Editori Mihaela Aluaş Simion Simon

Metode experimentale avansate pentru studiul şi analiza bio-nano-sistemelor

1

2

Editori Mihaela Aluaş Simion Simon

METODE EXPERIMENTALE AVANSATE
PENTRU STUDIUL ŞI ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR

Casa Cărţii de Ştiinţă Cluj-Napoca, 2012 3

Coperta: Patricia Puşcaş

Editură acreditată CNCSIS (24)

© Universitatea „Babeş-Bolyai”, 2012

Material editat în cadrul proiectului „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, ID 36154

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României Metode experimentale avansate pentru studiul şi analiza bio-nanosistemelor / ed.: Mihaela Aluaş, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Cărţii de Ştiinţă, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5 I. Aluaş, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.) 53

4

Prefaţă
În calitate de director al proiectului cu titlul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, cod contract” POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc să mulţumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza şi profesionalismul lor la realizarea acestui volum şi, implicit, la dezvoltarea programului doctoral. Mulţumirile mele se îndreaptă de asemenea către echipa de management a proiectului, în următoarea componenţă: Prof. dr. Simion Simon, coordonator ştiinţific program doctoral Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator ştiinţific relaţii internaţionale Cristina Dominic, asistent manager Andra Ghira, responsabil logistic şi asistent manager Jr. Alexandru Braşoveanu, consilier juridic Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar Ing. Carmen Ciplea, expert IT Ec. István Püsök, expert contabil Am convingerea că informaţia cuprinsă în această lucrare va sprijini generaţiile prezente şi viitoare de conducători de doctorat în activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor în lumea minunată a ştiinţei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercetător o vocaţie. Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013. C.S.III. dr. Mihaela ALUAŞ 5

6

Cuvânt înainte
Institutul de Cercetări Interdisciplinare a fost înfiinţat prin Hotărârea Senatului Universităţii Babeş-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare şi transfer tehnologic, având ca obiectiv de activitate atât realizarea de studii şi cercetări interdisciplinare în domeniile biologie moleculară, biomateriale şi sisteme biologice, materiale avansate şi mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural şi artificial, cât şi transferul rezultatelor obţinute către beneficiari locali, naţionali sau internaţionali. Institutul beneficiază de o clădire proprie, cu o suprafaţă desfăşurată de peste 3000 mp, modernizată la nivelul standardelor internaţionale din punct de vedere al dotărilor conexe şi având laboratoare de cercetare structurate în acord cu nevoile cercetărilor interdisciplinare menţionate. Între timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis să-şi dedice energia şi cunoştinţele cercetărilor la interfaţa Bio-NanoSistemelor, a devenit Institutul de Cercetări Interdisciplinare în Bio-NanoŞtiinţe (ICI-BNS). În cadrul acestuia îşi desfăşoară activitatea în prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conducători de doctorat), 25 alte cadre didactice şi cercetători şi peste 40 de doctoranzi cu frecvenţă. Aceştia aparţin domeniilor Fizică, Chimie, Biologie, Informatică, Ştiinţa mediului şi Psihologie. Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară” a oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercetători valoroşi, cu experienţă deosebită în tehnicile experimentale frecvent utilizate în cercetările interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-Ştiinţelor. Marea majoritate a experţilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoctorale în prestigioase laboratoare din lume unde au dobândit o bogată experienţă în utilizarea echipamentelor de înaltă performanţă de care dispune Institutul nostru. Studenţii doctoranzi, dar şi specialişti din domenii ca: fizică, chimie, biologie, geologie sau ştiinţa mediului interesaţi în studii experimentale interdisciplinare vor găsi în materialele incluse în prezentul volum date teoretice dar mai ales practice, despre tehnici experimentale avansate prezentate într-o formă accesibilă, cu exemple semnificative, menite a facilita înţelegerea fenomenelor studiate şi a contribui la creşterea aportului fiecărui cercetător la dezvoltarea domeniului în care îşi va desfăşura activitatea ştiinţifică. Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS

7

8

CUPRINS
I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13 Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea de proteine.......................................................................................................................... 13 Asist. univ. dr. Iulia Lupan Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare ........... 36 Asist. univ. dr. Iulia Lupan II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64 Culturi celulare ........................................................................................................... 64 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Culturi celulare – partea a II-a .................................................................................... 82 Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101 Microspectroscopia Raman....................................................................................... 101 Conf. dr. Monica Maria Baia Microspectroscopia Raman – partea a II-a................................................................ 121 Conf. dr. Monica Maria Baia IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134 Spectroscopia de absorbţie în infraroşu .................................................................. 134 Lect. dr. Nicolae Leopold Tendinţe moderne în spectroscopia de absorbţie IR ............................................. 147 Lect. dr. Nicolae Leopold V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160 Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160 Conf. dr. Dana Maniu Spectrofluorimetria - aplicaţii ................................................................................... 172 Conf. dr. Dana Maniu VI. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ MAGNETICĂ NUCLEARĂ ......... 191 Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) .................. 191 C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) – Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaţii pe sisteme moleculare organice în faza solidă .......................................................................................................... 216 C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş

9

Rezonanţa magnetică nucleară pe sisteme lichide ................................................ 246 Lect. dr. Mihai Vasilescu VII. MĂSURĂTORI TERMICE .................................................................................. 266 Analiză termică diferenţială. Analiză calorimetrică diferenţială......................... 266 Conf. dr. Raluca Ciceo-Lucăcel Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termică diferenţială si analiză calorimetrică diferenţială. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC........................................................................................................................... 275 Conf. dr. Raluca Ciceo-Lucăcel VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286 Difracţie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Determinarea structurii cristaline prin difracţie de raze X................................... 305 C.S.I. dr. Gheorghe Borodi IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ ŞI DE TRANSMISIE ........... 327 Microscopia electronică ............................................................................................. 327 şef lucrări dr. Lucian Barbu-Tudoran Microscopia electronică - partea a II-a .................................................................... 347 şef lucrări dr. Lucian Barbu-Tudoran X. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ ............................................................ 365 Microscopia de forţă atomică ................................................................................... 365 Conf. dr. Ioan Burda Microscopia de forţă atomică – partea a II-a ........................................................... 378 Conf. dr. Ioan Burda XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X ŞI ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394 Spectroscopia fotoelectronică ................................................................................... 394 C.S.III. dr. Maria Teodora Radu Studiul prin spectroscopie fotoelectronică de raze X a suprafeţelor diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424 C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga XII. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ ELECTRONICĂ DE SPIN .......... 437 Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin ................................................... 437 C.S. dr. Milica Todea Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin – partea a II- a ............................ 452 C.S. dr. Milica Todea

10

............. Réka Barabás     11 ................. 467 Conf...... Graziella Liana Turdean Electrochimia unei substanţe cu potenţial biologic activ........ ing......... Studiu de caz . dr........ 509 Lect................................. ing..................... 490 Conf........ dr.........XIII. SISTEME DE ANALIZĂ A SUPRAFEŢEI SPECIFICE ŞI A DIMENSIUNII PARTICULELOR .... Graziella Liana Turdean XIV................. dr... METODE ELECTROCHIMICE .. ing.. 467 Elaborarea............... testarea şi verificarea protocoalelor de practică experimentală pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice . 509 Sisteme de analiză a suprafeţei specifice şi a dimensiunii particulelor ................................

  12 .

........ ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc în ribozomi.......... Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ..................... Informaţia genetică nu poate fi transmisă invers................... Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare .... Bibliografie . Nu există cazuri de transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine................................................ ANALIZE GENETICE Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea de proteine Asist.. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ADN în sine are doar 2 funcţii importante şi anume păstrarea informaţiei genetice şi furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine........ care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o enzimă numită ARN polimerază............... 13 2.. Mesagerul informaţiei între ADN şi proteine este ARN........................... 13 ................... Acest fapt este realizat prin replicarea ADN şi împărţirea egală a celor două copii în timpul diviziunii celulare....... Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaţie la alta........ dr......... Dogma centrală a biologiei presupune transmiterea unidirecţională a informaţiei de la ADN la proteine prin intermediul ARN (Figura 1).......... 33 4......... Practic ARN este cărăuşul informaţiei din nucleu în citoplasmă unde are loc sinteza proteinelor....... 34 1........................ Informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN........... 31 3.... Iulia Lupan Cuprins 1................ de la proteine la ADN.............. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară ................................................. A doua funcţie este legată de descifrarea informaţiei pentru sinteza de proteine... univ.......I...

Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi introducerea ei în alte celule gazdă pentru multiplicare şi în unele cazuri pentru exprimare. fie prin tăierea acestuia din genom. Din această cauză în continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. Există 2 modalităţi de a obţine fragmentul dorit. ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un polipeptid şi serveşte ca matriţă în procesul de traducere (sinteză a proteinelor). iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică. fie prin copierea acestuia. procesul clonării constă din următoarele etape: • amplificarea genei de interes • introducerea genei de interes într-un vector de clonare • introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă • selecţia celulelor transformate (purtătoare ale moleculei recombinate) Figura 1. A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des 14 . Dogma centrală a biologiei. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă deoarece necesită prezenţa unor situsuri (secvenţe specifice) la capetele fragmentului. Moleculele de ARN rezultate în urma transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii: • ARN funcţional • ARN informaţional ARN funcţional este ARN care nu se traduce. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie într-o moleculă de ARN. care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente generate. • verificarea moleculelor recombinate Amplificarea genei de interes. Sumar. îndeplineşte anumite funcţii în celulă (în cea mai mare parte participă la procesul de traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă: ARN ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obţine milioane de copii ale unei singure gene. Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un genom este necesară extragerea acestuia. ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. În alte cazuri scopul clonării nu este obligatoriu o genă. De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonării codifică un polipeptid.

O condiţie obligatorie pentru o amplificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă. Această tehnică poate fi considerată un adevărat copiator de gene. Dacă în celule pentru replicare se foloseşte o întreagă serie de proteine. este rapidă şi sensibilă deoarece necesită cantităţi foarte mici de ADN matriţă. doar de 30-45 sec. Aceste amorse sunt complementare cu extremităţile secvenţei ţintă şi formează cu acestea porţiuni scurte dublu catenare. Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene. catenele complementare formând molecula dublu catenară după înlăturarea agentului de denaturare. Există mai multe formule de calcul. Principiul tehnicii PCR este o imitaţie a procesului de replicare a ADN care are loc în celule. temperatura este coborâtă la 40-60ºC timp de câteva zeci de secunde. denumite şi oligonucleotide. atunci se vor analiza cel puţin secvenţe ADN omoloage de la alte specii sau secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă. Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic. Această etapă este numită de aliniere sau hibridizare. Temperatura de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei şi de compoziţia ei. fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape: • denaturarea ADN • alinierea amorselor • sinteza catenei complementare de către ADN polimerază După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează. Dacă secvenţa este necunoscută. cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. în special la capetele acesteia. Amorsele (termenul englezesc este primer). Ca agent denaturant se utilizează temperaturi înalte de 94-98ºC. cea mai simplă formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este: Tm = 4 (G + C) + 2(A + T) 15 . Procesul este reversibil. Reacţia de amplificare este una ciclică. Pentru alinierea amorselor la secvenţele complementare. În acest scop se utilizează tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici. Temperatura de aliniere se stabileşte la câteva grade (2-5ºC) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei. e nevoie de mai mult timp. Tehnica este pe larg utilizată. Etapele de denaturare după primul ciclu sunt mai scurte. sunt secvenţe scurte de ADN monocatenar. care sunt foarte mari.utilizată. Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene. iar după 35-40 de cicluri se obţin milioane de copii ale fragmentului ţintă pornind de la o singură copie.

deoarece oferă o stabilitate mai mare • amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. izolată de la o bacterie termofilă Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei). dar şi ca punct start pentru ADN polimerază. în caz contrar amorsa poate forma secvenţe interne dublu catenare care au aspect de stem sau buclă • cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu trebuie sa fie complementare între ele. altfel se vor forma porţiuni dublu catenare sau dimeri de amorse. În acest fel tuburile de reacţie trebuiau schimbate de la o temperatură la alta şi după fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de 16 . pe larg utilizată şi astăzi este Taq polimeraza. ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia 5'→3' (Figura 2). în consecinţă moleculele bogate în G şi C au o temperatură mai mare de topire.Unde G. C. care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat într-un lanţ polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era inactivarea termică în timpul denaturării ADN. Taq polimeraza are activitatea optimă la 72°C şi nu se denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C foarte repede. Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolată de la bacteria Escherichia coli. care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'. Această enzimă este o ADN polimerază. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. astfel după câteva ore la 95°C pierderea de activitate este nesemnificativă. iar ca rezultat se vor amplifica porţiunile scurte rămase monocatenare. Amorsele servesc în primul rând la delimitarea fragmentului amplificat. De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi amorsa ADN. Numărul de G şi C se înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece între acestea există 3 legături de hidrogen. care are activitatea optimă de sinteză la 37°C. Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume: • numărul de nucleotide este de 15-35 • temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 şi 70ºC • conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55% • la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C. A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze azotate. polimeraza poate iniţia sinteza catenei complementare. Enzima revoluţionară în acest sens.

iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide – 2minute.aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec. Durata elongării necesare sintezei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă. Etapa iniţială de denaturare 5' 3' ADN genomic cu fragmentul ţintă 3' 5' 5' 3' 3 5' Alinierea amorselor la capetele fragmentului ţintă 3' 5' 3 ' 5' Ciclu I 5' 3' Etapa de elongare sau sinteză a catenei complementare de către ADN polimerază 3' 5' 5' 3' Sfârşitul primului ciclu 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' Ciclu II 5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 17 .

5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3' 3' Ciclu III 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' Taq polimeraza amorsă amorsă ce indică direcţia de sinteză Figura 2. RT-PCR se utilizează pentru obţinerea copiilor de gene eucariote care nu conţin introni şi analiza exprimării de gene. Enzime de restricţie Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. se fixează de acestea şi taie legăturile fosfoesterice între nucleotide. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN. Taq polimeraza este o ADN polimerază deoarece sintetizează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează o matriţă ADN pentru sinteză. Restrictazele recunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri specifice de recunoaştere. În ambele cazuri se porneşte de la ARNm (ARN informaţional care codifică proteine). Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că funcţia lor este de apărare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). Acest tip este asemănător PCR obişnuit. Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR. care este de fapt o ADN polimerază ARN-dependentă. Transcriptaza inversă a fost izolată de la virusurile care au material genetic ARN şi în momentul intrării în celulă necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. În mo18 . Enzima responsabilă de această sinteză este transcriptaza inversă. doar că foloseşte o matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN.

în general. nu taie ADN metilat.mentul intrării ADN fagic în bacterii. Până acum au fost descrise 4000 de enzime de restricţie de la câteva sute de specii bacteriene. Cu ajutorul unor programe speciale se pot alcătui hărţi de restricţie care reprezintă situsurile de recunoaştere pentru diferite restrictaze într-o secvenţă (Figura 4). Secvenţa palindrom este alcătuită din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele catene în direcţia 5′→3′ este identică. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I. Locurile de tăiere sunt indicate cu săgeţi. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restricţie prin metilarea unor baze azotate. Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte. iar enzimele SmaI şi EcoRV generează capete drepte sau netede (Figura 3). Această clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de recunoaştere. Enzimele cele mai utilizate în tehnicile moleculare sunt cele de tip II. care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi utilizează ioni de Mg2+ ca şi cofactor. enzimele de restricţie. II şi III. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi SmaI (B) şi capetele libere după tăiere. Enzima BamHI şi EcoRI generează capete coezive după tăiere. A EcoRI B SmaI 5′ GAATTC CTTAAG 3′ 3′ 5′ 5′ GGGCCC CCCGGG 3′ 3′ 5′ 5′ G CTTAA 3′ AATTC G 3′ 5′ 5′ GGG CCC 3′ CCC GGG 3′ 5′ Figura 3. iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13. enzimele de restricţie digeră aceste molecule. Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea bacteriei de la care a fost izolată. HindIII este izolată de Heamophilus influenzae tulpina Rd. 19 . Astfel.

Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. ADN ligaza T4 utilizează ATP ca şi cofactor. care este circulară.B am H I (533) H inf I (7 5) E co RV (5 8) H inf I (32) H inf I (461) E co RI (605) H inf I (616) E co RI (633) B am H I (7 7 3) NcoI (7 7 7 ) H inf I (942 Y LR3 7 7 C 1047 bp Figura 4. Cu cifre în paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricţie. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide. recombinării şi după repararea ADN. acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu există nici un lipici special. Ligarea fragmentelor de ADN Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire. Un plasmid este o moleculă dublu catenară de ADN. Vectori de clonare Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN străin în celulele gazdă. plasmide şi vectori artificiali. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a două fragmente ADN care au capete netede. Funcţia ligazei în celule vii este legarea fragmentelor în timpul replicării. Cea mai des utilizată este ADN ligaza T4 izolată de la bacteriofagul T4. Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită ADN ligază. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3′) şi gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (capătul 5′) (Figura 5). închisă şi capabilă de replicare autonomă în celule 20 . Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul clonării. Figura 5. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. bacteriofagi.

Cei mai frecvenţi markeri utilizaţi sunt genele ce conferă rezistenţă la antibiotice. Nicio moleculă de ADN nu poate fi replicată fără o origine de replicare. O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate începe replicarea şi care este recunoscută de anumite proteine care iniţiază replicarea. Dacă în SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv. vor supravieţui doar celulele care conţin plasmidul. care este originea de replicare. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost modificate. Pentru replicarea autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa ori. a căror produs (enzimă) fac posibilă selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt mai numeroase. Dacă în SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intactă. Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZ′ care codifică subunitatea α a enzimei β-galactozidază. Insert se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În această regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie şi a ligazei.gazdă. clonării. Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu plasmid recombinat adică cu insert de cele cu plasmid fără insert. Atât vectorul cât şi fragmentul ADN sunt tăiate cu aceleaşi enzime de restricţie şi legate împreună cu ajutorul ligazei. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va metaboliza acest substrat. O altă componentă foarte importantă a plasmidelor sunt markerii de selecţie care sunt de obicei nişte gene. cât şi fără plasmid. Astfel dacă un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conţine atât celule cu. Spre exemplu. În acest scop situsul multiplu de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Plasmidele au nişte secvenţe specifice necesare replicării. SMC conţine secvenţele de recunoaştere pentru mai multe enzime de restricţie care nu se conţin în altă regiune a vectorului. produsul ei este o proteină activă. În acest fel coloniile re21 . se însămânţează pe un mediu cu ampicilină. atunci produsul acestei gene împreună cu subunităţile codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o enzimă activă capabilă să metabolizeze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în mediu şi este incolor. Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă vor proteja celulele bacteriene de efectul antibioticului. iar produsul format în urma reacţiei va avea o culoare albastră. selecţiei şi uneori exprimării genelor. mai corect spus produsul genei conferă rezistenţă. β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină.

Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncţională şi vor supraveţui. Promotorul este o secvenţă care se află în amonte de genă şi este recunoscut de factorii de transcriere. Un alt tip de selecţie utilizează o enzimă toxică pentru celulele bacteriene. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un număr mai mare de copii per celulă. care se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază transcrierea. MBP este termenul în engleză). Numai în prezenţa promotorului exprimarea va fi foarte scăzută. în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN este necesară o cantitate mai mare de cultură. doar de câteva mii de pb şi în care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb până la 2000-3000 pb (Figura 6: A.zultate după transformare care conţin vectorul fără insert vor fi albastre. Aceste elemente sunt cele care se găsesc şi în genom şi fac parte dintr-o genă: promotorul. iar cele ce conţin vector recombinat vor fi albe. Vectorii de clonare au de obicei mărime mică. Astfel. B). Glutation S-transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein. Pentru vectorii mai mari numărul copiilor per celulă este mai mic. Acest codon este de obicei inclus în situsul multiplu de clonare. O caracteristică importantă pentru plasmide este numărul de copii per celulă. de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secvenţă care se transcrie dar care nu se traduce şi care este recunoscută de ribosomi. Aceste etichete vor fi parte integrantă a proteinelor la 22 . Acest fapt permite obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de bacterii (din 3-5 ml de cultură se pot obţine câteva μg de ADN plasmidic). deoarece ele nu produc enzimă activă capabilă de metabolizarea substratului X-Gal. Ribosomii se leagă la acest situs şi se deplasează de-a lungul ARNm până întâlnesc primul codon START de unde începe traducerea. celulele cu plasmid fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor. codonii START şi STOP care delimitează cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Plasmidele de exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus faţă de vectorii de clonare. Codonul START la procariote este în cele mai dese cazuri ATG. situsul de legare al ribosomilor. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag). în caz contrar acesta se poate introduce în fragmentul ţintă cu ajutorul amorselor. În unele cazuri acesta este prezent după regiuni care codifică anumite aşa-zise etichete. Etichetele facilitează purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Codonul STOP este inclus şi el de obicei în situsul de clonare. Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care oferă în plus posibilitatea exprimării genei clonate (Figura 6 C).

iar TCr rezistenţă la tetraciclină. C – harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care conferă rezistenţă la ampicilină. B – harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. A Eco RI (4360) Sca I (3847) Pvu I (3737) Cla I (25) HindIII (30) Eco RV (188) Bam HI (376) Sph I (567) Sal I (652) B LacZ Eco RI Sac I (6 AP r Pst I (3612) bla(AmR) Kpn I (6 TC r pTZ57R 2886 bp Xba I (6 Bam HI pBR322 4361 bp MCS Apa I (6 Sal I (6 Pst I (6 Hin dI ORI Bst Z17I (2247) T7 p T7 terminator C f1 origin His tag XhoI (159) Not I (167) HindIII (174) Sal I (180) Sac I (191) Ori M CS Eco RI (193) bla (Ap) Bam HI (199 Nde I (239 pET-21a 5443 bp T7 prom Bgl II (34 lacI ColE1 pBR322 origin Figura 6. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate faţă de anumite răşini cromatografice. promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG. 23 . Hărţile unor vectori plasmidici.capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau înainte de situsul de clonare respectiv. A – harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezistenţă la antibiotice: Apr conferă rezistenţă la ampicilină. în dependenţă de gena selectată pentru inserare. situsul multiplu de clonare care conţine un codon START şi un codon STOP după eticheta de 6 histidine. situsul multiplu de clonare îl poate constitui oricare dintre cele două gene de rezistenţă. Plasmidul are rezistenţă la ampicilină. iar situsul multiplu de clonare se află în gena lacZ' care oferă selecţia alb-albastră a clonelor pozitive. rezistenţa la antibioticul respectiv se va pierde .

Aceste spălări repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. ceea ce înseamnă ca la transformarea unui μg de plasmid s-ar obţine 1 milion de colonii.6-0. acestea având cea mai mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi proteinelor recombinate. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura 7 B). Această competenţă în cazul transformării chimice este indusă cu CaCl2. Numărul de colonii va corespunde numărului de celulele transformate deoarece fiecare colonie ia naştere dintr-o singură celulă. Amestecul de celule competente şi plasmide recombinate vor fi depuse într-o cuvă specială de electroporare. Eficienţa de transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile rezultate. o valoare foarte mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie 24 . O eficienţă bună de transformare este 106. la 42°C. Numărul obţinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoarea la 1000). Există două tipuri de transformare a celulelor bacteriene pe larg utilizate în laboratoarele de biologie moleculară: • transformarea chimică • transformare sub influenţa câmpului electric. adică fără plasmid. În continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote. deoarece E. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator. Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei competenţe de transformare. care va crea câmpul electric între doi electrozi.Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se numeşte transformare dacă sunt utilizate celule bacteriene sau transfecţie dacă sunt celule eucariote. timp de maxim 2 minute. Doar unele celule bacteriene sunt transformate. În acest scop se realizează o cultură de E. coli şi prin tratarea celulelor cu clorură de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bacteriene (Figura 7 A). Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele bacteriene. Celulele sunt şocate termic foarte scurt. Prepararea celulelor competente presupune doar creşterea lor până în faza logaritmică (D=600nm = 0.8) şi înlăturarea prin spălări repetate a mediului de cultură. Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât transformarea chimică. cea mai mare parte dintre ele fiind netransformate. ai cărei pereţi laterali sunt electrozii. coli nu are proprietăţi de transformare naturală. După transformare celulele şocate sunt preluate în mediu de cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice.

Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a acizilor nucleici. dar mai ieftină deoarece nu necesită aparatură şi cuve costisitoare.coli Însămânţarea celulelor transformate pe mediu selectiv Spălarea celulelor bacteriene 1800 V 5 msec Figura 7. deoarece este mai laborioasă.coli Celule transformate de E. Migrarea moleculelor se realizează printr-o matrice specifică. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină într-un câmp electric. Desigur în amestecul de ligare numărul de molecule recombinate este mic şi din această cauză este recomandată o eficienţă cât mai mare a celulelor competente. A CaCl2 2 min 42ºC B Celule de E. Primul loc în utilizarea vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de agaroză. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza proteinelor în condiţii denaturante în gel de poliacrilamidă (termenul englezesc SDS-PAGE). Această matrice este folosită mai rar în laboratoarele de analize genetice. mai ales în cazul fragmentelor mici. Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă. ea este utilizată cu succes deoarece este mai simplă. A – transformarea chimică cu CaCl2. Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea. Această sarcină face posibilă migrarea moleculelor de ADN şi ARN 25 . B – electroporarea celulelor bacteriene.sau de câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa de transformare şi de costuri. Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice şi pentru electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a separării fragmentelor de ADN.

Gelurile de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei. Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi purificarea ADN. iar cele mai mari vor avansa mai lent. Lungimea de undă a luminii ultraviolete la care este expus gelul trebuie să fie cuprinsă între 260 şi 300 nm. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare. Vizualizarea ne oferă informaţii despre integritatea ADN 26 . cu atât mărimea porilor va fi mai mică. Astfel separarea moleculelor va fi în dependenţă de masa lor moleculară. La concentraţii mai mici de agaroză. A B Figura 8. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. B – fotografia aceluiaşi gel. Acest amestec de molecule se numeşte marker molecular ADN. porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă.1 şi 10 kpb. dar în godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 8). oferind separarea moleculelor între 0. A – imaginea gelului la expunerea în UV. Amestecul de molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză. Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Pentru estimarea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelaşi gel. Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate din molecula dublu catenară de ADN. Cel mai des folosită în acest scop este bromura de etidiu. Cele mai folosite tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA). Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1 şi 3% în dependenţă de scopul urmărit. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. iar concentraţii mari pentru fragmente mici. Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesară utilizarea unui colorant. Gelurile de agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon specific. În concluzie concentraţii mai mici se folosesc pentru fragmente mari (câteva mii de pb).într-un câmp electric de la catod la anod. Gelurile de agaroză sunt plasate între cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de migrare.

acestea necesită totuşi o dovadă în plus a prezenţei plasmidului recombinat. Tli polimeraza ş. Ambele aparate utilizează principiul Sanger de secvenţiere. Matriţa ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată. În cadrul Centrului de Biologie Moleculară există 2 secvenţiatoare: Analizorul Genetic ABI Prism 310. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie enzimatică şi apoi prin secvenţializare. În unele cazuri se utilizează un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescută. Această digestie va confirma prezenţa insertului în plasmid şi aproximativ mărimea acestuia. dar asigură de obicei randamente de sinteză mai mari. rezultatul digestiilor enzimatice. dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa fragmentului clonat. estimarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie. Pfu polimeraza. Această verificare este necesară deoarece ADN polimeraza utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sinteză. ADN poate fi purificat din gel de agaroză după migrare prin excizarea fragmentului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificări. Applied Biosystems. Chiar dacă se foloseşte un sistem alb-albastru de selecţie a coloniilor pozitive. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secvenţiere. coli pe mediu selectiv. Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi). a. Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor kituri speciale. apoi la unul din capetele sale are loc ataşarea 27 . Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a clonării. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza. În acest scop se va efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va însămânţa cu o singură colonie. Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-18 ore de la transformare când apar coloniile de E. Cultura se va incuba peste noapte cu agitare la 37°C. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus în vector sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN polimerază care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Secvenţializarea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a clonării. SUA (laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi). ADN plasmidic etc). deoarece acestea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi colonii cu plasmid fără insert.(ADN genomic.

Electroforegramele sunt apoi analizate şi comparate cu secvenţa existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se foloseşte o singură amorsă) de diferite mărimi.unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei complementare. iar la final cele mai mari. Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei şi la care se urmăreşte cunoaşterea secvenţei. care presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul micrometrilor. Lipsa acestei grupări va face imposibilă continuarea sintezei ADN. O cantitate de câţiva microlitri vor fi separaţi în gelul din capilar. Numărul de cicluri este de 40. iar fluorescenţa emisă va fi captată şi prezentată sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Exprimarea genelor în sistem procariot Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul nucleotid. iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate. Figura 9. Pentru detecţia fragmentelor. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare. În ultima parte a capilarului există o fereastră transparentă prin care un fascicol laser va excita fluorocromii. Pentru fragmente mai mari sau pentru matriţe dificile (cu secvenţe repetitive) este necesară utilzarea unor kituri speciale. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de mărimea lor. Electroforegrama unei secvenţe obţinută cu ajutorul analizorului ABI Prism 310. 28 . Amestecul de fragmente rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare. fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc în toate punctele matriţei de ADN. cele mai mici vor fi primele. Amestecul PCR conţine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar şi di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a dezoxiribozei.

un codon START şi unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid). coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bacteriene nu va sigura o exprimare a genei. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine recombinate. adică împărţirea exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. codonul START în situsul multiplu de clonare şi codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Această genă se află sub controlul promotorului lac UV5 şi a operatorului lac (Figura 10). situsul de recunoaştere a ribosomilor. un situs de legare a ribosomilor (rbs). vectorii de tip pET de la Novagen asigură de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7. atunci din genă se va înlătura codonul STOP. care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi de ce cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă. Plasmidele de exprimare conţin neapărat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazdă. Figura 10. Clonarea în scopul exprimării genei şi obţinerii de proteină recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru exprimare. Promotorul T7 nu este recunoscut de către ARN polimeraza de la E. care este un analog al galactozei.Celulele de E. Dacă această etichetă nu este necesară. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Spre exemplu. Gena codificatoare poate fi clonată direct în vectorul de exprimare. Foarte important în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire. Inhibiţia exprimării genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 şi a genei ţintă în celulele gazdă de E. Dacă se optează pentru prezenţa unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificării. 29 . atunci în genă se va păstra codonul STOP şi traducerea se va opri înainte de etichetă. coli în lipsa inductorului. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin gena pentru ARN polimerază de la fagul T7.

Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate. care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimerază. astfel promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură purificarea proteinelor într-o singură etapă. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi împiedică transcrierea genei pe care o reglează. Pentru o purificare cât mai bună din amestecul total de proteine este necesară purificarea în cel puţin 2 etape prin metode cromatografice diferite. A – încărcarea amestecului total de proteine pe coloana cu răşină. C – eluarea proteinei ţintă de pe coloană. coli care va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Represorul lac este codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi în plasmidul de exprimare. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. A B C Figura 11. cum este spre exemplu situsul pentru trombină în cazul plasmidului pET28.Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină numită represorul lac. B – spălarea coloanei cu tampon şi fixarea proteinei ţintă de răşină. În acest scop pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţine situsul pentru peptidază. Agentul care induce exprimarea este un analog al galactozei IPTG. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene. ceea ce reduce timpul necesar şi asigură randamente de purificare mai mari (Figura 11). Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac. atunci se poate recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. Aceasta din urmă va recunoaşte promotorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Dacă eticheta deranjează în analiza ulterioară a proteinei. 30 .

Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică indispensabilă în laboratoarele de biologie moleculară. importante nu numai pentru biologie. • purificarea se face în mai multe etape care necesită timp. dar şi pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de proteine recombinate. se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine. obţinerea de proteine din celule umane ar fi imposibilă. • fuzionării. Prin intermediul tehnicilor de mutageneză pot fi introduse mai multe tipuri de mutaţii: • mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul. Clonarea genelor şi exprimarea lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem să le cultivăm în condiţii de laborator. • deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi înlăturate. În cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele în care aceasta se exprimă în mod firesc natural prezintă mai multe dificultăţi: • cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică. spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesară o cantitate de zeci de litri de cultură bacteriană. cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane. spre exemplu regiunea N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu capătul C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită. Un mare avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care pot dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea proteinei. iar rezultatul purificărilor în câteva etape pot fi sub 100 mg de proteină. • proteinele recombinate pot fi marcate.2. Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic sunt eliminate în cazul exprimării genelor în celule gazdă. consumabile şi are randamente mai mici. • obţinerea materialului pentru purificare implică probleme etice. Proteinele pot fi marcate 31 . Una dintre aplicaţiile acestei tehnici. • inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena codificatoare şi respectiv în proteina recombinată. • obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este aproape imposibil.

iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplasmă formează corpi de incluziune. glicozilări ş. în alte cazuri este nevoie de condiţii speciale şi alte proteine care contribuie la adoptarea conformaţiei proteinei active. Unele proteine atât de la eucariote cât şi de la procariote sintetizate în celule gazdă de E. astfel o proteină are structură: primară. coli nu reuşesc să adopte o structură secundară corectă.cu anumite molecule care sunt introduse în proteine în procesul lor de sinteză sau pot fi fuziuni. deoarece este mai rapidă şi mai puţin costisitoare. 32 . în mod specific sau randomic. terţiară şi cuaternară. Corpii de incluziune oferă posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii denaturante. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară. atunci se va recurge la clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-traducere este un avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte să se cunoască rolul grupărilor care sunt adăugate după sinteză. Cel mai important aspect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a proteinei şi nu structura ei secundară sau terţiară. secundară. Cauzele neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Există cazuri când acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este tehnica la care se apelează cel mai des. În unele cazuri proteinele adoptă structura secundară independent după sinteză. care apoi facilitează detecţia lor. O altă problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza apartenenţei genei sau pe baza analizei structurii primare. a. Un alt dezavantaj (deşi în unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificărilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacteriene. Exprimarea genelor şi sinteza proteinelor în celulele procariote asigură doar structura primară exactă a polipeptidului sintetizat. Proteinele denaturate purificate în acest mod pot fi utilizate pentru imunizarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente. În acest fel proteina recombinată nu va fi modificată şi se va putea deduce rolul acestor grupări în activitatea proteinei. Un exemplu în acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări conformaţionale dar şi modificări post-traducere cum ar fi fosforilări.

Jasco. Germania Doua bai de apa cu agitare. 198-1000 nm. pentru cinetică enzimatică Electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă. (3%) 33 . Memmert. Germania “Thermocycler”.2ml şi plăci ELISA cu 96 de godeuri. CamSpec. Germania Centrifugă de masă Sigma 1-13. 70 litri.2ml. Consort. rotor 8x50ml şi rotor 4x250ml Fără răcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi. maximum 28000xg. electrod combinat prevăzut cu senzor de temperatură Congelare probe biologice la -82ºC Congelare probe biologice la -82ºC Domeniul de măsurare de la 0. 100 litri. Memmert. Belgia Şase instalaţii electroforeza acizi nucleici. Consort. Eppendorf. max.2ml la 1 litru. Snijders Scientific. de la 0. Australia Electroporator Eppendorf. Sanyo. Scaltec. interfaţă pentru calculator şi imprimantă Incubarea culturilor bacteriene şi a probelor moleculare de la temperatura camerei la 70ºC Incubarea probelor biologice pana la 100ºC. Elga-Lab Water. gradient de temperatură Transformarea celulelor electrocompetente – bacterii şi drojdii Interval de fotometrare. 32 probe Electroforeza orizontală în gel de agaroză.3. autocalibrare. Germania Două incubatoare bacteriologice. Japonia Patru instalaţii electroforeză proteine. 13000xg) Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0. 0.2 MΩ/cm (apa MilliQ) Centrifugarea probelor. rotor 6x30ml. răcire de la temperatura camerei la 0°C.5ml şi placi ELISA cu 96 de godeuri.1mg la 160g. rotor Eppendorf (24 tuburi). Marea Britanie Centrifugă cu răcire Sigma 3K18 (4 rotoare). Marea Britanie Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu termostatare. Marea Britanie Instalaţie de apă ultrapură. Corbett Research. gradient de temperatură în tub Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0. Consort. cu termostatare. 48 probe Masurarea pH-ului. Germania Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301. Germania Caracteristici Achiziţia şi interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamidă sau geluri de agaroză Purificarea apei până la o rezistivitate de 18. Belgia pH-metru P901 (două bucăţi). Germania “Thermocycler”. rezoluţie 1 nm. Sigma. Olanda Două balanţe analitice. Sigma. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară Denumire echipament Instalaţie de preluare şi prelucrare a imaginilor Ced Limited. Belgia Congelator temperaturi foarte scăzute. max. 198-1000 nm. rezoluţie 1 nm Interval de fotometrare. Japonia Congelator temperaturi foarte scăzute.

New York: W. Berk A. An Introduction to Genetic Analysis. Lewontin R. Tymoczko J.. Amplificarea ADN-ului în timp real. Patten C. 8.. Glover D. ASM Press. filtru bacteriologic HEPA.. 2d edition.. gradient binar de înaltă presiune şi gradient cuaternar de joasă presiune Microscop inversat NIKON Studiul preparatelor celulare şi tisulare în lumina normaEclipse TE2000S. Nikon. SUA laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis System laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi Instalaţie Real Time PCR. 5th edition. New York: W. and Lewontin R.. detecţia simultană a 4 fluorocromi Separarea probelor prin cromatografie de înaltă perforInstalaţie HPLC. and Robertson D. Applied Biosystems.. Miller J. Lewis J.. Griffiths A. Freeman Company. H. 4th edition. DNA Cloning: A Practical Approach: Expression Systems (The Practical Approach Series).. Spania re. (2002)..L. contrast de fază şi fluorescenţă nia Autoclav 80l. Pasternak J. soft-uri speciale pentru secvenţiere şi genotipare. Australia Secvenţierea fragmentelor de ADN..C.3 Hota flux laminar biohazard µm 99. Dezintegrarea celulelor bacteriene. mateAutoclav AE-75-DRY Raypa.Bibliografie 1. 9. Corbett Research.M.. 6... flux de aer 100. Berg J. H... Freeman Company. ţesuturilor animale şi Sonics & Materials vegetale în volume de la 1ml până la 1 litru Hota PCR cu flux laminar Flux laminar vertical.C. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA.. and Walter P. Modern Genetic Analysis. Biochemistry. Japolă.. 4th edition.M. (2005).. 5th edition New York: W.L. (1999). 4th edition. Brown T. Matsudaira P..T. Hames B. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction... Miller J.. Gelbart W. Darnell J.. preparare probe PCR (4% Filtru exahustare HEPA (0. Molecular Cell Biology. electroforeza capilară la 15kV. prefiltru reciclabil (3-30 µm)..M.... H. (2006). Telstar. Johnson A.. Oxford University Press. (1995). rialelor şi instrumentelor Spania Ultrasonicator cu patru sonde.. Lodish H. 2nd Edition. and Stryer L. 7th edition. H. Glick B. Freeman Company. Roberts K.D.. (2002).97%). Griffiths A. 2. Coreea de Sud reglabil în 9 trepte (0. Spania Sterilizarea umedă sau uscată a mediilor de cultură. Suzuki D. identificare umană şi determinarea polimorfismelor genetice. Zipursky L.. Selecta. Alberts B. 4.Analizor Genetic ABI Prism 310.3 um 99. Molecular Biology of the Cell.R. 34 . and Gelbart W. 5.97%). (2000). Wiley-Blackwell Publishing. Freeman Company. New York: W.35-0. 4. New York: Garland Science. 3. Manipulation and Expression of Recombinant DNA. Baltimore D. (2009). 7. Raff M. Academic Press.J.. Carson S. Jasco. filtru HEPA (0.5 m/s).M.A. Japonia manţă. iluminasteril. (2000).

M.J. Editura Tehnică. 35 .. Watson J. PCR. (2007). Bucureşti..G. 13.. 1st edition. and.. H. 1 edition. W.A Short Course. Freeman Company. Basics: from Background to Bench. Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)). 1990. (2006). Metzenberg S. Mǿller S. 11.A. 3rd Edition. Taylor & Francis. Popescu O.. Witkowski J. 12. Recombinant DNA: Genes and Genomes .10. Electroforeza proteinelor în geluri de poliacrilamidă...A.D. McPherson M. (2000). Caudy A.. Springer-Verlag Telos. Myers R.

........... care nu se pot obţine prin fermentare directă sau prin extracţie....... 57 3. • cantităţile produse şi concentraţiile sunt mai mari... • se pot obţine derivaţi ai aminoacizilor sau aminoacizi rari.. pH. Bibliografie ... • necesită condiţii blânde de temperatură.......... • se pot sintetiza D-izomeri................. care nu se găsesc în natură...... din cauza costurilor prea mari a substratelor...... 60 1..... enzimele nu se purificau şi se folosea lizatul celular ce conţinea enzime specifice......... Metoda enzimatică de sinteză a acizilor aminaţi.... Sinteza enzimatică continuă prin imobilizarea enzimelor a fost aplicată în producerea L-tirozinei cu β-tirozinază şi a triptofanului cu triptofanază........... pentru producerea acizilor aminaţi pe cale enzimatică.. care nu se aplică la scară industrială la fel ca în fermentarea directă.. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor .. se foloseau enzime nerecombinate produse de microorganisme. şi de derivaţi ai acizilor aminaţi..................... Iulia Lupan Cuprins 1..... Metoda enzimatică de sinteză a acizilor aminaţi Un număr mare de aminoacizi se pot obţine prin sinteză enzimatică...... dr............ Imobilizarea enzimelor în sintezele enzimatice prezintă două avantaje importante şi anume reutilizarea multiplă a enzimelor costisitoare şi recuperarea substratelor rămase........... Această metodă capătă o amploare mai mare pe an ce trece datorită cererii mari de aminoacizi. O sursă de triptofanază 36 ... Totuşi metoda enzimatică prezintă unele avantaje faţă de alte metode. Pentru a reduce costul sintezelor..... 36 2....... presiune.....Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare Asist........ La început.. folosite în exces...... • sintezele sunt uşor de manipulat.... pornind de la indol.... fiind stimulată sinteza lor prin diverse metode............... deoarece: • izomerii optici ai aminoacizilor se pot obţine direct din substratele corespunzătoare............... univ...... piruvat şi săruri de amoniu...

. iar ionul formiat pentru reacţia de regenerare a NADH [Oshima şi colab. Producerea acidului aspartic la scară industrială s-a realizat enzimatic pornind de la fumarat şi săruri de amoniu şi utilizând aspartaza ca şi catalizator [Chibata şi colab. 1990]. Acest impediment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate. Honorat-Pascal şi colab. În strategia de sinteză s-au utilizat enzime provenite de la un singur microorganism şi anume Bacillus megaterium. costisitori în sintezele enzimatice. Mediul de sinteză mai conţine formiat de amoniu..coli. 1988. 37 .. Utilizarea enzimelor de la microorganismele termofile prezintă avantajul că au o stabilitate mai mare. Sinteza continuă a fost realizată prin încorporarea enzimelor în gel de poliacrilamidă. 1973]. Producerea continuă de L-valină folosind valin dehidrogenaza şi glucozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiată detailat [Monot şi colab.poate fi lizatul brut de E . NADPH). Tosa şi colab. Astfel. cu glucozo dehidrogenază pentru regenerarea NADH. Utilizarea de cofactori (NADH. 1981. 1979. 1985] şi formiat dehidrogenaza de la Candida boidinii. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate în sinteza acidului aspartic [Fusee şi colab.. 1984]. în care se utilizează enzime pentru regenerarea cofactorilor. 1988]. la care s-a indus sinteza acestei enzime. Aceeaşi metodă de imobilizare a fost folosită şi în sinteza alaninei cu celule de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat β-carboxilazei [Fusee şi Weber. nu permite extinderea sintezelor la scară industrială. Sistemul multienzimatic a fost utilizat şi în sinteza L-leucinei din α-cetoisocaproat. 1976]. pentru regenerarea NADH [Schütte şi colab. S-a testat eficienţa sintezelor în cazul folosirii lizatelor şi a enzimelor purificate. [1990] au sintetizat L-alanina şi L-valina folosind sistemul cuplat de alanin dehidrogenază. 3-fluoroalanina s-a obţinut din 3-fluoropiruvat. reacţie catalizată de alanin dehidrogenază într-un sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. în cazul folosirii lizatului brut până la 92%.... în cazul folosirii fracţiunilor purificate. 1974]... Honorat şi col. respectiv valin dehidrogenază. Numai în cazul sintezei alaninei s-a evidenţiat o creştere a randamentului sintezei de la 80%. Imobilizarea asigură sinteza continuă a aminoacizilor şi reciclarea amoniului şi piruvatului neutilizate. Fukui şi colab. Celule imobilizate de E. 1976]. folosite în exces [Deconttignies-Le Maréchal şi colab.. ionul de amoniu fiind necesar în reacţia de sinteză a aminoacidului. utilizând leucin dehidrogenază de la Bacillus stearothermophilus [Oshima şi colab.

1. leucin dehidrogenaza (LeuDH). valin. care include fenilalanin dehidrogenaza (PheDH). 1998]. această caracteristică fiind foarte importantă pentru industria farmaceutică. enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri. alanin dehidrogenazele şi suprafamilia de aminoacid dehidrogenaze au evoluat separat [Baker şi colab.şi glutamat dehidrogenaza). alanin-. care pot să monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma sanguină.1) catalizează reversibil reacţia de dezaminare a L-alaninei cu formare de piruvat. Nu există asemănări semnificative între secvenţele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) şi membrii acestei familii de aminoacid dehidrogenaze. 1.Aminoacid dehidrogenaze Aminoacid dehidrogenazele (EC 1. Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au importanţă industrială (fenilalanin-. 1994].. Aceste enzime catalizează eliminarea grupării amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunzători.1.X) sunt enzime care fac parte din familia oxidoreductazelor.4. caracteristic în unele patologii. 38 .. Aceste enzime au întrebuinţare şi în sinteza industrială de aminoacizi. Enzima are un rol important în furnizarea energiei necesare germinării sporilor. leucin-. Ele au fost folosite la construirea biosenzorilor.. S-a demonstrat că în lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificultăţi [Siranosian şi colab. care este comun pentru toate aceste enzime. Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate în vederea utilizării lor în diverse ramuri industriale.4. Deoarece ele acţionează stereospecific. în prezenţă de NAD(P)+. Alanin dehidrogenaza Aminarea reductivă a cetoacizilor la L-aminoacizi în procese NAD(P)H-dependente este catalizată de o suprafamilie de enzime omoloage de aminoacid dehidrogenaze. Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductază NAD+ dependentă. cu excepţia domeniului de legare a cofactorului. dar există şi câteva enzime care reacţionează şi cu aminoacizii β. Aminoacid + NAD+ + H2O ↔ α-cetoacid + NADH + H+ + NH3 Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru α-aminoacizi. Această enzimă a fost purificată şi studiată în principal la mai multe specii din genul Bacillus. valin dehidrogenaza (ValDH) şi glutamat dehidrogenaza (GluDH). Deşi realizează unul şi acelaşi proces biologic. L-alanina + NAD+ + H2O ↔ piruvat + NADH + H+ + NH3 Alanin dehidrogenaza a fost descrisă de către Wiame şi Piérard în 1955 [Norbert şi colab.

B. stabile şi la alţi factori care afectează proteinele. mediu acid sau alcalin. 1997]. [Nagata şi colab. Această 39 . cât şi 3-hidroxipiruvatul. 1989]. Una din aceste enzime este cea de la B.. coli.4.1. subtilis. subtilis este esenţială în cataliză şi este conservată şi la alte alanin dehidrogenaze.. Thermus. O mare atenţie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la microorganisme mezotermofile. stearothermophilus. solvenţi organici.. Diferenţele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. sphaericus. NAD+ se leagă înaintea piruvatului în reacţia de dezaminare oxidativă. cereus. dar care nu este specifică altor aminoacid dehidrogenaze.1993]. B. Leucina + NAD+ + H2O ↔ α-cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+ Echilbrul reacţiei este deplasat spre formarea aminoacidului. Alanin dehidrogenaza este o enzimă oligomerică. 1994]. prin denaturare termică. 1989].. Aspartat amoniu-liaza L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4. Mycobacterium. detergenţi. Enzima nu-şi pierde activitatea după incubare timp de 30 min la 70ºC [Oka şi colab. Enzimele termostabile nu prezintă numai avantajul termostabilităţii. deoarece sunt mai stabile. AlaDH poate utiliza ca substrate în reacţia de aminare atât piruvatul. cu ultimul reacţia fiind mult mai lentă.. Aminoacizii din vecinătatea acestei lizine prezintă o regiune conservată.3. [Delforge şi colab. stearothermophilus. iar proteina exprimată în celule de E. LeuDH intervine în catabolismul unor aminoacizi. Lizina din poziţia 74 din secvenţa de aminoacizi a AlaDH de la B. a cărei genă codificatoare a fost clonată. Majoritatea enzimelor studiate sunt hexameri. Această enzimă poate fi foarte utilă în sinteza de L-serină din 3-hidroxipiruvat [Nagata şi colab. Ca şi majoritatea aminoacid dehidrogenazelor.9) (LeuDH) este o oxidoreductază NAD+-dependentă. Leucin dehidrogenaza Leucin dehidrogenaza (EC 1. cum ar fi enzime proteolitice. în general. Alanin dehidrogenaza este o enzimă NAD+ dependentă. 2003]. 1988]. care catalizează reversibil dezaminarea L-leucinei şi a unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunzători. B. cum ar fi cele de la B. coli şi proteina recombinată de LeuDH permit purificarea acesteia într-o singură etapă. Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh şi colab. Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus sp DSPM730 care reacţionează în egală măsură cu ambele substrate. Mecanismele cinetice ale AlaDH au fost studiate la mai multe specii.1.. fiind.1) catalizează reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat şi NH4+. iar NADH în reacţia de aminare. Leucin dehidrogenazele studiate provin în mare parte de la genul Bacillus precum şi de la Thermoactinomyces [Ohshima şi colab. Anabaena.

glucoz dehidrogenaza de la Bacillus subtilis şi aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin metoda PCR utilizând amorse specifice. alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis. alanin dehidrogenaza şi aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). de circa 50 kDa. Produşii de digestie (produşii PCR şi vectorii) au fost separaţi cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. În secvenţa amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricţie necesare inserării genei în vectorul de exprimare. Enzima este activată în prezenţă de ioni de Mg2+ la un pH alcalin. Vectorii de exprimare au fost digeraţi cu aceleaşi enzime de restricţie. care are proprietatea de a 40 . Metode Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codifică leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus.enzimă joacă un rol important în metabolsimul azotului la bacterii. Acest vector oferă posibilitatea exprimării genelor la inducere cu IPTG. 1991]. la pH mai mic ea nu necesită ioni de metal [Karsten şi Viola. Pentru clonarea genelor ce codifică leucin dehidrogenaza. Pentru inserarea genelor în vectori s-a utilizat ADN ligaza. Produşii PCR au fost purificaţi din gel şi digeraţi cu enzimele de restricţie corespunzătoare (Tabel 1). Majoritatea aspartazelor studiate au masa moleculară în jur de 200 kDa şi sunt alcătuite din patru monomeri identici. Enzima AlaDH Q08352 LeuDH P13154 ALL (P0AC38) Amorsele utilizate 5΄-GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3΄ 5΄-GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3΄ 5΄-GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3’ 5΄-TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3΄ 5' –GGTAGGATCCGATGTCAAACAACATTCGTATCG– 3' 5' –GCTACTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA– 3' Escherichia coli Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus Organism sursă Enzime de restricţie BamHI XhoI BamHI XhoI NdeI BamHI NdeI BamHI NdeI BamHI Vector utilizat pET21b pET21b pET21b 5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3' GalM Escherichia coli (P0A9C3) 5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3' GlucDH P12310 5΄-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3΄ 5΄-CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3΄ Bacillus subtilis pET24a pET24a Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroză. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor. Tabelul 1.

Pereţii celulelor bacteriene au fost distruse prin sonicare. Moleculele recombinate rezultate după ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare în tulpina de Escherchia coli DH5α. După sonicare extractul bacterian a fost centrifugat (20 min la 21 000 ×g la 4°C). AlaDH 1 2 3 94 67 43 LeuDH 1 2 3 AAL 1 94→ 67→ 43→ ←54 2 ← ← 42→ ← ← ← ← 94 67 43 → → → → → ← 42 30 20. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare bacteriene.1 Figura 1. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportată la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene. coli a fost urmărită cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă în condiţii denaturante în prezenţă de SDS (Figura 1). Pentru obţinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0.1 14. moleculele corect recombinate au fost introduse prin transformare în tulpina de Escherichia coli BL21(DE3).4→ 30 20.1 (Applied Biosystems). Sinteza de proteine recombinate în celulele gazdă de E. s-a indus exprimarea genelor cu izopropil-β D-tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM.0 50 mM. Analiza exprimării genelor şi sintezei de proteine recombinate în celulele de E.reface legăturile fosfoesterice. Secvenţele genelor clonate au fost verificate prin secvenţializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utilizând kitul de secvenţializare BigDye Terminator v3. Celulele bacteriene au fost preluate în tampon Tris HCl pH=8. preum şi masele moleculare ale proteinelor recombinate. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri şi timp suplimentar. După câteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate şi păstrate la -80°C până la utilizare. 41 .1→ 14.5-1L).4 30→ 20. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular. coli. iar orice proces biotehnologic este cu atât mai valoros cu cât implică mai puţine costuri. Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor. După ce densitatea optică (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1. iar supernatantul cu proteinele solubile a fost utilizat pentru măsurarea activităţii enzimatice.

care are un coeficient molar de extincţie la aceasă lungime de undă egal cu 2. glicocol 50 mM pH 10. L-alanină 10 mM. L-leucină 10 mM.5. NAD 2 mM. astfel încât valorile DO/min să fie cuprinse între 0. Tris HCl 50 mM pH8. GDH 1 U e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM. NAD 2 mM. Tris HCl 50 mM pH 8. Tris HCl 50 mM pH 8. Tris HCl 50 mM pH 8. Tris HCl 50 mM pH 8.0 d) GalM (galacto mutarotaza): glucoză 10 mM. Mediile de reacţie pentru enzime au fost următoarele: a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM. Pentru măsurarea activităţii enzimatice s-au folosit câţiva µl de enzimă purificată sau extract brut bacterian. glicocol 50 mM pH 10. S-a ales porţiunea dreptei cu activitatea cea mai mare.05 şi 0.15 mM.0 în reacţia de aminare. La această lungime de undă NADH prezintă maximul de absorbanţă şi are un coeficient molar de extincţie de 6. NH4Cl 1 M. Tris HCl 50 mM pH 8. NADH 0.0.Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor Măsurătorile de activitate enzimatică a dehidrogenazelor s-au efectuat la 30ºC cu un spectrofotometru Jasco V-530 urmărindu-se scăderea absorbanţei NADH (reacţia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestuia (reacţia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. MgCl2 6 mM Pentru măsurarea activităţii enzimatice a aspartzei s-a urmărit formarea acidului fumaric la 240 nm. Activitatea enzimatică s-a calculat după formula: A=[(DO/min)/6.15 mM.54 ·103 ·M-1 ·cm-1.22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min – variaţia densităţii optice pe minut la 340 nm Vr – volumul reacţiei Vp – volumul probei FD – factorul de diluţie O unitate enzimatică (1U) corespunde formării unui µmol de produs într-un minut. NADH 0. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N Mediul de reacţie pentru sintezele de aminoacizi marcaţi cu 15N a conţinut: 42 .0 în reacţia de aminare. NADH 0.5 în reacţia de dezaminare b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM.0 f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM.15 mM. NAD 2 mM.3. NAD 2 mM.5 în reacţia de dezaminare c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoză 10 mM. NH4Cl 1 M.22 ·103 ·M-1 ·cm-1.

