Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

FENOMENE DE TRANSPORT PRIN MEMBRANA CELULARA Structura i funciile membranei celulare Organismele vii sunt alctuite dintr-un numr foarte mare de compartimente fluide interdependente, mrginite de membrane plasmatice. Membranele celulare sunt structuri planare cu grosimi moleculare cuprinse ntre 6 i 10 nm (1 nm = 10-9 m) care ndeplinesc cel puin dou funcii dinamice eseniale, ele neputnd fi privite ca nite pelicule pasive care delimiteaz dou medii care au caracteristici fizico-chimice diferite (lichidul interstiial i citoplasma). Prima funcie a membranei celulare este de a mpiedica micarea liber a particulelor ntre dou compartimente adiacente (lichidul interstiial i citoplasma), prin urmare membrana are rolul unei bariere fizice active. Lichidul interstiial i citoplasma sunt sisteme disperse avnd ca solvent apa, iar ca faze dispersate electrolii (ioni de Na, K, Cl, Ca, Mg), macromolecule (de ex. proteinele), organite intracelulare (de ex. mitocondriile) i molecule polare mici, n concentraii diferite. Lichidul interstiial i citoplasma au aceeai osmolaritate de aproximativ 300 mOsM/l, fiind deci, lichide izotonice. Fiind semipermeabile i selective, membranele celulare ndeplinesc i o a doua funcie foarte important i anume reglarea volumului i a compoziiei mediului intracelular. Aceast reglare asigur meninerea la valori constante a compoziiei i volumului intra- i extracelular, n ciuda fluctuaiilor din mediul extern. Structura membranei celulare a fost studiat prin microscopie electronic, difracie de raze X i recent, vizualizat cu ajutorul microscopiei de for atomic.

Fig. 1 Structura membranei celulare conform modelului mozaicului fluid proteolipidic Principalii constitueni ai membranelor biologice sunt lipidele i proteinele, conform modelului mozaicului fluid proteolipidic (Fig. 1) al lui Nicholson i Singer elaborat n 1972: membrana este format dintr-un bistrat lipidic, n care sunt inserate proteine i glicoproteine. Acest model presupune distribuia uniform a diferitelor tipuri de lipide n bistrat, lucru care a fost infirmat n ultimii ani. Simon si Ikonen au demonstrat n 1987 existena asa numitelor microdomenii lipidice (lipid rafts) de colesterol i sfingomielina care nu sunt solubile n detergeni nonionici, adic prezena unor insule membranare, lipidele nedistribuindu-se uniform pentru a forma bistratul lipidic. Lipidele Sunt molecule insolubile n ap i uor solubile n solveni organici, constituind aproximativ 50% din masa membranelor celulelor animale, avnd o densitate de aproximativ 5106 lipide / 1 m2 arie de membran. Lipidele formeaz matricea pentru fixarea proteinelor, dar ndeplinesc i alte funcii.

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Lipidele sunt fie amfifile, adic prezint capt polar (extremitate polar care interacioneaz puternic cu apa) i una sau mai multe catene alifatice puternic hidrofobe (formate din dou lanuri de hidrocarburi numite i cozi hidrofobe) (Fig. 2).

Fig. 2 Moleculele lipidice sunt amfifile Aceast conformaie influeneaz mpachetarea i micarea respectivei molecule lipidice n planul lateral al membranei. Capetele polare ale moleculelor amfifile au radicali fosfat i sunt fie ionice fie neutre, acestea din urm au o distribuie asimetric a sarcinii electrice determinnd orientarea n cmpul electric sau magnetic. Cele mai importante clase de lipide ntlnite n constituirea bistratul lipidic sunt: fosfolipidele, glicolipidele i colesterolul. Fosfolipidele sunt derivai ai glicerolului (acool simplu) sau ai sfingosinei (alcool complex) (Fig. 3). Exist fosfolipide care conin colin: fosfatidilcolina, sfingomielina sau care nu conin colin: fosfaditiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol etc. Una dintre cele dou cozi hidrofobe ale fosfolipidelor se prezint sub forma unui lan drept de acizi grai saturai, iar cealalt prezint o mic bucl datorit unei legturi duble cis nesaturate. Fosfolipidele sunt asimetric distribuite n bistrat, astfel, pe partea interstiial a membranei se afla fosfaditilcolina i sfingomielina, iar pe partea citoplasmatic a membranei se afla fosfaditiletanolamina i fosfaditilserina care are i sarcina electric negativ. Glicolipidele conin la captul polar molecule de zahr (glucoz sau galactoz), ele fiind ntlnite exclusiv pe suprafaa extracelular a membranelor lipidice. Colesterolul se orienteaz n biomembrane cu gruprile hidroxil din structura inelar steroid n vecintatea capetelor polare ale fosfolipidelor (Fig. 99) interacionnd i imobiliznd parial gruprile hidrocarbonate din cozile fosfolipidelor, avnd ca efect scderea fluiditii biomembranelor. Interacia fosfolipide ap Capetele polare ce conin gruparea fosfat interacioneaz cu moleculele polare de ap. Deoarece cozile moleculelor amfifile sunt hidrofobe, interaciunea cu moleculele de ap este mai slab dect interaciunea dintre moleculele de ap, din acest motiv, la contactul cu apa, cozile hidrofobe sunt eliminate din contactul cu aceasta. n funcie de concentraia fosfolipidelor n ap, se pot realiza trei tipuri de structuri (Fig. 4): - monostrat lipidic pentru concentraii mici de fosfolipide; prin mprtierea unei soluii de lipide pe o faz apoas se formeaz spontan un monostrat la interfaa aer/ap unde capetele polare ale lipidelor sunt orientate ctre ap, iar cozile hidrofobe ctre aer; astfel, 2

