Subiecte

1. Definiți factorul de selectivitate al unei coloane (α) în cazul a 2 specii.

Factorul de selectivitate al unei coloane reprezintă raportul dintre constanta de distribuție a
speciei mai puternic reținută de coloană și constanta de distribuție a speciei mai puțin reținută
de coloană.

KB – constanta de distribuție a speciei mai puternic reținută de coloană

KA - constanta de distribuție a speciei mai puțin reținută de coloană.

α este prin definiție mai mare decât 1.

Factorul de selectivitate se utilizează împreună cu factorul de retenție la rezolvarea
problemelor referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice.
 2. Care sunt efectele variației temperaturii asupra cromatogramelor?
Temperatura influențează coeficientul de difuzie care este o măsură a împrăștierii benzii
cromatografice. Creșterea temperaturii duce la scăderea vâscozității fazei mobile și astfel la
creșterea vitezei de curgere a acesteia. Cu cât viteza de curgere a fazei mobile este mai mare,
cu atât procesul de difuziune este mai redus.
De asemenea, temperatura intervine și în valorile coeficienților de transfer de masă.
Transferul de masă depinde de vâscozitatea fazei mobile, care este invers proporțională cu
temperatura. Astfel, prin creșterea temperaturii, crește numărul proceselor de transfer de
masă, crește numărul de talere teoretice, ceea ce duce la creșterea eficienței coloanei și la o
rezoluție de separare mai bună.
 3. Care este semnificația termenului de eluție în gradient?
Termenul de eluție în gradient semnifică modificarea fazei mobile în timpul separării
cromatografice, prin creșterea continuă a concentrației, obținându-se un gradient de
concentrație, cu scopul obținerii condițiilor optime de separare pentru fiecare din
componentele probei,
De exemplu, la concentrații mici de solvent vor fi separați compușii care interacționează slab
cu faza staționară, iar pe măsură ce creștem concentrația fazei mobile vor fi antrenați pe
coloană și compușii care interacționează mai puternic cu faza staționară.
4. Cromatografia cantitativă pe coloană – metode de analiză.
 5. Pentru determinarea volumului spațiului gol se utilizează :
a. albastrul de bromfenol
b. Coomassie Brillant blue
c. Blue dextran 2000
d. albastru de metilen
Precizați caracteristicile unei substanțe utilizabile în determinarea volumului total al unei
coloane.

c. Blue dextran 2000

Pentru ca o substanță să poată fi utilizată în determinarea volumului total al unei coloane
aceasta trebuie să nu interacționeze cu faza staționară, să aibă o masă moleculară foarte mare
și să fie un un compus colorat, pentru a se putea urmări eluarea lui din coloană.
 6. Descrieți succint trei metode de determinare a masei moleculare a unei proteine.

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezenta de dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE)

presupune tratarea proteinelor cu SDS, un detergent denaturant care se leagă la proteine și
determină anularea sarcinilor lor intrinseci, conferindu-le o sarcină globală negativă. Astfel,
separarea electroforetică va avea loc numai în funcție de masa moleculară a proteinelor. Prin
utilizarea unor markeri de masă moleculară se poate determina masa proteinei de interes, prin
extrapolare pe graficul logM=f(Rf), unde Rf =distanța parcursă de proteină/distanța parcursă
de colorantul de urmărire.

Gel-filtrarea : prin trecerea unui amestec proteic pe coloană, componentele probei vor
interacționa cu suportul astfel : proteinele cu V mic vor pătrunde mai adânc în porii
suportului, proteinele cu V mai mare vor interacționa mai puțin cu suportul, iar proteinele
foarte mari nu vor interacționa deloc. Determinarea masei moleculare a unei proteine
necunoscute se face extrapolând V eluție al proteinei pe graficul log M=f(Ve), realizat cu
ajutorul unor proteine cu masă moleculară cunoscută.