Sintezele au fost oprite prin denaturarea termică a enzimelor.• cetoacid 100 mM • 15NH4Cl 100 mM • NADH 1 mM • glucoză 670 mM Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8.4 1. S-a măsurat absorbanţa la 623 nm. Sintezele de aminoacizi marcaţi au fost efectuate la 30ºC cu urmărirea pH-lui şi agitare. Ca martor a servit amestecul de sinteză fără clorură de amoniu (din care cauză se adăuga la sfârşit). Amestecul de sinteză filtrat s-a încărcat pe coloană şi apoi s-a spălat cu apă (10 volume).8 0. a fenolnitroprusiatului şi a cloraminei. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionină.2 0 0 20 40 60 80 100 120 DO 623nm NH Cl (% ) 4 Figura 2. Probele s-au preparat după următoarea procedură: 10 µl de probă diluată de 20 ori. Această metodă constă în formarea unui compus de culoare. la interacţiunea ionului de amoniu. În Figura 2 este prezentată curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionină. după care s-a spălat până la un pH neutru. Înainte de declanşarea sintezelor s-a preluat o probă care a servit la alcătuirea unei curbe etalon. 200 µl de fenolnitroprusiat. Controlul eluării s-a făcut cu ninhidrină pentru aminoacizi. Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH 1M. Activarea umpluturii s-a făcut prin tratare cu HCl 2N. Reacţia s-a declanşat prin adăugarea enzimelor. Pe baza curbelor etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rămas în mediul de sinteză.99935 1. 200 µl de hipoclorit de sodiu şi 590 µl apă.068852 + 0. Fracţiunea cu aminoacid s-a concentrat pe 43 . Pe parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot.0 cu NaOH. timp de 15 min la 85ºC. Developarea culorii s-a făcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100ºC.013334x R= 0.2 1 0. Purificarea aminoacizilor sintetizaţi Aminoacizii sintetizaţi au fost purificaţi pe o coloană cu răşină schimbătoare de ioni Dowex 50W x 8. y = 0.4 0. în forma H+.6 0.

iar precipitatul obţinut s-a filtrat şi uscat. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze chimice şi enzimatice. după care s-a precipitat cu etanol absolut. În continuare. Precipitarea s-a lăsat peste noapte. datorită substituentului terţ-butil voluminos.5-1 mg de probă. Derivatizarea s-a făcut pe cantitaţi de probă de ordinul 0. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fiecărui aminoacid. cum se întâmplă în cazul derivatizării cu grupări trimetilsilil. cu hidrogen ca şi gaz purtător şi cu temperatură programată între 55 şi 250ºC. Derivatizarea. s-a facut prin sililare. la amină se introduce o singură grupare silil. care trebuie facută la ambele funcţiuni polare ale moleculei de aminoacid. iar prin ruperea legăturii dintre carboxil şi atomul de carbon alfa. Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă Pentru analiza calitativă prin metoda spectrometriei de masă a aminoacizilor este necesară o derivatizare a produsului de reacţie. reactivul având şi un conţinut de 1% terţ-butil-dimetil-clorsilan. utilizând metoda Das Neves şi Vasconcelos. randamente scăzute datorită mai multor etape de sinteză. Separarea gaz-cromatografică a produşilor de sinteză sub formă de TBDMS-derivaţi s-a făcut pe o coloană capilară cu fază staţionară DB5 de 30 m lungime. adiacent. la 120ºC timp de 20 minute. cum ar fi consumul unei cantităţi mari de amoniac. M-57 şi M-85. În primele etape de marcare a acizilor aminaţi cu izotopi stabili s-au folosit metode de sinteză chimică. în calitate de catalizator. aminoacizii astfel obţinuţi au fost supuşi determinării structurii. Prin ruperea în diferite poziţii din gruparea tert-butildimetilsilil se formează ioni cu masele M-43. iar spectrele s-au înregistrat cu un spectrometru de masă cuadrupolar HP 5985. ia naştere un fragment cu masa M-159. cu 150 µl de acetonitril ca solvent şi 50 µl reactiv MTBSTFA. care introduce la fiecare funcţiune polară din moleculă câte o grupare terţ-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul că. obţinerea racemicului. purităţii şi concentraţiei izotopice. Derivatizarea s-a făcut utilizând ca reactiv N-metil-N-(terţ-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) în calitate de donor al grupării silil.baia de apă. aminoacizii sub formă de TBDMS-derivaţi se produc în cea mai mare parte sub formă de ioni prin fragmentarea moleculelor. 44 . la carboxil şi amină. şi nu una sau două în mod statistic. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A. La ionizarea cu impact de electroni. Aceste metode prezintă un şir întreg de dezavantaje.

Această metodă prezintă dezavantajul manipulării laborioase a celulelor şi caracterul enantioselectiv scăzut al reacţiei. Pentru a evita acest fenomen există câteva căi de regenerare continuă a coenzimelor pe parcursul sintezelor: • regenerarea în vivo. care constă în oxidarea unui mediator şi transferul electronului la NAD(P)+. Schema de sinteză a aminocizilor marcaţi cu 15N utilizată în prezenta lucrare este reprezentată în Figura 3. 1989). marea majoritate provenind de la bacterii. O metodă relativ simplă şi mai utilizată pentru obţinerea de aminoacizi marcaţi cu 15N este sinteza enzimatică pornind de la cetoacizi şi săruri de amoniu (15N). 2000].Folosirea enzimelor în sinteze de aminoacizi marcaţi cu izotopi stabili prezintă mai multe avantaje faţă de metodele chimice. Sursele enzimelor utilizate în regenerarea coenzimelor sunt destul de variate. Un dezavantaj al metodei îl prezintă specificitatea şi viteza de regenerare reduse. cu utilizare de celule în creştere. datorită faptului că decurg stereoselectiv şi au randamente superioare. Majoritatea enzimelor utilizate în sinteza diverşilor compuşi necesită coenzime (NADH sau NADP). Sinteza de aminoa45 . Reacţiile de sinteză sunt cuplate cu reacţii de regenerare a cofactorilor costisitori. • regenerarea enzimatică în vitro. 15NH4Cl Cetoacid NADH AADH Acid gluconic GDH GalM β-glucoză -glucoză L-(15N)aminoacid NAD+ Figura 3.. • regenerarea electrochimică. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizată în regenerarea atât a NAD cât şi a NADP pentru producerea de hidromorfonă [Boonstra şi colab. AADH – aminoacid dehidrogenză Aminoacid dehidrogenazele catalizează reacţia de formare a aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl şi cetoacizii corespunzători. Modalitatea cea mai eficientă pentru regenerarea coenzimelor rămâne metoda enzimatică. Schema de sinteză a acizilor aminaţi cu 15N. Din cauza preţului mare a acestora utilizarea lor în cantităţi stoichiometrice nu este eficientă. cele mai utilizate enzime pentru regenerarea coenzimelor în sinteze fiind alcool dehidrogenaza şi formiat dehidrogenaza (Hummel şi Kula.

0. Purificarea acestora este o etapă suplimentară care. subtilis. Sinteza de [15N] L-Ala Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8. coli. Sinteza de [15N]-alanină. reprezintă aproximativ 50% din proteinele totale existente în lizatul bacterian. în general. constanta de inhibiţie calculată de noi Ki=4. NADH 1 mM. În unele sinteze s-a folosit galactozo-mutarotaza pentru transformarea α-glucozei în β-glucoză. Figura 4. exprimate în celule de E. GlucDH a servit la regenerarea NADH. cca 97 atom % 15N NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. DMTBS derivat. Reacţia s-a declanşat la adăugarea enzimelor (115 U de leucin dehidrogenază şi 60 U de glucozo-dehidrogenază). M = 318. la concentraţii mari de substrat activitatea enzimei este redusă. (B) Spectrul de masă al [15N]-Alaninei. Pe tot parcursul sintezei alaninei s-a urmărit consumarea clorurii de amoniu prin metoda Berthelot (Figura 4 A) care este o metodă colorimetrică foarte sensibilă de dozare a amoniacului. subtilis este inhibată de piruvat. Astfel. Sinteza de L-alanină marcată cu 15N s-a realizat pentru o cantitate de 8 mmol.cizi a fost cuplată cu reacţia catalizată de glucozo-dehidrogenaza (GlucDH) de la B. [1990] au testat sinteza de L-alanină şi L-valină cu enzime (alanin dehidrogenază şi valin dehidrogenază) purificate şi în lizat bacterian. O soluţie în acest 46 . Honorat şi colab. Acest fapt nu a influenţat randamentul sintezelor. 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-alanină. înainte de adăugarea enzimelor. utilizând ca substrat glucoza cu formare de acid gluconic. Mediul de reacţie utilizat a conţinut: piruvat de Na 150 mM. Enzimele utilizate în sintezele de aminoacizi marcaţi nu au fost purificate. glucoză 670 mM. Enzimele recombinate. (A) Consumul. nu conduce la mărirea randamentului reacţiei. Activitatea alanin dehidrogenazei din B.25 mM. După purificarea aminoacidului randamentul sintezei a fost de 60%. 15NH4Cl 130 mM.

Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-leucină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Tabelul 2. 302. O altă soluţie poate fi adăugarea piruvatului în mai multe etape. De aceste valori ale activităţii enzimatice s-a ţinut cont în sintezele de aminoacizi marcaţi cu izotopul stabil al 15N. În sintezele de aminoacizi la care enzima are o specificitate mai mică pentru precursorul acestora.6) 4. Enzima are cea mai mare specificitate de substrat pentru acidul α-cetoisovaleric. a fost necesară o cantitate mai mare de enzimă.5 (28) 36. Specificităţile de substrat ale leucin dehidrogenazei native din B. 232 şi 158. ceea ce demonstrează marcarea alaninei nu 15N (Figura 4 B). În cazul aminoacizilor mar47 .8) Activitatea enzimatică a fost determinată la 30°C în tampon Tris-HCl 50 mM. şi respectiv 200. stearothermophilus în prezenţa diferiţilor α-cetoacizi α-cetoacid Acid α-cetoisovaleric Acid α ceto-β-metilvaleric Acid α-cetoizocaproic Acid α-cetocaproic Acid α-ceto-γ-metiltiobutiric Acid α-cetobutiric LeuDH429 168 (100) 46. Activitatea specifică (U/mg de proteină) a LeuDH din B. Analiza spectrelor de masă a arătat prezenţa fragmentelor ion cu o unitate mai mult decât cele menţionate mai sus. 274.8 (22) 17. NH4Cl 1M şi NADH 0.4 (10) 7. stearothermophilus sunt prezentate în Tabelul 2. Masa moleculară a alaninei fără marcare izotopică este 317. În ambele cazuri este necesară o urmărire minuţioasă a consumului clorurii de amoniu.15 mM.8 (4. α-cetoacid 10 mM. 260. Masele fragmentelor ion ale alaninei cu conţinut izotopic natural sunt m/z 274. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 5 A).caz ar fi declanşarea reacţiei de sinteză cu cantităţi mai mari de enzimă. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale leucinei cu conţinut izotopic natural au valorile m/z 316.0. masa moleculară exactă pentru leucină fără marcare izotopică la azot este M=359. Între paranteze este exprimată activitatea procentuală considerând rezultatul obţinut cu acid α-cetoisovaleric ca 100%. Sinteza de [15N]-L-Leu Leucin dehidrogenazele au specificitate pentru un număr mai mare de cetoacizi. pH 8.7 (2. În cazul leucinei derivatizate cu două grupări silil.

Figura 5. raportul reactan48 . înainte de adăugarea enzimelor. Sinteza s-a declanşat cu 200 U de leucin dehidrogenază şi 125 U de glucozo-dehidrogenază. cca 97 atom % 15N NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. Sinteza s-a declanşat cu 205 U de leucin dehidrogenază şi 110 U de glucozo dehidrogenază.caţi cu 15N. înainte de adăugarea enzimelor. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto isovaleric:15NH4Cl )a fost de 1:1. cca 97 atom % 15N. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8. atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă (Figura 5 B). S-au realizat câteva sinteze. M = 346. Figura 6. (B) Spectrul de masă al [15N]-valinei. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-valină. DMTBS derivat. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).0 mmol. (B) Spectrul de masă al [15N]-Leucinei. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. Sinteza de [15N]-valină. M = 360. Sinteza de [15N]-L-Val Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-valină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode.2 mmol. DMTBS derivat. Sinteza de [15N]-leucină (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-leucină. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8.

0 12. 288.0 Randamentul sintezei (%) 79 86 92 Viteza de reacţie este. 292. după 10 min s-a consumat 50% clorură de amoniu. Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa valinei marcate cu 15N în produsul reacţiei enzimatice. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale metioninei fără marcare izotopică au valorile m/z 320. După purificarea aminoacidului s-a constatat un randament al sintezei de 94%. iar în cazul valinei marcate cu 15N.0 12.0 15NH 4Cl 3. Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul α-ceto-γ-metiltiobutiric este aproximativ 8 U/mg proteină. Din această cauză a fost nevoie de o cantitate mai mare de proteină. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 7 A). În continuare viteza reacţiei a scăzut. Pentru consumarea celorlalte 20% NH4Cl au fost necesare 100 min. În cazul metioninei marcate cu 15N. Sinteza de [15N]-L-Met Mediul de reacţie pentru sinteza de 15N-metionină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Masa moleculară a metioninei derivatizată cu două grupări silil este de 377. Scăderea vitezei de reacţie se poate explica prin scăderea concentraţiei substratelor. viteza reacţiei fiind direct proporţională cu concentraţia de substrat până la anumite valori. Sinteze de [15N]-L-valină Reactanţi (mmol) Acid cetoisovaleric 3.ţilor şi randamentele sintezelor sunt prezentate în Tabelul 3. acumularea de produşi de sinteză care pot inhiba activitatea enzimelor. şi deci şi consumul de clorură de amoniu este foarte mare în primele minute de sinteză. atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă. Spectrul de masă al valinei marcate isotopic este prezentat în Figura 6 B. Cel mai mare randament s-a constatat în cazul sintezei de 12 mmol.0 8. Astfel. masa moleculară exactă pentru valina fără marcare izotopică la azot este M=345 . atât masa moleculară cât şi 49 . Viteza reacţiei a scăzut foarte mult după primele 10 min când s-au consumat 50% din substrate (Figura 7 A). În cazul valinei derivatizate cu două grupări silil. Masele caracteristice ale ionilor fragment a valinei cu conţinut izotopic natural au valorile m/z 302.0 8. Viteza a scăzut mult după încă 10 min (în primele 20 min ale sintezei s-au consumat 80% clorură de amoniu). şi 218. 260 şi respective 186. Tabelul 3.

(B) Spectrul de masă al [15N]-metioninei.masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă. cca 97 atom % 15N Sinteza de [15N]-L-NorLeu Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-norleucină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Sinteza de [15N]-metionină. M = 378. Sinteza de [15N]-norleucină. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5. M = 360. DMTBS derivat. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero.7 mmol. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto caproic:15NH4Cl )a fost de 1:1.8 mmol. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto-γ-metiltiobutiric:15NH4Cl )a fost de 1:1. % 50 40 30 20 10 0 4 40 57 75 147 133 275 303 15 20 346 0 50 100 150 200 m/z 250 300 350 400 0 0 5 10 20 min 30 70 90 120 Figura 8. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-norleucină. înainte de adăugarea enzimelor. Figura 7. (B) Spectrul de masă al [15N]-norleucinei. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-metionină. cca 97 atom % 15N 50 . Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 4. Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa metioninei marcate cu 15N în produsul sintezei enzimatice. înainte de adăugarea enzimelor. Sinteza s-a declanşat cu 200 U de leucin dehidrogenază şi 125 U de glucozo dehidrogenază. Spectrul de masă al metioninei marcate isotopic este prezentat în Figura 7 B. 100 A 100 90 80 70 60 73 201 B 80 NH Cl (%) 60 I. DMTBS derivat. Sinteza s-a declanşat cu 106 U de leucin dehidrogenază şi 86 U de glucozo dehidrogenază şi 39 U de galacto mutarotază.

Masele fragmentelor ion ale norleucinei cu conţinut izotopic natural sunt sunt m/z 316. ceea ce demonstrează marcarea norleucinei nu 15N (Figura 8 B). Sinteza de [15N]-L-Norval Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-norvalină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto butiric:15NH4Cl)a fost de 1:1. cca 97 atom % 15N 51 .8% din activitatea pentru acidul cetoisovaleric). Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 9 A). Sinteze de [15N]-L-norleucină Reactanţi (mmol) Acid cetocaproic 2.03 mmol.0 4. ceea ce constituie 2. Tabelul 4. M = 346.7 15NH 4Cl Randamentul sintezei (%) 78 78 2. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8. înainte de adăugarea enzimelor.Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetocaproic este relativ mică (17.7 U/mg proteină.7 Masa moleculară a norleucinei fără marcare izotopică este 359. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. % 60 50 40 261 147 57 133 303 331 0 50 100 150 200 250 300 350 289 15 40 30 20 20 10 0 0 0 5 15 30 m in 60 90 120 m/z Figura 9. 302. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-norvalină. Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetobutiric este cea mai mică dintre substratele analizate (4.0 4. Sinteza s-a declanşat cu 310 U de leucin dehidrogenază şi 204 U de glucozo dehidrogenază. 274 şi 200. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 8 A). Sinteza de [15N]-norvalină. Raportul reactanţilor şi randamentele sintezelor sunt prezentate în Tabelul 4. DMTBS derivat. 100 A 100 90 80 187 73 B 80 NH4Cl (%) 70 60 I. (B) Spectrul de masă al [15N]-norvalinei. Analiza spectrelor de masă a arătat prezenţa fragmentelor ion cu o unitate mai mult decât cele mai menţionate mai sus.4 U/mg proteină).

Masele caracteristice ale ionilor fragment ale valinei cu conţinut izotopic natural au valorile m/z 302. 260 şi 186.27 mmol. atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă. masa moleculară exactă pentru izoleucină fără marcare izotopică la azot este M=359. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero. este M=345. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5. 52 .5 U/mg proteină) este mai mare decât pentru acidul cetoisocaproic (36. M = 360. ceea ce demonstrează marcarea izoleucinei cu 15N (Figura 10 B). înainte de adăugarea enzimelor. A 100 80 NH Cl (%) 100 90 80 70 60 201 73 B I. atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă. Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa valinei marcate cu 15N în produsul reacţiei enzimatice. Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul α-ceto-β-metilvaleric (46. şi respectiv 200. 288. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-isoleucină. 274. Sinteza de [15N]-isoleucină.8 U/mg proteină). (B) Spectrul de masă al [15N]-izoleucinei. DMTBS derivat. 302. Sinteza de [15N]-L-Ile Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-izoleucină s-a realizat cu reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. În cazul aminoacizilor marcaţi cu 15N. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale izoleucinei cu conţinut izotopic natural au valorile m/z 316. masa moleculară exactă pentru norvalină fără marcare izotopică la azot. cca 97 atom % 15N În cazul izoleucinei derivatizate cu două grupări silil. Spectrul de masă al norvalinei marcate isotopic este prezentat în Figura 9 B. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 10). iar în cazul norvalinei marcate cu 15N . % 60 4 50 40 15 303 57 75 147 133 275 40 30 20 20 10 0 0 0 5 10 20 40 min 60 90 120 345 50 100 150 200 250 300 350 400 0 m/z Figura 10.În cazul norvalinei derivatizate cu două grupări silil. Masele fragmentelor ion obţinute prin spectrometrie de masă sunt mai mari cu o unitate. Sinteza s-a declanşat cu 290 U de leucin dehidrogenază şi 221 U de glucozo dehidrogenază.

251 0.Media celor 4 măsurători au indicat o valoare a Keq = 3.Asp NH4Cl Fumarat L.749 10. În cazul reacţiilor reversibile nu se consumă tot substratul şi ca rezultat randamentul sintezelor scade.0 10.69 mM (sau 3.477 0. care este deplasat spre formarea de acid aspartic. diverse concentraţii de acid aspartic şi NH4Cl.432 3. Sinteza de acid aspartic s-a realizat la temperatura camerei. care este proporţională cu concentraţia de acid fumaric format (εmM = 2.352 0. MgCl2 6mM.523 10.Sinteza de acid L-aspartic Aspartaza este folosită cu succes în sinteza de acid aspartic din acid fumaric şi clorură de amoniu. 1976].0 0 0.. Determinarea constantei de echilibru (Keq = [NH3] [acid fumaric] / [acid aspartic]) a reacţiei catalizate de aspartaza din E..251 3.477 3. Celule imobilizate de E. Producerea acidului aspartic la scară industrială s-a realizat enzimatic din fumarat şi săruri de amoniu utilizând aspartaza ca şi catalizator [Chibata şi colab.0 0 1. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de acid fumaric prin citirea absorbanţei la 240 nm (Figura 11 A). Reacţia de sinteză s-a oprit prin denaturarea termică a enzimei. Tabelul 5. Pentru a determina concentraţiile reactanţilor la care se stabileşte echilibrul reacţiei am făcut mai multe determinări ale constantei de echilibru. Dozarea activităţii enzimatice a aspartazei s-a făcut de asemenea la temperatura camerei.70 Mediul de reacţie conţine la un volum de 1 ml următorii reactivi: tampon Tris-HCl 50 mM (pH 8. metoda fiind foarte eficientă şi simplă.53).Asp NH4Cl Fumarat (mM) 1. Concentraţiile la echilibru de L-Asp şi NH4Cl se calculează din concentraţiile lor iniţiale şi concentraţia la echilibru de acid fumaric. Tosa şi colab. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost utilizate în sinteza acidului aspartic [Fusee şi colab.0 10. Reacţia de formare a acidului aspartic din fumarat este reversibilă.28 2.0 0 3. între cei doi reactanţi (fumarat şi acid aspartic) se stabileşte un echilibru. La echilibru nu se mai observă nici o variaţie de extincţie.5).69 x 10 –3 M). 53 .0 20. Se adaugă apoi 1 U de aspartază recombinată. 1981. 1973].35 4.566 30. iar la diferite intervale de timp se citeşte extincţia la 240 nm.648 20.352 4.0 40.0 0 1. iar acidul aspartic având o cerere mare pe piaţa de aminoacizi. Acid L-aspartic ↔ Acid fumaric + NH4+ După o anumită perioadă de timp. Rezultatele şi condiţiile acestor determinări sunt prezentate în Tabelul 5.43 2.434 0.. coli Concentraţia iniţială (mM) Concentraţia de echilibru (mM) Keq L. indicate în partea stângă a tabelului.

Spectrul de masă al acidului aspartic fără marcare izotopică este prezentat în Figura 11 B. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale acidului aspartic fără marcare izotopică au valorile m/z 432. Pentru sinteză am utilizat şi aspartază recombinată de la E. Reacţia s-a declanşat cu aspartază 2 U/ml. % 50 40 400 30 20 75 200 10 0 0 50 100 147 202 244 150 200 250 302 316 300 350 418 390 400 450 460 500 0 0 50 100 150 200 min 250 300 350 m/z Figura 11. 390 şi 316. DMTBS derivat. (A) Consumul de acid fumaric şi formarea de acid aspartic în cursul reacţiei de sinteză a acidului aspartic. fapt care explică şi costurile mari a acestora. După purificare s-a constat un randament de 70%. Acesta reprezintă cel mai mare impediment în utilizarea AADH în sinteza enzimatică a cetoacizilor.8 M.Fumarat mM Aspartat mM 1000 100 90 80 73 Fumarat/Aspartat (mM) 800 70 60 600 I. Aspartaza a servit la înlăturarea ionului de amoniu format în urma reacţiei 54 . Leucin dehidrogenaza de la B. Aminoacid dehidrogenazele (AADH) catalizează dezaminarea L-aminoacizilor cu formare de cetoacizi corespunzători. Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa acidului aspartic în produsul sintezei enzimatice. M = 457.5 cu NaOH. coli. 418. Reacţiile sunt reversibile. (B) Spectrul de masă al acidului aspartic. Până acum nu a fost descrisă o metodă enzimatică eficientă de producere a cetoacizilor. iar echilibrul este deplasat spre formarea de aminoacid. NH4Cl 0. Sinteza de acid aspartic. Masa moleculară a acidului aspartic derivatizat cu trei grupări silil este de 457. Sinteza de acid α-cetoisocaproic Sinteza chimică a cetoacizilor este dificil de realizat. coli. aproape de două ori mai mare decât enzima nativă. Acest fapt ne-a determinat să testăm o sinteză de acid cetoisocaproic (Figura 12). catalizată de aspartaza recombinată din E. Componenţa mediului de sinteză a fost: acid fumaric 1 M. stearothermophilus cu 9 aminoacizi lipsă la capătul C-terminal are o activitate specifică în reacţia de dezaminare a L-leucinei. fără marcare cu 15N. pH s-a ajustat la valoarea de 8.

L-leucină

NAD+ LeuDH358 NADH LDH

Lactat

Acid αcetoisocaproic NH4+

Piruvat

+
Fumarat AAL Acid aspartic

Figura 12. Schema de sinteză a acidului cetoisocaproic.

de dezaminare a L-leucinei. Reacţia catalizată de aspartază este şi ea reversibilă, dar în acest caz echilibrul reacţiei este deplasat spre formarea de acid aspartic, deci spre consumarea de NH4+. Pentru regenerarea coenzimei am utilizat lactat dehidrogenaza din muşchi de bovine. Un impediment care poate apărea pe parcursul sintezelor de acest gen (cu mai multe enzime) este reacţionarea enzimelor secundare cu produsul sintezei. Este cunoscută specificitatea strictă a aspartazei pentru acid aspartic, de aceea am testat numai activitatea LDH cu diferiţi cetoacizi (Tabelul 6). Surprinzător este faptul că, totuşi, unii cetoacizi sunt substrate pentru LDH. Pentru sinteza cetoacizilor ce servesc ca substrate şi pentru LDH trebuie căutate alte enzime pentru regenerarea coenzimei.
Tabelul 6. Activitatea LDH din muşchi de bovine (Boehringer) în prezenţa diferiţilor α-cetoacizi în raport cu substratul fiziologic (acid piruvic) α cetoacid Acid piruvic Acid hidroxipiruvic Acid fluoropiruvic Acid α cetobutiric Acid α cetocaproic Acid α cetovaleric Acid α ceto γ metiltiobutiric Acid α cetoizocaproic Acid α ceto β metilvaleric Activitate U/mg proteină 140 69 38 10 0,38 0,13, 0,02 0,00 0,00 % 100 49 27 7,1 0,27 0,093 0,014 0,00 0,00

Mediul de reacţie conţine în volumul final de 1 ml: tampon Tris–HCl 50 mM (pH 8,5), MgCl2 6 mM, NADH 0,15 mM, α-cetoacid 1 mM.

55

Sinteza de acid isocaproic s-a realizat pentru o cantitate de 5 mmol. Temperatura la care a fost efectuată sinteza a fost de 35ºC. Reacţiile au fost oprite prin denaturarea termică a enzimelor (15 min la 85ºC). Formarea acidului cetosiocaproic s-a urmărit prin consumarea piruvatului (Figura 13).
Piruvat mM cetoisocaproat mM 120

100 Piruvat/cetoisocaproat (mM)

80

60

40

20

0 0 50 100 min 150 200 250

Figura 13. Consumul de acid piruvic şi formarea de acid α-cetoisocaproic în cursul reacţiei de sinteză a acidului α-cetoisocaproic în sistemul cuplat LeuDH/AAL/LDH. Componenţa mediului de sinteză a fost: acid fumaric 150 mM, acid piruvic 120 mM, L-leucină 100 mM, NAD 1 mM, pH-ul s-a ajustat la valoarea de 8,5 cu NaOH. Reacţia s-a declanşat cu 2 U/ml aspartază, lactat dehidrogenază şi leucin dehidrogenază (LeuDH358).

Din amestecul de sinteză s-a purificat leucina rămasă după sinteză. Cantitatea de leucină recuperată a servit la calcularea randamentului sintezei, care a fost de 30%. Deşi randamentul este mic, sinteza este rentabilă din punctul de vedere al preţului reactanţilor, cei folosiţi sunt mai ieftini decât produsul final. În concluzie, tehnicile care utilizează ADN recombinat au aplicaţiile cele mai diverse în biotehnologie. Aplicarea lor cere însă expertize variate cum sunt: - calcularea randamentelor de reacţie pe baza echilibrelor termodinamice şi a parametrilor cinetici a enzimelor implicate, - utilizarea unor procedee rapide de purificare prin cristalizare sau cromatografie, dar nu în ultimul rând şi cunoaşterea pieţei internaţionale privind cererea şi oferta produselor. Piaţa moleculelor marcate cu 15N este redusă dar interesantă, considerând valoarea ridicată a acestor compuşi. Pentru comparaţie, 1 kg 56

de acid L-glutamic valorează în prezent ~1 €, în timp ce 1 g acid [15N]-L-glutamic valorează ~150 €

2. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor
Bionanotehnologiile moderne se inspiră din organizarea celulară a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca şi structurile vii, sunt alcătuite din componente de natură organică şi anorganică. Aceste structuri sunt speranţa pentru tratarea a numeroase cancere, existând în prezent deja aplicaţii ale nanoparticulelor în tratamentul unor cancere. Nanoparticulele sunt o speranţă nu numai pentru tratamentul numeroaselor boli, dar şi pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea nanoparticulelor în medicină este axa prioritară în aplicarea bionanotehnologiilor. Limitările bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza particule de aceleaşi dimensiuni cu aceeaşi suprafaţă, controlul organizării lor. Ţesuturile tari, cum ar fi ţesutul osos, cochiliile la moluşte, conţin una sau mai multe componente organice de natură proteică care controlează organizarea structurală . Aplicaţii ale bionanotehnologiilor Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevărată speranţă în diagnosticul şi tratamentul cancerelor. Au a fost utilzat timp de câteva decenii în diverse aplicaţii în medicină (implanturi dentare) datorită caractersticilor sale neutre. Nanoparticulele de Au au început să fie din ce în ce mai des utilizate în depistarea şi chiar tratamentul unor celule canceroase datorită faptului că acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici şi capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a acţiona asupra unor anumite tipuri de celule chiar în absenţa oricăror grupe funcţionalizate. NP-Au induc moartea celulară liniei de celule de carcinom pulmonar A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) şi BHK21 (celule juvenile din rinichi de hamster) (Patra şi col., 2007). Diagnostic Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura depistarea celulelor canceroase în faze incipiente ale bolii. Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate pentru depistarea celulelor canceroase (Conde şi col., 2010). NP-Au la care s-au ataşat oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate în acest scop 57

reprezentau un fragment din joncţiunea care rezultă în urma translocaţiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este translocat la un alt cromozom, în acest caz fragmentul de la cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Această translocaţie este cauza leucemiilor mieloide cronice şi care sunt cauzate de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 14).

Figura 14. Formarea cromozomului Philadelphia – translocaţia reciprocă între cromozomul 9 şi 22.

Produsul acestei gene este o proteină himeră cu activitate tirozin-kinazică. Metoda de detecţie cu ajutorul nanoparticulelor se bazează pe formarea de porţiuni hibride ADN:ARN (ADN sonda: ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor împiedica agregarea nanoparticulelor de Au odată cu creşterea concentraţiei de săruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular de cancer oferă avantaje faţă de metodele utilizate actual în diagnostic (FISH, transcrierea inversă a ARNm şi amplificarea prin PCR) prin faptul că este mai ieftină şi mai rapidă (~30 min) şi necesită cantităţi mici de ARNm (10 ng/μl). Diagnosticul timpuriu în asemenea cazuri este foarte important, în fazele ulterioare celulele canceroase devenind rezistente la chemoterapice. Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive în domeniul bionanotehnologic după descoperirea efectului lor antibactericid (Sondi şi Salopek-Sondi, 2004). Acest efect este unul de importanţă majoră datorită faptului că bacteriile capătă din ce în ce mai multă rezistenţă la antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influenţă nu numai asupra bacteriilor, dar şi asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la concentraţii non-toxice pentru celule inhibă replicarea virală (sinteza materialului genetic ai virusului) 58

atunci când nanoparticulele sunt administrate înainte de infectare sau imediat după (2-4 ore) aceasta (Speshock şi col., 2010). Unele substanţe chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor asupra proliferării celulare, angiogenezei şi rol antiinflamator. Un astfel de exemplu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care induce apoptoza (moartea celulară) în celule umane de melanom A375 şi G361 (Cabello şi col., 2009). DCPIP s-a dovedit a avea acţiune antiangiogeneză şi antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116. Efectul acestuia este mai intens dacă este încapsulat în particule de poliacizi (lactic şi glicolic). Concentraţiile de ≥6 μg/ml de colorant (DCPIP) induc moartea celulară prin apoptoză (Mondalek şi col., 2010). Nanobiotehnologiile urmăresc nu numai crearea de nano-vehicule pentru transportarea diferitor substanţe, dar şi crearea şi manipularea unor adevărate nano-motoare, utile în nanomanipulare celulară. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a cărei mişcări pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici şi chimici (Ristic şi col., 2009). Sisteme particulare capabile de transport ţintit şi eficient a diferitor substanţe, cu puţine efecte adverse, se datorează probabil endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide cationice şi polielectroliţi s-au dovedit a fi cărăuşi excelenţi pentru transportul amfotericinei B – un antifungicid pentru Candida albicans (Vieira şi Carmona-Ribeiro, 2008). Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul că HDL este numit “colesterolul bun” deoarece este implicat în transportul moleculelor hidrofobe (colesterol) în fluxul sangvin care este un mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una simplă, fiind alcătuit din fosfolipide şi apolipoproteină (apo). Cea mai abundentă formă de lipoproteină din plasma sanguină umană este apoA-I, care este alcătuită din 243 de aminoacizi, este bine caracterizată şi la incubarea cu vezicule de fosfolipide în vitro formează HDL revers, capabil de transportul moleculelor hidrofobe (Ryan, 2010). Fosfolipidele cele mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC (dimirisstoil-fosfatidil colina) şi DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol). Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasamblează ND-HDL. Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dacă nu este utilizată enzima integrală, ci numai fragmente de apolipoproteine (Weers şi col., 2001). ND-HDL reprezintă astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor transmembranare, transportul unor substanţe hidrofobe. 59

Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele transmembranare care îşi păstrează proprietăţile sale conformaţionale şi activitatea. Suprafaţa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300 nm2, o suprafaţă suficientă pentru integrarea câtorva molecule proteice. Avantajul utilizării acestor structuri comparativ cu miceliile de detergenţi, este că asigură un mediu natural apropiat, fără prezenţa detergenţilor care pot schimba conformaţiile proteinelor. ND-HDL au fost utilizate în studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar fi bacteriorodopsina (Bayburt ţi col., 2006; Blanchette şi col., 2008), citoromul p450 3A4 (Baas şi col., 2004), toxina antraxului (Katayama şi col., 2010), hidrogenaze enzime de membrană produse de Pyrococcus furiosus care pot sintetiza H2 (Baker şi col., 2009). ND-HDL au fost testate în utilizarea lor pentru transportul diferitor substanţe hidrofobe, care sunt insolubile în mediu sangvin hidrofil. Un exemplu în acest sens este transportul de către ND-HDL a amfotericinei B un potenţial antifungicid care inhibă creşterea Saccharomyces cerevisiae şi a altor fungi patogene, care administrat sub această formă nu mai este toxic la anumite concentraţii (Oda şi col., 2006). ND-HDL ce conţineau cucurmină (un polifenol hidrofob natural obţinut din Curcuma longa) au inhibat creşterea liniei celulare hepatice HepG2 comparativ cu administrarea curcuminei libere (Ghosh şi col., 2010). O altă aplicaţie a nanodiscurilor de HDL a fost încorporarea de lipide cu ioni bivalenţi de Ni2+, care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichetă de 6-His (histidine). Proteina din învelişul virusului West Nile (Fischer şi col., 2010)

3. Bibliografie
1. Baas B. J., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 în a nanoscale native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase în water-soluble nanolipoprotein particles, Journal of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561-67. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single bacteriorhodopsin trimers în bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22. Blanchette C. D., Cappuccio J. A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein

2.

3.

4.

5.

60

6.

7.

8. 9. 10.

11.

12. 13. 14.

15. 16.

17.

18.

19.

20. 21.

containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(3), 724-31. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T., (2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells entrapped în polyacrylamide gels. Methods în Enzymology, 44, 739-746. Conde J., de la Fuente J. M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold nanoprobes - application to cancer diagnostics, Journal of Nanobiotechnology, 8:5. Deconttignies-Le Maréchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J.,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized Escherichia coli cells. European Jornal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J., Remacle J., (1997). Identification of lysine 74 în pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry, 272, 2276-84. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. European Journal of Biochemistry, 184, 1-13. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and immobilized β-tyrosinase. European Journal of Applied Microbiology, 1, 25-39. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76. Fusee M., Weber J., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat β-decarboxylase activity and application to L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8), 3453-57.

61

22. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38. 23. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors în human colon cancer cells în vitro and în ovo by free and nanoparticle-encapsulated redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9. 24. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74. 25. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63. 26. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62. 27. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews în Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67. 28. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67. 29. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12. 30. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97. 31. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine production în a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18. 32. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry, 11, 307-11. 33. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 111–19 34. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of Nanobiotechnology, 7:3. 35. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28. 36. Schütte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii. European Journal of Biochemistry, 62, 151.

62

37. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation în Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175, 6789-96. 38. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and Interface Science, 275, 177–82. 39. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of Nanobiotechnology, 8:19. 40. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89. 41. Vieira D. B., and Carmona-Ribeiro A. M., (2008) Cationic nanoparticles for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and activity în vitro, Journal of Nanobiotechnology, 6:6. 42. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.

63

II. CULTURI CELULARE Culturi celulare
Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Cuprins
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale .................................................... 64 2. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu ............. 67 3. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente .................................................. 71 3.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ..................................................... 71 3.2. Strategii de lucru ............................................................................................ 74 3.3. Instruirea personalului ................................................................................... 75 3.4. Cultivarea celulelor ......................................................................................... 78 3.5. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora .......................................................................................... 78 3.6. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor .................................................................. 79 3.7. Subclonarea; tripsinizarea............................................................................... 81 4. Bibliografie ............................................................................................................. 81

1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale
Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat în diferite ştiinţe au revoluţionat felul în care acea ştiinţă a fost percepută ulterior. Culturile celulare sunt un asemenea exemplu în biologie. Introducerea acestei tehnici în urmă cu aproximativ 100 de ani a permis practic importul naturii în laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor şi generalizarea strategiilor de studiu între cercetătorii din diverse instituţii, urmată de o explozie informaţională în lumea biologică. Avansarea cunoaşterii bio-medicale din ultimele decenii nu ar fi fost posibilă fără dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele. Cercetarea bio-medicală actuală foloseşte tehnicile de lucru cu celulele pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetica, biologia dezvoltării organismelor, evolutionism, medicina moleculară, farmacologia, bio-nano-tehnologia, inteligent drug design etc. 64

. cultura celulară poate cuprinde cultura ţesuturilor şi organelor. . secundare şi imortale/canceroase Proprietăţi Inhibiţia de contact1 Fenotipul faţă de situaţia in vivo Genotipul faţă de situaţia in vivo Necesarul factorilor de creştere Diferenţiate Număr de diviziuni Timp necesar cultivării Reproductibilitatea rezultatelor 1 primare da identic identic crescut da 2-3 crescut scăzută secundare da asemănător identic crescut da <100 scăzut crescută imortale/canceroase unele/nu asemănător/rotunde asemănător/diferit crescut/limitat da/nediferenţiate nelimitat scăzut crescută în mod normal. studii de genomică. secundare şi imortalizate (tabel 1). Tabel 1. testarea agenţilor anticanceroşi. celulele pot fi folosite ca şi model pentru studiul răspunsurilor fiziologice la diferiţi factori de stres din mediu. interferoni. Din punct de vedere al tipului de cultură se poate vorbi despre: . cancere şi altele.cultura de organe .presupune prelevarea şi cultivarea unui organ în totalitate. cultivarea organelor şi ţesuturilor cu aplicaţii în bolile cronice degenerative. producţia glico-proteinelor recombinante (cytokine. metabolism.cultura de ţesuturi . Celulele canceroase pierd această caracteristică fenotipică şi după ce ajung să fie confluente încep să crească una peste cealaltă formând ghemuri de celule uşor de distins la microscopul optic. 65 . eritropoietina).Este practic de neimaginat desfăşurarea activităţii într-un centru de cercetare bio-medical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Pe de altă parte. hormoni. anticorpi monoclonali folosiţi în cercetare şi clinica medicală.presupune prelevarea unor ţesuturi şi digestia lor pentru obţinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivată mai departe. Avansarea cercetării din domeniul celulelor stem şi lucrul cu celulele embrionare face posibilă. Aceasta include şi cultivarea unor embrioni întregi.cultura de celule . apoptoză. Dacă ne referim la cultura de celule. există trei tipuri de celule animale care sunt cultivate în laborator: primare. moment în care îşi opresc creşterea. Caracteristicile celulelor primare. deocamdată teoretic.presupune prelevarea unor fragmente de ţesuturi şi cultivarea lor. Într-un sens mai larg. Aplicaţii curente sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea vaccinurilor. celulele cresc în vasul de cultură până când stabilesc contact cu vecinele lor.

Culturi de celule imortalizate Este posibil ca unele celule din culturile secundare să sufere anumite transformări care le conferă caracterul de imortalitate adică posibilitatea de a se divide la nesfârşit. Este posibil ca celulele să formeze aderenţe între ele dar de obicei acestea sunt de o mică intensitate. Pentru a le separa de acesta şi pentru separarea celulelor unele de altele se folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Culturi secundare Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultură primară se pot obţine aşa-numitele culturi secundare. Diferite substanţe (factori de creştere ai diferitelor populaţii leucocitare şi/sau mitogeni – substanţe care stimulează mitoza) pot fi utilizate pentru diferenţierea şi înmulţirea celulelor în cultură. Deşi nu prezintă alterări ale setului de cromozomi (karyotipului). Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite. fibroblaste) se face prin biopsierea ţesutului şi formarea unei suspensii unicelulare. evitarea confluenţei care poate avea ca rezultat inhibarea creşterii. aceste celule acumulează anumite caracteristici fenotipice care le fac să devină o linie celulară distinctă. cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator este urmată de apariţia tumorilor la acestea. subcultura are ca scop menţinerea celulelor în faza logaritmică de creştere. Pe de altă parte. 66 .Culturi primare Majoritatea celulelor din culturile primare necesită ancoraj. Aceste celule vor creşte aderente de suprafaţa vasului de cultură. Celulele dintr-o cultură secundară pot parcurge până la 100 de diviziuni înainte de a-şi pierde potenţialul proliferativ. Pe lângă derivarea culturilor secundare. cultivarea celulelor prelevate din sângele periferic se face într-o manieră care nu necesită ancorarea acestora de pereţii vasului de cultură. fizici (radiaţii) sau biologici (virusurile oncogene). pot creşte cu mai puţini nutrienţi etc. Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter oncogenic. îndepărtarea celulelor moarte şi a produşilor de metabolism celular şi adăugarea substanţelor nutritive. celulele canceroase au unele proprietăţi care le diferenţiază de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezintă inhibiţia de contact. Aceste celule pot apărea ca urmare a unor modificări (transformări) la nivelul cromozomului prin factori chimici. După cum se poate observa din tabelul 1.

Pe scurt tehnica presupune imunizarea unui animal de experienţă cu un antigen şi recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit interval de timp după imunizare (figura 1). prin folosirea tehnologiei AND-ului recombinat este posibilă crearea celulelor transgene care constituie per se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic. antirabic). anticorpilor monoclonali şi altor substanţe imunomodulatoare (interferoni. factorilor de coagulare. dezvoltarea în ultimii ani a cunoştinţelor şi tehnologiei de lucru cu celulele stem constituie una dintre temele cele mai actuale în domeniul biomedical. anticorpii monoclonali şi-au găsit foarte rapid aplicaţii în domenii variate cum ar fi: diagnosticul şi trata67 . antivaricela.2. diferenţierii. traficului de membrană. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu Aplicaţiile culturilor celulare îşi găsesc utilitatea în producerea: vaccinurilor (antirubeolic. Mai mult. În plus. În 1975 cei doi cercetători au publicat rezultatele prin care pot fi obtinuţi anticorpii monoclonali. se formează celule hibrid (de unde şi numele de hibridoame) dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorită (caracter dobândit de la celula B a animalului imunizat) într-o manieră continuă (dobândind caracterul imortal de la celulele de mielom). Aceste celule sunt fuzionate apoi în prezenţa poli-etilen-glicolului (PEG) cu o linie celulară canceroasă de mielom (cancer al plasmocitelor). Această tehnologie a fost pusă la punct de către Milstein şi Koehler în urma cu aproape patru decenii. interleukine). Anticorpii monoclonali Una dintre aplicaţtiile culturilor celulare cu cel mai mare impact pentru societate la ora actuală este reprezentată de tehnologia de obţinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor. În urma acestei fuziuni. celulele animale sunt deosebit de utile în testarea citotoxicităţii diferitelor substanţe incluzând noile terapii anticanceroase. ciclului celular. Prin diferite metode de screening se pot găsi aceste celule care sunt ulterior subclonate dând naştere astfel unor linii celulare pure şi stabile are produc anticorpii monoclonali. enzimelor. Datorită specificităţii deosebit de mari (se consideră că un anticorp poate distinge antigenul pereche între 108 molecule). agenţilor anticanceroşi etc. eritropoietina). hormonilor şi factorilor de creştere (insulina. antiparotidita epidemică. îmbătrânirii şi apoptozei. Este de aşteptat ca acest domeniu să revoluţioneze tratamentul diferitelor afecţiuni. Nu în ultimul rând.

antigen PEG HAT Screening Subclonare Linie celulară producatoare de anticorp monoclonal Figura 1 Producerea anticorpilor monoclonali Splina este izolată la câteva saptămâni (timp necesar pentru îmbogăţirea repertoriului de celule B specifice) după imunizarea animalului cu antigenul faţă de care se doreşte producerea anticorpilor monoclonali. Screeningul face posibilă identificarea coloniilor care produc anticorpi faţă de antigenul dorit. Celulele B sunt izolate şi combinate cu mieloamele (partea stângă) în prezenţa PEG care mediază fuziunea celulelor. Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieţui în mediul suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT).mentul clinic. cercetare fundamentală şi aplicată (metode de izolare a diferitelor substanţe recunoscute). Urmează apoi subclonarea realizată prin diluarea celulelor din coloniile producătoare în aşa fel încât fiecare 68 . catalizatori ai reacţiilor chimice (abzymes). Folosirea terapeutică a anticorpilor monoclonali în diferite afecţiuni umane urmează două direcţii: markeri diagnostici care pot identifica diferite tipuri de antigene din populaţii celulare in vivo şi terapia ţintită a diferitelor afecţiuni în care anticorpului monoclonal îi sunt ataşate substanţe chimice toxice sau radioactive.

Această abordare a permis medicilor oncologi să obţină rezultate spectaculoase în diferite forme de cancere. oligopotente. Ajunşi în organism aceşti anticorpi ca orice altă substanţă străină iniţiază un răspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreţia de anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de şoarece. Deşi nu sunt toxici. multipotente. După sursa de provenienţă există două tipuri de celule stem: celule stem embrionare şi celule stem adulte. pluripotente. anticorpii monoclonali produşi în şoarece prezintă neajunsul de a fi străini organismului uman. După numărul de precursori ai liniilor diferenţiate pe care le poate produce. celule stem pot fi clasificate în: totipotente. Aceste celule sunt reprezentate de către ovulul fertilizat şi celulele obţinute din primele diviziuni ale acestuia. numărul celor aflaţi în diferite stadii de testare depăşeşte 100. Din acest motiv. cercetătorii au reuşit să izoleze şi cultive cu succes 69 . Prin definiţie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau naştere unei celule fiică identică şi unei alte celule care poate fi diferită. Tehnologia ADN-ului recombinat a făcut posibilă ataşarea părţii specifice (cea care recunoaşte antigenul) derivată de la şoarece cu un braţ constant (care consituie cea mai mare parte) de la om. După cum implică numele. Celule stem Următorul pas în revoluţia din domeniul biomedical a fost reprezentat de posibilitatea cultivării celulelor stem în laborator. în ultimii ani. Se obţin în acest fel colonii în care toate celule provin dintr-o singură celulă mamă şi deci vor produce acelaşi anticorp ca şi aceasta. Se poate vorbi la ora actuală de cancere tratate cu anticorpi monoclonali în care pacienţii supravieţuiesc fără recidivă la 30 de ani de la administrarea terapiei. anticorpii de şoarece au fost umanizaţi. Interesul major pentru biologia celulelor stem este explicat de potenţialul de diferenţiere al acestora în orice tip de ţesuturi şi organele dintr-un organism. celulele totipotente sunt capabile să formeze un organism în totalitate. Deşi cercetarea în acest domeniu este relativ la început. Cu timpul anticorpii umani pot neutraliza şi distruge anticorpii monoclonali injectaţi anulându-le efectele terapeutice. O schiţă a diferenţierii celulare se găseşte în figura 2. Cele mai bine studiate celule stem sunt cele derivate din măduva osoasă şi care constituie precursorii tuturor celulelor din sânge. Există la ora actuală şi peste 30 de anticorpi monoclonali folosiţi ca şi agenti terapeutici în diferite afecţiuni umane.recipient să conţină teoretic o singură celulă.

Folosirea acestor celule face posibilă şi obţinerea animalelor modificate genetic prin introducerea unor gene în embrionul tânăr. Deşi deosebit de atractivă. În urma analizelor care pot să depisteze diferite defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului în uterul viitoarei mame. Se pot produce astfel animale „chimera” care exprimă genele implantate în diferite organe. tehnologia cultivării celulelor stem embrionare este puternic îngrădită de normele actuale ale eticii cercetării.anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele fiind apoi diferenţiate în numeroase celule finale. atunci urmaşii unei împerecheri dintre doi astfel de şoareci chimera pot produce un knock-out/knock-in pentru acea genă. Dacă aceste organe sunt chiar gonadele. celulele stem prezintă şi aplicaţii diagnostice. Celula stem Pluripotentă Celula stem Multipotentă Celula stem cu potenţial limitat Celula diferenţiată Parţial Celula diferenţiată final. postmitotică Figura 2 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final 70 . Este posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat în urma fertilizării in vitro a unui ovul să fie îndepărtată şi analizată din punct de vedere genetic (celula este dispensabilă deoarece restul celulelor rămase refac embrionul). Pe lângă potenţialul terapeutic enorm.

1. • este prevazută în mod obligatoriu cu o lampă de UV care va fi pornită 5-10 minute înainte de începerea lucrului şi repornită pentru 5-10 minute după încheierea lucrului. Succesul în lucrul cu celule depinde de factori variaţi cum ar fi: utilarea laboratorului. Existenţa acestor celule canceroase stem poate explica apariţia recidivelor prin participarea unui număr redus de celule care nu pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Hota cu flux laminar • Serveşte lucrului efectiv cu celulele. Recent au fost descrise şi celule stem canceroase. concentraţia de CO2 este în general ajustată între 5% şi 7% pentru a obţine un sistem tampon optimal în combinaţie cu substanţele din mediul de cultură. calitatea celulelor şi a reactivilor. tehnica asepteică (prezentate în cele ce urmează) şi experienţa personală a operatorului care contribuie decisiv la primele trei. aranjarea spaţiului de lucru este descrisă în figura 4. • tipul de hotă folosită pe scară largă în cultura celulelor animale este hota cu flux de aer vertical care oferă o protecţie bună atât pentru celule cât şi pentru operator. Echiparea laboratorului de culturi celulare Organizarea generală a laboratorului de culturi celulare include următoarele echipamente de bază (figura 3): a. în funcţie de tipul de celulp. 71 .Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem embrionare au încurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem adulte. Această nouă descoperire pune sub semnul întrebării principiile actuale care stau la baza tratamentului cancerului. b. Incubator cu sursa de CO2 • creşterea celulelor. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente 3. 3. Rămâne de văzut dacă potenţialul unor astfel de celule stem adulte este la fel de nelimitat ca şi al celor embrionare. Experimental s-a dovedit că un număr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la un altul în timp ce un număr de câteva sute de ori mai mare de celule canceroase care nu prezintă caracteristicile celulelor stem sunt incapabile să transfere boala.