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

lipidele sunt surfactani (au proprietatea de a scdea coeficientul de tensiune superficial al apei)

Fig. 3 Clasificarea lipidelor membranare n funcie de structura lor (Structure-based classification of membrane lipids Expert Reviews in Molecular Medicine 2002 Cambridge University Press) - micele, cnd coninutul de lipide al amestecului este mult mai mare catenele alifatice se vor orienta ctre interior, iar capetele polare vin n contact cu faza apoas - bistraturi, la concentraie foarte mare de fosfolipid, capetele polare vin n contact cu faza apoas, iar catenele alifatice sunt mpachetate paralel una cu alta; miezul lipidic fiind hidrofob este exclus din faza apoas, iar bistraturile lipidice se nchid spontan formnd vezicule stabile.

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Fig. 4 Organizarea spontan n ap a moleculelor lipidice

Fig. 5 La temperatura la care se desfoar procesele biologice, bistratul lipidic se comport ca o structur dinamic Bistratul lipidic este o structur dinamic, prezentnd fluiditate: moleculele lipidice prezint micri de translaie n stratul n care se afl (difuzie lateral), rotaie n jurul axei proprii, rotaie descriind o suprafa conic, flexie, basculare dintr-un strat lipidic n cellalt (Fig. 5). Experimentul Gorter Grendel n 1925, Gorter i Grendel (iniiatorii modelului de bistrat al membranei plasmatice) au emis ipoteza c dac membrana plasmatic este bistrat, atunci, suprafaa ei trebuie s fie jumtate din cea ocupat de totalitatea lipidelor sale ntr-un monostrat. Pentru a testa aceast ipotez ei au msurat suprafaa eritrocitelor recoltate de la diferite mamifere la microscop, apoi au extras lipidele din membrana eritrocitelor, au mprtiat lipidele la supraata aer/soluie salin i au msurat aria monostratului obinut. Prin compararea celor dou tipuri de msurtori s-a obinut raportul de aproximativ 2:1 pentru diferitele celule roii, confirmnd astfel modelul de bistrat al membranei plasmatice. Proteinele membranare Proteinele sunt macromolecule care constituie elemente eseniale pentru toate procesele biologice. Concentraia proteinelor membranare variaz ntre 20% (mielina, de exemplu) i 75% (n membrana mitocondriilor) sau chiar 80% (n membrana microorganismului Halobacterium halobium, coninnd bacteriorodospin care este un pigment fotosensibil). Proteinele reprezint elementul activ al membranei, fiind structuri organizate de baz n desfurarea urmtoarelor procese biologice: - fenomene de transport (canalele i transportorii care contribuie la transportul ionilor i al moleculelor mici sunt proteinele specifice) - cataliza enzimatic (enzimele, n majoritatea cazurilor, sunt structuri proteice, care mresc vitezele de reacie ale proceselor desfurate in vivo de ordinul milioanelor)

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

- micarea coordonat (de exemplu, actina i miozina sunt structuri proteice specifice responsabile pentru existena micrii coordonate) - suport mecanic (colagenul este o protein esenial n structura pielii, a esuturilor osoase i a tendoanelor) - imunoprotecie (anticorpii sunt de asemenea proteine extrem de specializate cu rol n recunoaterea organismelor strine) Varietatea lor este mult mai mare dect a lipidelor fiind determinat de diversitatea funciilor lor. n funcie de modul n care se insereaz n membran, proteinele (Fig. 6) sunt: a) proteine intrinseci (integrale) care au urmtoarele caracteristici: - traverseaz membrana celular o dat (glicoforina) sau de mai multe ori (exemplu: proteinele transportoare, pompe ionice constituite din mai multe helixuri)

