P. 1
cromozomi

cromozomi

|Views: 267|Likes:
Published by Pancu Diana-mihaela
genetica
genetica

More info:

Published by: Pancu Diana-mihaela on Jul 20, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/28/2015

pdf

text

original

ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN

L. O. POPA, I. MOANŢĂ, F. RAICU, D. CIMPONERIU, G. BORDEIANU, P. APOSTOL, L. DAN, O. POPA Institutul de Genetica al Universitatii din Bucuresti Aleea Portocalilor Nr.1-3 Sector 6 Bucuresti

Introducere
Termenul “genom” a fost introdus in anul 1920 de catre botanistul german Hans Winkler, pentru a desemna setul haploid de cromozomi al unui organism eucariot. Termenul a fost extins pentru a se putea folosi si la organismele non-eucariote, genomul desemnand in acest caz cantitatea de material genetic ce defineste zestrea ereditara a unui organism. Genomul nu este insa doar o suma a partilor sale componente, datorita faptului ca diferite tipuri de interactiuni, functionale, evolutive, apar intre diferitele parti ale genomului, mai ales intre secventele sale codificatoare si cele necodificatoare. Genomul uman poate fi impartit in doua componente: genomul nuclear si genomul mitocondrial. Cele doua componente au putine lucruri in comun, atat in ceea ce priveste organizarea cat si in ceea ce priveste expresia genelor. In fapt, cele doua componente pot fi privite ca fiind doua sisteme genetice separate si independente. In cele ce urmeaza ne vom referi doar la componenta nucleara a genomului uman.

Dimensiune Dimensiunea totala a genomului nuclear uman este estimata, in urma ultimelor descoperiri realizate in cadrul Proiectului Genomului Uman, la aproximativ 3000Mb, dimensiune conforma, de altfel, cu estimarile anterioare. Genomul nuclear este impartit intrun numar de molecule ADN individuale, fiecare dintre acestea fiind continuta si formand un cromozom diferit. Aceste molecule de ADN sunt liniare. In majoritatea celulelor din organismul uman exista doua copii ale fiecarui cromozom, deci doua copii ale fiecarei gene. Acest ansamblu formeaza ceea ce este denumit complementul diploid; termenul haploid se refera la situatia intalnita de obicei in celulele germinale, unde nucleul contine o singura copie a fiecarui cromozom. Cromozomi Genomul uman este impartit in 23 cromozomi, fiecare continand deci o singura molecula de ADN liniara, dublu-catenara, cu dimensiunea cuprinsa intre 51Mb si 279Mb (vezi Tabelul 1).
285

L. O. POPA, I. MOANŢĂ, F. RAICU, D. CIMPONERIU, G. BORDEIANU, P. APOSTOL, L. DAN, O. POPA

Tabelul 1. Dimensiunile cromozomilor umani Cromozomul 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Dimensiune (Mb) 279 251 221 197 198 176 163 148 140 143 148 142 118 107 100 104 88 86 72 66 45 48 163 51

Daca genomul uman ar fi fost reprezentat de o singura molecula de ADN, lungimea totala a acesteia ar fi fost de aproximativ 1m. Cum cantitatea de ADN din celula umana este impartita intre 23 de cromozomi, lungimea medie a acestora ar trebui sa fie de aproximativ 5cm. Totusi lungimea cromozomilor umani este de ordinul micrometrilor. Trebuie sa existe deci un sistem inalt organizat de impachetare a unei molecule de o asemenea lungime intr-o structura atat de mica. La inceputul secolului, citologii au propus termenul cromatina pentru a desemna componenta cromozomului care se coloreaza mai puternic cu coloranti specifici pentru cromozom. Astazi, prin cromatina se intelege complexul format prin asocierea intre molecula de ADN continuta in cromozom si proteinele legate de aceasta, proteine responsabile de impachetarea ADN intr-o structura regulata in interiorul cromozomului.
286

H2A. denumite respectiv. fiind inalt conservate intre diferite specii. La microscopul electronic s-au observat aranjamente liniare de structuri sferice car au fost numite nucleosomi. In anul 1973 s-a demonstrat ca in urma digestiei cromatinei purificate cu o endonucleaza (enzima care taie molecula de ADN la nivelul legaturilor fosfodiesterice interne) si extractiei ADN-ului. Restul de proteine.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Cromozomii sunt formati aproximativ 50% din ADN si 50% din proteine. Acest experiment arata ca proteinele din cromatina sunt asociate cu ADN-ul intr-un mod regulat si ca aceste complexe proteice protejeaza molecula ADN de atacul endonucleazelor. Structura cromatinei 287 . incluzand ADN si ARN polimeraze si proteine reglatoare. Singura portiune din molecula de ADN accesibila endonucleazelor este reprezentata de ADN linker (50-70bp) care uneste nucleosomii intre ei. Histonele sunt proteine cu un pronuntat caracter bazic. Figura 1. H3 si H4. miez in jurul caruia se afla infasurata molecula de ADN. Din componenta proteica. este reprezentat de un grup de proteine numite histone. supusa unei noi metode preparative. fragmentele obtinute nu sunt de dimensiuni randomice. Acestia sunt formati dintr-un miez histonic (octamer) format din cate 2 molecule din histonele H2A. ci sunt multimeri de aproximativ 200bp lungime. asociate mai intim cu componenta ADN a cromozomilor. H3 si H4. o portiune este reprezentata de o mixtura heterogena de molecule. asa cum ar fi fost previzibil. H2B. Exact 146 nucleotide formeaza portiunea de ADN implicata in edificarea nucleosomului. H2B. H1. Aceste rezultate au fost completate anul urmator de prima observare in microscopie electronica a fibrei de cromatina. portiune protejata deci de atacul endonucleazelor. Taierea moleculei de ADN la nivelul acestui ADN linker va genera fragmente de 200bp.