DMSO) se poate folosi şi ca sistem de aspirare a mediilor folosite. c. • 72 . stabilitate în timp. igienizare uşoară. e. Frigider/congelator • stocarea reactivilor L-glutamina etc. o o alternativă este înlocuirea apei cu perle metalice care prezintă următoarele avantaje: reducerea contaminării reactivilor cu care vin în contact. • o precauţie deosebită trebuie acordată faptului că recipientul este extrem de rece (-196 grade Celsisus) şi azotul poate produce arsuri în urma contactului cu pielea sau mucoasele.• responsabil pentru menţinerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA. de obicei se găseşte într-o incintă anexată. economisirea consumului de energie. Alte componente • Baie de apă o păstrarea mediilor şi altor reactivi la temperatura de 37 grade Celsius. halat). Centrifuga de masă cu răcire • centrifugarea suspensiilor de celule în diverse scopuri. Pompa de vid şi sisteme de sterilfiltrare o pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. stocuri de antibiotice. de aceea este necesară utilizarea echipamentului de protecţie (ochelari/mască facială.) (medii cultură. Microscop optic inversat cu contrast de fază (opţional aparat foto) • serveşte la observarea celulelor. Recipient cu azot lichid • stocarea celulelor pe termen lung. • deoarece în cultura de celule animale. • contrastul de fază îmbunătăţeşte vizualizarea specimenelor transparente (celulelor). celulele sunt în general situate pe suprafaţa bazei recipientului se foloseşte microscopul inversat. high efficiency particulate air). umede şi cu temperatura constantă. • Autoclav şi sterilzor cu aer uscat o Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluţii şi recipiente folosite. manuşi. d. f.

codate în funcţie de aria utilă de cultivare şi de volumul maxim de mediu care poate fi conţinut.Figura 3. • vase de cultură . 73 . pot fi din plastic (de unică folosinţă) sau din sticlă (refolosibile după sterilizare). Organizarea laboratorului de culturi celulare Consumabile • pipete serologice. • medii de cultură (multe celule pot fi cultivate în DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaugă diferite concentraţii de L-glutamina şi antibiotice).

hormoni. Compoziţia mediilor de cultură este complexă incluzând: aminoacizi. vitamine. • acele încăperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezintă risc infecţios pentru cei implicaţi. serul provine de la animale mari. acizi graşi. glucoză şi altele în funcţie de particularităţile experimentului. Tot din acest motiv. există câteva principii de bază ale lucrului cu celulele: • culturile celulare vor fi făcute într-o cameră dedicată acestui scop. există riscul contaminării cu diferite microorganisme care datorită ratei 74 . Este de dorit ca această încapere să fie oarecum izolată faţă de restul laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. bicarbonat.2.4. Chiar dacă este vorba de un mediu sintetic. săruri. Mediile de cultură sunt soluţii saline tamponate. • suplimente pentru mediile de cultură: antibiotice – uzual se foloseşte un ameste de penicilină/streptomicină. un indicator al pH-ului care trebuie să rămână între 7 şi 7. • spre deosebire de celulele vegetale şi bacterii. cu unele excepţii serul este considerat un component de bază. în general de la vacă . La ora actuală. celulele animale sunt pretenţioase în ceea ce priveşte condiţiile în care pot sa crească. 3. Dacă acesta virează spre galben indicând un mediu acid este cazul ca mediul să fie schimbat. Cele mai multe medii conţin şi phenol red. • toate mediile şi suplimentele care urmează a fi folosite în cultura celulară trebuie să fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule (indicaţia cell culture certified/approved trebuie să apară pe ambalaj/descrierea produsului). carbohidraţi. cele naturale care includ serul sanguin şi alte secreţii de origine animală şi medii sintetice în care componentele de bază sunt produse separat şi apoi amestecate de obicei de către firme specializate. de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct implicaţi în procesul de lucru cu celulule. factori de creştere şi alte componente. accesul personalului în această cameră va fi restricţionat pe cât posibil. L-glutamină.Conologic se poate vorbi de existenţa a două categorii de medii.de unde şi numele de fetal bovine serum (FBS). Na-pyruvat. microelemente. de aceea încăperile vor fi semnalizate corespunzător. • personalul care urmează să lucreze cu celulele va fi instruit corespunzător (vezi mai jos). toate acestea trebuie adaptate liniilor celulare cu care urmează a se lucra în laborator.Strategii de lucru Din punct de vedere tehnic.

o nimic din ceea ce vine în contact direct cu celulele nu se deschide în afara hotei sterile. o faza de inhibare a creşterii datorită inhibiţiei de contact. creşterea celulelor animale urmează o curbă cu trei faze: o faza de echilibrare (primele 24h) în care celulele se acomodează cu noul mediu în care sunt introduse. 3. scăderii potenţialului de metabolizare a mediului. tripsina). pH-ul. în plus factori ca spre exemplu temperatura (37 de grade Celsius pentru celule mamifere). celulele animale sunt limitate în ceea ce priveşte numărul de generaţii pe care le produc. contaminarea se poate propaga din aproape în aproape şi duce în final la compromiterea nu doar a celulelor la care contaminarea a fost iniţial sem75 . creşterii densităţii peste un nivel critic. lucrul bine organizat şi desfăşurat fără grabă este esenţial pentru o eficienţă maximă: o mişcările vor fi măsurate şi sigure. oricine poate învaţa să menţină culturile de celule după doar câteva zile petrecute în laborator dacă respectă protocoalele şi are la dispoziţie echipamentul necesar.. şi o concentraţie a CO2 între 5 şi 7% condiţionează clutura celulelor animale (sistemul de tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau potasiu din mediul de cultură + CO2 din incubatorul folosit). celulele animale se vor opri din creştere după un număr de generaţii care depinde de sursa primară a celulelor. o faza de creştere exponenţială care durează în jur de 7-10 zile. Cu alte cuvinte. se poate porni un cronometru pentru a evita „uitarea” mediilor pentru un timp îndelungat şi degradarea lor (L-glutamina. înainte de scoaterea din hotă se verifică etanşeitatea închiderii. substanţele pot fi preîncălzite fie la 22.• • • • de creştere mult superioară celulelor animale vor deveni majoritare în scurt timp. De aceea desfăşurarea activităţii în linişte este esenţială în laboratorul de culturi celulare.3. Instruirea personalului Cultivarea celulelor este un lucru care se poate învaţa repede. o imediat după adăugarea suplimentelor în mediile de cultură se notează acest fapt pe recipientul respectiv. Odată aparută. Singurul lucru care este şi mai uşor şi nici măcar nu necesită învatare este să contaminezi celulele. osmolaritatea (290-310mOsm). Chiar şi în condiţii optime. fie la 37 grade Celsius (10-20 min e suficient.

nalată ci a întregului stoc de celule.pentru evitarea contaminării celulelor şi operatorului: o halat cu mâneci lungi o pantofi închişi o mănuşi de unică folosinţă • Spălatul pe mâini înainte şi după lucrul cu celulele. ei vor începe prin a observa manoperele de lucru şi a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. • Orice mediu sau obiect contaminat din greşeală va fi aruncat3. Chiar şi după câştigarea independenţei în lucru.) care urmează să fie introdus în hota pentru lucrul steril trebuie dezinfectat înainte sau imediat după introducere. recipient etc. Pe lângă considerentele financiare. • Orice lichid care ajunge în contact cu suprafaţa de lucru sterilă va fi îndepărtat imediat cu ajutorul unui prosop de hârtie îmbibat în ethanol 70%. mai întâi sub supravegherea directă a celor familiarizaţi şi mai apoi în mod independent. Orice obiect (pipeta. 3 Este vorba despre acele medii/suplimente/alte substanţe care nu mai pot fi sterilizate (fie prin sterilfiltrare fie prin autoclavare) şi respectiv obiecte care nu mai pot fi sterilizate. • Orice pipetă trebuie folosită o singură dată2. 76 . • Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. contaminarea recipientelor cu conţinut original (celule produse în laborator şi care nu pot fi achiziţionate de la companiile specializate sau transferate de la alţi investigatori) reprezintă cel mai neplăcut aspect care poate afecta un laborator de culturi celulare. 1 În categoria substanţelor cu efect antimicrobian sunt incluse alături de antisepticele aplicate pe ţesuturi vii. antibioticele care acţionează în interiorul organismului şi de asemenea dezinfectantele care distrug microorganismele aflate pe suprafeţele neaparţinând fiinţelor vii. Doar după această perioadă este permis lucrul direct. Asigurarea asepsiei şi antisepsiei Există anumite măsuri care asigură igiena în lucrul cu celulele: • Utilizarea echipamentului de protecţie . 2 Excepţie fac pipetele de sticlă care pot fi spălate şi sterilizate. Practic. cel proaspăt iniţiat va fi supravegheat din umbră de către un coleg cu experienţă care ar putea observa anumite manopere executate neconform cu normele curente. • O soluţie antimicrobiană1 de ethanol 70% trebuie să fie în permaneţă la îndemână. nu este permisă păstrarea pipetei în mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera mediu de la un recipient la altul. Toţi cei care urmează să lucreze cu celule vor fi în prealabil instruiţi teoretic înainte de a pătrunde pentru prima dată în laborator.

Organizarea spaţiului pentru lucrul steril Pentru reducerea la maxim a pericolului de contaminare este esenţială aranjarea locului de muncă sub hotă într-un mod care să evite încrucişarea mâinilor deasupra vaselor de cultură/mediilor. Organizarea spaţiului de lucru steril Figura prezintă organizarea de bază a spaţiului. Linia din faţă: Dreapta – pipeta/pompa aspirare medii prevazută la capăt cu pipetă de unică folosinţă Centru – recipientul cu celule În plan posterior: Stânga – vasele cu resturi lichide şi respeciv solide etichetate corespunzător 77 . Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare. aşa cum este ea întalnită în mod frecvent în majoritatea laboratoarelor. Se pot de asemenea observa contaminări cu alte celule sau microorganisme. Pentru organizarea eficientă a „mesei” de lucru se poate consulta figura 4. Figura corespunde pentru persoanele care folosesc cu precădere mâna dreaptă. WASTE Figura 4 .• Este necesară investigarea stării de sănătate a celulelor în fiecare zi. Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea. Figura nu este la scală. Trebuie evitată supraîncărcarea spaţiului de lucru care poate duce pe de o parte la blocarea fluxului de aer şi pe de altă parte la accidente nedorite care pot produce contaminarea celulelor sau reactivilor.

de asemenea se pot planifica în acest fel anumite experimente pentru anumite date. • • • 3.Dreapta – mediile de cultură Centru. evaluarea celulelor se face în mod normal în fiecare zi prin vizualizarea lor sub microscopul optic. Modul de lucru este asemănător pentru toate celulele dar există anumite particularităţi de care trebuie ţinut cont în cazul fiecărei grupe. Mediul de 78 . flacon cu ethanol 70%. o evaluare de primă instanţă a celulelor se realizează prin vizualizarea macroscopică a culorii mediului din sticlele de cultură. în anumite situaţii este nevoie de utilizarea unor soluţii de tripsina/EDTA pentru crearea suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea). culoarea standard a mediilor este roşu-orange.4. o culoare care virează spre galben indică necesitatea schimbării mediului. iar celulele care cresc în suspensie rămân rotunde şi uneori (în funcţie de linia cultivată) pot forma aglomerări de celule (asemănător cu o ciorchină de struguri). subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celulară poate influenţa negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus).5. există anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie a combinaţiilor optime. celulele eucariote pot fi împarţite în două mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de cultură şi cele care cresc în suspensie. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele într-un anumit protocol este nevoie de stabilirea numărului de celule pe unitatea de volum. 3. Cultivarea celulelor • după felul în care cresc în flacoanele de cultură. celulele care cresc aderent trebuie să apară distribuite pe suprafaţa de contact cu vasul în care cresc şi de cele mai multe ori capătă o formă poligonală.pipete serologice de diferite mărimi. se recomandă ca celulele să fie subcultivate. starea de sănătate a celulelor este confirmată şi de creşterea numărului de la o zi la alta. această procedură care se aplică în faza logaritmică de creştere a celulelor permite obţinerea unor cantităţi crescute de celule prin împărţirea/transferul acestora dintr-un recipient de cultură în mai multe recipiente fiecare reprezentând o nouă sursă de celule.suport pentru tuburi În afara hotei la îndemană .

Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor Doi paşi critici ai lucrului cu celulele sunt constituiţi de către îngheţarea şi dezgheţarea celulelor.6.cultură conţinând celulele este transferat unor tuburi în care se centrifughează (centrifuga trebuie echilibrată în prealabil . Celulele vor sedimenta ca şi în figura 5. Pentru o separare bună este nevoie de 10 minute la 200-250g/min (într-o centrifugă de masă cu rotor standard 1000rpm). • În plus.dacă avem un singur tub cu celule va trebui să folosim un al doilea tub cu aceeaşi greutate care poate să conţină apă distilată sau orice alt lichid cu densitate asemănătoare). Sub microscopul optic. După centrifugare celulele se resuspendă în mediu proaspăt şi apoi 10 microlitri sunt combinaţi cu 10 microlitri de soluţie Trypan blue 0. Soluţia de trypan blue va pătrunde în celulele moarte care apar albastre. Aspectul celulelor în tub după centrifugare 3. O viabilitate de peste 90-95% este în general acceptată pentru toate manipulările ulterioare.5% şi pipetate în camera de numărat. În funcţie de tipul camerei de numărăt. De aceea cea mai sigură metodă de prezervare a liniilor celulare este cryoprezervarea care opreşte procesele metabolice nelăsând astfel loc modificărilor genotipului. Îngheţarea este indispensabilă din următoarele considerente: • Celulele sunt supuse în permanenţă variaţiilor în compoziţia cromozomilor. leucocitele apar ca şi celule gălbui/transparente cu o membrană brună. există formule de calcul după care putem să aflăm numărul total de celule. de aseme79 . Figura 5 . cryoconservarea este o metodă practică din punct de vedere economic: este mult mai simplu să păstrezi un tub cu celule îngheţate care nu au nevoie decât de o completare periodică a rezervei de azot decât să cultivi în mod repetat celulele în laborator.

direct în baia de apă la 37 de grade Celsius. după care se poate adăuga mai rapid mediu până la 10ml.nea transportul între laboratoare este mai uşor dacă celulele sunt îngheţate. Dezgheţarea celulelor trebuie făcută extrem de rapid (ideal în mai puţin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot. la îngheţare apa iese din celule unde presiunea osmotică va creşte. celulele vor fi resuspendate direct în mediul de îngheţare răcit în prealabil la 4 grade la o concentraţie de 1x106-1x107/ml6 şi transferate imediat7 la -20 de grade C pentru 1-2 ore. Există dispozitive speciale care permit coborarea temperaturii cu un grad pe minut. • Nu în ultimul rând. Este esenţial ca înainte de începerea procedurii respective să notăm următoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celulă. metoda face posibilă revenirea la celule cu un număr mai mic de pasaje. Se centrifughează în general la 200rpm timp de 2-5 min pentru a elimina urmele mediului de îngheţare. Mediul de îngheţare5 cel mai frecvent folosit conţine mediul de cultură recomandat pentru linia celulară + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid (DMSO) sau 10-15% glycerol care are rolul de a scădea temperatura de îngheţ permiţând apei să iasă din celulă şi împiedicând astfel formarea cristalelor de gheaţă care ar putea distruge membrana. Mediul va fi schimbat pentru a înlătura celulele moarte şi resturile de cryoprotector (DMSO – sterilfiltrat sau glycelor . numărul de celule. Urmează apoi transferul peste noapte la -80 de grade Celsius şi apoi stocarea de lungă durată în azot lichid. De aceea trebuie limitat contactul acestuia cu celulele. 4 5 80 . 6 Numărul de celule/aliquot variază În funcţie de tipul de celule. Îngheţarea4 va fi lentă şi constantă pentru a minimaliza efectele adverse asupra viabilităţii celulelor. este important să avem o suspensie omogenă unicelulară. Există linii celulare la care se preferă folosirea altor substanţe în locul DMSO. numărul de pasaj şi data la care a fost creat stocul. Prin mişcări fine se distribuie celulele. După câteva ore (cel târziu a doua zi dimineaţa) se verifică starea celulelor prin vizualizarea la microscop.autoclavat). 7 DMOS este toxic pentru celuele la temperatura camerei. 8 Pentru a preveni socul osmotic. pe gheaţa uscată. Se resuspendă în 10 ml de mediu şi se transfera în sticlele de culturp etichetate. După centrifugarea şi verificarea vitalităţii (se recomandă folosirea celulelor vitale în proporţie de >90-95% la colorarea cu trypan blue). Odată ce dezgheţarea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheţată) aceasta se transferă într-un tub de 15ml peste care se adaugă picătură cu picătură8 o cantitate de mediu preîncălzit echivalentă cu de două-trei ori cantitatea suspensiei.

Spektrum Akademischer Verlag 2000 www. John Wiley & Sons 2004 Zell. Lindl T.7.Garland Science. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. A doua zi se recomandă schimbarea mediului care permite înlăturarea celulelor moarte şi a resturilor de tripsină/EDTA.. Pentru cele mai multe protocoale/manopere este necesară obţinerea unei suspensii unicelulare. tripsinizarea Celulele formează aderenţe între ele şi suprafaţa vasului de cultură (celule aderente) şi/sau între ele (celulele aderente. Urmărind sub microscop separarea celulelor (durează câteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubări prea îndelungate. Dasso M. Dacă este vorba de celule aderente protocolul de lucru presupune îndepărtarea mediului. Freshney RI.org www. La celulele neaderente nu se face tripsinizarea. Dacă manopera s-a făcut în alt scop. spălarea cu o soluţie salină tampon fără9 calciu şi magneziu şi adăugarea unei cantităţi de trispină/EDTA care să acopere stratul de celule. se urmează paşii din protocolul respectiv. Harford JB. 3.3.invitrogen. Cea mai frecventă combinaţie folosită în acest scop este tripsina/EDTA. La fiecare 2-4 săptămâni se centrifughează şi resuspendă celulele neaderente în mediu proaspăt. Lippincott-Schwartz J. 4. Auflage. Celulele nu trebuie lăsate neacoperite timp îndelungat. 4.und Gewebekultur – 4.com 9 Acesti ioni pot scadea eficienţa tripsinei/EDTA 81 . celulele sunt apoi transferate vaselor noi de cultură şi incubate până a doua zi. Subclonarea. Bonifacino JS.protocol-online. 6. După centrifugare celulele sunt resuspendate în mediu pentru a obţine o suspensie unicelulară şi apoi numărate/investigate la microscop prin colorarea cu trypan blue (proporţia celulelor moarte). Roberts K. Dacă tripsinizarea s-a făcut în cadrul protocolului de subcultivare. 2. Pentru a ajuta separarea este posibilă uşoara bătaie a sticlei de podul palmei. Yamada KM. celule pot fi direct numărate iar densitatea lor este ajustată prin adăugarea mediului proaspăt. Johnson A. Alberts B.Bibliografie 1. Walter P . unele celule care cresc în suspensie). Celulele devin rotunde odată ce pierd aderenţele. 5. Imediat. 2002 Short Protocols în Cell Biology – 1st ed. John Wiley & Sons 5th Edition 2005 Molecular Biology of the Cell – 4th ed. Raff M.. Lewis J. acţiunea trispinei este antagonizată prin adăugarea de ser urmată de transferul într-un tub adecvat şi centrifugarea.

...Culturi celulare – partea a II-a Lect...................... Mircea Teodor Chiriac Cuprins 1......1... genetică. Acesta este reprezentat de către totalitatea celulelor.... Dintre aplicaţiile moderne ale culturilor celulare... bio-nano-tehnologia.... biologia dezvoltării organismelor.. dr......... 82  1....... Bibliografie ..........................2...... 93  3............. biologie celulară şi moleculară.. Producerea proteinelor recombinate în celule mamifere.. 99  1................ 88  1. vom discuta în cele ce urmează folosirea celulelor ca şi entităţi de producţie a proteinelor recombinate cu aplicaţii în autoimunitate şi producerea şi caracterizarea anticorpilor monoclonali bio-nano-funcţionalizaţi cu aplicaţii în cancere şi boli autoimune........... farmacologia. 94  4. Studiul de literatură privind cercetări exploratorii recente ........ Studiul de literatură privind cercetări exploratorii recente Culturile celulare reprezintă una dintre cele mai puternice tehnologii/metodologii utilizate de către comunitatea ştiinţifică internaţională din domenii ca: biofizică... inteligent drug design etc........... Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi .............. 88  2........ ţesuturilor şi proceselor biochimice care au funcţia de a ne proteja faţă de efectele nedorite ale agenţilor patogeni din mediu şi/sau acţiunii dăunătoare a structurilor proprii 82 ... De asemenea dezvoltarea industriei farmaceutice a profitat din plin de avansarea tehnicilor de lucru cu celulele... Imunologia este ştiinţa care se ocupă cu studiul sistemului imun....... medicina moleculară............... biochimie.............. culturile celulare sunt folosite fie ca mini-bioreactoare pentru producerea diverselor produse biotehnologice fie ca şi model organismic pentru testarea efectelor/toxicităţii noilor medicamente................... Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei ................ Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii .. evoluţionism... În acest context..........

celulele natural killer etc. Tabel 1). Datorită diversităţii extraordinare pe care mediul o oferă. recunoaşterea structurilor străine se face într-un mod indirect. fenomen caracteristic bolilor autoimune. În ciuda specificităţii remarcabile a răspunsurilor imune. Din punct de vedere didactic. Acest fapt permite apariţia unor erori care au ca şi rezultat declanşarea unor reacţii împotriva propriilor structuri. Se vorbeşte despre un sistem imun cu componente umorale adică cel în care produşii celulelor imune circulă prin sânge sau secreţii (lacrimi. există diferite structuri care asigură trecerea lină de la un sistem la altul asigurând astfel o continuitate între cele două sisteme. răspunsul imun poate cuprinde două variante: • răspunsul înnăscut care reprezintă o primă barieră întâmpinată de către agenţii patogeni veniţi din afară (acest tip de răspuns apare pe scara evolutivă încă de la bacterii şi plante şi este păstrat şi la mamiferele superioare inclusiv la om).alterate (cum ar fi celulele tumorale). celulele B1. NKT sunt considerate a fi cele care prin diverşi receptori şi căi de semnalizare celulară fac posibilă comunicarea între sistemul adaptativ şi cel înnăscut. de sine stătătoare şi cel cu componente celulare în care celulele sunt cele care îndeplinesc funcţia majoră de apărare (Figura 1. sudoare etc. celulele dendritice. După cum menţionam anterior. funcţia sistemului imun este să ne protejeze faţă de patogenii din mediu şi faţă de structurile proprii modificate. • răspunsul adaptativ numit şi specific care este iniţiat atunci când răspunsurile înnăscute nu reuşesc să producă efectul dorit.) într-o formă finită. Se poate vorbi în acest context despre o împărţire judicioasă a sarcinilor în sistemul imun al mamiferelor. Celulele ca şi macrofagele. Deşi mecanismul apariţiei acestor boli nu este pe deplin înţeles. Ele pot fi clasificate în boli specifice pentru anumite organe aşa cum este spre exemplul pemfigusul vulgar care interesează pielea 83 . Există aşa-numitele celule. Deoarece sistemul imun adapatativ nu apare în urma unui salt brusc de la sistemul imun înnăscut. Se consideră că bolile autoimune constituie un grup heterogen de afecţiuni care apar la aproximativ 5% din populaţie. cum ar fi granulocitele. există din ce în ce mai multe date care au permis elaborarea unor teorii şi modele experimentale care s-au dovedit utile în caracterizarea acestor boli. care aparţin sistemului imun înnăscut şi alte celule cum sunt limfocitele care aparţin sistemului adaptativ. există diverse mecanisme care au evoulat cu timpul pentru a satisface cu eficienţă maximă rezolvarea fiecărei situaţii ivite. Răspunsurile adaptative apar pentru prima dată pe scara evolutivă la peştii cartilaginoşi ca o completare a sistemului imun înnăscut.

produsi de secretie ai celulelor imune care mijlocesc schimbul de informatii intre acestea (sageata cu doua sensuri). celule natural killer. Acest centru de control şi decizie este reprezentat de către celula (limfocitul) T helper (Th). Tabel 1 Componente ale sistemului imun al mamiferelor Linia de apărare Primară = imunitatea înnăscută Secundară = imunitatea dobândită (adaptativă sau specifică) 1 Imunitate celulară Granulocite. sistemul imun este organizat ierarhic în sensul ca există o unitate de control care integreaza informatiile primite de la toate celelalte componente şi pe baza lor stabileşte care este cea mai bună soluţie de urmat. Peptide antimicrobiene Anticorpii (imunoglobulinele) celulele dendritice şi monocitele/macrofagele aparţin didactic imunităţii înnăscute dar se găsesc din punct de vedere funcţional la graniţa dintre acesta şi sistemul adaptativ în sensul că fac legătura dintre antigen şi centrul de comandă reprezentat de limfocite. La mamifere. diabetul zaharat de tip I care afectează celule beta ale pancreasului sau tiroidita Hashimoto care apare la glanda tiroida. NK. şi mucoasele. macrofage. şi boli autoimnune generalizate care interesează mai multe organe sau ţesuturi aşa cum este spre exemplu lupusul sistemic eritematos în care unul dintre au84 .Th Imunitate înnăscută Imunitate adaptativă Granulocyte. coordoneaza activarea sistemului imun adaptativ şi controleaza mecanismele efectoare ale sistemului innascut inchizand astfel circuitul. Acesta primeşte informaţii de la sistemul imun înnăscut. Exista totodata schimburi directe intre sistemul innascut şi cel adaptativ care au loc cel mai adesea prin intermediul citokinelor. 1 Limfocitele B şi limfocitele T Imunitate umorală Sistemul complement. sistem complement Tc B (Ig) Figura 1 Organizarea ierarhică a sistemului imun al mamiferelor.

printre care se numară epidermoliza buloasă dobândită şi pemfigoidul bulos/pemfigoidul cicatricial sunt caracterizate de prezenţa anticorpilor circulanţi şi a anticorpilor legaţi la nivelul joncţiunii dermo-epidermale care fixează complementul in situ. bolile din grupa celor generalizate au tendinţa de a se croniciza. majoritatea pacienţilor sunt tratati cu ajutorul cortizonului şi derivaţilor acestuia. Necesitatea înţelegerii mecanismelor patogenetice la nivel molecular este esenţială nu doar din punctul de vedere al tratamentului dar şi din perspectiva unei depistări precoce sau chiar a posibilelor mijloace de prevenţie a unor asemenea afecţiuni. De asemenea. bule care se sparg lasând în urmă eroziuni acoperite parţial de cruste. Din punct de vedere clinic aceste boli se caracterizează prin prezenţa bulelor la nivelul pielii şi mucoaselor. La ora actuală. adică răspunsul autoimun este întreţinut în permanenţă de existenţa unui anumit nivel rezidual al autoantigenului. Cercetările din ultimii ani au reuşit să precizeze o parte dintre mecanismele efectoare responsabile de patologia observată. serurile majorităţii pacienţilor recunosc fomele native ale autantigenelor ţintă atât în imunoblot cât şi pe secţiuni de piele îngheţată. Bolile din această grupă. Scenariul fazei efectoare propune o succesiune de evenimente care debutează cu legarea autoanticorpilor la nivelul autoantigenelor ţintă urmată de fixarea componentelor sistemului complement.toantigenele ţintă este reprezentat de cromatina [1]. autoanticorpii prezintă reactivitate cu forme recombinate ale autoantigenelor ţintă atât în ELISA cât şi în imunoblot. Anticorpii recrutează şi activează fie direct fie prin intermediul complementului granulocitele in situ. Fie că este vorba despre boli specifice de organ fie că este vorba despre cele generalizate. Paraclinic. substanţe care produc deprimarea sistemului imun ca mijloc de aparare împotriva celulelor hiperreactive care întreţin distrucţia tisulară. Aceste celule odată activate produc şi eliberează specii reactive de oxigen care activează enzime 85 . O grupă de boli autoimune care se manifestă la nivelul pielii şi mucoaselor este caracterizată de prezenţa autoanticorpilor şi celulelor T autoreactive îndreptate faţă de autoantigenele de la nivelul pielii şi mucoaselor. lipsa unei înţelegeri depline a mecanismelor care iniţiază şi mai apoi întreţin distrucţia ţesuturilor proprii se repercută nefavorabil asupra prognosticului şi totodată calităţii vieţii celor afectaţi. Dezavantajul major al acestui tip de tratament se manifestă prin apariţtia multiplelor „atacuri” din partea microorganismelor patogene din mediu care găsesc un teren propice pentru dezvoltare într-un organism în care sistemul imun este deprimat. Deoarece cromatina se găseşte practic în toate celulele nucleate.

două enzime care sunt responsabile pentru conversia superoxidului în peroxid de hidrogen şi respectiv a celui din urmă în apă şi oxigen nu rezultă în inhibarea producerii separării dermo-epidermale.9. arată lipsa separării dintre derm şi epiderm.6. (a) Secţiunile incubate cu granulocite în lipsa altor substanţe rezultă în apariţia bulei experimentale.8.7. caracterizarea exclusivă a fazei efectuare a răspunsului autoimun nu generează nici o indicaţie asu86 . Odată eliberate aceste enzime digeră structurile proteice responsabile de asigurarea joncţiunii derm-epiderm [2.12] (Figura 2).11.proteolitice prezente în veziculele granulocitare fie direct fie indirect. (e) Diagrama prezintă lanţul de reacţii care produce speciile reactive de oxigen cu enzimele implicate (fundal roz şi albastru) şi respectiv inhibitori ai acestora (pe fundal verde) a-d. Deşi deosebit de utilă în precizarea posibilelor ţinte terapeutice specifice lipsite de efectele adverse ale terapiilor actuale.3. e Figura 2. Folosirea unui amestec de granulocite cu (b) superoxid dismutază sau (c) catalază.10. în care am folosit un ser de la un donator sănătos în loc de ser de la bolnavi. Reprezentare schematică a implicării speciilor reactive de oxigen în patogeneza bolilor subepidermale. (d) Controlul nostru negativ. criosecţiuni de piele umană sunt incubate cu anticorpi de la (a-c) pacienţi cu boli autoimune subepidermale şi apoi cu granulocite amestecate sau nu cu diferite substanţe capabile să influenţeze nivelul producţiei de specii reactive de oxigen în granulocite. mărire 200x (după [13]).5. Într-un model experimental ex vivo.4. prin degradarea inhibitorilor acestor enzime.

De asemenea tehnologia producerii. receptorii pentru porţiunea Fc de pe fagocite. De aceea eforturile din ultima perioadă urmăresc reproducerea bolii prin imunizarea activă a animalelor cu proteine recombinate. sau cu receptorii de pe celulele placentei – permit trecerea anticorpilor de la 87 . -COOH Fab Fc -NH2 Figura 3. Pentru aceste modele active de boală. Prezentare schematică a unei imunoglobuline. Din punct de vedere funcţional. interacţiunea cu diverse componente ale sistemului imun (cum ar fi complementul. caracterizării şi utilizării anticorpilor (Figura 3) monoclonali ca mijloace moderne de combatere a diverselor afecţiuni mergând de la cancer la boli autoimune sau boli degenerative va fi descrisă în cele ce urmează. În cele ce urmează vor fi descrise anumite caracteristici şi metode utile pentru înţelegerea acestor tehnologii. situate spre interior în această figură) şi două lanţuri uşoare (situate înspre exterior în partea de sus). Lanţurile grele sunt identice între ele la fel cum lanţurile uşoare sunt identice între ele.pra cauzelor care declanşează reacţia autoimună. imunoglobulina (numită şi anticorp când se gaseşte sub formă circulantă în sânge/secreţii) are două porţiuni: zona superioară (N-terminală) Fab are rolul de a recunoaşte specific antigenul iar zona inferioară (C-terminală) Fc are rolul de a îndeplini funcţiile efectoare. proteinele sunt produse prin tehnologia ADN-ului recombinat şi exprimate apoi în celulele mamifere care oferă un sistem de expresie superpozabil cu cel întâlnit in vivo. Imunoglobulinele sunt glicoproteine heterogene alcătuite din două lanţuri grele (cu masa moleculară mai mare.

• anumite aspecte adverse (apriţia unui răspuns imun faţă de însuşi anticorpii) datorită utilizării anticorpilor de la alte specii. 88 . Apoi în funcţie de aplicaţia dorită. se găsesc reziduuri de glucide care au rol în modularea interacţiunii dintre Fc şi receptorii sistemului imun (vezi text). După întocmirea strategiei de lucru. ţesutul care conţine antigenul ţintă este prelevat de la sursa de interes după care ARN-ul mesager obţinut în urma extracţiei este folosit ca şi matriţă pentru sinteza ADN-ului complementar [14. acestea vor fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boală fie pentru cel pasiv.mamă la făt). este semnalată folosirea serurilor pentru protejarea persoanelor în Turcia şi apoi odată cu experimentele doctorului Edward Jenner de la sfârşitul secolului al XVIII şi în Anglia.15].1. Totusi folosirea pe scară mai largă a anticorpilor în scop terapeutic a început să fie practicată începând cu secolul XX. În ciuda efectelor terapeutice extraordinare. În urmă cu câteva secole. • dificultăţilor tehnice în izolarea/producerea lor şi • necunoaşterea posibilelor ţinte terapeutice esenţiale pentru diferite afecţiuni. 1. folosind acest ADN complementar pot fi amplificate secvenţele de interes prin reacţia de PCR. După clonarea acestor fragmente în celule. fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica PCR. prevenţia/terapia cu ajutorul anticorpilor este o procedură folosită de câteva mii de ani. Pe scurt. 1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi Terapia biologică cu ajutorul anticorpilor este considerată la ora actuală ca fiind cea mai activă branşă a industriei farmaceutice[16].15]. Ataşat de aceste cozi Fc. urmează exprimarea proteinelor codate şi purificarea acestora [14. Producerea proteinelor recombinate în celule mamifere Tehnica de bază pentru producerea acestor proteine implică mai multe etape care sunt menţionate în tabelul 3.2. Chinezii şi indienii sunt cei cărora li se atribuie folosirea terapeutică a serurilor (fracţiunea sângelui în care se găsesc anticorpii alături de alte proteine) încă înaintea erei noastre. Cu ajutorul amorselor specifice. Din punct de vedere istoric. folosirea anticorpilor a fost însă limitată de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au fost: • lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni.

noua tehnologie a premis obţinerea lor prin tehnici relativ simple şi cu costuri substanţial diminuate înlăturând astfel cel de-al treilea dintre dezavantajele amintite anterior. a dus la înlăturarea primului din cele două mari dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali. 89 . Diferenţa între anticorpii policlonali (cei care erau la acea oră în uz medical) şi noii anticorpi (numiţi monoclonali) poate fi comparată. chiar şi numai pentru a face lucrurile mai uşor de înţeles. forme şi culori şi a doua purtând haine personalizate de către un croitor profesionist. cu diferenţa dintre două persoane. Această temere a fost dublată şi de avansarea tehnicilor industriale de producere a moleculelor cu masă moleculară mică care păreau să fi rezolvat în sfârşit problema inexistenţei unor medicamente perfecte. Într-o lucrare de referinţă pentru literatura biomedicală. cel de-al patrulea neajuns amintit mai sus) cât şi de către pragmatismul industriei farmaceutice (care găsea o nouă mină de aur în comercializarea noilor „gloanţe magice” aşa cum le numea Paul Ehrlich. începând de la lenjerie şi până la ultimul nasture al paltonului. Dezvoltarea acestei noi tehnici. şi anume lipsa unei surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene. lumea bio-medicală şi industria farmaceutică a fost în prima instanţă rezervată la posibila utilizare a acestora pe scară largă. Totuşi în anii care au urmat. prima purtând haine de diferite mărimi. entuziaştii au continuat însă lucrul la producerea anticorpilor monoclonali ducând la aprobarea utilizării primului anticorp produs în acest fel nu însă mai repede de un deceniu de la publicarea metodologiei de către Koehler şi Milstein [16]. În ciuda acestor piedici. Începând cu 1975 situaţia avea însă să se schimbe. Chiar dacă uşor exagerată şi poate nu cea mai potrivită din punct de vedere bio-medical. Anticorpii monoclonali produşi iniţial au păstrat neajunsul de a fi produşi în alte specii ducând la declanşarea unui răspuns imun masiv din partea primitorului (cel de-al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv. cu timpul. potenţialul imens al noii tehnologii a incitat atât curiozitatea comunităţii ştiinţifice (interesată în definirea noilor aplicaţii pentru care anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-căutată.Descoperirea antibioticelor în anii 30-40 ai secolului trecut alături de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor într-un con de umbră. doi cercetători anunţă în revista Nature [17] o metodă prin care se pot obţine cantităţi teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorită. de asemenea. folosirea acesteia are un substrat uşor de înţeles şi anume în literatura de specialitate de limba engleză termenii „tailor made antibodies” sunt folosiţi pentru a descrie producerea de anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaţii [18].

anticorpii sunt în aproape toate situaţiile luaţi în calcul la stabilirea strategiei terapeutice alternative sau câteodată constituie chiar terapia de primă alegere. cu o singură excepţie. Aceste date au menirea de a sublinia interesul major al comunităţii bio-medicale şi al guvernelor statelor industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanţate din bani publici) pentru găsirea unor strategii terapeutice specifice pentru tratarea acestei maladii. timpul scurs până la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de încă opt ani de la aprobarea OKT3. un anticorp monoclonal împotriva CD20 de pe celulele 90 . administrarea acestui anticorp a dus la apariţia sindromului eliberării sistemice de cytokine [21] datorită interacţiunii OKT3 cu receptorii pentru porţiunea Fc a IgG. Desigur această turnură a fost posibilă prin îmbunătăţirea permanentă a protocoalelor de lucru şi obţinerea unor anticorpi modificaţi prin tehnologia ADN recombinat. în topul primelor zece produse folosite în tratamentul diverselor afecţiuni existau. diagnostică şi preventivă a îmbolnăvirilor umane [16]. La ora actuală. majoritatea sunt destinaţi tratării cancerelor. De asemenea dintr-un total de 1500 de studii clinice în care sunt testaţi noi anticorpi monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora în tratarea cancerelor.părintele hematologiei şi chemoterapiei (acesta din urmă fiind un termen pe care l-a introdus chiar el). tehnici care au cunoscut o dezvoltare extraordinară în ultimele două – trei decenii. urmaţi de cei conjugaţi cu material radioactiv şi o mică proporţie sunt reprezentaţi de cei conjugaţi cu toxine. Mai mult. rituxan (rituximab). După unii. Datorită eşecului relativ al utilizării acestui medicament şi datorită timpului îndelungat necesar dezvoltării unui nou medicament. Folosirea pe scară largă a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost însă limitată de faptul că acest anticorp de origine murină (produs în celule de şoarece care diferă suficient de celulele umane) induce un răspuns imun amplu în organismul uman [20]. cu mai bine de un secol în urmă) [19]. După cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrării lui Koehler şi Milstein. în 1986 este aprobată utilizarea primului anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. se estimează că cinci din cele zece substanţe vor fi reprezentate de anticorpi în 2014 [16]. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflaţi la ora actuală pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afecţiunilor umane. Dacă în anul 2000. dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor monoclonali reprezintă inovaţia secolului trecut în ceea ce priveste importanţa terapeutică. În 1997. Majoritatea sunt folosiţi ca atare (neconjugati). doar substanţe cu greutate moleculară mică.

În plus dacă anticorpii iniţiali aparţineau clasei IgG1. o 91 . alături de un mecanism de inducere a apoptozei celulelor care exprimă CD20 pe suprafaţă. Acest anticorp chimer (combinaţie între uman şi murin) are multiple mecanisme de acţiune dintre care merită amintite: inducerea toxicităţii celulare indusă de anticorpi (ADCC) şi citotoxicitatea mediată de complement (CDC). diabetul zaharat de tip I. anticorpul păstrează specificitatea pentru care a fost creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de ţinta dorită urmând ca pe celalalt fragment Fab să lege un receptor de pe o celulă efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a distruge celula recunoscută specific. pemfigoidul). Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig. .B devine cel de-al treilea medicament admis pe piaţa din SUA pentru tumori ale celulelor B. Dintre acestea amintim: o modificarea porţiunii Fc a anticorpilor pentru: . anemia hemolitică autoimună.îmbunătăţirea interacţiunii cu receptorii Fc sau Fc de tip neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare.îmbunătăţirea proprietăţilor efectoare prin optimizarea interacţiunii cu sistemul complement. bolile buloase (pemfigusul. vasculita autoimună etc. anticorpii sunt substanţe care interacţionează cu structuri extracelulare sau de pe suprafaţa celulelor. Pe scurt. o multispecificitatea. Mare parte dintre eforturile actuale au menirea de a creşte penetranţa acestor glicoproteine pentru ţinte din interiorul celulelor. adică adăugarea unei alte specificităţi în zona de recunoaştere a Fab. Mai mult. Între timp acest medicament este folosit şi în tratamentul unor boli autoimune cum ar fi artrita reumatoidă. Utilitatea acestei modificări poate fi exemplificată ca şi în figura 4. investigaţii actuale sunt concentrate asupra diversificării activităţii prin schimbarea clasei şi deci a paletei de efecte posibile. prelungirea duratei de injumătăţire cu efecte favorabile datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv. În general. există câteva direcţii prin care se urmăreşte creşterea posibilelor interacţiuni terapeutice.

fie.A Celula tumorala B Celula tumorala Celula imun Celula imun C Celula tumorală D Celula tumorală Celula Celula imun imun nano nano + Figura 4. o enzimă sau chiar o cytokină care să crească puterea distructivă a anticorpului fie direct. în cazul cytokinei prin recrutarea altor celule imune în zona respectivă. Existenţa a două fragmante Fab duce la legarea unui anticorp de două antigene invecinate. Puntea creată are ca efect reducerea dramatică a spaţiului dintre cele două celule permiţând celulei imune să distrugă celula canceroasă în condiţii optime. în acest caz de pe celula tumorală. (C) Alternativ porţiunea Fc poate fi modificată (funcţionalizată) prin ataşarea unei nanosfere care poate avea ca atare un efect toxic asupra celulei tumorale. (B) Modificarea unuia dintre fragmentele Fab poate fi făcută în aşa fel încât acesta să nu mai recunoască ţinta iniţială ci un receptor de pe o celulă imună efectoare aducând-o în imediata vecinătate a celulei tumorale. Celula imună figurată cu linie punctată ramasă la distanţă nu este capabilă să distrugaă celula tumorală. 92 . de care se leagă. anticorpul monoclonal recunoaşte antigenul specific. (D) Este de asemenea posibil ca nanosfera să conţină un material radioactiv. o toxină. Modul de acţiune al anticorpilor bispecifici. (A) Clasic.

Într-un set de experimente menite să caracterizeze potenţialul anticorpilor specifici faţă de diferiţi receptori de pe suprafaţa celulelor B de a determina distrugerea acestora. Este de aşteptat ca o caracterizare precisă a mecanismelor patogenetice să necesite o perioadă relativ lungă de timp. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei Este de dorit ca în viitor. Potenţialul acestor anticorpi va fi studiat fie în preparaţii care conţin doar anticorpul pur fie în alte instanţe cu anticorpul funcţionalizat (Tabelul 2). implementarea metodologiei şi tehnicilor moderne este un deziderat al activităţii prezente şi viitoare a grupului de cercetare. un deziderat este reprezentat de funcţionalizarea anticorpilor îndreptaţi faţă de molecule de pe celulele B. vor fi luaţi în calcul anticorpi consacraţi cum ar fi anti-human CD20 alături de alţi anticorpi a căror ţintă se află tot pe celulele B dar a căror eficienţă în distrugerea acestor celule este încă necunoscută. un diagnostic precoce şi un tratament specific al acestor afecţiuni. în paralel este de dorit abordarea acestei problematici din punct de vedere terapeutic. De asemenea protocoale specifice a căror necesitate poate să apară pe parcursul desfăşurării experimentelor pot fi obtinute de la colaboratorii din afara Institutului. În acest context. 93 . Tehnicile de lucru cu celulele mamifere sunt puse la punct în laborator. De asemenea instruirea personalului şi co-interesarea şi implicarea cercetătorilor externi în tematicile de cercetare ale platformei este esenţială pentru întărirea resursei umane cu expertiză în domeniu. De aceea. De altfel. Odată produse aceste fragmente vor fi caracterizate din punct de vedere bio-chimic şi folosite apoi fie separat fie în diferite combinaţii pentru producerea de anticorpi şi/sau pentru reproducerea bolii umane în animalele de experienţă. caracterizarea precisă a mecanismelor patogenetice implicate în distrucţia tisulară din bolile autoimune sa permită o prevenţie.2. utilizând tehnicile şi aparatura specifică culturilor celulare vor fi produse diverse fragmente recombinate ale unor proteine cu rol cheie în asigurarea adeziunii dintre derm şi epiderm. Desigur importul premanent de know-how relevant pe plan internaţional este esenţial pentru consolidarea cercetării locale şi recunoaşterea validităţii datelor obţinute de către comunitatea ştiinţifică internaţională. celule cu rol cheie în patogeneza autoimună a acestor boli. grupul de cercetare include în preocupările sale problematica legată de caracterizarea răspunsului autoimun în diferite modele de boală. Într-o primă fază. la ora actuală. În vederea atingerii acestui obiectiv.

Integrinele sunt o clasă heterogenă de proteine implicate în diverse procese de la asigurarea contactelor dintre celule şi mediul înconjurător. Un interes primar pentru preocupările noastre îl constituie producerea fragmentelor recombinate ale proteinelor care asigură adeziunea keratinocitelor de stratul dermal. producerea unui model de boală şi modularea acestuia în scop preventiv/terapeutic implică mai multe etape (Tabelul 3). Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii Una dintre direcţiile de cercetare care vor fi abordate în viitor se va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor proteine autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. 94 . contribuind astfel într-un mod inovativ la definirea naturii autoimune a diferitelor entităţi clinice. Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate în patogeneza bolilor autoimune. Atenţia va fi concentrată pe producerea acelor autoantigene a cpror patogenitate este încă incomplet elucidată.Tabel 2. 3. Un exemplu în acest sens îl constituie clonarea fragmentelor de integrine. Obiective Stablilirea dozei 50%1 Model de studiu Culturi celulare ex vivo Strategie Anticorp pur Anticorp funcţionalizat cu nanosfere Anticorp funcţionalizat cu nanosfere + Rx/toxic Anticorp pur Anticorp funcţionalizat cu nanosfere Anticorp funcţionalizat cu nanosfere + Rx/toxic Stabilirea potenţialului preventiv/curativ al anticorpilor funcţionalizaţi 1 Model animal în vivo Este vorba despre doza care provoacă moartea a 50% dintre celule. odată produse aceste fragmente ar putea fi folosite în diferite combinaţii pentru a reproduce caracteristicile bolii umane în animalele de experienţă. la funcţii de recrutare şi transducerea semnalului. Ca şi metodologie de lucru. Nu este deocamdată clar în ce fel şi în ce masură autoanticorpii faţă de aceste molecule sunt implicaţi în patogeneza autoimună. Strategiile de lucru abordate pentru atingerea celor două obiective majore. De aceea.

folosirea autoantigilor modificaţi . cantităţi variabile de autoanitgen. diagnostic şi tratament a bolii induse: .izolarea claselor şi subclaselor din sursa de anticorpi policlonali şi investigarea mecanismelor efectoare prin care aceştia produc boala .Tabel 3. granulocite prin FcR etc.folosirea nanosferelor direcţionate specific împotriva celulelor imune autoreactive Imunizarea unor animale intermediare cu diferite combinaţii de proteine recombinate şi izolarea anticorpilor specifici produşi Transferul pasiv al acestor anticorpi în şoarecii de laborator Dezvoltarea strategiilor de prevenţie.folosirea diverselor căi de administrare.folosirea anticorpilor din diferite surse şi evaluarea mecanismelor patogenetice specifice fiecăruia (sistem complement. adjuvanţi. diagnostic şi tratament: .) .folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau funcţionalizaţi cu nanosfere . Etape recomandate pentru modelare în scop preventiv/terapeutic a unei boli autoimune în animalele de experienţă Denumire etapă Obţinerea fragmentelor recombinate ale autoantigenului Activităţi Stabilirea planului de clonare Designul şi producerea de amorse specifice Izolarea ARN-ului mesager RT-PCR Clonarea produşilor obtinuţi prin PCR Exprimarea proteinelor recombinate Imunizarea animalelor de experienţă cu diferite combinaţii de proteine recombinate Evaluarea clinică şi paraclinică a inducerii bolii Dezvoltarea unor strategii de prevenţie.modificarea anticorpilor prin tehnica ADN-ului recombinat (se urmăreşte în acest fel modularea interacţiunii cu diferite mecanisme efectoare prin modificarea spre exemplu a porţiunii Fc a anticorpului) Producerea modelului activ de boală Producerea modelului pasiv de boală 95 .

În ultimii ani. Tendinţa actuală este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN în funcţie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumită clasă de celule efectoare cu implicare în terapia afecţiunilor autoimune şi cancerelor. un accent deosebit a fost pus pe studierea interacţiunilor dintre porţiunea Fc a anticorpilor şi alte proteine efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor imunităţi înnăscute. De altfel interesul tot mai mare în explicarea la nivel molecular a susceptibilităţii la anumite afecţiuni a dus din ce în ce mai frecvent la obţinerea secvenţelor de nucleotide care codează pentru anticorpi. interesul extraordinar în găsirea combinaţiilor optime de anticorpi care să identifice celulele tumorale ţintă şi în acelaşi timp să angajeze un răspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab a început să fie balansată de interesul pentru modificarea porţiunii Fc în vederea creşterii efectivităţii. specificitate este adusă de către modificarea/modificările din porţiunea Fc astfel încât acestea să poată activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 5). specificitate pentru un alt receptor de pe o celulă citotoxică spre exemplu). Pe lângă specificitatea pentru celula tumorală ţintă şi cea pentru nanoparticule. patra etc. Astfel. iar o a treia. cea de-a doua porţiune Fab poartă specificitatea agentului terapeutic (nanosfera radioactivă sau toxina. Deşi acest lucru era cunoscut de mai multă vreme. De asemenea structura primară a lanţului polipeptidic care formează porţiunea Fc a anticorpilor este implicată în reactivităţile diferite observate la folosirea diverselor preparaţii de anticorpi. Cercetări recente au arătat că există diferenţe esenţiale între acţiunea diverşilor anticorpi care la prima vedere sunt identici. anticorpii multispecifici posedă şi alte specificităţi care să le crească capacitatea funcţională benefică. prin modificarea 96 . semnificaţia funcţională a acestui detaliu structural a rămas un mister până de curând. Ideea de bază este că un sistem imun „acordat” perfect reuşeşte să distrugă celulele nedorite prin implicarea la timpul şi momentul potrivit a potenţialului uriaş pe care celulele imunităţii il posedă. Spre exemplu. Este vorba despre adăugarea diferitelor lanţuri glucidice care fac anticorpii entităţi glicoproteice. Explicaţia propusă a fost că diferenţa este datorată unor modificări postranslaţionale apărute în porţiunea Fc a anticorpilor. S-a dovedit recent că o scădere a syalilarii lanţului glucidic din această porţiune duce la creşterea activării celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. sistemul complement). Se vorbeşte în acest sens despre anticorpi trispecifici/multispecifici în care pe lângă specificitatea porţiunii Fab pentru ţinta dorită. S-a dovedit astfel existenţa unei concordanţe între aceste secvenţe şi capacitatea lanţurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare.

6… Celula imună 3 2 1 nano-r x/tox ROS.Celula imună Celula tumorală/ autoimună 4 5. În prezent se urmăreşte lărgirea paletei de experimente şi metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroşi membri ai acestuia se află în prezent în diverse laboratoare partenere unde deprind metode şi tehnici noi pe care dorim să le implementăm odată cu reintegrarea acestora în laboratorul de origine. De asemenea.6…). Mecanisme de acţiune ale anticorpilor multispecifici. porţiunii Fc pe partea stângă a figurii. prin „personalizarea” interacţiunii fragmentului Fc cu celulele care poartă receptori pentru acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot avea ca rezultat o activare crescută a acestor celule cu producerea speciilor reactive de oxigen şi eliberarea proteazelor efectoare (5. folosirea unei duble specificităţi a porţiunii variabile a fragmentului Fab face posibilă recrutarea în vecinătatea tumorii a celulelor T citotoxice (4).specificitatea şi afinitatea mare 97 . Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca şi agenţi biologici în tratamentul cancerului amintim: .timpul de înjumătăţire crescut faţă de moleculele cu greutate moleculară mică ceea ce face posibilă scăderea dozei utilizate . În plus. proteaze CDC Figura 5. anticorpul capătă proprietăţi sporite de activare a sistemului complement care fie direct (2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune.

Diferite mecanisme de acţiune ale anticorpilor monoclonali Mecanism de acţiune propus ADCC1 CDC Inducerea apoptozei Blocarea interacţiunii factorilor de creştere cu receptorii specifici Blocarea fizică a dimerizării receptorilor pentru factorii de creştere Inhibarea neoformării vaselor sangvine Blocarea factorilor de creştere în forma solubilă Funcţionalizarea/conjugarea cu radioizotopi. toxine. Tabel 4. Cercetări recente au arătat că ADCC este mai eficientă la acei indivizi care prezintă anumite polimorfisme în porţiunea Fc (respondenţi cu grad înalt) [23.24].- - multiple mecanisme de acţiune care pot fi combinate (vezi anticorpi multispecifici pentru ADCC şi CDC) posibilitatea folosirii acestora ca şi terapie complementară/alternativă oricărei forme de terapie anti-canceroasă tradiţională utilizarea lor ca şi vehicul specific pentru transportul diverselor substanţe anticanceroase spre diverse destinaţii (vezi anticorpi bispecifici) utilizarea lor ca şi markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite afecţiuni în anumite cazuri anticorpii pot per se să controleze creşterea tumorii prin interferarea cu căile de semnalizare celulară. fie prin inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de creştere [22]. legarea concomitentă a Fv (partea a Fab) de antigenul ţintă şi a Fc de o celulă cum ar fi macrofagul sau celula NK care posedă receptori pentru această porţiune duce la activarea celulei imune urmată de distrugerea celulei ţintită specific. enzime sau cytokine 1 Reprezentant Anti-CD20 Anti-CD20 Anti-CD20 Anti-EGFR Anti-EGFR Anti-Her2/neu Anti-EGFR Anti-VEGF-A AntiDiverşi Referinţa bibliografică [23.29] [22] Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizaţi acţionează asupra ţintelor specifice prin acest mecanism. 98 .24] [22] [25] [26] [26] [27] [28.

14. (2009) A novel humanized neonatal autoimmune blistering skin disease model induced by maternally transferred antibodies. et al. et al. 5. Schroeder TJ. Exp Dermatol 14: 861-875. Ujiie H. N Engl J Med 350: 1079-1080. Sindrilaru A. Sitaru C. Kimball JA. (1995) The OKT3 4. Ujiie H. Norman DJ. Nat Med 13: 378-383. Sitaru C (2007) Immunopathology and molecular diagnosis of autoimmune bullous diseases. J Immunol 183: 4088-4093. Takahashi K.4. Mihai S. 3. Cell Mol Life Sci 67: 1343-1351. J Immunol 184: 2166-2174. J Cell Mol Med 11: 1117-1128. Haußer I. Roesler J. Natsuga K. 8. Oswald E. 17. (2007) NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. Chiriac MT. Zillikens D. (2010) A novel active mouse model for bullous pemphigoid targeting humanized pathogenic antigen. 16. Holers VM. et al. editor. Liu Z. Otto C. Mihai S. et al. et al. Chiriac MT. Mihai S. Lisi P. Chowdhury PS. Ito K. J Dermatol 37: 194-204. 18. Evensen M. Zillikens D (2005) Mechanisms of blister induction by autoantibodies. 1st ed. (2009) Pathogenicity of IgG subclass autoantibodies to type VII collagen: Induction of dermal-epidermal separation. J Pathol 212: 56-65. 10. Sitaru C. Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. J Autoimmun. Feldrihan V. (2010) Cross-reactivity of autoantibodies from patients with epidermolysis bullosa acquisita with murine collagen VII. J Cell Mol Med 11: 462-481. Travers P. Herrero-Gonzalez JE. Goto M. In: Zhiqiang A. Vidarsson G. Thurman JM. (2007) IgG4 autoantibodies induce dermal-epidermal separation. Goodall M. Shibaki A. 19. Chiriac MT. et al. Shimizu H (2010) What's new în bullous pemphigoid. 13. Murphy KM. Li Z. 12. Nishie W. J Clin Invest 115: 870-878. Sawamura D. (2008) Subepidermal blistering induced by human autoantibodies to BP180 requires innate immune players în a humanized bullous pemphigoid mouse model. et al. Li N. Wang G. Nishie W. Mihai S. Nishie W. (2005) Induction of dermal-epidermal separation în mice by passive transfer of antibodies to type VII collagen. Goto M. Kohler G. Methods 36: 11-24. Csorba K. et al. Cluj-Napoca: Babes-Bolyai University. Shinkuma S. 15. et al. Walport M (2007) Janeway's Immunobiology. Recke A. Shibaki A. 9. Sitaru C. Schwartz RS (2004) Paul Ehrlich's magic bullets. J Autoimmun 31: 331-338. Zhiqiang A (2009) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. et al.Bibliografie 1. (2007) Humanization of autoantigen. 20. Nishie W. Sui W. Chiriac MT. Scharffetter-Kochanek K. Sesarman A. Jefferis R. 6. 120 p. 11. J Immunol 178: 6514-6521. Chiriac MT (2007) Inflammatory Mechanisms of Tissue Damage Induced by Antibodies. Sawamura D. Shibaki A. Fritsch A. 99 . (2007) The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction în experimental epidermolysis bullosa acquisita. New York and London: Garland. New Jersey: Wiley. 2. Wu H (2005) Tailor-made antibody therapeutics. Chiriac MT. et al. 7. Zhao M. Sawamura D. Shield CF. Nature 256: 495-497.

et al. Press OW (2000) Signaling events involved în anti-CD20-induced apoptosis of malignant human B cells. et al. Winer J. Albanell J. Gerber HP. (1993) Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth în vivo. Cancer Immunol Immunother 48: 673-683. Systemic cytokine release and modulation by corticosteroids. 26. Transplantation 49: 697-702. (1990) în vivo cell activation following OKT3 administration. Dacheux L. 22. Ferran C. Zafir-Lavie I. Legendre C. Thouard I. Levy R (2003) Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab în patients with follicular lymphoma. Li B. 28. Blood 99: 754-758. Nature 362: 841-844. Cartron G. 24. Shan D. Oncogene 26: 3714-3733. Ferrara N. Novotny W (2004) Discovery and development of bevacizumab. Weng WK. Nat Rev Drug Discov 3: 391-400. Michaeli Y. Bardos P. Transpl Immunol 3: 212-221. et al. Solal-Celigny P. Rovira A. Mellado B. J Clin Oncol 21: 3940-3947. Ledbetter JA. Codony J. 100 . Hillan KJ. 29. Gascon P (2003) Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and 2C4. 23. 27. Merite S. Ferguson KM (2004) Active and inactive conformations of the epidermal growth factor receptor. an anti-VEGF antibody for treating cancer. Gillett N. Chatenoud L. Salles G. Adv Exp Med Biol 532: 253-268. Kim KJ. Antibody Response Study: a multicentre study of human anti-mouse antibody (HAMA) production following OKT3 use în solid organ transplantation. Armanini M. (2002) Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism în IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. 25. Biochem Soc Trans 32: 742-745. Reiter Y (2007) Novel antibodies as anticancer agents.21.

