturi.
Glutaraldehida determină deformări ale structurii alfa-helice a
proteinelor, fiind neadecvat pentru coloraţii imunoperoxidazice.
Cu toate acestea, datorită fixării rapide realizate, poate fi folosit în
electrono-microscopie. Penetrează puţin ţesuturile, dar realizează cele mai bune
detalii citoplasmatice şi nucleare.
Soluţia standard folosită este de concentraţie 2% glutaraldehidă în soluţie
tampon.
Fixatori pe bază de mercur
Aceştia fixează ţesuturile printr-un mecanism necunoscut.
Conţin cloruri de mercur, fiind cunoscuţi sub numele de fixatori B-5 şi
Zenker.
Aceşti fixatori penetrează slab şi cauzează indurare tisulară, dar sunt
rapizi şi realizează detalii nucleare excelente.
2
 Tehnicile histologice
Sunt folosiţi la fixarea ţesuturilor hematopoietice ţi reticuloendoteliale.
Datorită conţinutului în mercut, trebuie depozitaţi cu atenţie.
Fixatorii pe bază de alcool
Alcoolul, inclusiv cel metilic (metanol) şi etilic (etanol), denaturează
proteinele şi nu este folosit de rutină, deoarece determină fragilitate şi duritate
tisulară.
Cu toate acestea, este foarte bun pentru frotiuri, acţionând rapid şi
asigurând detalii nucleare bune.
Spray-urile cu fixatori alcoolici sunt folosite de medicii care realizează
frotiuri Papanicolau.
Agenţii oxidanţi
Agenţii oxidanţi includ:
 Fixatori pe bază de permanganat (permanganat de potasiu),
 Fixatori pe bază de dicromat (dicromat de potasiu)
 Fixatori pe bază de tetraoxid de osmiu.
Aceştia realizează legaturi încrucişate între proteine, dar cauzează
denaturare excesivă. Unii dintre aceştia au utilizări speciale, dar sunt foarte
rar folosiţi.
Fixatori pe bază de săruri ai acizilor picrici
Includ fixatorii cu acid picric. Acidul picric în formă desidratată prezintă
risc de explozie.
Printre aceşti fixatori se găseşte şi soluţia Bouin, al cărei mecanism de
acţiune este necunoscut. Sub formă de soluţie colorează totul în galben, inclusiv
pielea.
Este aproape la fel de bună ca fixatorii pe bază de mercur în ceea ce
priveşte nuclei, dar nu cauzează la fel de multă indurare.
Factorii ce afectează fixarea
Există numeroşi factori care afectează fixarea tisulară:
 Tamponarea
 Penetrarea
 Volumul
 Temperatura
 Concentraţia
 Intervalul de timp
Tamponarea
Fixarea se realizează cel mai bine la un pH apropiat de cel neutru, cu
limite între 6 şi 8.
Hipoxia tisulară scade pH-ul, de aceea fixatorul trebuie să aibă capacitatea
de a tampon, prevenind astfel aciditatea excesivă.
Aciditatea favorizează formarea pigmenţilor formalin-hemici care apar ca
depozite tisulare negre, polarizabile.
Cele mai folosite soluţii tampon sunt:
 fosfatul
3
 Tehnicile histologice

 bicarbonatul
 cacodilatul
 veronalul
Formalina comercială este tamponată cu fosfat, la un pH de 7.
Penetrarea ţesuturilor
Penetrarea ţesuturilor depinde de capacitatea de difuziune a fiecărui
fixator, care este constantă.
Formalina şi alcoolul penetrează cel mai bine, iar glutaraldehida cel mai
puţin.
Între aceştia se situează cei pe bază de mercur şi alţi fixatori.
O metodă de a rezolva această problemă este secţionarea fină a
ţesuturilor (2 - 3 mm).
Penetrarea într-o secţiune subţire se va produce mult mai rapid,
comparativ cu o secţiune groasă.
Volumul de fixator
Volumul de fixator este important. Trabuie să existe un raport de 10:1
între fixator şi ţesut. O cantitate mai mică nu oferă o fixare ideală.
O soluţie a acestei probleme este schimbarea intervalelor de fixare
pentru a evita evaporarea fixatorului.
Agitarea specimenului în fixator va potenţa, de asemenea, fixarea.
Temperatura fixatorului
Creşterea temperaturii, ca în toate reacţiile chimice, va creşte viteza de
fixare, atât timp cât ţesutul nu se arde.
Formalina fierbinte fixează mai repede ţesuturile, acesta fiind primul pas
spre procesarea automată a ţesuturilor.
Concentraţia
Concentraţia de fixator trebuie ajustată spre cea mai mică valoare
posibilă, făcând metoda mai economică.
 Formalina - 10%;
 Glutaraldehida - 0.25% până la 4%.
O concentraţie prea mare poate afecta ţesutul şi poate produce acelaşi tip
de artefacte ca şi căldura excesivă.
Timpul
Foarte important este şi intervalul de timp dintre excizia ţesutului şi
fixare.
Fixarea ar trebui realizată cât mai curând după excizarea ţesutului (în
cazul patologiei chirurgicale) sau cât mai curând după deces (în cazul
necropsiilor), pentru a preveni autoliza.
Cu cât timpul este mai lung, cu atât se vor pierde mai multe organite
celulare, nucleul se va strânge şi vor apărea artefacte prin agregare.
Artefactele pot fi cauzate şi de uscarea ţesutului. În cazul prelungirii
intervalului de timp, ţesutul trebuie ţinut umed în soluţie salină.

4
 Tehnicile histologice
Fixatori de uz general
Formalina
Formalina este folosită de rutină, pentru toate ţesuturile din patologia
chirurgicală sau pentru cele prelevate de la autopsie, atunci când se realizează o
colaraţie cu Hematoxilină-Eozină.
Formalina este cel mai blând fixator, atunci când condiţiile nu sunt ideale,
fără să deterioreze în mod semnificativ nici un ţesut.
Cei mai mulţi clinicieni şi asistente pot înţelege ce este şi ce face
formalina, aceasta având un miros suficient de neplăcut pentru a determina
manevrarea cu prudenţă.
Fixativul Zenker
Fixativul Zenker este recomandat pentru ţesuturi reticulo-endoteliale,
inclusiv noduli limfatici, splină, timus şi măduvă osoasă.
Acesta fixează foarte bine nucleii, conferind detalii bune.
Depozitele de mercur trebuie îndepărtate (dezenkerizare) înainte de
colorare, altfel apărând depozide negre pe secţiune..
Soluţia Bouin
Soluţia Bouin este recomandată uneori pentru fixarea testiculului, a
tractului gastrointestinal şi a ţesutului endocrin.
Se poate folosi şi pentru ţesuturi hematopoietice şi nu necesită
dezinkerizare înainte de colorare.
Glutaraldehida
Glutaraldehida este recomandată pentru fixarea ţesuturilor destinate
examinării prin microscopie electronică.
Glutaraldehida trebuie să fie rece şi tampontă şi nu mai veche de 3 luni.
Ţesutul trebuie să fie cât mai proaspăt posibil şi preferabil secţionat în
glutaraldehidă, la o grasime de până într-un milimetru, pentru a potenţa fixarea.
Fixatorii pe bază de alcool
Alcoolul, în special etanolul, este folosit în primul rând pentru frotiuri.
Etanolul (95%) este rapid şi ieftin.
Datorită grosimii frotiurilor de doar una până la câteva celule, nu există
problema ratatinării, iar datorită faptului că ţesuturile nu sunt secţionate,
friabilitatea indusă nu este o problemă.
Pentru fixarea secţiunilor la gheaţă se poate folosi orice, dar cei mai buni
fixatori rămân metanolul şi etanolul.

Includerea ţesutului
După fixare, ţesutul trebuie procesat spre o formă din care se pot realiza
secţiuni microscopice.
Includerea la Parafină
Cea mai comună metodă de includere este includerea la parafină.
Ţesutul inclus în parafină, care are o densitate asemănătoare ţesutului,
poate fi secţionat între 3 şi 10 microni, în general între 6 şi 8.

5
 Tehnicile histologice

Tehnica de fixare a ţesuturilor în parafină se numeşte procesare.

