Facultatea de Horticultură USV Iași

Disciplina Analiza și Controlul Calității Băuturilor

Analiza conținutului de antociani totali prin

spectrofotometrie UV-Vis
referat semestrul 2 masterat TCCB

Cadru didactic LUCHIAN Camelia Elena

Masterand COMAN George Ștefan

2023, mai/iunie

pagina 1 din 9
Pentru a putea desfășura o vinificare care să conducă la obținerea unor vinuri cu potențial de
excelență, trebuie să plecăm de la analiza structurii fizico chimice a unui strugure, astfel încât să
cunoaștem potențialul fiecărui element constitutiv în contextul unei anumite intenții de producție,
Potrivit Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 10, ELSEVIER – 2012 structura
fizico chimică a unui strugure este:

Pielița strugurilor are un rol foarte important în vinificație, deoarece tipul de vin (alb sau roșu) este
definit de modul în care diferitele părți ale strugurilor sunt utilizate în procesul de vinificare.
În pieliță se regăsesc majoritatea substanțelor responsabile de culoarea și aroma mustului și
ulterior vinului, respectiv:

Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 8, ELSEVIER – 2012

pagina 2 din 9
La formarea culorii bacelor concură mai mulți compuși, dintre cei mai notabili fiind:
» Clorofila
» Carotenoizi
» Betalaine (?) – pigmenți roșu-violet sau galbeni
» Polifenoli
⨂ Antociani – culoarea roșie
⨂ Flavonoide – culoarea galbenă
⨂ Taninuri – culoarea maro
Compușii fenolici au un rol extrem de important atât în evaluarea strugurilor cât și în cea a
vinurilor întrucât ei sunt responsabili pentru nivelul de existență a mai multor parametri senzoriali,
precum ar fi: aspectul vizual – primordial prin culoare, gustativ – amplificând prin prezența lor
gradul de astringență și gradul de amar sau olfactiv – în special prin intermediul fenolilor volatili.
Cantitățile de compuși fenolici din pielițe sunt variabile și depind în principal de soiul de struguri,
ele conținând între 12% și 61% din conținutul total de polifenoli al fructului, între 14% și 50% din
taninuri, 17% până la 47% din procianidine și aproape toți antocianii din soiurile de struguri roșii.1
Antociani reprezintă un termen generic ce face referire atât la antocianidine (flavonoide ce conțin
compusul heterociclic un compus ciclic de natură organică în care cel puțin unul dintre atomii componenți ai ciclului (în acest caz
denumit heteroatom) este al altui element decât carbonul
pirol, cele mai frecvente fiind: cianidina-portocaliu roșu
(predominantă în plante), delphinidina-violet, pelargonidina-portocaliu, malvidina-violet
(predominantă în struguri și în consecință și în vinuri), peonidina-roșu și petunidina-violet) cât și la
antocianine.
Antocianinele sunt compuși polifenolici din categoria flavonoidelor (categorie ce mai include
Flavonolii, Flavanonolii și Flavanolii catechine sau taninuri condensate distincția dintre tipuri făcându-se pe
baza substituenților), și reprezintă pigmenți ai plantelor care sunt compuși din 15 atomi de carbon
dispuși în două inele de benzen unite cu trei lanțuri de carbon scurte (C6-C3-C6)

În grupa compușilor polifenolici identificându-se încă trei categorii:

(i) fenoli simpli, cu un singur inel de benzen,
(ii) compuși fenolici polimerizați – taninuri, ce interacționează cu proteinele și
(iii) compuși fenolici minori. 2
Antocianidina și antocianina sunt două tipuri de flavonoide roșii-albastre ale plantelor, întâlnite
mai ales în florile și fructele plantelor superioare, principala diferență între antocianidină și
antocianină fiind că cea din urmă este un pigment vacuolar solubil în apă (astfel realizându-se

1
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 9, ELSEVIER – 2012
2
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 48, ELSEVIER – 2012

pagina 3 din 9
distribuirea ei în plantă), în timp ce antocianidina este contrapartida fără zahăr a antocianinei
(care se formează printr-o legătură glicozidică a zaharurilor cu antocianidina), respectiv agliconul
partea unei glicozide fără conținut glucidic, restul ce rămâne după ce o grupă glicozidică dintr-o glicozidă este substituită cu un atom de hidrogen

care este cel cromofor.