..... 111 2........................................................................ Cipuri ADN ...................4.......... 108 2..2...................................... 102 1............. Efectul Raman rezonant.. Aplicaţii bio-medicale ..2........... 112 3.1. Structuri alotrope de carbon .............................................................................................................................................. Aplicaţii în ştiinţa materialelor ..3....3.3. 119 4...............................2... Accesorii ......... 102 1............................... Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic .............................................. 113 3......2........... Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 şi a parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse aplicaţii ............................................... 109 2...........................3......................... Aplicaţii în stiinta mediului........... 112 3................................... Bibliografie ........2.....3............. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman ......................................2............1........... 104 1........2...... Modul de microscopie de forţă atomică model alpha 300 .................................... 107 2... Identificarea fazelor cristaline şi a tranziţiilor de fază...... 119 101 ..........2............................1...................3....... Localizarea şi identificarea unor bacterii .............................3............................. 117 3..................................................................... 107 2.......1....................... Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 ...... Celula Linkam ........ 109 2.......................................3.......................................... 117 3...............................................1. Efectul Raman ...............2.1... Monica Maria Baia Cuprins 1...1................................ Aplicaţii ale microspectroscopiei Raman............... 107 2...................1....................................3............ 111 3...1............................... Analiza domeniilor amorfe ............................III.......... Imagistica Raman confocală.............................. 115 3...........2.....1.......... 108 2.......... Parametrii optimi de funcţionare ..................... 103 1...................... Microspectroscopia Raman confocală ........ Înregistrarea spectrelor Raman confocale ....................... Analiza medicamentelor anticanceroase .............. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN Microspectroscopia Raman Conf......................1.......................... 110 2......2....... dr... Spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă .................. Detecţia poluanţilor din apă................................................. 109 2................2...... 113 3.................................................... 105 2......................... 111 2..2......

pe nivelele vibraţionale ale stării fundamentale cu energii mai mari se va găsi un număr mult mai mic de electroni. 1). şi care poartă numele de împrăştiere Rayleigh. de o parte şi de cealaltă a liniei Rayleigh [1.1.1. etc. 2]. un micro-organism. în urma căruia rezultă o cuantă a cărei energie rămâne neschimbată. Dacă o cuantă de lumină hν 0 nu este absorbită de o moleculă ea poate să sufere fie un proces de împrăştiere elastică. hν 0 . Efectul Raman O rază de lumină incidentă pe o probă (de exemplu o celulă biologică. Liniile Raman denumite Stokes şi anti-Stokes se găsesc simetric. 2]. De aceea. un material. aşa încât. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman 1. are o probabilitate de apariţie mult mai mare decât cel în urma căruia se eliberează o cuantă de energie hν 0 + hν s (linii anti-Stokes).) interacţionează cu atomii sau moleculele constituiente şi poate fi absorbită sau împrăştiată [1. 102 .h ν s hν0 h ν0 hν0 hν0 + hνs v=1 v=0 Imprastiere Rayleigh Imprastiere Raman (Stokes) Imprastiere Rayleigh Imprastiere Raman (anti-Stokes) Figura 1. în conformitate cu legea de distribuţie a lui Boltzmann. Diagrama tranziţiilor care au loc între diferite nivele energetice vibraţionale şi care corespund proceselor de împrăştiere Rayleigh şi Raman La temperatura mediului ambiant cea mai mare parte a electronilor se află pe nivelele vibraţionale ale stării electronice fundamentale cu energiile cele mai mici. procesul Raman. Nivel electronic excitat Energie hν0 hν0 hν0 h ν0 . fie un proces de împrăştiere inelastică care este cunoscut sub denumirea de împrăştiere Raman şi în urma căruia sunt emise cuante de energie hν 0 ∓ hν s (Fig. în urma căruia este eliberată o cuantă de energie hν 0 − hν s (linii Stokes).

Intensitatea benzilor Raman este în general de 3 ÷ 5 ordine de mărime mai mică decât intensitatea liniei Rayleigh.2. 1.h ν s h ν0 hν0 . Efectul Raman rezonant În spectroscopia Raman se folosesc în mod curent ca surse de excitare lasere cu lungimi de undă situate în domeniul vizibil (verde şi rosu) şi infraroşu-apropiat care nu au energie suficientă pentru a produce prima tranziţie electronică a majorităţii moleculelor. care la rândul său reprezintă aproximativ 10-4 . 3].10-8 din fotonii incidenţi sunt transformaţi în fotoni Raman.h ν s h ν0 . evitându-se astfel excitarea fluorescenţei [1. Se face distincţie între două tipuri de efecte Raman rezonant: efectul pre-rezonant şi efectul rezonant (vezi Fig. 2). Totuşi există substanţe care au capacitatea de a împrăştia radiaţia laser cu o intensitate de până la 106 ori mai mare decât cea a semnalului Raman normal. h ν0 h ν0 h ν0 . dacă energia laserului este apropiată de valoarea energiei necesare unei tranziţii electronice (efect Raman rezonant). deci doar 10-6. (b) efectului Raman pre-rezonant.10-3 din intensitatea radiaţiei incidente excitatoare. care este mai intensă cu câteva ordine de mărime decât semnalul Raman şi care apare mai ales la investigarea biomoleculelor şi a sistemelor biologice. În unele cazuri observarea efectului Raman este impiedicată de apariţia fluorescenţei. 2. Aceste neajunsuri pot fi înlăturate prin utilizarea unei surse de excitare (laser) cu lungimea de undă situată în domeniul infraroşu-apropiat (NIR) sau prin utilizarea unor tehnici speciale cum ar fi cea bazată pe efectul Raman rezonant sau spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă (surface-enhanced Raman spectroscopy SERS) [1-4]. cu cât energia de excitare este mai apropiată de energia necesară tranziţiei electronice cu atât este mai mare intensitatea 103 . ceea ce limitează detecţia unor molecule aflate în concentraţie mică. (c) efectului Raman rezonant.hνs (a) (b) (c) Figura. În cele mai multe cazuri. Diagrama tranziţiilor care au loc între diferite nivele energetice în cazul (a) efectului Raman convenţional.

Amplificarea semnalului Raman (de 106-108 ori) este explicată cu ajutorul a două mecanisme principale de amplificare [1. O contribuţie majoră la amplificarea electromagnetică este datorată plasmonilor de suprafaţă. Astfel. Tranziţiile de ordin superior. Spectroscopia Raman rezonantă se foloseşte mai ales la investigarea moleculelor poliatomice mari. în lipsa unor semnale spectrale datorate mediului înconjurător (ex. Spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă Efectul amplificării semnificative a semnalului Raman al moleculelor adsorbite pe suprafaţa rugoasă a unui electrod de argint a fost descoperit de Fleischman şi colab. unde absorbţia este localizată într-o anumită zonă a moleculei. 1. care duce la procese de transfer de sarcină între nivelele fundamentale şi cele excitate ale moleculelor adsorbite [6]. 5]: electromagnetic (amplificare a semnalului Raman de 104÷106 ori) şi chimic (amplificare a semnalului Raman de 10÷102 ori). Pentru folosirea efectului Raman rezonant nu este necesar un echipament special. se modifică regulile de selecţie şi vor fi amplificate doar anumite tranziţii vibraţionale Raman. În plus. săi în 1974 [5]. care sunt asociaţi oscilaţiilor colective ale electronilor de conducţie de pe suprafaţa particulelor metalice. Câmpurile locale rezultate amplifică intensitatea radiaţiei Raman emise. Modificarea regulilor de selecţie precum şi amplificarea tranziţiilor vibraţionale specifice de până la 106 ori permit utilizarea spectroscopiei Raman pre-rezonantă cât şi rezonanţa la un număr mare de aplicaţii din fizicp. la aşa numiţii cromofori. biochimie şi biologie. Efectul chimic al amplificării este asociat suprapunerii funcţiilor de undă ale metalului şi adsorbatului.3. Amplificarea semnalului Raman rezultă din excitarea acestor plasmoni de suprafaţă de către radiaţia incidentă. se folosesc doar lasere cu lungime de undă variabilă care să permită ajustarea energiei de excitare la valoarea necesară unei absorbţii electronice. care este proporţională cu pătratul amplitudinii câmpului electric incident pe moleculă. Amplificarea Raman rezonantă permite izolarea benzilor Raman datorate acestor cromofori şi a unităţilor structurale situate în vecinătatea lor facilitând astfel analizarea zonei cromoforice care este de obicei zona activă. O amplificare suplimentară apare datorită excitării plasmonilor de suprafaţă de către radiaţia Raman emisă de molecule. apar benzi noi din analiza cărora se pot obţine informaţii structurale suplimentare.benzilor observate. sunt deseori observabile într-un spectru Raman rezonant. cum sunt cele biologice. Ionul negativ obţinut are configuraţii geometrice de echilibru diferite faţă de cele 104 . 4. proteine). chimie. care de obicei nu se observă într-un spectru Raman convenţional.

a unor antigene specifice prostatei [13]. Acest lucru combinat cu faptul că intensitatea câmpului electromagnetic scade cu creşterea distanţei faţă de suprafaţă permite determinarea orientării speciilor adsorbite în raport cu suprafaţa. suspensiile coloidale de Au şi Ag. SERS poate fi exploatată la identificarea selectivă a unor specii moleculare precum şi la detecţia unei singure molecule [10]. 1. Pentru a întelege mai bine raţiunile care au stat la baza evoluţiei spectroscopiei micro-Raman este foarte importantă cunoaşterea tuturor factorilor care contribuie la modificarea intensităţii semnalului ( S ) „livrat” de detectorul unui spectrometru în cazul unei linii Raman înregistrată la o lungime de undă λ . modurile de vibraţie care rezultă dintr-o modificare a polarizabilităţii perpendicular pe suprafaţă vor fi amplificate. deoarece intensitatea câmpului electromagnetic local este maximă pe direcţia perpendiculară la suprafaţă. de mediu. Astfel. Pentru a optimiza amplificarea electromagnetică frecvenţa laserului trebuie să coincidă cu frecvenţa de rezonanţă plasmonică. sunt utilizate mai multe tipuri de substrate active SERS. SERS a fost utilizată ca un mecanism de transpunere a semnalului în senzori chimici. 105 . Astfel de exemple sunt analiza unor cantităţi reduse de pesticide [11]. Deoarece amplificarea depinde de proprietăţile substratului.Microspectroscopia Raman confocală În urmă cu aproximativ două decenii au fost efectuate primele măsurători Raman cu ajutorul unui microscop. filmele metalice de Au şi Ag. În particular. etc. De aceea. Pentru realizarea unui experiment SERS se foloseşte în principiu acelaşi echipament ca şi în cazul realizării unui experiment Raman convenţional.4. 8]. glucoza [14] şi a unor reziduuri nucleare [15]. biomedical. Regulile de selecţie ale spectroscopiei Raman amplificată de suprafaţă (SERS surface-enhanced Raman spectroscopy) sunt în principiu aceleaşi ca şi în cazul spectroscopiei Raman convenţionale [7. Îmbunătăţirea majoră era dată de folosirea unui obiectiv de microscop prin intermediul căruia se realiza atât iluminarea probei cât şi colectarea luminii împrăştiate.ale moleculei neutre neadsorbite. Datorită sensibilităţii de detecţie remarcabile şi a flexibilităţii sale de aplicare tehnică SERS este utilizată în mod frecvent pentru a soluţiona o mare varietate de probleme cu caracter analitic. Cele mai des folosite sunt electrozii de Au. Ag. Recent. şi de securitate globală şi naţională [9]. transferul de sarcină duce la apariţia unei molecule neutre excitată vibraţional şi la emisia unui foton Raman. Cu. antrax [12].

S ∝ I L ⋅ σ λ ⋅ N m ⋅ Ω ⋅ Tλ ⋅ s λ . unde I L este intensitatea radiaţiei laser incidentă pe probă (W⋅cm-2). Important în astfel de situaţii ramâne faptul ca mediul în care se face imersarea să nu influenţeze structura şi proprietăţile probei investigate. care focalizează radiaţia laser şi culege lumina împrăştiată sub un unghi solid mare. şi rezoluţie spaţială paralelă la axa optică sau rezoluţie axială). N m reprezintă numărul de molecule din volumul de probă investigat V P . specificate foarte exact de către producător. σ λ este secţiunea specifică de împrăştiere Raman (cm2⋅sterad-1⋅molecula-1). etc. ulei. şi a unui obiectiv de microscop. iar Tλ and s λ reprezintă capacitatea de înregistrare a instrumentului şi respectiv sensibilitatea detectorului la lungimea de undă λ . doar câţiva parametrii pot fi modificaţi astfel încât să se compenseze reducerea numărului de molecule N m . Eficienţa de colectare a luminii este aproape în totalitate influenţată de apertura numerică NA a obiectivului de microscop care este definită de relaţia NA = n sin θ max în care n este indicele de refracţie al mediului dintre obiectiv şi probă iar θ max este unghiul maxim de colectare al obiectivului. Ω este unghiul solid din care se face colectarea luminii împrăştiate Raman.) impune utilizarea unor obiective speciale care posedă caracteristici diferite pentru fiecare mediu. duce atât la obţinerea unui spectru Raman mai bun din punct de vedere calitativ cât şi la localizarea unei anumite zone de interes comparativ cu cazul în care acesta este înregistrat fără obiectiv de microscop [16]. În numeroase studii micro-Raman apare un neajuns deoarece informaţia spectrală obţinută nu este culeasă dintr-un volum suficient de mic (referirea se face în termeni de rezoluţie spaţială perpendiculară la axa optică sau rezoluţie laterală. Se poate observa că atunci cand se doreşte examinarea unui volum V P foarte mic dintr-o probă. Utilizarea unui astfel de mediu (apă. În microscopul convenţional întregul câmp vizual este uniform 106 . Aceştia sunt intensitatea radiaţiei laser incidentă pe proba I L şi unghiul solid Ω din care se face colectarea luminii împrăştiate Raman. a cărei putere poate fi reglată într-un domeniu relativ larg. Astfel. Se poate observa că în cazul unor măsurători efectuate cu un obiectiv de microscop imersat într-un mediu al cărui indice de refracţie este apropiat de cel al probei investigate (nu există o modificare a drumului razelor de lumină la trecerea într-un mediu cu indice de refracţie diferit) apare o îmbunătăţire a eficienţei de colectare şi a rezoluţiei spaţiale. utilizarea unei linii laser.

2. Confocalitatea poate fi de asemenea obţinută şi prin restrângerea ariei de pe detector unde intensitatea radiaţiei Raman este mare (realizarea unei ”aperturi electronice”). În paragrafele următoare sunt prezentate succint principalele informaţii care se pot obţine în urma aplicării microspectroscopiei Raman pe diferite sisteme de studiu.95) şi poate conduce la obţinerea de informaţie spectrală dintr-un tub focal cu un diametru de 1. Aplicaţii ale microspectroscopiei Raman Spectroscopia Raman este o tehnică care pe lângă faptul că permite obţinerea de informaţii extrem de rapide despre structura. în cele mai multe cazuri aplicarea ei nu necesită prepararea prealabilă a probei. nedistructivă şi extrem de puţin sensibilă la prezenţa apei. modificările structurale şi morfologice care apar în diferite tipuri de probe poate oferi şi unele avantaje unice în comparaţie cu alte tehnici. 2. ca fiind neinvazivă. Spectroscopia Raman poate fi utilizată pentru a examina interacţiunile dintre molecule mici şi ADN.iluminat şi observat.1. Experimentele iniţiale constă în înregistrarea spectrelor medicamentelor în soluţie în vederea realizării unei caracterizări Raman fundamentale. această tehnică spectroscopică poate fi considerată. Analiza medicamentelor anticanceroase Producerea unor structuri moleculare capabile să se ataşeze de diferite secvenţe ale unui lanţ de ADN reprezintă un domeniu de cercetare intens datorită importanţei pe care o are acest subiect în obţinerea unor compuşi noi cu potenţial terapeutic. spectroscopia Raman poate fi singura metodă care să permită detecţia lor în interiorul celulelor în absenţa unor marcări fluorescenţi. microscopul confocal utilizează o diafragmă (pinhol) care izolează radiaţia luminoasă care provine din zona marginală a volumului în care a fost focalizat fascicolul laser (zona din afara focarului). în cazul unor medicamente anticanceroase care nu prezintă fluorescenţă. Astfel. Aplicaţii bio-medicale 2.9 – 0. Spre deosebire de acesta. Astfel. Utilizarea primei metode de obţinere a confocalităţii necesită în general folosirea unor obiective de microscop cu apertură numerică mare (NA = 0. prin prezenţa pinholului se realizează o filtrare spaţială a radiaţiei. În plus. în funcţie de tipul aplicaţiei.22λ/NA şi o adâncime de 4λ/NA2 [17]. Astfel.1. 107 . la detector ajungând doar radiaţia din volumul în care a fost focalizat laserul [17].1.

Majorita108 . dacă există o secvenţă cunoscută de ADN fixată într-o anumită zonă a suprafeţei cipului şi dacă apare procesul de hibridizare al unui lanţ de ADN în acea poziţie. 2. suprafaţa cipului se foloseşte atât ca imobilizator al lanţului de ADN cât şi ca substrat activ SERS pentru lanţul de ADN marcat care va fi adus în vecinătate datorită procesului de hibridizare cu lanţul imobilizat. bacterii sau viruşi. În cele din urmă. în care diagnosticarea pe baza hibridizării este utilizată în mod eficient pentru a obţine informaţii despre secvenţele de ADN.2. (b) localizarea sa într-o anumită regiune sub-celulară (de ex.1. Prin înregistrarea spectrului Raman este posibilă diferenţierea marcărilor fluorescenţi care dau benzi Raman specifice. (c) forma chimică a compusului în interiorul celulei (de ex. microscopia Raman se poate utiliza pentru a studia medicamentele în interiorul celulelor şi a furniza informaţii despre: (a) interacţiunea dintre compus şi mediul celular. nucleu sau citoplasmă). Localizarea şi identificarea unor bacterii Cercetările din medicină şi biologie se confruntă cu necesitatea identificării precise a unor micro-organisme. Tehnica SERS poate fi utilizată în semnalarea unirii unui lanţ de ADN cu lanţul complementar şi formarea structurii dublu elicoidale. În aceste experimente.3.1.Următorul pas constă în efectuarea de studii Raman ale medicamentelor ataşate de anumite secvenţe ale unor oligonucleotide pentru a obţine informaţii de bază care vor fi mai apoi utilizate când se studiază in vitro aceste procese [18]. Astfel. 2. se poate determina secvenţa de ADN din acel lanţ [18]. Astfel. În plus. pentru a detecta cantităţi extrem de reduse ale unui anumit lanţ de ADN existent într-o probă se foloseşte tehnica SERS [18]. Metoda standard de detecţie a procesului de hibridizare foloseşte marcări fluorescenţi. Cipuri ADN Biocipurile revoluţionează diagnosticarea clinică modernă şi tehnicile farmaceutice datorită rapidităţii de testare a probelor şi de livrare a rezultatelor. ca de ex. fapt care face posibilă testarea diferitelor secvenţe care există într-o zonă a cipului. dacă în spectrul SERS se observă benzile moleculei folosite ca marker înseamnă că s-a produs hibridizarea ADN-ului. Acest fenomen este cunoscut sub denumirea de hibridizare şi stă la baza tehnologiei de obţinere a cipurilor ADN. dacă sunt posibile formele protonate sau neprotonate) [18].

Aplicaţii în ştiinţa materialelor 2. În plus. poate fi de asemenea evidenţiată prin spectroscopia Raman. Spectroscopia Raman confocală oferă posibilitatea identificării unor bacterii individuale. Un alt studiu a dovedit că temperatura la care are loc tranziţia de fază ortorombic-tetragonal a structurii ceramice de BaTiO3 depinde de mărimea grăunţilor [21].2.2.2. care este prezentă în Rhodotorula rubra şi a benzilor date de sarcinaxantin. S-a arătat faptul că structura cristalină a clusterilor nanometrici de TiO2. Este cazul structurilor preponderent amorfe.tea metodelor de identificare folosesc o evaluare morfologică combinată cu teste specifice în care se urmăreşte dezvoltarea micro-organismelor în diferite medii şi care durează până la 72 de ore. Cunoaşterea spectrelor Raman ale diferitelor faze cristaline permite caracterizarea tranziţiilor de fază care apar la modificarea temperaturii sau a presiunii prin analiza comparativă a modificărilor care apar în cazul modurilor de vibraţie.2. sarcinaxantin) în citoplasma membranei.1. 2. După înregistrarea spectrelor Raman şi analizarea benzilor date de β-carotina. suferă o tranziţie de la faza de rutil la anatas atunci când dimensiunile lor depăşesc 5 nm [20]. Trebuie menţionat faptul că prin folosirea laserului care excită rezonant cromoforii se obţin doar benzile acestora. existent în Micrococcus luteus. s-a reuşit identificarea celor două bacterii. care uneori este în strânsă corelare cu tranziţiile de fază. obţinuţi prin depunere din faza gazoasă. contribuţiile celorlalte componente nefiind prezente în spectru [3]. Existenţa unei diferenţe în energia de suprafaţă ca urmare a modificării dimensiunii nanoparticulelor. Analiza domeniilor amorfe Informaţiile obţinute prin aplicarea spectroscopiei micro-Raman sunt uneori mult mai utile decât cele determinate din analiza de raze X. observarea unor moduri vibraţionale interzise în spectrele Raman reprezintă o dovadă a distorşilor care apar la nivelul reţelei cristaline [19]. s-a reuşit identificarea unor bacterii care conţin un cromofor (β-carotina. 2. ceea ce facilitează identificarea directă a fazelor cristaline [19]. apoi au fost amestecate şi o mostră de analiză a fost investigată cu ajutorul unui echipament Raman confocal. Pentru aceasta au fost cultivate mai multe bacterii Rhodotorula rubra şi Micrococcus luteus. Atât studiile cristalografice cât şi 109 . Identificarea fazelor cristaline şi a tranziţiilor de fază Spectrul Raman a diverse nanostructuri este asemănător spectrului unui monocristal. De exemplu.

de la structuri cu grad de cristalinitate extrem de ridicat la structuri amorfe. Separarea fazelor poate fi de asemenea studiată în cazul sticlelor unde valoarea numărului de undă la care apare semnalul Raman este strâns legată de conectivitatea unităţilor structurale poliedrice constitutive [24].cele de spectroscopie Raman se bazează pe a interpreta măsura dezordinii în termeni de lărgime a benzii. Structuri alotrope de carbon Microspectroscopia Raman a fost des utilizată la studiul structurilor alotrope ale carbonului (diamant. Astfel. fulerene.2. Este una dintre puţinele tehnici sensibile la modificările structurale care apar în aceste tipuri de materiale. modurile Raman de deformare sunt influenţate de dezordinea geometriei locale. În timp ce în cazul difracţiei de raze X apariţia lărgimii benzii este asociată cu abaterile de la periodicitate a reţelei cristaline pentru un număr însemnat de atomi.3. Lărgimea celorlalte benzi Raman este în principal afectată atunci când au loc modificări ale câmpului cristalin local. Atribuirea benzilor în aceste cazuri se face pe baza comparaţiei cu spectrele experimentale obţinute pe faze cristaline similare compoziţional structurii sticlelor sau vitroceramicilor investigate. în timp ce modurile de intindere sunt afectate de dezordinea vecinătăţilor. 2. cu precădere în cazul structurilor dominate de legături covalente puternice. în cazul spectroscopiei Raman doar modurile de vibraţie ale reţelei şi cele de libraţie (care se găsesc la numere mici de undă) sunt afectate de dezordinea la mare distanţă.). dar nu poate fi facută o separare spaţială a acestora [22].5 nm) şi respectiv în cea de a doua (0. Cel mai rapid mod de a obţine componenta amorfă şi cea cristalină este de a deconvoluţiona modurile Raman situate la numere de undă mici în vecinătatea liniei Rayleigh care conţin cele două componente [23]. 26]. etc. Aplicarea spectroscopiei micro-Raman la studiul materialelor şi în special al polimerilor poate face uneori distincţie între domeniile conformaţionale submicrometrice cristaline şi amorfe.1-0. Dacă se ţine seama de descrierea moleculară a vibraţiilor. mai exact atunci când apar modificări structurale în ordinea la mică distanţă. în prima sferă de coordinare (0. care sunt reprezentate de anumiţi atomi ai altor subreţele sau de defecte care apar ca urmare a substituţiei de atomi sau a prezenţei vacanţelor. Din datele obţinute în urma analizei de difracţie de raze X se poate evidenţia faptul că există domenii cu structura periodică şi dezordonată. nanotuburi.5-5 nm) [19]. Raportul ariilor celor două benzi oferă o bună estimare a gradului de cristalinitate al probei. grafit. în spectrele Raman ale acestor structuri 110 . sau cu cele obţinute prin simulări teoretice [25.

apar clar definite benzi datorate vibraţiilor date de structuri grafitice (notate G) şi de structuri dezordonate (notate D şi D’). Detecţia poluanţilor din apă Prezenţa poluanţilor organici în apă a devenit o problemă de actualitate pentru comunitatea internaţională.3. Compuşi chimici precum hidrocarburile aromatice. Cunoaşterea proprietăţilor chimice este esenţială pentru dezvoltarea unor modele ecologice folosite pentru remedierea şi detoxificarea de compuşi antropogenici sau chiar de reziduuri nucleare [3]. Tehnica SERS datorită sensibilităţii sale este capabilă să detecteze concentraţii extrem de scăzute ale acestor substanţe. 111 . Determinarea substratului SERS cel mai potrivit pentru fiecare tip de poluant reprezintă un prim pas în dezvoltarea unui senzor bazat pe metoda SERS. Acestea au stabilit o concentraţie maximă permisă a acestor compuşi în apa potabilă de < 1 μg/l. Pentru a detecta aceste concentraţii mici este necesară folosirea unor tehnici instrumentale extrem de sensibile. Persistenţa precum şi efectele toxicologice ale acestor compuşi şi ale produşilor lor intermediari sunt semnale de alarmă pentru agenţiile de resort din lume. derivaţii toxici de azot. benzile datorate modurilor de respiraţie radială (Radial Breathing Mode) cu ajutorul cărora se poate determina diametrul nanotubului (relaţie de inversă proporţionalitate cu valoarea frecvenţei Raman) [19].3. Aplicaţii în ştiinţa mediului 2. Studiile SERS ale acidului humic au condus la obţinerea unor informaţii legate de mecanismele de legare şi/sau configuraţiile de complexare ale acidului humic.2. Extrem de important este faptul că în cazul nanotuburilor de carbon apar. fenolii sau derivaţii naftalinei sunt prezenţi în mediile acvatice datorită utilizării lor ca pesticide sau în procesele industriale. 2.1. Acidul humic apare în sol şi în apele subterane şi este implicat în numeroase procese chimice şi biologice care au loc în mediul terestru şi acvatic.3. 2. Cu ajutorul acestei tehnici este posibilă determinarea orientării şi a modului de adsorbţie al acestor molecule pe suprafaţa substratului activ SERS [27]. în regiunea numerelor mici de undă (< 200 cm-1). Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic Caracterizarea structurală a acidului humic precum şi determinarea comportamentului lui de complexare sunt extrem de importante în ştiinţa mediului.

20X.45. Echipamentul mai conţine un sistem de focalizare motorizat cu posibilitate de deplasare pe o distanţă de 30 mm şi o rezoluţie de 50 nm (un pas) şi o platformă de scanare prin acţionare piezo-electrică cu următoarele caracteristici: suprafaţa de scanare de 200 μm x 200 μm x 20 μm. Rezoluţia optică laterală la linia laserului de 532 nm este de 250 nm. 0.25 şi mărire 10X.3. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 şi a parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse aplicaţii 3. un YAG 532 nm şi un He-Ne 633 nm.8 şi 1. conectori.achiziţie de spectru/pixel (scanare) . cuplaj cu fibră optică standard SMA.microscopie de câmp întunecat cu obiectiv EC Epiplan-Neofluar 100X/0. detector CCD cu răcire Peltier (1340 x 100 pixeli) şi iluminare prin spate tip Marconi.9 HDDIC. spectrometru UHTS 300. x-z şi y-z (pănă la 1024 x 1024 pixeli) . 112 .imagistica de fluorescenţă confocală (prin montare de filtre adecvate) Sistemul dispune în prezent de 2 lasere. Dimensiunea maximă a probelor care pot fi măsurate este de 120 mm în diametru şi 20 mm înălţime. detecţie Raman între 150-3500 cm-1. acurateţe de poziţionare pe direcţiile x şi y sub 4 nm iar pe direcţia z sub 1 nm.3.1. 50X şi respectiv 100X (uscat şi în ulei de imersie). reflector de câmp intunecat . posibilitate de poziţionare a probei în planul x-y într-o regiune de 20 mm x 20 mm cu o rezoluţie mai mică de 1 μm. Sistemul de microscopie Raman confocală lucrează în următoarele moduri de operare: . 0. Drumul razelor în interiorul echipamentului CRM 200 este prezentat în schema de mai jos (Fig. 50 şi 25 μm). pe direcţiile x-y. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 Echipamentul de microscopie Raman confocală CRM 200 cu scaner este dotat cu un microscop optic care este echipat cu 4 obiective plan acromatizate de apertura numerică (NA) 0. domeniul lungimilor de undă de excitaţie 442-785 nm. două reţele de difracţie cu 600 şi respectiv 1800 linii/mm.microscopie confocală în reflexie .achiziţie de spectre din arii selectate (confocal micro-Raman) .imagistica spectrală Raman la lungimi de undă fixe. fibre optice multimod (100. incluzând de asemenenea un obiectiv (cu cantilever ataşat) pentru analiza AFM în lichide şi o cameră video color. 3) [28].

3.2. NA apertura numerică a obiectivului de microscop. sistem de focalizare motorizat pe axa z 09.5. 113 . este transmisă spectrometrului echipat cu o cameră CCD prin intermediul unei fibre optice multimod. Partea stângă a ecuaţiei este legată doar de parametrii obiectivului de microscop. pentru a obţine cea mai mare rezoluţie laterală vPmax ≤ 0. fibra optică multimod 06. obiectivul 04. Înregistrarea spectrelor Raman confocale În echipamentul CRM 200 radiaţia laser ajunge în microscop printr-o fibră optică standard iar radiaţia Raman împrăştiată. Drumul razelor în microscopul Raman WITec CRM 200. d0 diametrul ≥ NA v P max λ pinholului. 50 şi 25 μm. Fibra este montată în planul imagine al microscopului şi poate fi ajustataă astfel încât să se obţină eficienţa maximă de colectare.2. iar pentru vPmax ≤ 4 nu se modifică semnificativ rezoluţia axială). camera video Figura. iar vPmax este un parametru variabil a cărui valoare trebuie stabilită în funcţie de tipul de informaţie spectrală care se doreşte a fi obţinută (ex.01. colectată cu ajutorul obiectivului de microscop. fibra optică standard 03. laserul 02. Parametrii optimi de funcţionare 3. unde M este mărirea obiectivului.1. platforma de scanare 05. Relaţia care trebuie îndeplinită în cazul măsurătorilor Raman confocal este πd 0 M . λ lungimea de undă. Echipamentul CRM 200 are în dotarea standard trei fibre multimod cu diametre de 100. spectrometru UHTS 300 07. 3. lampa cu lumină albă pentru iluminare 08. Diametrul acestei fibre joacă rolul pinholului cu ajutorul căruia se realizează confocalitatea [29].

pentru a stabili puterea laserului. pentru măsurători în care este utilizat un laser cu lungimea de undă de 532 nm. În caz contrar.). Lungime de undă [nm] d0 = 10 μm d0 = 25 μm d0 = 50 μm d0 = 100 μm d0 = 200 μm 440 29 71 142 286 571 488 26 64 129 258 515 532 24 59 118 236 472 633 20 50 99 199 397 785 16 40 80 160 320 Cu ajutorul celor două tabele poate fi determinată mărimea corectă a pinholului în măsurătorile Raman confocal efectuate cu echipamentul CRM 200.5λ pentru diferite lungimi de undă şi diametre ale pinholului.25 80 100 / 1. De exemplu. Înaintea efectuării măsurătorilor propriu-zise.9 111 100 / 1. cea mai mare rezoluţie axială s-ar obţine pentru un diametru optim al pinholului de 50 μm. un obiectiv de microscop cu mărire de 100 şi o apertură numerică de 0.se lucrează cu fibra de 100 şi cu obiectivul de 20X sau 50X. în vederea stabilirii parametrilor optimi.6 67 60 / 0. În anumite situaţii se poate schimba şi fibra (vezi detaliile despre confocalitate prezentate mai sus) . se pot utiliza puteri mai mari (≤ 3 mW). Puterea laserului trebuie aleasă astfel încât să nu inducă transformări probei (fotodegradare.4 71 Tabelul 2. Raportul M/NA pentru diferite tipuri de obiective de microscop. Obiectiv microscop M/NA 10 / 0. etc. în experimente SERS pe molecule biologice se foloseşte o putere a laserului sub 1 mW.4 50 40 / 0. se foloseşte intensitatea liniei Rayleigh (ar fi bine să nu depăşească 400 ccd cts. . în cazul în care nu se obţine semnal Raman se creşte puterea laserului). în timp ce cea mai mare rezoluţie laterală s-ar obţine pentru un diametru optim al pinholului de 10 μm. Dacă proba de interes nu este predispusă la transformări din cauza laserului. Dacă semnalul Raman obţinut este bun.8 75 100 / 0.25 53 20 / 0.9. se parcurg următoarele etape: . fiind indicat să fie chiar mai mică de 200 ccd cts. apare riscul de a obţine semnal de la contaminanţi sau se poate degrada molecula.Tabelul 1.stabilirea timpului de înregistrare se face în funcţie de intensitatea semnalului Raman obţinut (se poate alege de ordinul milisecundelor sau de ordinul minutelor) 114 . Raportul πd0/2. iar spectrele obţinute să aibă un raport semnal/zgomot multumitor. Astfel. se schimbă obiectivul de 100X.

Exemplu: Spectrul SERS al adeninei înregistrat pe substrat solid obţinut prin picurarea soluţiei coloidale de argint cu adenină pe o sticlă de microscop. 115 . Înaintea efectuării unei scanări se stabilesc parametrii optimi de înregistrare (puterea laserului şi timpul de integrare) prin măsurarea spectrelor individuale şi time series.1 s şi 1 s). Imagistica Raman confocală Pentru imagistică este indicată utilizarea obiectivului de 100X (în aer sau cu imersie în ulei). 35000 30000 25000 Intensity [ccd cts] 20000 15000 10000 5000 0 400 600 800 1000 1200 -1 1400 1600 1800 Raman shift [cm ] Parametrii folosiţi: • fibra multimode de 100 μm • obiectivul 100X aer • linia laser 632. În ceea ce priveşte stabilirea numărului de linii şi de puncte pentru suprafaţa pe care dorim s-o scanpm. ideal este să fie cât mai mic cu puţinţă (între 0. Exemplu.8 nm • puterea laserului 640 μW • timp de integrare/măsurare 60 s 3.2.2. Harta spectrală a intensităţii benzii Raman de la 737 cm-1 din spectrul SERS al adeninei înregistrat pe substrat solid obţinut prin picurarea soluţiei coloidale de argint cu adenina pe o sticlă de microscop. Referitor la timpul de integrare. în general pentru o arie de 10 μm x 10 μm se utilizeazp minim 75 linii şi 75 de puncte pentru fiecare linie (la un număr prea mic de linii şi de puncte imaginea este de proastă calitate). iar stabilirea lui depinde de tipul probei. de puterea laserului şi de aria scanată.

500

737

400

Intensity [ccd cts]

300

200

100

0 500 1000 1500
-1

Raman shift [cm ]

În spectrul selectat din imaginea scanată se poate observa semnalul “curat” de la adenină. Parametrii folosiţi: • fibra optică multimod 100 μm • obiectivul 100X (aer) • linia laser 632.8 nm • puterea laserului: 640 μW • suprafaţa scanată: 10 μm x 10 μm • 75 linii; 75 puncte/linie • timp de integrare 0.5 s/punct (softul calculează timpul de integrare pentru o linie – în acest caz 37,5 s (trace) şi 0.075 s (retrace) Exemplu. Imagistica Raman pe o secţiune dintr-un dinte, la interfaţa dintre dinte şi plombă

116

Parametrii folosiţi: • fibra optică multimod 100 μm • obiectivul 100X (aer) • linia laser 532 nm • putere laser 3 mW. • suprafaţa scanată 10 μm x 10 μm • nr. de linii 150, puncte 150/linie • timp de integrare 0.2 s/punct

3.3. Accesorii
3.3.1. Modul de microscopie de forţă atomică model alpha 300 Echipamentul de microscopie Raman confocală CRM 200 cu scaner este combinat cu un modul de microscopie de forţă atomică (AFM) model alpha 300.

01. camera video 02. unitatea de deflexie a razelor 03. lampa cu lumină albă pentru iluminare 04. obiectivul AFM cu cantilever 05. platforma de scanare 06. masa antivibraţie

Figura 4. Drumul razelor în microscopul de forţă atomică alpha300.

Microscopul AFM alpha 300 lucrează în următoarele moduri: contact mod, forţă laterală, acustic (tapping) mod, contact mod intermitent cu imagistica în fază şi amplitudine cu o rezoluţie de 16 bit, digitizare 5 MHz, şi frecvenţa 10-500 KHz. Sistemul dispune de un laser de deflexie 980 nm, o unitate de detecţie a deflexiei, masa antivibraţie 0.7 – 1000 Hz, > 1000 Hz pasivă. Aria de scanare este de 100 μm x 100 μm x 20 μm. Drumul razelor în interiorul microscopului de forţă atomică alpha 300 este prezentat în schema de mai sus (Fig. 4) [30]. 117

Parametrii optimi de funcţionare 1. Modul acustic (AFM AC-Mode) • Este modul de operare uzual, utilizat mai ales în cazul probelor moi (probe biologice). • Se folosesc tip-uri de Si3N4 fixate pe cantilever-uri cu frecvenţa de rezonanţă mare (200 – 300 kHz). • În vederea realizării alinierii se efectuează următorii paşi: • Se determină frecvenţa liberă de oscilaţie a cantileverului aplicând o tensiune de 0.05 –0.1 V • Se ajustează amplitudinea oscilaţiilor libere ale cantilever-ului până la o tensiune de 2 V • Se setează un setpoint de 1.5 V • Se setează P-gain (proportional gain) la 5.0 şi I-gain (integral gain) la 5.0. • Valorile tipice ale parametrilor pentru scanare sunt: • Număr puncte pe linie: 256 • Număr linii pe imagine: 256 • Timpul scanare pe linie: 0.5 – 2 s • În timpul scanării se ajustează P-gain şi I-gain astfel încât drumul înainte şi drumul înapoi să coincidă. • Apropierea tip-ului de substrat se face automat.

Imagine topografică AFM

Imagine fază AFM

2. Modul contact (AFM contact mode) - Permite înregistrarea de imagini, scanarea de-a lungul unei singure linii sau înregistrarea curbelor de forţă. - în vederea realizării alinierii se efectuează următorii paşi: - Se utilizează tip-ul de AFM dorit. 118

Se setează P-gain (proportional gain) la 5.0 şi I-gain (integral gain) la 5.0. - Apropierea tip-ului de substrat se face automat. - Valori tipice ale parametrilor pentru scanare: - Număr puncte pe linie: 256 - Număr linii pe imagine: 256 - Timpul scanare pe linie: 0.5 – 2 s peraturi.
• • • • •

3.3.2. Celula Linkam pentru efectuarea unor măsurători la diferite temDomeniul de temperatură: -196 - 600 °C. Stabilitate < 0.1 °C. Rata de încălzire: max 150 °C/min. Senzor din platină 100 Ω. Sistem de răcire a corpului celulei cu apă pentru temperaturi > 300 °C.

4.Bibliografie
I. R. Lewis, H. G.M. Edwards (Eds.), Handbook of Raman Spectroscopy, Marcel Dekker Inc. New York, 2001. 2. S. Astilean, Metode şi tehnici moderne de spectroscopie optica, Spectroscopia IR şi Raman, Editura Casa Cartii de Stiinta, Cluj-Napoca, 2002. 3. R. Petry, M. Schmitt, J. Popp, Raman Spectroscopy–A Prospective Tool în the Life Sciences, ChemPhysChem, 4, 14, 2003. 4. S. Schluecker, (Ed.), Surface Enhanced Raman Spectroscopy: Analytical, Biophysical and Life Science Applications, Wiley VCH, 2010. 5. M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chem. Phys. Lett., 26, 163, 1974. 6. T. Vo-Dinh, SERS chemical sensors and biosensors: new tools for environmental and biological analysis, Sensors and Actuators B, 29, 183, 1995. 7. J. A. Creighton în Spectroscopy of Surfaces, Vol. 21 (Eds.: R. J. H. Clark, R. E. Hester), John Wiley & Sons, New York, 1988. 8. D. A. Weitz, M. Moskovits, J. A. Creighton în Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with Emphasis on Liquid - Solid Interfaces, Vol. 2 (Eds.: R. B. Hall, A. B. Ellis),VCH, Deer field Beach, FL, pp. 197- 243, 1986. 9. G. A. Baker, D. S. Moore, Progress în plasmonic engineering of surface-enhanced Raman-scattering substrates toward ultra-trace analysis, Anal. Bioanal. Chem. 382, 1751, 2005. 10. K. Kneipp, H. Kneipp, P. Corio, S. D. M. Brown, K. Shafer, J. Motz, L. T. Perelman, E. B. Hanlon, A. Marucci, G. Dresselhaus, M. S. Dresselhaus, Surface-Enhanced and Normal Stokes and Anti-Stokes Raman Spectroscopy of Single-Walled Carbon Nanotubes, Phys. Rev. Let. 84, 3470, 2000. 11. N. Weissenbacher, B. Lendl, J. Frank, H. D. Wanzenboeck, B. Mizaikoff, R. Kellner, Continuous Surface Enhanced Raman Spectroscopy for the Detection of Trace Organic Pollutants în Aqueous Systems, J. Mol. Struct. 539, 410, 1997. 1.

119

12. X. Zhang, M. A. Young, O. Lyandres, R. P. Van Duyne, Rapid Detection of an Anthrax Biomarker by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, J. Am. Chem. Soc. 127, 4484, 2005 13. D. S. Grubisha, R. J. Lipert, H. Y. Park, J. Driskell, M. D. Porter, Femtomolar detection of prostate-specific antigen: an immunoassay based on surface-enhanced Raman scattering and immunogold labels, Anal. Chem., 75, 5936, 2003. 14. K. E. Shafer-Peltier, C. L. Haynes, M. R. Glucksberg, R. P. Van Duyne, Toward a Glucose Biosensor Based on Surface-Enhanced Raman Scattering, J. Am. Chem. Soc., 125, 588, 2003; C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang, J. T. Jr. Walsh, R. P. Van. Duyne, A glucose biosensor based on surface-enhanced Raman scattering: improved partition layer, temporal stability, reversibility, and resistance to serum protein interference, Anal. Chem. 76, 78, 2004. 15. L. Bao, S. M. Mahurin, R. G. Haire, S. Dai, Silver-doped sol-gel film as a surface-enhanced Raman scattering substrate for detection of uranyl and neptunyl ions, Anal. Chem. 75, 6614, 2003. 16. J. M. Chalmers and P. R. Griffiths, (Eds.), Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley and Sons, Chichester, pp. 1419-1428, 2002. 17. N. J., Everall, Depth Profiling with Confocal Raman Microscopy, Part II, Spectroscopy 19, 16, 2004. 18. C. G. Coates, J. J. McGarvey, On the Pulse: Andor tehchnology, 1(8), 2001. 19. G. Gouadec, P. Colomban, Raman Spectroscopy of nanomaterials: How spectra relate to disorder, particle size and mechanical properties, Progress în Crystal Growth and Characterization of Materials 53, 1, 2007. 20. E. Barborini, I. N. Kholmanov, P. Piseri, C. Ducati, C.E. Bottani, P. Milani, Engineering the nanocrystalline structure of TiO2 films by aerodynamically filtered cluster deposition, Appl. Phys. Lett. 81, 3052, 2002. 21. M. H. Frey, D. A. Payne, Grain-size effect on structure and phase transformations for barium titanate, Phys. Rev. B, 54, 3158, 1996. 22. A. Guinier, Théorie et Technique de la Radiocristallographie, Dunod, Paris, 1956. 23. M. F. Cerqueira, L. Rebouta, M. Andritschky, J.A. Ferreira, M. F. Da-Silva, Microcrystalline silicon thin films prepared by RF reactive magnetron sputter deposition, Vacuum 46, 1385, 1995. 24. D. G. Georgiev, M. Mitkova, P. Boolchand, G. Brunklaus, H. Eckert, M. Micoulaut, Molecular structure, glass transition temperature variation, agglomeration theory, and network connectivity of binary P-Se glasses, Phys. Rev. B, 64, 134204, 2001. 25. D. G. Georgiev, P. Boolchand, K.A. Jackson, Intrinsic nanoscale phase separation of bulk As2S3 glass, Phil. Mag., 83, 2941, 2003. 26. Y. Wang, J. Wells, D. G. Georgiev, P. Boolchand, K. Jackson, M. Micoulaut, Sharp Rigid to Floppy Transition Induced by Dangling Ends în a Network Glass, Phys. Rev. Lett., 87, 185503, 2001. 27. E. A. Carrasco, M. Campos-Vallette, P. Leyton, G. Diaz, R. E. Clavijo, J. V. Garcıa-Ramos, N. Inostroza, C. Domingo, S. Sanchez-Cortes, R. Koch, Study of the Interaction of Pollutant Nitro Polycyclic Aromatic Hydrocarbons with Different Metallic Surfaces by Surface-Enhanced Vibrational Spectroscopy (SERS and SEIR), J. Phys. Chem. A, 107, 9611, 2003. 28. http://www.witec.de/en/company/witecnews/19/crm200flyer.pdf 29. Manual WITec CRM200. 30. www.witec.de/en/download/AFM/alpha300Aflyer.pdf

120

Microspectroscopia Raman – partea a II-a
Conf. dr. Monica Maria Baia Cuprins
1. Stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectroscopie Raman................... 121 1.1. Substrate SERS ............................................................................................. 122 1.2. Identificarea unor bacterii ............................................................................. 122 1.3. Caracterizarea celulelor ................................................................................. 123 1.4. Diagnosticarea unor boli ............................................................................... 124 1.5. Aplicaţii în domeniul farmaceutic................................................................. 125 1.6. Aplicaţii în domeniul alimentar .................................................................... 125 1.7. Nanotuburi de carbon ................................................................................... 126 2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocală din cadrul platformei ICI-BNS................................................................................... 126 3. Tematici de cercetare posibil de implementat în cadrul laboratorului de microscopie Raman confocală al platformei ICI-BNS .......................................... 128 4. Bibliografie ........................................................................................................... 130

1. Stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectroscopie Raman
În ultima perioadă, odată cu dezvoltarea tehnologică a aparaturii aferente care permite înregistrarea rapidă a spectrelor Raman folosind diferite linii de excitare laser precum şi vizualizarea zonelor cu ajutorul microscopiei de forţă atomică sau a celei electronice de baleiaj, microspectroscopia Raman este din ce în ce mai mult aplicată în diverse domenii cum ar fi: medicină, biologie, studiul materialelor, geologie şi mineralogie, arta, ştiinţa mediului, controlul calităţii alimentelor, etc. [1]. Datele bibliometrice furnizate de Thomson Reuters ISI Web of Science confirmă faptul că în perioada 2001-2009 numărul publicaţiilor referitoare la spectroscopia Raman şi aplicaţiile ei s-a dublat de la 1931 înregistrate în 2001 la 4078 apărute în 2009 [1]. Această creştere a numărului de publicaţii este datorată, în principiu, următoarelor motive: (a) dezvoltării continue a metodei SERS; (2) progresului extraordinar înregistrat în domeniul fabricării controlate a nanomaterialelor şi a nanostructurilor; (3) creşterii eficienţei în imagistica biomedicală şi de diagnosticare a bolilor; (4) numărului tot 121

mai mare de aplicaţii în afara laboratorului (artă, arheologie, criminalistică, farmaceutice), (5) designului tot mai sofisticat şi controlat al pulsurilor laser ultrarapide utilizate în aplicaţii care exploatează efectele Raman neliniare. Din domeniul vast de aplicabilitate al spectroscopiei Raman se remarcă cu precădere aplicaţiile biomedicale, axate pe diagnosticarea unor boli, de identificare a unor bacterii, de investigare a unor celule vii, cele din domeniul nanoparticulelor şi nanomaterialelor, precum şi cele din domeniul artei şi arheologiei, farmaceutic şi alimentar. Astfel, în continuare vom face o trecere în revistă a principalelor domenii de aplicabilitate, făcând o referire concretă la cele mai recente cercetări.

1.1. Substrate SERS
În ultimii ani, metoda SERS s-a dezvoltat considerabil datorită obţinerii unor substrate SERS capabile să producă o amplificare importantă a semnalului Raman al speciilor adsorbite, reproductibilă şi stabilă în timp. Uniformitatea răspunsului SERS al substratelor depinde de morfologia lor. Astfel, s-a dovedit că gradul de amplificare poate fi controlat prin utilizarea unor metode de nanofabricare a structurii suprafeţei în termeni de mărime, formă şi distanţa dintre formaţiunile de pe suprafaţă, pe care adsorb speciile moleculare. Astfel, în ultima perioadă pe lângă substratele SERS obţinute prin litografie cu fascicul de electroni, litografie cu nanosfere de polistiren [2-4] au fost preparate şi substrate constând din nanoparticule anizotrope de forme diferite [5, 6]. De asemenea, au fost realizate noi substrate constând din nanotuburi de TiO2 pe care a fost depus Ag, sau nanofire de ZnO pe care a fost depus Au [7, 8] toate manifestând o activitate SERS remarcabilă.

1.2. Identificarea unor bacterii
Identificarea rapidă şi precisă a micro-organismelor a devenit o cerinţă importantă nu numai pentru analizele clinice, sau cele ale unor materiale frauduloase, ci şi în diferite aplicaţii cum ar fi producţia de medicamente sau tehnologia de procesare a mâncării. În toate aceste aplicaţii este de dorit ca timpul de cultivare a micro-organismelor să fie minimizat pentru a prescrie pacienţilor în timp util tratamentul corespunzător sau pentru a reduce timpul în care unităţile de producţie sunt închise din cauza unor disfuncţionalităţi. Majoritatea metodelor convenţionale de identificare a bacteriilor se bazează pe efectuarea unor teste chimice după cultivarea microorganismelor în diferite medii şi necesită timp îndelungat. Dintre tehnicile 122

care permit identificarea rapidă a micro-organismelor spectrosopia Raman a devenit una dintre cele mai promiţătoare metode [9] . Procedura de caracterizare a unei celule bacteriene cu ajutorul spectroscopiei Raman constă în patru etape: colectarea micro-organismelor, localizarea moleculelor biologice cu ajutorul unor markeri fluorescenţi, înregistrarea spectrelor Raman şi compararea lor cu alte spectre existente în baze de date în scopul identificării bacteriilor. Combinând rezultatele Raman cu o metodă de clasificare bazată pe chemometrie s-a reuşit identificarea subspeciei unor bacterii cu o probabilitate de 98% [10]. O altă modalitate de identificare a bacteriilor şi/sau a sporilor este cu ajutorul metodei SERS. În acest caz, se detectează prezenţa unui compus chimic, cunoscut ca biomarker al sporilor sau al bacteriei [11]. Relativ recent, a fost dezvoltată o metodă de identificare a unor bacterii pe un cip microfluidic [12]. Prin aplicarea unui câmp electric pe un electrod de aur s-a reuşit sortarea bacteriilor, concentrarea lor şi apoi, prin înregistrarea specrelor SERS în cip, cercetătorii au fost capabili să identifice fiecare bacterie pe baza semnăturii sale spectrale. Testele au fost efectuate pentru două tipuri de bacterii Gram positive (Staphylococcus aureus) şi Gram negative (Pseudomonas aeruginosa). Cu ajutorul acestei metode se îmbunătăţeste semnificativ timpul şi efortul necesar identificării diferitelor bacterii din mâncare sau altă materie organică.

1.3. Caracterizarea celulelor
Spectroscopia Raman este o metodă sensibilă pentru studiul biochimic al celulei fiind capabilă să pună în evidenţă modificări care apar în urma interacţiunii cu diferiţi agenţi [13]. Pe de altă parte, microscopia de forţă atomică oferă informaţii despre topografia suprafeţei, adeziunea şi elasticitatea celulară a unei celule. Prin utilizarea combinată a celor două metode pot fi investigate proprietăţile biomecanice şi biochimice ale celulelor vii în diferite condiţii fiziologice [14]. Spectrele Raman ale celulelor vii constă din benzi corespunzătoare biopolimerilor existenţi în celule (lipide, proteine, ADN, ARN). Cu ajutorul spectrelor Raman este posibilă discriminarea celulelor vii de cele moarte. Acest lucru este extrem de important în realizarea unui biosenzor. De asemenea, cu ajutorul spectroscopiei Raman este posibilă monitorizarea în timp a interacţiunii dintre celule şi diverse medicamente, precum şi diferite elemente toxice folosite în bioterorism, în vederea stabilirii efectelor acestei interacţiuni.