Principalii paşi ai acestui process sunt deshidratarea şi clarificarea.
Deshidratarea
Ţesuturile fixate în soluţii apoase nu pot fi incluse direct în parafină.
În primul rând trebuie îndepărtată apa din ţesuturi, prin deshidratare.
Aceasta se realizează cu o baterie de alcooluri, cu concentraţie
crescătoare de la 70% până la 95% sau 100%.
Uneori primul pas este realizat cu o soluţie de formalină şi alcool.
Alte soluţii de desidratare care pot fi folosite au mari dezavantaje.
Acetona acţionează foarte rapid, dar este foarte imflamabilă, fiind sigură
numai pentru ţesuturi mici, procesate manual.
Dioxanul poate fi folosit fără clarificare, dar emană gaze toxice.
Clarificarea
Următorul pas este numit "clarificare" şi constă în îndepărtarea soluţiei de
deshidratere cu o substanţă miscibilă cu mediul de includere (parafina).
Cel mai utilizat agent de clarificare este xilenul.
Toluenul este mai tolerant faţă de cantităţile mici de apă remanente în
ţesut, dar este de 3 ori mai scump decât xilenul.
Cloroformul a fost folosit în trecut, dar este toxic şi acţionează încet.
Salicilatul de metil este rareori folosit datorită preţului ridicat, acesta
având un miros plăcut.
Există astăzi agenţi noi de clarificare ce pot fi utilizaţi.
Multi dintre aceştia au ca bază limolina, un ulei volatil gasit în frunzele
citricelor.
Se mai pot folosi hidrocarburile alifatice cu lanţ lung (Clearite).
Parafinarea
Ţesutul se infiltrează cu agentul de includere, care este în aproape toate
cazurile, parafina.
Se pot achiziţiona parafine cu temperaturi de topire diferite, în funcţie de
alegerea histotehnicianului şi de climat (cald vs. rece).
Paraplastul este un produs ce conţine aiditivi plastici, făcând blocurile
mai uşor de tăiat pentru unii tehnicieni.
Se poate aplica un aspirator în interiorul aparatului de procesat ţesutul,
pentru a asista penetrarea agentului de includere.
Includerea automatizată
Paşii de mai sus sunt aproape întotdeauna automatizaţi, pentru volume
mari de ţesuturi ce trebuie procesate.
Automatizarea constă într-un instrument ce mută ţesutul în diferiţi agenţi,
la un anumit interval de timp prestabilit.
Procesorul de ţesuturi "technicon" este cel mai comun şi mai fiabil dintre
toate (un processor mecanic cu motor electric), dar nu se mai fabrică.

6
 Tehnicile histologice

Formarea blocurilor
Ţesuturile ce ies din procesor sunt încă în casete şi trebuie puse manual în
blocuri, de către technician, care ridică ţesutul din casetă şi toarnă parafină topită
peste ele.
Procesul de includere este foarte important, deoarece ţesutul trebuie
aliniat sau orientat în mod adecvat în blocul de parafină.
Ca alternativă pentru parafină se pot folosi diferite materiale plastic, ce
permit o secţionare mai fină. Aceste materiale includ:
 metil metacrilat
 glicol metacrilat
 aralditepon
Metil-matacrilatul este foarte dur, fiind folosit la includerea oaselor
nedecalcifiate.
Glicol-metacrilat este uşor de manevrat, din această cauză fiind foarte
des folosit.
Aralditul este aproape la fel ca metacrilatul, dar procesul de includere
este mai complex.
Eponul este folosit de rutină pentru microscopia electronică, unde
secţiunile trebuie să fie foarte fine.
Materialele plastice necesită reactivi speciali, dar scumpi, pentru
desidratare şi clarificare. Din acest motiv, şi datorită faptului că puţine ţesuturi
sunt incluse în materiale plastice, procesul este în general manual.
Pentru secţionarea acestor blocuri se folosesc microtoame speciale.
Blocurile trebuie să fie mici, tehnica pretându-se la biopsii, cum ar fi cele de
măduvă osoasă sau ficat.
Includerea la ghiaţă
Câteodată, în timpul intervenţiilor chirurgicale, este necesar un diagnostic
anatomopatologie rapid. Acesta poate fi cerut pentru:
 Siguranţa marginilor de rezecţie
 Procesul decizional, atunci când este întâlnită o leziune neaşteptată
 A şti dacă s-a recoltat ţesutul adecvat pentru diagnostic.
Toate acestea se realizează prin folosirea includerii ţesuturilor în gheaţă.
Ţesuturile sunt îngheţate instant într-un lichid rece sau în mediu rece (-20
până la -70 Celsius). Îngheţarea face ca ţesutul să fie îndeajuns de solid pentru
secţionare cu microtomul.

Secţionarea
Blocul de parafină
După includerea ţesutului, acesta trebuie secţionat pentru montarea
lamelor.
Aceasta se realizează cu microtomul. Microtomul este un cuţit cu un
mechanism ce avansează în blocul de parafină, la distanţe standard.

7
 Tehnicile histologice

Există trei condiţii pentru o secţionare adecvată: (1) un cuţit foarte ascuţit
(2) un cuţit foarte ascuţit şi (3) un cuţit foarte ascuţit.
Cuţitele sunt:
 Din metal gros standard
 Subţiri şi detaşabile (ca o ramă de ras detaşabilă).
Blocurile de plastic (metacrilat, araldit sau epon) se secţionează cu:
 Cuţite de sticlă
 Cuţite de diamant
Cuţitele de sticlă pot secţiona la aproape 1 micron. Secţiunile pentru
microscopia electronică (la 1/4 microni) sunt secţionate cel mai bine cu cuţitul
de diamant, care este foarte scump (2500 $).
Microtoamele au un mecanism de avansare în bloc, în partea opusă
cuţitului.
În general această distanţă poate fi setată, pentru majoritatea ţesuturilor
incluse în parafină fiind de 6-8 microni.
Cu cât este mai scump microtomul ($15,000 - $20,000), cu atât acest
mechanism este mai rezistent în timp .
Secţionarea ţesuturilor este o adevărată artă, necesitând multă pricepere.
Histotehnologii sunt artiştii laboratorului.
Este important ca ţesutul să fie bine fixat şi inclus, pentru a evita
artefactele ce pot apărea la secţionare.
Cele mai frecvente artefacte sunt:
 ruperea
 despicarea
 găurirea
 plisarea
 "petele oarbe veneţiene"
După tăiere, secţiunile sunt introduce într-o baie de apă caldă care înlătură
pliurile. Sunt pescuite pe o lamă de microscop.
Lamele de sticlă sunt apoi puse într-un cuptor călduţ pentru aproximativ
15 minute pentru ca secţiunea să adere la lamă.
Această etapă poate dăuna antigenilor (pentru imunohistochimie); se
poate evita prin folosirea lamelor cu suprafaţă acoperită de o substanţă adezivă.
Secţiunile la gheaţă
Secţiunile la gheaţă sunt realizate cu un instrument numit criostat.
Criostatul este o ladă frigorifică ce conţine microtomul. Temperatura în
interiorul criostatului este de -20 până la -30 grade Celsius.
Ţesuturile sunt secţionate şi întinse pe o lamă de sticlă. Sunt apoi colorate
rapid.

