Definitie

Cultura de celule - metoda

de cretere a celulelor animale
si umane n condiii artificiale,
in afara actiuniilor sistemice
ale organismului

Istoric
1907 Harrison: 1912 Carrel (primii
care au folosit metoda pentru studiul
comportamentului celulelor animale
in afara variatiilor sistemice si a
stresului)
Metoda la inceput migrarea
celulelor din fragmente de tesut
nedezagregat (metoda folosita inca
timp de 50 ani)

Alte evenimente importante

1916 metode de dezintegrare tisulara cu enzime
hidrolitice
1940 introducerea antibioticileor in tehnica de lucru
1952 transplant de nucleu
1955 medii artificiale complexe
1964 celule stem de soarece (pluripotente)
1966 primul factor de crestere (NGF)
1970 aparitia primelor hote cu flux laminar
1976 medii sintetice, fara ser sanguin bovin
1980 dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si
inginerie tisulara
1998 cultura de celule umane stem
2000+ - proiectul genomului uman

POSIBILE APLICATII

Avantajele studiilor in vitro

(in cultura celulara)
Controlul mediului extracelular
pH, temperatura, osmolaritate, gaze in atmosfera
Componente nutritive
Micromediu (celule-celule, celule-MEC)
Omogenitatea materialului
Medii selective , clonare

Economie, scara redusa, mecanizare

Caracterizare relativ usoara prin metode imunocitochimice
Volum redus, conservare, acces direct la celule, cost
avantajos
Dispozitive automatizate

Modelarea conditiilor in vitro

Reducerea numarului de animale utilizate

Limitari (dezavantaje)
Control permanent al produsului
Manipulare in conditii sterile
Contaminare chimica
Contaminare microbiana

Control permanent al mediului

Sterilitatea spatiului de lucru
Controlul incubatorului
Deseuri periculoase, cu risc biologic

Cantitatea si pretul materialelor si a mediilor de

cultura
Materiale de unica folosinta
Medii scumpe
Ser fetal de vitel

Instabilitatea genetica
Dediferentiere. adaptarea, cresterea necontrolata selectiva

Identificarea dificila a celulelor

Diferente majore intre comportamentul in vivo si in
vitro

Tipuri de culturi celulare

Dup sistemul de cultur

Celule aderente
Celule n suspensie

Dup tipul celulelor din cultur

Celule normale (nedifereniate, epiteliale, conjunctive)
Celule tumorale

Dup sursa celular

Celule embrionare i fetale
Celule din esuturi adulte (stem sau difereniate)

Dup modul de iniiere

Culturi primare
Culturi de linii celulare

Dup dimensiunea culturii

Culturi n condiii de laborator (petri, flacoane, tuburi, placi
multicelulare)
Culturi la scar industrial (n bioreactoare)

Avantajele si dezavantajele diferitor

tehnici de initiere a culturilor de celule
(Ian Freshney, 2005)

BIOLOGIE CELULARA

Structura celulei eucariote animale

NVELIUL CELULAR
Plasmalema membrana celulara
(componenta de baz a inveliului
celular)
Citoscheletul membranar (pe faa
citoplasmatic a plasmalemei)
Glicocalixul (pe partea externa a
plasmalemei, care vine n contact cu
matricea extracelular)

NVELIUL CELULAR

PLASMALEMA
Plasmalema - 6-8 nm
structura complex i dinamica
Principiul de organizare a
plasmalemei este comun cu cel al
membranelor intracelulare
Singer si Nicolson n 1972 descriu
membrana celular prin modelul
mozaicului fluid lipo-proteic

Mozaicul fluid lipo-proteic

Bistrat lipidic n stare de cristal lichid
Proteine care strabat in intregime sau
parial bistratul lipidic

Compoziia chimic a membranelor

celulare

Lipide 52%
Lipide

Plasmalema celulei hepatice

Plasmalema eritrocitului

Teaca de mielina

Fosfolipide

54%

60%

42%

Glicolipide

7%

3%

28%

Colesterol

17%

23%

22%

Alte lipide

22%

13%

8%

Proteine 40%
teaca de mielina - 25%
plasmalema 50%
membrana interna a mitocondriilor - 75%

Glucide - aproximativ 8%

FOSFOLIPIDELE MEMBRANARE
esteri fosforici ai
glicerolului
aprox. 60% din totalul
lipidelor membranare
2 acizi grasi de 14-24 atomi
de carbon, unul nesaturat
Capul polar al fosfolipidului
poate fi

fosfatidilcolin
fosfatidiletanolamina
fosfatidilserina
fosfatidilinozitol
fosfatidilserin

Sfingomielina face parte

din clasa fosfolipidelor

GLICOLIPIDELE MEMBRANARE

aprox. 5% din totalul lipidelor membranare;

sunt localizate doar n stratul extern al plasmalemei;
capul hidrofil alctuit dintr-un radical glucidic;
coada - o molecula de sfingozin legat de un acid
gras;
clasificare:
Glicolipide neutre - gruparea hidrofil este alctuit din unul
sau mai multe reziduri glucidice neutre. Cel mai simplu
glicolipid galactocerebrozida glicolipid neutru
Glicolipide polare (gangliozidele) au o structura complexa.
Contin mai multe resturi glucidice (galactoza, glucoza, Nacetilgalactozamina) si unul sau mai multe resturi de acid
sialic (acid-N-acetilneuraminic, sau NANA), care confera
moleculei o incarcatur electric negativ

STRUCTURA GLICOLIPIDELOR
NEUTRE

POLARE

COLESTEROLUL

Molecul specific doar

membranelor celulare din
lumea animal;
Se gsete n proporie de 323% din totalul lipidelor
membranare;
Molecula de colesterol este
amfipatica, prezentnd un
segment hidrofil (anionul OH),
ataat la primul inel sterolic in
pozitia C3. Restul moleculei
de colesterol poart un
caracter hidrofob
Aranjamentul specific al
moleculelor de colesterol n
membrana celular duce la
ordonarea i imobilizarea
lipidelor, crescnd rigiditatea
membranar