123

1.4. Diagnosticarea unor boli
După introducerea spectroscopiei Raman în studiul pielii de către Williams et all în 1992 [15] utilizarea ei în acest domeniu a devenit tot mai frecventă. În prezent, spectrele Raman înregistrate pe piele sunt bine analizate şi pe baza diferenţelor s-a pus în evidenţă existenta unor boli [16, 17]. Deoarece intensitatea semnalului Raman este scăzută, timpii de achiziţie sunt extrem de lungi şi din această cauză aplicaţiile clinice sunt reduse. Relativ recent, s-a reuşit implemetarea spectroscopiei Raman în aplicaţii clinice prin intermediul unui sistem capabil să înregistreze şi să analizeze în timp real spectre Raman in vivo [18]. Cu ajutorul acestui sistem s-a reuşit efectuarea unei evaluări a pielii unor voluntari precum şi diagnosticarea unor boli ale pielii. S-a constatat că există regiuni spectrale care prezintă benzi specifice pentru piele provenită din diferite regiuni ale corpului. De asemenea, s-a constatat că semnăturile spectrale specifice ale pielii diferă de la un individ la altul. Astfel, prin evaluarea raportului dintre conţinutul de lipide şi proteine se poate face o evaluare a pielii precum şi o diagnosticare cu ajutorul spectroscopiei Raman [19]. De asemenea spectroscopia Raman permite identificarea şi monitorizarea melaninei, un pigment natural care acţionează ca un scut împotriva radiaţiei solare, înlătură speciile chimice active şi produce radicali activi care afectează ADN-ul. Cancerul este o boală complexă indusă de o instabilitate genetică şi o acumulare a unor alternări moleculare multiple [20]. Deoarece diagnosticarea timpurie implică o rată de supravieţuire ridicată, un interes deosebit l-a avut dezvoltarea unor metode de detecţie moleculară care să permită vizualizarea unor biomarkeri sau a unor evenimente celulare şi să indice starea de fapt a cancerului. Spectroscopia Raman este o metodă utilă în diagnosticarea cancerului datorită sensibilităţii sale de a detecta modificări moleculare extrem de mici care sunt asociate cu cancerul, cum ar fi o creştere a raportului dintre nucleu şi citoplasmă, existenţa cromatinei dezordonate, o activitate metabolică crescută şi modificări ale cantităţilor de lipide şi proteine [21]. În principal spectroscopia Raman a fost aplicată la diagnosticarea cancerului de piele, de sân, de tract gastrointestinal şi cervical sau de col uterin [21]. Senzorii optici bazaţi pe metoda SERS au fost în ultima perioadă destul de des folosiţi pentru diagnosticarea in vitro şi in vivo a cancerului [22]. Ei sunt capabili să ofere informaţii moleculare specifice despre moleculele ţintă de interes, fără o marcare prealabilă a acestora.

124

1.5. Aplicaţii în domeniul farmaceutic
Spectroscopia Raman a devenit o metodă rapidă, directă şi nedistructivă în analizele farmaceutice, odată cu dezvoltarea aparatelor şi a metodelor chemometrice de analiză. Majoritatea studiilor se bazează pe investigarea ingredientului farmaceutic activ şi în consecinţă, bazele de date existente conţin informaţii referitoare la aceste ingrediente. Reletiv recent [23] a fost publicată o bază de date cu spectre Raman ale mediului excipient în care este înglobat ingredientul farmaceutic activ, astfel încât se pot realiza analize complete ale produselor farmaceutice. În ultima perioadă, creşterea cantităţii de medicamente contrafăcute pe piaţă pune în pericol sănătatea cetăţenilor şi ridică un semnal de alarmă. Aceste produse pot fi dăunătoare sănătăţii deoarece conţin impurităţi inodore, pot fi inactive şi/sau să aibă o absorbabilitate scăzută sau chiar inexistentă. De asemenea, aceste medicamente pot conţine alte ingrediente decât cele dorite, cantităţi incorecte ale agenţilor farmaceutici activi sau ambalaje necorespunzătoare. Cu ajutorul spectroscopiei Raman se pot obţine informaţii specifice legate de identificarea ingredientului farmaceutic activ, a mediului excipient, precum şi informaţii utile legate de identificarea elementelor necunoscute [24].

1.6. Aplicaţii în domeniul alimentar
Melamina este un ingredient folosit la obţinerea plasticului, dar este frecvent adăugat în mod abuziv şi în mâncare, pentru a crea impresia falsă a unui conţinut ridicat de proteine, deoarece această moleculă conţine un număr mare de atomi de azot. În anul 2007, aproximativ 1700 de câini şi pisici din SUA au murit ca urmare a consumului de mâncare contaminată cu melamină [25]. În ţesuturile şi urina animalelor moarte au fost detectate, pe lângă melamină, şi cantităţi reduse de acid cianuric, amelina şi amelida, care au rezultat cel mai probabil din descompunerea unor derivaţi ai melaminei [26]. În anul 2008, 54000 de copii au fost intoxicaţi iar 5 au murit ca urmare a consumului de lapte contaminat, produs în China. Mai târziu s-a aflat că melamina a fost introdusă intenţionat în multe alte produse lactate produse în China şi destinate exportului [25]. Spectroscopia Raman a fost utilizată în analizarea melaminei din gluten, hrana pentru pui, prăjituri şi tăiţei [27]. A fost de asemenea identificată melamina din făina contaminată, gluten din porumb, hrana pe bază de soia, lapte praf şi a fost stabilit un algoritm de analiză calitativă şi cantitativă a melaminei din amestecuri [26]. În plus, spectroscopia Raman împreună cu 125

În plus. carbon poros grafitizat şi grafit. printre tematicile de cercetare ale platformei se regăsesc multe dintre cele prezentate anterior. Astfel. Astfel. în general şi a celor funcţionalizate. Spectroscopia micro-Raman confocală a fost utilizată şi la stabilirea compoziţiei unor sucuri de fructe [28]. 2. microspectroscopia Raman poate fi o metodă de analiză complementară sau alternativă măsurătorilor de turbiditate care sunt de obicei utilizate în industria alimentară în producţia berii. Acest fapt ar permite utilizarea acestei metode pentru monitorizarea on-line a conţinutului acestor substanţe în sucurile aflate în diferite stagii de producţie.7. Limita de detecţie a melaminei a fost de 1%. monitorizarea apei. etc. această metodă ar putea oferi informaţii şi despre caracteristicile lor biochimice. se desfăşoară cercetări interdisciplinare axate pe fabricarea şi biofuncţionalizarea unor nanoparticule de metal nobil. Prin utilizarea combinată a spectroscopiei Raman cu alte tehnici de analiză se pot obtine informaţii cantitative referitoare la particulele nedorite prezente în sucurile de fructe [29]. fructoza şi β-carotenul. În toate aceste studii s-a urmărit banda caracteristică a melaminei de la 676 cm-1. nanotuburi de carbon cu un perete sau cu mai mulţi pereţi. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocală din cadrul platformei ICI-BNS În prezent. Heise şi colaboratorii săi [31] au caracterizat materiale pe bază de carbon utilizând spectroscopia Raman prin compararea spectrelor înregistrate pe filtre cu nanotuburi de carbon. Nanotuburi de carbon Spectroscopia Raman este o metodă consacrată pentru caracterizarea nanotuburilor de carbon. 1. în cadrul grupului care utilizează echipamentul de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 combinat cu un modul de microscopie de forţă atomică (AFM) model alpha 300. S-a determinat existenţa a trei componente importante ale sucurilor de fructe şi anume pectina. S-a demonstrat modul în care deschiderea sau închiderea reversibilă a nanotuburilor poate fi utilizată pentru a monitoriza cu succes procesul de umplere [32]. precum şi a unor 126 . C59N şi antracena. Spectroscopia Raman a fost de asemenea aplicată la investigarea nanomaterialelor încapsulate în nanotuburi de carbon pentru a determina procesul de umplere a nanotuburilor cu C60. pe lângă faptul că ar detecta particule nedorite. în special [30].imagistica Raman au fost utilizate pentru o testare rapidă a hranei în vederea detecţiei melaminei pentru a creşte siguranţa şi securitatea publică.

În figura de mai jos (Fig. s-a dovedit a avea proprietăţi multifuncţionale atât ca senzor SERS cât şi ca senzor LSPR [33. 1a) şi a nanoparticulelor sintetizate şi testate din punct de vedere a capacităţii lor de amplificare a semnalului Raman al unor specii moleculare adsorbite pe suprafaţa lor (Fig. 41. O parte a substratelor SERS obţinute. Selecţie de imagini a substratelor SERS ordonate (a) şi a nanoparticulelor de metal nobil sintetizate (b). proteine şi biopolimeri relevanţi (PEG. Toate aceste studii contribuie la înţelegerea mecanismelor care stau la baza amplificării SERS. 42]. În cadrul unui studiu. 1. Câteva dintre nanoparticulele obţinute au fost utilizate în aplicaţii biomedicale cu impact în nanomedicină bazate pe proprietăţile optice. mai ales cele constând din nanoparticule de metal nobil. 44]. chimice 127 . S-a studiat interacţiunea diferitelor biomolecule (triptofan. Astfel. 1b). folosind metode de auto-asamblare. chitosan.) cu nanoparticule metalice de forme şi dimensiuni diferite [39-41. iar în cazul celor dezordonate au fost obţinute diferite tipuri de nanoparticule metalice care au fost asamblate pe substrate solide funcţionalizate/nefuncţionalizate anterior [37-45]. Prin combinarea imagisticii AFM cu imaginile SERS înregistrate prin microspectroscopie Raman confocală s-a reusit evidenţierea implicării mecanismului plasmonic de amplificare la semnalul de bază SERS [36]. cu scopul de a permite dezvoltarea unor noi aplicaţii spectroscopice şi plasmonice. ordonate şi dezordonate. s-a reuşit corelarea activităţii SERS cu topologia substratului cu ajutorul imagisticii Raman [35]. etc. în cazul substratelor ordonate s-au folosit nanosfere de polistiren peste care au fost depuse filme metalice [33-36]. (a) (b) Figura. 1) este prezentată o selecţie a tipurilor de substrate SERS ordonate obţinute (Fig.).nanostructuri hibride. 43. glutation etc. albumină. O mare parte a activităţii de cercetare este concentrată pe obţinerea de noi substrate SERS.

Au fost efectuate numeroase investigaţii cu scopul înţelegerii spectrelor. Au fost de asemenea efectuate studii de detecţie SERS intracelulare utilizând nanoparticule de aur PEGylate şi marcate cu coloranţi [44] Rezultatele obţinute demonstrează faptul că nanoparticulele prezintă stabilitate. s-a demonstrat că o serie de nanobastonaşe de aur sau alte nanoparticule de metal nobil anizotrope. o boală metabolică. la animale şi în câteva cazuri şi la oameni. Astfel. Există numeroase studii în literatură referitoare la utilizarea metodelor spectroscopice complementare Raman şi de absorbţie în IR în analizarea osului şi a cartilajelor. realizându-se şi studii complementare de absorbţie în IR. Doar în ultimii ani. În majoritatea studiilor spectroscopia Raman a fost acompaniată de imagistica Raman sau AFM. Tematici de cercetare posibil de implementat în cadrul laboratorului de microscopie Raman confocală al platformei ICI-BNS Având în vedere stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectroscopie Raman precum şi dotările existente în cadrul platformei. caracteristici care conferă acestui tip de markeri SERS aplicabilitate ca şi agenţi imagistici în interiorul organismelor vii [44]. În cadrul unui alt studiu s-a dovedit că o serie de nanoparticule de argint de formă triunghiulară invelite în chitosan posedă activitate bactericidală. şi osteogeneza imperfectă. cercetătorii au considerat spectroscopia vibraţională ca o metodă capabilă să furnizeze informaţii legate de diagnosticarea bolilor care apar la nivelul ţesuturilor muscularo-scheletale [46. şi corelării caracteristicilor spectrale cu modificările care apar datorită vârstei sau a diverselor boli. de obicei învelite într-un strat polimeric biocompatibil. s-ar putea aborda noi tipuri de experimente bio-medicale de diagnosticare a unor boli cum ar fi cele ale sistemului osos sau arteroscleroza. 3. Au fost investigate două dintre cele mai importante boli ale oaselor şi anume osteoporoza. conservându-şi identitatea Raman in vitro. fiind capabile să distrugă Staphylococcus aureus [45]. în grupul de cercetare care utilizează echipamentul de microscopie Raman confocală WITec CRM 200 combinat cu modulul de microscopie de forţă atomică (AFM) model alpha 300. Se ştie că 128 . pot fi utilizate în terapia fototermică a cancerului [40].şi termice ale nanoparticulelor de aur în detecţia şi tratamentul la nivel celular al cancerului (hipertermie locală indusă laser) sau în evaluarea profilului de toxicitate a nanopartirculelor în medii celulare. 47]. care constă dintr-o serie de defecte genetice care afectează scheletul.

vor exista contribuţii ale fotonilor din afara acestei zone. Această confinare duce la modificări ale spectrului de vibraţie al materialelor nanostructurate în comparaţie cu cel al materialului bulk. în spectrul Raman. De asemenea au fost investigate prin spectroscopie Raman efectele de confinare a fononilor optici în materialele nanostructurate [53]. Aceste modificări ale structurii sunt reflectate în spectrele Raman şi IR ale probelor [46. În timp. elastina. Metodele spectroscopice vibraţionale sunt capabile să identifice ţesuturile anormale afectate de această boală [48]. 47]. ea devine turbulentă şi inegală. Studii efectuate pe nanostructuri poroase 129 . S-a constatat că în principiu metodele spectroscopice vibraţionale pot fi atât un instrument de diagnosticare cât şi o metodă care să monitorizeze progresul tratamentului asupra bolii. maladia se tratează medical cu aminobisfosfonaţi iar spectroscopia poate juca un rol important în urmărirea progresului tratamentului.) şi lipidelor. În prezent. prin depunerea de calciu se formează plăcile ateromatoase. În ultima perioadă. Aceste plăci se formează datorită colesterolului şi grăsimilor prezente în cantităţi excesive în sânge (datorită greşelilor de alimentaţie) care se "infiltrează" în pereţii arterelor. Ea se datorează prezenţei aşa-numitelor plăci ateromatoase pe pereţii arterelor.un os afectat de osteoporoză are un grad de cristalinitate crescut şi un domeniu mai îngust de cristalinitate decât osul sănătos. etc. În cadrul unui studiu a fost analizată dependenţa deplasării benzilor Raman în funcţie de dimensiunea unor nanocristale [52]. deoarece absenţa periodicităţii la dimesiuni sub cele ale particulei relaxează regulile de selecţie ale fononilor optici în regiunea centrală a zonei Brillouin şi prin urmare. spectroscopia Raman s-a dovedit a fi o metodă fezabilă în studiul materialelor nanostructurate. infarct miocardic. şi se pot localiza plăcile ateromatoase prin prezenţa benzilor caracteristice carbonatului de calciu [49-51]. manifestată în special prin fracturi la nivelul oaselor lungi. Osteogeneza imperfectă este o maladie genetică al cărei principal semn clinic este fragilitatea osoasă crescută. Arteroscleroza stă la baza apariţiei majorităţii bolilor cardiovasculare (angina pectorală.). actina. accident vascular cerebral. cardiopatie ischemică. Se pot monitoriza benzile caracteristice proteinelor (colagen. Această boala apare ca urmare a mutaţiilor de la nivelul genelor care codifică producerea de colagen tip I. Metodele spectroscopice complementare Raman şi de absorbţie în IR sunt capabile să coreleze informaţiile histopatalogice ale unei aorte afectate de arteroscleroză cu compoziţia chimică a unei aorte sănătoase [49-51]. Ele stânjenesc din ce în ce mai mult circulaţia liberă a sângelui prin artera afectată: din laminară şi fluentă. arteriopatie obliterantă etc.

printre tematicile de cercetare care ar putea fi abordate în viitor s-ar putea regăsi atât studiul unor materiale nanostructurate de tipul nanofirelor şi a filmelor nanostructurate cât şi al unor obiecte din patrimoniul cultural. Part IV. B 110. având în vedere aceste considerente şi ţinând seama de echipamentele existente în cadrul platformei. Studii Raman ale nanofirelor sau nanoconurilor de GaP au dovedit faptul că există o dependenţă între intensitatea spectrală şi caracterul spaţial al radiaţiei Raman împrăştiate şi dimensiunea. J. Chem. 2006. 1566. Acest lucru a fost confirmat cu ajutorul microspectroscopiei Raman [57]. A. L. 2. Metal Film over Nanosphere (MFON) Electrodes for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS): Improvements în Surface Nanostructure Stability and Suppression of Irreversible Loss. Nafie. J. În acest mod. D. Astfel. utilizate în artifacte ca de exemple manuscrise. M. T. Balster. Phys. C.semiconductoare au dovedit faptul că în cazul unor unităţi structurale de câţiva nanometri. A. S. Li şi colaboratorii săi [58] au realizat analiza decoraţiunilor şi au identificat pigmenţii folosiţi la decorarea unui covor chinezesc din secolul al 5-lea cu ajutorul tehnicilor complementare micro-Raman şi FT-IR. R. S. Astilean. textile. Chem. aşa cum au fost observate în cazul şi sau Ge poros. 23982. Metoda este prezentă în departamentele de conservare şi restaurare a celor mai recunoscute muzee şi librării din lume şi este utilizată pentru identificarea unor materiale. L. P Van Duyne. De exemplu. acompaniată în ultimii ani de microscopie şi de tehnica SERS. L. Dick. sticle. Baia.Bibliografie 1. Pe de altă parte. Nanostructured Gold Surfaces as 3. A. Sackmann. B 106. ceramici. sculpturi. 2002. A. 2010. Popp. J. presupuse a fi lucrări medievale autentice. picturi. Raman Spectrosc. Materny. Baia. Phys. 4. J. McFarland. 4. Recent advances în linear and nonlinear Raman spectroscopy. pot fi diferenţiate operele de artă veritabile de cele contrafăcute sau falsificate. Cu ajutorul acestei metode se obţin informaţii despre compuşii moleculari aflaţi în probele supuse analizei. Gold Films Deposited over Regular Arrays of Polystyrene Nanospheres as Highly Effective SERS Substrates from Visible to NIR. spectroscopia Raman. a devenit o metodă de investigare extrem de utilă în domeniul patrimoniului cultural. 853. un număr de cinci picturi în miniatură achiziţionate de Muzeul Victoria şi Albert în 2008. M. de la pigmenţi anorganici la biomateriale. Bom. L. 130 . monumente de piatră [56]. s-au dovedit a fi pictate la sfârşitul secolului al 19-lea sau începutul secolului 20. 41. Haynes. efectele de confinare pot fi utilizate pentru a determina dimensiunea acestora [54]. forma şi compoziţia nanofirelor [55].

P. Janik-Czachor. de Veij. Wu. A. Edwards. I. M. O. N. E. McLean. J. R. McEwen. C. Ed. Chem. 2003). And Tech. H. Technology. M. M. 2008. 22. Ronneberger. H. Ellis. D. A. 461. Raman Spectroscopy Cell-based Biosensors. 2010. R. Gold-coated zinc oxide nanowire-based substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy. Burkhardt. 81. Raman Spectrosc. Ed. 277. C. J. Lin. pp. A. J. 2009. Shen. Barry. Roguska. Vo-Dinh. D. Roesch. X.1200708. Y. Krause. Notingher. Khan. 7. A. G. Lankers. 23. 2007. R11. Harz. InTech. Sant’Ana.-D. M. pp. Cell 100. ch. 19. Anal. The Hallmarks of Cancer. D. Hanahan. R. M. H. 13. 2009. J. P. H. în Biomedical Photonics Handbook. P. I-F. Wu.. J. M.-Y. Schuele. 38. Surface-enhanced Raman spectroscopic detection of a bacteria biomarker using gold nanoparticle immobilized substrates. A.Weinheim. 57. Popp. 2009. Qian. Esenturk. 24. Zhao. Zeng. S. K. T. 2007.5. 912. 17. Zhou. 455-474. Dolata. R. Raman Spectrosc. 40. J. T. 1992. A.. G. Size-dependent SERS enhancement of colloidal silver nanoplates: the case of 2-amino-5-nitropyridine. Pisarek. pp. D.0856.1117/2. I. Peschke. J. J. J.. 2010. 515-522. Williams. în vivo nonmelanoma skin cancer diagnosis using Raman microspectroscopy. SPIE Proceeding. 37. D. Santos. J. H. 2003. Witkowski. Z. Hogan. Mahadevan-Jansen. Lui. H. 14. G. S. The use of Raman spectroscopy în the detection of counterfeit 131 . Int. B. 21. FORMATEX 2010. Lieber. Méndez-Vilas and J. Díaz (Eds. 11. Thiele. R. 9. Cheng. 1652. Combined AFM/Raman microspectroscopy for characterization of living cells în near physiological conditions.-W. H. Majumder. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.-C. H. Washington DC. Moens. Remon. Yu.. 40. 9902. 183. Raman investigations of TiO2 nanotube substrates covered with thin Ag or Cu deposits. Motzkus. Caspers. A. R. Biomicrofluidics 4. 16. Huan. P. Popp. 85. Rocha. 86. 6. A. Reproducible Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy. 40.Wuttig. pp. Weinberg. L. 18. Fourier transform Raman spectroscopy a novel application for examining human stratum corneum. Riesenberg. 484. Biophotonics: Vision for a better Health Care. Hofer. Raman Spectrosc. J. S. Chang. Skin Res. Temperini. Raman Spectrosc. Pharm. A. 572. H.). A. 297. D. M. H. (CRC Press. 15. P. P. 2009. Schmautz. S. McLean. A. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy via gold nanostars. Lewandowska. T. 12. M. G.. 10. Lasers în Surgery and Medicine. M. Nie. HightWalker. Domenico Campolo. Wiley-VCH. D. Online monitoring and identification of bioaerosols (OMIB). 40. M. Microscopy: Science. 81. 2008. Applications and Education A. 40. H. C.-W. 1343. Sensors. Lui. 89–165. M. 034104. I. Vandenabeele.-C. T. C. 40. R. B. J. Puppels. 7. 2009. Integrated real time Raman system for clinical în vivo skin analysis. Lin. New Developments în Biomedical Engineering.. Shanker. Biophys. 2009. Kudelski. Chem Soc Rev.-Q.-L.A. D. Mahadevan-Jansen. Raman Spectrosc. L. Petry. Zanchet. Billheimder. Cheng. 30:1–30:27. 2008. 10. Zeng. Zhao. Raman Spectrosc. Identification of micro-organisms by Raman spectroscopy. Combined în Vivo Confocal Raman Spectroscopy and Confocal Microscopy of Human Skin. A dielectrophoretic chip with a roughened metal surface for on-chip surface-enhanced Raman scattering analysis of bacteria. 20. S. Reference database of Raman spectra of pharmaceutical excipients. A. J. M. H. 1539. 14.. 8. M. G. Lucassen.-L. De Beer. 2006. 2000.-Y.

40. S. Li. V. M. Y. 2011. A. Study of tryptophan assisted synthesis of gold nanoparticles by combining UV–Vis.and multi-walled nanotubes. 42. single. Gabudean. Zenone. Potara. January/February 2005. Asthana. Phys. 7. D. 2009. Instrum. Raman spectroscopy of covalently functionalized single-wall carbon nanotubes. Farcau. Olkhovyk. Nanopart. H. 3574. Canpean. S. Solution-phase. Characterisation of carbonaceous materials using Raman spectroscopy: a comparison of carbon nanotube filters. 477. 40. Gabudean. Mater. 43. S. C. Chen. 2010. 32. American Pharmaceutical Review. Simon. 2008. A. 35. Boca. Astilean. graphitised porous carbon and graphite. A. Srivastava. Chem. C. J. C. 2007. Spectrosc. Ledoux. Iosin. G. S. 29. M. 38. Schaman. M. R. D. N. C. T. Graupner. Martens.. 2007. 34. S. Kuzmany. Methods Phys. Baia. Boca. Detection of Melamine în Gluten. Hasi. Multilayer Structures of Self-Assembled Gold Nanoparticles as a Unique SERS and SEIRA Substrate. Biro. S. 36. S. Chem. M. dual LSPR-SERS plasmonic sensors of high sensitivity and stability based on chitosan coated anisotropic silver nanoparticles. 420. Detoxification of gold nanorods by conjugation with thiolated poly(ethylene glycol) and their assessment as SERS-active carriers of Raman tags. G. 372. Priore. Srivastava. and Processed Foods Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy and HPLC. He. Mustapha. Multivariate Calibration. S. 27. 1993. 95. J. Raman Spectrosc. H. 193110. V. Lepore. M. O. R. Mita. Lin. M. P. 12. Mol. Toderas. 993. J Food Sci. S. G. Awika. The study of Raman enhancement efficiency as function of nanoparticle size and shape. S.. 704. Farcau. A. H. 2843. 41. P. 2010. Investigation on Clarified fruit juice composition by using visible light micro-Raman spectroscopy. 73. Y. 11717. Astilean. B 267. Nucl. T129. Chan. Farcau . Struct. J. Nanotechnology 21. 63. Chao. 31. K. Yang. Tagmatarchis. Pfeiffer. 2008. 2049. 2009. Baldeck. R. Kuckuk. 2007. V. Lancet. Chem C 114. L. Griffiths. 28. Evidence of a surface plasmon-mediated mechanism în the generation of the SERS background. 1106. Plank. ChemPhysChem 10. J. Tuschel. Formation 132 . K. 2009. 21. A. Appl. W. Ch. Heise. D. 673. Camerlingo. Chicken Feed. Sect. 344. Public-health risks of melamine în milk products. 2009. and adulterated pharmaceutical products. 235601. J. Astilean. I. S. Potential of Raman spectroscopy and imaging methods for rapid and routine screening of the presence of melamine în animal feed and foods. F. S. Mapping the SERS Efficiency and Hot-Spots Localization on Gold Film over Nanospheres Substrates. Ojha. D. Baia. Y. 26. J. 39. Appl. F. D. C. Sensors. F. 2011. S. 2009. R. C. B. 33. Raman scattering from nanomaterials encapsulated into single wall carbon nanotubes. Liu. F. Canpean. Pagona. Res. N. Raman Spectrosc. Raman Spectrosc. M. S. E. D. L.25. 1444. Commun. Maniu. Phys. 406. 2011. Noes. Astilean. Maniu. Silver half-shell arrays with controlled plasmonic response for fluorescence enhancement optimization. Astilean. 47. S. Delfino. W. M. J. Wiley: New York. Gabudean. 3861. M. 37. L. Astilean. 3625. Diano. fluorescence. M. Kim. Astilean. Astilean. A. Astilean. Rotas. 30. 2010. 38. and SERS spectroscopyJ. Localized surface plasmon resonance (LSPR) and surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of 4-aminothiophenol adsorption on gold nanorods. H. Lab Chip 9. R. Res. 2009. Astilean.. Multifunctional plasmonic sensors on low-cost subwavelength metallic nanoholes arrays. 38. Lett. J. Focsan (Iosin). Farcau. Astilean.

47. A. 697. J. Burgio. 133 . Arora. T. Fang. characterization and their application as SERS-active tags inside living cells. J. Ravindran. 2006. J. Y. Flower-shaped gold nanoparticles: synthesis. Edwards. Identifying chemical changes în subchondral bone taken from murine knee joints using Raman spectroscopy. B. Anedda. A. C. Barbu-Tudoran. Cao. Laim. 57. Chem. T. A..-J.. Raman scattering of nanoporous semiconductors. 060502. J. P. 031117. V. 2009. A. Jr. van der Laarse. R. 33. pp. D. Sivasubramanian. Nanotechnology 22. J. Crane. 52. W.-M. P. 135101. B. K. J. O. Nogueira. G. M. 1911. 53. Jelicks. T. Pacheco. în situ investigation of the chemical composition of ceroid în human atherosclerosis by Raman spectroscopy. Nabet. 1134. D. M. S. 54. R. 58. Raman Spectrosc. Spectrosc. E. A. Q. of size and shape tunable gold nanoparticles în solution by bio-assisted synthesis with bovine serum albumin în native and denaturated state. Hark. Raman spectroscopy study of atherosclerosis în human carotid artery. Rugina. Morris. “Raman Spectroscopy în Art and Archaeology: A New Light on Historical Mysteries” în Frontiers of Molecular Spectroscopy. 2007. M.-F..-Y. 2006. Inverse Spatially Offset Raman Spectroscopy for Deep Noninvasive Probing of Turbid Media. E. R. A. 64. Bakker Schut. M. V. 40. E. Smukler. . J. C. 2006. Elucidation of the atherosclerostic disease process în apo E and wild type mice by vibrational spectroscopy. T.. A. 2011. Raman Spectrosc. 38.-S. J. 38. Chavantes. 129. Potara. 48. G. Rousseau. N. Optics. Yang. Dehring. Shi. 055702. J. 2009. A. R. Li. K A. 49. Raman Spectrosc. Salis. L. D. Opt. Astilean. Raman Spectroscopy. Boca. S. 40. M. 55. D. Pigment identification and decoration analysis of a 5th century Chinese lacquer painting screen: a micro-Raman and FTIR study. L. G.44. M. T. Synergistic Antibacterial Activity of Chitosan–Silver Nanocomposites on Staphylococcus Aureus. 2031. Irmer. Spanier.133-173. Jakab. Popescu. Y. S. Elsevier 2009. 38. J. D. J.. Canpean. J. H. C. Schulmerich. 51. Puppels. Clark. 11. Pintea. L. S. C. L. 45. K. V. C. Appl. J. A. Xie. An analytical form for the Raman shift dependence on size of nanocrystals. Rajalakshmi. R. Naudin. 604. Raman Spectrosc. Laane Ed. V. He. X.-L. On the Raman scattering from semiconductor nanowires. Wang. J.SPIE 2004. Vanasse. F. Raman Spectrosc. Morris. Phys. 7 5321A-11 (p. S. McHugh. B. L. 1341. S. M. M.. 2009. H. Biomed.1 of 9). Roessler. L. Ricci. 634.. Mat. 10. R. A. Dooley. Applied Spectroscopy. A. Biomed.. Matousek. Damert. 2007. 544. 40. 50. Raman spectroscopy of optical phonon confinement în nanostructuredmaterials. 2005. Valenzuela. P. 56. 60. C. 2011. 60. Goldstein. Nanotechnology 22. Adar. 2002. Transcutaneous fiber optic Raman spectroscopy of bone using annular illumination and a circular array of collection fibers. Silveira. M. A. Spectroscopic investigation of modern pigments on purportedly medieval miniatures by the "Spanish Forger". J. Yeh. Raman Spectrosc. 939. Martin. Zângaro. Astilean. Pasqualucci. J. 46. 2007. van de Poll.G.M. V. T. 2011.

...... Legea Lambert-Beer .................................................. Introducere Materia este formată din electroni......... Fiecare subdiviziune a materiei.....................................IV........... ioni pozitivi şi negativi.......................... 134 2.............. cum ar fi un atom......... În interacţiunea luminii cu materia. nuclee.............................................................................................. 141 7......... sau un solid prezintă o distribuţie de sarcină specifică............................................................. câmpul electric oscilează cu o frecvenţă de aproximativ 1015 Hz..... Nicolae Leopold Cuprins 1........ Aceste sarcini nu sunt doar sarcini izolate (monopoli)............. Bibliografie ............................................ 135 3............................... Introducere .... 138 5... Instrumentaţia şi metodologia obţinerii spectrelor IR ...... o moleculă.................................... În unda de lumină............... 137 4.. SPECTROMETRUL IR Spectroscopia de absorbţie în infraroşu Lect........ 139 6..... Reguli de selecţie pentru spectroscopia IR ............. câmpul electric (şi într-o măsură mai mică şi cel magnetic) al undei electromagnetice poate să modifice distribuţia de sarcină şi în acest fel să inducă un moment de dipol.......................... 146 1...... Moduri de vibraţie .. ci sunt sarcini pozitive şi negative ce formează dipoli şi multipoli electrici................................................. dr........... ceea ce înseamnă că modificarea distribuţiei de sarcină va avea loc 134 ........ Oscilatorul armonic .

Gradele de libertate rămase corespund numărului modurilor de vibraţie: 3N-5 pentru molecule liniare. 135 . pot fi privite ca fiind complementare. ca fotonii să interacţioneze cu materia este descrisă de aşa numita “secţiune eficace “ a efectului spectroscopic. oferind informaţii unice despre materie. acele vibraţii care duc la o modificare a polarizabilităţii moleculare vor fi active Raman. Numărul modurilor de vibraţie posibile al unei molecule poate fi determinat din numărul atomilor N din moleculă şi geometria moleculară. 2. în cazul moleculelor cu centru de simetrie. molecula unei anumite substanţe de exemplu.cu aceeaşi frecvenţă în materie. procesele sunt descrise de anihilarea unui foton. activitatea unui mod vibraţional depinde de simetria lui şi de simetria moleculei. Probabilitatea specifică. Benzile vibraţional-rotaţionale sunt observate doar când proba se află în stare de gaz. Astfel. ce apar la interacţiunea luminii cu materia. În teoria cuantică. IR şi Raman. şi alte două (molecule liniare) sau trei (molecule neliniare) grade sunt necesare pentru a specifica mişcarea de rotaţie. vibraţiile active Raman nu sunt active IR. sau generarea unui foton când sistemul trece de la o stare energetică ridicată la una joasă. modificări (oscilaţii) ale distribuţiei de sarcină. şi invers. pot fi observate doar frecvenţele de vibraţie ale probei. O regulă simplă de simetrie este aşa numita “regula excuziunii mutuale”. un câmp electric. precum şi spectroscopia Raman oferă informaţii despre modurile vibraţionale şi vibraţional-rotaţionale ale moleculelor. schimbul de energie între unda electromagnetică şi materie este de asemenea specifică. Aceste procese. În funcţie de simetria moleculei. trei dintre aceste grade fiind folosite pentru specificarea mişcării de translaţie a moleculei în spaţiu. la rându-i. Geometria moleculară este specificată de coordonatele carteziene ale fiecărui atom. În schimb. Conform acesteia. Molecula are aşadar 3N grade de libertate. sunt în tratarea clasică procesele de bază ale fiecărei metode spectroscopice. pe scurt spectroscopia IR. Pe de altă parte. unde moleculele se pot roti liber. şi 3N-6 pentru moleculele neliniare. În fazele condensate (lichidă sau solidă). De vreme ce distribuţia de sarcină este specifică pentru un anumit tip de materie. urmate de tranziţia în stări de energie mai mari. precum un dipol oscilator poate genera. Moduri de vibraţie Spectroscopia de absorbţie în infraroşu. O vibraţie va fi activă IR dacă are loc o variaţie a momentului de dipol în timpul vibraţiei. cele două tehnici.

De exemplu, vibraţiile fundamentale ale moleculei de apă, H2O, sunt prezentate în Figura 1. Apa, fiind o moleculă neliniară prezintă trei vibraţii fundamentale:

întindere simetrică

întindere asimetrică

deformare (forfecare)

Figura 1. Moduri de vibraţie de întindere şi deformare ale H2O.

Dioxidul de carbon, CO2, este o moleculă liniară, astfel că va prezenta patru vibraţii fundamentale (Figura 2). Vibraţia de întindere asimetrică a CO2 generează o bandă intensă în spectrul IR la 2350 cm-1. De menţionat este că această bandă se observă de regulă în spectrul IR al background-ului, datorită prezenţei CO2 în atmosferă.

întindere asimetrică

deformare (forfecare) perpendiculară pe planului foii

întindere simetrică

deformare (forfecare) în planul foii

Figura 2. Moduri de vibraţie de întindere şi deformare ale CO2.

Cele două vibraţii de deformare (forfecare) sunt echivalente, vibraţia acestora având loc la aceeaşi frecvenţă, fiind astfel numite degenerate, şi apar în spectrul IR la 666 cm-1. Vibraţia de întindere simetrică a CO2 este inactivă IR deoarece această vibraţie nu produce modificare în momentul de dipol al moleculei.

136

3. Oscilatorul armonic
Cel mai simplu model pentru vibraţia unei molecule diatomice este oscilatorul armonic. În acest model se consideră cei doi atomi de mase m1 şi m2 ai moleculei legaţi printr-un resort elastic. Descrierea matematică a mişcării de vibraţie a acestor două corpuri cu masele m1 şi m2 poate fi simplificată prin considerarea unui singur corp cu masa redusă µ=m1*m2/(m1+m2), ce oscilează în jurul centrului de masă al moleculei biatomice, într-un câmp potenţial de tipul kx2/2.

Figura 3. Modelul oscilatorului armonic pentru molecula diatomică. Variaţia energiei potenţiale cu distanţa internucleară.

Din punct de vedere fizic, aşa cum se poate deduce din Figura 3, o energie mai mare a oscilatorului armonic corespunde unei amplitudini mai mari a oscilaţiei, frecvenţa fiind aceeaşi pentru toate nivelele de energie. Energiile vibraţionale cuantificate se obţin în urma rezolvării ecuaţiei Schrödinger pentru oscilatorul armonic: Ev=hν(v+

1 ) , v=0,1,2…. 2

(1.1)

unde v este numărul cuantic de vibraţie, ν este frecvenţa de vibraţie şi h este constanta lui Planck. Frecvenţa de vibraţie a oscilatorului armonic depinde de puterea legăturii (constanta de forţă a legăturii k) şi masa redusă µ: ν=

1 2π

k

μ

(1.2)

137

Nivelele de energie vibraţionale sunt la distanţe egale (echidistante) în modelul oscilatorului armonic, diferenţa între două nivelele de energie adiacente E fiind: ΔE=hν=ћ k μ (1.3)

4. Reguli de selecţie pentru spectroscopia IR
O moleculă diatomică va absoarbe radiaţie IR numai dacă momentul ei de dipol se modifică în urma variaţiei distanţei internucleare. Probabilitatea de tranziţie depinde de diferenţa de populaţie ΔN dintre două stări cuantice şi pătratul momentului de dipol al tranziţiei, M: probabilitatea de tranziţie ~ ΔN M
2

(1.4)

unde, pentru o moleculă aflată într-o stare electronică dată, momentul de dipol al tranziţiei pentru o tranziţie vibraţională este dat de:
* (e) M= Ψν " μ 0 Ψν ' d τ

(1.5)

Funcţiile de undă ψ ν " şi ψ ν ' reprezintă stările vibraţionale finală şi respec(e) tiv iniţială, iar μ 0 este momentul de dipol electric permanent în această stare electronică. Pentru vibraţia unei molecule diatomice, momentul de dipol electric permanent poate fi extins într-o serie Taylor după distanţa internucleară de echilibru re :

∂μ ⎞ (e) =µe+ ⎛ μ0 ⎜ ⎟ q+ ⎝ ∂r ⎠ re

1 2

⎛ ∂ 2 μ ⎞ q2+ … ⎜ ⎜ ∂r 2 ⎟ ⎟ ⎝ ⎠ re

(1.6)

Aici q=r-re, iar r este distanţa internucleară la un moment dat, şi µe este momentul de dipol când legatura se află în poziţia de echilibru. Probabilitatea apariţiei unei tranziţii vibraţionale într-o moleculă diatomică poate fi obţinută substituind forma extinsă a momentului de dipol electric permanent în ecuaţia momentului de dipol pentru tranziţia vibraţională:

∫ Ψν

*
'

(e) μ0 Ψν d τ =
'

* µe Ψν " Ψν ' d τ + ⎜

⎛ ∂μ ⎞ 1 * ⎟ ∫ Ψν ' q Ψν d τ + 2 ⎝ ∂r ⎠ re
'

⎛ ∂2μ ⎞ ⎜ ⎜ ∂r 2 ⎟ ⎟ ⎝ ⎠ re

∫ Ψν

*
"

q2 Ψν ' d τ + … (1.7)

138

Primul termen din această ecuaţie este egal cu zero de vreme ce funcţiile de undă vibraţionale ψ ν " şi ψ ν ' sunt ortogonale. Al doilea termen este diferit de zero doar dacă momentul de dipol depinde de distanţa internucleară r

⎛ ∂μ ⎞ ⎜ ⎟ ≠0 ⎝ ∂r ⎠

(1.8)

De aceea, moleculele biatomice prezintă absorbţie vibraţională în spectrul IR doar atunci când există o modificare a momentului de dipol în cadrul mişcării de vibraţie. Moleculele diatomice homonucleare au momentele de dipol zero pentru toate lungimile legăturilor, astfel nu prezintă spectru de absorbţie vibraţional. Astfel, teoria mecanicii cuantice specifică faptul că absorbţia luminii infraroşii va apărea doar dacă un mod vibraţional implică o modificare a momentului de dipol şi că nivelele de energie vibraţionale în moleculă sunt cuantificate. Teoria ne spune de asemenea şi faptul că tranziţiile pot avea loc doar între nivele de energie adiacente, deoarece integrala din cel de-al doilea termen pentru polinoamele Hermite care descrie funcţia de undă a oscilatorului armonic, este diferită de zero doar dacă Δv= ± 1.

5. Legea Lambert-Beer
Domeniul spectral IR al radiaţiei electromagnetice este poziţionat între domeniul vizibil şi cel al microundelor. Prin convenţie, domeniul spectral IR este subdivizat în domeniul IR apropiat (Near Infrared Region - NIR), IR mijlociu (Mid Infrared Region - MIR) şi IR îndepărtat (Far Infrared Region FIR) (Figura 4). Spectrele IR discutate în această lucrare sunt toate din domeniul spectral MIR.

Figura 4. Domeniile spectrului electromagnetic şi subdiviziunile domeniului IR.

139

Spectrul IR se obţine prin înregistrarea intensităţii radiaţiei în lipsa probei de analiză (spectrul background) şi a intensităţii radiaţiei IR după ce aceasta trece prin probă. În urma trecerii prin probă, intensitatea fasciculului se va atenua datorită absorbţiei de radiaţie de către analit, precum şi a împrăştierii radiaţiei la interfaţa şi în interiorul probei (Figura 5a). Astfel, spectrul IR reprezentat va fi dat de mărimea: T= Is/IR unde, T este transmitanţa, Is intensitatea radiaţiei IR după, iar IR înainte de a traversa radiaţia proba. Valorile transmitanţei sunt între 0 şi 1, sau 0–100% pentru transmitanţa exprimată în procente. Între transmitanţă şi concentraţia unui compus relaţia este logaritmică. De aceea, pentru o reprezentare mai convenientă, în majoritatea cazurilor, în locul transmitanţei se foloseşte o altă mărime, absorbanţa A:

A = lg

1 = − lg T T

Relaţia dintre transmitanţă şi absorbanţă în funcţie de concentraţie este reprezentată în Figura 5b

Figura 5. (a) Atenuarea unui fascicul de radiaţie la refelexia interfeţei probei, împrăştierea de către particule şi absorbţia analitului. (b) Relaţia dintre transmitanţă, T, şi absorbanţă, A, în funcţie de concentraţia unui compus ipotetic.

În mod independent, Bouguer în 1729 şi Lambert în 1760, au stabilit că la concentraţie constantă, absorbanţa este direct proporţională cu grosimea probei, iar Beer în 1852 a observat că dacă grosimea probei este constantă, absorbanţa este proporţională cu concentraţia. Combinarea acestor observaţii a dus la legea Lambert-Beer, ce exprimă absorbanţa: 140

(I.2) unde a este absorbtivitatea – o constantă de proporţionalitate a moleculei la o lungime de undă specifică, d este lungimea drumului optic prin probă, iar c reprezintă cocentraţia substanţei analizate. Concluzionând, spectroscopia IR oferă atât informaţii moleculare calitative, prin modurile de vibraţie specifice fiecărei molecule, cât şi informaţii cantitative, aşa cum rezultă din legea Lambert-Beer.

A = a⋅d ⋅c

6. Instrumentaţia şi metodologia obţinerii spectrelor IR
Odată cu introducerea spectroscopiei transformată Fourier (FTIR) principalele dezavantaje ale spectroscopiei ”clasice” dispersive IR au putut fi înlăturate. Pe scurt, spectroscopia FTIR nu mai înregistrează intensitatea la fiecare lungime de undă, în mod secvenţial, la o lungime de undă după alta, şi de asemenea, spre deosebire de spectrometrele dispersive nu necesită prismă sau reţea de difracţie monocromatoare, unde apar pierderi majore în energia emisă de sursa IR la trecerea prin diferite fante de intrare şi ieşire. În spectroscopia FTIR, se aplică modularea interferometrică a radiaţiei (Figura 6). Pentru aceasta, un divizor de undă, de regulă din KBr acoperit cu un film de germaniu, împarte radiaţia în două fascicule, un fascicul fiind direcţionat către o oglindă fixă, iar celălalt fascicul către o oglindă mobilă (Figura 6). Aceste două fascicule sunt reflectate înapoi pe divizorul de undă, după care se recombină, intensitatea fasciculului variind în timp, datorită alternării interferenţei constructive şi destructive în funcţie de diferenţa de drum optic dintre cele două oglinzi, la fiecare moment de timp. Astfel, fiecare parcurs al oglinzii mobile este caracterizat de o interferogramă în funcţie de timp. Diferenţa de drum δ este proporţională cu timpul t, deoarece oglinda mobilă se deplasează cu viteză constantă v, astfel că δ = 2vt. Prin folosirea unui algoritm de transformată Fourier rapidă (Fast Fourier Transform - FFT algorithm), interferograma în funcţie de timp, I(δ), este convertită într-o interferogramă în funcţie de frecvenţă, I( v ), folosind următoarea relaţie:

I (δ ) = 0.5 H (v ) I (v ) cos 2πvδ I (δ )
unde H( v ) este un factor de corecţie dependent de numărul de undă şi de caracteristicile spectrometrului. Interferograma convertită în domeniul frecvenţelor se numeşte spectru de tip single-beam.

141

IR-light source

Figura 6. Spectrometrul FTIR. (a) Schema bloc a componentelor de bază ale unui spectrometru IR. (b) Principiul de funcţionare a unui interferometru Michelson format din sursă de lumină, divizor de undă, oglindă fixă, oglindă mobilă, detector şi probă (panel sus). Oglinda mobilă a interferometrului (panel sus) produce un semnal sinusoidal la detector pentru fiecare frecvenţă modulată (panel central). Pentru sursa IR, cu domeniu spectral de frecvenţe larg, semnalele modulate se suprapun şi formează o interferogramă complexă (panel jos).

Spectrometrele FTIR prezintă mai multe avantaje faţă de instrumentele convenţionale IR dispersive, incluzând o îmbunătăţire dramatică a raportului semnal-zgomot (S/N), obţinută prin multiplexare (detectarea simultană a tuturor frecvenţelor), reducerea timpului de scanare, precum şi un câştig mai mare în energia radiativă. Un alt avantaj important este reproductibilitatea excelentă în lungimea de undă a spectrometrelor FTIR, datorită utilizării unui laser de referinţă intern (de regulă HeNe, 632.8 nm ), ceea ce permite manipularea datelor spectrale, cum ar fi scăderea, adunarea sau scalarea spectrelor cu un grad foarte ridicat de acurateţe. De asemenea, progresul spectroscopiei FTIR a fost facilitat şi de dezvoltarea calculatoarelor personale, ce permit utilizarea de programe soft complexe, pentru aplicaţii calitative şi cantitative. Pentru partea practică a acestei lucrări, spectrele au fost înregistrate cu un spectrometru Jasco FTIR-6200 cuplat cu un microscop IR Jasco IRT-5000 (Figura 7). 142

Figura 7. Aparatura IR Jasco: spectrometrul FTIR-6200 şi microscopul IRT-5000.

Principalele părţi componente ale spectrometrului FTIR sunt sursa de emisie, interferometrul şi detectorul. Sursa de emisie IR este componenta cea mai simplă a instrumentului, constând într-un filament incadescent (10000C). Interferometrul este de tip Michelson, iar parcursul maxim al oglinzii mobile determină rezoluţia spectrală a spectrometrului. Alegerea detectorului este legată de aplicaţiile abordate. Astfel dacă se urmăreşte de exemplu cinetica unei reacţii chimice, este absolut necesară folosirea unui detector de tip MCT (Mercury Cadmium Telluride). Acestea sunt de două tipuri: MCT A, detector de foarte înaltă sensibilitate în domeniul spectral 650-7800 cm-1 ce permite înregistrarea rapidă a spectrelor (până la ns), şi MCT B, detector de înaltă sensibilitate în domeniul spectral 400-7800 cm-1, de asemena pentru înregistrări rapide. De menţionat că detectoarele MCT necesită răcirea cu azot lichid. Detectoarele de tip DTGS (Deuterated L-Alanine doped Triglycene Sulphate) lucrează la temperatura camerei într-un domeniu spectral larg 10-7800 cm-1, însă sensibilitatea acestora este de până la două ordine de mărime mai mică faţă de detectoarele MCT. De menţionat însă că domeniul spectral de detecţie al spectrometrului este limitat de fereastra din faţa detectorului (de regulă KBr) precum şi de divizorul de undă (beamsplitter, de regulă din KBr acoperit cu un strat de Ge), astfel că spectrometrele IR uzuale nu permit înregistrarea spectrelor sub 400 cm-1. Spectrometrul FTIR-6200 permite înregistrarea spectrelor IR în modul transmisie, pentru acest mod fiind necesară prepararea în prealabil a probe143

lor sub formă de dispersie în pastile KBr. Tot pentru măsurători IR în transmisie se poate presa proba între două discuri/ferestre dintr-un material ce nu absoarbe (este transparent) în domeniul IR mijlociu, de exemplu ZnSe, Si, Ge, KBr etc. Microscopul IRT-5000 este dotat cu un obiectiv tip Cassegrain şi unul de tip ATR (Attenuated Total Reflectance). Obiectivul de tip Cassegrain se pretează doar pentru probe plane (filme, suprafeţe lucioase etc.). În prealabil, la folosirea obiectivului Cassegrain, se înregistrează spectrul background prin focalizarea pe oglinda de aur, un accesoriu din dotare. Modul de analiză ATR (Attenuated Total Reflection) este utilizat pentru investigarea probelor lichide şi solide. De asemenea, modul ATR se pretează pentru caracterizarea materialelor care sunt fie prea groase sau prea puternic absorbante pentru a fi analizate prin spectroscopie în transmisie. În modul de analiză ATR, radiaţia IR trece printr-un cristal transparent în infraroşu, cu un indice de refracţie ridicat, astfel că fasciculul IR va efectua reflexii interne succesive în cristalul ATR, aşa cum este prezentat schematic în Figura 8.

Figura 8. Prezentare schematică a tehnicii de analiză ATR-IR.

În vederea analizei, suprafaţa probei este presată astfel încât să fie în contact optic cu suprafaţa superioară a cristalului ATR. La reflexia internă a fasciculului, aşa numita undă evanescentă IR pătrunde în afara cristalului ATR, astfel că o mică parte din radiaţie penetrează proba. În modul de analiză ATR nu este necesară o preparare în prealabil a probei în vederea analizei. Dezavantajul constă în limitarea spectrală datorită cristalului ATR, de exemplu pentru un cristal ATR din ZnSe spectrele se pot înregistra începând de la 650 cm-1. De regulă, în prealabil, la folosirea modului ATR, se înregistrează spectrul background al atmosferei, cristalul ATR fiind în aer. Folosind microscopul IRT-5000 în modul de analiză ATR, au fost înregistrate spectrele FTIR/ATR a următoarelor substanţe de interes farmaco144

logic: aspirina, paracetamol şi deferoxamina. Structurile moleculare ale acestora sunt prezentate mai jos.

Aspirina

Paracetamol

Deferoxamina Tabloul spectral din Figura 9 prezintă spectrele de absorbţie în IR ale celor trei substanţe analizate.

Figura 9 Spectrele FTIR/ATR ale substanţelor de interes farmacologic: aspirina, paracetamol şi deferoxamina.

145

Aştilean. Weinheim. Casa Cărţii de Ştiinţă. 2005. Spectroscopia IR şi Raman. Teubner. 2001. Casa Cărţii de Ştiinţă. Cluj-Napoca. Smith and G. O. Cluj-Napoca. V. Aufbau der Moleküle. Modern Raman Spectroscopy – A Practical Approach. Metode şi tehnici moderne de spectroscopie optică. Germany. S. UK. 11. Leopold. Germany. N. D. Chichester. Dent. Simon. O.M.E. 9. 2000. David. 8. Chiş. 2002. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Schrader. Engelke. Atribuirea benzilor de vibraţie se poate face pe baza literaturii de specialitate comparând spectrele cu cele ale compuşilor asemănători sau prin calcularea teoretică a spectrelor IR folosind programe dedicate de chimie cuantică. 1986. 2009. Grecu. Cluj-Napoca. Litografia Universitatii Babes-Bolyai. pentru fiecare substanţă putându-se identifica o amprentă spectrală caracteristică. 3. 2. F. Casa Cărţii de Ştiinţă. Cluj-Napoca. T. 7. 4. Wiley. Selected Applications. Leopold. B. Cluj-Napoca.Spectrele din Figura 9 sunt caracteristice structurilor moleculare corespunzătoare. VCH. Aştilean. 10. Iliescu. Cîntă-Pînzaru. Simetrie Moleculară. Spectroscopie Optică Moleculară.Methods and Applications. 2007. J. L. N. Hollas. W. Probleme de Fizica Moleculei. Chiş. UK. T. S. Modern Spectroscopy. Maniu. S. Cozar. Napoca Star. Ed. Bibliografie 1. Cluj-Napoca. I. 2004. Iliescu. 2002. Infrared and Raman Spectroscopy . 6. 1992. Cozar. Cluj-Napoca. Teoria Grupurilor în Fizica Atomului şi Moleculei. Aplicaţii ale spectroscopiei vibraţionale. 1998. Stuttgart. 7. Litografia Universităţii Babeş-Bolyai. Napoca Star. R. Chichester. Vol. 146 . Wiley. 5.

.................................................... 147 2...... Introducere Spectroscopia de absorbţie în infraroşu (IR) reprezintă o metodă analitică de investigaţie moleculară utilizată într-un număr vast de domenii......................................... 148 2............................... Cuplajul on-line electroforeza capilară (CE)-IR ........ 150 2........................1................................................... Aplicaţii biomedicale ale spectroscopiei IR ....................................1.... Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR ..................... Bibliografie ................................ 155 6.. Spectroscopia IR în calitatea şi siguranţa alimentelor ............... 154 5...........2... Îmbunăţiri tehnice recente în cuplajul LC-IR. Publicaţiile din ultimii 5 ani cu tematica legată de spectroscopia de absorbţie IR pot fi clasificate pe domenii ştiinţifice după cum este prezentat în Figura 1.. 147 .................................. 151 4...1...................... Nicolae Leopold Cuprins 1.......... 149 2......................................... Introducere ...... dr..... 150 3.. 157 1......................... Aplicaţii analitice ale spectroscopieie IR ........Tendinţe moderne în spectroscopia de absorbţie IR Lect............................................................ Aplicaţii ale spectroscopiei IR în geoştiinţe..................

Clasificarea pe domenii a numărului de publicaţii din ultimii 5 ani cu tematica legată de spectroscopia de absorbţie IR (www. Aplicaţii analitice ale spectroscopieie IR Aplicaţiile analitice ale spectroscopiei IR sunt extrem de diversificate.com) Este evident din numărul mare al publicaţiilor în domeniile chimiei şi a fizicii că spectroscopia de absorbţie IR este în continuare o metodă experimentală de bază în cercetarea fundamentală.scopus.Figura 1. 148 . De aceea s-a ales în mod reprezentativ cuplarea on-line a detecţiei IR în metodele de separare cromatografie de lichide (LC) şi electroforeza capilară (CE). 2. astfel că pot fi foarte greu cuprinse într-o prezentare unitară.