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezență de bromură de cetil trimetil amoniu (CAT-

PAGE) este o metodă care permite determinarea maselor moleculare a proteinelor native.
CTAB este un detergent care leagă proteinele, conferindu-le sarcină netă pozitivă. Acestea
vor migra către polul pozitiv și se vor separa în funcție de masa lor moleculară.
 7. Se pregătește o soluție de acrilamidă-bisacrilamidă prin dizolvarea a 7,3 g acrilamidă
si 0,2 g bisacrilamidă în 25 ml apă distilată.
Din această soluție se folosesc 2,5 ml la pregătirea unui amestec de polimerizare cu un
volum final de 10 ml.
a. Calculati T% initial și final
b. Calculati C% initial și final
c. Gelul obținut se poate utiliza drept gel de concentrare sau de separare?

a. T% = cantitatea de acrilamidă plus cantitatea de bisacrilamidă în 100 ml soluție

25 ml soluție….(7,3+0,2) g acrilamidă+bisacrilamidă
100 ml soluție….T% initial
T% initial = (7,3+0,2)x4=30%.

100 ml….30 g acrilamidă+bisacrilamidă

2,5 ml……x
x=0,75 g acrilamidă+bisacrilamidă
10 ml….0,75 g acrilamidă+bisacrilamidă
100 ml….T% final
T% final=7,5%

b. C%=

C% initial =

25 ml soluție….7,3 g acrilamidă…0,2 g bisacrilamidă

2,5 ml soluție….x…………………y
x=0,73 g acrilamidă ; y=0,02 g bisacrilamidă
C% final=

Gelul realizat se poate utiliza ca gel de separare deoarece are un T% suficient de mare pentru
ca procesul de cernere moleculară să se desfășoare. Gelul nu poate fi utilizat ca gel de
concentrare, deoarece acestea trebuie să aibă un T% mai mic : 4-5%.
8. Precizați o serie de metode de denaturare utilizate în analiza electroforetică a unei
proteine.
- denaturare cu detergenți (SDS, LDS, CTAB)
- denaturare folosind uree (6-8M)
- denaturare cu clorură de guanidină (6-8 M)
- denaturare folosind agenți reducători ai punților disulfurice : β-mercaptoetanol,
ditiotreitol, ditioeritritol.
- denaturare prin incubare la fierbere
 9. Determinati masele moleculare (lgMM) ale
celor doua proteine separate prin PAGE (linia 3)

Markerii moleculari sunt miozina (200 kDa), beta-

galactozidaza (116 kDa), fosforilaza b (97 kDa),
albumina serica bovina (66 kDa), ovalbumina (45
kDa), anhidraza carbonica (31 kDa), inhibitorul
tripsinei (21,5 kDa) si lizozimul (14,4 kDa).

MM lg MM
200000 5,30103
116000 5,064458
97000 4,986772
66000 4,819544
45000 4,653213
31000 4,491362
21500 4,332438
14400 4,158362
 10. Se amestecă 28,5 g acrilamidă cu 0,5 g bisacrilamidă și se aduce la 100 ml cu apă
distilată
a. Calculați T% si C%
b. Se realizează un amestec de polimerizare compus din

Gel 1
Acrilamidă/bisacrilamidă 2,69 ml
Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 2,5 ml
Apă distilată 4,75 ml
SDS 100µl
TEMED 20µl

Gel 2
Acrilamidă/bisacrilamidă 0,85 ml
Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 ; 1,3 ml
Apă distilată 2,8 ml
SDS 50µl
TEMED 5µl

Calculați T% si C%. Care este rolul celor doua geluri?

a. T%=28,5+0,5=29%
C%=

b. Soluție stoc acrilamidă/bisacrilamidă T=29%

Gel 1 :
100 ml…29 g acrilamidă+bisacrilamidă
2,69 ml…x ; x= g

V gel 1 = 2,69+2,5+4,75+0,1+0,02=10,06 ml
0,78 g….10,06 ml
T%..........100 ml
T%=7,75%

100 ml....28,5 g acrilamidă........0,5g bisacrilamidă

2,69 ml....a g acrilamidă.............b g bisacrilamidă
a=0,76665 g ; b=0,01345
C%= 1,72 %