8
 Tehnicile histologice

Colorarea
Deparafinarea
Ţesuturile ce conţin parafină nu pot fi colorate. Pentru a îndepărta ceara
din ţesut şi a permite coloranţilor solubili în apă să penetreze ţesuturile sunt
parcurse invers etapele procesului de includere.
Îndepărtarea parafinei din ţesuturi se face ajutorul agenţilor de clarificare
dintre care clm ai frecvent utilizaţi sunt xilenul şi toluenul.
Hidratarea
Hidratarea ţesutului după îndepărtarea parafinei se face tot cu ajutorul
alcoolurilor ca şi deshidratarea numai că, de data aceasta, alcoolurile din bateria
de hidratare au concentraţie descrescătoare de la 100% la 70%. Ultima etapă
presupune hidratarea cu apă de la robinet.
Colorarea propriu-zisă
Procesul de colorare foloseşte o gamă largă de coloranţi, selectaţi pentru
capacitatea lor de a marca anumite component celulare ale ţesutului.
Coloraţia de rutină este hematoxilină-eozină (HE). Alte coloraţii sunt
supranumite "coloraţii speciale" deoarece sunt efectuate în situaţii speciale, în
funcţie de diagnosticul urmărit.
Secţiunile colorate trec din nou printr-un proces de deshidratare cu soluţii
alcoolice cu concentraţie crescătoare de la 80% la 100% şi printr-o ultimă etapă
de clarificare cu agenţii de clarificare menţionaţi.
Secţiunile la gheaţă sunt colorate manual, proces ce este mai rapid pentru
una sau două secţiuni individuale. Colorarea este progresivă, secţiunea fiind
lăsată în contact cu colorantul până se obţine nuanţa dorită.

Montarea
Secţiunile de pe lamă care au fost colorate, trebuie acoperite cu o lamelă
subţire de plastic sau sticlă, pentru a proteja ţesutul de deteriorare, pentru a
îmbunătăţi imaginea la microscop şi pentru a putea păstra secţiunea mai mulţi
ani.

Decalcificarea
Unele ţesuturi conţin depozite de calciu care nu permit secţionarea
adecvată atunci când sunt incluse în parafină, datorită densităţilor diferite ale
calciului şi parafinei.
Fragmentele osoase sunt cele mai fracvente, dar există şi ţesuturi cu zone
de calcificare. Acest cacliu trebuie îndepărtat înainte de includere.
Pentru decalcificare au fost folosite tehnici variate, dar nici una dintre
acestea nu este perfectă. Au fost folosite:
 Acizi minerali
 Acizi organici
 EDTA

9
 Tehnicile histologice

 Electroliza
Acizi minerali tari cum ar fi acidul azotic sau clorhidric sunt folosiţi
pentru osul de tip cortical, îndepărtând rapid mari cantităţi de calciu. Din
păcate, aceşti acizi puternici modifică morfologia celulară, nefiind recomandaţi
pentru ţesuturi delicate, cum ar fi măduva osoasă.
Acizii organici cum ar fi acidul acetic şi acidul formic sunt mai potrivite
pentru măduva osoasă, deoarece nu acţionează la fel de dur. Aceştia acţionează
încet pe osul compact cortical.
Acidul formic în concentraţie de 10% este, per ansamblu, cel mai bun
decalcifiant.
Se pot găsi unele soluţii comerciale ce combină acidul formic cu
formalina, pentru a fixa şi a decalcifica ţesuturile în acelaşi timp.
EDTA poate îndepărta calciul şi este blând (nu este un acid), dar nu
penetrează bine ţesuturile, acţionează încet şi este scump în cantităţi mari.
Electroliza a fost încercată experimental când calciul trebuia îndepărtat
cu minime modificări la nivelul ţesutului. Aceasta acţionează încet, nefiind
adecvată pentru folosire zilnică, de rutină.

ARTEFACTE ÎN SECŢIUNILE HISTOLOGICE

Artefactele ce apar la nivelul preparatelor colorate pot rezulta din:
 fixare neadecvată
 tipul de fixator folosit
 deshidratare slabă cu infiltrarea parafinei
 reactivi neadecvaţi
 secţionare defectoasă cu microtomul

Pigmentul formol-hem
Prezenţa unui precipitat negru fin pe lame, adesea fără relaţie cu ţesutul
de bază (ex: precipitatul apare adiacent ţesutului, la nivelul interstiţiului sau al
vaselor), sugerează formarea unui pigment între formol şi hemoglobină.
Acesta poate fi confirmat în microscopie cu lumină polarizată, apărând
alb-strălucitor (ca cerul înstelat).
Pigmentul formalină-hem este adesea întâlnit în ţesuturi dens celulare sau
ţesuturi ce conţin sânge şi în ţesuturile prelevate de la necropsie.
El se formează când soluţia tampon din formalină este epuizată şi ţesutul
se acidifică, iniţiind formarea unui complex între hemul din eritrocitele alterate
şi formol.
Ţesuturile cum ar fi splina şi ţesutul limfatic sunt în special susceptibile la
acest artefact.
Secţionarea fină şi folosirea unei cantităţi suficiente de formol tamponat,
neutru, (raport 10:1 fixator:ţesut) pot fi de ajutor.
Daca soluţia de fixare are culoare maronie spre roşu, ţesutul trebuie
plasat într-un fixator nou.

10
 Tehnicile histologice

Înlăturarea depozitelor de mercur

Prezenţa unor agregate neregulate, negre, la nivelul ţesuturilor fixate cu
fixator pe bază de mercur, care precipită pe lamă, dovedeşte că aceste ţesuturi nu
au fost "dezenkerizate" anterior colorării. Aceste precipitate negre apar albe în
lumină polarizată.

Artefacte datorită deshidratării insuficiente

Ţesuturile deshidratate insuficient înainte de clarificare şi infiltrare cu
parafină se secţionează greu la microtom, cu artefacte apărute prin ruptura
sau găurirea secţiunilor.
Ciclurile de procesare tisulară trebuie să acorde suficient timp
deshidratării, iar concentraţia soluţiei etanolice finale trebuie să fie 100%.
În medii ambientale umede, acest deziderat se atinge greu.
Acoperirea soluţiilor şi izolarea lor de mediul înconjurător pot fi de ajutor.
Aerul condiţionat (cu agenţi de răcire, nu cu răcire prin vapori) poate de
asemenea să reducă umiditatea în laborator.
Toluenul, ca agent de clarificare, este mai blând cu ţesuturile slab
deshidratate, dar este mai scump şi este mai dăunător pentru sănătate decât
agenţii non-xilenici de clarificare.

Alcoolul pe piese la parafină

Deşi alcoolul, cum ar fi etanolul, fixează excelent frotiurile, are tendinţa
de a friabiliza ţesuturile, realizând artefacte la secţionarea cu microtomul.

Artefacte la montare
Se pot forma bule de aer sub lamelă atunci când mediul de montare este
prea sărac, uscându-se şi trăgând aer sub lamelă.
Contaminarea agenţilor de clarificare sau a mediului de montare pot
produce bule la examinarea microscopică.

PROBLEME ÎN PROCESAREA TISULARĂ

Fragmente flotante
"Fragmentele flotante" sunt mici bucăţi de ţesut care apar pe lamă care au
plutit în timpul procesării.
Procedură defectuoasă în timpul tăierii fragmentelor
Fragmentele flotante pot apărea datorită:
 prosoapelor murdare
 instrumentarului murdar
 mănuşilor murdare
ce pot avea fragmente de ţesuturi de la cazul anterior.
Este esenţial să se prelucreze fiecare ţesut separat, curăţind masa înainte
de deschiderea cazului următor.
11
 Tehnicile histologice
Cea mai bună metodă de a evita fragmentele flotante este de a separa
specimenele asemănătoare. De exemplu, dacă avem două cazuri cu fragmente
prostatice, acestea trebuie intercalate între specimene total diferite, cum ar fi
utere. În acest fel, dacă se încurcă numerele, se scriu greşit etichetele sau se
transportă ţesuturi de la un caz la altul, greşeala va fi evidentă. În caz contrar,
transportul unui fragment prostatic peste alt fragment prostatic sau încurcarea
numerelor unor ţesuturi identice, face ca acestea să nu mai poată fi recunoscute.
Casete reutilizabile
Dacă se folosesc casete reutilizabile, trebuie să ştim că fragmentele
flotante pot apărea chiar şi la câteva zile de la utilizarea iniţială.
Problema apare când, în timpul includerii, nu se îndepărtează tot
fragmentul tisular din casetă. La clarificare nu se îndepărtează toată ceara.
Următoarea persoană care foloseşte caseta nu acordă atenţie ţesutului déjà
existent, plasând un fragment în interiorul acesteia. Fragmentul flotant apărut pe
lamă va părea bine fixat deoarece a fost procesat în parafină.
Identificarea adecvată a ţesutului
Asigură-te întotdeauna că ai identificat ţesutul!
Fragmentul primeşte un număr. Acest număr trebuie să însoţească mereu
fragmentul. Eticheta fragmentului tisular trebuie să corespundă cu fişa de
însoţire.
O casetă trebuie însoţită mereu de un număr.