Cert este faptul că în ultimii ani sunt depuse eforturi pentru a cupla cu spectrometria de masă şi alte metode de detecţie cum ar fi spectroscopia Raman sau spectroscopia de absorbţie IR. aceste metode prezintă avantaje şi dezavantaje în funcţie de analizele efectuate. Totuşi. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR Cromatografia de lichide este cea mai uzuală metodă instrumentală folosită în laboratoarele analitice pentru separarea amestecurilor fizice. precum şi posibilitatea de a utiliza soluţii tampon nevolatile [3-4]. detecţia substanţelor interzise. absorbţia UV-VIS sau spectrometria de masă. Cele două subiecte sunt strâns corelate. sau laboratoare pentru studii farmacologice. aspecte ce pot interveni la înlăturarea solvenţilor. iar atunci când sunt ambele luate în considerare este uşor de înţeles numărul limitat de referinţe cu privire la cuplarea on-line a spectroscopiei de absorţie IR cu cromatografia de lichide.Metodele de separare cromatografice şi electroforetice sunt tehnici standard în laboratoare analitice privind siguranţa şi autenticitatea alimentelor. În dectecţia off-line folosirea interfeţelor de înlăturare a solventului duce la îmbunătăţirea senzitivităţii. aceste metode de separare sunt cuplate cu metode de detecţie ca. 2. cristalizare sau degradare oxidativă. Utilitatea spectroscopiei de absorbţie IR. fie on-line folosind celule de curgere (flow-through cells) transparente pentru radiaţia infraroşie. 149 . incluzând o rezoluţie cromatografică îmbunătăţită. Două dintre cele mai citate dezavantaje ale cuplajului LC-FTIR sunt următoarele: i) dificultatea de a corecta absorbţia de fond a solvenţilor şi a aditivilor folosiţi pentru prepararea fazei mobile. Desigur. fiind pusă la îndoială în mod frecvent viabilitatea acestui cuplaj. De regulă. furnizarea de informaţii în timp real. identificare şi cuantificare. Cuplarea on-line permite totodată înregistrarea de spectre IR pentru analiţi fără o anumită orientare.1. Detecţia on-line LC-FTIR a fost limitată în trecut de un anumit număr de restricţii privind aplicabilitatea în problemele analitice de tip real-life. în mod special a celei cu transformată Fourier (FTIR) ca şi mijloc de detecţie on-line în urma separării cromatografice a fost demonstrată în mod repetat în ultimii ani [1-3]. abordarea on-line este de preferat datorită unor avantaje majore. şi ii) senzitivitatea redusă datorată utilizării unui drum optic redus al celulor pentru a evita saturarea semnalului ce intervine datorită absorbţiei eluentului. laboratoare medicale. Cuplarea cromatografiei de lichide cu un sistem de detecţie IR se poate realiza fie în modul off-line după înlăturarea solventului.

05% TFA-acid trifluoroacetic):acetonitril] timp de 15 min pentru separarea soluţiilor standard de nitrofenoli. limite de detecţie între 35-94 ng. Separarea apare în urma aplicării unei tensiuni înalte. mai ales în analizele bio-chimice din cauza eficienţei mari a separării cât şi consumului redus de substanţă [13-15].1.2. Au fost puşi în mişcare gradienţi liniari în limitele 50:50-35:65 [apă(0.2. Prin reducerea dimensiunii şi a costurilor aparaturii se conturează o direcţie clară în ceea ce priveşte detecţia on-line IR dedicată cromatografiei de lichide. Sistemul a fost utilizat pentru separarea a opt constituenţi ai vinului şi ai sucului de struguri. pe coloană. Un alt factor de limitare pentru detecţia IR cuplată cu cromatografia de lichide este legată de absorbţia puternică a apei în domeniul spectral MIR. Kuligowski et al. Un set-up optic bazat pe trei oglinzi de aur şi un separator de fascicule din ZnSe a fost folosit pentru a direcţiona lumina emisă de laser printr-o celulă fluidică cu un drum optic de 52 µm către un detector MCT (mercury-cadmium-telluride). 150 . [5] folosind o micro-celulă de curgere [6] cu ferestre transparente în IR mijlociu din CaF2. duce la o nouă abordare a detecţiei IR on-line [7-10] folosind noi dispozitive [11]. Folosind tehnica gradienţilor s-au putut obţine spectre de înaltă calitate ale analiţilor în urma aplicării unei corecţii ale fondului (semnal background) la datele înregistrate. Dezvoltarea din ultimii ani a unei noi tehnologii laser pentru surse IR. Acest lucru a fost evidenţiat de coeficienţii de corelare cuprinşi între 89-96% (în regiunea spectrală 1700-1050 cm-1) şi utilizaţi pentru compararea spectrelor de referinţă cu cele obţinute în urma injectării în sistemul cromatografic a unei cantităţi între 230-270 ng din analiţi. obţinându-se astfel on-line. fapt care duce la o curgere electro-osmotică în capilar. cu un volum intern al celulei de 7. Avantajul surselor IR de tip QCL constă în posibilitatea reglării lungimii de undă a laserului prin reglarea temperaturii de funcţionare [12]. Cuplajul on-line electroforeza capilară (CE)-IR Electroforeza capilară (CE) a devenit o tehnică de separare importantă. Urmând studii anterioare [7].5 nL. [12] au folosit două lasere QCL pentru detecţia on-line în cromatografia de lichide de înaltă performanţă. QCL . care a fost plasat pe un condensor al fasciculului optic ataşat spectrometrului.quantum-cascade laser. Îmbunăţiri tehnice recente în cuplajul LC-IR Pentru a creşte senzitivitatea cuplajului LC-FTIR şi pentru a obţine astfel o limită de detecţie mai bună s-a realizat interfaţarea unui sistem de cromatografie capilară pentru lichide cu spectrometrul FTIR. facilitând o serie de noi aplicaţii. 2.1.

aşa cum s-a arătat la discriminarea on-line de enantiomeri în timpul separării chirale într-un mediu neapos. guaninei şi a adenosinei-5’ monofosfat în domeniul ng folosind electroforeza capilară convenţională [16]. Pentru detecţia prin spectroscopia infraroşie mijlocie s-au raportat măsurători atât off-line cât şi on-line. fibroblast [60]. limfon non-Hodgkin’s [53]. bucal [50]. Spectrele înregistrate 151 .De obicei. Un alt domeniu în care spectrometria IR poate furniza informaţii importante este analiza proteinelor. tot mai multe studii arată că detecţia on-line FTIR este utilizată cu succes. limfoid [51]. Acest articol raportează prima separare a unor proteine în electroforeza capilară cu detecţia FTIR on-line. iar în cazul detecţiei UV-Vis sensitivitatea este limitată de diametrul mic al capilarului. detecţia în CE este dificilă. sau pentru monitorizarea glucozei [67]. [26] au evidenţiat potenţialul spectroscopiei FTIR ca instrument de biodiagnostic în cancerul de col uterin. creier [47-49]. În măsurători de transmisie folosind celule transparente manufacturate special pentru IR o parte din spectru este blocat din cauza absorbţiei puternice a fazei lichide. os [61] sau ţesut tumoral [62]. Recent însă. Acest ultim aspect este cel care face spectroscopia FTIR o metodă de analiză biomoleculară foarte atrăgătoare [20]. Utilitatea detecţiei FTIR on-line a fost demonstrată prin separarea şi cuantificarea adenosinei. limfocite [52]. Aplicaţii biomedicale ale spectroscopiei IR Analiza FTIR este folosită într-o serie largă de studii biologice cuprinzând măsurători pe diverse ţesuturi ca: piele [21-25]. Aplicaţiile principale în acest domeniu sunt cele privind dinamica proteinelor şi elucidarea structurii secundare. col uterin [26-34]. Un alt studiu prezintă separarea şi detecţia IR a 5 analiţi. rezultatele fiind foarte bune din punct de vedere calitativ şi cantitativ [17]. colon [56-59]. Maturitatea cuplajului CE-FTIR on-line este considerată prin separarea şi cuantificarea cu succes a glucidelor din băuturi răcoritoare [18]. permiţând discriminarea moleculelo analit [19]. gastrointestinal [43-46]. medicamente anti-cancer [66]. Wood et al. din cauza concentraţiei mici de substanţă disponibilă pentru detecţie. distinct. Informaţia moleculară specifică livrată de spectrul IR poate fi interpretată în mod avantajos. prostată [54-55]. sân [38-42]. Alte studii relevante au fost efectuate pe bacterii [63-64] ADN [65]. plămân [35-37]. 3. Interacţiunea moleculelor analit cu selectorul chiral a produs diastereomeri cu un spectru IR clar. Detecţia on-line bazată pe tehnica reflexiei totale atenuate ocoleşte această problemă prin reducerea eficientă a drumului optic.

[30] pe melanom fixat cu formalină şi pe celule canceroase de col uterin bazat pe microspectroscopia FTIR a urmărit detecţia unor biomarkeri comuni care apar în cele două afecţiuni. Un avantaj major al acestei metode îl reprezintă posibilitatea de a obţine rezultate determinante foarte rapid. [36] se bazează pe posibilitatea de achiziţie directă de pe ţesut de plămân canceros sau normal prin microscopia FTIR. a culturilor celulare şi a xenogrefelor de acest tip. Acestea reprezintă un factor discriminant privind ţesutul de plămân canceros şi cel normal. Zona de interes a studiilor comparative de spectroscopie IR pentru Fabian et al.pe celule epiteliale normale prezintă benzi intense ale glicogenului la 1022 cm-1 şi 1150 cm-1. sugerând prin aceasta modificări spre malignitate. Într-un alt studiu. Caracteristicile spectrale care sugerează transformări de malignitate sunt în principal modurile de vibraţie simetrice şi antisimetrice ale grupării fosfat precum şi reducerea în intensitate a benzii atribuite glicogenului. Pentru evaluarea cantitativă a malignităţii s-au ales intensităţile benzilor de la 1045 şi 1465 cm-1. Yano et al. La nivel macroscopic. atribuită glicogenului şi grupării fosfat din acizii nucleici. atribuite glicogenului şi colesterolului. Wood et al. [38] a fost reprezentată de cancerul la sân. fosfaţi şi carbohidraţi. probele păreau să fie 152 . Diferenţa considerabilă este reprezentată de raportul benzilor de la 1030 şi 1080 cm-1. Nivelul acestora din urmă s-a dovedit a fi un bun indicator în diagnosticarea şi detecţia cancerului de col uterin. Studiul iniţiat de Mordechai et al. Privind aceeaşi afecţiune. Acest studiu a demonstrat potenţialul de aplicabilitate a tehnologiei automatizate FTIR în monitorizarea cancerului de col uterin în mediul clinic. ARN. Scopul acestui studiu a fost determinarea eficienţei spectroscopiei IR în diagnosticare şi în acest sens s-a descoperit că leucocitele. [35] s-au concentrat asupra studiilor microscopice FTIR ale celulelor canceroase din fluidul pleural. şi totodată o pronunţată bandă atribuită întinderii simetrice a grupării fosfat la 1078 cm-1. Rezultatele lor demonstrează că sunt diferenţe semnificative între celulele normale din plămân şi cele tumorale. [28] au investigat cu microspectroscopia FTIR tipurile de celule şi potenţialele variabile care ar duce la confuzii în diagnosticarea malignităţii acestui ţesut. Spectrele înregistrate au fost analizate privind posibilele modificări în ceea ce priveşte nivelul biomoleculelor: ADN. încercând astfel diferenţierea ţesutului canceros de cel normal. respectiv limfocitele au o caracteristică spectrală în zona legăturii fosfodiester (1300-900 cm-1). Wang et al. în vederea implementării acesteia ca şi tehnică medicală în acest domeniu.

Utilizând spectroscopia FTIR s-a realizat această discriminare cu o acurateţe de 88. Fujioka et al. [44] au studiat tumori de stomac. Choo et al. Prin utilizarea mai multor metode multivariate au arătat că este posibil să se clasifice datele spectroscopice non-subiectiv. s-a reuşit determinarea cantitativă a apei în fiecare caz. urmărind absorbţia atribuită colagenului. 66%. Prin comparare cu spectre ale cheratinei pure şi ale colagenului s-au obţinut rezultate care să susţină introducerea acestor investigaţii în clinici. [46] au realizat o investigare a biopsiilor cu spectroscopia ATR-FTIR privind afecţiuni ca şi: gastrită superficială. colon. S-a concluzionat că un studiu de spectroscopie IR poate deveni foarte util în interpretarea corectă şi înţelegerea pe deplin a patologiei acestui ţesut. însă foarte rar în cele de ţesut tumoral. [43] au raportat diferenţierea spectroscopică între ţesutul gastric normal şi cel tumoral. Li et al. rect. cancer de stomac şi gastrită cronică prin comparare cu ţesut normal şi a obţinut o acurateţe în diagnostic de 90%. Se presupune că pentru această apreciere este necesară obţinerea de informaţii fundamentale privind pătrunderea şi pierderea lichidului apos de la nivelul corneei.6%. Ulterior s-au detectat modificări în conţinutul de colagen şi a depozitării celulelor lipidice. intestin subţire. [23] a utilizat spectroscopia ATR-FTIR (spectroscopia IR cu tranformată Fourier în reflexie totală atenuată) pentru a măsura gradul de hidratare al corneei.omogene din punct de vedere al ţesutului conjunctiv care a fost ales ca şi amprentă spectrală. Andrus şi Strickland [51] au monitorizat gradual tumori limfoide cu ajutorul spectroscopiei FTIR. dar acest stu153 . [50] au folosit spectroscopia FTIR pentru a studia diferenţele între celule canceroase gingivale şi celulele epiteliale gingivale normale. 74%. Astfel. [47] au aplicat spectroscopia IR în diagnosticarea afecţiunii Alzheimer investigând spectre achiziţionate pe ţesut uman de sistem nervos central. respectiv 90%. ficat şi a altor părţi ale sistemului digestiv cu ajutorul fibrei optice FTIR şi a spectroscopiei FT-Raman. Lucassen et al. achiziţia de informaţii având loc la contactul cu o sondă ATR. Fukuyama et al. [62] au ales un studiu de reflexie FTIR prin absorpţie amplificată la suprafaţă a acizilor nucleici din celulele tumorale. Rezultatele au indicat faptul că banda atribuită întinderii C=O a adipozei poate fi identificată în spectrele probelor de ţesut normal. respectiv să diferenţieze materia albă de cea cenuşie cu acurateţe de 90%. urmărind vibraţia de deformare a apei în combinaţie cu cea de întindere a legăturii OH în cazul unei suprafeţe normal hidratată de cornee şi a uneia nehidratate suficient din cauza unor ocluzii. Weng et al. urmărindu-se raportul benzilor de la 1460 şi 1400 cm-1. Dovbeshko et al.

Regresia de tip parţial least-squares (PLS) ce corelează conţinutul de fructe şi spectrele FTIR centrate pe o bandă la 1729 cm-1 a asigurat o bună calibrare statistică la analizarea gemului de căpşuni [69]. [70] au analizat afine. iar pentru fiecare produs s-au stabilit limite inferioare ale acestuia. Spectre MIR au fost folosite pentru a diferenţia sucurile concentrate pure din rodii de cele contrafăcute cu suc de struguri concentrat (2%-14% v/v) folosind analiza de componente principale (PCA) în regiunea IR 1780-1685 cm-1. merişor. Autorii au 154 . În mod similar. rapide şi nedistructive ale compuşilor chimici. spectroscopia de absorbţie IR reprezintă o metodă senzitivă în ceea ce priveşte analiza malignităţii ţesuturilor cu potenţial real pentru aplicaţii clinice în detecţia şi diagnosticarea a diverse afecţiuni. Spectroscopia MIR a fost folosită în autentificarea sucurilor cu ingrediente de înaltă calitate contrafăcute din surse inferioare. atribuită în principal întinderii C=O [68]. respectiv apariţia prin interpretarea spectrelor a unor configuraţii “ciudate” de baze şi zaharuri. până la părţi pe milliard (ppb). spectroscopia MIR a fost de mare succes în diferenţierea varietăţilor de fructe şi a originilor geografice. nectar de prune şi sucuri de mere de la diferiţi producători. Spectre înregistrate după extracţia fazei solide din sucuri a îmbunătăţit puterea de modelare pentru compararea cu sucul pur şi a recunoaşterii prin folosirea unui tipar (soft independent analysis of class analogy (SIMCA)) şi a permis diferenţierea sucurilor de origini diferite. preparatelor şi a gemurilor de fructe este procentul care desemnează conţinutul de fructe. 4. He et al. Rodiile sunt foarte apreciate pentru activitatea lor antioxidantă cât şi pentru potenţialele efecte chemopreventive împotriva cancerului de prostată [68].diu a ridicat anumite probleme.Spectroscopia IR în calitatea şi siguranţa alimentelor Spectroscopia FTIR este o tehnologie promiţătoare pentru industria agroalimentară deoarece permite măsurători simple. industria agroalimentară este deja familiarizată cu această tehnologie şi cu potenţialul ei de implementare în monitorizarea alimentelor. Datorită utilizării tehnicii FTIR în aplicaţii de control a calităţii şi a procesării. struguri Concord. Progresul în instrumentaţia FTIR combinat cu dezvoltarea unor metode statistice multivariate de analiză a datelor fac această tehnologie ideală pentru monitorizare rapidă cât şi caracterizarea compuşilor din alimente la nivel de urme. Extracţia fazei solide a minimizat interferenţa zahărului cu spectrele şi a izolat componentele fenolice care au oferit o amprentă unică în autentificarea sucurilor. Un parametru important în monitorizarea autenticităţii piureurilor. În concluzie.

rezultând o precizie similară şi o rezoluţie spaţială chiar mai bună. niciuna dintre ele fiind foarte practică pentru că sunt costisitoare din punct de vedere al timpului necesar efectuării lor şi al setărilor pentru controlul de calitate. ci mai degrabă mai mulţi compuşi chimici.4 % (wt) H2O. Cozzolino et al. Până în 2009 nu a fost o metodă standardizată în industria viticolă care să permită determinarea eficientă a compoziţiei şi autenticităţii vinurilor organice [71]. dar au subliniat că această metodă este o îmbunătăţire reală comparativ cu încercărilor anterioare [70]. incluzând compuşi fenolici volatili şi nevolatili.2-1.atras atenţia asupra limitărilor acestei metode. Aplicaţii ale spectroscopiei IR în geoştiinţe Concentraţia şi distribuţia apei în rocile vulcanice din Sumisu Caldera şi Vulcanul Torishima din arcul Izu-Bonin (Japonia) au fost studiate de Wysoczanski şi Tani [72]. Rezultatele au fost comparabile cu cele obţinute prin metoda convenţională bazată pe micro-FTIR. Aproape 200 de soiuri de vinuri roşii şi albe din 13 regiuni din Australia au fost analizate folosind spectroscopia MIR combinată cu PCA. iar pentru obsidian 0. inclusiv în procesul de extracţie şi asupra nevoii unui spectru larg de probe pentru a îmbunătăţi repetabilitatea acestui model. Autorii aduc la cunoştinţă că spectroscopia MIR combinată cu tehnici chemometrice au permis o discriminare bună între probele produse în sisteme de producţie organică şi anorganică. dar a existat o uşoară suprapunere [71]. care ar contribui la discriminarea vinurilor. DPLS a clasificat corect 85% din vinurile organice. În general. iar LDA a reuşit să clasifice 75%. Masa brută a dacitelor din Sumisu Caldera conţine între 1. 155 . şi analiza discriminantă liniară (LDA). folosesc solvenţi dăunători şi monitorizează doar un parametru la un moment dat. regresia PLS discriminantă (DPLS). valori corespunzătoare cu saturarea apei la presiunile de erupţie. estimată la circa 5µm [72]. Explorarea rezultatelor analizei PLS nu a desemnat un parametru chimic individual care să fi explicat diferenţierea vinurilor. rezultatul analizei PCA a separat vinurile organice de cele anorganice. 5. [71] au fost primii care au folosit tehnologia IR pentru a clasifica vinuri comerciale provenite de la sisteme de producţie organică şi anorganică. Consumatorii sunt tot mai interesaţi de produse organice şi sunt dispuşi să plătească un preţ mai mare pentru aceste produse.2 % (wt) H2O. Metodele tradiţionale pentru autentificarea sucurilor de fructe includ cromatografia sau analiza raportului izotopilor de carbon. Industria de vinuri a recunoscut acest trend şi astfel în multe podgorii se pune accentul pe vinuri organice.

Pe lângă caracterizarea cristalo-chimică. fiind 3 peak-uri bine definite la 3604 cm-1. Mulţumiri pentru suportul acordat de Drd. O microanaliză preliminară a acestor probe a dezvăluit o absorpţie în regiunea 3000-4000 cm-1 datorată vibraţiilor de întindere a apei. faptul că acel conţinut de CO2 depinde puternic de faza mineralului [82]. Krisztian Herman la redactarea acestui material. Astfel se susţine ideea că o analiză amănunţită a speciilor volatile din minerale poate oferi informaţii cantitative şi calitative privind activitatea apei şi a CO2. procesele de deformare cât şi a unui “geotermometru” privind rocile din crusta terestră [83]. în special privind studiile arheologice şi problemele de conservare.Este bine cunoscut faptul că mineralele anhidride nominale formate în condiţii de înaltă presiune conţin urme de specii hidride [73-74]. Mircescu şi Mast. conţinutul de CO2 din lazurite a fost propus ca şi indicator al sursei naturale ultramarine de pigmenţi. Studiile care tratează incluziunile de fluide sunt foarte utile în definirea rolului fluidelor în geneza. Italia). Aceste incluziuni determină totodată şi dezvoltarea modelelor restrictive în geneza depozitării minereurilor şi oferă informaţii pentru exploatarea geotermală şi petrolieră în producţia la nivel industrial. De fapt. dar teste efectuate pe incluziunile de fluide din minerale sunt rare [81]. mineralele au o largă răspândire în istoria rocilor ornamentale sau a pigmenţilor utilizaţi în operele de artă. la 3500 cm-1 şi la 3245 cm-1. a fost că imagistica FTIR a distribuţiei apei în leucite reprezintă un instrument valoros în monitorizarea evoluţiei sistemelor magmatice. Numeroase studii recente au arătat că specii volatile ca şi CO2 şi specii hidride ca şi OH şi H2O pot fi de asemenea încorporate în circumstanţe speciale în majoritatea mineralelor din crustă [75-77]. Concluzia lui Della Ventura et al. fugacitatea oxigenului şi compoziţia fluidelor în sistemele minerale. Della Ventura et al. Nicoleta E. 156 . studiul speciilor volatile în minerale are aplicaţii şi în alte domenii. [76] au studiat un set de cristale leucite transparente atent selecţionate provenind din vulcanul Alban Hills (Roma. analiza spectroscopică a CO2 fiind comună în studiul rocilor. precum era de aşteptat. În acest context. aceste studii fiind folositoare în determinarea genezei şi a evoluţiei sistemelor magmatice [78]. colecţia de imagini obţinute prin scanare a arătat. Aplicând fluorescenţa de raze X. de aceea aceste materiale merită ca toată atenţia. Analiza apei în minerale [79] şi roci [80] cu ajutorul spectroscopiei FTIR este aproape o tehnică de rutină.

L. Vellekoop. Burden and D. Stranc. Journal of Chromatography A 1068 (2005) 3-30. Kuligowski. M. V. Kolhed. 17. Baena. Edelmann. R. Talanta 67 (2005) 269-279. K. Mordechai. Karlberg. Kantarovich. M. S. Jackson. Lendl. A. Quintas. Electrophoresis 24 (2003) 687-692. 12. C. Frank. M. Guterman. Rigas. 9. Warakamin. E. Lendl. 2. N. 20. Lucassen. Kolhed and B. Sensors and Actuators a-Physical 115 (2004) 591-599. Pilavdzic and A. W. Wong. A. Biospectroscopy 2 (1996) 143-153. Tait. R. W. M. M. G. 10. M. 19. Analyst 130 (2005) 772-778. Sindhuphak. Diem. C. C. A. K. Analytical Chemistry 74 (2002) 3843-3848. McIntosh. Journal of Investigative Dermatology 112 (1999) 951-956. R. S.quantared. M. R. S. Anastos. Jansen. Lammerhofer. Surowiec. B. 4. Lendl and B. W. P. Faist. A. Godwin. Sahu. Svasek. Schrenk. McNaughton. P. Ashdown. Hammody. 15. Biospectroscopy 4 (1998) 47-53. Trojanowicz and B. Baena and B. D. M. V. G. Applied Spectroscopy 58 (2004) 667-670. Xie. J. Arce. Sindhuphak. Lendl. 26. Applied Spectroscopy 58 (2004) 662-666. H. P. R. Yee. Barry. P. Karlberg. 23. R. B. A. Kolhed. S. P. Schaden. Journal of Biomedical Optics 3 (1998) 267-280. Muller. Haberkorn. Schindler. P. Svasek. Frank. M. A. Lasers în Surgery and Medicine 24 (1999) 382-388. Biospectroscopy 4 (1998) 75-91. M. Quintas and B. 21. 7. J. F. Edwards and A. Mantsch. 3. B. Brinkman. Quinn. 25. Journal of Chromatography A 934 (2001) 123-128. Righetti. B. H. Journal of Chromatography A 1080 (2005) 132-139. R. McNaughton. V. Srisookho. T. Gooijer and U. A. Hinsmann. 28. Svasek. J. Austria http://daylightsolutions. J. M. C. M. Wood. Karlberg. Barth and C. Journal of Chromatography A 856 (1999) 213-242. 30. Veen and J. Frank. T. Talanta 64 (2004) 1127-1146. D. G. T. Brunetto. Issaravanich. Lendl. http://www. Lendl. Journal of Raman Spectroscopy 23 (1992) 641-645. Goldstein and S. P. G. Analyst 128 (2003) 2-6.6. B. Quinn. 157 . Dusitsin. P. Lammerhofer and B. Gallignani and M. J. G. Goldstein. W. J. J. J. M. E. Hislop. A. D. L. Frank. 27. Ruzicka. D. H. B. R. B. P. 11. R. Z. Lendl. Williams. 18. Frank. J. H. B. Nilsson. Mark. Analytical Chemistry 81 (2009) 3746-3753. Argov. Zarou. 29.com J. A. M. M. Boonbundarlchai and N. Udomprasertgul. Bruch. S. M. S. S. W. Lewis. Crowson. Podshyvalov. 8. Bibliografie 1. Journal of Microscopy-Oxford 215 (2004) 86-91. Svasek. Lendl. N. M. Kolhed. H. Cancer Research 53 (1993) 762-765. Grekin. Lendl and B. T. P. M. S. 5. Strasser. Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) 369-430. Wood. B. N. Lendl and M. W. G. Gornik and G. L. T. Chiriboga. R. I. 14. 22. 13. Hinsmann. 6. Gynecologic Oncology 90 (2003) 10-14. 24. Zscherp. Hinsmann. Laurell. G. F. Somsen. N. Romeo and D. 16. Kuligowski and B.com Vienna. Journal of Chromatography A 1079 (2005) 24-40. C. Sukuta and R. Karlberg and B. Applied Physics B-Lasers and Optics 99 (2010) 833-840. Analytical Chemistry 72 (2000) 1645-1648. T. M. Pivik and B. Vigorita. J. Beck and J. Lendl. Zakim and M. B. Barnett and S.

Technology în Cancer Research & Treatment 5 (2006) 157-167. Mordechai. Nguyen. F. Lockyer. Analytical Biochemistry 287 (2000) 218-225. Mordechai. El Haj. S. B. O. T. Hu. Vickerman. Yuasa. Biospectroscopy 1 (1995) 141-148. D. Halliday and H. Sun. Y. G. 46. Yang. B. P. Richards-Kortum. J. S. Utzinger. Choo. A. F. Strickland. Yang. F. X. Levi. Gridina. Wu. F. 55. U. Salman. K. 42. A. Y. J. Pashchuk. Shi and J. Lacelle and P. 54. Cohen. T. D. P. Malpica. N. Scott. P. A. S. Eckel. H. H. Analytical Chemistry 67 (1995) 777-783. J. M. G. L. Journal of Pathology 201 (2003) 99-108. Q. Jackson. N. J. Mahadevan-Jansen. T. K. H. Kumaido. V. Kruglova and O. C. G. American Clinical Laboratory 19 (2000) 20. Yang. E. S. Wong. Huang. Kegelaer. H. J. Shohat. Feld. H. Heintzelman. Gardner. Dasari and M. X. X. Fichtner and H. Biospectroscopy 5 (1999) 117-126. P. C. Fujioka. R. S. Miyazaki. M. M. Ghanbari-Siahkali. 37. P. H. 35. Biospectroscopy 4 (1998) 37-46. Sule-Suso. Proceedings of the SPIE 3918 (2000) 66-77. M. P. K. A. Erukhimovitch. Ohoshima. Y. J. S. Biospectroscopy 3 (1997) 281-290. S. Y. X. Moriguchi and H. Z. A. Yoshida. J. Frank. E. Y. N. Xie. Huo. Che and W. J. Kikuchi. L. H. C. M. Gazi. Miyan. S. Talanta 53 (2000) 233-246. Z. P. Y. J. Huleihel. Z. R. J. L. Fabian. Myles. 48. W. P. Xu.31. R. B. Hart and M. J. S. J. Mordechai. N. P. Gotou. Wang and Y. 38. Lacelle. Hammody. Dovbeshko. Fung. R. A. Argov. V. 34. Application of FTIR microspectroscopy for the follow-up of childhood leukemia chemotherapy 4491 (2001) 243-250. 45. S. Crowe. K. Zhang. L. W. 32. 36. Journal of Molecular Structure 565 (2001) 329-334. T. K. Watanabe and H. J. L. G. Clinical Chemistry 51 (2005) 346-350. Y. Wu. I. Mordehai. Senterman. I. A. W. Mikhael. Mantsch. H. Shanks. D. Weng. Mansfield. J. N. Zarou. N. Mantsch. M. K. G. 158 . Biospectroscopy 2 (1996) 155-165. 47. Zakim and M. C. Sun. Katayama. Yano. Fitzmaurice. M. M. C. 49. Yanagisawa and M. 51. Sockalingum. Journal of Raman Spectroscopy 33 (2002) 552-563. C. Biospectroscopy 4 (1998) 55-59. R. Xu. L. 53. Bernshtain. M. M. R. A. A. Z. Somorjai. Wong. Biopolymers 78 (2005) 311-317. Biospectroscopy 1 (1995) 357-364. D. C. Argov. 41. Kapelushnik C. K. Sakai. Salman. Yoshida. 39. McCreery and D. Applied Spectroscopy 55 (2001) 955-959. Takeshita. H. Goldstein. Mikhael. T. R. S. Song. J. 52. Senterman and N. Redd. Weng. E. Chiriboga. F. O. Brown. B. 44. Manfait and A. S. Arai and M. Journal of Raman Spectroscopy 28 (1997) 119-&. Biospectroscopy 1 (1995) 37-45. Vibrational Spectroscopy 27 (2001) 165-173. V. Ling. S. L. S. Y. N. S. Li. 43. Follen and R. S. Paluszkiewicz and W. Murphy. Dwyer. Ramesh. Watson. Kwiatek. H. Erukhimovitch. J. Wade. Y. G. Sato. Shimizu. Kline and P. K. Zhou and J. F. M. Zelig and S. Vigorita. T. Diem. J. T. X. Chaims and Z. Moser and J. Jackson. 56. D. Treado. Science of the Total Environment 204 (1997) 283-287. P. 40. E. U. W. Sahu. M. M. Fukuyama. Y. X. Cancer Detection and Prevention 28 (2004) 32-36. L. W. P. Zhang. 50. Guan. I. Andrus. Huang. Fung. Clarke. Andrus and R. J. S. 33. Kobayashi. A. D. M. Li. Haka. G. Morimoto. C. Wang. Pizzi. Okuyama. Shafer-Peltier. J. L. Biopolymers 75 (2004) 384-392.

F. A. Nardi. 72. D. 69. M. D. 70. Johnson. Frezzotti and E. F. V. A. Shirshov. 83. F. 61. I. Knapp-Mohammady. A. I. S. M. V. Della Ventura. Rossman. F. Lima and J. Jurgensen. A. H. Nieminen. L. N. Ramesh. 59. 64. K. Suhai. L. Infrared and NIR raman spectroscopy în medical microbiology 3257 (1998) 245-257. A. J. S. 82. B. P. S. G. Rodriguez-Saona and M. 77. Journal of Volcanology and Geothermal Research 156 (2006) 302-314. T. V. S. Salzer. M. Solyanik. Skogby. P. I. M. R. Naumann H. R. Mossoba. Huleihel. D. R. Repnytska. O. K. Volatiles în Magmas 30 (1994) 67-121. Smith and I. Keppler and S. Jensen. S. E. 71. R. Jayakumar. Yamada. Z. R. P. Bellatreccia and M. Keppler. Vardin. Physics and Chemistry of Minerals 23 (1996) 319-327. M. 81. Bellatreccia and M. L. M. H. 62. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87 (1990) 8140-8144. Wysoczanski and K. J. Murakami. Rodig and B. R. I. 63. V. Goldman and P. McMillan. M. Food Chemistry 116 (2009) 761-765. R. Hervig and P. Piccinini. J. 78. Lithos 55 (2001) IX-XI. C. Vibrational Spectroscopy 28 (2002) 103-110. Piccinini. Andersen. M. Cavallo and M. B. Todor and C. H. A. Linnen. Rendiconti Lincei-Scienze Fisiche E Naturali 19 (2008) 141-159. T. T. Food Chemistry 108 (2008) 742-748. 58. M. Giusti. G. J. A. F. Beran and E. 159 . Claussen. R. garnet and accessory minerals 62 (2006) 169-191. Mordechai. G. Water în Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 117-154. G. 73. Salman. I. Ozen and L. Biopolymers 67 (2002) 470-486. Webster. Libowitzky and G. Ihinger. Water în natural mantle minerals II: Olivine. Wong. U. A. M. H. B. Mauer. M. Morgello. 67. G. Arimoto and Y. T. Schieber. Hammody and S. Dovbeshko. G. Tani. Carle and A. 60. W. International Journal of Quantum Chemistry 106 (2006) 1160-1198. T. Tarumi. J. Frimand and S. F. J. M. 80. Gridina. 74. Al-Khaldi. American Mineralogist 93 (2008) 1538-1544. R. Y. A. Smith. Herrmann. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (2007) 4443-4452. L. 73 (2009) 399-413. R. M. R. P. Sterner. Abu-Id. Kirkwood. Bergmann. R. Wong. I. Rigas. Wade. E. Rigas and P. G. H. Vibrational Spectroscopy 38 (2005) 229-235. A. J. F. G. M. Della Ventura.57. Cancer Research 52 (1992) 84-88. Fry. Brilli. Jung. Binoy. Nielsen. Della Ventura. He. T. A. Johannsen. A. T. D. M. Mag. Pettit and O. Elements 1 (2005) 19-24. Dambergs. Richter. Degtyarenko. Sedman and A. Niehaus. R. 68. T. J. Holdstock. 79. Jalkanen. 66. E. Chegel. V. W. C. H. I. Burke. Ismail. S. Joe. M. De Vivo. Tryndiak. Water în Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 155-167. Cynkar and P. F. Y. M. Libowitzky H. Bellatreccia. Journal of Materials Science-Materials în Medicine 5 (1994) 775-778. H. Fugel. Steiner. Rahim. Tay. H. Abraham. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 50 (2002) 111-121. Tamura. K. Shimada. M. Cozzolino. 65. Journal of Raman Spectroscopy 35 (2004) 939-946. Erukhimovich. B. F. R. A. Rehman. Mantsch. J. Physics în Medicine and Biology 48 (2003) 2373-2390. J. Mineral. Trends în Food Science & Technology 16 (2005) 433-441. 76. 75. Piccinini. Canadian Mineralogist 42 (2004) 1275-1282. M.

.................................V............ deci nu emit radiaţie de fluorescenţă....... Consideraţii teoretice Fluorescenţa este un fenomen de fotoluminiscenţă (procesul prin care substanţele absorb lumină şi după aceea reemit lumină cu o lungime de undă diferită).................................................. Energia acestor nivele depinde de energia (lungimea de undă) radiaţiei luminoase care produce excitarea........... Aplicaţii ale spectrofluorimetriei ............. Atunci când radiaţia luminoasă ajunge pe o moleculă fluorescentă................................... 164 3.. 169 6............ dr......................... Moleculele fluorescente sunt instabile atunci când se află pe un nivel vibraţional al stării electronice excitate.. Bibliografie .... 166 5................. De aceea ele 160 .. procesul se numeşte fluorescenţă.................................. Dana Maniu Cuprins 1.. În starea electronică fundamentală moleculele fluorescente se află într-o configuraţie stabilă........ Consideraţii teoretice.......................... 166 4................... SPECTROFLUORIMETRUL Spectrofluorimetria Conf.... Avantajele spectrofluorimetriei ......................... aceasta poate trece într-o stare electronică excitată (cu energie mai mare) în urma absorbţiei de energie de la radiaţia luminoasă.................... 160 2........................... 171 1............................ Prin absorbţie de radiaţie luminoasă moleculele pot fi excitate prin trecerea unui electron de pe nivelul fundamental pe un nivel excitat........ se numesc molecule fluorescente sau fluorofori.................. molecula dezexcitându-se................................... Energia stării excitate nu poate fi menţinută decât o perioadă foarte scurtă.............................. Tehnica experimentală ....... Moleculele care au această proprietate..... Aparatura disponibilă ... Din aceeaşi clasă fac parte şi fosforescenţa şi fosforescenţa întârziată.................. Există o mulţime de nivele vibraţionale ale stării electronice excitate pe care se poate afla o moleculă fluorescentă..... Dacă molecula se dezexcită (electronul trece din starea excitată în starea fundamentală) prin emisie de lumină........

.moleculele aflate pe diferite nivele vibraţionale se relaxează pe nivelul fundamental al stării electronice respective. . sunt posibile următoarele procese (ilustrate în figura 1): .intersystem crossing (ISC) . Molecula fluorescentă poate absorbi energie luminoasă din nou. care este semi-stabilă. O radiaţie luminoasă de mare intensitate poate provoca modificarea structurii moleculei fluorescente. astfel încât aceasta să nu mai emită radiaţie de fluorescenţă. deoarece înseamnă că o moleculă poate emite radiaţie de fluorescenţă de mai multe ori. Această proprietate face ca fluorescenţa să fie o tehnică foarte senzitivă (chiar şi o mică cantitate de substanţă poate fi detectată). Timpul de viaţă a unei stări excitate de triplet poate ajunge până la 10 s. Intervalul de timp în care o moleculă fluorescentă se află în stare excitată se numeşte “timp de viaţă“ şi are o valoare foarte mică (între 10-15 şi 10-9 s). relaxarea vibraţională se face prin pierderea de energie în urma ciocnirilor dintre molecule (10-14 . deci procesul descris mai sus poate fi repetat. stare de singlet (S1). Acest proces se poate observa la atomii grei (Br. excesul de energie dintre cele două stări regăsindu-se în energia radiaţiei luminoase emise în procesul de dezexcitare. deci emisia de fosforescenţă poate continua şi după încetarea iradierii iniţiale.10-11 s). ceea ce face posibilă degradarea ei. De obicei fosforescenţa apare doar la temperaturi scăzute sau în medii cu vâscozitate mare (dezexcitatea nivelului T1 se poate face şi prin conversie internă sau alte procese neradiative). În realitate.conversia internă (IC) . I) sau la metale. procesul de fluorescenţă este ciclic şi are loc atâta timp cât există o radiaţie luminoasă. În urma absorbţiei unui foton de către o moleculă.fosforescenţa . Acest fapt este deosebit de util.trec în cea mai joasă stare electronică excitată. moleculele fluorescente trec din stare electronică excitată în stare electronică fundamentală.unele molecule aflate în prima stare electronică excitată. Radiaţia luminoasă de fluorescenţă are energie mai mică decât radiaţia luminoasă absorbită de moleculă. Acest proces este numit “photobleaching“. făcându-se prin ciocnirea cu alte molecule. pot trece în prima stare de triplet (T1). După acest interval. 161 . O tranziţie triplet-singlet este mult mai puţin probabilă decât o tranziţie singlet-singlet. moleculele fluorescente sunt instabile structural în intervalul de timp cât se află în stare de excitaţie (timpul de viaţă). De fapt. care să excite molecula.moleculele aflate în starea de triplet pot să se dezexcite prin emisia unui foton. pierderea de energie este neradiativă. Deci lungimea de undă a radiaţiei emise este totdeauna mai mare decât lungimea de undă a radiaţiei absorbite datorită energiei pierdute de moleculă în timpul trecerii pe cea mai joasă stare electronică excitată.

Fluorescenţa de tip Stokes reprezintă emisia de fotoni cu lungime de undă mai mare (frecvenţă mai mică) de către o moleculă ce a absorbit fotoni cu o lungime de undă mai mică (frecvenţă mai mare). valoarea maximă fiind 1. moleculele fluorescente au spectre de absorbţie şi de fluorescenţă caracteristice.fluorescenţa. Atât absorbţia cât şi emisia de fluorescenţă sunt unice pentru fiecare moleculă. Diagrama Perrin-Jablonski. În acest caz relaxarea vibraţională este mai rapidă decât relaxarea prin fluorescenţă.Figura 1. este proprietatea moleculelor de a emite radiaţie electromagnetică la trecerea de pe prima stare excitată de singlet S1 pe un nivel vibraţional al stării electronice fundamentale S0. Lumina emisă are totdeauna lungime de undă mai mare decât lumina absorbită (figura 2). De aceea. Fluorescenţa poate să apară doar în timpul absorbţiei (timpul de viaţă a unei stări excitate de singlet este între 10-9 şi 10-15 s). 162 . Fluorescenţa observată cu ajutorul spectrofluorimetrelor este cunoscută ca Fluorescenţa de tip Stokes. Fluorescenţa se poate măsura cu ajutorul eficienţei cuantice Q (randament cuantic): Q = (numărul de fotoni emişi) / (numărul de fotoni absorbiţi) Q are o valoare fixă pentru fiecare moleculă (pentru aceleaşi condiţii). Majoritatea moleculelor nu sunt fluorescente deoarece starea excitată S1 se suprapune cu nivelele vibraţionale ale stării fundamentale S0. .

Intensitatea radiaţiei fluorescente este proporţională cu intensitatea radiaţiei absorbită de o moleculă fluorescentă: F = K'(I0-I) unde I0 este intensitatea radiaţiei incidente pe probă. atunci printr-o simplă înlocuire se obţine legea fluorescenţei: F = K' I0 (1 .Figura 2. unde A = bcε este absorbanţa. iar K' este o constantă ce depinde de condiţiile experimentale şi de eficienţa cuantică a fluorescenţei. Curba de calibrare 163 . I este intenstitatea radiaţiei după ce a traversat un strat de substanţă de lungime b.10-εbc) Figura 3. Spectru de fluorescenţă (emisie) şi de absorbţie (excitaţie) caracteristic. Dacă ţinem cont de legea Beer: I/I0 = 10-εbc .

Astfel. iar celalalt analizează lungimea de undă a radiaţiei de fluorescenţă (emise). Semnalul detectat poate fi reprezentat în funcţie de cele două lungimi de undă sau numai în funcţie de una din cele două lungimi de undă.3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c)3 − .⎤ F = K ' I 0 ⎢2. Radiaţia emisă este colectată la un 164 . detector (figura 4). orice spectrofluorimetru modern este interfaţat cu un computer cu ajutorul căruia se setează parametrii de măsurare.. monocromator a radiaţiei excitatoare.3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c)2 + (2. intensitatea radiaţiei de fluorescenţă nu depinde liniar de concentraţie. Un fluorimetru măsoară abilitatea unei probe de a absorbi lumină la o anumită lungime de undă şi de a emite lumină la o lungime de undă mai mare. se înregistrează şi se prelucrează datele.. 2. proprietăţile fluorescente ale probei pot fi scanate pentru un domeniu larg de lungimi de undă ale radiaţiei excitatoare (200-1000 nm). Bineînţeles. unul pentru lumina excitatoare şi unul pentru radiaţia de fluorescenţă emisă. Spectrofluorimetrele folosesc două monocromatoare. Primul monocromator analizează lungimea de undă a radiaţiei excitatoare. Pentru o concentraţie mai mare decât c1 curba de calibrare nu mai este liniară. avem: ⎡ (2. Dacă folosim o descompunere în serie Taylor. monocromator al radiaţiei emise.05) termenii de ordin superior pot fi consideraţi nuli. Avantajul spectrofluorimetrelor este faptul că permit variaţia controlată a lungimii de undă a radiaţiei excitatoare. Părţile principale ale unui spectrofluorimetru sunt: sursa. Tehnica experimentală Pentru a măsura fluorescenţa există două tipuri de instrumente: fluorimetre şi spectrofluorimetre. Fluorimetrele se folosesc pentru măsurători cantitative pentru compuşi specifici (măsurători de rutină).3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c − ⎥ 2! 2! ⎣ ⎦ Dacă εbc are o valoare suficient de mică (< 0.Spre deosebire de legea Beer. camera probei.. deci putem scrie: F = 2.3·K'·ε·b·c·I0 Relaţia de mai sus ne arată ca pentru concentraţii suficient de mici intensitatea de fluorescentă este proporţională cu concentraţia şi cu intensitatea radiaţiei excitatoare la frecvenţa de absorbţie.

Prin fanta de ieşire a monocromatorului radiaţiei excitatoare iese lumină cu lungimea de undă dorită. pentru a permite instalarea diferitelor accesorii pentru probe solide. Primul monocromator descompune radiaţia excitatoare în culorile componente. sursă monocromator detector probă monocromator Figura 4. Fanta de intrare este ajustabilă continuu (cu ajutorul soft-ului) pentru a se asigura maximul de rezoluţie şi reproductibilitate. 165 .unghi de 90° faţă de radiaţia excitatoare pentru a preveni orice interferenţă între radiaţia excitatoare şi cea emisă. cât şi lungimea de undă a acesteia este monitorizată şi controlată cu ajutorul unui fotodetector suplimentar situat între monocromator şi camera probei. Schema bloc pentru un spectrofluorimetru Sursa unui spectrofluorimetru emite în domeniul UV şi vizibil (de obicei se folosesc lămpi cu Xenon). Lumina emisă de sursă este focalizată pe fanta de intrare a primului monocromator cu ajutorul unei oglinzi sferice sau eliptice. Camera probei este de obicei destul de spaţioasă. sau poate să se modifice continuu pe tot domeniul de emisie al sursei. Lumina emisă de probă este focalizată pe fanta de intrare al celui de-al doilea monocromator. Deoarece radiaţia de fluorescenţă are totdeauna lungime de undă mai mare decât radiaţia excitatoare. Atât intensitatea luminoasă a radiaţiei incidente. lichide şi gazoase. elementul dispersiv al celui de-al doilea monocromator este astfel conceput încât să aibă maximul de eficienţă în domeniul vizibil. Astfel radiaţia luminoasă incidentă pe probă poate să aibă lungime de undă fixă pentru tot timpul măsurătorii. sau pentru controlarea temperaturii probei. Acesta descompune radiaţia de fluorescenţă emisă de probă în culorile componente. Detectorul este poziţionat la ieşirea din cel de-al doilea monocromator.

Specificitatea: Spectrofotometrele măsoară doar lumina absorbită. Spectrofluorimetrele au limite de detecţie mult mai bune decât spectrofotometrele. rigidităţii şi structurii proteinelor. 3. Fluorimetria poate fi folosită pe un domeniu mare de concentraţii fără a fi nevoie de diluţia eşantioanelor sau de modificarea celulei în care se pune eşantionul. Senzitivitatea şi specificitatea mare a acestei tehnici reduce sau chiar elimină procedurile de preparare a probelor. studiile pot fi efectuate în soluţii apoase fără a fi nevoie ca probele să fie tratate. Domeniu de concentraţie: Intensitatea semnalului de fluorescenţă este direct proporţional cu concentraţia substanţei fuorescente pe un domeniu larg. Viteză şi simplitate: spectrofluorimetria este o tehnică analitică relativ simplă. etc. 4.) folosind probe foarte mici. hidrocarburi aromatice. Pentru multe substanţe fluorescente este obişnuită o limită de detecţie de părţi/miliard sau chiar părţi/triliard. Tehnicile spectrofotometrice au probleme de interferenţă deoarece multe materiale absorb lumina. ceea ce face dificil izolarea semnalului de la materialul de analizat din matricea în care se află.Toate spectrofluorimetrele moderne sunt controlate de computer. Fluorescenţa oferă informaţii asupra dinamicii. Această extraordinară senzitivitate permite detecţia sigură a substanţelor fluorescente (clorofilă. Datele obţinute în urma măsurătorilor efectuate se pot prelucra cu ajutorul programelor speciale. prin intermediul computerului se pot seta toţi parametri necesari derulării diferitelor tipuri de măsurători. vi166 . Avantajele spectrofluorimetriei Senzitivitatea: Limitele de detecţie depind în mare măsură de proprietăţile probei de măsurat. Spectrofluorometrele au o specificiate ridicată şi apar mult mai puţine probleme de interferenţă deoarece substanţele fluorescente pot fi incluse în solvenţi sau matrici care nu sunt fluorescente. face ca această tehnică să fie folosită atât pentru cercetări avansate cât şi pentru analize de rutină sau controlul calităţii în domeniile farmaciei şi medicinii. sau chiar dacă au fluorescentă este puţin probabil ca două substanţe să absoarbă şi să emită radiaţie de fluorescenţă în acelaşi domeniu. Astfel. Aplicaţii ale spectrofluorimetriei Medicină şi farmacologie Sensitivitatea deosebită a spectroscopiei de fluorescenţă. De asemenea.

Pentru a asigura calitatea produselor alimentare. fapt ce are deosebite aplicaţii în imunologie. Deoarece probele preluate din mediul înconjurător sunt deosebit de complexe. Mediul înconjurător Cu ajutorul fluorescenţei se poate monitoriza calitatea aerului. mucegaiuri. Fluores167 . Cu ajutorul fluorescenţei se poate identifica prezenţa unui număr foarte mare de analiţi chiar dacă aceştia sunt în cantităţi foarte mici (sub picomolar). microorganisme. AND-ului. Culturile de bacterii ce pot să apară pe alimente sunt distructive şi periculoase datorită potenţialului de contaminare şi îmbolnăvire pe care îl au.efectul prezenţei atomilor grei . pentru detectarea diferitelor substanţe sunt necesare tehnici de mare senzitivitate şi selectivitate care să evite multiplele surse de interferenţă. pot fi elaborate metode şi teste de rutină pentru analizele de laboratoar. Calitatea ambalajelor este de asemenea importantă atât ca membrană protectoare împotriva oxidării alimentelor cât şi datorită faptului că sunt o posibilă sursă de contaminare cu urme de plastic sau de polimeri. etc.efectul general de solvent . toxine.reacţia la diferite suprafeţe Industria alimentară şi agricultura În industria alimentară este importantă îmbunătăţirea calităţii nutriţionale a alimentelor. producătorii trebuie să identifice contaminanţi. Spectrele de fluorescenţă 3D pot fi folosite ca o amprentă unică care duce la identificarea calitativă a compuşilor.timpul de viaţă şi randamentul cuantic . Prin determinări de fluorescenţă pot fi determinate: .ruşilor.efectul temperaturii . mutageni sau substanţe canceroase. După ce sunt determinate caracteristicile de bază (excitaţie. Chimia analitică În chimia analitică se studiază spectrele de luminescenţă precum şi eficienţa cuantică a speciilor flourescente în funcţie de matriţa în care sunt puse. creşterea termenului de garanţie precum şi a calităţii ambalajelor. randament cuantic) ale unei substanţe fluorescente. a apei şi a solului prin detectarea urmelor de substanţe organice sau inorganice. emisie.momentul de dipol al stării excitate . De asemenea măsurătorile de fluorescenţă 3D sunt folosite pentru determinarea surselor geologice a diferitelor eşantioane de petrol. şi chiar pesticide utilizate în mod normal pentru a preveni răspândirea unor boli.

pentru analiza medicamentelor. Companiile de cosmetice şi produse pentru îngrijirea sănătăţii evaluează eficacitatea unor noi produse cum ar fi loţiunile pentru protecţie solară. Biologie celulară În studiul proceselor biologice sunt implicaţi o largă varietate de markeri fluorescenţi. Industrie Producătorii folosesc fluorescenţa pentru a monitoriza calitatea vopselelor. hormonilor. a plascticelor. fluorescenţa este folosită ca instrument de cercetare în domeniul biotehnologiilor.mecanismul molecular de transfer prin membrana de proteină a bacteriorhodopsinei (o membrană integrală de proteină care acţionează ca o pompă de protoni .o tehnică pentru localizarea.capturează energie luminoasă şi o foloseşte pentru a transfera protoni în exteriorul celulei).folosirea "quantum dots"-urilor ca probe biologice în diagnosticarea cancerului şi studierea ţesuturilor. a polimerilor. Una din tehnicile cele mai folosite în acest domeniu este determinarea raportului dintre intensităţile semnalului de fluorescenţă emis de markerul folosit la diferite lungimi de undă. şi a altor substanţe biologice.conversia biologică de energie în fotosinteza plantelor verzi.cenţa poate fi folosită şi în determinarea randamentului şi calităţii anumitor culturi în urma aplicării fertilizatorilor. Aceştia pot fi caracterizaţi cu ajutorul spectrelor de fluorescenţă de excitaţie şi de emisie. carotenoide. emolientele pe bază de lipide şi cremele anti-rid. vitaminelor. Fabricanţii de instrumentar medical şi clinic studiază sistemele invazive pe bază de fibre optice (ce pot fi introduse în interiorul arterelor sau a altor orificii). Fotochimie Mecanismul absorbţiei luminii precum şi proprietăţile fotofizice ale unei substanţe determină rolul său în procesele biologice şi chimice. înălbitorilor optici şi suprafeţelor fosforescente. . 168 . . tehnică mai avantajoasă decât cea clasică în care se măsoară intensitatea absolută de fluorescenţă la o singură lungime de undă.terapia fotodinamică . identificarea şi controlul tumorilor. Aplicaţiile fotochimice ale fluorescenţei includ: . . De asemenea. . etc).caracterizarea substanţelor fotoreceptoare (flavine. proteinelor.