Acest lucru se datoreaza faptului ca in urma unor coloratii specifice. Nucleosomii sunt aranjati intr-o structura numita solenoid. Aproximativ 85kb ADN sunt continute in fiecare bucla. POPA Impachetarea ADN in nucleosomi. In realitate este vorba aici de doi cromozomi uniti la nivelul unei structuri numite centromer. fibra de cromatina formeaza bucle superrasucite care emerg dintr-un miez proteic de natura nonhistonica. a sincroniei replicarii si modelului de bandare. Deci exista un alt nivel de organizare a cromatinei pentru a se putea ajunge la dimensiunea reala a cromozomilor. raportului bratelor. In celulele care se divid. DAN. Caracterizarea morfologica a cromozomilor mitotici a fost completata ulterior la Conferintele de la Londra (1963). RAICU. MOANŢĂ. mai densa decat simpla insiruire a nucleosomilor. Chicago (1971) si Paris (1972) consacrate cariotipului uman. cromatidele diferitilor cromozomi nu se coloreaza identic. ceea ce ar face ca dimensiunea cromozomilor sa fie de aproximativ 1. Cuprinde cromozomi mari. CIMPONERIU. fiecare din cei doi cromozomi uniti la nivelul centromerului se numeste cromatida. G. Grupa A (1-3). APOSTOL. P. Pe baza lungimii relative a cromozomilor. Aceasta conformatie reprezinta o reminiscenta a nucleoidului bacterian. Cromozomii umani au fost repartizati in 7 grupe morfologice la Conferinta de la Denver (Colorado) din anul 1960. Nucleosomii se asociaza pentru a forma fibra de cromatina cu diametrul de 30nm. POPA. O. aspectul acestora fiind un alt caracter utilizat in identificarea unui cromozom dat. O. prin formarea cromozomilor metafazici. Aceasta maniera de impachetare reduce dimensiunea cromozomilor de aproximativ 7 ori. iar cei din perechea 2 submedian. dintre care 1 si 3 au centromerul situat median. Pentru formarea acestei structuri. pentru a da nastere fibrei de cromatina. Aspectul tipic al unui cromozom metafazic este prezentat in figura 1. intervine un al treilea nivel de impachetare a fibrei de cromatina.4mm.75 m. fibra cu un diametru de aproximativ 30nm. 288 . I. Dimensiunea acestei structurii este de aproximativ 0. Cromozomii din perechea 1 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. observatii care au revelat o fibra de cromatina. D. In cromozomul metafazic. cei 46 de cromozomi au fost repartizati in urmatoarele grupe morfologice ale cariotipului uman: 1. F. indicelui centromeric.L. deci fiecarui cromozom metafazic. L. deci si uman. in acord cu dimensiunea cromozomului metafazic. Al doilea nivel de organizare a fibrei de cromatina a fost caracterizat intre anii 1977-1980 de catre Aaron Klug prin observatii de microscopie electronica. prezentei satelitilor si a constrictiilor secundare. Pozitia centromerului este caracteristica pentru un cromozom dat si este unul din criteriile utilizate pentru a distinge membrii cariotipului (intregul complement cromozomal din nucleu). sugerand ca acesta este cel mai inalt nivel structural de organizare prezentat de cromozomul eucariot. BORDEIANU. aparand un model de benzi pozitive si negative (pentru coloratia respectiva) caracteristic fiecarei cromatide. reduce lungimea moleculei de acid nucleic de aproximativ 6 ori.

Sunt cromozomi de marime mijlocie. Toti cromozomii grupei sunt de marime mijlocie. 7. Sunt cromozomi mici. Cuprinde cei mai mici cromozomi ai cariotipului uman. Acrocentrici si prezinta sateliti. Grupa B (4-5). 6. Cromozomul X este apropiat ca lungime de cei din perechea 6 si prezinta centromerul situat median. 8. lipsit de sateliti. 8 si 11 au centromerul situat median. Grupa C (6-12). Grupa F (19-20). Cromozomii din perechile 6. 7. Heitz a denumit sub termenul de heterocromatina partea de cromatina care ramane condensata in cursul interfazei. cu centromerul situat medain la cei din perechea 16 sau submedian la perechile 17 si 18.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN 2. Cariotipul uman realizat prin bandare G Cromatina se prezinta sub doua stari fizice: condensata si decondensata. In 1928. 5. Cromozomii din perechea 16 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. Cei din perechea 9 prezinta o constrictie secundara in regiunea proximala a bratului q. Grupa E (16-18). Cromozomi mari. iar 9. avand o lungime apropiata de cei din grupa G. Grupa G (21-22). iar cromozomul Y este de tip acrocentric. submetacentrici. diferentiindu-se astfel de eucromatina care devine 289 . metacentrici. Figura 2. 3. Grupa D (13-15). 10 si 12 submedian. acrocentrici si care prezinta sateliti. Sunt cromozomi relativ mici. 4.

POPA. ADN-ul extragenic reprezinta aproximativ 70-80% din intregul genom uman. P. situsuri de reglare) si care nu este recunoscuta ca provenind dintr-o gena (pseudogene. Secventele de tip LINE-1 (aproximativ 60000 copii) reprezinta un retroelement de tip non-viral. caracterizata printr-un continut inalt de ADN repetitiv. Termenul de heterocromatina facultativa trebuie utilizat numai pentru a desemna cromozomul X hetropicnotic. DAN. inclusiv in introni. In cazul genomului uman. ADN repetitiv dispersat Secvente SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Majoritatea ADN extragenic consta din secvente unice sau aflate in numar mic de repetitii. F. BORDEIANU. nu este asociata cu o gena (secvente leader. Cel mai cunoscut exemplu de SINE este reprezentat de familia Alu. Secvente LINE 290 . al femelelor la mamifere. Figura 3. POPA condensata. Tipuri de secvente Genomul uman poate fi impartit in ADN genic si ADN extragenic. Prin ADN extragenic intelegem orice secventa ADN care nu este continuta intr-o gena (sub forma de exoni sau introni). Ulterior s-a propus ca termenul de heterocromatina sa fie utilizat doar pentru desemnarea heterocromatinei constitutive sau cariotipice. CIMPONERIU. heterocromatina formeaza aproximativ 6.5% din totalul genomului. un transpozon care se poate replica si deplasa in genom printr-un proces care implica revers-transcrierea. este format din ADN moderat si inalt repetitiv. aproximativ 0. D. fragmente genice). fie dispersat in genom. permitandule sa se replice si sa se deplaseze in noi locuri in genom. L.L.7Mb. Restul. Secvente SINE Secvente LINE (Long Interspersed Nuclear Elements). Se pare ca aceste secvente poseda activitate de transpozoni. MOANŢĂ. inactivat. Si aceste secvente se pare ca s-au propagat prin transpozitii. G. trailer. APOSTOL. Membrii acestei familii prezinta o dimensiune de aproximativ 250bp. fie aglomerat in clustere. O. RAICU. O. promotor. Figura 4. Orice ADN care nu se incadreaza in aceste categorii este extragenic. aceste secvente fiind repetate de aproximativ 700000 in intregul genom. I.