SECURITATEA ÎN LABORATOR
Ventilarea
Laboratorul trebuie să fie bine ventilat.
Există reglementări asupra folosirii formolului şi hidrocarburilor, cum ar
fi xilenul şi toluenul.

Fişa compuşilor chimici

Fiecare compus chimic folosit în laborator trebuie însoţit de o fişă de
securitate a materialului, care specifică natura, toxicitatea şi măsurile de
precauţie la utilizare.

Îndepărtarea ţesuturilor
Laboratorul trebuie să aibă o metodă de eliminare a deşeurilor.
În general, clinicile fac contract cu firme de eliminare a deşeurilor.
Ţesuturile colectate se păstrează în formalină şi pot fi incinerate sau fragmentate
printr-un mechanism ataşat la o chiuvetă (similar unei mari unităţi de eliminare a
deşeurilor).

12
 Tehnicile histologice

Instrucţiuni de folosire pentru echipamente

Toate instrumentele folosite în laborator trebuie să aibă specificaţii de
folosire a electricităţii şi instrucţiuni scrise privind utilizarea lor.
Produsele inflamabile
Produsele inflamabile pot fi stocate în camere speciale destinate acestui
scop.
Procedurile de siguranţă în caz de incendiu trebuie afişate. Echipamentele
de siguranţă includ instinctoare, pături neinflamabile şi alarme de incendiu uşor
accesibile. Duşul şi o facilitate de spălare a ochilor trebuie să fie la îndemână.
Accidentele de laboratoar trebuie raportate.

Situaţii pericuolase posibile

Aceste situaţii includ:
 Soluţia Bouin este alcătuită din acid picric. Acest acid este vândut
doar în stare lichidă. Când se usucă, devine exploziv.
 Multe chituri de reactivi conţin un conservant numit azidă de sodiu.
Aceste soluţii trebuie aruncate la chiuvetă împreună cu multă apă,
deoarece acest compus formează azide metalice în instalaţie, acestea
fiind explozive.
 Benzidina, benzenul, antracenul şi naptolul conţin compuşi
carcinogeni care nu ar trebui folosiţi.
 Soluţiile ce conţin mercur (Zenker sau B-5) trebuie eliminate în
cuve speciale. Mercurul, aruncat la chiuvetă, formează amalgam cu
metalele ce nu mai pot fi înlăturate.

13
 Tehnicile histologice

COLORAŢIILE MANUALE
Hematoxilina
Hematoxilina este un produs oxidat din arboreal de băcan (SANTAL)
cunoscut ca hematină.
Deoarece acest arbore este foarte rar în zilele noastre, majoritatea
hematinei este obţinută sintetic.
Pentru a fi folosită ea trebuie "murată" sau oxidată.
Acest lucru se poate realiza:
 Natural, prin depozitarea acesteia pe raft şi utilizarea în câteva luni
 Peni cumpararea unei hematoxiline “murate”
 Prin adăugarea unor agenţi în hematină.
Hematoxilina nu colorează direct ţesuturile, necesitând un "mordant" sau
conector la ţesut. Acesta poate fi un cation metalic, cum ar fi:
 fierul
 aluminiul
 tungstenul.
Exiastă multe varietăţi de hematoxilină, în funcţie de tipul de ion metallic
folosit. Acestea variază în intensitate şi culoare.
Hematoxilina, un colorant de bază, are afinitate pentru acizii nucleic
din nucleul celulei.
Hematoxilina colorează "regressiv" or "progresiv".
Coloraţia regresivă – secţiunile sunt lăste în soluţie pentru un anumit
timp, apoi reintroduse într-o soluţie precum acidul-alcool, care îndepărtează
parţial culoarea. Această metodă se pretează pentru grupuri de secţiuni.
Coloraţia progresivă – secţiunea se introduce în hematoxilină până când
se obţine intensitatea dorită, în general pentru secţiunile la gheaţă. Se foloseşte
uşor pentru o singură secţiune, fiind puţin eficientă pentru grupuri mari de
secţiuni.

Eozina
Eozina este un colorant acid cu afinitate pentru componentele
citoplasmatice ale celulei.
Există o gamă largă de eozine sintetizate pentru uz, cu nuanţe diferite, dar
toate acţionează similar.
Singura problem ce poate apărea este supracolorarea, în special pentru
ţesuturile supuse decalcificării.

14
 Tehnicile histologice

COLORAŢII SPECIALE
Coloraţiile pentru mucină
Există o mare varietate de coloraţii pentru mucină, toate având ca scop
evidenţierea unuia sau mai multor tipuri de substanţe mucopolizaharidice
tisulare.
Aceste tipuri de mucopolizaharide sunt următoarele:
 Neutre – Sunt întalnite în glandele tractului digestiv şi în prostată.
Sunt PAS-pozitive însă nu se colorează cu albastru alcian, fier
coloidal, mucicarmină sau coloranţi metacromatici.
 Acide simple sau nonsulfatate – Sunt mucinele tipice ale celulelor
epiteliale ce conţin acid sialic. Sunt PAS-pozitive, se colorează cu
albastru alcian la un pH de 2,5, fier coloidal şi coloranţi
metacromatici. Sunt rezistente la digestia hialuronidazei.
 Acide simple, mezenchimale – Acestea conţin acid hialuronic şi se
găsec în stroma diferitelor ţesuturi. Nu se colorează cu PAS dar se
colorează cu albastru alcian la pH 2,5, fier coloidal şi coloranţi
metacromatici. Sunt digerate de acidul hialuronic. Sunt întâlnite în
sarcoame.
 Acide complexe sau sulfatate, epiteliale – Sunt întâlnite în
adenocarcinoame. Sunt de obicei PAS-pozitive. Coloraţia cu albastru
alcian este pozitivă la pH = 1. Coloraţiile cu fier coloidal, mucicarmin
şi coloranţi metacromatici sunt de asemenea pozitive. Sunt rezistente
la digestia hialuronidazică.
 Acide complexe, ţesut conjunctiv – Sunt întâlnite în stroma tisulară,
cartilagii, os şi includ substanţe cum ar fi condroitinsulfatul sau
keratansulfatul. Sunt PAS-negative dar se colorează selectiv cu
albastru alcian la pH = 0.5.

Există o mare varietate de coloraţii pentru mucine.

Coloraţia PAS (acid periodic Schiff)
Este coloraţia cea mai sensibilă însă, în vederea obţinerii unui grad mai
mare de specificitate este necesară o foarte bună interpretare. Această coloraţie
este folositoare în multe situaţii.
Colorează atât glicogenul, mucina, mucoproteinele precum şi fungi.
Pentru înlăturarea glicogenului trebuie efectuată o predigerare a ţesutului cu
amilază.
Coloraţia PAS este utilă în evidenţierea structurilor tisulare – membrane
bazale, capsule, vase sangvine etc. Nu colorează foarte multe lucruri şi în
consecinţă fundalul ramâne intact.

Exemplificare: Plansa 1

15
 Tehnicile histologice
Coloraţia cu Mucicarmin
Coloraţia cu mucicarmin are specificitatea cea mai mare pentru mucină.
Având însă, o intensitate foarte mare, nu este foarte folositoare.
Mucicarminul are specificitate mare pentru mucinele epiteliale.

Exemplificare: Plansa 2

Coloraţia cu Albastru alcian

Coloraţiile cu albastru alcian sunt foarte simple dar în acelaşi timp
colorează destul de mult şi fondul.
Pentru o mai mare specificitate se ajustează pH-ul.

Exemplificare: Plansa 3

Coloraţia cu Fier coloidal („AMP”)

Particulele de fier sunt stabilizate în amoniac şi glicerină şi sunt atrase de
mucopolizaharide. Necesită fixare cu formol. Se pot colora de asemenea şi
fosfolipidele şi acizii nucleici liberi.
Culoarea albastră provine de la colorarea cu albastru de Prusia.
În vederea obţinerii unei specificităţi mai mari, ţesutul poate fi predigerat
cu hialuronidază.
Coloraţiile cu fier coloidal sunt imprevizibile.