Culoarea antocianinei și a antocianidinei depinde de pH, roșu în pH acid și albastru în pH bazic
pentru antocianine, respectiv roșu în pH acid și incolor în pH bazic pentru antocianidine.
Antocianinele sunt mult mai stabile în forma lor heterozidă (antociani) decât ca agliconi
(antocianidine).
În soiul Vitis vinifera și corespunzător în vinurile obținute din acei struguri, au fost identificați doar
antociani monoglicozidici cu legătură glicozidică la poziția 3, glucoza putând fi esterificată (acilată)
în poziţia 6 cu acid (i) cafeic derivat hidroxilat al acidului cinamic (ii) p-cumaric sau (iii) aceticetanoic.
Variația proporției cantităților celor mai importanți șase tipuri de antociani concură la variația
culorilor diferitelor sortimente de struguri (pielițelor) și implicit și a vinurilor obținute din
respectivele soiuri, exemplificând cu3:

Alte specii, ca de exemplu cele originare din America Vitis riparia sau Vitis rupestris conțin diglicozide și, ca
urmare, se poate descoperi eventuala fraudă a îmbutelierii/comercializării unor vinuri obținute din
respectivele soiuri sub o etichetă în care se menționează origine corespunzătoare Vitis vinifera.
Trebuie ținut cont de faptul că prezența diglicozidelor este un caracter dominant genetic și, în
consecință, încrucișările între Vitis vinifera și o specie de viță de vie americană dau naștere la
plante cu această caracteristică, deși o a doua încrucișare între un producător hibrid și un soi de
Vitis vinifera nu prezintă inevitabil caracterul, majoritatea conțin de fapt diglicozide, care pot fi
detectate chiar și la concentrații foarte scăzute. Acest lucru poate fi utilizat pentru a preveni
comercializarea frauduloasă a vinurilor ca fiind derivate din Vitis vinifera, atunci când acestea sunt
de fapt produse folosind alte soiuri.
Antocianii pot apărea sub diferite forme, în funcție de pH-ul mediului, iar acest lucru le
influențează culoarea, la pH scăzut, forma predominantă este cationul flavylium (A+), care este
roșu, dar pe măsură ce pH-ul crește, pot apărea două reacții:

3
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 62, ELSEVIER – 2012

pagina 4 din 9
 O reacție de transfer de protoni duce la formarea unei baze chinonice (AO), care are o
nuanță violetă: A+ ⬌AO + H+
Adiția de apă la dubla legătură a heterociclului dă naștere unei baze de carbinol - incoloră
(AOH): A+ + H2O⬌AOH + H+
Proporțiile diferitelor forme care sunt prezente depind de pH și o curbă a proporțiilor lor teoretice
poate fi trasată din constantele lor de echilibru. Prima observație este că la pH-ul întâlnit în mod
obișnuit în vinuri există un echilibru între formele roșii, albastre și incolore și că doar 20% până la
30% dintre antociani contribuie la culoarea vinului.4

Concentrația de antociani și taninuri depinde de poziția ciorchinului de struguri pe viță și a bobului

din ciorchine. De exemplu, strugurii care sunt expuși la soare au concentrații mai mari din ambele
tipuri de compuși decât cei aflați la umbră.
Datorită amplitudinilor de variație între diferiți factori, numărul de puncte “colectare probă de
strugure” în care trebuie să se preleveze mostre variază în funcţie de analizele cerute. Pentru a
determina cu precizie valorile variabilelor mai eterogene, este necesar să se colecteze un număr
mai mare de eșantioane pentru a asigura date reprezentative, de exemplu:
Pentru a determina conținutul de antociani cu o eroare mai mică de 5%, sunt necesare 221
de puncte de prelevare, în timp ce pentru a determina conținutul de zahăr la același nivel de
eroare sunt necesare doar 19 probe, în practică, numărul de puncte de eșantionare fiind uzual
între 100 și 200 de puncte pe parcelă.5