formand un cluster genic. dar nu identice. dar in cazul microsatelitilor unitatile repetitive sunt rareori mai mari de 4bp. ADN microsatelit Dimensiunea clusterilor este aceeasi ca in cazul minisatelitilor. acest numar mare este probabil datorat necesitatii de cantitati mari de produs genic in acelasi moment de timp. reprezentata la om de aproximativ 2000 de copii. 2. 291 . Monorepetitii de tipul 5’AAAAAAAAAAAAAAAA-3’ formeaza inca 0. Clusterle de lanivelul centromerului formate din repetiiile Alphoid reprezinta exemplul clasic de ADN satelit. De exemplu. Secvente dinucleotidice. familia de gene pentru ARN ribozomal 5S. Genomul uman ilustreaza toate cele trei modalitati posibile in care familiile multigenice pot fi organizate: 1. Exista doua tipuri de familii multigenice: 1. 2. inclusiv la om. reprezentand aproximativ 0. Familii multigenice simple. de tipul 5’-CACACACACACACACACACA-3’. ADN minisatelit ADN minisatelit formeaza clustere de 100bp-20kb lungime. Genele cu secventa de nucleotide similara sunt numite gene omoloage. Exemplul cel mai bun este reprezentat de genele pentru globine la toate vertebratele. cantitate pe care o singura copie sau doar cateva copii ale genei respective nu ar fi putut sa o satisfaca. ADN satelit clasic Acesta a fost primul tip de ADN satelit identificat in genomul uman si consta in regiuni de 100-5000kb lungime. Familii multigenice complexe. Familii de gene . gene care prezinta secventa identica sau similara de nucleotide si deci care contin informatie identica sau inrudita. formate din gene similare.3% din totalul genomului. sunt foarte frecvente in genomul uman.5% din total. intr-un singur loc in genom. Acest tip de ADN este numit ADN satelit si este impartit in trei categorii.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN ADN repetitiv grupat in clusteri Genomul uman contine regiuni intinse formate din secvente repetate aranjate in tandem. ale carui 5 gene sunt localizate pe cromozomul 17 si familia de gene pentru ARN ribozomal 5S. Telomerele (10-15kb) sunt clasificate ca ADN minisatelit. in care toate genele sunt identice. in functie de dimensiunea clusterilor: 1. 3. In unele cazuri genele individuale sunt localizate impreuna. Exemple sunt familia de gene pentru hormonul de crestere.caracterizare O familie multigenica este un cluster de gene inrudite. care cuprinde 2000 de gene repetate in tandem pe bratul lung al cromozomului 1.

grupate in 5 clusteri de cate 50-70 unitati fiecare. catenele si . 3. Fiecare tip de polipeptid care intra in componenta hemoglobinei. 9. genele sunt raspandite in genom. D. Genele pentru globinele umane au fost printre primele studiate cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant. exista ca o familie de molecule inrudite. L. Astfel. si .L. Unele familii genice mari sunt atat raspandite in genom cat si organizate in clusteri genici. clusteri localizati pe bratele scurte ale cromozomilor 13. MOANŢĂ. BORDEIANU. O. gasite doar in stadiile embrionare. In cazul altor familii genice. CIMPONERIU. 10. Analize ulterioare au permis stabilirea cu precizie a pozitiei fiecarei gene in cadrul familiei. Sa analizam acum cateva astfel de familii genice pentru o mai buna intelegere a organizarii lor. exista aproximativ 280 de copii pentru unitatea transcriptionala a ARN ribozomal. si cinci molecule de tip . la om exista de fapt doua molecule de tip . APOSTOL. 21 si 22. respectiv . ca genele pentru globinele umane sunt organizate intr-o familie multigenica pentru globina pe cromozomul 16 si o familie multigenica pentru globina pe cromozomul 11. de exemplu. proteina raspunzatoare de transportul oxigenului in torentul sanguin. cu tipurile si . Tom Maniatis si colaboratorii sai au descoperit la sfarsitul anilor 1970. Tipul de globina din sange depinde de stadiul de dezvoltare a organismului. DAN. POPA. in acelasi timp. care difera una de cealalta prin cativa aminoacizi. patru catene polipeptidice. 292 . A . De exemplu cei 5 membri ai familiei genei aldolazei sunt localizati pe cromozomii 3. RAICU. G. . Familia de gene pentru globine umane La om. Astfel. P. I. G si . 2 si 2 sunt combinate cu un cofactor hem pentru a forma o singura molecula de hemoglobina. 15. POPA 2. 14. O. 16 si 17. F.