Fig.6 Tipuri de proteine membranare - pot fi extrase prin tratare cu detergeni - sunt implicate n procesele de transport b) proteine extrinseci (periferice) - ptrund n membran pe o anumit distan, pe una din cele dou fee, sau sunt ataate la suprafaa membranei (receptorii membranari, proteine cu rol imunologic etc.) - pot fi ndeprtate prin splare ori prin tratare cu soluii cu trie ionic sczut - sunt implicate n transmiterea informaiei n interiorul celulei Fluiditatea membranelor plasmatice La temperatura la care se desfoar procesele biologice, membrana are proprieti fizice ce o apropie mai mult de starea de agregare fluid, aadar, dispunnd de o mare libertate, att lipidele ct i proteinele membranare pot executa diferite micri. Aceste micri sunt datorate agitaiei termice proprii, precum i ciocnirilor cu moleculele cu care vin n contact, ceea ce permite realizarea reaciilor enzimatice. Proteinele pot executa micri de translaie lateral prin bistrat, precum i de rotaie n jurul unei axe perpendiculare pe bistratul lipidic. Spre deosebire de lipide care se pot mica liber n bistrat, micarea proteinelor este mai restrictiv, fiind condiionat de interaciunea cu alte proteine. n orice moment o fraciune nsemnat a lipidelor membranare este adiacent proteinelor, dar exist un permanent schimb ntre lipidele limitrofe i cele din restul stratului lipidic. Diversele tipuri de lipide au afinitate diferit fa de proteine, aadar vor exista diferene ntre compoziia general a bistratului i a pturii adiacente a proteinelor. Fluiditatea membranar depinde de compoziia acesteia. Cnd membranele plasmatice sunt alctuite din fosfolipide nesaturate sunt mult mai permeabile pentru substanele liposolubile. Acest lucru poate fi explicat prin existena legturilor duble ale catenelor alifatice din fosfolipidele nesaturate, legturi duble care mpiedic rotirea catenelor conducnd la imposibilitatea mpachetrii strnse a acestor catene. Prin urmare, interacia dintre catene este mai slab i fluiditatea membranei crete. Se poate astfel explica de ce substanele lipidice difuzeaz mai repede prin membrane mai fluide. 5

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Fluiditatea membranelor biologice depinde i de cantitatea de colesterol din membran. Structural, colesterolul este situat alturi de capetele polare determinnd extinderea catenelor alifatice n aceast zon (Fig. 7).

Fig.7 Colesterolul n bistraturile lipidice Rigiditatea inelului colesterolului limiteaz micarea natural a catenelor alifatice nvecinate, partea dinspre exterior a moleculei lipidice devenind mai puin flexibil, creterea concentraiei de colesterol din membran determinnd scderea fluiditii membranare. Acest efect al colesterolului are un anumit rol i n natur. De exemplu, unele antibiotice formatoare de canal (Nystatinul, de exemplu) opereaz numai n membrane ce conin colesterol, probabil c rigiditatea membranar indus de colesterol determin o stabilitatea mai mare a porilor. Pe de alt parte, colesterolul descrete permeabilitatea biomembranelor pentru moleculele biosolubile mici, conducnd la creterea stabilitii mecanice a bistratului lipidic. S-a constatat c membrana celulelor crora le-a fost suprimat genetic capacitatea de a sintetiza colesterol sunt foarte fragile din punct de vedere mecanic, prezena colesterolului fiind absolut necesar supravieuirii celulor respective. Funciile membranei celulare n primul rnd, membrana asigur meninerea caracteristicilor fizico-chimice diferite ale celor dou compartimente pe care le separ. Membrana reprezint o zona de comunicare controlat ntre cele dou compartimente, n ambele sensuri prin: 1. Transport de substan prin membrana intact (molecule, ioni i ap) sau prin ruperea membranei urmat de refacerea acesteia datorit plasticitii ei excepionale. 2. Traducere i transfer de informaie adus de diferii stimuli (mecanici, electrici, electromagnetici, chimici, termici etc.) prin receptorii specifici pe care membrana i conine. 3. Implicare n funciile celulare datorit enzimelor i complexelor enzimatice pe care le conine: replicarea ADN, biosinteza proteinelor, bioenergetic celular, rspuns hormonal. Transportul de substan prin membran se face prin macrotransport dac substana transportat este n stare solid sau lichid (formele de macrotransport fiind fagocitoza i pinocitoza) i prin microtransport care poate fi pasiv sau activ. Macrotransportul n procesul de fagocitoz celula nglobeaz particule de substan solid, nvluindu-le anterior cu nite prelungiri citoplasmatice numite pseudopode, prelungiri care fuzioneaz apoi n spatele acestor particule.

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

La protozoare (la amoebe de exemplu) fagocitoza este procesul prin care celula se hrnete. La celulele mai dezvoltate, acest mecanism servete altor scopuri i anume: macrofagele i leucocitele nghit fragmente celulare i intrui. Prin pinocitoz, lichidele, dispersate n picturi fine, i macromoleculele sunt introduse n celul sau scoase din aceasta, dup ce n prealabil au fost nvelite ntr-un bistrat lipidic devenind vezicule. Veziculele fuzioneaz cu membrane celular i pot fi transportate dintr-o parte ntr-alta a membranei. Expulzarea coninutului lichid al veziculei are loc ca efect al forelor de tensiune superficial Formele pinocitozei sunt: - endocitoza (ptrunderea in interiorul celulei a veziculei, urmat de expulzarea coninutului acesteia). - transcitoza (vezicula traverseaz celula, fr a se sparge, Fig. 8) are loc cu precdere n celulele endoteliului capilar, facilitnd trecerea proteinelor plasmatice din snge ctre spaiul extravascular.