Coloraţiile pentru amine biogene

Celulele care produc hormoni polipeptidici, amine active sau precursori ai
aminelor (epinefrină sau norepinefrină) pot fi libere (celulele Kulchitsky ale
tractului digestiv) sau grupate (medulara adrenală).
Clasificarea următoare este cea clasică, bazată pe capacitatea celulelor de
a reduce nitratul de argint amoniacal la argint metalic (depozite de culoare
neagră pe secţiuni):
 Cromafine
 Argentafine
 Argirofile (necesită prereducere)
Deosebirea dintre cromafin şi argentafin este legată de fixatorul folosit.
Celulele „cromafine” posedă granule citoplasmatice ce se colorează maro
în urma fixării cu o soluţie de dicromat.
Celulele „argentafine” reduc soluţia de argint la argint metalic după fixare
cu formol.
Oricare din cele două reacţii pot fi efectuate, în funcţie de fixatorul folosit.
De obicei reacţia cromafinică este asociată cu medulara adrenală sau
ţesutul paraganglionar extraadrenal (feocromocitom) în timp ce reacţia
argentafinică este asociată cu tumorile carcinoide ale intestinului.

16
 Tehnicile histologice
Introducerea etapei de prereducere poate duce la colorarea unui număr
mai mare de celule care în acest caz, sunt denumite argirofile.
 Coloraţii pentru celule argentafine:
 Diazo (săruri diazoice)
 Fontana-Masson
 Schmorl
 Autofluorescenţa
 Coloraţii pentru celule cromafine:
 Giemsa modificat
 Schmorl
 Wiesel
 Coloraţii pentru celule argirofile:
 Grimelius (preferabilă folosirea soluţiei Bouin ca fixator)
 Pascual

Coloraţiile pentru melanină

Melanina este de obicei întâlnită la nivelul tegumentului, ochiului şi
substanţei negre. Poate fi de asemenea întâlnită în melanoame.
Metoda uzuală Fontana-Masson (coloraţia pentru melanină) se bazează pe
proprietatea granulelor de melanină de a reduce nitratul de argint amoniacal
(există şi alţi pigmenţi argentafini, cromafini şi lipocromici care se colorează tot
în negru).
Metoda Schmorl foloseşte proprietăţile reducătoare ale melaninei pentru a
colora granulele în albastru-verzui.
Metoda cu specificitatea cea mai mare este o metodă histochimică
enzimatică denumită DOPA-oxidaza. Pentru a obţine rezultate bune este
necesară folosirea secţiunilor congelate, putând fi însă folosite şi secţiuni din
blocuri de parafină cu condiţia unei foarte bune fixări anterioare.
Mecanismul acestei reacţii se bazează pe acţiunea DOPA-oxidazei asupra
substratului DOPA la nivelul celulelor ce produc melanină, rezultatul fiind
apariţia unor depozite de culoare maron închis.
Tehnicile de decolorare urmăresc îndepărtarea melaninei în vederea
obţinerii unei imagini mai bune a morfologiei celulare. Acestea folosesc agenţi
oxidanţi puternici cum ar fi permanganatul de potasiu sau perhidrolul.
Decolorarea melaninei oculare durează câteva ore în timp ce melanina
tegumentară se deceolorează în cîteva minute.
Fluorescenţa indusă de formaldehidă poate fi folosită pentru a evidenţia
aminele biogene (cromafine, argentafine) şi melanina tisulară. Fixarea cu formol
conferă ţesutului necolorat şi inclus în parafină o autofluorescenţă de culoare
galben aprins.
Pseudomelanina din melanosis coli este PAS-pozitivă în timp ce melanina
adevărată este PAS-negativă. Mai mult, pigmentul pseudomelanic este întâlnit
de obicei în macrofage.
17
 Tehnicile histologice

Exemplificare: Plansa 4

Coloraţiile pentru pigmenţii lipocromici (lipofuscina)

Sunt produşii de degradare rezultaţi în urma oxidării lipidelor şi
lipoproteinelor.
Ei sunt pigmenţii de uzură întâlniţi cel mai frecvent la nivelul cordului,
ficatului, SNC şi cortexului adrenal (zona reticularis).
O altă formă de pigment lipocromic este mul mai puţin oxidatul pigment
„ceroid” din interstiţiul testicular şi veziculele seminale.
Pigmetul lipocromic se coloerază folosind tehnicile Sudan B, Ziehl-
Neelsen şi Schmorl.
Poate de asemenea prezenta o autofluorescenţă de culoare portocaliu
aprins pe secţiunile necolorate fixate în formol şi incluse în parafină.

Exemplificare: Plansa 5

Coloraţiile pentru fier (hemosiderină)

Hemosiderina (granule de stocare a fierului):
 poate fi prezentă în zonele de hemoragie veche (hemosideroza este
noţiunea folosită în cazul în care fierul nu interferă cu funcţia
organului)
 poate fi depozitată în ţesuturile cu suprancărcare de fier
(hemocromatoza care implică existenţa unei supraîncărcări cu fier
asociată cu alterare funcţională).
Coloraţia Perls reprezintă tehnica clasică pentru evidenţierea fierului
tisular.
Secţiunile sunt tratate cu acid clorhidric în vederea eliberării ionilor de
fier legaţi de proteinele de legare. Aceşti ioni reacţionează apoi cu ferocianatul
de potasiu rezultând un compus insolubil de culoare albastră (reacţia cu albastru
de Prusia).
Se pare că fixatorii pe bază de mercur sunt mai buni decât formolul,
păstrând mai bine fierul de la nivelul măduvei osoase.

Exemplificare: Plansa 6

Coloraţiile pentru calciu

Prin metodele de colorare poate fi evidenţiat numai calciul legat de un
anion (cum ar fi PO4 sau CO3).
Calciul şi hematoxilina formează un compus de culoare negru-albăstrui,
de obicei cu margini nete, ce dă o culoare albastră pe lamele colorate cu H-E.
18
 Tehnicile histologice
Coloraţia VonKossa este o metodă de reducere a argintului ce
evidenţiază fosfaţi şi carbonaţii, prezenţi de obicei alături de calciu. Această
metodă este utilă în cazul în care există cantităţi mari de calciu, cum este cazul
ţesutului osos.
Roşul de alizarină S formează împreună cu calciul un compus de culoare
roşu-portocaliu la pH = 4,2. Cele mai bune rezultate se obţin în cazul în care
există cantităţi mici de calciu (de exemplu în cazul corpilor Michaelis-Gutman).
Metoda cu alizarină este folosită şi de analizatorul Dupont ACA ce
măsoară calciul seric prin metoda fotometrică.
Pentru a diferenţia ţesutul osos osteoid de cel mineralizat se foloseşte
coloraţia Azan.

Coloraţiile pentru uraţi

Cristalele de acid uric apar în urina acidă. La nivel tisular, uraţii sunt
prezenţi sub forma uratului de sodiu.
Sunt solubili în soluţii apoase şi puţin solubili în soluţii alcoolice slabe.
În consecinţă, pentru a preveni pierderea uraţilor din ţesuturi, acestea
trebuie fixate în alcool 95% sau alcool absolut.
Uraţii se colorează în negru cu argint de methenamină.
Cristalele de urat de sodiu prezintă de asemenea proprietatea de
birefringenţă în lumină polarizată. În cazul în care axul lung al cristalului este
orientat în direcţia undei lente şi dacă se foloseşte un filtru roşu, cristalele
prezintă birefringenţă negativă (culoare galbenă). La un unghi de 90º cristalele
sunt albastre.

