INTRODUCERE

Antocianii sunt coloranţi naturali, care au prezentat interes crescut datorită gamei extinse
de culori, efectelor inofensive şi benefice pentru sănătate. Din cauza potenţialului mare de
aplicare pe care antocianii îl reprezintă pentru industria alimentară, farmaceutică şi cosmetică,
utilizarea lor a fost limitată din cauza instabilităţii lor relative şi procentului mic de extracţie.
În prezent, cele mai multe investigaţii ale antocianilor sunt axate pe rezolvarea acestor
probleme, precum şi pe purificarea şi identificarea lor. Cele mai recente progrese în investigarea
chimică a antocianinelor sunt prezentate pe scurt, subliniind efectele pH-ului, co-pigmentării
ionului complex şi activităţii antioxidantă asupra stabilităţii lor.
Studiul coloranţilor naturali este un domeniu extins şi activ al investigaţiei datorită
interesului crescut de substituire a coloranţilor sintetici cu efecte toxice la oameni. Carotenoidele
şi antocianinele sunt printre cei mai utilizaţi coloranţi vegetali în industria alimentară.
Carotenoidele sunt liposolubile, instabile şi capabile să coloreze produsele alimentare de la
galben la roşu; aceştia sunt obţinuţi în general din morcovi, roşii şi ardei. Pe de altă parte,
antocianinele sunt solubile în apă şi mai puţin stabile decât carotenoidele; ei sunt extraşi din
struguri, fructe de pădure, varză roşie, mere, ridichii, trandafiri, lalele şi orhidee.
Antocianinele (din greacă „anthos”=floare şi „kianos”=albastru) sunt pigmenţii cei mai
importanţi ai plantelor vasculare; ei sunt inofensivi şi uşor de încorporat în mediul apos, ceea ce
îi fac interesanţi pentru utilizarea lor precum coloranţi naturali solubili în apă. Aceşti pigmenţi
sunt responsabili pentru culorile portocalii, roşii, rozului, violete, albastre strălucitoare ale
florilor şi fructelor unor anumite plante. O altă proprietate importantă a antocianinelor este
activitatea lor antioxidantă, care joacă un rol vital în prevenirea bolilor neuronale şi
cardiovasculare, cancer şi diabet. Există mai multe rapoarte axate pe efectul antocianinelor în
tratarea cancerului, pe nutriţia umană şi pe activitatea lor biologică.
Prin urmare, datorită potenţialului enorm al antocianinelor naturale ca pigmenţi sănătoşi,
există un număr foarte mare de rapoarte găsite în literatura de specialitate pe diverse domenii,
cum ar fi: dezvoltarea unor tehnici analitice de purificare şi separare, aplicarea în produsele
alimentare, identificarea şi distribuţia în plante, urmărirea culorii şi schimbării pigmenţilor,
biosinteza, analizele cantitative folosind tehnici cromatografice şi electroforetice şi în presarea
plantelor.
Investigaţiile cele mai recente pun accent pe informaţiile importante obtinute pe baza
metodelor de separare, extracţie, purificare şi identificare.

1
 CAP.I. PROPRIETATI FIZICO-CHIMICE

Antocianidele sunt structurile de bază ale antocianinelor. Antocianidele (sau agliconii)

sunt constituite dintr-un nucleu aromatic legat de un lanţ heterociclic care conţine O 2, şi care
este, de asemenea, legat printr-o legătură C-C de C al nucleului aromatic. Când antocianidele se
regăsesc în formă glicozidică sunt cunoscute sub numele de antociani.
Culoarea acestor molecule a fost explicată prima dată de Pauling în 1939, care a presupus
că structura de rezonanţă a ionului de flavilium este cauza intensităţii culorii lor.
Există o mare varietate de antocianidine răspândite în natură. Principalele diferenţe între
ele sunt numărul grupărilor hidroxilate, natura şi numărul de zaharuri legate de structura lor,
grupările carboxilice alifatice sau aromatice legate de zahărul din moleculă şi poziţia acestor
legături. Până în prezent, există mai mult de 500 de antocianidine diferite, din care doar 6 sunt
cele mai întâlnite în plantele vasculare: Pg, Pn, Cy, Mv, Pt şi Dp. Derivaţii glicozidici ai celor 3
antocianidine non-metilate (Cy, Dp, Pg) sunt cei mai frecvent întâlniţi în natură, fiind găsiţi în
proporţie de 80% în frunzele pigmentate, 69% în fructe şi 50% în flori.
Structurile de baza ale antocianilor (antocianidinele), prezentate in figura 1, influenteaza
proprietatile lor chimice ce au implicatii importante in cazul stabilitatii acestora, echilibrului
apos, culorii, efectelor de co-pigmentare, reactivitatii, precum si in cazul proprietatilor lor
antioxidante.