Fig. 8 Transcitoza - exocitoz (expulzarea de ctre celul a unei vezicule care, de exemplu, conine substane pe care celula este incapabil de a le utiliza). Fenomenele de exocitoz sunt frecvente n terminaiile nervoase i n celulele secretorii. Microtransportul Transportul pasiv Prin transport pasiv moleculele i ionii se deplaseaz n sensul gradientului electrochimic sau de presiune fr consum de energie metabolic, sistemul avnd tendina de a ajunge la echilibru termodinamic. Gradientul electrochimic este o for termodinamic productoare de flux i reprezint rezultatul unor procese desfurate cu consum energetic. n timpul transportului, moleculele i ionii utilizeaz energia micrilor de agitaie termic i cea derivat din atracia sau respingerea electrostatic. Un anumit tip de molecule aflate ntr-o soluie nmagazineaza o energie chimic sub form de potenial chimic care se poate exprima prin relaia c = 0 + RT ln 0 c unde 0 reprezint potenialul standard (potenialul chimic al unui solvit aflat ntr-o concentraie egal cu unitatea, la 25oC), R este constanta universal a gazelor, iar T este temperatura termodinamic. n cazul n care solvitul este un electrolit disociat, pe lang energia chimic a ionilor si exist i energia electric a acestora exprimat prin relaia zFE unde este numrul de echivalent-gram de ioni de un anumit tip, z este valena ionilor, F este numrul lui Faraday (96400 C/eq), V este potenialul electric al soluiei. 7

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Prin urmare, potenialul electrochimic al unei specii de ion n soluie va fi dat de suma celor dou energii prin expresia: W = ( + zFV) Considerand c de o parte i de alta a membranei celulare avem o anumit specie ionic n concentraii c1 = cin, c2 = cex, cu potenialele electrice ale soluiilor V1 = Vin, V2 = Vex obinem:

W = Win Wex = RT ln

cin + zF (Vin Vex ) cex

Deosebim dou cazuri: - W > 0 - ionii tind s prseasc celula i se ntmpl acest fenomen dac celula este permeabil pentru acei ioni. - W < 0 - ionii tind s ptrund n celul, dac membrana este permeabil pentru acetia. Transportul pasiv al unei specii ionice nceteaz la echilibru, adic n momentul n care potenialele electrochimice ale ionului n celul i n afara ei devin egale, adic pentru W = 0:

E = Vin Vex =

RT cexterior ln zF cint erior

ecuaia Nernst Folosind relaia lui Nernst se poate calcula diferena de potenial electric de o parte i de alta a membranei a unei specii ionice n condiiile n care se cunosc concentraiile ionului, la echilibru. Exist trei tipuri de transport pasiv: difuzia simpl, difuzia facilitat i difuzia prin canale i pori. Difuzia simpl se produce prin dizolvarea speciei moleculare transportate n membran. Datorit structurii membranei de bistrat lipidic, zona intern fiind hidrofob, o particul, pentru a trece de pe o fa a membranei pe cealalt, trebuie s strbat o zon hidrofil i s ptrund n zona hidrofob. De aici rezult ca mecanismele de difuzie sunt diferite pentru particulele hidrofile (ioni i molecule polare) i particulele hidrofobe (nepolare), respective particulele hidrosolubile i liposolubile. Solubilitatea unei substane este diferit n mediul apos i n membran, prin urmare, difuzia simpl depinde de coeficientul de permeabilitate al membranei (P vezi cursul de sisteme disperse) dar i de caracteristicile particulei, adic de coeficientul de partiie (). S vedem care sunt particulele care pot traversa membrana prin difuzie simpl. Un ion n mediu apos formeaz un sistem stabil cu acesta datorit interaciunii cu moleculele polare de ap, i de aceea pentru a-l transporta n mediul dielectric al bistratului lipidic este nevoie de un lucru mecanic. Prin urmare, simpla difuzie a ionilor prin bistrat este improbabil, trecerea ionilor prin membran fcndu-se prin mecanisme specializate care nltura bariera energetic. Macroionii nu pot difuza prin membrana celular datorit att sarcinii electrice ct i dimensiunii lor mari, acest lucru avnd o importan deosebit n stabilirea diferenei de potenial dintre feele membranei. Moleculele hidrofobe pot traversa membrana, permeabilitatea membranei pentru acestea fiind cu att mai mare cu ct dimensiunea particulei este mai mic, deoarece bistratul lipidic are o structura destul de compact. n concluzie, numai moleculele mici nepolare, moleculele hidrofobe i gazele pot traversa membrana prin difuzie simpl.

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Difuzia facilitat Moleculele hidrofile mari, cum sunt muli factori nutritivi necesari celulei, precum i unii ioni traverseaz membrana prin difuzie facilitat, utiliznd molecule transportoare existente n membran sau introduse artificial n aceasta. Asemenea molecule transportoare au o anumit specificitate, recunoscnd specia molecular sau ionic pe care o transport. Exist transportori pentru glucoz, colin, pentru diferii ioni (ionofori).