Gel 2 :
100 ml…29 g acrilamidă+bisacrilamidă
0,85 ml…x ; x= 0,2465g

V gel 2 = 0,85+1,3+2,8+0,05+0,005=5,005 ml
0,2465 g….5,005 ml
T%..........100 ml
T%=4,92%
C%=1,72%
11. Definiți Ka si Kav (asemănari/deosebiri)
12. Avantajele eluției în trepte
În cadrul eluției în trepte, coloana este eluată cu soluții cu putere de eluție crescătoare.
Avantajele acestei metode sunt timpul scurt de realizare și obținerea componentelor
probei într-o formă mai concentrată...............
13. În cazul cromatografiei în strat subțire în sistem cloroform-butanol 7:3, o proba A se
rezolvă în 2 spoturi intim legate. Expuneți căile/metodele de crestere a rezolutiei.
14. Fenomene de adsorbție nespecifică – enumerați cauze
 15. Completați locurile libere

Componenta T=7,5% T=10%

Acrilamida 4,75 g 9,5 g
Bis 0,25 g 0,375 g

Componenta T=5% T=7,5% T=10%

Acrilamida 4,75 g 7,125 g 9,5 g
Bis 0,25 g 0,375 g 0,5 g
16. Aplicații ale electroforezei în flux liber continuu în separarea celulelor
 17. Calculați masa moleculară a unei proteine utilizând relația
log M = -1,10 log a + 6,23
valorile experimentale sunt :

D (cm) V*h*103
0,15 2,5
0,25 5
0,4 7,5
0,56 15
0,77 20
1 25
1,2 30

D (cm) 35

30

25

20

15

10

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
V*h*103

panta dreptei = 26,80471244

log M = -1,10 log(26,804) + 6,23
M = 45600,30341 Da
18. Explicați rolul Blue Dextran 2000 în cromatografie.
Ce se poate spune despre o proteină care migreaza odată cu Blue Dextran? Cum se poate
crește tR pentru aceasta proteină?

Blue dextran 2000 se utilizează pentru determinarea timpului mort (tM) și a volumului
spațiului gol (void volume) în gel-filtrare. Blue dextran 2000 este un conjugat al
dextranului (polizaharid cu masa moleculară foarte mare ) cu un colorant și datorită
mărimii foarte mari trece prin coloană fără a interacționa cu aceasta. Timpul de eluție al
blue dextran 2000 pe coloană va reprezenta tM, iar volumul de eluție va fi void volume.
Dacă o proteină migrează o dată cu blue dextran 2000 se poate spune că aceasta nu
interacționează cu faza staționară, din cauza mărimii foarte mari care nu permite
pătrunderea acesteia prin porii gelului. Pentru a crește tR pentru această proteină trebuie să
alegem un domeniu de selectivitate în care să se regăsească proteina de interes. În funcție
de mărimea proteinei alegem mărimi diferite ale particulelor gelului.
19. Un compus A nu poate fi extras din linia de start în sistemul cloroform-metanol-apă
7:2:1. Încercați să explicați fenomenul si să gasiți soluția adecvată pentru a produce
migrarea acestuia pe support.
Compusul a rămas în linia de start deoarece alegerea fazei mobile nu a fost adecvată,
aceasta fiind prea puțin polară în raport cu compusul pentru a permite eluarea acestuia
pe suportul cromatografic. Pentru a produce migrarea compusul A pe suport putem să
mărim proporția metanolului în sistemul de solvenți ales sau putem să folosim un
solvent mai polar.
20. In cazul cromatografiei de schimb ionic se poate vorbi de void volume? Ce proprietăți
trebuie să aibă o substanță pentru măsurarea acestuia?

Void volume se poate determina și în cazul cromatografiei de schimb ionic. În acest caz,
se introduce pe coloană o proteină care posedă aceeași sarcină superficială ca și sarcina
schimbătorului de ioni. Această proteină nu va interacționa deloc cu schimbătorul de ioni,
astfel încât se poate determina volumul spațiului gol ca fiind volumul necesar eluției
proteinei pe coloană.
21. Explicați relația dintre timpul de retenție și volumul de eluție.
Timpul de retenție și volumul de eluție sunt termeni echivalenți și sunt caracteristice
pentru un compus dat. Timpul de retenție este definit ca timpul necesar unui compus să
treacă printr-o coloană cromatografică, în timp ce volumul de eluție reprezintă volumul de
fază mobilă necesar eluției acelui compus de pe coloană.
22. Gel filtrarea – principiu, aplicatii, avantaje, dezavantaje
 23. Preparați 10 ml gel poliacrilamidă cu T=10% dintr-un amestec acrilamidă-
bisacrilamidă 29,2:0,8 g/100 ml. Calculați C%. Calculați volumul de apă știind că
amestecul de polimerizare conține 2.5 ml tampon Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8, 0.1 ml APS
10% ; 0.05 ml TEMED și 0.1 ml SDS. Care este rolul : APS, TEMED și SDS? Ce fel
de gel s-a preparat? Care este rolul său în separarea electroforetică? Peste acest gel se
toarnă un nou gel cu T=4%, dar tamponul utilizat are pH 6,8. Care este rolul acestui
gel? Modificarea lui T% conduce la modificarea C%?

