1.

INSULINA UMANĂ RECOMBINATĂ

1.1. Aspecte generale

• principalul hormon pancreatic

• glucagonul - antagonist, hiperglicemiant
• descoperită în 1921, de catre romanul N. Paulescu şi de către canadienii Banting, Mac Leod şi Best
• 1923 premiul Nobel în fiziologie.

1
Extrasa initial din pancreasul de porcine şi bovine. Procesul de purificare - optimizarea
extracţiei în vederea reducerii concentraţiilor de impurităţi generale proteice si impurităţi
proteice asociate insulinei (proinsulina şi polimerii insulinei).
Elaborarea de formulări s-a concentrat asupra ameliorării stabilităţii chimice prin:
■ deplasarea de la formulări cu caracter acid la formulări cu caracter neutru
■ prin modificarea profilului timp-acţiune, lucru posibil prin folosirea diferitelor
concentraţii de zinc şi protamină.
Eli Lilly - prima firmă farmaceutică care a produs şi comercializat insulina animală
care se extrăgea în cantitate de circa 100g din o tonă de pancreas.
1952 - cristalizare
1955, Sanger - structura chimică a insulinei: două lanţuri polipeptidice A şi B formate
din 21 şi respectiv 30 de aminoacizi.
1979 - au fost sintetizate genele corespunzătoare celor două lanţuri polipeptidice ale
insulinei umane de catre Itakura
1978 - 1980 insulina umană biosintetică
1982 - in S.U.A., Anglia, Olanda şi R.F.G. s-a aprobat comercializarea insulinei umane,
produsă prin tehnologia ADN recombinat.
Firmele Eli Lilly din S.U.A. şi Novo din Danemarca produc acum pe scară industrială
insulina sintetizată de gene sintetice introduse în bacterii.
Insulina umană prin inginerie genetică este rezultatul colaborării Genentech, Eli Lilly
şi City of Hope Medical Center din California.
Testele clinice au dovedit că această insulină are aceeaşi activitate ca şi insulina din
pancreasul bovin sau porcin si nu produce efectele secundare ale acestora. 2
 1.2. Descrierea chimică a insulinei
Insulina matură, biologic activă, este o proteină mică cu greutate moleculară (5,7kD, 51 de
aminoacizi). Este constituită din două catene polipeptidice distincte: catena A, conţinând 21 de
aminoacizi şi catena B formată din 30 de aminoacizi. Cele două catene sunt legate între ele prin două
legături disulfurice (A7 - B7 şi A20 - B19). O a treia legătură disulfurică este o legătură intracatenară
localizată în catena A între resturile cisteinice A6 şi A11.

Fig.1. Structura insulinei (2 catene polipeptidice A si B reunite prin 3 legaturi disulfurice reprezentate cu
verde – 2 intercatenare A7-B7 si A20-B19 si o legatura intracatenara in catena A A 6-A11)
3
 1.3. Biosinteza şi secreţia insulinei din celulele beta pancreatice
- sintetizată sub forma unui precursor numit pre-proinsulină = produsul de translaţie al ARNm.
Pre-proinsulină = proinsulina şi o secvenţa "semnal"
- secvenţa "semnal" este necesară transportului pre-proinsulinei prin membrana reticulilor
endoplasmatici. Este îndepărtată enzimatic în timpul transportului pre-proinsulinei la veziculele
celulelor pancreatice.
- biosinteza insulinei active (maturarea insulinei) are loc în veziculele celulelor pancreatice prin
conversia enzimatică a proinsulinei în insulină. Procesele au loc în celulele beta pancreatice din
insulele Langerhans. In acest proces are loc eliminarea unei catene polipeptidice (polipeptida C) care
în proinsulină face legătura între catenele A şi B.
Prin urmare, insulina matură este rezultatul final al conversiei:
pre-proinsulină → proinsulină → insulină

4
 1.4. Reglarea secreţiei de insulină
Factori care regleaza secretia de insulina:
a) - stimulatori:
• glucoza serică chiar în cantităţi fiziologice (80-100mg/dl);
• alte monozaharide uşor metabolizabile - fructoza, manoza;
• aminoacizii în special arginina, lizina şi leucina;
• polipeptidul inhibitor gastric (GIP), cu funcţie de hormon local, polipeptid eliberat de mucoasa
duodenală şi jejunală la ingestia de glucoză.
b) - inhibitori:
• agoniştii α-adrenergici; adrenalina prin α-receptori este un inhibitor fiziologic al insulinei;
• somatostatina, produsă de celulele D (δ) din pancreas prin acţiune paracrină.