Exemplificare: Plansa 7

Pigmenţii şi mineralele mai sus menţionate provin din înconjurător şi

pătrund în organism prin inhalare, ingestie sau contact cu tegumentele expuse.
Uneori, pătrunderea acestora în organism este rezultatul expunerii la noxe
profesionale (industria mineritului). Alteori acestea ajung în organism în mod
intenţionat (tatuaje).
Carbonul este prezent în organism sub forma pigmentului antracotic la
nivelul plămânului. Poate fi deosebit de pigmentul melanic prin efectuarea
decolorării melaninei.
Ţesuturile slab fixate pot conţine pigment formol-hem de culoare neagră
şi uşor granular, însă acesta este dispersat la nivelul ţesuturilor nerespectând
criteriul celular. Şi acest pigment prezintă proprietatea de birefringenţă în
lumină polarizată.
Azbestul este un tip particular de cristale de siliciu lungi şi subţiri, şi
anume siliciu liber cristalin.La nivel tisular aceste cristale au acţiune puternic
iritativă şi fibrogenă.

19
 Tehnicile histologice
Fibrele sunt înconjurate de un matrix format din proteine, fier şi calciu ce
le conferă aspectul de “shish-kebab”. Aceste formaţiuni sunt denumite “corpi
feruginoşi” deoarece pot fi evidenţiaţi cu ajutorul unei coloraţii pentru fier.

Figura 05. Corpi azbestozici, necoloraţi.

Figura 06. Corpi azbestozici, coloraţie pentru fier.

Siliciul este prezent în numeroase minerale şi materiale de construcţie.

Majoritatea formelor sunt inerte şi nu pot fi colorate însă pot fi evidenţiate prin
birefringenţa albă în lumina polarizată.
Cel mai frecvent este prezent la nivelul plămânilor dar poate ajunge şi la
nivelul ganglionilor limfatici.

Exemplificare: Plansa 8, Planșa 9, Planșa 10

Drogurile injectate intravenos sunt adesea diluate cu compuşi ce conţin

minerale ca de exemplu siliciu sau talc. Aceste cristale pot fi întâlnite în tot
organismul dar în special la nivelul ţesuturilor limforeticulare.

Coloraţiile pentru grăsimi

Coloraţia ORO (oil red O) poate identifica lipidele neutre şi acizii graşi pe
frotiuri şi în ţesuturi.
Frotiurile proaspete şi secţiunile congelate sunt necesare deoarece fixatorii
pe bază de alcool sau procesarea obişnuită a ţesuturilor ce include şi clarificarea
au ca rezultat îndepărtarea lipidelor.
Coloraţia ORO este rapidă şi simplă. Este utilă în identificarea embolilor
grăsoşi din ţesutul pulmonar sau din secţiunile prin trombii din sângele periferic.

Exemplificare: Planșa 11

Coloraţiile pentru ţesutul conjunctiv

Coloraţia tricromică este utilă la evidenţierea stromei colagene de
susţinere pe secţiunile din diferite ţesuturi.
Aceasta oferă posibilitatea determinării tipului de leziune tisulară.
Este de asemenea utilă în identificarea structurilor normale cum ar fi
capsulele conjunctive ale oraganelor, lamina propria a tractului gastrointestinal
şi structurile bronhovasculare ale plămânului.

Exemplificare: Plansa 12, Planșa 13, Planșa 14

Coloraţia pentru fibrele de reticulină este utilă la nivelul organelor

parenchimatoase (ficat, splină) pentru a evidenţia citoarhitectura acestora.
20
 Tehnicile histologice
Pot fi astfel observate fibrele delicate de reticulină care sunt argirofile.
Aceeaşi coloraţie este utilă uneori în identificarea tiparului de creştere al
neoplasmelor.

Exemplificare: Planșa 15

Coloraţia Giemsa
Există numeroase coloraţii “tip Romanowsky” ce folosesc amestecuri de
albastru de metilen, azur şi compuşi eozinici.
Printre acestea se numără şi coloraţiile Giemsa şi Wright (sau coloraţia
Wright-Giemsa). Ultima este folosită la colorarea frotiurilor ed sânge periferic.
Coloraţia Giemsa este utilă în identificarea unor numeroase componente
dintr-o varietate de ţesuturi.
Una din proprietăţile coloranţilor albastru de metilen şi albastru de
toluidină este metacromazia, adică una din componentele tisulare se colorează
în altă culoare decât cea a colorantului. De exemplu graunlele mastocitare,
cartilajul, mucina şi amiloidul se colorează în violet şi nu albastru, fenomen util
în identificarea acestor compoennte.

Exemplificare: Plansa 16, Planșa 17

Coloraţiile pentru microorganisme

Indiferent de reacţia gram, în coloraţia H-E bacteriile apar ca bastonaşe
sau cocci de culoare albastră.
Coloniile au aspectul unor aglomerări de culoare albastru difuz.
Coloraţiile tisulare gram sunt în mare aceleaşi cu cele folosite în
laboratoarele de microbiologie cu excepţia că în loc de safranină se foloseşte
roşu neutru.
De obicei colorarea organismelor gram pozitive este bună ceea ce nu se
întâmplă şi în cazul celor gram negative (datorită faptului că lipidele din peretele
bacterian sunt înlăturate pe parcursul procesării tisulare).
Metoda cea mai des utilizată este metda Brown şi Brenn (sau modificarea
Brown şi Hopps).
Fungii se colorează în albastru cu H-E şi roşu cu PAS. Metoda cea mai
sensibilă folosită petru evidenţierea acestora este cooloraţia argentică cu
metehenamină.
Spirochetele se colorează foarte greu. Metoda cea mai bună este Warthin-
Starry.
Coloraţia Giemsa poate evidenţia corpii Donovan şi Leishmania.

Exemplificare: Planșa 18

21
 Tehnicile histologice

Coloraţia AFB (acid fast bacilli)

Această tehnică foloseşte carbol-fucsină pentru a colora peretele lipidic al
orgabismelor acid-alcolo-rezistente cum este şi cazul M. tubersulosis.
Metoda cea mai frecvent utilizată este metoda Ziehl-Neelsen.
O altă metodă folosită este metoda Kinyoun. O variantă modificată a
acesteia este metoda Fite ce foloseşte un acid mai slab pentru bacilul M. leprae
presupus a fi mult mai delicat. În orice caz, o mare parte din lipidele conţinute
de peretele bacterian sunt înlăturate în urma procesării tisulare şi astfel, această
coloraţie este uneori foarte dificilă, depistarea unui organism existent la nivelul
unui granulom fiind foarte îndelungată.
În ceea ce priveşte mycobacteriile, coloraţia cu gradul cel mai mare de
sensibilitate este cea cu auramină, interpretarea necesitând însă examinarea la un
microscop cu fluorescenţă.
În afară de mycobacterii există şi alte organisme acid-alcoolo-rezistente.
Printre acestea se numără Cryptosporidium, Isospora şi capetele de Cysticercum.

Exemplificare: Plansa 19, Planșa 20

Coloraţia argentică cu methenamină Gomori

Această coloraţie, cunoscută şi sub denumirea “GMS”, este folosită la
colorarea fungilor şi pentru Pneumocystis carinii.
Componenta care se colorează este peretele celular al acestor
microorganisme astfel încât acestea sunt evidenţiate de conturul colorat maron
până la negru.
Acestă coloraţie are tendinţa de a produce numeroase artefacte datorită
colorării fundalului, fenomen ce implică o bună cunoaştere a morfologiei
organismului căutat.

Exemplificare: Planșa 21

22
 Necropsia

NECROPSIA

PROSECTURA
Serviciul de anatomie patologică sau prosectura este un serviciu de
specialitate a spitalului clinic, teritorial sau orăşenesc care execută toate
examinările anatomopatologice (necropsii, examinări histopatologice, şi
citrologice) cerute de secţiile spitalului şi de unităţile sanitare de pe teritoriul
arondat, care nu au asemenea servicii.
Serviciul de anatomie patologică se compune din:
- laboratoare, în care se execută examinările histopatologice şi
citologice, şi
- un compartiment în care se execută necropsiile, se păstrează şi se
eliberează cadavrele.
- Activitatea prosecturală este reglementată de Legea Sanitară şi prin
ordinele Ministerului Sănătăţii.
- Compartimentul în care se execută necropsiile se compune din: sală
de necropsie, cameră frigorifică pentru păstrarea cadavrelor, cameră pentru
depozitarea pieselor macroscopice, cameră pentru îmbrăcarea şi predarea
cadavrelor, sală de aşteptare, încăperi şi grupo sanitar pentru personalul acestui
compartiment.

