Aplicații Clinice Ale Biopsiei

Lichide Ca Biomarkeri
Prognostici și Predictivi în
Carcinomul Hepatocelular:
Celulele Tumorale Care Circulă
și ADN-ul Tumorilor Circulante
Cuprins:
 fundal
 Concluzie
 Sfaturi de bază
 Abrevieri
 Aplicații Clinice Ale Biopsiei Lichide Ca
Biomarkeri Prognostici și Predictivi în Carcinomul Hepatocelular: Celulele Tumorale
Care Circulă și ADN-ul Tumorilor Circulante
Video: Aplicații Clinice Ale Biopsiei Lichide Ca
Biomarkeri Prognostici și Predictivi în Carcinomul
Hepatocelular: Celulele Tumorale Care Circulă și
ADN-ul Tumorilor Circulante
Video: Punctia Biopsie Mamara - Dr. Emil Popa, medic primar chirurgie generala 2022,
Octombrie
Carcinomul hepatocelular (HCC) este o boală extrem de malignă, cu prognostic slab și
mortalitate ridicată, datorită unei rate scăzute de diagnostic precoce, rezistenței la
tratamente sistemice și progresiei către boala hepatică în stadiu tardiv. Datorită
limitărilor de detectare a HCC și a lipsei de conștientizare a sistemelor de asistență
medicală, mai puțin de 40% dintre pacienții cu HCC sunt eligibili pentru intervenții
chirurgicale datorită stadiilor avansate ale bolii în momentul diagnosticării și apariției de
leziuni multiple în ciroza sau ficatul fibrotic. În prezent, ghidul actualizat al Asociației
Americane pentru Studiul Bolilor Ficatului (AASLD) nu mai recomandă testarea alfa-
fetoproteinei (AFP) ca parte a evaluării diagnostice. Astfel, este imperativ să se
stabilească o nouă strategie de diagnostic cu sensibilitate și fiabilitate ridicată pentru a
monitoriza factorii de risc pentru a detecta HCC într-un stadiu incipient. În ultimii ani,
„biopsia lichidă” (inclusiv celulele tumorale circulante (CTCs) și ADN-ul tumoral circulant
(ctDNA)), a apărut ca o tehnică pentru caracterizarea celulelor circulante, oferind o bază
puternică pentru tratamentul individualizat al pacienților. Ca metodă de detectare
noninvazivă, biopsia lichidă este de așteptat să joace un rol important în diagnosticul
precoce, monitorizarea dinamică a pacienților cu cancer și screeningul medicamentelor.
În această revizuire, ne vom concentra pe aplicațiile clinice, studiile recente și
perspectivele viitoare ale biopsiei lichide, în special concentrându-ne pe HCC.

fundal
Carcinomul hepatocelular (HCC) este al cincilea cel mai frecvent cancer la nivel
mondial și rămâne a treia cea mai frecventă cauză de deces prin cancer, cu aproape
321.200 de decese și 366.100 de cazuri noi raportate în China (1, 2). Factorii de risc
pentru dezvoltarea HCC includ ciroza hepatică rezultată din infecții virale cauzate de
virusul hepatitei B (VHB) și / sau virusul hepatitei C (VHC), aportul excesiv de alcool,
boala Wilson, stadiul IV ciroza biliară primară și expunerea mediului la aflatoxinele (3,
4). Deși prevenirea primară a infecției cu VHB prin vaccinare la sugari s-a dovedit a fi
eficientă la copiii din China, iar decesele prin cancer hepatic au fost reduse cu 95% la
populația mai tânără (vârste între 0-19 ani) la 15 ani de la punerea în aplicare a unui
program de vaccinare împotriva VHB în zonele cu risc ridicat din China în 1986, poate fi
prea devreme pentru ca tendința de incidență să fie afectată pe toate categoriile de
vârstă (5).

În ciuda managementului modern, inclusiv introducerea de tehnici chirurgicale

îmbunătățite, tratament cuprinzător și terapii țintite, ratele de supraviețuire (OS)
generale ale pacienților cu HCC nu s-au îmbunătățit semnificativ. În plus, HCC este
relativ rezistent la chimioterapie, iar intervențiile chirurgicale incluzând rezecția parțială
a ficatului și transplantul de ficat rămân singurele opțiuni de tratament realiste pentru
HCC. Cu toate acestea, din cauza limitărilor de detectare și a lipsei de conștientizare a
sistemelor de asistență medicală, mai puțin de 40% dintre pacienții cu HCC sunt eligibili
pentru operație din cauza stadiilor avansate ale bolii la diagnostic și a apariției de leziuni
multiple în ficatul cirotic sau fibrotic (6). S-au făcut diverse eforturi pentru îmbunătățirea
ratelor de supraviețuire prin metode de screening timpuriu bazate pe alfa-fetoproteină
serică (AFP) și ecografie hepatică, care sunt metodele cele mai utilizate pe scară largă
pentru screeningul HCC; cu toate acestea, cu o sensibilitate de 25% la 65% pentru AFP
și 60% pentru ecografie, detectarea unei boli cu un impact atât de ridicat prin aceste
metode rămâne suboptimală (7). Prin urmare, este imperativ ca metodele de diagnostic
să fie îmbunătățite pentru a detecta HCC într-un stadiu incipient, astfel încât un
tratament eficient să poată fi administrat la pacienții cu HCC și cancer colorectal
metastatic.
Deși AFP seric a fost utilizat de mult timp ca marker pentru screeningul și
supravegherea HCC, nu este un marker de diagnostic sensibil sau specific pentru HCC.
Mai mult, nivelurile AFP pot fi crescute în bolile non-HCC, inclusiv afecțiunile cronice ale
ficatului, cum ar fi ciroza și inflamația hepatică; colangiocarcinom intrahepatic; și cancer
de colon metastatic (8). Deși nivelurile de AFP serice sunt eficiente pentru a prezice
rezultatele bolii și pentru a monitoriza evoluția tumorii la pacienții cu HCC producători de
AFP, Asociația americană actualizată pentru Studiul bolilor hepatice (AASLD) nu mai
recomandă testarea AFP ca parte a evaluării diagnostice (9). În aceste ghiduri,
evaluarea diametrelor nodulilor hepatici, tomografiei computerizate (CT), imagisticii prin
rezonanță magnetică (RMN) sau biopsiei tisulare sunt recomandate pentru diagnosticul
de HCC.