29,2 g acrilamidă și 0,8 g bisacrilamidă

C%=

T=10% 10 g acrilamidă+bisacrilamidă 100 ml

xg 10 ml
x=1 g acrilamidă+bisacrilamidă

T% initial=30%
30 g 100 ml
1 g acrilamidă+bisacrilamidă y=3,33 ml soluție acrilamidă + bisacrilamidă
VH20=10-(3,33+2,5+0,1+0,05+0,1)=3,92 ml
Gelul preparat reprezintă un gel de poliacrilamidă cu SDS și are rolul de a separa proteinele în
funcție de masa lor moleculară, fiind gel de separare într-o electroforeză in sistem
discontinuu.
Gelul cu T=4% reprezintă gelul de concentrare și are rolul de a stivui componentele probei în
benzi subțiri, proteinele migrând sub această formă în gelul de separare, unde sunt rezolvate.
Modificarea T% nu duce la modificarea C%.
24. Metode de transfer pe membrane și de detectie după transfer.
25. Electroforeza în camp pulsatoriu – principiu, aparatură, utilizări.
26. Definiți următorii termeni : eluție, faza mobilă, faza staționară, constanta de
distribuție, timp de retenție, factor de selectivitate, înălțimea talerului teoretic,
rezoluția coloanei, eluent.
Eluție – trecrea compușilor pe coloană la adăugarea continuă de fază mobilă
Faza mobilă – solventul utillizat pentru eluția probelor
Faza staționară – mediul utilizat în cromatografie prin care componentele probei trec
și unde sunt separate în funcție de tăria interacției stabilite cu faza staționară
Constanta de distribuție – raportul dintre concentrația molară a solutului din faza
staționară și concentrația molară a solutului din faza mobilă
Timp de retenție – timpul necesar unui compus să treacă printr-o coloană
cromatografică
Factor de selectivitate – raportul dintre constanta de distribuție a speciei mai puternic
reținută de coloană și constanta de distribuție a speciei mai puțin reținută de coloană.
Înălțimea talerului teoretic – raportul dintre lungimea coloanei împachetate și numărul
talere teoretice; la nivelul fiecărui taler teoretic se stabilește un echilibru între faza
mobilă și faza staționară.
Rezoluția coloanei – măsură a capacității coloanei de separare a 2 analiți
Eluent – volumul de fază mobilă
27. Descrieți problema generală a eluției.
28. Cum poate fi manipulat factorul de retentie în cazul unui solut?
În cazul cromatografiei cu faza mobilă gazoasă, factorul de retenție poate fi crescut prin
creșterea temperaturii. În schimb, în cazul cromatografiei cu fază mobilă lichidă, creșterea
temperaturii are un efect neglijabil asupra factorului de retenție, în acest caz, factorul de
retenție putând fi modificat prin schimbarea compoziției solventului. Creșterea factorului
de retenție duce în general la creșterea rezoluției, îmbunătățind semnificativ separarea
compușilor.
29. Definiți procesul de alterare a fazei mobile și stationare. Exemple
30. Descrieți o metodă de determinare a numărului de talere teoretice dintr-o coloană.
31. Caracterizați timpul de retentie și volumul de eluție în cazul unui solut.
32. Descrieți tipul de cromatografie de partiție în functie de starea stationară și mobilă.
33. Două proteine A și B se determină prin focalizare izoelectrică având pIA=7,5 și
pIB=8,0. Cele doua proteine se separă prin cromatografie de schimb ionic. Stabiliți
tamponul de eluție și matricea cromatografică utilizată.
Matricea cromatografică : carboximetil Sephadex (CM-Sephadex)
Soluție tampon : tampon acetat pH 4,6
Eluție în gradient sau în trepte cu NaCl
34. Cromatograma de mai jos prezintă modul de separare a celor doua proteine. Calculați
rezoluția de separare a celor două proteine și factorul de asimetrie al acestora. Care
este factorul de trenare?
35. Descrieți succint o metodă cromatografică de determinare a masei moleculare a celor
două proteine.
 36. Amestecul celor doua proteine se supune separării prin electroforeză nativă pe un gel
de poliacrilamidă preparat astfel :
Gel de concentrare (T=4,5%)
Acrilamidă (29,5 g) si bisacrilamidă (0,5 g)
aduse la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 1,3
Apă distilată
Persulfat de amoniu 20 µl
TEMED 5 µl
Volum total 5 ml