5
 1.5. Procedee de obţinere a insulinei prin inginerie genetică
Insulina produsă de bacteriile modificate este absolut identică cu insulina umană
pancreatică.
A. Obţinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic
(clonarea genelor corespunzătoare catenelor A şi B ale insulinei)
• pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide înlănţuite în mod specific
(catena A are 21 aminoacizi x 3 nucleotide/aminoacid = 63)
• pentru catena B de 90 de nucleotide cuplate
(catena B – 30 aminoacizi x 3nucleotide/aminoacid = 90 nucleotide).
Proiectul a mai prevăzut ataşarea la capetele lor a unor nucleotide care să asigure:
• cuplarea corectă a genelor de vector - adăugarea a 12 nucleotide, dintre care 6 asigură jumătate din
situsul enzimei de restricţie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide jumătate din situsul enzimei de restricţie
BamHI.
• prezenţa semnalelor necesare pentru pornirea şi oprirea exactă a transcrierii genelor
• pornirea este realizată de codonul ATG plasat la începutul genei între situsul enzimei EcoRI şi
gena structurală;
• oprirea transcrierii este asigurată de doi codoni (TAA şi TAG) plasaţi între capătul genei
structurale şi situsul enzimei de restricţie BamHI.
• gena A a fost obţinută din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin metoda fosfotriesterilor
• gena B a fost obţinută din 18 oligodeoxinucleotide diferite sintetizate prin aceeaşi metodă chimică.

6
Cele două gene corespunzătoare catenelor A şi B ale insulinei mature au fost apoi inserate
independent pe câte un vector de clonare genetică prevăzut cu elementele de control ale
operonului lac - plasmid.
Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea celulelor de E.
coli. În celulele transformate ADN recombinat se replică.
Sub controlul elementelor de reglaj ale operonului lac se sintetizează complexul β-galactozidaza-
catena A a insulinei în celulele transformate cu ADN recombinat conţinând gena A şi complexul
β-galactozidaza-catena B în celulele transformate cu ADN recombinat conţinând gena B a
insulinei.
În final, cele două catene ale insulinei sunt detaşate de β-galactozidaza cu ajutorul unui reactiv
chimic (BrCN) care acţionează asupra metioninei situată exact la locul de joncţiune dintre cele
două componente.
După purificare, cele două catene se amestecă şi, prin simpla oxidare cu aer, ele se cuplează
prin legături disulfurice (cisteina), dând naştere insulinei, care este identică atât structural cât şi
funcţional cu insulina umană.

7
Fig.3. Obţinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic

8
 B. Obţinerea insulinei prin ADN recombinat conţinând gena pentru proinsulină
Acest procedeu are la bază construirea unor plasmide care să conţină secvenţele (genele) care
codifică proinsulina sub forma ADNcomplementar. Acest ADNc se poate sintetiza in vitro din ARNm
pentru proinsulină izolat din celulele beta din insulele Langerhans ale pancreasului.
ARNm se izolează din aceste celule, se purifică prin cromatografie pe oligo-dT-celuloză şi este
apoi utilizat la sinteza de ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La începutul lanţului de ADNc se
ataşează codonul ATG (sintetizat chimic) corespunzător metioninei.
În acest fel are loc marcarea pentru ADNc şi se asigură şi delimitarea galactozidazei de
proinsulină, ceea ce uşurează procesul de purificare a proinsulinei prin tratarea cu BrCN.
ADNc astfel pregătit este apoi cuplat cu vectorul plasmidial prevăzut cu elementele de control
ale operonului lac conţinând o mică parte din gena structurală a galactozidazei.
ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E. coli. Celulele
transformate produc o proteină compusă din β-galactozidază şi proinsulină. Aceasta, tratată cu
BrCN, eliberează proinsulina, care apoi este convertită în insulina matură pe cale enzimatică.
Avantajele insulinei umane obţinută prin ADN recombinat faţă de insulina izolată din
pancreasul animal sunt:
■ nu induce afecţiuni oculare (retinopatie) şi renale (nefropatie)
■ nu provoacă alergii (faţă de 5% alergii la insulina animală)
■ are un grad înalt de puritate, se poate obţine în orice cantitate
■ producţia nu este dependentă de abatoare, care sunt aprovizionate discontinuu
■ testele clinice au stabilit că insulina umană obţinută prin inginerie genetică este mai activă
decât insulina umană.

9
Fig.4. Obţinerea insulinei prin ADN recombinat conţinând gena pentru proinsulină
10
 1.6. Formulări farmaceutice ale insulinei umane recombinate
1.6.1. Formulări ale insulinei sub formă de preparate solubile cu acţiune rapidă
Molecula de insulină are o sarcină negativă netă la pH neutru.
Această sarcină negativă netă a insulinei a fost folosită la dezvoltarea formulărilor farmaceutice.
La început produsele cu insulină solubilă au fost formulate în condiţii soluţii la pH acid – instabile
(proces de dezamidare considerabil la nivelul asparaginazei din poziţia 21 - lanţul A ► pierderea
activităţii biologice pe parcursul unei conservări prelungite în condiţii de pH acid).
Pentru a ameliora stabilitatea chimică - soluţii neutre stabilizate cu zinc prin folosirea capacităţii sale
de a se autoasocia uşor sub formă de dimeri sau sub formă de stări cu un ordin mai mare de
autoasociere.
Fiziologic, insulina este stocată în celulele beta ale pancreasului sub forma unor hexameri care conţin
zinc.
Ca urmare în formulările simple (normale) neutre, insulina este stabilizată chimic prin adăugarea de
zinc (~0,4%) şi conservanţi fenolici:
Zincul
• structuri hexamerice distincte (care conţin doi atomi de Zn/hexamer)
• poate cupla 6 molecule de conservanţi fenolici.
• preparatele cu insulină comercializate - excipienţi fenolici (fenol, m-cresol) - agenţi antimicrobieni
• specii fenolice se cuplează la locurile specifice de pe hexamerii Zn-insulinei,
• modificare conformaţională care măreşte stabilitatea chimică a insulinei în preparatele
comerciale (starea R6).

11
 Fig.5. Asocierea moleculelor de insulina. Rolul zincului si al conservantilor fenolici in
stabilizarea preparatelor cu insulina

Formulările moderne ale insulinei mai pot conţine

■ un agent pentru izotonicitate (glicerol sau NaCl) pentru a reduce lezarea ţesutului şi durerea
la injectare şi
■ un tampon fiziologic (fosfat de sodiu) pentru a împiedica deplasarea pH-ului în cazul unor
formulări sensibile la pH.

Formulările normale (simple) neutre numite Insulina Regular prezintă o activitate maximă a
insulinei după 2-3 ore, cu o durată maximă de 6-8 ore.
Ca şi în cazul altor formulări, variaţiile intervenite în relaţia timp-acţiune pot fi atribuite
factorilor următori: doza, locul injectării, temperatura şi activitatea fizică a pacientului.

12
 În pofida stării solubile a insulinei, în aceste formulări s-a observat o întârziere a declanşării
acţiunii.
A fost atribuită timpului necesar hexamerului pentru a disocia în dimeri şi/sau monomeri
înaintea absorbţiei prin membrane biologice.

Fig.6. Difuzia insulinei prin membrane biologice

13
Au fost elaboraţi analogi monomerici pentru evitarea proprietăţii de autoasociere a insulinei
- analog monomeric, prin schimbarea poziţiilor între ele a lizinei (Lys 28) şi prolinei (Pro 29)
din lanţul B al insulinei umane = Insulina lispro care prezintă un profil mai rapid al relaţiei
acţiune-timp, având o activitate maximă după aproximativ o oră datorită posibilităţii reduse
de autoasociere, comparativ cu insulina umană.
Tabel1. Modificari ale aminoacizilor in insulina

Insulina lispro poate fi stabilizată în cadrul unui complex hexameric dependent de un

conservant care asigură stabilitatea chimică şi fizică necesară tuturor preparatelor de
insulină păstrându-şi profilul său rapid acţiune-timp.
În afara formulărilor rapide menţionate mai înainte, fabricanţii au conceput formulări
solubile care să fie utilizate în pompe externe sau implantate. În majoritatea privinţelor,
aceste formulări sunt foarte asemănătoare cu insulina regular (simplă sau normală în cea
ce priveşte starea de asociere hexamerică, conservantul şi zincul); cu toate acestea în
formulările respective pot fi incluşi: agenţi de tamponare şi/sau surfactanţi pentru a
reduce agregarea fizică a insulinei care poate determina astuparea tubului pompei.
14
 1.6.2. Formulări farmaceutice ale insulinei cu acţiune intermediară
Insulină NPH şi Insulină lente. Ambele formulări permit obţinerea unor profiluri prelungite privind
relaţia timp-acţiune prin faptul că necesită dizolvarea unei forme precipitate şi/sau cristaline a
insulinei, etapă care limitează viteza de biodisponibilitate a insulinelor cu acţiune intermediară şi
lungă.
► Insulină NPH.
Iniţialele NPH se referă la Neutral Protamine Hagedorn, nume care vine de la inventatorul - H.C.
Hagedorn. Este o suspensie cristalină neutră care este preparată prin co-cristalizarea insulinei cu
protamina. Protamina - grup de proteine cu caracter bazic puternic, grup de substanţe strâns
înrudite care sunt obţinute din sperma de peşte. În general, protamina este caracterizată printr-un
număr de aproximativ 30 aminoacizi, dintre care arginina este în proporţie de 65-70%. Momentul
în care, după cristalizare, în soluţie nu mai există protamină sau insulină măsurabilă este denumit
ca fiind punctul de isophane.
De aceea Insulina NPH se mai numeşte Insulina "Isophane".
Insulina NPH are o declanşare a acţiunii cuprinsă între 1-2 ore, o activitate maximă cuprinsă
între 6-12 ore şi o durată a activităţii de 18-24 ore.
Ca şi în cazul altor formulări, variaţiile observate la relaţia timp-acţiune sunt datorate unor
factori cum ar fi: doza, locul injectării, temperatura şi activitatea fizică a pacientului.
Insulina NPH poate fi amestecată uşor cu Insulina regular fie ex tempore, de către pacient,
fie în formulări preamestecate. Insulina preamestecată, de exemplu NPH/Regular în raportul
70/30 sau 50/50, oferă pacientului o ameliorare a exactităţii la dozare şi, în consecinţă, o
ameliorare a controlului glicemiei.

15
 Au fost soluţionate şi controversele privind imunogenitatea la protamină prin folosirea de
Insulină Lente sau Insulina Ultralente.

►Insulina Lente este o suspensie de zinc-insulină care a fost concepută pentru o singură
injecţie zilnică:
• un amestec constituit din două forme insolubile de insulină
• 70% cristale romboedrice de zinc-insulină (componenta ultralente)
• 30% particule de insulină amorfă (componenta semilente).
• este un preparat neutru care conţine:
• tampon pe bază de acetat
• un exces de zinc care se leagă la suprafaţa hexamerului insulinei, reducând astfel
solubilitatea insulinei şi astfel
• se produce o încetinire a profilului timp-acţiune.
• Insulina Lente are o declanşare a acţiunii după 1-3 ore, activitatea maximă este între 6-12 ore şi
durata acţiunii revine la 18-24 ore. Ca şi în cazul altor formulări, variaţiile observate în ceea ce
priveşte profilul timp-acţiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectării, temperatura
şi activitatea fizică a pacientului
• amestecare a Insulinei Lente cu Insulina Regular este limitată la amestecurile ex tempore care
sunt utilizate imediat după preparare din cauza precipitării insulinei din produsul Regular datorată
probabil cuplării surplusului de zinc aflat în preparatul Lente la suprafaţa structurii pe hexamerice a
insulinei solubile.

16
 1.6.3. Formulări farmaceutice ale insulinei cu acţiune prelungită
În mod curent singura insulină cu acţiune prelungită disponibilă este insulina Ultralente,
care este o suspensie de insulină cristalizată.
Formularea conţine un agent de tamponare cu valoare neutră a pH-ului şi un surplus de
zinc.
Insulina Ultralente are o declanşare a acţiunii la 4-6 ore, o activitate maximă cuprinsă între
8-20 ore şi o durată acţiunii situată între 24-28 ore. Ca şi celelalte formulări, variaţiile profilului
timp-acţiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectării, temperatura, activitatea
fizică a pacientului.
Amestecarea preparatului de insulină Ultralente cu insulina Regular este limitată la
amestecarea ex tempore şi utilizarea imediată.

17
 Tabel.2. Preparate comerciale cu insulină

Denumirea
Tipul Aspect Compoziţia Durata de de acţiune
comercială
insulinei
zinc (0,01-0,04 mg/100
Insulina Regular
unităţi)
R (insulină solubilă Soluţie clară 6-8 ore
m-crezol
injectabilă)
glicerol
zinc (0,01-0,04 mg/100
unităţi)
tampon fosfat
Insulina NPH
N Suspensie m-crezol şi fenol 18-24 ore
(insulina “isophane”)
glicerol
protamina (0,32-0,44 mg/100
unităţi)
zinc (0,12-0,25 mg/100
unităţi)
Insulina Lente
L Suspensie tampon acetat 18-24 ore
Insulina-zinc
metilparaben
glicerol
zinc (0,12-0,25 mg/100
unităţi)
Insulina Ultralente
U Suspensie tampon acetat 24-28 ore
Insulină-zinc
metilparaben
glicerol

18
 1.6.4. Statutul comercial al preparatelor cu insulină umană recombinată
Insulina umană recombinată se prezintă pe piaţa farmaceutică, în mod obişnuit, în flacoane
de 10 ml.
În S.U.A. concentraţia de 100 U/ml reprezintă concentraţia standard.
În afara Statelor Unite se folosesc două concentraţii, respectiv 100 U/ml (U-100) şi 40 de
U/ml (U-40).

19
 2. RECOMBINAREA GENETICĂ ÎN OBŢINEREA MEDICAMENTELOR CU
INTERFERONI

2.1. Aspecte generale privind sistemul interferonic

Descoperiți în 1957, de către cercetătorii englezi Aleck Isaacs şi Jean Lindenman. Denumirea
de "interferon" (IFN) derivă de la fenomenul de interferenţă virală. Iniţial interferonii au fost
definiţi ca substanţe proteice, elaborate de către celule ca răspuns la infecţia virală şi care au
proprietatea de a transfera altor celule rezistenţa la agentul viral respectiv sau la alte virusuri.
Evidenţierea capacităţii leucocitelor umane de a sintetiza IFN (K. Cantell şi col.), ca şi a
proprietăţilor antitumorale ale IFN (I. Gresser) au impus reconsiderarea interferonilor ca un sistem
biologic complex.
În 1986 Fradelizi includea interferonii în grupa imunohormonilor sau a limfokinelor, pe baza
proprietăţii acestora de efectori celulari.
În concepţia actuală, interferonii reprezintă un grup de biomolecule care fac parte din familia
mare a substanţelor responsabile de comunicarea intercelulară numite citokine şi care au rol în
special în apărarea antivirală, în modularea răspunsului imun, în controlul proliferării şi
diferenţierii celulare.

20
 2.2. Structura chimică a interferonilor. Tipuri de interferoni
Din punct de vedere structural, interferonii sunt glicoproteine ce cuprind 146-166 aminoacizi şi
lanţuri polizaharidice cu acizi sialici terminali.
Interferonii prezintă specificitate de specie şi în cadrul unei anumite specii animale există mai multe
forme de IFN diferite prin:
• antigenitate
• masă moleculară (de la 15 la 1000 kD)
• grad de glicolizare.
Masa moleculară a interferonilor umani este cuprinsă între 17kD şi 23kD.
Există 3 clase majore iar la om există mai multe tipuri genetice de interferoni: alfa, beta, gama, tau şi
omega. Cromozomul 9 conţine genele pentru IFN alfa, beta, tau şi omega, iar cromozomul 12 pentru
IFN gama. Sunt cunoscute în prezent o diversitate de tipuri şi subtipuri de interferon mai ales pentru
IFN alfa. Explicaţia acestei diversităţi ar putea fi legată de specificitatea diferitelor virusuri care au
agresat celula de-a lungul filogeniei.
Interferonii β prezintă analogie structurală şi imunologică cu interferonii α (o treime din molecula lor
este comună).
Interferonii  au proprietăţi citotoxice şi cea mai puternică activitate antitumorală.
Interferonii α şi β şi apropiaţi de limfokinele de tip interleukine.

21
 2.3. Biosinteza interferonilor. Inductorii interferonilor
Referitor la biosinteza IFN există două ipoteze.
■ celulele produc cu o rată constantă un prointerferon, iar inducţia ar consta în stimularea formării
unui sistem activator care converteşte prointerferonul în interferon activ.
■ interferonul este produs de novo. Informaţia genetică pentru sinteza lui se găseşte în patrimoniul
ereditar al celulelor, însă în mod normal sinteza lui este represată.
S-a dovedit experimental că semnalul pentru inducţia de interferon este ARN bicatenar şi dublu
spiralat, formă care apare în ciclurile de reproducere ale virusurilor animale. Acesta acţionează ca
un derepresor neutralizând represorul specific al sintezei de IFN. Factorul determinant al inducţiei
este structura însăşi a moleculei de ARNm şi nu informaţia genetică pe care acesta o conţine.
Inductorii pentru IFN pot fi:
■ virali (virusuri, acizi nucleici, poliribonucleotide sintetice)
■ non-virali (unele pirimidinone, unele antrachinione şi fluorinone).

22
Unii autori clasifică inductorii interferonului în:
■ universali, activi asupra majorităţii celulelor (leucocite, fibroblaşti, celule epiteliale) şi care
sunt:
• virusurile (în special virusul Sendai şi virusul Newcastle)
• unele bacterii
• acizii nucleici bicatenari
• unele poliribonucleotide
• polimeri anionici;
■ speciali, care acţionează numai asupra anumitor celule (celule NK – Natural Killer şi
limfocite) şi care sunt:
• celulele infectate de virusuri
• celulele tumorale
• antigenele
• mitogenele.

23
 2.4.Receptorii celulelor ţintă pentru interferon
Au fost identificate două tipuri de receptori pentru IFN:
■ tipul I, comun interferonilor α şi β, care este o glicoproteină cu M=100kD; sinteza sa este
sub dependenţa unor gene de pe cromozomul 21.
■ tipul II, care este specific pentru IFN γ; sinteza sa este dependentă de cromozomii 6 şi 21.

Legarea interferonului  de receptorul său specific fiind inhibată parţial prin IFN β, s-a postulat
existenţa şi a unui al treilea tip de receptor (β şi γ). Numărul receptorilor pe celulă variază în cazul
limfocitelor de la sute până la 50.000-100.000, cele mai multe celule posedând 1000-2000 de
receptori pentru IFN.
2.5.Mecanisme biochimice de acţiune ale interferonilor
S-au propus două mecanisme pentru explicarea modului de acţiune a interferonului la nivel
celular
■ stabilirea legăturii IFN - receptor este însoţită de un proces de internalizare prin
endocitoză, asociat cu o serie de reacţii celulare (sinteză de proteine antivirale şi inhibitoare ale
creşterii).
■ prin legarea interferonului de receptor se declanşează un semnal (mesager secund AMPc sau
GMPc) care acţionează asupra genomului celular şi antrenează astfel răspunsul celular.

24
 2.6. Activităţile biologice evidenţiate la interferoni
Efectele biologice complexe ale interferonilor, stau la baza principalelor acţiuni care au fost puse
în evidenţă pentru IFN: antivirală, imunomodulatoare, antiproliferativă şi antitumorală.
2.6.1. Acţiunea antivirală a interferonilor
IFN-ul sintetizat de o celulă infectată printr-un virus nu are acţiune asupra celulei care l-a produs,
ci asupra celulelor vecine încă neinfectate. Activitatea antivirală a celulei infectate este foarte
puternică, rapidă, nespecifică pentru un virus, dar este tranzitorie şi dependentă de doză.
2.6.2. Activitatea imunomodulatoare a interferonului
IFN exercită efecte importante şi complexe asupra unui număr de răspunsuri imunitare in vivo şi
in vitro, fiind implicate imunitatea umorală şi celulară.
2.6.2.1. Imunitatea umorală – acțiunea e dependentă de doză şi de momentul administrării IFN în
raport cu antigenul:
■ antigenul este introdus după IFN, producţia de anticorpi este inhibată,
■ antigenul este administrat înainte de IFN, răspunsul este variabil în funcţie de doză:
- o doză mică de IFN - creşterea sintezei de anticorpi;
- o doză mai mare de IFN - inhibarea sintezei acestora.
2.6.2.2. Imunitatea celulară -acţiunea IFN la nivelul celulei din sistemul imunitar este variabilă,
complexă şi diferenţiată pe tipuri de celule.
2.6.3. Acţiunea antiproliferativă şi antitumorală a interferonilor
Acţiunea antiproliferativă se exercită deopotrivă asupra celulelor tumorale cât şi asupra celulelor
normale; Acţiunea antiproliferativă este reversibilă la întreruperea tratamentului şi depinde de: doză,
tipul histologic al tumorii, tipul de interferon. Cea mai puternică activitate antiproliferativă aparţine
interferonului γ, între diferitele tipuri de IFN existând un sinergism de acţiune.
IFN acţionează în special aspra tumorilor cu creştere lentă. Celulele tumorale cele mai sensibile
la IFN sunt aceleaşi cu cele mai sensibile la alţi agenţi citotoxici.
25
 2.7. Recombinarea genetică în obţinerea interferonilor
Iniţial, tehnicile de obţinere pentru IFN s-au bazat, pe producerea lui în culturi celulare (de
leucocite, fibroblaşti şi limfocite transformate).

S-au conturat trei principale variante de obţinere pe scară industrială:

■ Obţinerea interferonilor cu ajutorul bacteriilor cu genom modificat (procedeul Biogene)
■ Obţinerea interferonilor cu ajutorul drojdiilor (procedeul Genentech Inc.)
■ Obţinerea interferonilor cu ajutorul viermilor de mătase (procedeu japonez).

26
 2.7.1. Obţinerea interferonilor alfa cu ajutorul bacteriilor modificate
Varianta de obţinere a interferonului alfa cu ajutorul bacteriilor modificate a fost aplicată în practică
încă din anul 1980 la firma internaţională Biogen.
În esenţă, procedeul se bazează pe construirea unui ADN recombinat din gena interferonului şi un
vector, plasmida pBR 322, care introdus în celula de E. coli suşa X1776, determină sinteza
interferonului.
Principalele etape ale procesului tehnologic sunt:
- izolarea unui ARN mesager specific pentru tipul de IFN de interes. Izolarea se face cu ajutorul
enzimelor de restricţie din celule de leucocite activate prin tratare cu virusul Sendai, ca inductor;
- biosinteza genei interferonului leucocitar prin ADN complementar obţinut pe cale enzimatică
folosind enzima virală reverstranscriptaza şi enzima ADN polimeraza;
- inserţia genei biosintetizate într-o plasmidă de E. coli, cu obţinerea unui ADN recombinat (sudarea
genei este realizată cu ajutorul unei ligaze specifice);
- reintroducerea plasmidei hibride în E. coli;
- multiplicarea E. coli în cultură + producerea de IFN;
-extracţia şi purificarea IFN cu ajutorul anticorpilor monoclonali.
Din punct de vedere structural, interferonul sintetizat de E. coli diferă de cel leucocitar fiind
neglicozilat, celula bacteriană neavând capacitatea de a realiza glicozilarea proteinelor.
Se obţine interferon alfa recombinat cu activitate identică omologului său endogen, de înaltă puritate,
cu o activitate specifică, asemănătoare celui produs de leucocite, dacă nu chiar identică, inducând în
celulele umane starea de rezistenţă la infecţia virală. Poate fi folosit pentru prepararea formelor
farmaceutice comercializate.
27
Fig.7. Obtinerea interferonilor in bacterii
28
 2.7.2. Obţinerea interferonilor cu ajutorul drojdiilor
Procedeul se bazează pe utilizarea plasmidelor de exprimare genică special construite pentru a putea
exprima, multiplica şi secreta interferonul produs de drojdii (Hitzeman şi colaboratorii, 1983).
Plasmidele construite sunt capabile să dirijeze sinteza interferonilor (IFN) umani, IFN α1, IFN α2,
IFN γ în drojdia Saccharomyces cerevisiae. Plasmidele construite pentru sinteza şi secreţia
interferonilor umani au derivat din plasmida denumită YEpIPT. Aceste plasmide trebuie să conţină
următoarele fragmente nucleotidice:
■ fragmentul promotorului fosfogliceratkinazei (PGK) care asigură transcrierea eficientă a
genei inserate (a interferonilor);
■ o parte din vectorul pBR 322, conţinând originea replicării (ori) şi genele de rezistenţă la
tetraciclină (Tcr) şi ampicilină (Apr), ceea ce asigură creşterea, menţinerea şi selecţia în bacteria E.
coli;
■ gena triptofanului (trp 1) din cromozomul 4 al drojdiei, care permite selecţia plasmidei din
mutanţi trp 1 cultivaţi în mediu fără triptofan;
■ originea replicării plasmidei din drojdie, care permite replicarea automată a plasmidei
YepIPT în celulele de drojdie cultivate în mediu lipsit de triptofan;
■ semnalul pentru terminarea transcrierii;
■ locul pentru inserţia genei interferonului, reprezentat de secvenţele de clivare specifice
enzimei de restricţie Eco RI.
Genele interferonilor α1, α2 şi γ, înainte de a fi inserate în vector, sunt astfel prelucrate încât să poată
asigura şi secreţia interferonilor sintetizaţi în mediul de cultură. Pentru transformare s-au folosit
tulpinile de drojdie 20B12 şi GM3C.
Celulele din extractele de drojdie au fost recoltate prin centrifugare. Pentru indepartarea a 90% din
peretele celular sunt resuspendate intr-un mediu: sorbitol, fosfact monopotasic, zimoliază și incubat 30
min. la 30°C, rezultând particule sferice, care sunt centrifugate și resuspendate în clorhidrat de
guanidină, diluate în tamppon fosfat salin, conținând albumină serică bovină. 29
 2.7.3. Obţinerea interferonilor cu ajutorul viermilor de mătase
Procedeul, pus la punct de Maeda în Japonia, se bazează pe utilizarea unui
ADN recombinat, construit din genomul virusului poliedrozei nucleare şi genele
interferonilor umani.
Cu acest ADN recombinat se realizează infectarea viermilor de mătase, care
produc apoi cantităţi mari de interferoni. Izolarea şi codificarea interferonilor se face
relativ simplu din hemolimfa viermilor de mătase, care în paralel continuă şi
secreţia de mătase.
Prin acest procedeu se produce IFN α, dar el poate fi utilizat şi la obţinerea
interferonilor de tip β şi γ.

30
 2.8. Statutul comercial al produselor farmaceutice cu interferon uman recombinat (rHuIFN)
2.8.1. Medicamente cu interferon α uman recombinat
■ Interferon α. Pe piaţa farmaceutică există o gamă variată de forme sistemice ale interferonului α:
versiunile recombinate ale unui subtip specific de interferon α, dar şi amestecuri purificate cu interferon α
natural de origine umană. Familia naturală a interferonului α constă din cel puţin 14 subtipuri diferite.
Clonarea recombinată a unei singure gene a interferonului α permite obţinerea unuia din subtipurile
specifice.
• Interferonul α-2a recombinat (Roferon A), care este un subtip de interferon α, constă dintr-o catenă
de proteină neglicozilată cu 165 de aminoacizi fiind produsă de E. coli prin inginerie genetică.
Molecula are un rest de lizină la poziţia 23 a catenei proteice. Procesul de purificare include
cromatografia de afinitate cu utilizarea anticorpilor monoclonali murinici specifici pentru interferon,
produsul final conţinând un singur subtip de interferon alfa (IFN α-2a).
• Interferonul α-2b recombinat (Intron A) este un interferon α format din 165 de aminoacizi. Este
produs de E. coli prin inginerie genetică şi este deci o proteină neglicozilată având un rest de arginină la
poziţia 23. Produsul final conţine un singur subtip de interferon α.
• Interferonul α-n3 (Alferon N) este un amestec cu un grad mare de purificare constituit dintr-un număr
de 14 subtipuri de interferon α uman natural. Este preparat prin izolare din leucocite umane care au
fost induse prin infecţie incompletă cu virusul Sendai al păsărilor; acest preparat conţine catene de
proteine cu aproximativ 166 aminoacizi. Procesul de preparare include purificarea prin intermediul
cromatografiei de imunoafinitate cu anticorpi monoclonali murinici, apoi acidularea la o valoare de
pH = 2, timp de 5 zile la 4°C şi în final cromatografie prin filtrare în gel.
• Interferonul α-n1 (Welferon) este un amestec de IFN α naturali obţinut din celulele limfoblastoide
umane după inducţia cu virusul Sendai. Interferonul α-n3 şi α-n1 conţin proteine glicozilate.
31
 Aspecte de farmacologie a interferonului α-recombinat. Interferonii α au activităţi
antivirale, antiproliferative şi imunomodulatoare. Deoarece interferonii-α sunt proteine, rezultă
că administrarea nu se face în nici un caz pe cale orală datorită distrugerii lor gastrice. Căile de
administrare vor fi în cazul interferonilor α: calea intramusculară, subcutanată, intralezională,
intraveziculară. Concentraţiile maxime plasmatice sunt atinse după 3 ore de la administrarea i.m.
şi după 7 ore după administrarea s.c. în cazul interferonului α-2a şi respectiv după 3 ore şi 12 ore
în cazul interferonului α-2b recombinat. Literatura de specialitate menţionează de asemenea că
interferonii α sunt filtraţi în totalitate prin glomerulii renali şi suferă un proces de degradare în
timpul reabsorbţiei în tubii renali.

32
 2.8.2. Medicamente cu interferon β uman recombinat
Interferon β-1b este o proteină obţinută prin inginerie genetică folosind E. coli. Gena nativă
este obţinută din fibroblaşti umani. Proteina este modificată faţă de IFN β natural, în sensul că restul
de cisteină din poziţia 17 este de înlocuit cu serină; nu este glicozilată.
Interferonul β posedă atât efecte antivirale cât şi efecte imunomodulatoare. Activităţile
interferonului β sunt specifice speciei.
Interferonul β recombinat are activitate în scleroza multiplă în plăci, maladie caracterizată
printr-o suită de remisiuni şi recăderi. Produsul Betaseron care conţine interferonul β-1b recombinat
a fost primul folosit în această maladie, iar recent s-a aprobat şi produsul Avonex care conţine
interferonul β-1a recombinat.
Reconstituirea produsului liofilizat în flacoane se face prin adăugarea de 1,2 ml de diluant
(soluţie de NaCl 0,54%) şi trebuie să fie folosit în decurs de 3 ore. Flacoanele, destinate unei singure
utilizări, nu trebuie să fie agitate, iar administrarea se face pe cale subcutanată.
Din 1966 a fost aprobată folosirea interferonului β-1a recombinat prin produsul Avonex în
tratamentul formelor recurente ale sclerozei multiple.

33
 2.8.3. Medicamente cu interferon γ recombinat
O versiune recombinată pentru IFN γ este interferonul γ-1b care reprezintă principiul activ pentru
produsul farmaceutic Actimmune. Este o polipeptidă cu o catenă unică cu 140 de aminoacizi. Este
produs de E. coli prin inginerie genetică, purificarea produsului obţinut făcându-se prin cromatografie
pe coloană.
Interferonul γ are activitați antivirale, antiproliferative și imunomodulatoare. Proprietațile antivirale
ale interferonului γ sunt mai reduse decât cele ale interferonului-α. Interferonul γ are un efect mult mai
puternic asupra celulelor fagocitice comparativ cu IFN α sau β.
IFN γ, în mod natural este produs de celulele T stimulate de antigen precum şi de celulele NK. Prin
cuplare cu receptorii de pe suprafaţa celulelor ţintă, IFN γ induce activarea macrofagelor şi
monocitelor, aflate în stare de repaus, intervenind în producerea intracelulară a metaboliţilor toxici
ai oxigenului din aceste celule, folosiţi ca arme de apărare contra agenţilor patogeni. IFN γ măreşte şi
funcţia fagocitară a granulocitelor, cum ar fi neutrofilele şi monocitele. După expunerea la IFN γ aceste
celule au capacitate sporită de a produce anionul superoxid care ajută la eliminarea patogenilor care au
fost fagocitaţi.
Interferonul γ are eficacitate în tratamentul granulomatozei cronice care este o tulburare moştenită,
caracterizată printr-o deficienţă a metabolismului oxidativ fagocitic. Actimmune, care conţine IFN γ-
1b, a redus semnificativ incidenţa infecţiilor grave precum şi perioadele de spitalizare. Deci este util
pentru a reduce frecvenţa şi gravitatea infecţiilor grave asociate cu maladia granulomatoasă cronică. S-ar
părea că acest produs este eficace pentru toate tipurile genetice ale acestei maladii.
Interferonul γ-1b poate fi formulat ca o soluţie sterilă, clară care conţine 100 mg (3 milioane de UI) de
interferon în 0,5 ml. Flacoanele cu produs sunt pentru o utilizare unică şi înainte de folosire nu trebuie să
fie lăsate la temperatura camerei mai mult de 12 ore.
Administrarea se face s.c. şi doza recomandată pentru pacienţii cu granulomatoză cronică este de 50
mg/m2 (1,5 mU/m2) de trei ori pe săptămână. 34
35
36
37