În prezent, detectarea factorilor motori moleculari ai tumorilor și a mutațiilor specifice

ADN în probele de biopsie tumorală a devenit o practică clinică de rutină în era
medicamentului individualizat, cu scopul de a evalua biomarkeri specifici pentru a
prezice răspunsul sau rezistența la agenții vizați. Cu toate acestea, din cauza
eterogenității tumorii, descrise de diferite profiluri genomice atât în „spațiu cât și în timp”,
în zone anatomice diferite ale aceleiași tumori primare și în metastaze, s-ar putea să nu
fie suficientă caracterizarea heterogenității genetice a tumorii cu o singură biopsie (10,
11). Mai mult decât atât, rezistența dobândită la medicamente la agenții vizați este
frecventă pe parcursul bolii. Aceste descoperiri indică o nevoie urgentă de identificare a
biomarkerilor suplimentari specifici cancerului pentru diagnosticul precoce,
monitorizarea evoluției tumorii și predicția prognostică.

Spre deosebire de biopsia tisulară, biopsia lichidă (inclusiv celulele tumorale circulante
(CTC)) și ADN-ul tumoral circulant (ctDNA) se bazează pe obținerea unui eșantion într-
o manieră convenabilă și minim invazivă la mai multe momente de timp pe parcursul
bolii. Biopsia lichidă permite detectarea și caracterizarea neinvazivă a cancerului,
predicția răspunsului la tratament, monitorizarea recidivei bolii și identificarea
mecanismelor de rezistență la terapii țintite. În acest articol, ne vom concentra pe
aplicații clinice, studii recente și perspective viitoare de biopsie lichidă, în special
concentrându-ne pe HCC (Fig. 1).
figura 1
Biopsia lichidă a HCC: celulele tumorale circulante (CTCs) și ADN-ul tumoral circulant
(ctDNA) sunt ușor accesibile în sângele periferic al pacienților. Aceste molecule sunt
eliberate din celulele HCC supuse apoptozei sau necrozei și pot fi extrase dintr-o probă
de sânge. Analiza acestor molecule poate fi utilizată pentru detectarea precoce a
tumorii și oferă strategie de tratament prognostic de la pacienții cu HCC

Imagine completă

Biologie, detectarea și îmbogățirea CTCS

CTC-urile au fost descoperite pentru prima dată de medicul australian Thomas R.
Ashworth în 1869 în sângele unui pacient cu cancer de sân (12). CTC-urile sunt celule
tumorale care sunt transferate de la o tumoră solidă primară la circulația periferică sau
la sistemul limfatic pentru a fi circulate și, în cele din urmă, cresc în sânge, măduvă
osoasă, ganglioni limfatici sau alte organe sănătoase (13). Acest proces are loc în
fiecare etapă a dezvoltării tumorii. Cu alte cuvinte, CTC sunt markeri utili pentru
diagnosticul precoce și monitorizarea recidivei bolii. Cu toate acestea, studiile asupra
CTC au fost împiedicate de zeci de ani, deoarece aceste celule sunt prezente la
frecvențe extrem de mici în sângele pacientului. În timpul procesului metastatic, aceste
celule trebuie să lupte pentru a supraviețui în fluxul sanguin și mai puțin de 0, 01% din
CTC-urile introduse în circulație supraviețuiesc pentru a produce metastaze (14). Prin
urmare, detectarea CTC a devenit un blocaj și îmbunătățirea procesului de detectare s-
a dovedit dificilă.

În ultimii ani, odată cu îmbunătățirea tehnologiei, separarea și îmbogățirea CTC s-au

îmbunătățit mult. Aceste metode de separare și îmbogățire pot fi clasificate în două
tipuri pe baza proprietăților fizice sau proprietăților biologice ale CTC.