. . . .zgomot este 200:1 sau mai mare. . Cu ajutorul spectrofluorimetrului Jasco 6500 pot fi efectuate următoarele tipuri de măsurători: . Spectrofluorimetrul este echipat cu accesorii pentru modificarea controlată a temperaturi probei şi pentru polarizarea luminii incidente. Fantele monocromatoarelor au dimensiuni reglabile.măsurători de cinetică. precum şi cu suporturi pentru diferite tipuri de probe (solide. .determinarea stabilităţii intensităţii de fluorescenţă în timp. atât ca lăţime cât şi ca înălţime.determinarea timpului de viaţă în cazul probelor fosforescente.acurateţea lungimii de undă este ±2 nm pentru ambele monocromatoare.măsurători 3D de fluorescenţă. lichide şi gazoase).rezoluţia monocromatoarelor este de 1 nm.viteza de scanare este între 20 şi 10. Cele două monocromatoare sunt echipate cu reţele de difracţie holografice concave (1500 trăsături/mm) cu unghi de "blaze" optimizat. 169 .000 nm/ min pentru ambele monocromatoare.determinarea spectrului de fosforescenţă a unei probe. Calibrarea spectrofluorimetrului se face cu ajutorul kit-ului inclus ce utilizează ca probă standard Rodamina B. ceea ce asigură maxim de senzitivitate pe întregul domeniu de lungimi de undă (200-850 nm). . .determinarea concentraţiei de substanţă fluorescentă (analiză cantitativă). .determinarea spectrului de fluorescenţă a unei probe.5.raportul semnal . .măsurători la lungimi de undă fixă. Aparatura disponibilă Spectrofluorimetru Jasco FP 6500 Spectrofluorimetrul Jasco 6500 are următoarele caracteristici: Sursa este o lampă cu xenon de 150 W dotată cu un fotomultiplicator ce monitorizează şi compensează orice variaţie în intensitate asigurându-se astfel maximul de stabilitate. Alte caracteristici ale spectrofluorimetrului Jasco FP 6500 sunt: .

la viteze diferite de scanare. Rezultatele măsurătorilor probelor de concentraţie necunoscută vor fi date în unitatea de măsură de concentraţie în care a fost construită curba de calibrare. fie pe emisie. Se pot face spectre de excitaţie sau de emisie. Modul "Time course measurement" permite verificarea stabilităţii în timp a intensităţii fluorescenţei soluţiilor.) Analiza acestor spectre permite determinarea poziţiei maximului de excitaţie şi de emisie. Modul "Spectrum measurement" permite măsurarea fluorescenţei probelor prin scanare de spectru. Se obţin spectre tridimensionale (pe o axă este reprezentată intensitatea semnalului de fluorescenţă şi pe celelalte două axe avem lungimea de undă de excitaţie. 170 . Această acţiune presupune măsurarea soluţiilor etalon. Modul "Fixed wavelength measurement" permite efectuarea măsurării fluorescenţei probelor la maxim 4 lungimi de undă simultan.Controlul acestor măsurători se face folosind programul "Spectra manager" Modul "Quantitative analysis": pentru a efectua o analiză cantitativă trebuie trasată o curbă de calibrare. respectiv de emisie. Se face citirea la o lungime de undă selectabilă într-un interval de timp selectabil. selectabile fie pe excitaţie. Astfel. Modul "3D Fluorescence measurements" permite măsurarea în acelaşi timp a (i) spectrului de fluorescenţă a unei probe în timp ce se modifică lungimea de undă a radiaţiei excitatoare şi (ii) măsurarea spectrului de excitaţie în timp ce se modifică lungimea de undă de emisie. construirea şi stocarea curbei de calibrare. fapt deosebit de util pentru probe necunoscute. se pot face spectre pe tot domeniul sau pe un domeniu selectat de utilizator.

spectrum measurement" permite măsurarea spectrului de fosforescenţă al probelor.com/Products/Spectroscopy/FP-6000-Series-Spectrophotom eters. 3. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. 6. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Bernard Valeur. 2.jascoinc.Modul "Phospho. 2002 Joseph Lakowicz. 2006 http://www. Bibliografie 1. Ed.aspx 171 . Ed. Springer. Wiley-VCH.

................... apar pe aceeaşi scară temporală cu emisia de fluorescenţă.. pentru a obţine informaţii chimice mai amănunţite trebuie determinată variaţia în timp a fluorescenţei.......................................... 187 4......... în urma modificărilor de temperatură şi pH......... Dana Maniu Cuprins 1...................................... Monitorizarea denaturării termice a albuminei bovine la diferite valori ale pH-ului ..... Unele molecule excitate vor emite radiaţie de fluorescenţă înainte de durata 172 ...........................................1.............................3... Microscopia confocală de fluorescenţă ............ 180 3................ Determinarea interacţiunii dintre albumina bovină şi nanoparticule de aur .................. Evaluarea modificărilor conformaţionale induse în albumina bovină adsorbită la suprafaţa nanoparticulelor de aur........................................... Microscopia de fluorescenţă prin scanare optică în câmp apropiat (NSOM) ... .........................3........ Fiecare moleculă individuală emite aleatoriu după excitaţie............. Fluorescenţa în timp real furnizează mai multe informaţii despre moleculele ce se află în imediata vecinătate a fluoroforului............... Fluorescenţa în timp real ... Exemple de aplicaţii ale spectrofluorimetriei ......... 174 2.................................. 176 2........................................... transferul rezonant de energie şi stingerea dinamică.... 184 3......................2............. Microscopia de fluorescenţă avansată ... Fluorescenţa în timp real Deşi măsurătorile normale de fluorescenţă pot fi folosite ca o sondă non-invazivă extrem de selectivă şi sensibilă......Spectrofluorimetria .............. Bibliografie .......................................... Deoarece timpul de viaţă de fluorescenţă a unei molecule este foarte sensibil la vecinătatea sa moleculară...... 190 1....aplicaţii Conf.............. 178 3.................... determinarea acestui timp de viaţă este deosebit de util în determinarea stării fluoroforului..2.1................. 175 2..................................... Microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy) ..... dr............ 172 2. Multe evenimente macromoleculare................. Este important să ne amintim că timpul de viaţă de fluorescenţă este timpul mediu pentru ca o moleculă să rămână în stare excitată înainte de a emite un foton........ 180 3......................... cum ar fi difuzia rotaţională............. Astfel...................... spectroscopia de fluorescenţă în timp real poate fi utilizată pentru a investiga aceste procese şi a obţine informaţii despre vecinătatea chimică a fluoroforului...................................

Pulsul de frecvenţă ω1 trece printr-un dispozitiv optic ce produce o întârziere de fază (optical delay line). Armonica a doua a acestui puls (frecvenţa ω2) este generat într-un cristal neliniar. deşi în unele cazuri pot avea ordinul sutelor de nanosecunde sau să fie mai mici decat 1 ns (sute de femtosecunde). Emisia de fluorescenţă incoerentă emisă de probă este colectată şi mixată cu pulsul de frecvenţă ω1 într-un cristal neliniar. de ordinul 1-10 ns. iar pulsul de frecvenţă ω2 este focalizat pe probă (flow cell). De obicei. fiind separat de fundamentală cu ajutorul unui divizor de undă dicroic. cristalul trebuie rotit la diferite unghiuri. iar alte molecule excitate vor emite radiaţie de fluorescenţă mult timp după durata medie de viaţă. Din această cauză este foarte important ca aparatura experimentală folosită pentru acest tip de masurători să aibă rezoluţie temporală foarte bună. Cu cât este mai mare decalajul temporar dintre pulsul ω1 şi emisia de fluorescenţă ωfl. Pentru o poziţie dată a cristalului. în general. Deci dacă interesează întreg domeniu de fluorescenţă. O sursă laser emite un puls ultra scurt (de ordinul femtosecundelor) cu lungimea de undă λ1 corespunzătoare frecvenţei ω1. Timpii de viaţă de fluorescenţă sunt. numai pentru un domeniu îngust din spectrul de fluorescenţă apare coincidenţa temporală şi spaţială cu pulsul de frecvenţă. ceea ce ne demonstrează că există o coincidenţă temporală şi spaţială între ω1 şi ωfl.medie de viaţă. Această mixare ("fluorescence up-conversion") generează lumină cu frecvenţa ωsum = ω1 + ωfl . cristalele neliniare sunt confecţionate din potasiu-dihidrogen-fosfat (KDP) sau borat de bariu (BBO). Intensitatea Isum a pulsului cu frecvenţa ωsum pentru un anumit decalaj temporar între pulsul de frecvenţă ω1 şi emisia de fluorescenţă de frecvenţă ωfl este proporţională cu funcţia de corelaţie dintre intensitatea de fluorescenţă Ifl şi intensitatea I1 a pulsului de frecvenţă ω1: I sum (τ ) ≈ ∫ I fl (t ) I1 (t − τ )dt −∞ ∞ În acest fel se poate determina dependenţa intensităţii de fluorescenţă de timp prin modificarea timpului de întârziere (prin intermediul dispozitivului "optical delay line"). 173 . Cristalele din borat de bariu au avantajul transparenţei în UV şi eficienţei cuantice mai mare (cu un factor de 4-6). cu atât intensitatea de fluorescenţă este mai mică. În figura 1 este prezentat un montaj experimental folosit pentru determinări de fluorescenţă în timp real.

fluorescenţa în timp real a fost folosită cu succes în studii ale proceselor biologice care au loc în prezenţa luminii (proteina galbenă fotoactivă. 2001). PM . în principal. BBO -cristal neliniar. Observarea emisiei de fluorescenţă poate fi efectuată cu ajutorul ochiului observatorului. proton transfer etc. HW . (DM . mixturi polimerice. dar este de asemenea folosită pentru a studia diferite sisteme chimice cum ar fi coloizi.) şi a proceselor intermoleculare (elctron transfer etc. 174 . Set-up experimental pentru fluorescenţă în timp real (Mialocq and Gustavsson.fotomultiplicator. lockin . cristale lichide.filtru. proteina albastră fluorescentă. pentru a investiga celulele şi ţesuturile vii. GG420 .coupled device). iar rezoluţia maximă este aproximativ egală cu jumatatea lungimii de undă a radiaţiei folosite la excitare.cameră video. Microscopia de fluorescenţă avansată Microscopia de fluorescenţă convenţională este folosită. Un microscop de fluorescenţă convenţional diferă de un microscop standard prin faptul că este folosită o sursă de lumină (lampă cu mercur sau oxigen) ce emite şi în domeniu UV.placă semi-undă. CCD . Profunzimea de câmp a unui microscop convenţional cu fluorescenţă este 2-3 µm. M .monochromator.).numărător) Măsurătorile de fluorescenţă în timp real sunt foarte potrivite pentru investigarea proceselor intramoleculare fotoinduse (charge transfer. fotodegradarea polimerilor naturali. colorarea fibrelor etc.).Figura 1. proteina verde fotoactivă etc.oglindă dicroică. Lungimea de undă de excitaţie este selectată cu ajutorul unui filtru de interferenţă sau a unui monocromator. De asemenea. 2. a unui film fotografic sau a unei camere cu detector CCD (charge.

În acest caz imaginea se poate îmbunătăţi cu ajutorul computerului. grosimea secţiunilor confocale poate atinge limita teoretică de aproximativ 0. De asemenea. Microscopia confocală de fluorescenţă În cazul unui microscop confocal. Astfel.În cazul în care proba este mai subţire decît valoarea profunzimii de câmp. fasciculul de lumină este focalizat pe probă. Deoarece în microscopia confocală de fluorescenţă se colectează numai 175 . este de preferat folosirea altor tehnici. Principiul microscopiei confocale (stânga) comparativ cu microscopia convenţională (dreapta). Una din caracteristicile microscopiei confocale de fluorescenţă este faptul că se pot obţine imaginile unor straturi cu o grosime bine definită. Figura 2. Emisia de fluorescentă produsă de proba situată în afara planului de focalizare nu va trece prin fanta multiplicatorului deoarece se va lovi de tubul ocularului (figura 2). 2.5 µm. Emisia de fluorescenţă este separată de lumina excitatoare cu ajutorul unei oglinzi dicroice şi este focalizată cu ajutorul lentilelor obiectivului pe fanta unui fotomultiplicator. deci prin deplasarea probei pe verticală se obţine imaginea tridimensională a acesteia. imaginea este neclară datorită defocalizării. folosind o lentilă cu apertură numerică mare.1. dar. prin folosirea microscopiei optice în câmp apropiat (near-field scanning optical microscopy (NSOM)) se poate lucra dincolo de limita de difracţie optică. cum ar fi microscopia confocală (confocal microscopy) sau microscopia prin excitaţia cu doi fotoni (two-photon excitation microscopy). de obicei.

Secţiunea eficace a procesului de absorbţie a doi fotoni este foarte mică (10-50 cm4·s/foton·moleculă pentu rodamina B). cei doi fotoni absorbiţi sunt identici. pentru a putea folosi unui fascicul excitator cu putere mai mică. Microscopia confocală de fluorescenţă este o tehnică utilizată pe scară largă în biologia celulară (vizualizarea celulelor. Probabilitatea absorbţiei a doi fotoni depinde de coincidenţa temporală şi spaţială a fotonilor incidenţi (diferenţa dintre timpul în care cei doi fotoni ajung la fluorofor trebuie să fie sub 10-18 s). 2. microscopia confocală de fluorescenţă a fost folosită în studii din domeniul coloizilor. iar tehnica se numeşte microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy).2. fenomen numit photobleaching. Creşterea energiei fasciculului de excitare duce la descompunere fotochimică a fluoroforului. absorbţia a doi fotoni din domeniul roşu poate excita o moleculă care absoarbe în domeniul UV. imagistica pH. iar tehnica se numeşte microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu două culori (two-color excitation fluorescence microscopy). Microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy) În spectroscopia de fluorescenţă convenţională. Dacă se folosesc două lasere. etc. Excitaţia cu doi fotoni este un proces neliniar. Microscopia confocală de fluorescenţă poate fi combinată cu tehnicile domeniu-timp şi frecvenţă-timp (time-domain. fluoroforul este excitat prin absorbţia unui foton a cărui energie corespunde cu diferenţa de energie dintre starea electronică fundamentală şi starea electronică excitată.). a cristalelor lichide şi a amestecurilor de polimeri.o parte din fasciculul de fluorescenţă emis. imagistica Ca2+. frequency-domain) pentru a se obţine imagini din perioada numită timp de viaţă al fluoroforului (lifetime imaging). De asemenea. de asemenea. În consecinţă. energia de excitare necesară trebuie să fie mai mare decât în microscopia de fluorescenţă convenţională. vor fi excitaţi numai fluoroforii situaţi într-o 176 . atunci fotonii sunt diferiţi (1/λe = 1/λ1 + 1/λ2). determinarea distribuţiei potenţialului electric. absorbţia depinde de pătratul intensităţii luminii folosite la excitaţie. Reducerea efectelor nedorite datorate fenomenului de photobleaching se face prin utilizarea de fluorofori stabili şi prin folosirea unui microscop confocal echipat cu detector cu sensibilitate mare şi obiectiv cu apertură numerică mare. Dacă este folosit un singur laser. De exemplu. posibilă prin absorbţia simultană a doi fotoni de energie mai mică (lungime de undă mai mare) prin intermediul unei stări virtuale cu timp de viaţă foarte scurt (Figura 3). Excitaţia fluoroforului este.

în cazul excitării cu doi fotoni avem următoarele avantaje: (i) deoarece fasciculul de excitare este concentrat atât în timp cât şi în spaţiu nu apare fenomenul de photobleaching în afara focarului şi (ii) fasciculul excitator nu este atenuat de abosorbţia din afara focarului. Deci. excitarea cu doi fotoni a fluoroforului poate avea loc doar în focar. acesta reprezintă o reducere a volumului de excitare de 1010 ori. Excitarea cu doi fotoni permite obţinerea unei rezoluţii tridimensională deosebită în microscopia de fluorescenţă. Figura 3. peste 80% din intensitatea totală de fluorescenţă va fi emisă dintr-o zonă situată la 1 mm în jurul focarului. probabilitatea de absorbţie a doi fotoni în afara regiunii focale scade cu puterea a patra a distanţei.25 şi un fascicul de excitare având 780 nm. deci trebuie folosiţi laseri cu putere mare şi funcţionare în impulsuri. nedorit. Deşi. 177 .1-1 femptolitri. fenomenul de difuzie duce la scăderea intensităţii fasciculului de fluorescenţă emis din focar. ceea ce duce la obţinerea unui contrast mai bun pentru obiecte de mici dimensiuni. Comparativ cu fluorometrele convenţionale. (Linia punctată reprezintă starea virtuală care mediază absorbţia a doi fotoni. Comparaţie între excitaţia cu doi fotoni şi excitaţia cu un foton.regiune unde fluxul de fotoni este foarte mare. Folosind un obiectiv cu o apertură numerică de 1.) Deoarece intensitatea fasciculului de excitare variază cu pătratul distanţei de la planul focal. Volumul de excitaţie este de ordinul a 0. în ambele tipuri de excitari (cu doi fotoni sau cu două culori). în cazul excitarii cu două culori nu apare decât o creştere minimală a background-ului de fluorescenţă. cum ar fi laserul cu Ti-safir. Excitarea cu două culori se foloseşte atunci când se doreşte observarea unor obiecte microscopice situate în medii puternic difuzante. ceea ce duce la creşterea adâncimii de penetrare a fasciculului excitator. Deşi efectul secţionării 3-D este comparabil cu cel din microscopia confocală.

Figura 4. Suprafaţa probei este poziţionată în imediata apropiere a fantei. Majoritatea instrumentelor NSOM sunt construite în jurul unui microscop cu fluorescenţă inversat. Fanta acţionează ca o sondă luminoasă de dimensiune sub-lungime de undă care poate fi folosită pentru a lumina suprafaţa probei înainte ca lumina să fie difractată. Proba se află pe un suport piezo. de tip NSOM (Figura 5). Lumina din vârful NSOM ataşat fibrei optice excită proba. care permite deplasarea ei în planul xy. care permite deplasarea pe verticală . Fasciculul laser trece printr-o fibră optică uni-modală la ataşată de un vârf special pentru determinările în câmp apropiat (vârf NSOM). Această tehnică are o rezoluţie spaţială foarte mare (de ordinal sub-micrometrilor) şi o sensibilitate foarte bună. iar emisia de fluorescenţă este colectată de obiectivul cu apertură numerică mare. Această limită poate fi depăşită prin utilizarea unei surse de lumină cu lungime de undă mai mică şi prin plasarea probei foarte aproape de această sursă (în câmp apropiat). H. Synge (figura 4).3. astfel încât fasciculul emergent este forţat să interacţioneze cu proba. care oferă avantajul de a furniza imagini normale şi permite ca regiunea de studiat să fie localizată cu rezoluţie mare.axa Oz). Principiul scanării în câmp apropiat (conform ideii lui Synge) Ideea de optică în "câmp apropiat" este atribuită cercetătorului E. unde λ este lungimea de undă a sursei de luminii. Limita de rezoluţie este de aproximativ λ/2.2. montat sub suportul pe care se află proba şi detec178 . Microscopia de fluorescenţă prin scanare optică în câmp apropiat (NSOM) Rezoluţia unui microcop convenţional este limitată datorită fenomenelor de interferenţă şi difracţie. Radiaţia luminoasă incidentă trece printr-o fantă cu dimensiuni sub-lungime de undă. Vârful este montat într-un cap piezo.

mod iluminare. Tehnica NSOM este remarcabilă pentru analiza filmelor subtiri. cristale lichide. Alternativ. etc. Cu ajutorul tehnicii NSOM au fost investigate cu succes sisteme fotosintetice. Acest lucru poate fi realizat cu ajutorul feedback-ului bazat în general pe metoda de forţă-forfecare: vârful este intercalat lateral la una dintre frecvenţele sale de rezonanţă cu o amplitudine de aproximativ 2-5 nm. Această amplitudine poate fi monitorizată şi folosită pentru a genera un semnal de feedback cu ajutorul căruia se controlează distanţa dintre probă şi vârf în timpul scanării. cartografierea cromozomilor şi microstructura membranelor. Pentru a obţine imagini de înaltă rezoluţie este necesară poziţionarea precisă a vârfului NSOM (de ordinul nm) faţă de suprafaţa probei. Acest mod este numit modul iluminare. Când vârful NSOM interacţionează cu câmpul de forţe Van der Waals a probei. localizarea proteinelor. forţele de forfecare atenueză amplitudinea vibraţiilor acestuia. a capacităţii de cartografiere a topografiei suprafeţei şi datorită faptului că fenomenul de photobleaching este redus.tată printr-un filtru (pentru a elimina lumina reziduală de la laserul folosit pentru excitare) şi un detector. Sistemele care scanează piezo şi înregistrează imaginile sunt similare cu cele utilizate în microscopia de forţă atomică. Instrument NSOM construit în jurul unui microscop de fluorescenta inversat . Microscopia de fluorescenţă prin scanare optică în câmp apropiat poate oferi noi perspective în studiul sistemelor biologice complexe din cauza rezoluţiei mai mari decât în microscopia confocală.). 179 . Figura 5. proba este iluminată de la un câmp îndepărtat şi emisia de fluorescenţă este colectată de către un vârf NSOM. în modul colectare. (polimeri electroluminiscenţi.

ce le permite conjugarea uşoară cu diferite biomolecule. stabilizate de o reţea internă de 17 legături disulfide. cu formă aproximativ elipsoidală (4nm×4nm×14nm). II şi III). Deoarece interacţiunea dintre proteine şi nanoparticulele de aur este foarte sensibilă la starea conformaţională a proteinei şi la chimia suprafeţei nanoparticulelor. Nanoparticulele de aur (GNP) sunt sonde ideale pentru investigarea proceselor biologice datorită biocompatibilităţii lor. fiecare domeniu fiind format din şase elice. Pe de altă parte conjugarea dintre proteină şi nanoparticulele de aur nu are ca efect doar stabilizarea sistemului proteină-nanoparticulă. În unele cazuri interacţiunea dintre proteină şi suprafaţa nanoparticulelor de aur poate determina modificări de structură ce duc la alterarea proprietăţilor proteinei. Albumina bovina (Bovine Serum Albumin) este o proteină globulară. este foarte importantă determinarea modificărilor conformaţionale pe care le suferă proteina în urma adsorbţiei la suprafaţa nanoparticulei. Determinarea interacţiunii nanoparticule de aur dintre albumina bovină şi Iosin şi colaboratorii [4] au demonstrat interacţiunea directă dintre nanoparticulele de aur şi albumina bovină. Iosin şi colaboratorii [4] au înregistrat spectrele de fluorescenţă ale bioconjugatelor BSA-nanoparticule de aur cu ajutorul unui Spectrofluorimetru Jasco LP-6500 cuplat cu un dispozitiv pentru controlarea temperaturii (ADP-303T). Structura nativă a albuminei bovine (BSA) este caracterizată de un singur lanţ polipeptidic compus din 583 reziduri de aminoacizi.3. datorită prezenţei celor două reziduuri de triptofan din structura ei. Soluţia de bioconjugate (nanoparticule de aur şi BSA) a fost pusă într-o cuvă de cuarţ având dimensiunea de 10 mm. ci determină biocompatibilizarea (funcţionalizarea) acestor nanoparticule pentru alte interacţiuni sau cuplaje cu mediul biologic.1. Semnalul de fluorescenţă al albuminei (BSA) a fost obţinut la 337 nm prin excitarea reziduului de triptofan cu o radiaţie având lungimea de undă 280 nm. cu ajutorul căruia temperatura poate fi modificată controlat de la −10 °C la +110 °C. Albumina bovină (BSA) este utilizată ca proteină model în studiile biologice deoarece are o structură bine cunoscută şi posedă proprietăţi de fluorescenţă specifice. Exemple de aplicaţii ale spectrofluorimetriei 3. folosită des în aplicaţii din domeniul bio-nanotehnologiilor. Albumina bovină (BSA) se găseşte în cantităţi mari în plasmă. Cunoaşterea efectelor biologice ale nanoparticulelor de aur necesită determinarea legăturilor ce apar între nanoparticule şi proteinele cu care interacţionează. structura terţiară cuprinde trei domenii omoloage (I. 180 . şi joacă un rol important în procesele fiziologice.

(c) 1.1×10-11 M. fluorescenţa intrinsecă a BSA-ului este dată în principal de reziduurile de triptofan. F0 – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei apoase de BSA. Iosin şi colaboratorii [4]. bandă ce este datorată emisiei reziduurilor de triptofan. În realitate. de aceea studiul emisiei de fluorescenţă a acestuia este deosebit de utilă în determinarea modificărilor conformaţionale ale proteinei şi adsorbţia la nanoparticule. regiune ce coincide cu banda de emisie a triptofanului. deoarece fenilalanina are un randament cuantic foarte mic. au monitorizat stingerea semnalului de fluorescenţă prin creşterea concentraţiei nanoparticulelor de aur de formă sferică. După cum se poate observa în figura 6. (d) 1. Albumina bovină (BSA) conţine trei cromofori: triptofan. Triptofanul este deosebit de senzitiv la modificarea vecinătăţii locale. Pe langă efectul evident Figura 6.Din spectrele de fluorescenţă se pot obţine informaţii importante (constanta de legătură şi numărul ”siturilor” de legătură) referitoare la modul de legare a proteinelor de suprafaţa nanoparticulelor de aur. tirosina şi fenilalanina a căror emisie de fluorescenţă poate fi stinsă. (e) 2. (b) 0. 181 . F – concentraţii intermediare.55×10-11 M. iar fluorescenţa tirosinei este aproape stinsă dacă este ionizată sau dacă este aproape de un grup amino. Fsat – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei de BSA saturată cu nanosfere de aur. Măsurătorile de fluorescenţă au fost efectuate cu o radiaţie excitatoare de 280 nm.65×10-11 M. iar nanoparticulele de aur nu prezintă emisie de fluorescenţă. Spectrele de fluorescenţă ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraţii ale nanosferelor de aur: (a) 0. carboxyl sau triptofan. Spectrele de fluorescenţă ale unor soluţii având diferite concentraţii de nanoparticule de aur şi albumină bovină (BSA) au fost monitorizare în domeniul 290-450 nm. Soluţia apoasă de BSA are o bandă puternică de fluorescenţă cu maximul situat la 336 nm. lungime de undă ce este departe de banda plasmonică de rezonanţă a nanoparticulelor de aur.2×10-11 M.

(c) 2. Această comportare se datorează unui efect de saturaţie (când toate moleculele de BSA sunt legate de nanoparticulele de aur. (e) 4. folosind metoda descrisă de Tedesco et al. Figura 7. (b) 1. În cazul complexului BSA-nanobastonaşe nu se observă nici o deplasare a maximului benzii de fluorescenţă odată cu modificarea concentraţiei. deplasare ce indică o modificare a polarităţii din jurul reziduului de triptofan. Se observă că intensitatea benzii de fluorescenţă descreşte odată cu creşterea concentraţiei de nanobastonaşe de aur. în ambele cazuri. autorii au observant şi o deplasare spre roşu a maximului benzii de fluorescenţă cu 4 nm (de la 336 nm la 340 nm). În figura 7 sunt prezentate spectrele de fluorescenţă ale complexului BSA-nanobastonaşe de aur. [6]: (F0 – Fsat)/(F – Fsat) = ([M]/Kdiss)n unde F0.18×10-14 M. Spectrele de fluorescenţă ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraţii de nanobastonaşe de aur: (a) 0. Fsat şi F sunt intensităţile de fluorescenţă datorate reziduurilor de triptofan din BSA: 182 . intensitatea emisiei de fluorescenţă rămâne constantă după atingerea unui nivel de concentratie a nanoparticulelor de aur.de stingere a fluorescenţei.24×10-14 M. Din spectrele de fluorescenţă de mai sus autorii au determinat constanta de legătură (Kb) precum şi numărul siturilor de legătură dintre nanoparticulele de aur şi BSA.06×10-14 M. pentru diferite concentraţii.12×10-14 M. Fsat – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei de BSA saturată cu nanobastonaşe de aur. F0 – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei apoase de BSA. adaugarea în continuare a nanoparticulelor nu duce la apariţia de noi legături BSA-nanoparticule). F – concentraţii intermediare. (d) 3.

Valorile astfel calculate se găsesc în tabelul 1.34 × 1011 0. F este F intensitatea de fluorescenţă a soluţiilor de BSA având concentraţii intermediare. iar nanosferele au sarcină electrică negativă.38 Valoarea mai mare a constantei de legatură în cazul nanosferelor este datorată faptului că cele două tipuri de nanoparticule au sarcinii electrice şi o chimie a suprafeţei diferite: nanobastonaşele au sarcină electrică pozitivă. folosind efectul de stingere a emisiei de fluorescenţă a triptofanului din BSA. indus de suprafaţa metalică a nanoparticulei comjugată.Fsat)] în funcţie de log([M]). e reprezintă coeficientul de extincţie molară Pentru a calcula parametrii ‘‘n” şi ‘‘Kb” autorii au reprezentat grafic log[(F0 .Fsat)] = 0 au obţinut constanta de disociere (Kdiss). d este grosimea cuvei folosită pentru înregistrarea spectrelor. Fsat este intensitatea de fluorescenţă a soluţiei de BSA saturată cu nanoparticule de aur. Concentraţia nanoparticulelor de aur a fost estimată cu ajutorul relaţiei A = [M]dε unde: A este absorbanţa soluţiei. Din panta graficului au calculat numărul siturilor de legătură ‘‘n”. [M] reprezintă concentraţia nanoparticulelor de aur.37 0. 183 . În concluzie. iar din valoarea lui log[M] pentru care log[(F0 . nanosfere de aur nanobastonaşe de aur Kb 2. n reprezintă numărul ”siturilor” de legătură dintre nanoparticulele de aur şi BSA Kdiss este valoarea reciprocă a constantei de legătură Kb. Tabelul 1. În plus nanobastonaşele sunt stabilizate cu citrat de sodiu pe când nanosferele sunt stabilizate cu CTAB.5 × 105 n 1.F)/(F . interacţiunea locală dintre nanoparticulele de aur şi albumina bovină a fost investigată cu ajutorul spectroscopiei de fluorescenţă.F)/ (F .F0 este intensitatea de fluorescenţă a soluţiei apoase de BSA pur. [M] este concentraţia particulelor (în moli). Constanta de legătură (Kb) şi numărul siturilor de legatură (n) pentru complexul BSA-nanoparticule de aur.

În cazul albuminei bovine. în principal printr-un mecanism static (constanta de legatură Kb este dependentă de valoarea pH-ului). Modificări conformaţionale ale proteinelor pot fi induse de variaţii ale temperaturii şi ale pH-ului. Spectrele înregistrate sugerează faptul că nanoparticulele de aur inhibă emisia de fluorescenţă a reziduurilor de triptofan din BSA. spectrul c) are maximul benzii de emisie la 337 nm. Iosin şi colaboratorii [5] au monitorizat mecanismul de interactiune între albumina bovină (BSA) şi nanoparticulele de aur cu ajutorul spectroscopiei de fluorescenţă. Deplasarea maximul benzii de emisie indică faptul că modificarea pH-ului soluţiei duce la obţinerea de stări con184 . atracţia sau respingerea nanoparticulelor de aur. Structura albuminei bovine este puternic dependentă de pH şi temperatură. Spectroscopia de fluorescenţă. datorită senzitivităţii mari. în soluţie.2. poate fi folosită pentru a obţine informaţii legate de modificările coinformaţionale ale proteinelor induse de interacţiunea cu nanoparticulele de aur la diferite valori ale pH-ului şi la diferite temperaturi. determinând. 5 (spectrul b) şi 9 (spectrul d) au maximul benzii de emisie la 324 nm.7 [7]. în urma modificărilor de temperatură şi pH. M. Valoarea pH-ului afectează atât structura albuminei bovine cât şi sarcina grupării funcţionale a proteinei. având o influenţă majoră asupra interfeţei dintre nanoparticule şi substanţele biologice. Evaluarea modificărilor conformaţionale induse în albumina bovină adsorbită la suprafaţa nanoparticulelor de aur. Sarcina netă a albuminei bovine este puternic dependentă de pH-ul soluţiei. în consecinţă. După cum se observă în figura 8. unde pI reprezintă punctul izoelectric [6]. după cum am mai amintit. fiecare stare conformaţională având formă şi dimensiune proprie. Aceste modificări ale structurii proteinelor pot duce la apariţia cancerului. grupare aflată într-o poziţie hidrofobică). punctul izoelectric este 4. Nanoparticulele de aur folosite sunt încărcate negativ la suprafaţă datorită faptului că sunt acoperite cu citrat pentru a prevenii agregarea lor. a diabetului şi a afecţiunilor cardiovasculare. fiind pozitivă pentru pH< pI.3. grupărilor de triptofan ce sunt localizate pe suprafaţa proteinei (în domeniul I: Trp-134. 336 nm respectiv 339 nm. grupare expusă mai puternic influenţei vecinătăţii hidrofilice) şi în interiorul proteinei (în domeniul II: Trp-213. iar spectrele de fluorescenţă ale soluţiilor de BSA cu valori ale pH-ului 2 (spectrul a). Proprietăţile fluorescente ale albuminei bovine (BSA) sunt datorate. neutră pentru pH= pI şi negativă pentru pH> pI. spectrul de fluorescenţă al soluţiei pure de BSA (pH = 6.

Pentru a obţine informaţii legate de emisia de fluorescenţă a triptofanului din albumina bovină la diferite valori ale pH-ului în prezenţa nanoparticulelor de aur.form’). datorită creşterii separaţiei inter-domeniu şi schimbării configuraţiei proteinei astfel încât gruparea triptofan are o vecinătate mai hidrofobică. în timp ce la pH = 2 şi pH = 9 albumina bovină are formă extinsă (‘E-form’) respectiv bazică (‘B. Din spectrele de fluorescenţă. 185 . autorii au calculat constanta de stingere a fluorescenţei (KSV) folosind ecuaţia Stern–Volmer: F0/F = 1 + Kqτ0[GNPs] = 1 + KSV[GNPs] unde: F0 şi F sunt intensităţile relative de flkuorescenţă ale triptofanului în absenţa şi în prezenţa nanoparticulelor de aur. pH 6 (c) şi pH 9 (d). Spectrele de fluorescenţă înregistrate (figura 9) demonstrează scăderea drastică a emisiei de fluorescenţă (quenching) a triptofanului din albumina bovină la pH = 2 odată cu creşterea concentraţiei nanoparticulelor de aur (de la 0. Iosin şi colaboratorii [5] au folosit o concentraţie fixă de BSA titrată în cantităţi diferite de soluţie de nanoparticule de aur. Spectre de fluorescenţă ale albuminei bovine la pH 2 (a). Astfel. Emisia de fluorescenţă a albuminei bovine de tipul ‘E-form’ are maximul deplasat spre albastru.formaţionale diferite ale albuminei. iar deplasarea maximului benzii de emisie spre lungimi de undă mari ne indică faptul că triptofanul este mai expus solventului.55×10−11 M la 2. la pH neutru albumina bovină are o formă nativă (‘N-form’).75×10−11 M). Deplasarea maximului benzii de emisie spre lungimi de undă mai mici indică faptul că triptofanul din albumina bovină are o vecinătate mai hidrofobică (se modifică structura terţiară). Figura 8. pH 5 (b). în comparaţie cu emisia albuminei bovine de tipul ‘N-form’.

32×1018 M−1 s−1 la pH = 9. 1.65×10−11 M. În urma calculelor s-au obţinut următoarele valori pentru numărul siturilor de legătură (n): 1. Kq = 0. obţinându-se valorile KSV = 1. (e) 2.0×1010 M−1 s−1) în cazul stingerii emisiei de fluorescenţă a macromoleculelor biologice datorită mecanismului de ciocnire.1×10−11 M.Kq este constanta de stingere bimoleculară.34×1018 M−1 s−1 la pH = 6. ce indică senzitivitatea fluoroforului la molecula ce determină stingerea fluorescenţei (quencher).77 la pH 2. Astfel. τ0 = 5×10−9 s este timpul de viaţă mediu al albuminei bovine în absenţa nanoparticulelor de aur. KSV este constanta de stingere Stern–Volmer. (b) 0.11×109 M−1. respectiv Kq = 0.2×10−11 M şi (f) 2. constanta de stingere bimoleculară Kq a fost calculată.22×1018 M−1 s−1 pentru bioconjugatele BSA– GNPs la pH = 2. Spectre de fluorescenţă ale grupării triptofan din BSA la pH = 2 pentru diferite concentraţii ale nanoparticulelor de aur: (a) 0. în cazul bioconjugatelor BSA–GNPs stingerea emisiei de fluorescenţă nu este iniţiată de ciocniri dinamice ci de formarea unui complex nefluorescent în urma unui mecanism de stingere static.7×109 M−1 pentru pH = 6 şi KSV = 1.6×109 M−1 pentru pH = 9. Graficul inserat reprezintă curba Stern–Volmer. [GNPs] reprezintă concentraţia nanoparticulelor de aur.97 la 186 . Prin fitare liniară s-a obţinut KSV = 1. În mod similar au fost calculate constantele de stingere Stern–Volmer pentru pH = 6 şi pH = 9. obţinându-se valorile: Kq = 0. Valoarea obţinută pentru constanta de stingere bimoleculară Kq este mai mare decât valoarea obţinută (2. precum şi numărul siturilor de legătură (n) dintre nanoparticule şi BSA conform relaţiilor din pargraful anterior. Figura 9.55×10−11 M.75×10−11 M. Iosin şi colaboratorii [5] au determinat constanta de legătură la echilibru Kb (indică echilibrul dintre speciile adsorbante şi cele resorbante). (c) 1. Deci. (d) 1.

valori ce indică faptul că adsorbţia maximă a moleculelor de albumină la suprafaţa nanoparticulelor de aur apare pentru o valoare a pH-ului apropiată de punctul izoelectric (pI) al BSA-ului. deci determinarea condiţiilor în care are loc acest proces este foarte importantă pentru înţelegerea stabilităţii proteinelor. soluţia apoasă pură de BSA are o emisie de fluorescenţă puternică. curba de denaturare a albuminei bovine pure sugerează existenţa a două temperaturi de tranziţie: una la 43 ºC.82×109 M−1. prima temperatură de tranziţie apărând în 187 .81×109 M−1 la pH 6 şi 2. La aceste temperaturi apare o modificare a vecinătăţii triptofanului din albumină.76 la pH 9. 3. grupările –SH libere.3.85 şi Kb = 2. prin creşterea temperaturii forma nativă a proteinei devine mai flexibilă.03×109 M−1 la pH 9. iar cealaltă la 65 ºC. maximul benzii de fluorescenţă datorată triptofanului se deplasează spre numere de undă mai mici. După cum observă şi autorii. De menţionat că valorile mai mari ale constantei de legătură indică o atracţie mai puternică între cele două specii. Odată cu creşterea temperaturii. Numărul siturilor de legătură şi constanta de legătură pentru pH = 5 este: n = 1.74×109 M−1 şi Kq = 0. Monitorizarea denaturării termice a albuminei bovine la diferite valori ale pH-ului Denaturarea termică a proteinelor este un proces intrinsec. au fost monitorizate modificările emisiei de fluorescenţă a triptofanului din BSA pentru temperaturi cuprinse între 22 ºC şi 85 ºC (domeniu în care apare o modificare importantă a structurii terţiare a albuminei). 1. Pentru a mima o vecinătate biologică reală. Platoul curbei de denaturare indică faptul că albumina îşi menţine starea nativă pînă la aproximativ 42 ºC. cerntrată la 337 nm. autorii au studiat formarea bioconjugatelor la pH = 5.6×109 M−1 la pH 2. Ca urmare a acestui fapt. respectiv pentru constanta de legătură Kb: 2. Constanta de stingere Stern–Volmer şi constanta de stingere bimoleculară obţinute pentru această valoare a pH-ului sunt: KSV = 1. ajungând până la 330 nm (figura 10). Graficul inserat (denaturation curve) indică o relaţie neliniară între deplasarea maximului benzii de absorbţie şi temperatură. În acest scop. înainte şi după absorbţia la suprafaţa nanoparticulelor de aur. De fapt.348×1018 M−1 s−1. La temperatura camerei. sau regiunile hidrofobice devin predispuse la interacţiuni intermoleculare noi. analizând emisia de fluorescenţă a triptofanuluui din BSA.pH 6 şi 1. Iosin şi colaboratorii [5] au studiat modificările structurale ce apar în cazul denaturării termice a albuminei bovine. deci creşterea temperaturii duce la apariţia de modificări structurale ale proteinei.

În mod contrar. temperatura de tranziţie la care începe denaturarea termică este mai mare (46 °C) decât în mediu neutru. datorită expunerii triptofanului la moleculele de solvent. deplasare ce sugerează tranziţia albuminei de la starea nativă (compactă) la o stare cu o structură mai deschisă. apare şi scăderea în intensitate a emisiei de fluorescenţă a triptofanului. În urma măsurătorilor efectuate s-a observat o dependenţă accentuată de valoarea pH-ului a temperaturii de tranziţie la care proteina îşi modifică conformaţia. Inserat: curba de denaturare termică (variaţia maximului benzii de fluorescenţă în funcţie de temperatură . Astfel.jurul pragului maxim admis al febrei ce apare în condiţii de boală (42 ºC). Autorii au studiat efectul combinat al pH-ului şi al temperaturii înainte şi după conjugarea albuminei bovine cu nanoparticulele de aur. Prin măsurarea emisiei de fluorescenţă a triptofanului din albumină în procesul de răcire. creşterea temperaturii de la 22 ºC la 85 ºC determină descreşterea cu 72% a emisiei de fluorescenţă. la pH 6. După cum se observă în figu188 . Figura 10. în mediu acid (pH mic) proteina este mai stabilă termic. Astfel. Dependenţa de temperatură a emisiei de fluorescenţă a grupărilor de triptofan din albumina bovină.9). în mediu alcalin (pH mare) temperatura de tranziţie este mult mai scăzută (32 °C) decât în mediu neutru (pH = 6) ceea ce indică o denaturare termică mult mai rapidă în mediu bazic. valoare la care apare un al doilea platou în curba de denaturare. O dată cu creşterea temperaturii. s-a determinat faptul că procesul de denaturare termică a albuminei bovine este ireversibil.la creşterea şi descreşterea temperaturii). pe lângă denaturarea proteinei. Între 43 ºC şi 65 ºC se observă o deplasare spre albastru a maximului emisiei de fluorescenţă a albuminei bovine. prin compararea denaturării termice (între 22 ºC şi 85 ºC) a proteinei în soluţie pentru diferite valori ale pH-ului (2 . Denaturarea completă a proteinei se face după 65 ºC.

modifică forma curbei de denaturare. rezultând creşterea temperaturii de tranziţie indiferent de valoarea pH-ului. bioconjugarea albuminei bovine cu nanoparticule de aur. După cum se observă şi din figura 11. De exemplu. Pentru a investiga efectul temperaturii asupra fenomenului de stingere a fluorescenţei albuminei bovine de către nanoparticulele de aur a fost calculată constanta de stingere KSV pentru diferite temperaturi. deci modifică comportarea termică a proteinei. Inserat: dependenţa constantei de stingere Stern–Volmer de temperatură. 189 . Figura 12. în funcţie de temperatură pentru diferite valori ale pH-ului. pentru pH = 6 temperatura de tranziţie creşte de la 42 °C la 47 °C. respectiv din bioconjugatul BSA-nanoparticule. Figura 11. Curbele Stern–Volmer pentru stin gerea fluorescenţei BSA-ului de către nanoparticule de aur (pH = 6). a emisiei de fluorescenţă. Variaţia maximului emisiei de fluorescenţă a triptofanului din BSA. prezenţa nanoparticulelor induce o deplasare. prezenţa nanoparticulelor de aur îmbunătăţeşte stabilitatea termică a proteinei. Deci. spre numere de undă mari.ra 11.

9994 0. J. Tabelul 2. Berlin (2001).0721 0. T. BMC Struct. Biol.deviaţia standard pentru valorile coeficientului KSV. 338. 395-401. Canpean. Bernard Valeur. Constanta de stingere KSV şi parametrii termodinamici pentru complexul BSA-nanoparticule de aur. Springer. 318.0683 0. 3.-C.coeficientul de corelaţie) pH 6 T (K) 295 318 338 295 318 338 KSV (L/mol) 1. (2011). M. 4. Alexov. Wiley-VCH. Mol.0700 R 0. 217.0782 0. 924–926 (2009) 196–200. Investigation of femtosecond chemical reactivity by means of fluorescence up-conversion. P. Joseph Lakowicz.88x109 5. P. 358 K) ne indică faptul că constanta de stingere KSV scade odată cu creşterea temperaturii (figura 12). 7.9988 0. Study of protein-gold nanoparticle conjugates by fluorescence and surface-enhanced Raman scattering. Crystal structural analysis of human serum albumin complexed with hemin and fatty acid.and thermally induced conformational changes of Bovine Serum Albumin adsorbed onto gold nanoparticles.A. Mialocq and T.11x109 6.R. Ed. confirmă faptul că mecanismul de stingere a fluorescenţei triptofanului din albumina bovină de către nanoparticulele de aur este iniţiat de formarea unui complex ne-fluorescent prin adiţia moleculelor de albumină bovină la nanoparticulele de aur. Biophys. Astilean. (2006).Graficul Stern-Volmer ce caracterizează stingerea emisie de fluorescenţă a triptofanului din albumina bovină de către nanoparticulele de aur. Toderas. 83 (2002) 1731–1748.9982 0. Springer Verlag. 6. Eds B. M. Tsuchida. Iosin. Curry. la pH 6 pentru diferite temperaturi (295. S. Ghuman. Zunszain. 3 (2003) 1–9. Baldeck.22 2 Proporţionalitatea inversă dintre constanta de stingere KSV şi temperatură (tabelul 2). E.9980 0.59 55.E.-C.41x109 9. 190 . F. V.87 53. Struct. S.96 81.79 132.32 51. J. S.29 -28. Astilean. “Molecular Fluorescence: Principles and Applications”. Komatsu. Georgescu. J. (2002). 5. Combining conformational flexibility and continuum electrostatics for calculating pKas în proteins.70x109 1. M. J. 2. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry.11 10. R.70 -64. Bibliografie 1. Iosin. R . 4. Gunner. E. Gustavsson. “Principles of Fluorescence Spectroscopy”.0651 0.9975 ΔH(kJ/mol) ΔS(J/mol K) ΔG(kJ/mol) -48.60x109 1. J. (SD . Valeur.05x109 SD 0.35 -54. Spectroscopic studies on pH.9983 0.G. Brochon. Fluorescence Spectroscopy: New Trends în Fluorescence Spectroscopy.0601 0. Ed.

....i = .... Plasarea probei care conţine momente magnetice nucleare într-un camp magnetic extern intens. şi (ii) polarizările spinilor..... are două efecte majore: (i) axa polarizării de spin efectuează o mişcare de precesie cu frecventa Larmor...................... cu relevanţă în special pentru sisteme moleculare organice.................. în jurul direcţiei câmpului magnetic static (direcţia z)............... dr...... dr................ astfel încât după o perioadă de ordinul aşa numitului timp de relaxare longitudinal......S................. Principiul metodei...... Claudiu Filip C..... asociate speciei nucleare i. sunt prezentate în tabelul de mai jos: 191 .. Tehnici experimentale de bază pentru aplicaţii RMN-S în sisteme moleculare organice ....I.................. 196 3..VI.......... Mihaela Aluaş Cuprins 1. B0 ~ 7-23 T (generat cu ajutorul unei bobine supraconductoare)........... Bibliografie ..........III. se vor reorienta sub acţiunea câmpurilor magnetice locale fluctuante uşor datorită mişcării termice....... proba va fi caracterizată de o magnetizare macroscopică orientată de-a lungul direcţiei câmpului magnetic extern. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ MAGNETICĂ NUCLEARĂ Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) C... T1............ 191 2........ 202 4..S.............................γiB0. distribuite izotrop în momentul aplicării lui B0.......... Infrastructura existentă la UBB Cluj pentru exprimente RMN-S ... ω0.. Principalele proprietăţi ale câtorva nuclee active RMN................... iar γ i reprezintă factorul giromagnetic.......... Principiul metodei Generarea semnalului RMN Spectroscopia RMN se bazează pe fenomenul de rezonanţă magnetică aplicat asupra momentelor magnetice nucleare μi = γiS.... unde S este numărul cuantic de spin.............. 215 1.

adică sub forma unui puls. sau este apropiată de aceasta: în literatura RMN această precesie este deseori denumită nutaţie. perpendicular pe câmpul magnetic extern: el este generat de curentul aplicat asupra unei bobine de transmisie în interiorul căreia este plasată proba.7 T 500 76. xy.i /2π este de ordinul zecilor de kHz. Pentru valori tipice ale lui B1 utilizate în spectroscopia RMN-S.Specia nucleară.98 0. După încetarea acţiunii pulsului rf magnetizarea Figura 1 192 . câmpul oscilant (numit şi câmp de radiofrecvenţă.6 0. rf) va determina o mişcare de precesie cu frecvenţa ω1.7 1. este necesară mai întâi rotirea polarizării de spin în planul transversal. şi amplitudinea B1.9 -2.1 6.5 125 35.7 225 63.i [MHz] B0 = 11. astfel încât rotirea magnetizării în plan transversal (ω1. Deşi în practică B1 << B0.9 90 Deoarece magnetizarea longitudinală nu poate genera un semnal RMN.02 1.i = γiB1 a polarizării spinilor i în jurul direcţiei lui B1 dacă ωrf satisface condiţia de rezonanţă.7 Abundenţa naturală [%] 99. i 1H 2H 13C 14N 15N γ iγ S 1/2 1 1/2 1 1/2 [ 107 rad s-1T-1] 26.5 50 B0 = 21 T 900 137.i tp = π/2) necesită aplicarea câmpului rf pe durata tp de ordinul câtorva µs. Acest lucru se realizează prin aplicarea unui câmp magnetic oscilant cu frecvenţa ωrf.1 99.8 4. ωrf = ω0.i = ω1.37 ν0.i. frecvenţa de nutatie ν1.

şi este ilustrat schematic în Fig. etc. numit timp de achiziţie. 2 în cazul nucleelor 13C: 193 . sau FID (free-induction decay). şi deci implicit la apariţia mai multor linii în spectrul RMN 1D. spectrul asociat speciei nucleare i ar conţine o singură linie la poziţia frecvenţei Larmor asociate. precum este cel ilustrat în Fig. forme şi intensităţi de linie) depind în mod esenţial de interacţiunile la care sunt supuşi spinii nucleari pe durata t2. ştiinţa materialelor. După o perioadă de aproximativ t0 ~ 5T1 polarizarea de spin se reconstruieşte de-a lungul direcţiei z şi experimentul poate fi repetat. Frecvenţele asociate interacţiunilor de spin interne sunt mult mai mici decât frecvenţele Larmor.i. cât şi cel în domeniul de frecvenţă. să existe o fereastră spectrală de lărgime limitată. ΔΩi << ω0. Această mişcare induce un curent electric oscilant pe bobina de detecţie (aceeaşi cu bobina de transmisie) ce poartă numele de semnal RMN. prezenţa aşa-numitor interacţiuni de spin interne conduce la valori ale câmpului magnetic local la poziţiile diferitor spini i uşor diferite de B0. Atât semnalul în domeniul temporal. 1 se obţine un spectru RMN 1D (unidimensional) ale cărui proprietăţi (poziţii. Descrierea de mai sus se referă la aşa-numitul experiment RMN de “un puls”.i care conţine întregul spectru RMN-1D al speciei nucleare respective. conţin o parte reală şi una imaginară. adică înregistrarea de spectre RMN distincte pentru fiecare specie nucleară în parte. adică spectrul RMN. 1.i). FID-ul este înregistrat în intervalul de timp t2. iar conţinutul lui de informaţii ar fi extrem de sărac. ceea ce face ca pentru fiecare specie nucleară i. În realitate. Detecţia semnalului RMN Aplicând transformata Fourier asupra FID-ului se obţine reprezentarea acestuia în domeniul de frecvenţă. despicările şi/sau lărgirile liniilor individuale sunt în directă conexiune cu elemente de structură chimică/spaţială bine determinate. astfel încât amplitudinea lui se apropie de zero. şi constituie astfel baza multiplelor aplicaţii ale spectroscopiei RMN în (bio)chimie. Parametrii spectrali.i. corespunzător modului de detecţie în cuadratură.transversală va precesa liber în jurul lui B0. B0. de exemplu deplasările (faţă de ω0. ω0. pe durata căruia se produce defazarea polarizării transversale. În acest context. soluţia practică utilizată în spectroscopia RMN modernă corespunde aşa-numitului mod de lucru pe canale rf distincte. în jurul lui ω0. Cu ajutorul experimentului din Fig. Considerând doar interacţiunea cu câmpul static extern.

şi interacţiunea scalară (cuplajul J).şi heteronucleara). şi sunt prin urmare reprezentative pentru gruparea chimică din care nuceele respective fac parte. Deplasările chimice reflectă deplasările frecvenţei de precesie la diferite poziţii ale nucleelor 13C în sistemul molecular investigat faţă de valoarea ω0. poziţiile liniilor în spectrul 13C din Fig. În consecinţă. cu linii suficient de înguste încât să permită identificarea componentelor izotrope ale acestora. 2 sunt determinate de valorile izotrope ale ecranării chimice.C ca urmare a diferenţelor în intensitatea câmpului magnetic local indus de distribuţia electronică din vecinătate. aşa-numitele deplasări chimice. 194 . De exemplu. spectre RMN 1D precum cel ilustrat în Fig. au fost dezvoltate o serie de tehnici speciale numite de decuplare: ele acţionează în sensul atenuării efectului produs de anizotropia interacţiunilor de spin şi conduc la spectre RMN-S de înaltă rezoluţie. Primele două sunt dominante în cazul nucleelor cu spin ½ (având constante de cuplaj de la câţiva kHz până la aproximativ 100 kHz) şi au un caracter anizotrop.Figura 2 Interacţiunile de spin cu relevanţă în aplicaţiile spectroscopiei RMN-S pe probe organice. prin identificarea grupărilor chimice distincte din moleculă în funcţie de regiunea spectrală specifică în care se plasează liniile RMN. Ele produc în general spectre cu linii foarte largi caracterizate prin suprapuneri severe ce fac imposibilă extragerea de informaţii utile. interacţiunea de ecranare chimică. 2 sunt utile pentru determinarea structurii chimice. În acest mod. sunt interacţiunea dipolară (homo.

şi (iii) frecvenţa de offset. 1). care reprezintă unghiul φ pe care îl face B1 faţă de axa Ox. Aceasta din urmă este dată în principal de cantitatea de probă. menite să asigure legătura între baza conceptual-teoretică prezentată mai sus şi elementele concrete cu caracter aplicativ. ca şi deplasare faţă de o linie de referinţă caracteristică fiecărei specii nucleare. Valoarea optimă a lui N (denumit număr de scanuri în terminologia de specialitate) depinde pentru fiecare specie nucleară de sensibilitatea asociată. spectrul RMN-S 13C a unui compus în faza policristalină cu izotopul 13C în abundenţă naturală şi cu un număr de până la 10 poziţii chimice distincte a carbonilor din moleculă necesită acumularea unui număr de ordinul miilor de scanuri pentru a obţine un raport semnal/zgomot acceptabil (> 30). fie în unităţi relative numite părţi pe milion (ppm) care reprezintă raportul dintre această deplasare faţă de frecvenţa de referinţă şi frecvenţa Larmor a speciei respective. (ii) faza pulsului. Δωi = ωrf . Pentru exemplificare. care vor fi adunate pentru a genera semnalul RMN final. cu un timp de repetiţie determinat de valoarea lui t0 (conform Fig. privind implementarea lor concretă în practica curentă: • Un spectrometru RMN este caracterizat în mod tradiţional prin valoarea frecvenţei Larmor a spinilor 1H în câmpul magnetic al acestuia (de exemplu un spectrometru cu un criomagnet care produce un câmp B0 = 11. în cazul în care ωrf nu este exact în rezonanţă cu frecvenţa de precesie Larmor a speciei nucleare i. factorul giromagnetic. în timp ce pentru un spectru 1H de calitate este suficientă înregistrarea unui singur scan. etc. • Fiecare specie nucleară distinctă este caracterizată de o aşa-numită fereastră spectrală de lărgime limitată în interiorul căreia se plasează toate liniile RMN posibile: de exemplu lărgimile tipice ale acestei 195 .ω0.Noţiunile introductive vor fi completate în final cu câteva precizări utile. π. • Un puls rf se caracterizează prin trei parametri distincţi: (i) unghiul α de rotire a magnetizării faţă de direcţia z – aşa-numitul unghi de tilt (de exemplu α = π/2.7 T va fi denumit spectrometru de 500 MHz) • Pentru a obţine un spectru RMN de calitate (cu raport semnal/zgomot cât mai mic) este în general nevoie de înregistrarea unui număr N de FID-uri.). câmpul magnetic static. abundenţa izotopică şi numărul de poziţii chimice distincte în sistemul studiat. • Poziţiile liniilor într-un spectru RMN sunt date fie în unităţi absolute de frecvenţă (Hz).i. Cel de-al doilea mod este de obicei preferat pentru că poziţiile liniilor într-un compus dat vor fi aceleaşi indiferent de valoarea câmpului magnetic .