Proteinele membranare
In general, continutul proteic al membranelor celulare reflecta
intensitatea functionala a structurii din care fac parte
Clasificare
proteine integrale (intrinseci) - traverseaz integral sau
partial dublul strat lipidic, stabilind legaturi puternice cu lipidele
a)transmembranare strbat membrana n ntregime, au
proprieti amfifile. Au un mijloc hidrofob si extremiti hidrofile
b)superficiale - strabat partial membrana (se gsesc doar n
unul din straturi). Au un domeniu hidrofil si unul hidrofob
proteine periferice (extrinseci) - stabilesc legaturi
necovalente cu gruparile polare de pe suprafeele dublului strat
lipidic sau cu domeniile extra- si intracelulare ale proteinelor
intrinseci. Sunt proteine cu nveli n totalitate hidrofil

Clasificarea proteinelor
membranare dup structur
Proteine globulare -rezulta din plierea
lanturilor polipeptidice (n general proteinele
intergrate n membran)
Proteine fibrilare lanuri polipeptidice
liniare (localizate pe superfa ntern sau
extern a membranei, alctuiesc structura
MEC sau fac parte din citoscheletul
membranar)

GLICOCALIXUL
GLICOCALIXUL - zona periferica externa a
suprafetei celulare (NVELIUL DULCE AL CELULEI);
Alctuit din resturile glucidice ale componentelor
stratului extern al plasmalemei (glicolipide,
glicoproteine);
Se continu cu matricea extracelular (MEC)
Funciile glicocalixului:
- recunoasterea celulara,
- adeziunea intercelular i de substrat,
- distributia sarcinilor electrice pe suprafata
celulara,
- depozite de calciu ionic
- depozite de factorilor de crestere tisulara sub
form inactiv

CITOSCHELETUL MEMBRANAR
reea proteic fibrilar pe faa intern a
plasmalemei;
alcatuit n cea mai mare parte din filamente
de actina si filamente intermediare;
funciile citoscheletului membranar:
determin forma specific a celulei;
este implicat n motilitatea celular;
formeaz specializrile plasmalemei polului
apical (microvili, stereocili, cili vibratili);
particip la formarea jonciunulor celulare

FUNCIILE PLASMALEMEI
Transport transmembranar
pasiv, activ, microtransport, macrotransport

Controlul fluxului de informaie

recunoasterea, recepia si transmiterea
moleculelor semnal

Funcia enzimatic
cataliza unor reacii specifice intercelulare

Formarea conexiunilor intercelulare i celulMEC

jonciuni adeziune, comunicare, strnse
ancorarea celulelor la matricea extracelulara prin
jonctiuni de adeziune i contacte focale

Funciile plasmalemei sunt

asigurate de proteinelele
membranare

Tipuri de microtransport
(sintez)

MACROTRANSPORT
Endocitoza, Exocitoza,
Transcitoza

SEMNALIZAREA CELULAR

Localizarea receptorilor
Receptori membranari
(proteine membranare)
Receptori citoplasmatici
(proteine-enzime citoplasmatice)
Receptori nucleari
(proteine reglatoare de gene)

Mecanismele de actiune
Semnalizare prin clivarea
componentelor membranare (albastu)
Semnalizare prin intermediari
membranari si citoplasmatici (verde)
Semnalizare prin pasajul moleculeisemnal prin membrana celular n
citoplasm i nucleu (galben)
Semnalizare direct la nivel de nucleu
(rosu)

Receptori membranari

Receptori citoplasmatici

Receptori membranari
Sunt proteine transmembranare
Recunosc specific o anumita molecula
ligand specific
Legatura ligand - receptor se
caracterizeaz printr-o afinitate mare
o
concentraie foarte mica (10-910-11 Mol) a
ligandului poate fi detectat de receptor i
poate declana fenomenele intracelulare
de transmitere a mesajului
Mecanismele de actiune intacelulare ale
receptorilor membranari sunt de tip
ionotrop sau chimiotrop

Receptorii membranari

Receptorilor membranari ionotropi leaga un ligand specific, iar

legatura ligand-receptor duce la deschiderea unui canal ionic cu
modificarea permiabilitii membranare pentru un anumit ion. Acestia
sunt canale ionice cu poart dependent de ligand, care au un

situs extracelular specific de recunoatere i legare a unei

molecule

Exemple:
receptorul nicotinic pentru acetilcolin (Ach) (pt. Na)
pentru acidul--aminobutiric (GABA) (pt. Cl)
receptorul glutaminic (glutamate analogue N-Methyl-DAspartate - NMDAr) (pt. Ca)
Receptorii chimiotropi sunt proteine membranare cuplate funcional cu
proteine de tip G sau alte enzime, care declaneaz reacii intracelulare n
cascad, de activare sau inhibiie a altor enzime.
Exemple:
receptorii cuplai cu proteinele G (receptorul muscarinic pentru
Ach, receptorii adrenergici, receptorul serotoninergic,
dopaminergici, receptorii opeoizi, hormoni peptidici si altele)
receptorii cu acivitate enzimatic (receptorii pentru factorii de
cretere tisulara)
receptorii asociai cu enzime membranare, altele decat
proteinele G (receptori pt. citokine, in particular interleukine -IL

Receptor ionotrop
(Canal ionic cu poart
acionat de un stimul chimic)

Tipuri de proteine G

Cytokines, Growth Factors and

Hormones

SIGMA-ALDRICH

Mecanismul de transductie
citoplasmatica