Metodele fizice depind în principal de proprietățile fizice ale CTC, inclusiv dimensiunea,
densitatea, malleabiliby, capacitatea migratorie și sarcina electrică. Metoda de bază de
îmbogățire a CTC-urilor, cum ar fi izolarea după mărimea celulelor tumorale epiteliale
(ISET), este utilizată pentru izolarea celulelor tumorale epiteliale pe baza presupunerii
că celulele tumorale (~ 17-52 μm) sunt relativ mai mari decât globule roșii (RBC) (~ 6–8
μm) și celule albe din sânge (WBC) (~ 7-15 μm) (15). Centrifugarea gradientului este o
altă metodă care poate fi selectată pentru CTC-uri prin centrifugare pe un gradient de
densitate Ficoll bazat pe diferențele de densitate între celulele tumorale și celulele
sanguine (16). Datorită diferenței substanțiale dintre celulele tumorale ale unei tumori
ale unui pacient sau dintre diferiți pacienți, unele celule din sânge pot afișa proprietăți
fizice similare cu CTC-uri; prin urmare, aceste metode fizice au o rată falsă-pozitivă mai
mare, ceea ce limitează utilizarea lor.

Tehnologiile bazate pe proprietăți biologice depind de legarea antigenului-anticorp și de

anticorpi specifici care se leagă la markerii de suprafață de CTC, incluzând molecula de
adeziune a celulelor epiteliale (EpCAM), receptorul factorului de creștere a epidermei
umane (Her2), membri ai familiei citokeratinei (CK), CK18 și CK19) și markeri
mezenchimali (N-cadherin și vimentin) (17, 18, 19). Principiul metodei de captare a
imunității este de a viza un antigen specific; acest lucru este realizat de granule
magnetice conjugate cu un anticorp corespunzător, care este apoi folosit pentru a se
lega de celulele țintă pentru a crea un complex de „țelă-antigen-anticorp-mărgelă
magnetică” sub acțiunea unui câmp magnetic într-o anumită direcție pentru a îmbogăți
celule țintă. Există două metode de captare imună: îmbogățirea pozitivă și îmbogățirea
negativă. Îmbogățirea pozitivă folosește o combinație de perle magnetice legate de
anticorpi anti-țintă pentru a separa celulele tumorale direct sub influența câmpului
magnetic. Cea mai reprezentativă metodă de îmbogățire pozitivă este Cell-Search ™
System (CSS: Veridex LLC, NJ, SUA), care este primul și singurul produs din lume care
a fost aprobat de Food and Drug Administration (FDA) din SUA și Administrația
Națională Chineză a Alimentelor și a Medicamentului (CFDA) pentru depistarea CTC-
urilor pentru diagnosticul bolilor maligne. În această platformă, mărgele ferromagnetice
acoperite cu anticorpi anti-EpCAM sunt utilizate la etapa inițială pentru a îmbogăți CTC,
după care colorarea CK, CD45 și DAPI sunt utilizate pentru a confirma prezența CTC și
pentru a elimina leucocitele (20). Pe piața timpurie a tehnologiilor CTC, acest sistem a
fost considerat a avea o bună repetabilitate, sensibilitate și specificitate (necesită doar
7, 5 ml de sânge, pentru depistarea CTC-urilor printre mai multe celule din sânge și
WBC). Cu toate acestea, nu este capabil să capteze CTC-uri care ar fi putut pierde
aceste molecule specifice, cum ar fi EpCAM, în timpul tranziției epitelial-mezenchimale
(EMT). Mai mult, expresia moleculelor de suprafață a celulelor tumorale, cum ar fi
EpCAM pe multe tumori epiteliale solide, este foarte heterogenă sau chiar nedetectabilă
(cum ar fi în cazul melanomului), ceea ce duce la insuficiență și limitări, și chiar
restricționează aplicarea clinică a EpCAM -strategii dependente pentru captarea directă
a CTC-urilor. Mai mult, în urma reticulării anticorpului de antigene de suprafață celulară,
CTC-urile capturate de anticorpul anti-EpCAM nu mai rămân ca celule naive
nestimulate și acest lucru duce la instabilitatea intracelulară a CTC-urilor izolate, ceea
ce le face improprii pentru analizele ulterioare de proteine, moleculare și genomice.
Aceste limitări au dus la dezvoltarea metodei de îmbogățire negativă. Sistemul
Cytelligen, considerat a fi o platformă integrată unică pentru îmbogățirea scăderii (SE) și
imunostaining-fluorescență hibridizare in situ (iFISH) pentru detectarea eficientă a
celulelor rare circulante, inclusiv CTC-uri vărsate din diverse tumori epiteliale solide,
celule endoteliale circulante (CEC)), și celulele stem, reprezintă această metodă (21).
Diferite metode de detectare a CTC au propriile avantaje și dezavantaje. Prin urmare,
de mult timp, metodologia de izolare și îmbogățire a CTC-urilor este în curs de
dezvoltare.