Funcție de metodele de obținere a mustului variază și parametrii compușilor chimici din mustuială,
metodele care implică omogenizarea strugurilor eliberând reproductibil (atâta timp cât
4
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 72, ELSEVIER – 2012
5
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 140, ELSEVIER – 2012

pagina 5 din 9
dispozitivele funcționează similar) atât taninuri cât și antociani, dar provoacă o reducere
considerabilă a acidității titrabile și o creștere a pH-ului, ambele legate de eliberarea de potasiu
din pereții celulari ai boabelor fărâmițate în timpul procesului.6

Metoda folosită pentru obținerea mustului destinat analizelor chimice trebuie aleasă în funcție de
variabila care trebuie monitorizată. Pentru monitorizarea tradițională a maturării (zaharuri și/sau
aciditate), presele tradiționale dau rezultate bune.
Dacă se urmărește analiza compușilor fenolici, centrifugarea fructelor urmată de colectarea
cojilor, curățarea și uscarea este o opțiune bună. Reproductibilitatea acestei metode de extracție
este bună și eroarea este mai mică de 5%, deși este necesară utilizarea unei prese tradiționale
pentru a obține valori reprezentative pentru aciditate și pH.7
Având în vedere nivelul ridicat de impact a prezenței antocianilor asupra parametrilor senzoriali ai
vinurilor roșii, au fost cercetate metode de determinare calitativă și cantitativă a respectivilor
componenți, printre ele fiind și spectrofotometria UV-VIS, o metodă clasică pentru analiza
cantitativă și calitativă a probelor lichide, dar care se poate preta și pentru alte stări de agregare.
Spectrofotometria măsoară instrumental lumina monocromatică transmisă printr-o soluţie,
bazându-se pe teoria legii empirice lui Lambert – Beer (riguros respectată dacă radiația este
monocromatică) care leagă atenuarea luminii de proprietățile materialului prin care se deplasează
lumina, algebric fiind formulată de exemplu sub forma: I = I0 * e-kl

6
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 140, ELSEVIER – 2012
7
Juan MORENO & Rafael PEINADO, Enological chemestry, pag 141, ELSEVIER – 2012