Fig. 9 Exemplu de difuzie facilitat: difuzia facilitata a gucozei (dupa Baldwin & Lienhard, Trends Biochem. Sci. 6:210, 1981) Transportorii sunt proteine att de specializate nct pot deosebi speciile levogire de cele dextrogire. Fiind vorba despre o form de transport pasiv, sensul de aciune al transportorilor n difuzia facilitat este sensul gradientului electrochimic. Molecula transportoare, cu rol enzimatic, se poate gsi n dou stri conformaionale. n Fig. 9 este figurat transportul facilitat al moleculei de glucoz. Se poate observa cum molecula de glucoza, numit substrat n aecast situaie, se leag pe una din feele membranei ntr-un anumit loc de legare numit situs. Se produce n urma legrii o modificare conformaional i situsul de legare este expus prii opuse, simultan cu scderea afinitii transportorului pentru glucoz i eliberarea acestei molecule de partea cealalt a membranei. Prin eliberare se revine la conformaia iniial i ciclul se repet. Difuzia prin canale ionice Substanele ionizate nefiind liposolubile, difuzia lor prin membran se poate face prin structuri proteice specializate care strabat membrana pe toat grosimea ei i creeaz ci de trecere pentru ioni, formnd canale sau pori. Noiunea de por este folosit pentru structurile neselective, fcnd o discriminare doar pe baza diametrului particulei. Cu precdere, prin pori trece apa, caz n care acetia se numesc porine. Ionii au n jurul lor o zona de hidratare, din care cauz au diametrul prea mare pentru pori. Canalele ionice sunt proteine specializate care strbat membrana lipidic celular, permind astfel trecerea substanelor neliposolubile. Prin canale ionii pot s treac n ambele sensuri, dar transportul are loc n sensul gradientului electrochimic. Spre deosebire de pori, canalele ionice sunt structuri selective. Eficacitatea transportului prin canale este foarte mare, printr-un singur canal putnd trece 106-108 ioni/s. 9

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

n Fig. 10 este reprezentat schematic structura unui canal ionic. Filtrul recunoate un anumit tip de ion i l las s treac n vestibulul. Senzorul primete informaia din exterior, fie din partea unei molecule receptoare, fie direct de la un semnal electric (acesta este cazul canalului din Fig. 10), i, dac informaia este corespunztoare, comand deschiderea porii permind ionului s intre sau s ias din celul, mpins de potenialul su electro-chimic. Canalul poate fi nchis sau deschis printr-o modificare conformaional a proteinei canal comandat printr-un mecanism specific electric, chimic sau prin alte mecanisme. Fiecare tip de canal poate fi blocat specific de anumite toxine: tetrodotoxina inhib funcionarea canalului de Na+ din membrana axonal, tetraetilamoniul blocheaz canalul de K+). Blocanii specifici permit studierea proprietilor canalelor sau identificarea proteinelor canal. Canalul ionic este caracterizat de un parametru electric numit conductan G, care reprezint inversul rezistenei electrice R. Unitatea de msur a conductanei este Siemens-ul (S). Din punct de vedere biologic, conductana canalului reprezint echivalentul electric al permeabilitii acesteia pentru un anumit tip de ion. Se poate aprecia conductana unei poriuni de membran ca fiind dat de produsul dintre conductana unui canal izolat i densitatea canalelor deschise, deoarece conductana canalului deschis este constant. Ordinul de mrime al conductanei unui canal ionic este pS (1 picoSiemens = 10-12 S).

Fig. 10 Reprezentarea schematic a canalului membranar Exist substane care formeaz n jurul ionului o structur hidrofob, permindu-i acestuia difuzia prin bistrat. O astfel de substan care, inclus n membrana celular, permite translocarea ionilor de pe o fa pe cealalt se numete ionofor. Ionoforii pot forma canale prin membran sau pot aciona ca nite molecule transportoare. De exemplu, valinomicina (Fig. 11) este un ionofor care poate ncorpora ionii de K+, forndu-i s prseasc prin membran celula bacterian, provocnd moartea acesteia, acionnd astfel ca un antibiotic.

Fig. 11 Valinomicina este un ionofor care face ca ionii de K+ s ias din celula bacterian, provocndu-i moartea Din studiul comparativ al transportului pasiv prin difuzie facilitat i al transportului prin canale rezult urmtoarele: - moleculele transportoare au o specificitate mai mare pentru moleculele sau ionii transportai dect canalele, moleculele transportoare putnd distinge ntre diferiii izomeri ai unei molecule 10

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

- moleculele transportoare au o vitez mult mai mic de lucru dect a canalelor ionice, permind trecerea doar a 1000 de ioni pe secund, acest lucru fiind compensat de numrul lor foarte mare - transportorii pot participa i la transportul activ - canalele au o foarte mare vitez de lucru, pn la 10 milioane de ioni pe secund motiv pentru care canalele sunt cile preferate pentru transportul ionilor atunci cnd sunt necesare variaii brute ale compoziiei i concentraiei ionice (n excitaia celular, de exemplu).