Aplicații clinice de detectare a CTC la pacienții cu HCC

Analiza specificității identificării celulelor HCC circulante prin detectarea ARNm AFP
asociată hepatocitelor sau HCC în sângele periferic a fost prima dată raportată de
Matsumura M și colab. în 1994 (22). Autorii au demonstrat că nivelul mRNA AFP din
sânge a crescut semnificativ în asociere cu dimensiunea tumorii și concentrația serică a
AFP. Metastaza extrahepatică a fost observată numai la pacienții care aveau ARNm
AFP în sângele periferic. În rezumat, autorii au ajuns la concluzia că prezența mRNA
AFP în sângele periferic poate fi un marker util al hepatocitelor maligne circulante, care
ar putea fi utilizate pentru a prezice răspândirea metastatică hematogenă a celulelor
tumorale la pacienții cu HCC. Cu toate acestea, în studiul respectiv, autorii nu au găsit o
corelație semnificativă între nivelurile crescute de AFP și CTC. În plus, un studiu ulterior
realizat de Matsumura și colab. (23) a raportat o concluzie cu privire la detectarea
mRNA AFP în CTCs în HCC folosind o metodă RT-PCR. Ei credeau că prezența ARNm
AFP în sânge este un predictor al rezultatelor la pacienții cu HCC. Cu toate acestea, alți
cercetători au ajuns la o concluzie contradictorie că, deși mRNA AFP poate fi utilizat
pentru depistarea focarelor tumorale micrometastatice circulante în HCC, ARNm AFP în
sângele periferic nu este un marker specific al micrometastazelor circulante de la HCC,
în special în contextul tratamentului chirurgical al HCC (24). În urma acestor studii,
utilitatea clinică a mRNA AFP periferic a fost de asemenea explorată la mai multe
centre de cercetare, iar controversa privind semnificația sa ca marker prognostic a
persistat (25, 26, 27, 28, 29, 30). Prin urmare, alte molecule specifice tumorii din
sângele periferic, inclusiv MAGE-1, MAGE-3 (31), hTERT (29), GPC-3 (32), CD133,
CD90 (33), K19, CD44 (34) și PLAC1 (35)) au fost cercetate utilizând RT-PCR pentru a
explora o corelație directă între numărul de CTC-uri circulante și reapariția
postoperatorie a HCC. Deși rezultatele mai multor studii în prezent indică faptul că mai
multe gene asociate HCC pot fi utile ca biomarkeri clinici pentru detectarea precoce a
cancei, evaluarea metastazelor, predicția prognosticului și monitorizarea răspunsului la
tratament, încă nu există un indicator larg recunoscut. Problema este probabil legată de
faptul că acești markeri nu sunt specifici HCC. Mai mult decât atât, analizele bazate pe
RT-PCR nu pot cuantifica cu exactitate numărul de CTC și nu sunt în măsură să
furnizeze CTC intacte pentru cercetări ulterioare. Prin urmare, este imperativ să se
stabilească alte metode sensibile și specifice pentru îmbogățirea și detectarea CTC la
pacienții cu HCC.

Pe baza unui principiu diferit de metoda RT-PCR, tehnologia ISET, care asigură o
caracterizare morfologică, imunocitologică și genetică a CTC-urilor individuale, este
utilizată pe scară largă în detectarea CTC. Vona și colab. Au raportat prima aplicare a
metodei ISET pentru detectarea CTC-urilor la pacienții cu HCC. în 2000 (36). Autorii au
considerat că tehnica ISET oferă o oportunitate unică pentru analiza citologică a
sângelui periferic în oncologie și pentru combinarea studiilor imunomorfologice cu teste
noi pentru a explora anomalii genetice în celulele individuale izolate (37). Platforma de
analiză CTC CanPatrol (SurExam, China) este o altă tehnică de îmbogățire a izolării și
caracterizării CTC (38, 39). Această tehnică include două etape majore: o metodă
bazată pe filtru pentru izolarea CTC-urilor și caracterizarea ulterioară a CTC-urilor
folosind markeri EMT, incluzând markerii epiteliali EpCAM și CK și markerii
mezenchimali vimentin și twist.