pagina 6 din 9
unde I = intensitatea finală<I0 a fasciculului de lumină după ce a traversat complet soluția cu
concentrația C
I0 = Intensitatea radiației incidente a unei unde monocromatice, cu lungime de undă (𝜆)
specifică compusului pe care dorim a-l analiza, integrat constând într-o soluție, cu
concentrația C?
l = lungimea cunoscută a câmpului de soluție analizată prin care trece unda de lumină
monocromatică, lungimea celulei
k = coeficientul de absorbție, proporțional cu concentrația C a substanței ce absoarbe
lumina, respectiv: k = constantă * C
funcție de variatele moduri de exprimare ale concentrației, întâlnim:
⨂ dacă concentrația este exprimată în mol L-1 atunci constanta reprezintă
coeficientul molar de extincție (sau de absorbanță) și se notează cu ε
Convențional, definim transmitanța T ca fiind raportul dintre I și I0 astfel încât putem
reformula:
ln(I/I0) = -kl ⇒ -ln(I/I0)=ln(I0/I)=kl ⇒ A=ε*l*C astfel încât: dacă l=1cm
C=1 mol L-1
T, transmitanța A, absorbanța A= ε
Coeficientul molar de extincție reprezintă absorbanța unei soluții cu concentrația de
1mol/L dacă lungimea celulei este de 1cm.
Intervalul de încredere pentru valorile măsurate prin metoda spectrofotometriei este valid
doar pentru soluții diluate, concentrații inferioare pragului de 10-2 mol L-1, nefiind recomandată
pentru analiza unor componente majore (>10% din orice categorie de probe).
Principiul ce stă la baza determinărilor prin spectrofotometrie UVultraviolet-Visvizual constă în
abilitatea atomilor, moleculelor și ionilor de a absorbi lumina cu o lungime de undă specifică, în
ultraviolet (180-400nm) sau spectrul vizual (400-800nm), absorbția fiind asociată cu schimbările
stărilor de energie ale electronilor materializate în tranziția pe o orbită mai “înaltă”.
Deoarece fiecare nivel de energie al unei molecule sau al ionului molecular are și sub-
niveluri vibraționale și rotaționale asociate, acest lucru are ca rezultat multe tranziții permise, care
sunt în general imposibil de separat, producând astfel benzi de absorbție mai degrabă decât linii
ascuțite. Aceste “benzi” sunt caracteristice grupărilor și legăturilor funcționale dintr-o moleculă.8
Pentru o determinare prin spectrofotometrie trebuie utilizat un spectrofotometru ce
constă într-un echipament cu următoarele caracteristici:
⨂ o sursă de lumină care să dispună de exemplu de o lampă cu deuteriu
(pentru spectrul UV), lampă tungsten-halogen (spectrul vizual) sau lampă xenon
(care acoperă ambele spectre UV/Vis),
⨂ un filtru “monocromator”,
⨂ alte elemente optice, cum ar fi lentile și oglinzi, ce permit fluxului de lumină
să fie generat sub formă de rază/raze (dacă este cazul unui spectrofotometru cu
rază de referință),

8
European Pharmacopoeia 11.0 – 2.2.25. Absorption spectrophotometry, ultraviolet and visible

pagina 7 din 9
 ⨂ un recipient pentru mostre, un suport sau un dispozitiv de prelevare de
probe ca de exemplu o cuvă din cuarț de înaltă puritate sau safir (transparente
pentru radiația UV-Vis),
⨂ un detector mono-canal (de exemplu fotomultiplicator sau fotodiodă) sau
multi-canal (matrice de fotodiode-PDA sau dispozitiv cuplat cu încărcare-CCD)
Anterior măsurătorilor propriu-zise se verifică gradul de claritate a cuvelor-recipient destinate
probelor ce urmează a fi analizate precum și cotele dimensionale efective în comparație cu cele
marcate (este admisă o abatere de ±0,5% - respectiv 0,005cm pentru o cuvă de 1cm),9
Pentru verificarea stării de curățenie a pereților și a paralelismului sau grosimii pereților cuvei se
procedează la efectuarea unor măsurători cu raze a căror lungime de undă este 240nm-cuve din
cuarț sau 650nm-cuve din dticlă, umplute cu Water R Solution și, după măsurarea inițială a
absorbanței rotim cu 1800 cuvele și măsurăm din nou absorbanța aparentă – la aceeași lungime de
undă, criteriile de acceptanță presupunând:
⨂ absorbanța aparentă nu trebuie să fie mai mare de 0,093 (în spectrul UV) pentru o cuvă
din cuarț cu grosimea de 1cm sau 0,035 (în spectrul Vis) pentru o cuvă din sticlă
⨂ după rotația de 1800 absorbanța măsurată nu trebuie să difere cu o valoare mai mare de
0,005 de valoarea inițial măsurată
Spectrele de absorbţie sunt definite ca fiind dependenţa semnalului de lungimea de undă, λ. Cea
mai utilizată variantă de reprezentare a absorbanţei este în funcţie de lungimea de undă: A = f(λ).
Fiecare substanță este caracterizată de un spectru de absorbție - domeniu spectral, număr de
maxime picuri precum și de raporturile între intensitățile variatelor picuri, poziția picului fiind
caracterizată inclusiv de lungimea de undă ce-i corespunde 𝜆max – perechea de date reprezentând
maximul de absorbție, neexcluzându-se posibilitatea de-a exista mai multe maxime (numărul lor și
forma generală a curbei reprezentând o caracteristică calitativă după care se pot identifica
substanțele, iar înălțimea curbei și suprafața încadrată de curbă reprezentând caracteristici
cantitative ce servesc la determinarea concentrației substanțelor din probe).
Antocianinele conțin în general una, două sau trei unități de monozaharide, care sunt fie zaharuri
hexoze, fie pentoză. Substituenții de zahăr întâlniți în mod obișnuit în structura antocianică includ
glucoză, ramnoză, xiloză, galactoză și arabinoză. Variațiile structurale ale antocianilor sunt
determinate de tipul, numărul și poziția fragmentului de zahar. Din punct de vedere chimic,
antocianinele pot diferi unele de altele în ceea ce privește numărul de grupări hidroxil, tipul,
numărul de fragmente de zaharuri asociate cu antocianidină și poziția acestui atașament,
prezența/absența acilării și natura și numărul de acizi alifatici sau aromatici atașați de zaharurile
din moleculă.
Antocianii sunt de două tipuri principale: acilați când zaharurile, atașate cu fragmentul de antocianidină, sunt legate cu un
acid alifatic/aromatic
și neacilați când zahărul nu mai este legat. Partea de zahăr, care este o parte constitutivă a
antocianilor, poate fi esterificată reacția reversibilă dintre un acid și un alcool, cu formare de ester și eliminare de apă cu acizi
alifatici și aromatici. Acizii alifatici predominanți asociați cu antociani includ acizii acetic, malonic,
succinic, oxalic, tartric și malic, în timp ce acizii aromatici includ acizii cumaric, ferulic, cafeic, galic,
sinapic, cinamic și p-hidroxibenzoic. Mai mult de 60% dintre antocianii raportați apar în natură în
formele lor acilate, care au mai multă stabilitate decât omologii lor neacilați.10