Fig. 12 Comportamentul diferitelor tipuri de molecule n apropierea membranei lipidice n concluzie, membrana celular poate fi traversat prin transport pasiv de moleculele mici hidrofobe prin difuzie simpl, de ioni prin canale i difuzie facilitat i de moleculele hidrofile mari prin difuzie facilitat (Fig. 12).

Fig. 13 Difuzia apei printr-un por Transportul apei care intervine esenial n toate procesele biologice se realizeaz att prin difuzie simpl i osmoz ct i prin canale (pori apoi (Fig. 13)), permeabilitatea membranei pentru ap fiind foarte mare. Mecanismele de transport al apei sunt foarte complexe i incomplet elucidate, un rol foarte important avndu-l diferena de presiune osmotic. 11

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Transportul activ Este o form de transport care necesit consum de energie metabolic (a unei reacii chimice, de exemplu). Se realizeaz n sensul invers gradientului de potenial electrochimic. Se disting dou forme de transport activ: transportul activ primar i transportul activ secundar. Transportul activ primar se realizeaz folosind proteine integrale numite pompe ionice membranare. In urma transportului activ se stabilete gradientul de concentraie n sensul cruia se desfoar transportul pasiv. Pompa leag ionul pe o parte a membranei ntr-o anumit zon activ numit situs de legare i, datorit unor modificri conformaionale care intervin n urma legrii ionului, l transfer pe cealalt parte unde l elibereaz. Pompa folosete, de obicei, hidroliza ATP n ADP i P. Exemplul cel mai cunoscut este ATP-aza Na+/K+ care transloc 3 ioni de Na + din interiorul celulei, unde concentraia acestuia este mic, spre mediul extracelular i 2 ioni de K+ din exteriorul celulei n interiorul acesteia (Fig. 14).

Fig. 14 Pompa Na/K Deoarece rezultatul unui ciclu este un transfer net de sarcin pozitiv n exteriorul celulei, spunem c pompa este electrogenic. De asemenea, pompa de Na+/K+ asigur prin funcionarea ei osmolaritatea egal pe ambele fee ale membranei.

12

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Fig.15 Schema Albert Post a etapelor funcionrii ATP-azei Na+/K+ n Fig. 15 este reprezentat succesiunea etapelor ATP-azei de Na+/K+. Aceasta este schema Albert Post i are urmtoarele etape: 1. enzima ia Na+ pe partea citoplasmatic i leag ATP aceats legare este posibil numai n prezena ionilor Mg++ 2. ATP este hidrolizat, complexul fosforilat sufer o tranziie conformaional, urmat de scderea afinitii pentru Na+ i creterea afinitii pentru K+ 3. ionii de Na+ se desprind i se leag ionii de K+ 4. legarea ionilor de K+ determin defosforilarea 5. n urma defosforilrii, proteina pierde afinitatea pentru K+, acetia desprinzndu-se 6. enzima revine la conformaia iniial i ciclul se reia. Exist i alte pompe n membrana celular, cum ar fi: - pompa de H+, K+ din mucoasa gastric (din membrana plasmatic a celulelor parietale) (Fig. 16), tot o ATP-az a crei structur este asemntoare cu cea a Na-K-ATP-azei.

Fig. 16 ATP-aza H+/K+ din mucoasa gastric Aceast pomp se gsete n veziculele intracelulare. n urma unui semnal hormonal, veziculele fuzioneaz cu membrana, n care se insereaz pompele. Se pot obine diferene de pH de 6,6, corespunztoare unui raport de concentraie a protonilor de 4.106. - pompa de Ca++ din reticulul sarcoplasmic i din membrana plasmatic

13

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Fig. 17 Mecanismul prin care se menine un pH sczut n lumenul stomacal - pompa protonic bacteriorodopsina (Fig. 18) care, sub aciunea luminii, pompeaz protoni din interiorul n exteriorul celulei.

Fig. 18 Bacteriorodopsina pompeaz protoni mpotriva gradientului lor electrochimic, sub aciunea luminii Transportul activ secundar Prin transport activ secundar speciile transportate ptrund ntr-un compartiment (extracelular sau intracelular) mpotriva gradientului lor electrochimic, asociindu-se cu molecule care se deplaseaz n sensul gradientului de concentraie. Specia transportat ct i molecula care efectueaz transport pasiv se leag de aceeai molecul transportoare. Transportul activ secundar utilizeaz transportorii ntlnii la difuzia facilitat, acetia putnd lega substratele transportate n aceeai stare conformaional sau n stri conformaionale diferite (Fig. 19). Dac ambele specii moleculare transportate se leag de aceeai parte a proteinei, transportul poart denumirea de simport sau co-transport, iar transportorul i poate modifica starea conformaional doar dup ce ambele substrate au ajuns n situsurile de legare. Cazul n care speciile transportate se leag pe cele dou pri ale transportorului, care se va afla astfel n stri conformaionale diferite, se numete antiport sau contra-transport.