Sun YF și colab. (40) a descris pentru prima dată posibilitatea detectării CTC-urilor
pozitive EpCAM cu sistemul CellSearch ™ (CSS) la pacienții cu HCC. Cercetătorii au
testat probe de sânge de la 123 de pacienți HCC înainte de rezecție și după o lună
după aceea și au detectat ≥1 CTC (+) CTC în 82 dintre eșantioane, dintre care 51 au
avut ≥2 EpCAM (+) CTC. Aceștia au crezut că un număr preoperator de CTC ≥2 este
un nou predictor pentru reapariția tumorii la pacienții cu HCC după intervenția
chirurgicală, în special în subgrupurile de pacienți cu valori AFP de ≤400 ng / ml. În mod
similar, Schulze K și colab. (41) a detectat ≥1 CTC la 18/59 pacienți cu HCC și a
constatat că sistemul de operare a fost semnificativ mai scurt în cohorta pozitivă CTC
decât în cohorta negativă CTC și, prin urmare, a sugerat că CTC-uri pozitive EpCAM
sunt frecvent detectabile la pacienții cu HCC avansat și prezintă valoare prognostică în
ceea ce privește sistemul de operare și invazia vasculară. Un studiu similar făcut de
Kelley RK și colab. a raportat ≥2 CTCs EpCAM (+) la 7/20 pacienți, arătând o corelație
puternică între EpCAM (+) CTC și nivelurile AFP și invazia vasculară (42). Cu
implicarea continuă a mai multor centre de cercetare, aceste studii indică faptul că CCC
EpCAM (+) contribuie la recurența HCC și, prin urmare, poate fi utilizat ca un nou
predictor prognostic pentru pacienții cu HCC. Cu toate acestea, doar o proporție mică
de celule HCC exprimă EpCAM, care identifică doar un număr scăzut de CTC la
aproximativ 30–40% dintre pacienți (43). În plus, EMT, care este considerat un proces
de inițiere pentru metastaza cancerului, implică pierderea de markeri epiteliali precum
EpCAM, ceea ce înseamnă că CSS poate trece cu vederea celulele HCC circulante.
Aceste motive limitează utilizarea continuă a CSS la pacienții cu HCC.
Yin ZF și colab. (44, 45, 46) a folosit citometria în flux pentru a identifica celulele HCC
care circulă folosind biomarkeri precum Hep Par 1, CK și CPS1 și a demonstrat că
sistemul unic de separare a celulelor HCC cu circulație magnetică mediat de
interacțiunea receptorului asialoglicoproteinei (ASGPR) cu ligandul ar putea fi utilizat
pentru detectarea specifică și eficientă a celulelor HCC circulante. În studiul lui Liu ZX și
colab. (47), CTC-urile în probe de sânge au fost analizate prin citometrie de flux
imagistic bazate pe raportul carioplasmic, precum și EpCAM și CD 45. Autorii au
descoperit o asociere puternică între numărul de CTC și raportul karioplasmic, prezența
invaziei microvasculare (MVI) și Prognostic HCC. Cu avansuri tehnologice, combinații
multimarker, inclusiv pERK și pAkt (48), markeri EMT (twist și vimentin) (49), MAGE-3 și
survivin (50), CK, EpCAM și Glypican-3 (51), Annexin V, EpCAM, ASGPR1 și taMPs
(52), au fost utilizate în detectarea CTC pentru evaluarea metastazelor și prognosticului
și pentru monitorizarea eficacității sorafenibului. În plus față de diferitele metode de
detectare menționate mai sus, CTC-Chip a fost considerat un dispozitiv microfluidic
eficient pentru captarea acestor celule care exprimă EpCAM bazate pe microposturi
acoperite cu anticorp (53, 54, 55, 56). În ciuda diversității metodelor de detectare și a
importanței mai multor ținte moleculare, sunt încă necesare studii multicentrale pentru a
susține afirmația că detectarea CTC va contribui la gestionarea clinică viitoare a
pacienților cu HCC (Tabelul 1).

Tabelul 1 Cercetarea celulelor tumorale circulatorii în carcinomul hepatocelular

Tabel cu dimensiuni complete

Directii viitoare
Analiza CTC ar putea oferi strategii personalizate și eficiente pentru clinicieni și
cercetători, deoarece CTC sunt biomarkeri sensibili care permit diagnosticarea timpurie,
monitorizarea în timp real și caracterizarea moleculară pentru a facilita implementarea
medicamentului de precizie. Într-o meta-analiză raportată de Sun C și colab., Ei au
demonstrat că testul CTC nu este recomandat ca instrument independent de diagnostic
HCC, ci este asociat cu caracteristicile clinicopatologice slabe ale pacienților cu HCC și
ar putea indica un prognostic slab. În plus, au sintetizat sistematic rezultatele studiului
divers și oferă dovezi puternice pentru valoarea potențială clinică a testului CTC (57).
Cu toate acestea, numeroase blocaje trebuie să fie depășite înainte ca analiza CTC să
fie aplicată în clinică. Una dintre provocări este inconsistența dintre metodele de
detectare. Diferitele metode de detectare a CTC menționate mai sus au propriile
avantaje și dezavantaje. Este extrem de dificil să stabilim o metodă extrem de sensibilă
și specifică, care să poată capta întregul spectru de CTC-uri. Prin urmare, protocoalele
standardizate de analiză pentru analiza CTC, inclusiv pregătirea, îmbogățirea și
detectarea eșantionului, sunt critice. În plus, majoritatea studiilor sunt cercetări de un
caz de control de caz, cu o dimensiune limitată a eșantionului. Validarea este uneori
dificilă, dacă nu este complet inexistentă. Este nevoie de studii prospective
multicentrale, cu o dimensiune suficientă a eșantionului și monitorizare îndelungată
pentru a evalua metodologiile de detectare a CTC. În studiile multicentrice, metoda de
detectare este uniformă, iar eșantioanele mari pot oferi o validare puternică pentru
analiza exactă și evaluarea standard a datelor finale. Deși detecția CTC este realizată
în prezent doar pentru cercetare, progresele continue ale tehnologiei vor face posibilă
practica clinică în viitorul apropiat.

Biologia, detectarea și îmbogățirea ADNc

Înainte de a introduce ctDNA, trebuie să introducem conceptul de acizi nucleici circulați
liberi de celule (cfNAs) care conțin ADN, ARNm și miRNA care au fost descoperiți în
probe de sânge periferic uman (58). Primul raport al cfNA-urilor din sângele periferic
uman a fost publicat în 1948 de Mandel și Metais (13). Cu toate acestea, munca lor nu
a câștigat suficientă atenție decât treizeci de ani mai târziu, cu descoperirea unor
concentrații mai mari de ADN fără celule (cfDNA) în ser și plasmă de la pacienții cu
cancer decât la cei de la persoane sănătoase (59). În prezent, cfDNA este considerat
secretat în sânge periferic în stare fiziologică de celulele normale la o concentrație
medie de 30 ng / ml (0–100 ng / ml) (60). ctDNA reprezintă ADN fragmentat derivat de
tumoră în fluxul sanguin al pacienților cu cancer, cu o constituție care variază
substanțial de la 60% din alelele aflate în circulație (61, 62). ctDNA poartă informațiile
genetice ale tumorii, iar analiza cantitativă sau calitativă a ctDNA are o valoare clinică
importantă pentru diagnosticul precoce, tratamentul și monitorizarea progresiei
tumorilor. Concentrația de cfDNA a fost însoțită de o scădere a activității DNazei,
deoarece cfDNA este degradată de activitatea de dezoxiribonuclează din sânge
periferic. Celulele normale din circulația periferică pot elibera și cfDNA, iar acest lucru
reduce concentrațiile de ctDNA (63). Pentru ca ctDNA să fie utilizat ca instrument de
biopsie lichidă, cheia este să poată distinge ctDNA de cantitatea mare de cfDNA
folosind tehnologia avansată existentă.