Gel de separare (T= )

Acrilamidă (29,5 g) si bisacrilamidă (0,5 g) 3,33 ml
aduse la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 2,5
Apă distilată 4,14
Persulfat de amoniu 50 µl
TEMED 10 µl
Volum total 10 ml

a. Determinati T% si C% in soluția de acrilamidă : bisacrilamidă inițială.

b. Completați locurile libere din cele două tabele.
c. Care este C% în gelul de concentrare? Dar in gelul de separare?

a. T%=29,5 g acrilamidă+0,5 g bisacrilamidă=30%

C%= x100=1,66%

b. Gel de concentrare (T=4,5%)

Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) 0,75 ml
aduse la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 1,3 ml
Apa distilata 2,925 ml
Persulfat de amoniu 20 µl
TEMED 5 µl
Volum total 5 ml

4,5 g acrilamidă+bisacrilamidă…100 ml
x……………………………........5 ml x=0,225 g

30 g……100 ml
0,225 g…..y y=0,75 ml acrilamidă+bisacrilamidă

Gel de separare (T= 10% )

Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) 3,33 ml
aduse la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 2,5 ml
Apa distilata 4,14 ml
Persulfat de amoniu 50 µl
 TEMED 10 µl
Volum total 10 ml

100 ml......30 g
3,33 ml.....x
x=0,99 g

0,99 g...10 ml
T%...........100 ml
c. C% are aceeași valoare în ambele geluri și este egal cu C% din soluția inițială.
C%= x100=1,66%
37. Tamponul de migrare utilizat este Tris-glicina pH 8,3. Explicați succint rolul glicinei
în separarea electroforetică a celor doua proteine.

Ionul glicinat are rol de ion terminal pentru că este un ion lent și migrează ultimul.
Între ionul glicinat și ionul clorură (care este ionul frontal, deoarece migrează rapid în
câmpul electroforetic) se dispun componentele proteice ale probei, aceasta fiind
stivuite în gelul de concentrare și migrând în gelul de separare sub această formă.
38. Amestecul celor două proteine se separă apoi prin electroforeză pe gel de
poliacrilamidă în prezență de SDS. Dupa colorare, proteina B conduce la două benzi.
a. Ce se poate spune despre cele doua proteine?
b. Care este rolul SDS?
c. Care este rolul β-mercaptoetanolului?

a. Proteina A este alcătuită dintr-o singură catenă polipeptidică, în timp ce proteina B

este o proteină oligomeră, fiind alcătuită din 2 subunități.
b. SDS este un detergent anionic, care are rolul de a conferi proteinelor o sarcină totală
negativă, sarcinile intrinseci ale proteinelor devenind neglijabile, astfel încât separarea
se realizează numai în funcție de masa moleculară.
c. β-mercaptoetanolul este un agent reducător al punților disulfurice și este implicat în
denaturarea proteinelor și separarea acestora în subunitățile componente.
39. Variabilele cinetice care afectează împrăștierea zonei cromatografice.
40. Utilizarea gel-filtrării la separările de grup ale proteinelor.
41. Rășini schimbătoare de ioni utilizate în cromatografia de schimb ionic a proteinelor.
Caracteristici.
42. Factorii care influențează rezoluția de separare și mobilitatea electroforetică.
- pH-ul soluției tampon – sarcina electrică este funcție de pH, deci alegerea unei
soluții tampon cu pH corespunzător conduce la rezoluții de separare superioare;
- difuziunea post-electroforetică – apare de la oprirea curentului electric până în
momentul prelucrării gelului și depinde de tipul de electroforeză;
- factori proprii particulelor care se separă : mărime, formă, sarcină, concentrație,
grad de hidratare, grad de disociere;
- factori caracteristici mediului de separare : pH, vâscozitate, intensitatea câmpului
electric, timpul de migrare;
43. Aplicații ale electroforezei frontale.
44. Calculul voltajului în sistemele electroforetice pe gel de agaroză submarine.
45. Factorii de care depinde viteza reacției de polimerizare a acrilamidei : bisacrilamidei.
- concentrația de monomeri și de radicali liberi
- temperatura (reacția de inițiere necesită căldură)
- puritatea reactivilor
- concentrația de inhibitori : oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor,
acesta putând fi eliminat prin dezaerare.
Alți inhibitori : amidele alifatice, H+
46. Principiul separării proteinelor prin cromatografie de afinitate.
47. Principiul separării proteinelor prin cromatografie de afinitate cu ion de metal
imobilizat.
48. Definiți Rf în cromatografie și electroforeză (asemănări și deosebiri).
49. Rezoluția de separare în cromatografie și electroforeză.
50. Sisteme utilizate în denaturarea proteinelor în cazul electroforezei.
51. Rezoluția coloanei.
52. Prezentați succint o tehnică de cromatografie pe coloană.
53. Diagrama Ferguson în cazul a două proteine care diferă prin sarcină dar au aceeași
dimensiune moleculara. Ce reprezintă intersecția cu axa OY?

Diagrama Ferguson se obține prin separarea celor două proteine în geluri cu T%

crescător și reprezentarea grafică a mobilității electroforetice relative (Rm, Rf) funcție
de T%. Panta dreptei obținute este o măsură a masei moleculare și se numește factor
de retardare. Intersecția cu axa OY reprezintă mobilitatea electroforetică relativă în
condiții libere și reprezintă o măsură a sarcinii electrice.
În acest caz, diagrama Ferguson va fi reprezentată de 2 drepte paralele, cu pantă egală,
dar care vor intersecta axa OY în puncte diferite, în funcție de sarcina electrică a
proteinelor.
54. Componentele unui sistem de polimerizare în SDS-PAGE în condiții denaturante.
Descrieți succint rolul fiecărui component.
Componente :
Gel de poliacrilamidă alcătuit din monomerii acrilamidă și bisacrilamidă.
Acrilamida este o substanță care suferă o polimerizare cap-coadă pentru a produce
polimeri lungi. Acești polimeri sunt legați în rețea de către bisacrilamidă, care este
agentul de reticulare.
APS este o sursă de radicali liberi și are rol de inițiator al reacției de polimerizare.
TEMED este catalizatorul reacției de polimerizare, crescând viteza de polimerizare.
SDS este un detergent ionic folosit pentru a denatura proteinele. SDS se leagă la
proteine în proporție mare, astfel încât sarcina intrinsecă a proteinelor devine
neglijabilă față de sarcinile negative induse de prezența detergentului.
Soluția tampon are rol în menținerea pH-ului la valoarea dorită și de asemenea,
conferă contraionii necesari migrării electroforetice.
55. Se prepară un amestec de polimerizare :
2,5 ml acrilamidă:bisacrilamidă 29,5:0,5g%
2,5 ml tampon Tris-HCl pH 8, 1,5M
100 µl persulfat de amoniu
50 µl TEMED
apă distilată până la 10 ml.
Calculați T% initial și final și C% initial și final.

T% initial=29,5+0,5=30%

100 ml soluție….30 g acrilamidă+bisacrilamidă

2,5 ml……………x
x=0,75 g acrilamidă+bisacrilamidă

0,75 g acrilamidă+bisacrilamidă în 10 ml amestec de polimerizare

T%.................................................100 ml
T% final=7,5%

C% inițial=C% final=
56. Punctul isoelectric al 6 fosfogluconat dehidrogenazei este 6. Explicați de ce
tampoanele folosite în cromatografia pe DEAE-celuloză trebuie să aibă pH mai mare
de 6, dar mai mic de 9, pentru ca enzima să se lege la suport. Se va lega această
enzimă la CM-celuloză în același domeniu de pH folosit pentru DEAE-celuloză?
Explicați. În ce domeniu de pH vă așteptați să se lege această dehidrogenază la CM-
celuloză? Explicați.
DEAE celuloza este un schimbător de ioni încărcat pozitiv și leagă proteine cu sarcini
negative. La valori de pH mai mari de pH-ul izoelectric, proteinele au sarcină netă
negativă și enzima se poate lega la suport. Totuși, nu se poate lucra la orice valoare de
pH, deoarece enzima își poate pierde activitatea biologică, dacă se află la un pH în
afara domeniului său de stabilitate.
CM-celuloza este un schimbător de ioni încărcat negativ și va lega doar proteinele cu
sarcină netă pozitivă. Enzima nu se poate lega la CM-celuloză în domeniul de pH 6-9,
deoarece este încărcată negativ. Pentru ca 6-fosfogluconat dehidrogenaza să se lege la
suport ar trebui lucrat la o valoare de pH sub valoarea pI.
57. Ce metodă cromatografică este adecvată pentru separarea următoarelor perechi de
peptide : Ala-Ala-Lys și Ala-Phe-Lys?
Pentru separarea celor două peptide se poate utiliza cromatografia cu fază inversă pe
coloană, în care faza staționară este hidrofobă și faza mobilă este hidrofilă, iar
proteinele interacționează cu faza staționară prin intermediul aminoacizilor nepolari.
Această metodă este foarte specifică, permițând separarea peptidelor care diferă printr-
un singur aminoacid.
 58. Cunoscând faptul că pI al următoarelor proteine sunt :
Mioglobină(cal) 7
Hemoglobină(om) 7,1
Ribonuclează A(bovina) 7,8
Citocrom c (cal) 10,6
indicați ce metode cromatografice ar fi adecvate pentru separarea perechilor de substanțe :
mioglobină-hemoglobină și ribonuclează A-citocrom c.

Mioglobină-hemoglobină – cromatografie de gel-filtrare

Ribonuclează A-citocrom c – cromatografie de schimb ionic
59. Stabiliți corespondența dintre proprietățile proteinelor prezentate în coloana din stânga
și metodele de separare și purificare prezentate în dreapta.
a. Mărime 1. electroforeza
b. Sarcină 2. Gel filtrare
c. Legare specifică 3. Salting-out
d. Solubilitate 4. Imunoprecipitare
5. focalizare izoelectrică
6. cromatografie de afinitate
7. cromatografie de schimb ionic
8. ultracentrifugare zonală

1. a, b
2. a
3. d
4. c
5. b
6. c
7. b
8. a
60. Descrieți succint principiul următoarelor tehnici de cromatografie : cromatografie pe
hidroxiapatită, cromatografia în fază inversă a proteinelor, cromatografia de interacție
hidrofobă, cromatografia de adsorbție tiofilă, cromatografia de schimb ionic.
În care din aceste tehnici se utilizează sulfatul de amoniu? Care este rolul lui? Dar
clorura de magneziu și clorura de sodiu?
61. Rolul glicinei în electroforeza multifazică pe gel de poliacrilamidă.
62. Descrieți 3 metode de determinare a masei moleculare în biochimia analitică.
63. Matrici (suporturi) utilizate în cromatografia de schimb ionic.
64. Rolul Blue dextran 2000 în calcularea caracteristicilor unei coloane cromatografice.
65. Descrieți parametrii T% și C%.
66. Rolul albastrului de brom fenol în determinarea masei moleculare a proteinelor prin
electroforeză.
67. Principiul electroforezei native în prezență de Coomasie Brillant Blue (BN-PAGE)
68. Geluri solubilizabile utilizate în electroforeză.
69. Definiți factorul de retenție și modalitatea sa de determinare.
70. Talerul teoretic. Definiție și rolul său în determinarea eficienței de separare a unor
compuși.
71. Definiți centrii C și P ai unui gel de hidroxiapatită.
72. Separarea populațiilor de celule prin electroforeză în flux continuu.
73. Agenți de reticulare ai acrilamidei utilizați în electroforeză.
74. Factorul de întârziere (Rf). Definiție și rolul său în determinarea eficienței de separare
a unor compuși prin electroforeză și cromatografie.