SALA DE NECROPSIE
Sala de necropsie trebuie să fie o încăpere spaţioasă, luminoasă, cu pereţii
şi pardoseala acoperiţi cu o răşină, cu sifoane de scurgere. Trebiue asigurată
încălzirea şi ventilaţia corespunzătoare. Ferestrele se vor proteja cu sită (de
sârmă sau material plastic), pentru împiedicarea pătrunderii muştelor.
Pentru executarea necropsiilor cea mai corespunzătoatre este lumina
naturală sau cea a tuburilor fluorescente. În lumina gălbuie a becurilor electrice
obişnuite aprecierea culorilor nu este întotdeauna posibilă, respectiv
corespunzătoare.
Pentru menţinerea cât mai uşoară a curăţeniei în sala de necropsie,
mobilierul cuprinde numai strictul necesar: masă de necropsie, dulap pentru
instrumente, etuvă pentru sterilizarea lor, măsuţă pentru balanţă, măsuţă pentru
borcane, reactivi, medii de cultură şi instrumente acccesorii, masă de birou cu
registrul de necropsii, 1-2 scaune, dulăpior de perete pentru prosoape, masă cu
dispozitivul de fotografiere, reflectoare, grătare de lemn în jurul mesei de
necropsii.
Masa de necropsie este confecţionată din placă de marmură, mozaic,
faianţă, material plastic, tablă inox uneori lemn acoperit cu tablă de zinc.
Masa are 2-2,10 m lungime, 0,9-1 m lăţime şi aproximativ 1 m înălţime.
Marginile mesei sunt ridicate, suprafaţa ei este uşor înclinată spre capătul unde
se găseţte orificiul de scurgere (capătul dinspre piciorul cadavrului). Tot la acest

23
 Necropsia
capăt al mesei se află un rezervor şi conductele de apă rece şi caldă şi un furtun
de cauciuc pentru spălarea organelor.
În timpul necropsiei, pe masă se aşează o măsuţă sau o placă de lemn
pentru instrumente şi una pentru secţionarea organelor, iar o tavă smălţuită
serveşte la păstrarea organelor până la terminarea necropsiei.
După coaserea şi îmbălsămarea cadavrelor ele sunt transportate cu
ajutorul unui cărucior ăn camera frigorifică, unde se păstrează până la eliberare.
În camera pentru depozitarea pieselor macroscopice organele se păstrează
în formol pentru preparate de muzeu, prelucrarea histologică sau demonstrarea
la lucrările practice cu studenţii şi şedinţele anatomo-clinice.

MĂSURI DE PROTECŢIE CONTRA INFECŢIILOR

Sala de necropsie este un mediu infectat. Intrarea este permisă numai în
haină de protecţie (halat), iar la părăsirea săliii este necesară spălarea şi
dezinfectarea mâinilor, chiar dacă nu s-au atins organele sau instrumentele. Se
evită strîngerea de mână cu persoanele care vin în sala de necropsie. Fumatul
este interzis, de asemenea pentru prevenirea infecţiilor.
Medicul, tehnicianul şi studenţii care execută necropsia voe purta haine de
protecţie speciale:
- halat chirurgical, care se leagă la spate
- sorţ de cauciuc, muşama sau material plastic
- mănuşi de cauciuc şi de aţă
- bonetă
- galoşi de cauciuc
- în cazuri excepţionale, ca de ex. La necropsia cazurilor de turbare,
se utilizează mască şi ochelari de protecţie.
În cursul necropsiei se menţine curăţenia perfectă pe masa de necropsie şi
măsuţa pentru instrumentar. Sîngele şi diferitele secreţii se îndepărtează
permanent, prin spălare de pe masă, instrumente şi mănuşi. Transportul
organelor la o altă masă sau la cântar se face numai cu o tavă, pentru evitarea
picurării de sânge.
Dacă necropsia se efectuează cu mâini goale, fără mănuşi, pentru
protejare se va unge mâna şi antebraţul cu vaselină. Ân acest caz mâinile se
spală foarte frecvent în cursul necropsiei, pentru îndepărtarea sângelui şi
secreţiilor.
În cazul necropsiei celor decedaţi în boli infecţioase, măsurile preventive
sunt mai severe. Ân cursul necropsiei masa, instrumentarul şi mănuşile vor fi
dezinfectate permanent cu ajutorul unei soluţii de cloramină (1 tabletă la 1 litru
de apă), sau de bromocet (soluţie apoasă de 1%). Studenţii nu participă efectiv la
necropsia acestor cazuri.
Dacă în cursul necropsiei mănuşa de cauciuc se găureşte, se întrerupe
necropsia, se schimbă mănuşa, după ce prealabil mânba a fost spălată şi
dezinfectată.

24
 Necropsia
După necropsie, masa şi instrumentarul se vor spăla şi dezinfecta cu
soluţia de cloramină sau bromocet. După necropsia cazurilor de boli infecţioase,
instrumentarul se va steriliza ăn etuvă, sau prin fierbere timp de 20-30 minute.
După terminarea necropsiei, mănuşa se spală cu săpun, se şterge şi se
pudrează cu talc. Numai după aceea se scot, prin tragere de la mânecă,
obţinându-se astfel întoarcerea lor, cu suprafaţa externă spre interior. Ânainte de
reîntrebuinţare ele vor fi din nou întoarse. După scoaterea mănuşilor mâna se
spală cu săpun şi se dezinfectează cu soluţie de bromocet.
În caz de rănire necropsia se întrerupe, se spală mâna şi prin comprimarea
ăn jurul rănii se evacuă cât mai multă sânge pentru îndepărtarea eventualelor
impurităţi. Rana se dezinfectează şi se pansează. În cazul rănirilor mai mari este
necesară toaleta chirurgicală a plăgii, eventual administrarea de antibiotice, ser
antitetanic, etc.
În zilele noastre infecţiile produse în cursul necropsiilor sunt rare. Se pot
întâlni eventual foliculite, uneori granulaţii nodulare de piele, cu tendinţă slabă
de vindecare (tuberculi anatomici, verucă necrogenă), eventual hepatită virală.

PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE NECROPSIEI

Necropsia se efectuează în termen de 24 ore de la constatarea morţii. Cînd
există un interes ştiinţific sau urmează şă fie recoltate organe pentru
transplantare (cornea, vase, os) necropsia va fi efectuată la 1-2 ore după deces.
(Unele date demonstrează posibilitatea efectuării culturilor de ţesuturi din
rinichi, splină, ficat, muşchi etc. chiar după 24-96 ore de la instalarea morţii.
Astfel cadavrul nu trebuie privit ca un material degradat, inapt pentru metodele
moderne de investigaţii (Ambrose)).
Necropsia anatomopatologică trebuie să fie sistematică şi completă,
cuprinzând examinarea celor trei cavităţi principale ale organismului: craniul,
cavitatea toracică şi abdominală. Membrele, articulaţiile, oasele, coloana
vertebrală etc. se examinează numai atunci , c’nd particularităţile cazului impun
acesta.
Lucrând ordonat, sistematic, fără omisiuni ireparabile, necropsia se poate
face complet în circa două ore.
Necropsia propriu-zisă este precedată de examenul extern prin inspecţie şi
palpare. După deschiderea unei cavităţi (torace, abdomen) se examinează
poziţia, limitele, respectiv raporturile anatomice ale organelor (situs toracic,
situs abdominal) după care se trece la scoaterea lor.
La scoaterea organelor se poate proceda în două feluri:
- Păstrând legăturile anatomice dintre ele (metoda Rokitansky) sau
- Întrerupând legăturile anatomice şi scoaterea izolată a organelor
(metoda Wirchow)
Metoda urmărită urmăreşte ambele procedee. Unele organe se scot
separat, altele în bloc (de ex. Organele gâtului, ale micului bazin). Tehnica de
necropsie este numai o metodă care serveşte un csop bine definit, şi anume
evidenţierea modificărilor patologice. Din acest motiv ea nu trebuie aplicată
25
 Necropsia
mecanicist, ci individualizat, luându-se ăn considerare particularităţile fiecărui
caz. Metodologia se poate modifica oricând pe parcursul necropsiei, dacă
situaţia impune aceasta.
Organele scoase- izolate sau în bloc se examinează cu ochiul liber şi prin
palpare, iar la nevoie se poate utiliza şi lupa de mână. Numai după acest examen
macroscopic se trece la secţionarea lor, urmărind obţinerea suprafeţelor cât mai
mari. Organele cavitare sau tubulare se deschid cu foarfeca, întotdeauna în
direcţia circulaţiei, respectiv înaintării conţinutului lor.
Secţionarea şi examinarea complexelor de organe (organele g’tului,
abdomenului şi micului bazin) se face după următoarea succesiune:
- organele aparatului circulator
- organele aparatului respirator
- organele aparatului digestiv
- organele aparatului excretor, secretor
- organele genitale
În cazul organelor pereche se recomandă scoaterea şi examinarea mai
întâi a celui stâng, apoi a celui din partea dreaptă (din motiv mnemotehnic).
Rezultatele necropsiei depind în primul rând de aplicarea corectă şi
adecvată a tehnicii. Orice scăpare sau greşeală de tehnică este ireparabilă,
deoarece necropsia nu poate fi reluată de la început. (Cine minimalizează
tehnica, minimalizează implicit rezultatele necropsiei, adică interpretarea.
(Crăciun)). Este foarte important, ca orice manoperă din cursul necropsiei şă fie
executată sub control vizual şi palpator direct.
Din motive estetice (cadavrele se predau aparţinătorilor) se vor evita acele
secţiuni sau intervenţii care produc diferite deformări, mai ales în acele părţi
care rămân descoperite după îmbrăcarea cadavrului.