În prezent, există o dezbatere despre metodele de colectare și extracție pentru

prelevarea ctDNA din ser sau plasmă. Liza ADNc apare secundar procesului de
coagulare a celulelor sanguine în tuburile de colectare; astfel, mai multe studii au găsit
concentrații semnificativ ridicate de cfDNA în ser decât în plasmă (64, 65). După cum
am menționat anterior, acest lucru reduce în continuare concentrația de ctDNA. În mod
similar, colectarea necorespunzătoare a specimenului sau prelucrarea mecanică a
sângelui duce la distrugerea celulelor sanguine, determinând eliberarea de ADNAD în
plasmă (66). Până de curând, viziunea principală a multor cercetători a indicat o
preferință a analizei de ADNc în fracția plasmatică față de cea din ser (67). Deși teoretic
este mai puțin probabil să fie contaminat cu ADN din celulele sanguine, cantitatea de
ADN din plasmă este mai mult sau mai puțin afectată datorită intervalului de timp dintre
colectarea sângelui și analiză (66). Pentru colectarea sângelui sunt recomandate trei
tuburi diferite. Tuburile EDTA sunt de obicei primul tub de colectare recomandat dacă
sângele urmează să fie prelucrat în 6 ore, dar dacă sângele trebuie să fie păstrat o
perioadă mai lungă de timp (> 6 h) înainte de a fi procesat, Streck sau CellSave
colectează sânge (Omaha, NE, SUA) pot fi opțiuni mai bune (68). Aceste detalii sunt
esențiale în procesul de extracție a ADNc și afectează direct stabilitatea și acuratețea
procesului.
Metode de detectare a ctDNA
În general, metodele de detectare a ctDNA ar trebui să fie extrem de sensibile și
specifice, deoarece 1 ml de sânge poate fi utilizat pentru a extrage 10 ng de ADN fără
celule, din care doar 1% sau chiar 0, 01% din ADN-ul tumorii circulante (69). Pe baza
diferențelor în scopuri de testare, metodele de detectare a ctDNA pot fi de asemenea
diferite. Metodele de detectare pot fi rezumate după cum urmează: metode țintite pentru
a analiza câteva mutații cunoscute folosind PCR (de exemplu, PCR digitală, BEAMing
(margele, emulsie, amplificare și magnetică) PCR digitală, sistem de mutație
amplificator-refractar (ARMS) -PCR) și metode nealterate pentru secvențarea a
milioane de fragmente de ADN (de exemplu, secvențiere Sanger, secvențiere de
generație următoare (NGS)). Conform diferitelor strategii de îmbogățire, tehnologiile
bazate pe NGS pot fi împărțite în secvențiere de amplificare țintită (TAS) și secvențiere
de captură țintită (TCS). TAS implică utilizarea a zeci sau chiar sute de perechi de
primer PCR pentru gena țintă pentru mai multe runde de amplificare și îmbogățire a
PCR, iar o metodă reprezentativă este marcată-secvențiere profundă amplicon (TAM-
Seq) (70). TCS implică utilizarea unei sonde pentru captarea genei vizate prin utilizarea
metodei de îmbogățire hibridă. Cea mai clasică metodă TCS este profilarea
personalizată a cancerului prin secvențiere profundă (CAPP-Seq) (71).