9
European Pharmacopoeia 11.0 – 2.2.25. Absorption spectrophotometry, ultraviolet and visible
10
Supradip SAHA and others, Anthocyanin Profiling Using UV-Vis Spectroscopy and Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Journal of AOAC

pagina 8 din 9
În general, spectrul UV-Vis al antocianilor prezintă un model tipic de absorbție. Maximele de
absorbție (λmax) în regiunea vizibilă sunt în general înregistrate la aproximativ 510–520 nm, urmate
de o cocoașă în intervalul 400–450 nm. În plus, se observă un vârf în intervalul 310-340 nm, în
funcție de tipul de antocianin și de natura substituției sale.11

Un spectru UV-Vis tipic al unei familii de antociani arată două grupuri de bază de absorbanță,
primul la o regiune cu lungime de undă de 260-280 nm (regiune UV) și celălalt la 490-550 nm
(regiune vizibilă). În afară de acestea, se observă un vârf suplimentar în intervalul de lungimi de
undă de 310-340 nm ori de câte ori fragmentul de zahăr este acilat. Acest vârf este aproape
absent (sau apare ca o mică cocoașă) în antocianii neacilați. În plus, este înregistrată și o cocoașă
la 400-450 nm, a cărei dimensiune depinde de numărul de fragmente de zahăr atașate la
fragmentul de antocianidină. În general, structura antocianică include un sistem π-conjugat
complet delocalizat, care îi oferă stabilitate.
Ca o caracteristică unică, spectrele UV oferă informații despre natura zahărului atașat cu
fragmentul aglicon al antocianilor. Absorbția molară a unei molecule de antociani este un indicator
al prezenței unui fragment de zahăr. În general, raportul de absorbție E440/Evis de 29-35 prezice o
monozidă, în timp ce o valoare mai mică de 15-24 este observată pentru o biozidă.

International Vol. 103, No.1, 2020

11
Supradip SAHA and others, Anthocyanin Profiling Using UV-Vis Spectroscopy and Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Journal of AOAC

pagina 9 din 9