14

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Fig. 19 Comparaie ntre formele de transport activ: primar i secundar ntlnim simport la ptrunderea glucozei n celulele mucoasei intestinale; ea se asociaz cu Na+ care intr pasiv. Ionii de Na+ sunt eliminai activ prin transport primar, prin ATP-aza de Na+/K+, iar glucoza rmne. i n acest caz, avem de-a face cu un transport electrogenic deoarece rezultatul net const n transportul unei sarcini pozitive dintr-o parte a membranei n cealalt.

Fig. 20 Simportul glucoza Na+ din celulele mucoasei intestinale Un exemplu de antiport este cel de 3Na+/Ca2+, de la nivelul muchiului cardiac, care asigur o concentraie sczut a ionilor de calciu n interiorul celulei. Energia pe care o folosete antiportul este furnizat de transportul activ al ionilor de sodiu din mediul extracelular ctre interiorul celulei.

Fig. 21 Antiportul de 3Na+/Ca2+ menine sczut concentraia ionilor de calciu n interiorul celulelor Transportul este electrogenic, deoarece avem sarcin net (+1) translocat prin membrana celular. 15

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Traducerea i transferul de informaie prin membrana celular Pentru a menine parametrii termodinamici n limite fiziologice i pentru a deprta sistemele biologice de strile de echilibru termodinamic este nevoie ca ntre diferitele compartimente ale unui organism viu s existe transfer de informaie. Receptorii membranari din membrana plasmatic celular sunt proteine intrinseci cu funcie enzimatic care au capacitatea de a recunoate o molecul semnal din mediul extracelular, numit mesager prim, i de a interaciona cu ea rapid i reversibil. Molecula purttoare de informaie se numete ligand specific i se poate lega de un anumit tip de receptor. n mod obinuit, moleculele semnal nu ptrund n interiorul celulei, rolul lor fiind doar de a transmite prin diferite mecanisme membranare informaia pe care o poart. Mesagerii primi pot fi molecule dar i factori fizico-chimici. Printre moleculele cu rol de mesager prim se ntlnesc: mediatorii chimici, hormonii polipeptidici, factori de cretere, antigenii, medicamentele, drogurile. n urma interaciei, celula poate sintetiza o alt molecul semnal numit mesager secund care declaneaz rspunsul celular specific. Mesagerul secund poate fi, uneori, chiar complexul receptor mesager prim. Mesageri secunzi frecvent ntlnii sunt: acidul adenozin monofosforic ciclic (c-AMP), acidul guanozin monofosforic ciclic (c-GMP), diacil glicerolul (DAG), inozitol trifosfatul (InosP3). Procesele care au loc la nivel celular sunt urmtoarele (Fig. 22): de ndat ce ligandul s-a fixat de receptor, informaia este transmis la nivelul membranei, acest lucru survenind de obicei, n urma modificrii conformaiei receptorului; n urma acestui proces se declaneaz o cascad de reacii n interiorul celulei avnd ca urmare o modificare a activitii celulare la nivelul metabolismului sau la nivelul expresiei genelor; informaia se transmite i de-a lungul membranei celulare, prin semnale electrice sub forma de poteniale locale i de tip tot sau nimic.

Fig. 22 Calea de transducie a unui semnal De exemplu, membrana plasmatic a axonilor celulelor nervoase este capabil s conduc pe distane lungi informaia sub forma unui curent electric transmembranar care se propag de la corpul celular la extremitile sinaptice.

16

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Etapele semnalizrii intercelulare 1. Sinteza moleculei semnal 2. Eliberarea moleculei semnal 3. Transportul moleculei semnal ctre int 4. Detecia semnalului 5. Rspunsul celular 6. Desprinderea moleculei semnal de receptor Semnalele sunt clasificate in urmatoarele categorii: semnale endocrine semnale paracrine semnale de contact semnale nervoase. Semnalele endocrine sunt reprezentate de hormonii produi n glandele endocrine, secretai n snge i distribuii n organism; Semnalele paracrine, generate de celule, acioneaz local n vecintate; Semnalele de contact, necesit contactul intercelular; Semnalele nervoase se transmit de-a lungul axonilor ctre celulele int; n ceea ce privete clasificarea receptorilor membranari, aceasta se face dup un criteriu bazat pe clasele funcionale de evenimente primare asociate cu legarea moleculei semnal de receptor. Avem de-a face cu receptori ionotropi care sunt asociai cu canalele ionice i care chiar pot fi canale ionice receptori metabotropi care pot determina sinteza mesagerilor secunzi (prin intermediul unei proteine efectoare), pot fi protein kinaze sau pot activa o protein kinaz Receptorii ionotropi au o zon receptoare de care se leag mesagerul prim i o zon efectoare prin care comunic senzorului canalului comanda de deschidere sau nchidere a porii. Receptorul este nu canal ionic si legarea ligandului (numit si agonist) determina dschiderea canalului, permitand un flux ionic ce modifica potentialul membranar. Prin urmare, n urma activrii, receptorul ionotropic afecteaz direct activitatea celulei prin deschiderea nemijlocit a unor canale ionice. Printre receptorii ionotropi se numara receptorul de acetilcolina, receptorul acidului gamma-aminobutiric (GABA), receptorul glicinic. Receptorii metabotropi pot determina sinteza mesagerilor secunzi (prin intermediul unei proteine efectoare), pot fi protein kinaze sau pot activa o protein kinaz.