Aplicarea clinică a detectării ctDNA la pacienții cu HCC

ctDNA poartă informații despre modificări genetice sau epigenetice specifice tumorii,
cum ar fi mutații punctuale, variații ale numărului de copii (CNV), rearanjări
cromozomiale și modele de metilare ADN și oferă o oportunitate unică pentru
monitorizarea serială a genomurilor tumorale într-un mod noninvaziv, convenabil și
precis. Două modificări diferite sunt monitorizate în timpul detectării ctDNA: modificări
cantitative și schimbări calitative. Prima metodă de detectare măsoară cantitatea de
ctDNA în circulație, iar cea de-a doua detectează aberații genetice specifice tumorii.
Multe studii au investigat modificări cantitative ale cfDNA în sângele pacienților cu HCC
și au demonstrat că nivelurile ridicate de cfDNA pot reprezenta un instrument nou
complementar cu potențiale aplicații clinice pentru screening, detectare, monitorizare a
tratamentului și prezicerea potențialului metastatic în HCC (72, 73, 74, 75, 76, 77, 78).
De exemplu, Ren N și colab. (72) a demonstrat că combinația de ADN plasmatic
circulant și dezechilibru alelic (AI) la D8S258 ar putea fi un predictor independent pentru
prognosticul HCC. Nivelul ADN plasmatic circulant a fost detectat la 79 de pacienți cu
HCC, iar AI la D8S258 a fost corelat semnificativ cu diferențierea tumorii, stadiul TNM și
invazia vasculară și a fost corelat negativ cu supraviețuirea fără boală de 3 ani (DFS) și
OS. GSTP1 cfDNA concentrații s-au dovedit a fi semnificativ crescute în serurile de
pacienți cu HCC asociată cu VHC în studiul Lizuka N și colab. (73). Ei au crezut că
circulația GSTP1 cfDNA este un biomarker bun și specific pentru HCC-asociat cu VHC.
În mod similar, Yan L și colab. (78) a analizat un indice HCC incluzând vârsta, cfDNA și
AFP pentru diagnosticul de HCC cu 87% sensibilitate și 100% specificitate. Metilarea
ADN-ului este una dintre cele mai vechi căi de modificare cunoscute și un număr mare
de studii au arătat că metilarea ADN-ului poate duce la modificări în structura
cromatinei, conformația ADN-ului, stabilitatea ADN-ului și interacțiunile ADN și proteine,
controlând astfel expresia genelor. Mai multe studii au relevat faptul că modificări ale
metilării ADN-ului la multe gene, inclusiv p15 (79), p16 (80), APC (81), SPINT2 (82),
SFRP1 (83), p16INK4a (84), TFPI2 (85), GSTP1 (86) și RASSF1A (87, 88), sunt
asociate cu inițierea și progresia HCC. De exemplu, proteina familiei 1A (RASSF1A) din
domeniul de asociere Ras este un supresor tumoral care se pierde frecvent în
cancerele umane prin metilarea specifică promotorului. Mohamed, N. A și colab. (89) a
arătat că hipermetilarea genei RASSF1A ar putea fi detectată în serul a 90% dintre
pacienții cu HCC și 62, 5% dintre pacienții cu VHC, în timp ce doar 10% dintre voluntarii
sănătoși au prezentat hipermetilare la această genă. Analiza de regresie logistică a
identificat suplimentar că nivelurile serice ale RASSF1A metilate ar putea fi utilizate
pentru a diferenția pacienții cu HCC de voluntarii sănătoși, cu o suprafață sub curba
caracteristicilor de operare ale receptorului (AUROC) de 0, 83 nmol / l și o precizie
generală predictivă de 77, 5%. Luate împreună, aceste descoperiri indică faptul că
nivelurile serice ale RASSF1A metilate pot fi utile pentru diagnosticul precoce al HCC,
în special la pacienții cu risc ridicat cu infecție cu VHC. Detectarea metilării în ADN-ul
periferic are un potențial mare de evaluare a eficacității diagnostice, prognostice și
terapeutice în HCC, dar cel mai important aspect este valoarea sa de diagnostic. Un
număr mare de gene hipermetilate, cum ar fi DBX2 (90), TGR5 (91), MT1M, MT1G (92)
și INK4A (93), în cfDNA de la pacienții cu HCC au fost identificate ca biomarkeri sau
invazie vasculară. Deși s-a dovedit că un grad important de metilare la multiple gene
joacă un rol important în procesul de diagnostic HCC, nu există niciun indicator
recunoscut confirmat în mai multe centre. În plus, detectarea combinată a stării de
metilare a mai multor gene poate fi o modalitate eficientă de a îmbunătăți eficiența
diagnosticului (94). Pentru a evalua potențialul markerilor de metilare a ADNc pentru
diagnosticarea și evaluarea prognosticului HCC, Xu RH și colab. (94) a comparat
profilurile de metilare diferențiale ale țesuturilor HCC și leucocitelor din sânge la indivizi
sănătoși și au identificat un panou de marcaj de metilare care este îmbogățit în HCC.
Sensibilitatea și specificul acestui model de predicție de diagnostic cu zece markeri într-
un set de date de instruire de 715 eșantioane HCC și 560 probe normale au fost de 85,
7%, respectiv 94, 3%. Folosind metodele UniCox și LASSO-Cox, a fost construit un
panou cu 8 markeri pentru a prezice prognosticul pacienților cu HCC. Un scor
prognostic combinat (scor cp) cu acești markeri a fost corelat semnificativ cu riscul de
deces atât în setul de date de instruire, cât și de validare, iar scorul cp a fost un factor
de risc independent pentru supraviețuire. În plus față de analizele bazate pe metilare
ale ctDNA, modificări genetice, cum ar fi mutații, ștergeri, modificări epigenetice pot fi,
de asemenea, utilizate ca biomarkeri tumori în HCC. Până de curând, multe studii au
confirmat că mutațiile specifice tumorii în TP53 (95), ITH (96), HCK (97), CTNNB1 și
TERT (98) sunt frecvente în sângele periferic al pacienților cu HCC. Jiang P și colab.
(99) a aplicat modelul matematic CAZA stabilit pentru a calcula CNV-urile în tumori prin
secvențierea ADN-ului. Mai mult, au fost descoperite CNV anormale la doi pacienți cu
hepatită B utilizând acest model, iar apariția HCC a fost observată și în timpul urmăririi.
Prin urmare, cfDNA are potențial utilitate clinică ca biomarker pentru diagnosticul
precoce al HCC și pentru predicția rezistenței la medicamente și a rezultatelor
prognostice la pacienții cu HCC (Tabelul 2).
Tabelul 2 care circulă cfDNA în carcinomul hepococular