Fig.1. Structurile celor mai comune antocianidine prezente in natura

I.1. Stabilitatea antocianilor

Antocianidinele izolate prezinta o instabilitate ridicata, precum si o tendinta spre
degradare. Stabilitatea acestora este afectata de mai multi factori, cum ar fi pH-ul, temperature de
stocare, structura chimica, concentratia, oxigenul, solventii, prezenta enzimelor, flavonoidele,
proteinele si ionii metalici.

2
 Stabilitatea chimica a antocianilor reprezinta principalul punct de interes a multor studii
datorita aplicatiilor abundente, efectelor benefice, precum si datorita utilizarii ca o alternativa a
colorantilor artificiali.

I.1.1. Solventul si efectele concentratiei antocianidinei

Investigaţiile recente cu sărurile sintetice de flavilium în soluţii de natură diferită
(acetonitril : apă, etanol, propileuglicol, dioxan şi 2-butadonă) au arătat că schimbările de culoare
depind de solvent şi de concentraţia sărurilor sintetice de flavilium (VF s). În solvenţi protici,
sărurile sintetice se colorează în roşu, în timp ce în solvenţii aprotici soluţiile sunt galbene. Acest
lucru a fost explicat presupunând că speciile roşii şi galbene corespund unui monomer, respectiv
unui dimer; de aceea, atunci când creşte concentraţia sărurilor sintetice de flavilium, culoarea
roşie este favorizată.
De asemenea, s-a observat că, atunci când creşte cantitatea de apă în acetonitril,
monomerul este transformat într-un dimer de culoare verde. Astfel, apa joacă un rol fundamental
în dimerizarea sărurilor de flavilium, datorită faptului că aceste molecule necesită neutralizarea
propriilor lor repulsii electrostatice cu moleculele de apă, astfel încât dimerizarea să poată avea
loc.

I.1.2. Influenta pH-ului

Antocianinele pot fi găsite în diferite forme chimice care depind de pH-ul soluţiei. La
pH =1, cationul de flavilium (de culoare roşie) este specia predominantă şi contribuie la
colorarea soluţiilor în roşu şi violet. La valorile pH-ului cuprinse între 2 şi 4, speciile
predominante sunt cele quinoidale albastre. La valori ale pH-ului cuprinse între 5 şi 6, doar 2
specii incolore pot fi observate (pseudobaza carbinolului şi calconul). La pH>7, antocianinele
sunt degradate în funcţie de grupele lor de substituenţi). La valori ale pH-ului cuprinse între 4 şi
6, coexistă patru forme structurale ale antocianinelor: cationul de flavilium, baza quinoidală
anhidrida, baza incoloră a carbinolului şi calconul galben pal. Echilibrul dintre bazele quinoidale
şi carbinol are loc prin intermediul cationului de flavilium. Când pH-ul este crescut, de
asemenea, suma bazelor anhidre creşte şi, în condiţii mai acide, specia predominantă este ionul
roşu de flavilium.
Stabilitatea antocianidinelor este influenţată de substituenţi şi de prezenţa grupelor
adiţionale de hidroxil sau de metoxil, care scad stabilitatea agliconului în mediul neutru; de
aceea, Pg este antocianidina cea mai stabilă. Opus agliconilor, monoglicozidelor şi
diglicozidelor, derivaţii sunt cei mai stabili în condiţii de pH neutru. Investigaţiile cu privire la
stabilitatea antocianinelor şi la variaţia culorii cu pH duc la concluzia că schimbările de culoare
ale acestor compuşi sunt cele mai importante în regiunea alcalină, datorită instabilităţii lor.