DESCRIEREA ORGANELOR
Descrierea macroscopică a roganelor şi leziunilor trebuie să fie copletă,
exactă şi amănunţită. Descrierea se face într-un limbaj simplu şi clar, se vor
evita interpretările şi diagnosticele.
Atunci când există posibilitatea dictării protocolului chiar în timpul
necropsiei, descrierea se va face în ordinea în care s-a executat necropsia. Dacă
protocolul se redactează ulterior, descrierea se face pe sisteme, respectiv aparate
(sistemul nervos, endocrin, aparatul cardio-circulator, respirator, digestiv etc.)
În cazul organelor pereche, dacă cele două organe sunt asemănătoare, se
descrie numai unul (de obicei cel stâng), la celălaltul se menţionează doar că are
aspect identic.
Caracterele macroscopice ale organelor şi ale diferitelor leziuni se descriu
în următoarea succesiune:
- Poziţia (raporturile anatomice)
- Dimensiunile, greutatea
- Număr şi forma
- Lungime, lăţime, înălţime, circumferinţă
26
 Necropsia
- Greutate în grame
- suprafaţa
- seroasa, capsula, marginile, mucoasa
- culoarea
- luciul, transparenţa
- consistenţa
- elasticitatea, friabilitatea
- conţinutul
- structuri particulare
- desen lobular, fascicular, folicular etc.
- schelet conjunctiv
Descrierea acestor caractere se face într-o anumită ordine:
- de sus în jos
- dinainte spre înapoi
- de la suprafaţă spre profunzime.
Se descrie mai întâi suprafaţa organului, apoi suprafaţa de secţiune,
respectiv straturile peretelui şi suprafaţa internă în cazul organelor cavitare.
Poziţia şi raporturile anatomice ale organelor se descriu la examinarea
situsului toracic şi abdominal.
Dimensiunile se dau în centimetri (milimetri) sau comparându-le cu:
boabe de linte, mazăre, fasole, alună, nucă, ouă, măr, diferite monede, palma,
cap de copil etc.
Consitenţa organelor se detrmină prin palpare, iar în cazul rinichiului prin
ruperea parenchimului.
Culoarea organelor depinde de: culoarea lor proprie, conţinutul de sânge
şi prezenţa unor substanţe care au culoare proprie (pigmenţi, grăsime).
În descriere se indică de obicei mai multe culori care intră în componenţa
culorii ţesutului (de ex. Cenuşie-galbenăp, roşie-maro, brun-gălbuie).
Conţinutul organelor parenchimatoase se examinează prin comprimarea
suprafeţei de secţiune între muchia cuţitului şi mâna, respectiv prin raderea
suprafeţei de secţiune cu tăişul cuţitului, lama fiind uşor înclinată.
În cazul organelor cavitare se descrie organul în întregime, peretele,
straturile peretelui din exterior spre interiotr, cavitatea şi conţinutul.
Caracterle conţinutului se descriu în următoarea ordine:
- localizare
- dimensiunile sau cantitatea (în funcţie de starea de agregare)
- culoarea, transparenţa
- consistenţa
- friabil, elastic, vâscos, fluid
- caracterul (aspectul)
- seros, mucinos, purulent, putrid etc.
- omogen, grunjos, cazeos, stratificat
- mirosul

27
 Necropsia
Conţinutul cavităţilor seroase şi a organelor cavitare se scoate cu lingura
cu coadă şi se adună într-un vas gradat, pentru determinarea cantităţii şi
caracterului.
Ca reguli general valabile în descriere trebuie să reţinem următoarele:
- aspectul şi structura normală se descriu sumar
- modificările patologice se descriu amănunţit şi exact
- se descriu numai constatările pozitive şi numai excepţional cele
negative. Astfel dacă în diagnosticul clinic figurează o leziune, care la necropsie
nu a fost găsită, este bine ca în protocolul de necropsie să fie consemnată această
constatare negativă.

PROTOCOLUL DE NECROPSIE
Protocolul de necropsie este un document medical fundamental, având în
valoare stiinţifică deosebită.
Protocolul de necropsie se compune din 4 părţi principale:
1. preambul
2. partea descriptivă
3. diagnosticul anatomopatologic
4. concluzii

Preambulul
Conţine datele personale ale decedatului
Numele, vârsta, sexul. Ocupaţia de bază, domiciliul
Data internării, data şi ora decesului, data necropsiei şi diagnosticul clinic

Partea descriptivă
Conţine descrierea macroscopică a organelor, respectiv modificările
patologice şi rezultatele examinărilor complementare: histopatologice,
bacteriologice, parazitologice, serologice, biochimice etc.
Parte a descriptivă poate fi întregită lanevoie cu schiţe, desene şi
fotografii.

Diagnosticul anatomopatologic
Rezumă datele consemnate în partea descriptivă. În diagnostic trebuie să
figureze toate leziunile, dar în ordinea importanţei lor şi a legăturilor
patogenetice dintre ele.
Diagnosticul anatomopatologic se formulează ăn următoarea succesiune:
a. diagnosticul bolii de bază (leziune care în mod nemijlocit sau prin
urmările ei a dus la evoluţia letală)
b. diagnosticul bolilor secundare (enumerate în ordinea importanţei
lor sau pe sisteme)
c. alte modificări

28
 Necropsia

Concluzii
Pe baza datelor clinice şi anatomopatologice, se face o sinteză (epicriză)
cu privire la evoluţia bolii, aparişia complicaţiilor şi mecanismului morţii
(tanatogeneză). În această parte a protocolului se pot sublinia şi unele constatări
negative şi se pot face chiar presupuneri.
Pe baza dispoziţiilor Ministrului Sănătăţii, la sfârşitul protocolului se face
o confruntare a diagnosticului clinic, cu cel anatomopatologic. Neconcordanţele
pot fi de natură:
- nozologică (de ex. În loc de tbc pulmonar carcinom
bronhopulmonar)
- etiologică (de ex. În loc de meningită tbc, meningită pneumococică)
- de localizare (de ex în loc de tumoare a capului pancreasului, calcul
al coledocului)
- în complicaţia finală (de ex. În loc de infarc miocardic,
trombembolie pulmonară)

Schema privind formularea concluziilor se poate rezuma astfel:

1. scurt istoric al bolii
2. boala de bază (etiologie, evoluţie, complicaţii)
3. boli secundare (legătura lor cu boala de bază)
4. cauza directă a morţii (tanatogeneza)
5. confruntarea anatomoclinică (concordant, neconcordant, natura
neconcordanţelor)

29