Fig. 23 Aparitia raspunsului celular 17

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Mesagerii secunzi sintetizai activeaz o protein kinaz citoplasmatic -influeneaz activitatea celulei n etape: mai nti are loc o modificare metabolic a celulei. aceasta poate n final s duc la deschiderea sau nchiderea unui canal ionic ori poate modifica o alt activitate a celulei (de exemplu transcripia unei proteine ori alt rspuns celular specific). Prin legarea mesagerului prim de zona receptoare, zona efectoare activeaz adenilat-ciclaza care catalizeaz transformarea ATP n AMP-ciclic, care este chiar mesagerul secund. Acesta, la rndul su, activeaz protein kinaza c-AMP dependent, facnd-o apt sa declaneze rspunsul celular. Exist posibilitatea ca n loc de c-AMP s fie folosit c-GMP n calitate de mesager secund, caz in care n locul adenilat ciclazei avem de-a face cu guanilat ciclaza i cu o protein kinaz c-GMP dependent. Exist receptori care prin zona lor efectoare activeaz o protein kinaz.

Fig. 24 De exemplu, receptorul de insulin poate activa o tirozin kinaz, se fosforileaz alte proteine i n final se produce rspunsul celular care poate fi creterea permeabilitii pentru glucoz. Exemplu: epinefrina (adrenalina), mesagerul prim, se leag de receptorul specific (de zona receptoare a acestuia). n urma acestei legri, n urma unei modificri conformaionale, receptorul devine apt s lege o protein G. Proteina G, alctuit din 3 subuniti notate , i , i care n stare liber leag GDP, sufer la rndul ei o modificare conformaional n urma creia elibereaz GDP i leag GTP la subunitatea . Subunitatea se separ de subunitile i i difuzeaz pna cnd ntlnete un efector (zona efectoare), adenilat ciclaza. Prin legare de efector acesta se activeaz i catalizeaz transformarea ATP din celul n c-AMP (mesager secund); c-AMP declaneaz o serie de reacii enzimatice prin care este activat enzima fosforilaz i aceasta din urm determin transformarea glicogenului n glucoz ce este eliberat din celul (rspunsul celular). Dup activarea efectorului, subunitatea a proteinei G, prin hidroliza GTP devine inactiv i se recombin cu subunitile i , refcnd proteina G. Procesul se poate relua. Alt exemplu: ciclul biochimic al rodopsinei n excitaia vizual. Receptorul pentru lumin, rodopsina, leag n urma fotoactivrii traductina (protein G) i, n mod analog, traductina activeaz o protein efectoare (PDE). PDE convertete c-GMP (mesager secund) n GMP. Prin aceast conversie se nchid canalele de Na i Ca. Celula se hiperpolarizeaz i informaia este transmis creierului pe cile nervoase.

18

Curs Biofizica MG 2008 2009 Transport membranar

Categoria de receptori care funcioneaz cu o protein G rmn activi i dup disocierea de proteina G, putnd activa n continuare un mare numr de proteine G, determinnd astfel o amplificare a semnalului. Mesagerul secund c-AMP poate activa o serie de protein kinaze care, la rndul lor, determin n ultim instan eliberarea de hormoni, neurotransmitori etc. Ali receptori folosesc drept mesageri secunzi diacil glicerolul DAG sau inozitol trifosfatul InosP3 (IP3) care se sintetizeaz plecnd de la fosfaditil inozitol difosfat (PIP2) din membrana. Spre deosebire de DAG care activeaz direct protein kinaza, Inos P3 elibereaz Ca din depozitele celulare si acesta activeaz protein kinaza Ca dependenta. De exemplu, anumii receptori leag molecule semnal cum ar fi angiotensina, glucoza, Ach etc i activeaz apoi o protein G care, la rndul ei, activeaz o enzim numit fosfolipaza C. Substratul acestei enzime este reprezentat de fosfolipide, n special fosfatidil inositol 4-5 difosfat (PIP2). Enzima descompune PIP2 in inositol 1,4,5-trifosfat (IP3), eliberat in citosol, i diaciglicerol (DAG) care rmne ataat de bistratul lipidic. IP3 se leag de un receptor specific situat in membrana reticulului endoplasmic, receptor care este un canal de calciu. La legarea IP3 canalul de Ca se deschide. La rndul sau, calciul eliberat poate aciona si el ca mesager secund pentru alte procese celulare. Unul dintre acestea este activarea, mpreun cu DAG, a protein kinazei C- Ca dependente i aceasta poate fosforila diverse proteine. Un alt proces declanat de Ca este activarea calmodulinei care poate apoi interaciona cu alte proteine etc.

Fig. 25

19