Tabel cu dimensiuni complete

Directii viitoare
Profilarea modificărilor moleculare ale tumorilor este importantă pentru îndrumarea
terapiei vizate. În plus față de îndrumarea tratamentului molecular țintit, detectarea
ADNc ar putea ajuta la monitorizarea răspunsului la tratament, deoarece starea
mutațională în plasmă a fost demonstrată pentru a reflecta sarcina tumorii la pacienți și
a fi corelată cu starea clinică a pacienților (100). În studiile ulterioare efectuate în HCC,
strategiile de cercetare pentru analiza ctDNA pot fi împărțite în două categorii. În primul
rând, modificările asociate cancerului, incluzând mutații / indeluri punctuale, metilare
ADN sau aberații cromozomiale, pot fi identificate prin analiza țesuturilor tumorale,
urmată de identificarea și cuantificarea modificărilor corespunzătoare specifice tumorii
în plasmă. Această strategie poate furniza date puternice pentru terapii vizate ulterioare
la pacienții cu HCC. În al doilea rând, detectarea ctDNA în plasmă poate fi utilizată
pentru screeningul direct al modificărilor asociate cancerului și pentru screeningul sau
supravegherea HCC. În același timp, modificările ctDNA pot oferi, de asemenea, o bază
pentru cronologia chimioembolizării transarteriene (TACE) la pacienții cu HCC.

Inhibitorul tirozin kinazei (TKI) sorafenib a fost opțiunea standard de tratament sistemic
la pacienții cu HCC avansat local timp de câțiva ani. În anii resentimentați, au fost
efectuate multe studii pentru a investiga utilizarea altor ITC în tratamentul din prima sau
a doua linie; cu toate acestea, numai regorafenib, cabozantinib și lenvatinib au arătat o
eficacitate suficientă și au atins punctele finale principale în studiile lor din faza 3 (101).
Imunoterapia a intrat, de asemenea, în cele din urmă în stadiul pentru tratamentul HCC
(102). Cu toate acestea, predicția răspunsului la imunoterapie sau ITC nu a fost fiabilă
în HCC. Sarcina mutațională a tumorii poate fi un predictor potențial pentru răspuns la
aceste tratament. În plus, cuantificarea mutațiilor în HCC folosind ctDNA s-a dovedit a fi
un predictor foarte bun pentru răspunsul la imunoterapie și TKI. Astfel, există o nevoie
urgentă de a evalua și dezvolta utilizarea ctDNA pentru a verifica dacă acesta poate fi
un instrument bun pentru a evalua răspunsurile la imunoterapie sau TKI.

Concluzie
Principalul avantaj al analizei biopsiei lichide este potențialul unic al CTC-urilor și al
ctDNA care trebuie obținute în mod convenabil prin metode minim invazive în mai multe
momente de timp pe parcursul bolii. Cercetările ulterioare privind caracterizarea
moleculară a ctDNA și CTCs vor oferi o mai bună înțelegere a dezvoltării rezistenței la
sorafenib sau TACE și vor ajuta la stabilirea unor planuri de tratament mai
personalizate, cu costuri mai mici și cu efecte secundare mai puține pentru pacienții cu
HCC. Aceste date pot avea un impact profund asupra utilizării acestei strategii speciale
pentru pacienți și pot juca un rol în selecția pacienților care primesc tratament. Biopsia
lichidă a făcut posibilă screeningul pentru HCC în stadii incipiente și a arătat o
promisiune în domeniile diagnosticării, tratamentului și monitorizării tumorii. În plus,
beneficiile biopsiei lichide îl fac un instrument promițător pentru monitorizarea dezvoltării
tumorilor, cu o valoare de aplicare clinică extrem de ridicată și cu o perspectivă de
piață.

Datorită diferențelor de proiectare experimentală și metode de detectare pentru CTC-uri

și ctDNA în cadrul studiilor, datele experimentale sunt foarte diverse și de încredere.
Standardizarea metodelor de detectare și precizia detectării biomarkerilor sunt factori
cheie pentru aplicarea CTC și a ctDNA. Odată cu datele de biopsie lichidă de
acumulare, împreună cu biologia și complexitatea HCC, prezența a câtorva indicatori
pentru distincția dintre tumori și modelele non-tumorale va duce la o schimbare către
modelele de cercetare bazate pe date mari și inteligență artificială. Prin urmare, mutații
la multiple loci, panouri de detecție care implică modele multiple de metilare și
biomarkeri imunitari multipli folosind CTC și ctDNA vor fi utilizate pentru monitorizarea
terapeutică, evaluarea prognostică și evaluarea riscului în HCC.

Sfaturi de bază
Carcinomul hepatocelular este o cauză principală a decesului prin cancer la nivel
mondial. Deoarece CTC și ctDNA la pacienții cu HCC conțin caracteristicile moleculare
ale celulelor HCC, analiza biopsiei lichide în sânge poate fi suficientă pentru a furniza
informații convenabile, neinvazive și exacte pentru diagnostic, tratament și evaluări
prognostice. În această revizuire, vom rezuma și vom discuta progresul actual al
cercetării și provocările în aplicarea biopsiei lichide în HCC.

Abrevieri
cfNAs: