TEHNOLOGIILE

MICROARRAY
 DE LA CITOGENETICA CLASICĂ LA GENETICA MOLECULARĂ

Cariotipare aCGH
 Sonde fluorescente a digitală sau
(Cariotipare
Cromozomi bandaţi GTG
Specificitate de locus virtuală)
Detectează anomalii
Detectează aberaţii de Echivalent unui FISH de
grosiere
dimensiuni medii densitate foarte mare
Analiza se realizează în
Analiza se realizează în Analiza se realizează
microscopie optică
microscopie fluorescentă folosind un scaner cu laser
Oferă imaginea întregului
Oferă imaginea unor loci Oferă imaginea întregului
genom
specifici genom
Rezoluţie 3-5 Mb
Rezoluţie 60-100 kb Rezoluţie 40-200 pb
(Prin bunăvoinţa Agilent Technologies / Agilrom Scientific)
 TEHNOLOGIA MICROARRAY
Array – dispunerea ordonată a unor spoturi, sub
forma unei grile, pe un suport de sticlă (lamă).
Fiecare spot conţine repetiţii multiple şi identice
ale unor secvenţe ADN; pentru un spot dat, fiecare
secvenţă este complementară şi specifică unei
secvenţe unice din ADN genomic al speciei de
interes.
CUM FUNCŢIONEAZĂ UN MICROARRAY?
Fragment necomplementar de
ADN marcat fluorescent
Fragment complementar de ADN
marcat fluorescent

T
A
A
A T A A G
C G C C C
G C G G G
T A T T T
T A T T T
C G C C G
C G C C A
G C G G G
A T A A Secvenţa ADN =
sondă
(Prin bunăvoinţa Agilent Technologies / Agilrom Scientific) A T A A

Fiecare spot conţine un număr mare de secvenţe ADN identice

STRUCTURI-ȚINTĂ PENTRU MICROARRAY
 Acizi nucleici:
• ADN;
• ARN;

 Proteine, fragmente peptidice  protein microarray:

- identifică interacțiunile proteină-proteină, substraturile
protein-kinazelor, activatorii factorilor transcripționali, țintele
moleculelor active mici;
- grila constă din proteine, secvențe ADN
specifice sau anticorpi, care captureaza proteine
din lizatul celular.
 Alte componente celulare:
• lipide  lipid array: grila este constituită
din lipide, ce capturează proteine cu care
respectivele lipide interacționează;
• polizaharide: grila este reprezentată
de lectine sau anticorpi, ce permit
screeningul și identificarea glicanilor;

 Celule / fragmente de celule  cell

microarray: grila constă din proteine,
lipide sau anticorpi, care interacționează
cu celulele, capturându-le, sau chiar
declanșând răspunsuri specifice (secreție
etc)
 Țesuturi  tissue array:
fragmente mici (0,6 mm diametru) sunt
extrase din țesturi fixate și inserate într-un
bloc de parafină, într-o dispoziție tip grilă;
ulterior, din acest bloc sunt tăiate secțiuni,
la microtom, montate pe lama de
microscop și analizate prin metodele
standard de histologie (imunohistochimie,
FISH etc); un bloc poate fi tăiat în 100-500
secțiuni.
CE INVESTIGHEAZĂ TEHNOLOGIA MICROARRAY?
GENOM TRANSCRIPTOM PROTEOM

ARN ARNm
ADN
proteină

Intron

Exon

Polimorfism
miARN
Promotor

Alterări la nivel
cromozomial Splicing

(Prin bunăvoinţa Agilent Technologies / Agilrom Scientific)

 TIPURI DE MICROARRAY (Agilent)

aCGH-SNP CH3 ChIP GX EXON miARN Perspective

Număr de Factori de Izoforme ARN de

Metilare ARNm
copii / SNP transcripţie ARNm interferenţă

 Obţinerea de  Identifică şi  Elucidează   Explorează

Explorează  Investighează  Obţinerea de  Silenţierea
profile genomice monitorizează rolul pe care îl transcripția
transcripţia la
la transcriptomul şi profile genelor etc
ilustrând modificările joacă scara
scară genomică
genomică identifică formele microARN,
numărul de copii epigenetice, cu interacţiuniie de splicing explorând rolul
ADN şi roluri proteină-ADN alternativ, acestora în
modificările sale, fundamentale în în transcripţie, implicit, rolul lor reglarea expresiei
cu rezoluţie mare numeroase replicare, în procese genice
 Aplicaţii: boli procese celulare modificare şi fiziologice
genetice, cancer reparare normale şi
patologice,
răspunsul la
medicamente etc.

(Prin bunăvoinţa Agilent Technologies / Agilrom Scientific)

TEHNOLOGIA HIBRIDIZĂRII COMPARATIVE
GENOMICE BAZATE PE MICROARRAY
(array-based comparative genomic hybridization - aCGH)
 Definiţie:
Metodă care foloseşte tehnologia microarray pentru a identifica, prin
compararea ADN de interes cu un ADN de referinţă, schimbările cantitative
(duplicaţii, deleţii etc) din genom şi locul specific în care acestea s-au produs.

 În comparaţie cu metoda CGH (hibridizarea comparativă genomică), care

foloseşte pentru analiză cromozomi metafazici (ţinta), aCGH se bazează pe
utilizarea unor sonde ADN pentru hibridizarea cărora ADN de interes intră în
competiţie cu ADN de referinţă.
 Etapa 1
ADNg de interes
Etapa 2
ADNg de referinţă
aCGH: etape
Etapele 1-2: ADN genomic de interes şi de referinţă sunt fragmentate şi
marcate fluorescent.
Etapa 3: ADN genomic este amestecat, purificat din amestecul de
marcare şi pregătit pentru hibridizare.

Etapa 3 Etapa 4: ADN genomic de interes şi de referinţă sunt în competiţie

pentru a hibridiza cu sondele din grilă.
Etapa 5: Semnalele fluorescente emise sunt măsurate de către un
scaner.
Etapa 6: În urma analizei computerizate este generat un profil
genomic/cromozomial.

Etapa 5 Etapa 6

Etapa 4 HIBRIDIZARE

Alterarea dozei de ADN

Analiza
Profil genomic/
computerizată
cromozomial
Fără Pierdere de Câştig de (Genomic
modificări ADN ADN Workbench)

Theisen, A. Microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH). Nature Education 1(1), (2008) , prin bunăvoinţa
Agilent Technologies/Agilrom Scientific
 APLICAȚII ALE aCGH
 Diagnostic prenatal, preimplantator.

 Diagnostic în numeroase boli genetice: retard mental, cancer etc.

 Stratificarea pacienților
 Monitorizarea tratamentului în oncologie
 Predicția supraviețuirii
 Cuantificarea numărului de copii ADN (segmente).

 Identificarea disomiei uniparentale / pierderii de heterozigoție.

 Detecţia şi diagnoza (timpurie) a aberaţiilor genetice, inclusiv a

celor de tip microdeleţie/microamplificare.

 Cartografierea punctelor de rupere.

 Întelegerea mecanismelor patogenetice și de rezistență la

medicamente.

 Identificarea de noi biomarkeri.

 Identificarea de noi ținte terapeutice.

 AVANTAJELE aCGH
 Rezoluția mare, permițând detectarea anomaliilor mici, discrete;
 Simplitatea relativă a tehnicii;
 ADN este o moleculă stabilă;
 Pot fi folosite si probe biologice împarafinate;
 Cantitate mare de date;
 Flexibilitate mare – grilele pot fi construite dupa designul utilizatorului.

DEZAVANTAJELE aCGH
 Costul ridicat;
 Aparatul matematic implicat, complex;
 Dificultățile de interpretare a datelor.