I.1.3. Efectul de co-pigmentare

Co-pigmentarea este un fenomen în care, pigmenţii şi alţi compuşi organici incolori, sau
ionii metalici, sub formă moleculară sau ascoiaţii complexe, generează o creştere sau o
schimbare a intensităţii culorii. În stiinţa alimentară, acest fenomen este considerat o interacţiune
foarte importantă deoarece culoarea este unul din factorii cruciali de calitate în acceptarea
produselor. Unele investigaţii sugerează că, co-pigmentarea antocianinelor cu alţi compuşi (co-
pigmenţi) este principalul mecanism de stabilizare a culorii în plante. Co-pigmenţii sunt sisteme
bogate în electroni p, care au capacitatea să se asocieze cu ionii flavilium, care sunt destul de

3
săraci în electroni. Această asociere oferă protecţie atacului nucleofil al apei în poziţia 2 a ionului
de flavilium şi altor specii, cum ar fi peroxizii şi sulfur-dioxinele în poziţia 4.
Co-pigmenţii sunt, în general, incolori, dar când sunt amestecaţi cu o soluţie antocianică,
interacţiunea producând un efect hipercronic şi o schimbare batocromă în spectru de absorbţie
(regiunea UV-VIS). Co-pigmenţii pot fi flavonoide, alcaloizi, aminoacizi, acizi organici,
nucleotide, polizaharide, metale sau alte antocianine.
Interacţiunea antocianine – co-pigmenţi poate fi realizată în 5 moduri diferite, în funcţie
de speciile care intreacţionează (figura 2). Dacă co-pigmentul este altă antocianină, este formată
o autoasociere sau o copigmentare intramoleculară (fig 2A si 2B); când interacţiunea se face cu
un metal, se efectuează o complexare (fig 2C); în cazul în care are loc intre co-pigmenţi şi
perechea de electroni liberi, are loc o co-pigmentare intermoleculară (fig 2D), iar în cele din
urmă, cazul cel mai complex, co-pigmentarea poate avea loc prin interacţiunea unui aglicon,
zahar, co-pigment si protoni, toate în acelaşi timp.

Fig.2. Interactiunea antocianidinelor:

(A) autoasociere; (B) copigmentare intramoleculara; (C) complexare metalica; (D)
copigmentare intermoleculara

Când co-pigmentul este un alt compus fenolic, interacţiunea este trecătoare din cauza
lipsei legăturilor chimice. Acest comportament este rezultatul unui femomen chimic cunoscut
sub denumirea interacţii p-p; acest fenomen apare atunci când compuşii cu sarcini opuse
interacţionează. Rezultatul final al co-pigmentarii se bazează pe două etape:
4
 - formarea complexului p-p, care determină schimbările proprietăţilor spectrale ale
moleculelor în ionul flavilium, creşte intensitatea absorbţiei (efectul hipercromic) şi a
lungimii sale de undă (efect batocrom)
- stabilizarea ionului de flavilium format de un complex p deplasează echilibrul în partea în
care creşte intensitatea culorii roşii
Prin urmare, amploarea efectului de co-pigmentare este dependentă de pH, deoarece la
valori mici ale pH-ului, toate moleculele antocianinei sunt în forma flavilium, iar la valori
ridicate ale pH-ului, antocianina este în forma ei pseudobază de carbinol, care este incoloră.
Efectul de co-pigmentare este evident la pH=4-6, unde antocianinele există în forme
incolore.

I.1.4. Interactia ionilor metalici

Varietatea de culori în cazul florilor, a fost explicată initial prin formarea chelaţilor dintre
metale şi sărurile flaviliumului. În ciuda interesului scăzut în industria alimentară in ceea ce
priveste complexarea antocianini-metal, această interacţiune constituie o alternativă viabilă
pentru stabilizarea culorii, în special, în cazul în care metalele conţinute nu implică un risc pentru
sănătate sau în cazul în care ele chiar fac parte din mineralele esenţiale dietei. Una dintre
principalele caracteristici ale antocianilor cu grupări orto-di-hidroxil (Cy, Dp, Pt), este
capacitatea lor de a forma complcşi metal-antocianină. Unele studii privind stabilitatea culorii în
plante sugerează că aceste nuante albastre sunt datorate unui complex format între antocianine şi
unele metale, cum ar fi: Al, Fe, Cu, Sn, Mg şi Mo.
În cazul interacţiunii antocianinei cu Al(III), complexarea a fost formată cu Cy şi alţi
derivaţi flavonoizi. Alţi autori au studiat variaţia culorii a unui ţesut de varză Hindu adăugând
soluţii de Mo (IV şi VI), unde, în ambele cazuri culoarea albastră a fost stabilizată. Acest fapt
sugerează posibilitatea de complexare dintre antocianină şi Mo. Mai multe studii recente au
arătat că,complexarea dintre o-di-hidroxilantocianină şi Fe (III) sau ionii de Mg (II) la pH=5, este
esenţială pentru formarea culorii albastre în plante, mai ales în cazul în care raportul
stoichiometric antocianină:Fe(III) este 1:6 sau mai mare pentru Mg (II).

I.1.5. Activitatea antioxidanta

Compuşii care sunt mai uşor de oxidat sunt adesea cei mai buni antioxidanţi (moleculele
care pot dona un electron liber sau un atom de H pentru a reacţiona cu radicalii liberi). Câteva
studii au sugerat că, conţinutul de antociani şi activitatea lor antioxidantă corespunzătoare,
contribuie la efectul protector al fructelor şi legumelor împotriva bolilor cornice şi degenerative.
Unele plante şi extracte din fructe cu conţinut ridicat de compuşi fenolici, au fost folosite pentru
a acţiona ca inhibitori mutagenici şi carcinogenici. Substanţele fitochimice, care prezintă o
activitate antioxidantă, include, pe lângă compuşii fenolici (flavonoide), compuşi azotaţi,
tocoferoli, carotenoide şi acid ascorbic.
În catecoli, oxidarea se realizează prin intermediul radicalilor liberi, până când formează
semiquinone foarte stabile. Compuşii cu grupe de catecol sau 1,4-hidroquinonă sunt deosebit de
uşor de oxidat, deoarece radicalul fenoxil poate fi stabilizat cu oxigen.
Dacă s-ar realiza o anlogie între grupările de catecol şi cele mai frecvente antocianidine,
ar fi de aşteptat că acelea care au o substituţie cu o-dihidroxil (Cy, Dp, Pt) sunt cele mai sensibile
la oxidare. În cazul Pg, Pn şi Mv oxidarea nu se poate realiza uşor, deoarece ele nu sunt
substituite o-dihidroxil. Din cele 6 cele mai comune antocianidine, Pg este cea mai stabilă în
condiţii de pH neutru.

5
 Antocianii au arătat o activitate antioxidantă mai mare decât vitamina C şi E. Aceşti
compuşi sunt capabili de a capta radicalii liberi prin donare de atomi de hidrogen fenolici; acesta
este explicatia pentru activitatea lor anticarcinogenică. A fost de asemenea raportată o corelare
lineară între valorile capacităţii antioxidante şi conţinutul de antocianine în mure, zmeură şi
căpşuni; în plus, a fost descris faptul că extractele de mure posedă o activitate de curăţare ridicată
faţă de speciile reactive ale oxigenului generate chimic. Acţiunea antioxidantă a fructelor de
pădure este direct proporţională cu conţinutul de antocianine.

6
 CAP.II. METODE MODERNE DE SEPARARE

II.1. Cromatografie in contracurent

Cromatografia in contracurent a fost aplicata cu success pentru separarea si izolarea
antocianilor puri din numeroase surse (vin rosu, vin rosu Californian, vin roze, coaja de grefa,
struguri rosii, coacaze negre, fructe de padure, afine, zmeura).
Amestecurile de solventi utilizate pentru separarea antocianilor prin cromatografie in
contracurent pot fi considerate polare. Acestea contin deseori n-butanol, care poate fi dificil de
manevrat atunci cand trebuiesc realizate evaporari sau concentratii, dar permite ambelor faze sa
aiba polaritate mare, mentinand sistemul bifazic. Acestea include, de asemenea, acidifierea cu
acid trifluoracetic (TFA) pentru a deplasa echilibrul catre ionul flavinium care imbunatateste
separarea.
Modul normal de functionare este de la cap la coada : faza mai putin densa este faza
stationara, iar faza mai densa este faza mobila. In consecinta, acesta este un mod de elutie
descendent. De asemenea, pot fi gasite si metode ascendente.
O varietate de sisteme disperse pot fi utilizate pentru a imbunatati separarea si purificarea
antocianilor. Este recomandabil sa se optimizeze sistemele disperse de fiecare data cand o noua
sursa este testata deoarece compozitia antocianilor poate diferi considerabil de la o sursa la alta.
Un factor care influenteaza separarea antocianilor il reprezinta numarul de spire din
echipamente, precum si debitul aplicat. De exemplu, Degenhardt si altii nu au obtinut nici o
separare atunci cand au utilizat un sistem cu o singura serpentina, dar au separat antocianii din
coacaze negre cu
Cromatografia in contracurent poate fi aplicata direct in cazul surselor de materie prima
dizolvate intr-una din fazele sistemului. Cu toate acestea, randamentele bune sunt furnizate
atunci cand pasii de pre-purificare (curatarea probelor, etc) sunt realizati, deoarece, in aceasta
situatie cantitati mari pot fi injectate in coloana.
Prin utilizarea cromatografiei in contracurent au putut fi izolati antociani din surse
diferite, in cantitati de pana la cateva sute de miligrame de compusi puri. Aceasta metoda poate
avea un rol essential pentru identificarea unor noi structuri deoarece ofera pentru studiile RMN
cantitati foarte mari de antociani necunoscuti prezenti in cantitati foarte mici in surse natural,
cum ar fi pirano-antocianidinele din vinuri sau alte bauturi, precum si in plante, cum ar fi
Tradescantia pallida. In aceste cazuri, metoda HPLC-MS a fractiilor eluate va oferi informatii
valoroase astfel incat acesti compusi sa poata fi identificati.

II.2.

7
 UTILIZARI

Antocianii reprezinta una din grupele de flavonoide cel mai intens studiate in ultimii ani.
Antocianii se gasesc in multe produse deoarece sunt responsabili pentru nuantele de albastru si
rosu a multor fructe, cum ar fi fructe de padure rosii (fructe de padure, afine, zmeura, coacaze
negre, dude), cirese, rodii sau prune, si de asemenea, vinete, sfecla sau cartofi roz. Toate aceste
fructe sunt consummate regulat in diete, si in consecinta, sunt utilizate de multa vreme in
industria alimentara pentru producerea sucurilor, bauturilor racoritoare, bauturilor alcoolice etc.
Caracteristicile organoleptice ale antocianilor au fost exploatate pentru a crea produse
colorate atractive. Cel mai clasic exemplu este vinul rosu, iar rolul antocianilor si actiunile
acestora asupra intensitatii culorii si stabilitatii vinului au fost studiate pe larg prin caracteristicile
lor spectroscopice, efectul copigmentarii si prin formarea pirano-antocianilor prin reactii de
condensare.
La inceput, antocianii au fost utilizati in industria alimentara ca si coloranti alimentari,
dar acum, a inceput utilizarea acestora in domeniul sanatatii ca si suplimente nutritionale, in
medicina, pentru formarea alimentelor de baza etc. Efectelor acestora asupra sanatatii au fost
legate de proprietatilor lor antioxidante si de efectele notabile asupra inflamatiilor cornice,
hipertensiunii arteriale, prevenirii cancerului si asupra reglarii metabolismului.
Cautarea indelungata a antocianilor cu potentiale beneficii asupra sanatatii, impreuna cu
cele mai recente progrese in ceea ce priveste tehnicile de separare si metodele de identificare, a
dus la o crestere considerabila a numarului de structuri ale acestor compusi.
Au fost initiate noi cercetari pentru gasirea antocianilor bioactivi precum si a efectele lor
benefice, cercetari ce nu s-au limitat la sursele traditionale. De exemplu, in ultimii ani, Chirinos
si altii au investigat proprietatile antocianilor din extracte de mashua purificate, Thompson si altii
au aratat beneficiile pe care le au unele soiuri de cartofi asupra cancerului la san, Mezadri si altii
au investigat fractia de antociani prezenta in acerola, Prata si Oliveira au propus coji proaspete de
cafea ca surse potentiale de antociani, Longo si altii au identificat prezenta malvidin-3-5-o-
diglucozida ca fiind singurul antocian present in fructele Eugenia myrtifolia Sims, iar Escribano-
Bailon si altii au publicat un articol interesant privind antocianii din cereal axate pe porumb,
grau, orez.
Care este dovada care să susţină ideea că fructele şi legumele colorate, adică alimentele
care conţin niveluri ridicate de antociani, posedă proprietăţi de întârziere sau de prevenire a
cancerului? Deşi datele epidemiologice nu sunt abundente, există rapoarte care fac aluzie la
potenţialul lor de anti-carcinogenitate.
Într-un grup de persoane vârstnice, care au consumat cantităţi mari de căpşuni, aportul
adăugat de a dezvolta cancer a fost de 0,3 comparativ cu subiecţii care s-au abţinut de la
consumul mare fructe.
Consumul de fructe şi legume colorate a fost, de asemenea, asociat unui risc redus de
cancer mamar uman şi reapariţia polipului colorectal. Antocianii conţinuţi de produsele
alimentare au fost asociaţi cu un risc scăzut de boli cardiace coronariene. S-au dovedit a avea
efecte benefice în mai multe părţi ale organismului, inclusiv sistemului nervos central şi ochi, şi
au fost suspectate de a semăna cu „paradoxul francez”, adică scăderea riscului de boli
cardiovasculare în ciuda unei diete bogate în grăsimi la persoanele care trăiesc în Franţa.

8
 În ceea ce priveşte inhibarea cresterii celulelor neoplazice, antocianidinele au demonstrat
potenţă mai mare decât omologii lor glicozilici. Antocianidinele compromit durata de
supravieţuire a celulelor atunci când se găsesc în concentraţii de 10-5 - 10-4 M. Antocianidinele au
dovedit a inhiba creşterea fibroplastelor embrionare şi a celulelor canceroase maligne derivate
din ţesuturile umane. Dintre antocianidine, delfinidina posedă cea mai mare creştere a activităţii
inhibitoare. Antocianina conţinută în extractele din struguri, afine sau fructe de pădure, la 25-75
lg/ml inhibă dezvoltarea celulelor maligne de cancer la colon. Delfinidina, cianidina şi malvidina
inhibă activitatea receptorilor factorului de creştere epidermică (EGFR) tirozin kinazeică.

9
 CONCLUZII

Accentul asupra investigaţiilor recente ne permite sa prevedem o creştere notabilă în

cazul utilizarii antocianilor pe post de coloranţi naturali în diverse produse în următorii ani.
Având în vedere efectul benefic pentru sănătate a acestor compusi, încorporarea lor în industria
alimentară şi a băuturilor va avea un impact semnificativ. Punerea în aplicare a unor metode mai
bune de extracţie, separare, purificare şi identificare, va avea în viitorul apropiat o influenta
asupra costului acestor coloranţi, precum si un impact in ceea ce priveste crearea de noi
instrumente pentru autentificarea produselor alimentare şi descoperirea falsurilor sofisticate.
În ultimul timp au fost efectuate numeroase studii privind efectul benefic al antocianilor
asupra sănătăţii: ingerarea acestora alături de alţi polifenoli prezenţi în alimente scade riscurile
de îmbolnăvire de cancer, boli cardiovasculare, boala Alzheimer, infecţii virale, etc., probabil
datorită acţiunii antioxidante sau de modulare a activităţii unor enzime şi receptori celulari. Este
cunoscut aşa numitul “paradox francez” potrivit căruia mortalitatea datorată bolilor
cardiovasculare este mult mai mică decât cea atribuită proporţiei de acizi graşi saturaţi din dieta
zilnică a francezilor, acest lucru fiind pus pe seama consumării cu regularitate a vinului roşu,
bogat în antociani şi alte flavonoide.

10
 BIBLIOGRAFIE

1. Araceli Castaneda-Ovando, Ma. De Lourdes Pacheco-Hernandez, Ma. Elena Paez-

Hernandez, Jose A. Rodriguez, Carlos Andres Galan-Vidal, “Chemical studies of
anthocyanins: A review”, Food Chemistry 113 (2009): 859-871

2. Darren Cooke, William P. Steward, Andreas J. Gescher, Tim Marczylo, “Anthocyans

from fruits and vegetables – Does bright colour signal cancer chemopreventive
activity?”, European Journal of Cancer 41 (2005): 931-1940

3. J. Valls et al., “Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and

flavanols”, Journal of Cromatography A 1216 (2009) 7143-7172

11