dar informatia codificata nu mai este activa. Izolarea. genele 1. Acest lucru a condus la concluzia ca boala este de natura autosomala. 293 . Gena HD. dominanta. de ambele sexe. autosomala.3 in anul 1983 si a fost clonata 10 ani mai tarziu. Deoarece polimorfismele la nivelul ADN sunt frecvente. cu transmitere dominanta. Maladia Huntington Maladia Huntington este o boala neurodegenerativa progresiva. gena pentru mucoviscidoza. Ca subiect pentru acest studiu au fost alese doua familii. In continuare s-a incercat localizarea genei raspunzatoare pe cromozomi. clusterii pentru globinele de tip si includ. a fost localizata pe cromozomul 4p16. 2 si 1. in afara genelor deja prezentate. contracteaza boala daca unul din parinti este afectat. una americana si una venezueleana. 1. caracterizata fenotipic prin miscari involuntare (chorea). Analiza incidentei bolii a aratat ca aproximativ jumatate din descendenti. Aceste “gene” sunt foarte asemanatoare celorlalti membri ai familiei. Familiile de gene pentru globinele umane Familiile genelor pentru globine ilustreaza un alt aspect al organizarii genelor: pseudogenele. Gusella si colaboratorii au adoptat o strategie sistematica de identificare a unui astfel de marker ADN asociat cu maladia Huntington. distonie. tulburari emotionale si scaderea capacitatii intelectuale. secventierea. care a suferit o mutatie la bolnavi. Astfel.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Figura 5. caracterizarea unor gene umane: gena pentru maladia Huntington.

utilizand HindIII ca enzima de restrictie. rezulta ca de asemenea ea este linkata cu cromozomul 4. in timp ce la indivizii afectati. Clona G8 era un bacteriofag recombinant continand o secventa unica de ADN uman de 17. limfocite colectate de la ambele familii au fost permanentizate in cultura. Mutatia responsabila de generarea maladiei consta in extinderea repetitiei unei trinucleotide. in interiorul exonului 1 al genei. cu 17 codoni in aval de codonul de initiere ATG. (CAG)n. Nu exista un tratament specific si in majoritatea cazurilor maladia este extrem de invalidanta.L. care survine la diferite varste. I. maladia antreneaza o patologie a secretiilor exocrine. s-a constatat ca celule hibride om-soarece continand cromozomul 4 uman hibridizau cu sonda G8. ci doua astfel de polimorfisme. numarul de repetitii este cuprins intre 40-121. C si D. in timp ce toti hibrizii lipsiti de cromozomul 4 nu hibridizau. CIMPONERIU.6kb. O. de multe ori peste 20 de ani. pentru a se constitui surse permanente de ADN pentru analiza. sau haplotipuri. Mucoviscidoza Mucoviscidoza este maladia recesiva autosomala cea mai frecventa in populatiile de origine europeana. si denumite situsul 1. denumita G8. POPA. F. D. DAN. avand o incidenta de 1:2500 nou-nascuti. Gena pentru maladia Huntington segrega intotdeauna cu halpotipul A. Pentru a se localiza pe cromozom gena bolii Huntington. ambele detectabile cu ajutorul sondei G8. Numarul de repetitii este invers proportional cu varsta la care apare boala. in cazul familiei din America si cu haplotipul C. O. Una din aceste sonde. care afecteaza mai ales epiteliul cailor respiratorii. MOANŢĂ. In al doilea rand s-a stabilit ca un model caracteristic de situsuri de restrictie era transmis ereditar impreuna cu maladia Aceasta analiza a fost destul de complexa deoarece s-a aratat ca asociat cu boala nu era un singur polimorfism al unui sit de restrictie. aceasta frecventa implica faptul ca 1:25 indivizi este heterozigot I populatie si ca frecventa genei mutate este de 2%. G. Subiectii masculi 294 . Pentru a stabili ca sonda G8 continea secvente din apropierea genei pentru maladia Huntington au fost necesare doua etape: 1. B. rezultate din aceste doua polimorfisme la nivelul situsurilor 1. POPA Pentru aceasta. Aplicand legea HardyWeinberg. 2. P. L. respectiv 2. In screeningul initial s-au folosit un numar de sonde pentru a analiza ADN-ul provenit de la familia americana. RAICU. Acestea au fost detectate prin metoda Southern. Cele patru combinatii de alele. respectiv 2. La indivizii normali. Mai intai s-a stabilit ca un numar de polimorfisme ale unor situsuri de restrictie poate fi detectat cu aceasta sonda. a aratat o puternica asociere cu gena maladiei Huntington. In forma sa cea mai obisnuita. BORDEIANU. care codifica pentru glutamina. APOSTOL. evoluand inexorabil spre o insuficienta respiratorie mortala. datorita dezvoltarii tratamentelor paliative. in cazul familiei din Venezuela. Cum gena pentru maladia Huntington este linkata cu secventa G8. au fost desemnate ca fiind haplotipurile A. numarul de repetitii al acestui codon este cuprins intre 6-35.

C. Rapid acesta din urma a fost incadrat de doi markeri mai apropiati. Acest fenomen implica pe de o parte ca gena este foarte aproape de domeniul de cateva zeci de kilobaze 295 . Haplotipuri asociate cu gena CF Haplotip A B C D Alela Xv-2c 1 1 2 2 KM-19 (sau CS7) 1 2 1 2 O asociere preferentiala intre haplotipul B si gena mutanta CF a fost descoperita pentru prima data in populatiile din Europa de Nord. pentru ca ulterior sa fie descoperite in populatiile de origine europeana din Statele Unite ale Americii si in Europa. situati respectiv la 0. pleda in favoarea unui locus unic implicat in maladie. 1987). descoperire facuta de Tsui in 1985. Totusi. Acest prim marker era situat la aproximativ 15cM de locusul CF. Aplicarea strategiei geneticii inverse la genele autosomale responsabile de o maladie recesiva se loveste de o dificultate intrinseca: imposibilitatea de a distinge heterozigotii. paroxonaza (locusul PON). CS7 si KM-19 la locusul anonim D7S23) care au permis detectarea unor RFLP in puternic dezechilibru de linkage cu gena CF mutanta (Estivil et al. descoperirea unei prime legaturi semnificative intre un marker proteic polimorf. proto-oncogena met si sonda anonima pJ3. 1987). desemnate respectiv A.3cM de locusul CF. sanatosi dar purtatori ai genei anormale. localizata pe bratul lung al cromozomului 7. deoarece absenta unui indice in favoarea unui cromozom a impus o abordare pur aleatoare a cartografiei de excluziune. Cautarea genei CF Gena se afla deocamdata circumscrisa intr-un teritoriu care nu depasea 1 milion de perechi de baze (Williamson. B. si D (vezi Tabelul 2) Tabelul 2. cu localizare cromozomala necunoscuta insa. Aceasta prima etapa a fost una laborioasa.11. In subclonele derivate din aceasta regiune s-au pus in evidenta sonde (sondele XV-2c. de homozigotii normali. Localizarea primara a genei CF pe cromozomul 7. Cu ajutorul acestor markeri s-au definit 4 haplotipuri. Acest locus a fost identificat gratie legaturii dintre boala si un situs polimorf explorat cu sonda anonima DOCRI 917. Au durat aproximativ 4 ani pentru a exclude in jur de 50% din genom. O problema foarte dezbatuta la inceput s-a referit la heterogenitatea genetica posibila a maladiei. Cautarea genei CF (Cystic Fibrosis) a fost demarata inca de la inceputurile strategiei geneticii inverse (1980).ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN ajunsi la maturitate sunt sterili datorita unei azoospermii generat de impermeabilitatea canalelor deferente. data fiind heterogenitatea clinica a acesteia.4 cM si 0.

Patologia genei CFTR este dominata de un factor major in populatiile caucaziene: existenta unei alele comune. Collins (Ann Arbor). Proiectul Genom Uman (HGP. APOSTOL.F508 sunt actualmente repertoriate. DAN. POPA. restul de 30% fiind constituite de o constelatie de alele rare si variate. D. mutatia F508. Una din aceste secvente. CIMPONERIU. L. Acesta a fost argumentul decisiv pentru a se accepta ca gena pentru mucoviscidoza a fost desoperita. a permis izolarea unei clone corespunzatoare inceputului genei. si anume pe haplotipul B care insoteste alela mutanta in peste 80% din cazuri Descoperirea genei Gena CF a fost in cele din urma identificata in anul 1989 de catre echipele lui L. pe un haplotip comun. proiect 296 . O. apartinand superfamiliei transportorilor activi ATP-dependenti. POPA explorate de markerii respectivi. ca mutatia a avut loc o singura data. RAICU. intr-o banca de cADN din celule de glande sudoripare. I. P. corespunzatoare unei insule HTF. in particular al ionilor de Cl-. Validarea acestei gene s-a facut prin descoperirea unei deletii de 3 nucleotide care antrena pierderea unui codon Phe in pozitia 508 (mutatia numita F508). ea a fost denumita CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator. National Institutes of Helth) si Departamentului Energiei al USA. Datorita rolului presupus indirect al acestei proteine in transferul ionilor. mai mult de 230 de mutatii non. In anul 1990. C. MOANŢĂ. ceea ce explica dificultatile intalnite in identificarea ei. Aceasta prima secventa ( de doar 113 bp) a permis reconstituirea intregului puzzle de cADN. iar pe de alta parte. reprezentand 70% dintre mutatii. F. sub conducerea Institutului National de Sanatate (NIH. structura care este aceea a unei proteine transmembranare. deoarece aceasta reprezinta cea mai mare gena din genomul uman. Human Genome Project) a fost in mod oficial initiat in USA. G. O. cauzele bolilor si relatia dintre mediu si organismul uman. Acest succes a fost obtinut printr-o strategie de deplasare si salt pe un teritoriu de mai multe sute de kilobaze in aval de situsul KM-19.L. Gena este formata din 27 de exoni repartizati pe un teritoriu de 250Kb. in cautarea unor secvente in acelasi timp conservate si exprimate. S. regasita in 70% dintre cromozomii 7 purtatori ai anomaliei CF si in nici un caz la cromozomii nepurtatori. Un alt argument a fost furnizat de modelarea structurii proteinei putative codificate de aceasta gena. Tsui (Toronto) si F. Astfel. BORDEIANU. Un proiect cu scopul de determina secventa completa de nucleotide a genomului uman a fost pentru prima oara adus in discutie in 1985. Descifrarea genomului uman: Proiectul Genom Uman Decifrarea secventei ADN care codifica genomul uman a fost anticipata de sperantele pe care un astfel de proiect le genera in ceea ce priveste intelegerea evolutiei speciei umane.

tehnicile de baza de secventiere a ADN dezvolate in urma cu 20 de ani sunt inca in uz. Detectarea acestor polimorfisme SNP (Single Nucleotide Polymorphism) poate fi un insrtument important de caracterizarea genelor pentru maladii umane. Influenta factorilor de mediu. Pentru a capta atentia publicului si a oferi o alternativa in acest domeniu.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN care urma sa se intinda pe durata a 15 ani. Secventele obtinute prin selectia randomica a clonelor ADNc furnizeaza o imagine statistica a nivelului si complexitatii expresiei genice in tesutul de provenienta. Secventele genice obtinute pot fi utilizate eficient pentru cartare fizica prin determinarea pozitiei lor pe cromozomi. 1996). iar posibilitatea de a identifica rapid toate genele umane a condus la dezvoltarea unor baze de date comerciale care contineau secventele EST. Merck Inc. fiind revers-transcris din ARNm. Seventele EST pot fi de asemenea utilizate pentru a evidentia variatii la nivelul unei singure baze in cadrul genelor. Cele mai importante tehnici de secventiere a ADN sunt metoda enzimatica de blocare a lantului 297 . reprezinta o sursa directa de secvente codificatoare ale genelor. EST (Expressed Sequence Tags) Genomul organismelor superioare este reprezentat doar intr-o mica masura de ADN codificator de proteine (1-3% in genomul uman). Din acest motiv.. precum si expresia genica specifica tesutului respectiv pot fi astfel studiate (Okubo et al. pentru descifrarea completa a genomului uman. (Lennon et al. In anul 1991 a fost descrisa prima aplicatie a acestei metode de secventiere a ADNc. Aceste secvente partiale reprezentau gene exprimate in tesutul nervos la un anumit moment de timp si ele au fost denumite EST-uri.A. ceea ce va permite prezicerea regiunilor transcrise ale genomului. Tehnologii de secventiere a ADN In ciuda resurselor implicate in eforturile de secventiere a genomului.E. Abordari similare pentru alte tesuturi. a initiat in anul 1994 sponzorizarea efortului public de secventiere a EST-urilor la Univeritatea Washington. dar sunt de asemenea importante si din alte puncte de vedere.M. ADN-ul complementar (ADNc). prin utilizarea de clone ADNc provenite de la consortiul I. cu un buget de 3 miliarde USD. EST-urile reprezinta cea mai semnificativa forma de informatie per baza secventiata. iar secventierea EST-urilor provenite de la diferite organisme va permite efectuarea de studii evolutioniste si clonarea unor gene interesante trecand peste barierele taxonomice. clone din creier uman fiind alese randomic si secventiate.G. clonarea pozitionala a genelor pentru diferite maladii va fi mult facilitata de combinarea intre secventierea EST-urilor si cartarea fizica de mare densitate. Mai mult. Secventele EST sunt extrem de utile pentru identificarea de noi gene.. In sfarsit. secventierea ADNc a devenit o tehnica larg acceptata care completeaza intr-o masura importanta eforturile de secventiere ale genomului. Aceste fapte confirma necesitatea secventierii ADNc ca o completare a secventierii genomului. 1992). Totusi. secventele EST contribuie la intelegerea granitelor exoni-introni. ca si pentru alte organisme au urmat rapid.

Cosmidele pot contine inserturi de aproximativ 40kb si au fost frecvent utilizate ca legatura intre YAC-uri si vectori de secventiere. Pe de alta parte. Consta in ordonarea clonelor continand inserturi mari de-a lungul cromozomilor. 298 . Dezavantajul YAC-urilor este rata mare de himerism si rearanjari pe care le sufera. 1977) si metoda de degradare chimica (Maxam si Gilbert. cosmide). P. manipularea facila si stabilitatea au facut din acesti vectori instrumente mult mai potrivite pentru cartarea fizica decat Cosmidele. 1994). si a fost denumit PAC (P1derived Artificial Chromosome) (Ioannou et al. fiecare dintre acestia putand contine inserturi de diferite dimensiuni. Cosmidele sunt vectori plasmidiali care contin situsul cos de la fagul . Scopul ultim il constituie generarea unei harti fizice care sa acopere intregul genom. Un al doilea sistem a fost dezvoltat prin modificarea unui vector bazat pe bacteriofagul P1. F. acest vector poate contine inserturi de 15300kb. O. 1977). Acest sistem are proprietati similare cu BAC.coli. uzual 100-200kb. In ultimii ani atat BAC cat si PAC au fost larg utilizati in secventierea genomurilor mari.. Astfel. metoda Sanger genereaza siruri de date mai usor de interpretat. ceea ce permite impachetarea in vitro de particule fagice. si au fost utilizate pentru a produce contiguri (contig= set de clone care se suprapun) care acopereau majoritatea genomului uman (Cohen et al. D. Cartarea fizica. a fost construit un cromozom artificial bacterian numit BAC (Bacterial Artificial Chromosome).).coli.. APOSTOL.L. pentru a fi supus secventierii orice genom trebuie sa fie subclonat in fragmente suficient de mici pentru a putea fi utilizate tehnicile de secventiere.. Clonele ordonate vor constitui baza pentru subclonarea ulterioara in vectori corespunzatori. O data cu dezvoltarea HGP a devenit tot mai imperioasa nevoia existentei unor vectori care sa mentina in stare stabila fragmente de ADN cu dimensiuni cuprinse intre cele continute de YAC-uri si cele continute de cosmide. ceea ce reduce riscul de recombinare. 1993).coli. ceea ce a facut ca aceasta tehnica sa devina cea mai larg utilizata. POPA sintetizat (Sanger et al. I. MOANŢĂ. YAC-urile pot contine regiuni dificil de clonat in constructe mici (de ex. Astfel. care sa contina inserturi de dimensiuni accesibile tehnicilor de secventiere. YAC-urile (Yeast Artificial Chromosome) tolereaza inserturi cu dimensiunea intre 250kb-1Mb. In comparatie cu metoda Maxam-Gilbert. in mod obisnuit una sau doua copii. Eficienta mare in clonare prin electroporare. DAN. POPA. G. ceea ce face ca BAC-urile sa fie mentinute intr-un numar mic per celula. ADN-ul clonat poate fi cu usurinta introdus in celule de E. Replicarea vectorilor ce contin factorul F se afla sub strict control in E. in anul 1992 (Shizuya et al. Un numar de vectori diferiti este disponibil pentru construirea hartilor fizice. RAICU. pentru a sigura acuratete procesului de secventiere. L. iar secventierea trebuie sa se realizeze pe ambele catene la nivelul intregului genom. BORDEIANU. Secventierea genomului In ciuda diferentei semnificative de talie intre diferitele genomuri. Prin utilizarea factorului F de la E. CIMPONERIU. O.

secventa obtinuta in urma unei reactii este utilizata pentru a construi urmatorul primer. uzual denumita secventiere “shotgun”. sinteza care este scumpa si lenta. comparativ cu metoda “shotgun”. de aproximativ 100-1000bp. denumite STS (Sequence Tagged Site) (Olson et al. randomica si directa. sau “nebulizare”. Cele doua metode difera in ceea ce priveste procedura de clonare. Secventierea randomica este realizata pana cand se acopera 75-95% din fragmentul initial. 299 . cu dimensiunea inserturilor de 1-2kb. 1989). si pot fi utilizate deci pentru a ordona YAC-urile sau BAC-urile prin metode de screening PCR. dimensiunea inserturilor si strategia de secventiere. In cazul metodei randomice. Metode directe de secventiere. o plimbare de-a lungul secventei se poate realiza pe ambele catene. O imbunatatire in acest sens s-a produs odata cu utilizarea PCR pentru a amplifica regiuni genomice unice. Fractionarea inserturilor mari initiale in subclone se poate obtine prin cateva tehnici: digestia cu enzime de restrictie. ceea ce permite standardizarea metodei. tratamentul cu Dnaza I. Secventele sunt apoi combinate pentru a genera contiguri de pe ambele catene. ruperea ADN prin sonicare. Cea mai comuna metoda de secventiere directa este cea denumita “primer walking”. Caracteristica tehnicii “shotgun” este numarul mare de clone care trebuiesc procesate pentru a se acoperi regiunea de interes. Un mare numar din aceste clone sunt apoi izolate randomic si secventiate utilizand primeri specifici pentru vectorul utilizat. deoarece pozitia exacta a fiecarei reactii este cunoscuta. Asamblarea datelor este mai simpla decat in cazul metodelor “shotgun”. toate aceste reactii de secventiere se pot realiza cu aceeasi primeri.. presiune scazuta. Umplerea golurilor ramase in urma acestei metode se realizeaza prin metode directe. generand astfel secvente raspandite randomic in fragmentul original (insert dintr-un cosmid sau BAC). HPLC. dupa care se aplica strategii directe de secventiere pentru a umple golurile ramase. Numarul de reactii de secventiere este deci mai mare decat in cazul tehnicii directe. Dezavantajul metodei consta in continua nevoie de construire de primeri. apar o singura data in genom. In acest caz. Secventierea randomica Exista doua strategii majore de sceventiere a fragmentelor mari de ADN. Se refera la tehnici in care reactia de secventiere este realizata la pozitii cunoscute in molecula de analizat. Secventierea “shotgun” necesita utilizarea unor algoritmi computerizati de calitate pentru a asambla datele in contiguri.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Pentru a crea harti fizice de mare rezolutie trebuiesc aplicate diferite tehnici de ordonare a clonelor. Aceste secvente. pe de lata parte insa. este generata o librarie de subclone plasmidiale sau M13. Astfel. Strategia conduce la o minima redundanta si un numar semnificativ mai mic de reactii de secventiere.

RAICU. gene sau dimensiune a genomului nu poate fi raspunzatoare de diferentele de complexitate constatate intre diferite organisme.L. In urma secventierii si asamblarii a aproximativ 95% din portiunea eucromatinica a genomului uman s-a estimat existenta a 26000-38000 gene. Desi s-au identificat peste 3 milioane de SNP-uri. L. tesuturi. Numarul mic de gene umane. etc. in principal din domeniul medical. Totusi pot fi deja citate cateva aplicatii directe. DAN. Gene implicate in fenomene patologice O aplicatie importanta a cercetarilor in domeniul genomului uman este descoperirea de gene cu functie biochimica necunoscuta prin cartare pozitionala. sunt multe cazuri in care secventa genica joaca un rol de suport. Aplicatii ale rezultatelor HGP In cele mai recente lucrari. Complexitatea genomului Simpla examinare a numarului de neuroni. In aditie. POPA. Variatia secventei ADN uman si distributia acesteia de-a lungul genomului. F. POPA Rezultatele HGP Incheierea HGP a condus la o serie de concluzii care acopera diferite aspecte ale genomului uman. CIMPONERIU. furnizand candidati pentru markeri microsatelitici asociati cu diferite maladii. I. P. D. s-a evidentiat o puternica heterogenitate in distributia acestor polimorfisme in genom. APOSTOL. Acestea reprezinta doar o parte din numarul de SNP prezente in intregul populatiei umane. nu in numarul mare de gene. Cel putin 30 de gene implicate in procese patologice au fost pozitionate in acest fel (Tabelul 3). MOANŢĂ. complexitatea este datorata mai degraba a interactiei dintre toti acesti factori. tipuri genice. BORDEIANU. 300 . Numarul mic de gene umane inseamna ca mecanismele care genereaza complexitatea inerenta in dezvoltarea umana si semnalele complicate implicate in mentinerea homeostaziei trebuiesc cautate in alta parte. mult mai putine decat in estimarile anterioare (50000-140000). O. G. O. aceasta nu inseamna ca sarcina identificarii de alte polimorfisme SNP este incheiata. autorii pot doar specula asupra viitoarelor aplicatii ale acestui proiect. Totusi.

Gene implicate in procese patologice Locus Maladie BRCA2 Breast cancer susceptibility AIRE Autoimmune polyglandular syndrome type 1 (APS1 or APECED) PEX1 Peroxisome biogenesis disorder PDS Pendred syndrome XLP X-linked lymphoproliferative disease DFNA5 Nonsyndromic deafness ATP2A2 Darier’s disease SEDL X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda WISP3 Progressive pseudorheumatoid dysplasia CCM1 Cerebral cavernous malformations COL11A2/DFNA13 Nonsyndromic deafness LGMD 2G Limb-girdle muscular dystrophy EVC Ellis-Van Creveld syndrome ACTN4 Familial focal segmental glomerulosclerosis SCN1A Generalized epilepsy with febrile seizures plus type 2 AASS Familial hyperlysinaemia NDRG1 Hereditary motor and sensory neuropathy –Lom CNGB3 Total colour-blindness MUL Mulibrey nanism USH1C Usher type 1C MYH9 May_Hegglin anomaly PRKAR1A Carney’s complex SCA10 Spinocerebellar ataxia type 10 OPA1 Optic atrophy XLCSNB X-linked congenital stationary night blindness FGF23 Hypophosphataemic rickets GAN Giant axonal neuropathy AAAS Triple-A syndrome HSPG2 Schwartz-Jampel syndrome 301 .ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Tabelul 3.

O. F. exista aplicatii similare in domeniul fiziologiei sau al biologiei celulare. Perspective Desi s-a realizat un progres semnificativ in secventierea genomului uman. POPA. O mare parte din aceasta plasticitate rezulta din controlul fin la nivel transcriptional. Aceste studii au condus rapid la descoperirea unei noi familii de astfel de proteine. O lista recenta inventariaza 483 tinte pentru virtual toate medicamentele existente pe piata.L. Biologie fundamentala Desi exemplele discutate pana acum se refera doar la domeniul medical. G. in toate tesuturile. Se estimeaza ca pana in anul 2003 toti cromozomii vor fi complet secventiati. P. DAN. Finalizarea secventei genomului uman Secventa genomului uman va servi ca baza pentru cercetarea biomedicala in anii urmatori si. iar apoi au cautat regiuni relevante in secventa genomica uman pentru receptori cuplati cu proteina G. Astfel. MOANŢĂ. secventierea genomului uman a permis elucidarea unei probleme care ramanea nerezolvata de cateva decenii: baza moleculara a gustului amar. Desi doar o minoritate dintre genele umane pot fi tinte pentru medicamente. de aceea. Analiza comparativa a genomului de la multiple vertebrate ofera cea mai buna speranta de identificare pe scara larga de astfel de motive. Recent cercetatorii au cartat aceasta trasatura atat in genomul uman cat si in cel murin. POPA Tinte pentru medicamente In ultimul secol industria farmaceutica a depins de numarul limitat de tinte cunoscute pentru medicamente. I. Identificarea de regiuni reglatoare Genomul uman. APOSTOL. si determinarea consecintelor biologice ale metilarii. cum ar fi metilarea resturilor citozina la scara intregului genom. Oamenii si alte animale prezinta polimorfism in ceea ce priveste perceperea gustului amar. contine suficienta informatie pentru diferentierea a sute de celule diferite si pentru a raspunde la o gama vasta de stimuli interni si externi. precum si a proteinelor codificate de acestea permite extinderea efortului de identificare de noi tinte. O. se estimeaza ca numarul acestora va depasi cateva mii si aceasta prezumtie a condus la o extindere masiva a cercetarii genomice in asociatie cu cercetari farmacologice. L. Cunoasterea completa a secventei genelor. un proiect pilot al epigenomului uman a fost lansat. RAICU. la demonstrarea ca acestea sunt exprimate aproape exclusiv in papilele gustative si la confirmarea experimentala a faptului ca receptorii din celulele in cultura raspund la substante specifice amare. Desi s-au invatat multe de spre motivele reglatoare cis ale diferitelor gene. De asemenea. CIMPONERIU. va fi interesant de studiat modificarile epigenetice. in incercarea de a dezvolta noi produse. 302 . semnalele genice ale majoritatii genelor raman in ca necunoscute. este crucial ca golurile ramase sa fie umplute iar ambiguitatile sa fie eliminate cat mai repede. D. regasit in toate celulele. In acest scop. BORDEIANU. raman inca pasi care trebuiesc parcursi pentru a produce o secventa completa.

localizarii proteinelor. modalitatii chimice de inhibare a diferite cai metabolice. In completare. Nu este vorba doar de aspectele medicale implicate. De la secventa la functie HGP s-a concentrat pe identificare secventei genomului uman ca sursa de informatie biologica. a directiei in care mergem. Pentru aceasta insa mai sunt de strabatut pasi. Completarea catalogului variabilitatii umane Secventierea genomului uman realizata pana in prezent a permis identificarea a peste 1. Rezultatele obtinute vor permite o intelegere mai adanca a ceea ce suntem. intr-o maniera sistematica. caci se poate spune ca pe masura ce invatam mai multe despre genomul uman.4 milioane SNP-uri. interactiei proteina-proteina. care sunt raspunzatoare intr-o proportie semnificativa de variabilitatea umana. Acest program trebuie extins pentru a se identifica virtual toate variantele genomice si pentru a se identifica haplotipurile ancestrale prezente in populatii. 303 . etice. determinarea secventei genomului a cat mai multe organisme este un deziderat important. Acest deziderat implica perfectionarea tehnicilor si bazelor de date pentru analiza globala a: expresiei ARN si a proteinelor. secventa genomului va furniza instrumente pentru o abordare functionala. ci si de cele filosofice.ORGANIZAREA GENOMULUI UMAN Secventierea altor genomuri mari Pentru realizarea cat mai completa si eficienta a analizei comparative in ceea ce priveste genomul. Concluzii Proiectul Genom Uman va avea consecinte profunde pe termen lung asupra societatii umane. se ivesc mai multe aspecte de explorat.

Current Opinion in Genetics & Development 1995. ***. Brookes AJ. 76: 1-31 16. Collins FS. Gardiner K. Citogenetica moleculara si evolutionista. Bucuresti. Walters LR. Reddy PH. 5: 656-662 10. APOSTOL. oxford University Press. Journal of Biotechnilogy 2000. 409: 860-921 11. 5: 315-322 8. Chakravarti A. and the members of the DOE and NIH planning groups. Genetics a molecular aproach. Current Opinion in Neurobiology 1995. I. MOANŢĂ. CIMPONERIU. The sequence of the Human Genome. Science 2001. Inc. 282: 744-746 2. Rogoz I. Trends in Biotechnology 1999. Chapman & Hall. BORDEIANU. Recent advances in understanding the pathogenesis of Huntington’s disease. POPA. Tagle DA. Current Opinion in Biotechnology 1997.S. 29: 445-476 4. Genes V. ***. Human genome organization. Williams M. A Physical Map of 30. 8: 684-687 304 . Zubay G. Biologie moleculaire et medecine. Kirschbaum BJ. Annu. 282: 682-689 7. 1989 9. Zweiger G. Delpech M.Nature 2001. Rev. RAICU. Brown TA. 1994 12. Gusella JF. Gene 1999. 22. L.. Genetics. The Benjamin / Cummings Company. F. 248-255 15. Lungeanu A. P. The Human Genome: Organization and Evolutionary History. D. Kaplan J-C. MacDonald ME. Scott RW. 17: 73-77 13. Sterky F. O. Patrinos A.000 Human Genes. Huntington’s disease: CAG genetics expands neurobiology. New Goals for the U. Gesteland R. The essence of SNPs. Initial sequencing and analysis of the human genome. Kozian DH. Comparative gene-expression analysis. 291: 1304-1351 3. 1994 14. Human Genome Project: 1998–2003. Science 1998. DAN. POPA Bibliografie 1. Gavrila L. Sequence analysis of genes and genomes. Bernardi G. Lewin B. 234: 177-186 5. 1992 6. Flammarion Medecine – Science. Jordan E. 1999. From expressed sequence tags to ‘epigenomics’: an understanding of disease processes. O. 1995. Science 1998. G.1987 17. Trends Neurosci. Editura Stiintifica si Enciclopedica. International Human Genome Sequencing Consortium. Genetics.L. Lundeberg J.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->