Magnetul acestora este autoecranat. iar câmpul generat de acesta este de 9. respectiv 14.1 Tesla cu frecvenţa de rezonanţă pentru nucleii de hidrogen de 400 MHz şi 600MHz. şi 500 ppm (pentru 15N). transformarea Fourier se va aplica asupra acestui semnal digitizat. Referinţe detaliate cu privire la fundamentarea teoretică a acestor tehnici moderne. Exemplul prezentat în Fig.• • ferestre spectrale sunt de aproximativ 20 ppm (pentru 1H). Spectrometrul Bruker DRX 400 din dotarea CNRM 196 . această tehnologie fiind introdusă chiar de firma Bruker în 1996. şi permit extragerea selectivă a informaţiilor dorite. şi se realizează utilizând aşa-numitul algoritm FFT (fast Fourier transform). Infrastructura existentă la UBB Cluj pentru experimente RMN-S Descrierea componentelor hardware Laboratoarele Centrului Naţional de Rezonanţă Magnetică (CNRM) sunt dotate cu două spectrometre Bruker. achiziţionate în anii 2002 şi 2009. pot fi găsite în literatura de specialitate. De-a lungul timpului a fost dezvoltată o diversitate foarte mare de tehnici RMN complexe care presupun aplicarea de secvenţe multi-puls extrem de sofisticate. 2. 1 prezintă cel mai simplu experiment posibil în spectroscopia RMN. precum şi la implementarea lor experimentală. simultan pe mai multe canale rf. 300 ppm (pentru 13C). În consecinţă. 1) se realizează în mod discret (digital) cu un timp de eşantionare numit dwell time. Achiziţionarea directă a semnalului RMN (pe durata lui t2 în Fig.4 Tesla.

iar rotirea mecanică a probei se poate face la o frecvenţă de rotatie de până la 35 kHz. 57Fe. Ambele sisteme pot analiza atât probe în stare condensată cât şi probe în stare lichidă. Pentru studiul probelor solide există în dotare mai multe capete de sondă care permit efectuarea experimentelor la temperaturi între -80 °C şi 200 °C. 27Al. 69Ga etc. 13C. Pot fi efectuate măsurători spectroscopice de rezonanţă magnetică nucleară pe o gamă foarte largă de nuclee: 1H. Magnetul spectrometrului Bruker DRX 600 din dotarea CNRM Unitatea MAS folosită pentru controlul automat sau manual al rotirii probelor solide la unghiul magic 197 .Spectrometrele Bruker DRX 400 şi Bruker DRX 600 sunt complet digitale iar controlul acestora se face în totalitate prin intermediul unui calculator de tip PC. 15N.

iar programul TopSpin comandă spectrometrul Bruker DRX 600. Cele două versiuni ale soft-ului de comandă Bruker diferă prin interfaţa grafică şi prin numărul 198 . primul este instalat pe spectrometrul Bruker DRX 400. În imaginea de mai sus se poate observa rotorul şi instrumentaţia specifică. prin intermediul fibrei optice. necesară introducerii şi tasării substanţei de măsurat precum şi scoaterii acesteia din rotor. În cazul spectrometrelor Bruker. Se pot observa conectările acestui cap de probă la surse de aer necesar atât pentru rotirea probei la unghiul magic cât şi pentru controlul temperatuii probei. a vitezei de rotaţie a probei. începând cu generaţia de spectrometre Avance III. soft-ul de comandă se numeşte XWin NMR (până la generaţia Avance II).Capul de probă folosit pentru măsurătorile pe probe solide introdus în câmpul magnetic static. Se mai poate observa şi conexiunea cablului care serveşte la detectarea. Corespunzător echipamentelor existente la UBB Cluj. Descrierea componentelor software Pentru comanda modulelor electronice ale unui spectrometru RMN există pachete software specializate prin intermediul cărora elementele distincte ale unui experiment RMN sunt transpuse în comenzi specifice. şi respectiv TopSpin.

conform relaţiei 2πν1tp = π/2). Valorile lui p1 şi f1 sunt introduse explicit de către utilizator în aşa numita tabela de achiziţie (acquisition table). ν1 trebuie să fie 100 kHz. o serie de proprietăţi specifice • Primul tip de acţiuni corespunde elementelor standard ale unui experiment RMN (precum cel ilustrat în Fig. y.sporit de scripturi pentru calibrarea parametrilor experimentali existente în TopSpin dar. ele sunt echivalente la nivel conceptual.. după care se ajustează puterea la ieşire a transmiţătorului astfel încât curentul transmis pe bobină să producă o intensitate B1 a câmpului rf care să corespundă unui puls de 900 (în cazul exemplificat. precum şi faptul caă este aplicat pe canalul f1. 31 – indicele asociat). -x şi –y). p1. 31 – indicele asociat). n = 0 . 1. Faza ph1 este în schimb explicitată la sfârşitul programului de pulsuri (valorile corespund convenţiei Bruker în care 0. prin intermediul unor variabile care poartă acelaşi nume. • Sensibilitatea spectrală maximă se obţine pentru o valoare α = 900 a unghiului de tilt pentru pulsul p1 (asa-numitul puls de 900). de exemplu la 2. în continuare vom face o foarte scurtă prezentare axată pe evidenţierea principiior fundamentale. incluzând cazul general în care acestea nu sunt multipli de 900. se recomandă consultarea manualului de utilizare Bruker. perioade de evoluţie liberă şi perioada de achiziţie directă. cu faza ph1. durata fiecăruia dintre acestea şi. x. şi go=n (go – este un script care transmite comenzi specifice receptorului pentru achiziţionarea digitală a semnalului RMN. comanda referitoare la aplicarea pulsului rf este p1:f1 ph1. În mod similar se procedează şi în cazul în care se calibrează un puls cu orice altă valoare a unghiului de tilt. 180 şi respectiv 2700. respectiv: pulsuri rf. necesar în experimentul considerat. iar în reprezentarea modelului vectorial. 1). 2 şi 3. 90. reprezintă fazele 0... n = 0 . Pentru o privire completă a modului de lucru cu fazele. în rest. În practică. Ea specifică durata acestuia. comune ambelor programe: • Comanda unui experiment RMN se realizează prin intermediul aşa numitului program de pulsuri (pulse program) care specifică acţiunile aplicate în cadrul experimentului. iar n este eticheta liniei de comandă care va fi efectuată după încheierea achiziţiei) • În programul de pulsuri prezentat mai jos (care implementează experimentul RMN de un puls în Fig. 199 . în funcţie de tipul acţiunii. dn (d – delay. 1).5 μs. De aceea. Ele au asociate următoarele comenzi specifice în programul de pulsuri: pn (p – puls.. calibrarea acestui puls se realizează prin fixarea duratei lui p1. α.

În convenţia Bruker. adică semnalul RMN digitizat). ce reprezintă punctul de unde experimentul RMN se repetă. de exemplu între pulsuri rf consecutive. scrierea datelor achiziţionate etc. a fazelor. wr #0 (scrie în memorie datele achiziţionate. iar valoarea lui este introdusă explicit în tabela de achiziţie. respectiv recycle delay. 2us pl1:f1 (pe durata unui delay fixat la 2 μs se setează atenuatorii la ieşirea transmiterului la valoarea specificată prin parametrul de achiziţie pl1.) şi au asociat un timp (ideal cât mai scurt) pe durata căruia comutarea se poate realiza din punct de vedere fizic. şi sunt necesare pentru implementarea practică a elementelor componente în experimentul RMN dat (de exemplu comutarea frecvenţelor de offset. valorile pln sunt date în decibeli (dB). astfel încât orice comandă pn care apare după aceasta linie va aplica un puls rf de durata pn şi cu un nivel de putere pl1). Al doilea tip de acţiuni specificate într-un program de pulsuri nu au echivalent în schema standard a unui experiment RMN. în exemplul nostru. În exemplul de mai jos. Ea reprezintă aşa numitul delay. pentru a achiziţiona un nou scan: acest fapt este explicitat în linia de comandă asociată achiziţiei semnalului RMN. Ele corespund în general unor comenzi care se aplică asupra modulelor electronice. aceste tipuri de acţiuni sunt reprezentate de comenzile: 1 ze (efectuează resetarea tuturor modulelor electronice la valorile lor iniţiale). în afară de recycle delay vor exista mai multe perioade de evoluţie liberă a sistemului. unde ph31 este faza receptorului). Din acest motiv. a nivelurilor de putere la ieşirea transmiţătorului. 200 . care vor fi specificate prin comenzi de tipul dn. În experimente multi-puls mai complexe. Linia de comandă 2 d1 din programul de pulsuri de mai jos reprezintă o perioadă de durată d1 (a cărei valoare este introdusă explicit în tabela de achiziţie) în care intensitatea câmpului rf transmis/receptat este zero.• • • Nivelul de putere al unui puls rf este cel specificat în programul de pulsuri anterior comenzii de aplicare a pulsului respectiv. pl1. şi corespund atenuării care trebuie aplicată la ieşirea transmiţătorului pentru a obţine valoarea dorită a câmpului rf pe bobina. linia de comandă are în faţă indicele 2. go=2 ph31. cu scopul comutării lor între diferite regimuri de funcţionare. adică timpul necesar reconstruirii magnetizării longitudinale după detecţia sa. şi exit (comanda de încheiere a experimentului). iar în exemplul nostru concret d1 corespunde unei valori rezervate.

tipul nucleului asociat cu canalele rf utilizate în experimentul dat ( f1. valorile numerice ale parametrilor incluşi în programul de pulsuri sunt specificate în tabela de achiziţie. dewll time (dw) – durata de eşantionare a semnaluilui RMN digitizat. se recomandă consultarea manualelor Bruker. adică durata între două puncte consecutive. frecvenţele de offset pe canalele pe care se lucrează (o1. pe canalul f2. exprimate de obicei în multiplii de 16. însă reprezintă doar o mică parte din numărul total de parametri posibili (câţi anume dintre aceştia sunt utilizaţi efectiv într-un experiment dat depinde de complexitatea lui). tipul de achiziţie directă (qsim – în cuadratură. dar colectând altenativ puncte în partea reală şi imaginară a semnalului RMN. etc. pe canalul f1. 2D.) – se exprimă în Hz sau ppm.). de asemenea. După cum s-a precizat mai sus. o2. sf2. se recomandă consultarea manualelor Bruker. : pentru fiecare nucleu aceasta este fixată în momentul configurării spectrometrului). Pentru detalii. Pentru o descriere detaliată. etc. După achiziţionarea semnalului RMN. etc. f2.). etc. Aceştia sunt parametri cei mai importanţi în cadrul unui experiment RMN tipic. 201 . qseq – în cuadratură.• • • Liniile care încep cu . Parametri specifici acestui proces sunt incluşi în aşa numita tabelă de procesare. În afară de aceştia. etc. iar tipul şi numărul acestor parametri depinde de complexitatea experimentului avut în vedere. acesta trebuie supus transformării Fourier pentru a genera spectrul RMN. care oferă informaţii cu privire la: tipul de experiment (1D. colectând simultan puncte în partea reală şi imaginară a semnalului RMN. domeniul temporal (td) – numărul de puncte achiziţionate. numărul de scanuri (ns) – numărul de semnale RMN achiziţionate direct şi adunate între ele în scopul reducerii nivelului de zgomot la un nivel acceptabil. tabela de achiziţie va mai conţine în mod obligatoriu şi alţi parametri caracteristici experimentelor RMN. numele programului de pulsuri utilizat în experimentul considerat (pulprog). şi reprezintă devierea (cu + sau -) faţă de frecvenţa de bază pe canalul respectiv (sf1.). reprezintă linii de comentarii: ele sunt necesare (în special în cazul experimentelor multi-puls mai complexe) pentru a explicita semnificaţia parametrilor incluşi în programul de pulsuri asociat.

la lărgirea liniilor de rezonanţă. în 202 .# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/zg" . obţinut spre exemplu cu ajutorul experimentului de un puls ilustrat în Fig.high power pulse . 1 diferă fundamental în funcţie de starea de agregare a probei. efectul componentelor anizotrope ale interacţiunilor de spin prezente în sistem este mediat la zero. şi decuplarea heteronucleară Aspectul liniilor de rezonanţă dintr-un spectru RMN 1D.power level for pulse (default) . fapt care duce la menţinerea caracterului anizotrop al interacţiunilor de spin şi. respectiv lichidă sau solidă. caracterizat de rezoluţie înaltă.Avance2.p1 : f1 channel . şi spectrul aceluiaşi compus aflat în stare solidă.pl1 : f1 channel .1D sequence # 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/Avance. datorată mişcării moleculare rapide: prin aceasta. adică un spectru cu linii de rezonanţă înguste şi bine separate în funcţie de deplasările chimice izotrope.d1 : relaxation delay. implicit. Spectrele compuşilor în soluţie sunt caracterizate de o rezoluţie foarte bună. 1-5 * T1 3. În stare solidă mişcarea rapidă de reorientare moleculară este absentă. Anizotropia interacţiunilor prezintă pe de o parte dezavantajul de a conduce la pierderea rezoluţiei prin suprapunerea liniilor RMN: în Fig. păstrându-se doar partea lor izotropă.incl" 1 .incl 1 ze 2us pl1:f1 2 d1 p1:f1 ph1 go=2 ph31 wr #0 exit ph1=0 2 2 0 1 3 3 1 ph31=0 2 2 0 1 3 3 1 . 3 este ilustrată comparaţia dintre un spectru 1H RMN tipic al unui compus organic în soluţie. decuplarea homonucleară. Tehnici experimentale de bază pentru aplicaţii RMN-S în sisteme moleculare organice Tehnici specifice de înaltă rezoluţie în solide: rotirea în jurul unghiului magic (MAS – Magic Angle Spinning).

la mijlocul anilor ’50 a fost introdusă tehnica MAS 203 . Pentru a diminua efectul negativ al anizotropiei interacţiunilor de spin în spectroscopia RMN-S. manifestarea caracterului anizotrop al interacţiunilor de spin în probe solide prezintă şi avantaje de ordin practic. anizotropia ecranării chimice furnizează informaţii despre structura electronică (prin tipul orbitalilor moleculari) şi legăturile dintre atomi. Figura 3 Comparaţie între spectrul 1H RMN static al unui compus organic tipic în stare solidă (a) şi în stare lichidă (b) Pe de altă parte. adică la rezoluţie spectrală înaltă şi (ii) reintroducerea selectivă pe durata celorlate perioade ale exeprimentului a unor componente anizotrope ale interacţiunilor de spin (care să afecteze mărimi spectrale altele decât lărgimile de linie). care să conducă la separarea liniilor RMN-S în funcţie de deplasările chimice izotrope ale diferitelor grupări chimice din sistemul molecular investigat. care vor fi introduse în raportul următor. iar anizotropia cuplajului dipolar conţine informaţii despre distanţele internucleare.care se observă cu usurinţă pierderea completă a rezoluţiei prin suprapunerea severă a liniilor RMN. Având în vedere toate aceste considerente. rezultă necesitatea dezvoltării de metode specifice ale spectroscopiei RMN-S care să conducă în cadrul aceluiaşi experiment la două efecte distincte: (i) pe durata anumitor perioade ale experimentului să se obţină medierea componentelor anizotrope ale interacţiunilor de spin. pentru a codifica în spectrul obţinut şi informaţii specifice cu privire la structura şi/sau dinamica moleculară din sistem – în acest scop sunt aplicate aşa numitele metode de recuplare. deoarece componentele anizotrope conţin informaţii importante cu privire la structura şi dinamica din sistem. În mod explicit.

∀ t1 . şi implicit asupra lărgirii liniilor RMN. şi respectiv 2υR. efectul termenilor modulaţi devine din ce în ce mai mic cu creşterea frecvenţtei de rotaţie a probei: în perioada scursă de la introducerea metodei MAS şi până în prezent tehnologia în domeniu a avansat extrem de mult. t2 şi (ii) interacţiuni omogene (interacţiunea dipola204 . 4. Din acest punct de vedere. Această metodă. trebuie menţionat că. mecanismul de îngustare prin MAS a liniilor RMN în solide se bazează pe manipularea părţii spaţiale a hamiltonianului de interacţiune: termenii anizotropi ai acestuia în proba rotită se descompun într-o componentă statică. se pot evidenţia două cazuri distincte: (i) interacţiuni neomogene (deplasarea chimică şi interacţiunea dipolară heteronucleară pentru care [ H (t1 ). Figura 4 Majoritatea metodelor RMN-S moderne de înaltă rezoluţie sunt aplicate în condiţii de rotaţie a probei în jurul unghiului magic. permiţând rotaţii de până la 70 kHz ale probei în jurul unghiului magic. efectul lor asupra dinamicii de spin. H (t2 )] = 0. va fi diferit. care devine zero când axa de rotaţie este înclinată la unghiul magic în raport cu direcţia câmpului magnetic static. şi două componente dependente de timp ce corespund unei modulări periodice cu frecvenţele υR. ilustrată schematic în Fig. Conform descrierii teoretice de mai sus. în funcţie de forma explicită a hamiltonienilor asociaţi acestor interacţiuni. în raport cu direcţia câmpului magnetic static. numit “unghiul magic”. De asemenea.(Magic Angle Spinnining) în cadrul căreia proba este rotită în jurul unei axe înclinate la un unghi. După cum se va prezenta în continuare. mediază efectul anizotropiei interacţiunilor de spin prin faptul că rotaţia mecanică a probei determină oscilaţia în timp a termenilor anizotropi şi prin aceasta micşorează efectul lor de lărgire asupra liniilor RMN.

datoraţi interacţiunii dipolare homonucleare în sisteme multi-spin. t2 . care apar la multiplii întregi ai frecvenţei de rotaţie. pentru frecvenţe de rotatie în intervalul 0 – 35 kHz Un pas foarte important în îmbunătăţirea rezoluţiei spectrale pentru sisteme de tip multi-spin. În aceste două cazuri. Evoluţia lărgimii liniilor RMN. forma spectrelor se apropie de cea întalnită în cazul în care predomină interacţiunile neomogene. în care datorită numărului mare de protoni inter205 . iar pentru υR ~ 3 kHz. se consideră acţiunea Hamiltonienilor de tip omogen. pornind de la cazul static până la domeniul de frecvenţe înalte (35 kHz).ră homonucleară în [ H (t1 ). în cazul static se obţine doar un spectru foarte larg. fără rezoluţie. în Fig. 5 sunt prezentate spectrele 1H RMN pentru diferite frecvenţe de rotaţie υR în cazul a doi compuşi organici. respectiv ale policarbonatului (b). caracterizaţi prin dinamica moleculară complet diferită. respectiv adamantanul şi policarbonatul. precum şi benzile de rotaţie laterale. Mergând spre limita superioară a frecvenţei de rotaţie. Figura 5 Spectele 1H RMN-MAS ale adamantanului (a). Astfel. încep să se contureze atât linia centrală de rezonanţă. ∀ t1 . H (t2 )] ≠ 0. exemplifică modalitatea prin care frecvenţa de rotaţie acţionează asupra caracterului omogen al interacţiunilor de spin din sistem. sisteme multi-spin) pentru care Pentru a ilustra efectul interacţiunilor omogene asupra formei şi lărgimii liniilor de rezonanţă.

206 .32 ppm în cazul (b). 6 este prezentat spectrul 1H al dipeptidei β-L-Asp-L-Ala obţinut rotind proba cu υR= 65 kHz (a). În Fig. este predominantă. la 0. precum şi RNnυ şi SAM (Smooth Amplitude Modulation). De exemplu. ultimele două metode fiind aplicate în timpul perioadei de evoluţie indirectă a experimentelor de tip bidimensional. Acestea presupun aplicarea pe canalul 1H (care este şi canalul de detecţie) a unor secvenţe de pulsuri adecvate care să conducă la medierea efectului produs de interacţiunile dipolare homonucleare. astfel încât interacţiunea dominantă din sistem rămâne ecranarea chimică (cu componentele ei izotropa. constă în combinarea tehnicii MAS cu metode de decuplare homonucleară. deoarece este aplicabilă în cazul rotirii probei cu frecvenţe înalte de ordinul a 65 – 70 kHz. astfel încât lărgimea liniei grupării metil scade de la 1. mai pot fi enumerate şi FSLG. iar apoi prin aplicarea celor două tehnici .1 ppm în cazul (a).acţiunea dipolară homonucleară. Comparând spectrele obţinute se observă o creştere apreciabilă a rezoluţiei spectrale în cazul decuplării homonucleare. una dintre secvenţele intens utilizate în prezent. pe lângă mai sus amintita metodă DUMBO. În cazul sistemelor de spini cu factor giromagnetic mic (de exemplu 13C sau 15N) în abundenţă naturală (adică separaţi prin distanţe mari) cuplajele dipolare devin neglijabile. de tip omogen. Figura 6 În clasa metodelor de decuplare homonucleră. respectiv anizotropa). se numeşte DUMBO. PMLG.MAS şi decuplare homonucleră cu ajutorul secvenţei DUMBO (b).

Situaţia prezentată în Fig. Pentru a creşte rezoluţia spectrală în aceste cazuri este nevoie de combinarea teh207 . Spectrul static al L-Alaninei prezintă caracteristicile tipice întâlnite în cazul unui sistem de spini izolaţi. La o frecvenţă de rotaţie mică. astfel încât efectul spectrul RMN 13C al L-alaninei. adică η =1 în cazul grupării COO-.5 pentru CH2. liniile de rezonaţă fiind largi. Odată cu creşterea lui υR până la valori mari. intensităţile benzilor rotaţionale se reduc semnificativ astfel încât un spectru MAS de înaltă rezoluţie va conţine cu o bună aproximaţie doar linii poziţionate la valori ale deplasărilor chimice izotrope corespunzătoare grupărilor chimice din probă. în interacţiunilor suplimentare datorate acesprezenţa ecranării chimice tora nu poate fi neglijat în practică. 7 corespunde unui model teoretic idealizat. situate la multiplii întregi ai frecvenţei de rotaţie. respectiv 0. Forma liniilor este dată de valoarea parametrului de asimetrie. Din punct de vedere teoretic. Chiar şi în cazul frecvenţelor de rotaţie mari se vor obţine linii de rezonanţă ale 13C (15N) cu lărgimi reziduale mari dacă se foloseşte doar tehnica MAS.3 pentru CH3. evoluţia cu frecvenţa de rotaţie a liniilor într-un spectru RMN 1D într-un sistem de trei spini 13C care nu interacţionează dipolar dar sunt supuşi ecranării chimice este prezentată în Fig. care ilustrează comportarea în condiţii de MAS a unor interacţiuni de spin de tip pur neomogen: în realitate.În acest caz. centrate la valori ale deplasării chimice izotrope asociate fiecărei grupări chimice. este de aşteptat în principiu ca odată cu creşterea frecvenţei de rotaţie a probei să se obţină spectre cu rezoluţie şi sensibilitatea spectrală din ce în ce mai înalte. liniile celor trei grupări se descompun într-o serie de benzi de rotaţie laterale. nucleele 13C (15N) sunt Figura 7 Evoluţia cu frecvenţa de înconjurate în compuşii organici de un rotaţie a liniilor de rezonanţă din număr mare de protoni. în care se consideră doar efectul ecranării chimice. 0. 7. υR= 1 kHz.

poziţionate la valori ale deplasării chimice izotrope caracteristice fiecărei grupări structurale. În esenţă. asemănătoare celor simulate pentru cazul idealizat al interacţiunilor pur neomogene (Fig. această tehnică constă în aplicarea pe canalul 1H a unui câmp rf intens. Calibrarea parametrilor pe canalul 1H cu ajutorul experimentului de un puls Pentru calibrarea nivelului de putere (sau echivalent. Din punct de vedere practic. al cărui program de pulsuri este listat la finalul Secţiunii 2. cu o diferenţă de un ordin de mărime faţă de valorile întâlnite în mod uzual în cazul compuşilor în stare lichidă. utilizarea decuplării heteronucleare în condiţii de MAS conduce la linii de rezonanţă înguste. sub formă continuă sau de pulsuri cu modulaţie în fază. bine separate. 1. 8 pentru cazul spectrului RMN pe 13C al L-alaninei măsurat la o frecvenţă de rotaţie de 10 kHz. Lărgimile liniilor pentru toate cele trei grupări sunt în intervalul 20 – 50 Hz.nicii MAS cu o tehnică suplimentară numită decuplare heteronucleară în scopul de a se limita efectul de lărgire produs de protonii din vecinătate. procedura constă în următoarele: • Se utilizează adamantanul drept probă standard pentru calibrarea nivelurilor de putere pe canalul protonilor deoarece spectrul 208 . în timpul achiziţionării semnalului RMN pe canalul 13C (15N). Figura 8 După cum se observă în Fig. 7). valoarea B1 a câmpului rf exprimat în kHz) generat de transmiter pe canalul 1H în funcţie de valoarea atenuării (in dB) se utilizează experimentul simplu de un puls din Fig.

5 dB) până se constată anularea (sau inversarea) liniei RMN-S. cu lărgime mai mică decât a altor compuşi organici în fază solidă (sub 1 kHz pentru frecvenţe de rotaţie a probei mai mari decât 10 kHz). În funcţie de capul de probă folosit. şi stabilizarea rotaţiei la frecvenţa aleasă. În cazul inversării. 6.• • • • RMN-S 1H al acestui compus constă dintr-o singură linie. Trebuie avut însă în vedere că scăzând câmpul 209 . în cadrul căruia se modifică durata pulsului (p1) şi nivelul de putere asocial (pl1) şi se înregistrează spectrul RMN-S 1H al adamantanului. Se repetă apoi în mod identic procedura de baleiere a nivelurilor de putere pl1 descrisă mai sus pentru toate valorile câmpului rf (implicit. Modificarea acestor parametri se poate face înscriind valorile dorite în tabela de achiziţie. p1) considerate. şi respectiv pl1 <valoare> (in dB) Mai întâi se fixează durata pulsului p1 astfel încât aceasta să corespundă unui puls de 1800 pentru un set de valori dorite ale câmpului rf pe canalul 1H (de exemplu. şi se determină în final valoarea exactă a pl1 pentru care intensitatea liniei se anulază complet: această valoare va corespunde deci pulsului de 1800 pentru câmpul rf considerat. Se recomandă calibrarea în ordinea descrescătoare a câmpului rf . Aceste proprietăţi favorabile conduc la o sensitivitate şi o rezoluţie foarte bună care permit calibrarea rapidă şi precisă a pulsului de 1800 (după cum se va descrie mai jos). şi 10 us. p1 = 5. se scanează pl1 cu paşi mai mici (0. caz în care se va putea începe cu o valoare de strat pl1 = 2-0 dB care va fi scăzută în paşi mai mari la început (de exemplu 0. se recomandă utilizarea unor frecvenţe de rotaţie cuprinse între 10 şi 30 kHz Se începe apoi procedura de calibrare a puterilor pe canalul protonilor prin rularea repetată a experimentului de un puls (programul de pulsuri redat mai sus. 75 şi 50 kHz).1 dB) în jurul valorii pentru care acesta s-a obţinut. se procedează la operaţiunile preliminare standard de acordare a frecvenţei de rezonanţă şi a impedanţelor (aşa numitele tuning şi matching). ceea ce reduce foarte mult tăria cuplajelor dipolare 1H-1H După plasarea probei în magnet. şi se utilizează comanda zg). pentru câmpuri de 100.67. sau direct prin comenzile p1 <valoare> (in us). şi se datorează faptului că molecula de adamantan nu este rigidă în reţeaua cristalină ci efectuează mişcări rapide de rotaţie simultan în jurul a trei axe de simetrie. Pentru fiecare dintre aceste valori fixe se baleiează parametrul pl1 până când intensitatea liniei din spectrul RMN-S înregistrat devine zero.

• rf valoarea de start a parametrului pl1 creşte în mod corespunzător. phn. şi implementarea ei pe spectrometrul Bruker. sau <valoare> us). 9 utilizând reprezentarea schematică convenţională din RMN. descrisă în Fig.0) .basic cp experiment 1 ze 2 d1 do:f2 210 . pln. şi listat mai jos. deoarece monitorizarea rezultatului prin intermediul unui semnal care se anulează este mai sensibilă decât dacă s-ar urmări valoarea maximă a acestuia. şi respectiv de fază. şi delay-uri. Calibrarea parametrilor pe canalul 13C cu ajutorul experimentului CP-MAS Secvenţa de pulsuri asociată experimentului de Cross-Polarizare în condiţii MAS (CP-MAS) este ilustrată în Fig. de putere. Pentru a face mai uşoară o comparaţie directă între aceasta reprezentare schematică. În practică se preferă calibrarea prin intermediul pulsului de 1800 şi nu 900. pentru a se evita de exemplu să se pornească cu o valoare care deja corespunde unui puls > 1800. dn. Figura 9 # 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-const" . incluşi în programul de pulsuri cp-const asociat acestei secvenţe. pn.cp (TopSpin 2. în figură sunt menţionaţi explicit parametrii de timp (pulsuri. 9.

El este un experiment standard în spectroscopia RMN-S care se utilizează atât pentru înregistrarea spectrelor 1D convenţionale ale nucleelor cu factor giromagnetic mic. la condiţia de matching n =1: aceasta înseamnă că valoarea câmpului pe canalul 13C(15N) va fi astfel calibrată încât să fie mai mare (sau mai mică) cu valoarea frecvenţei de rotaţie a probei. CP) este un proces coerent generat de interacţiunile dipolare heteronucleare 1H. unde n=1. 1m exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1 . şi vom începe prin a explica de ce se preferă în practică experimentul CP-MAS pentru a înregistra spectre RMN-S 1D ale 13C(15N) în locul experimentului mult mai simplu de un puls. and p30 the pulse CP-MAS este un experiment de dublă rezonanţă. deoarece presupune aplicarea de câmpuri rf (pulsuri) simultan pe două canale distincte (f1: 13C şi f2: 1H în cazul particular ilustrat mai sus).pl12 is used here with cw .13C(15N) şi se desfăşoară în condiţiile iradierii simultane cu câmpuri rf pe canalele asociate (aşa numitele pulsuri de contact: Fig. În cadrul prezentului raport. pentru o rotaţie cu νR = 15 kHz (o valoare uzuală pentru înregistrarea spectrelor 13C) a probei în jurul unghiului magic. Procesul de transfer prezintă maxime de eficienţă dacă amplitudinile celor două câmpuri rf de contact satisfac aşa-numita condiţie Hartmann-Hahn de matching. Procesul de transfer de polarizare 1H <-> 13C(15N) prin aşa-numitul mecanism de polarizare încrucişată (cross-polarization.2. 9). De exemplu.go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu. este necesară calibrarea unui câmp rf pe canalul carbonului de 35 sau 65 kHz pentru a asigura un transfer maxim de 211 . ν1H = ν13C +(-) nνR. În general se lucrează cu valori ale câmpului în jur de 50 kHz pe canalul protonilor. precum 13C sau 15N.pl12 is used here with tppm.1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u pl12:f2 . se va considera în detaliu doar primul aspect. cât şi ca parte componentă în experimente multi-dimensionale mai complexe.

un experiment CP/MAS standard (sau convenţional) se derulează în modul următor: mai întâi se aduce polarizarea longitudinală a spinilor nucleari 1H în planul transversal (de exemplu de-a lungul direcţiei x. Această polarizare este apoi „blocată” – aşa-numitul „spin locking” – cu ajutorul pulsului de contact p15 aplicat pe canalul f2 cu faza x (deoarece direcţia câmpului rf asociat şi direcţia polarizării trebuie să coincidă). Simultan se aplică pulsul de contact de aceeaşi durată p15 şi pe canalul carbonului cu un nivel de putere corespunzător unui transfer maxim de polarizare 1H->13C (adică să satisfacă una dintre condiţiile de matching Hartmann-Hahn descrise mai sus). Plecând de la secvenţa de pulsuri ilustrată schematic în Fig. până la 1-2 ms: această durată depinde direct de tăria medie a cuplajelor dipolare dintre fiecare spin 13C din probă şi protonii cei mai apropiaţi. şi nu polarizarea asociată nucleelor 13C(15N). cuplajul dipolar 1H. însă şi în aceste condiţii câştigul în intensitate al semnalului RMN este semnificativ. 9. De asemenea. d1. prin aplicarea pulsului p3 de 900 cu faza y pe canalul f2 asociat protonilor). În realitate aceşti factori teoretici sunt rareori obţinuţi în practică datorită proceselor de relaxare care se desfăşoară pe durata pulsului de contact. Deoarece.5 ori mai mare decât cuplajul 1H. Polarizarea transferată pe 212 . rezultă că într-un anumit interval dat se pot acumula mult mai multe scanuri cu ajutorul CP/MAS decât ar fi posibile în cazul utilizării experimentului simplu de un puls. Utilizarea polarizării transferate de la protoni mai are încă un avantaj important care este determinat de valorile mult mai mici ale timpului de relaxare longitudinal T1 în cazul nucleelor 1H în comparaţie cu cei asociaţi 13C(15N): deoarece aceşti timpi practic guvernează valoarea duratei de repetiţie a experimentului (aşa-numita recycle delay. comparativ cu intensitatea care s-ar obţine printr-un experiment de un puls. şi respectiv de zece ori în cazul spinilor 15N. şi valoarea optimă a pulsului de contact va creşte corespunzător (în acest caz se obţine un transfer maxim de polarizare la valori ale p15 cuprinse între 3-7 ms).15N la aceeaşi distanţă internucleară. rezultă o amplificare de aproximativ patru ori în intensitatea semnalului RMN-S 13C. şi respectiv programul de pulsuri asociat. în Fig.polarizare 1H -> 13C. Ambele mecanisme conduc la creşterea substanţială a sensibilităţii spectrale în cazul utilizării metodei CP/MAS. Deoarece la echilibru termic raportul dintre aceste polarizări este proporţional cu raportul factorilor giromagnetici corespunzători. 9).13C este de aproximativ 2. valorile optime pentru durata pulsului de contact (p15) în cazul nucleelor de 13C este cuprinsă între câteva sute de μs. Avantajele principale ale unui experiment CP-MAS rezultă din faptul că polarizarea iniţială care conduce la formarea semnalului RMN-S este cea transferată de la spinii 1H.

de ordinul zecilor de secunde. ea evoluează liber şi poate fi achiziţionată ca şi semnal RMN (FID). TPPM este tehnica de decuplare heteronucleară cel mai des utilizată pentru înregistrarea de spectre 13C RMN-S pe compuşi organici cristalini. iar în cadrul unei metode mai recente. şi (ii) alternarea în paşi de 900. 90. de exemplu în scopul calibrării experimentului CP/MAS. adică în cazurile în care nu este necesar aplicarea unor câmpuri rf de decuplare foarte intense. parametrii caracteristici ai experimentului CP/MAS trebuie mai întâi calibraţi cu ajutorul unor compuşi de referinţă (standard). respectiv ph3 = 90 şi 2700. ceea ce conduce la o sensibilitate spectrală foarte bună. Compuşii standard cel mai des utilizaţi în acest scop sunt adamantanul (calibrarea nivelelor de putere pe canalul carbonului) şi glicina (ajustarea valorii unghiului magic). adamantanul prezintă avantajul că se obţin linii 13C RMN-S relativ înguste (2-3 Hz). adamantanul este considerat un compus ideal pentru procesul de calibrare a experimentului CP/MAS. deoarece acesta necesită în general 213 . Ca şi în cazul calibrării puterilor pe canalul 1H. 180 şi 2700. În final trebuie menţionat că detecţia FID-ului se face în condiţii de decuplare heteronucleară. pentru un experiment CP/MAS: în acest fel. Pentru a obţine spectre RMN-S 13C de calitate ale compusului studiat. numite Continuous Wave – CW. sau la înregistrarea de spectre 15N RMN-S. În principiu. câmpul se aplică în mod continuu cu faza arbitrară.durata lui p15 se construieşte de-a lungul direcţiei câmpului de contact aplicat pe canalul f1: aceasta reprezintă în fapt o polarizare transversală a spinilor 13C astfel că. respectiv la un timp de acumulare scurt. respectiv 0. care conţine două subcicluri suprapuse: (i) alternarea cu 1800 a fazei pulsului p3. câmp ce trebuie să satisfacă anumite cerinţe în funcţie de condiţiile experimentale concrete: în cadrul celei mai simple metode. cu Δφ având valori cuprinse în general între 15 şi 300. φ = φ + Δφ. În mod uzual un experiment CP/MAS se efectuează cu un phase cycling de 8 paşi. toate tehnicile de decuplare heteronucleară constau în aplicarea unui câmp rf pe canalul protonilor de-a lungul întregii durate de achiziţie a semnalului RMN. pentru a elimina contribuţia polarizării iniţiale a spinilor 13C la semnalul detectat. cu performanţe îmbunătăţite. numita TPPM (Two Pulse Phase Modulation) câmpul se aplică sub formă de trenuri de două pulsuri cu faze alternante. însă şi metoda CW este preferată uneori. în momentul încetării acţiunii pulsului de contact. a fazei receptorului în sincronie cu faza ph1 a pulsului de contact pe canalul f1 (aşa-numitul Cyclops phase cycling) pentru a elimina eventualele imperfecţiuni ale circuitelor de detecţie în cuadratură. adică prin utlizarea unor tehnici speciale care au drept scop minimalizarea efectelor produse de interacţiuniile dipolare 1H-13C şi 1H-1H (în special efectul de lărgire a liniilor spectrale) pe durata achiziţionării semnalului RMN 13C.

Setul de spectre obţinut astfel furnizează aşa-numită curba de matching Hartmann-Hahn. intensitatea spectrală obţinută este maximă dacă sunt îndeplinite simultan următoarele trei condiţii: (i) pulsul p3 pe canalul protonilor este un puls 900. pentru pulsul de contact pe canalul protonului.1 dB mergând înspre valori mici. Conform schemei experimentale din Fig. trebuie deci calibrate puterile pl3. În particular. Curba de matching Hartmann-Hahn prezintă cinci maxime corespunzătoare celor cinci condiţii menţionate anterior. Plecând de la aceste considerente.achiziţionarea unui număr mare de spectre până când sunt determinate valorile optime ale tuturor parametrilor de interes. Corespunzător acestor elemente. respectiv a eficienţei procesului de transfer de polarizare prin CP. În cazul fiecărui parametru optimizarea se face prin maximizarea intensităţii liniilor RMN în spectrul achiziţionat (în cazul particular al adamantanului avem două linii poziţionale la 29. astfel încât acestea să corespundă unei valori a câmpului rf de 50 kHz: şi în acest caz se utilizează rezultatele anterioare ale calibrării puterilor pe canalul 1H. Valorile particulare ale parametrului pl1 pentru care se obţin aceste maxime se transformă în valori ale câmpului rf asociat utilizând relaţia ν13C = 50 kHz +(-) nνR.5 şi 38. 214 . 1. 5 dB) şi se scanează acest parametru în paşi de 0. frecvenţa de iradiere pe canalul f2 va fi cea corespunzătoare frecvenţei de rezonanţă a liniei adamantanului din spectrul 1H RMN-S.5 ppm. (ii) nivelurile de putere ale pulsurilor de contact p15 pe cele două canale sunt astfel ajustate încât să îndeplinească condiţia Hartmann-Hahn de matching descrisă mai sus. • Se ajustează valoarea puterii pl1 a câmpului de contact pe canalul carbonului până când se obţine o intensitate maximă a liniilor RMN în spectrul CP/MAS achiziţionat. respectiv dependenţa puterii pe canalul 13C a intensităţii spectrale. pl1. Aceasta este etapa cea mai laborioasă din cadrul procedurii. Pentru a evita posibile efecte de offset. 2. procedura de calibrare a experimentului CP/MAS poate fi descrisă pe scurt în felul următor: • Pentru valorarea fixată a lui p3 se setează puterea pl3 (determinată anterior în procesul de calibrare a puteriolor pe canalul protonului) astfel încât aceasta să corespundă unui puls de 900. şi (iii) tehnica de decuplare utilizată să conducă la îngustarea maximă posibilă pentru compusul dat. cu n = 0. pl2 şi pl12 (în condiţiile în care se consideră fixate valorile pulsurilor p3 şi p15. determinate de grupările CH şi CH2 din moleculă). • Se setează valorile pl2 şi pl12. se porneşte de la valori mari ale lui pl1 (de exemplu. 9. iar metoda de decuplare utilizată pentru adamantan este CW). şi respectiv câmpul de decuplare prin CW.

Wiley 2008 J. Introduction to High-Resolution Solid-State NMR. şi se reţine acea valoare pentru care intensitatea spectrală atinge un maxim absolut. Levitt. Pentru valoarea setată a lui pl12. Datorită faptului că glicina este o moleculă relativ rigidă în reţeaua cristalină (aşa cum sunt majoritatea compuşilor organici) decuplarea prin CW la câmpuri mici.H. Elsevier Science 2007 H. A. După acest pas este trecut se procedează în continuare la ajustarea pulsului p31 în secvenţa de decuplare heteronucleară prin TPPM pentru a se obţine în final îngustarea maximă posibilă a liniilor spectrale. de ordinul a 50 kHz. 2. TOPSPIN User Manual. Guenther. Experimentul CP/MAS cu parametri calibraţi pe adamantan din punct de vedere al nivelurilor de putere. Ernst. 5.R. Wiley 2001 Bruker Biospin Group. amplitudine maximă). Keeler.• În final. R. Oxford 1987 M. Principles of Nuclear Magnetic Resonance în One and Two Dimensions. se modificăa uşor înclinarea axei rotorului până ce se obţine un spectru 13C RMN-S a glicinei în care linia carbonilului (de la 176. 3. 4. pentru o ajustare mai fină a pulsului iniţial de 900 pe canalul protonului se revine la primul pas. Bodenhousen. astfel încât se preferă metoda TPPM la câmpuri intense (ideal pl12 ar trebui să corespundă unor câmpuri de cel puţin 100 kHz).Bibliografie 1. Wiley 2010 T. Wokaun. În practică. Oxford University Press. prin modificarea uşoară a puterii pl3 în jurul valorii fixate iniţial. 6. nu mai poate produce o rezoluţie spectrală satisfăcătoare. Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance.5 ppm) are lărgime minimă (implicit. 4. Această etapă este necesară deoarece valorile câmpului rf pe canalul 1H în general sunt determinate cu un grad de eroare mai mare prin experimentul de un puls decât cu ajutorul experimentului CP/MAS. G. Understanding NMR Spectroscopy. Alegerea acestui compus standard este motivată de faptul că el are un spectru RMN-S simplu care conţine doar două linii (deci sensibilitate spectrală mare) dintre care una corespunde grupării carbonil a cărei lărgime este foarte sensibilă la deplasări mici ale înclinării axei de rotaţie a probei faţă de valoarea unghiului magic: acest efect se datorează anizotropiei mari a deplasării chimice. se utilizează în continuare pe glicină pentru ajustarea valoarii unghiului magic şi pentru optimizarea pulsurilor p31 asociate decuplării prin metoda TPPM. NMR Spectroscopy. astfel încât calibrarea lui p31 se face pornind de la această valoare de referinţă. durata optimă a pulsului p15 se apropie în general de cea a unui puls de 1800. 2008 215 . Gullion.

.. şi vom ajunge în final la prezentarea de metode care 216 . cu aplicaţii în investigarea structurii sistemelor moleculare organice cristaline.......................... Introducere ........ Accentul va fi pus pe experimente RMN-S de dublă rezonanţă pe 13C............................. care să permită rotaţii ale probei până la 70 kHz........I.... Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) – SQ (Single Quantum) ........ în ordinea creşterii complexităţii lor: se vor descriere mai întâi experimente care necesită înregistrarea de seturi de date bidimensionale (2D)... însă doar în cazul acelor compuşi unde se obţine o rezoluţie spectrală satisfăcătoare în condiţiile tehnice date... dr.......................... sau metode de înaltă rezoluţie pe 1H.... Vor fi ilustrate de asemenea tehnici bazate pe detecţia 1H.......... Claudiu Filip C.226 4......S.............. de exemplu cele care implică lucrul simultan pe trei canale rf [1] (metode de triplă rezonanţă)................... Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea dinamicii transferului de polarizare 1H-13C ..III.. Bibliografie .... dr...... Mihaela Aluaş Cuprins 1................................. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C .......... Drept urmare........216 2.......................219 3......................Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) – Implementarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaţii pe sisteme moleculare organice în faza solidă C......................................................... care necesită o electronică adaptată secvenţelor de decuplare homonucleară [2] şi/sau capuri de probă de tip „ultra-fast MAS”... Deoarece acestea sunt considerate ca făcând parte din „arsenalul de bază” al metodologiei moderne RMN-S pe sisteme moleculare organice.......................................... chiar dacă nu pot fi utilizate în practică la UBB Cluj............S..245 1... Introducerea metodelor se va face progresiv......... nu vor putea fi prezentate o serie de metode RMN-S intensiv utilizate în domeniu................ metode ce au fost până în prezent implementate şi testate experimental pe infrastructura existentă la UBB Cluj............... Introducere În acest raport se vor prezenta în mod detaliat o serie de experimente RMN-S avansate............ recomandăm studenţilor aprofundarea lor cel puţin la nivel teoretic (consultând bibliografia indicată mai sus)...237 5... dar care nu necesită transformarea lor în spectre 2D.....................

pe durata lui t2. se înregistrează şi se stochează FID-ul corespunzător acestei valori. Această succesiune de perioade poartă denumirea de secvenţă de pulsuri 2D. şi în special nivelurile de putere pe fiecare canal rf.) care va evolua pe durata t1. respectiv că toţi parametri experimentali relevanţi. 1. constă în aplicarea celui de-al doilea puls (sau pulsuri) de radiofrecvenţă. în acest caz transformata Fourier trebuie aplicată de două ori. este de menţionat că. În consecinţă. unde n este de obicei cuprins între câteva zeci şi câteva sute). în afară de aspecte pur practice se va face şi o scurtă prezentare a fundamentelor teoretice pe care aceasta se bazează. se aplică unul sau mai multe pulsuri rf. 217 . În fiecare caz. 3Δt1…nΔt1. semnalul RMN bidimensional constă dintr-un set de n FID-uri. Un spectru RMN 2D se obţine în următorul mod: se aplică secvenţa de pulsuri pentru t1 = 0. semnalul RMN este descris de o funcţie care depinde de două variabile de timp. 2Δt1. unde spectrul RMN se obţine prin transformarea Fourier a FID-ului. Schema generală pentru un experiment RMN bidimensional este redată în Fig. t1 şi t2. etc. şi va depinde explicit de ambele variabile temporale. De asemenea. Spre deosebire de varianta unidimensională. Apoi se repetă aceeaşi procedură pentru t1 egal cu multiplii întregi ai perioadei de sampling Δt1 (adica Δt1. în spectroscopia RMN bidimensională (2D).furnizează informaţii structurale pe bază de spectre RMN-S 2D de corelaţie. se presupune că mai întâi au fost parcurşi paşii prezentaţi în raportul anterior. t1 (corespunzător dimensiunii indirecte F1) şi t2 (corespunzător dimensiunii directe F2). cea de preparare. pentru fiecare tehnică RMN-S avută în vedere. Pentru a se obţine spectrul în frecvenţă. Figura 1: Schema de principiu a unui experiment RMN bidimensiuonal (2D) În prima perioadă. polarizare transversală. coerente de mai multe cuante. prin intermediul semnalul RMN. deoarece ea defineşte corelaţiile care se stabilesc între mărimile care evoluează în t1 şi polarizarea transversală asociată fiecărui spin care se detectează în mod direct. au fost calibrate corespunzător. Secvenţa de mixing are rolul cel mai important într-un experiment 2D. în urma cărora se generează o mărime fizică asociată sistemului de spini (de ex. iar informaţia care se regăseşte în spectrul RMN depinde concret de tipul interacţiunii care a fost selectată în perioadele de preparare şi de mixing. Următoarea perioadă – perioada de mixing.

care va evolua în dimensiunea indirectă F1. 1. Astfel.Figura 2: Exemple de spectre RMN 2D şi modalitatea în care apar peakurile diagonale. De 218 . se obţine spectrul anizotrop al interacţiunii recuplate. numite peak-uri diagonale. În cazul spectrelor bidimensionale de separare. ilustrată în Fig. separat. respectiv cross-peakurile Modul de apariţie a peak-urilor în spectre RMN bidimensionale şi interpretarea acestora vor fi descrise pe scurt în cele ce urmează. de exemplu Fig. vor exista diferenţe în ceea ce priveşte (i) mărimea fizică asociată sistemului de spini (de exemplu coerente de una sau mai multe cuante). iar pe durata perioadei de mixing acelaşi semnal a fost transformat cu ajutorul unei anumite secvenţe de pulsuri într-un alt semnal care evoluează cu frecvenţa ωB pe durata t2. t1. atunci pe durata perioadei de preparare s-a format un semnal care a evoluat cu frecvenţa ωA de-a lungul lui t1. şi (ii) interacţiunea de spin recuplată pe durata perioadei de mixing. iar în dimensiunea indirectă. şi perioada de mixing coincid. În funcţie de tipul de experiment RMN de corelare utilizat. o secvenţă de pulsuri specifică spectroscopiei RMN 2D de separare corespunde cazului particular în care domeniul temporal indirect. în funcţie de succesiunea de pulsuri aleasă. F1. dacă într-un spectru 2D va apărea un peak poziţionat la ωA în dimensiunea F1 şi la ωB în dimensiunea F2 (aşa numitele cross-peakuri). Un alt tip de peak-uri care se pot obţine într-un spectru RMN 2D. 2(c). Conform schemei generale a unui experiment 2D. în cazul spectrelor de corelare ambele dimensiuni codifică deplasările chimice izotrope. iar interacţiunea recuplată va genera peakuri de corelatie (cross-peakuri) între nucleele diferitelor grupări chimice dintr-un anumit compus. pentru fiecare linie izotropă. În practică. generează spectre care conţin ambele tipuri de peak-uri. corespund cazului în care frecvenţa de rezonanţă a unui semnal generat în timpul perioadei de preparare va rămâne neafectată de pulsul (sau pulsurile) care alcătuieşte perioada de mixing. şi respectiv de corelare [3]. Spre deosebire de spectrele RMN 2D de separare. se pot obţine două tipuri distincte de spectre RMN 2D: de separare. în dimensiunea F2 se obţine spectrul izotrop al compusului studiat. Multe dintre tehnicile RMN 2D utilizate în mod curent.

Referitor la notaţiile atât în reprezentarea schematică. parametri adimensionali. dn. se foloseşte aceeaşi convenţie ca şi în raportul anterior. în figură sunt mentionaţi explicit parametrii de timp (pulsuri. niveluri de putere ale pulsurilor rf. cât şi în programul de pulsuri. şi listat mai jos. Figura 3: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D de investigare a transferului de polarizare 1H-13C prin intermediul secvenţei CP-MAS clasice 219 . roşu şi verde reprezintă durate. phn. şi anume. etc. pn. Secvenţa de pulsuri asociată acestui experiment este redată mai jos în Fig. sau <valoare> us). pln. şi anume experimente de corelare homonucleare sau heteronucleare. utilizând reprezentarea schematică convenţională din RMN. şi respectiv de fază. experimentele bidimensionale pot fi clasificate şi în funcţie de tipul de nuclee implicate. şi delay-uri.) sunt reprezentate cu negru. de putere. cu eficienţe care depind de distanţele dintre spinii nucleari implicaţi. 3. variabilele notate cu albastru. 2.asemenea. Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea dinamicii transferului de polarizare 1H-13C Metoda RMN-S 2D bazată pe secvenţa CP-MAS clasică Exemplul cel mai ilustrativ al unei metode RMN-S 2D de separare este reprezentat de experimentul de recuplare a interacţiunii dipolare heteronucleare C – H cu ajutorul secvenţei clasice CP-MAS ce are drept efect un transfer de polarizare între protoni şi nucleele 13C din vecinătate. incluşi în programul de pulsuri cp-var asociat acestei secvenţe. Pentru a face mai uşoară o comparaţie directă între această reprezentare schematică. şi implementarea ei pe un spectrometru Bruker. Toate celelalte elemente (comenzi. şi respectiv faze asociate acestor pulsuri. descrisă în raportul anterior.

se aplică transformata Fourier de-a lungul dimensiunii directe (F2) prin intermediul comenzii xf2. În programul de pulsuri. and p30 the pulse În esenţă. 3 presupune înregistrarea unui set de date 2D. modul de achiziţie 2D este specificat prin comenzile de incrementare şi de repetiţie (loop) specifice: if (increment file – trece la un nou fişier unde va fi stocat următorul FID din cadrul setului de date 2D).# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-var" .0) . ivp (increment variable pulse – trece la următoarea valoare a pulsului de contact specificată în lista de pulsuri).go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu. de un număr de ori specificat prin parametrul de achiziţie td1) – repetă experimentul de N ori (N = td1) pentru a acumula toate datele prevăzute în experimentul 2D. secvenţele CP-MAS efectiv utilizate diferă între ele prin durata pulsului de contact. urmează procesarea datelor: concret. După achiziţionarea celor N semnale RMN distincte. Valorile acestor pulsuri sunt stocate într-o aşa-numită listă de pulsuri (variable pulse list) care este apelată în cadrul programului de pulsuri prin comanda vp (variable pulse).cp (TopSpin 2.basic cp experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (vp ph1):f1 (vp ph2):f2 1u pl12:f2 . achiziţionate prin intermediul secvenţei CP-MAS clasice: la fiecare dintre cele N repetiţii ale experimentului. lo to 2 times td1 (loop la linia 2. experimentul descris în Fig.pl12 is used here with cw . 1m 1m if 1m ivp lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1 . care constă dintr-un număr N de semnale RMN 13C distincte. Lista este cuprinsă în fişierul care este specificat în tabela parametrilor de achiziţie. şi se obţine astfel 220 .pl12 is used here with tppm.

Astfel. Acesta este format din N spectre 13C CP-MAS. în locul curbelor CP se vor obţine aşa-numitele spectre dipolare: cele două modalităţi de a extrage informaţii despre parametrii interacţiunii dipolare sunt însă echivalente. respectiv COOH). proprietăţile caracteristice ale unei asemenea curbe descriu. Considerând variaţia intensităţilor de linie cu poziţia spectrului CP-MAS din setul de date 2D. pentru fiecare poziţie chimică distinctă a atomilor de carbon din sistemul molecular investigat. În practică. astfel încât numărul de N de repetiţii ale experimentului. obţinându-se în final aşa-numitele curbe CP-MAS. respectiv COOH. obţinându-se spectrul izotrop al compusului. contribuţii însemnate vor avea cei situaţi până la o distanţă de 2. se reprezintă grafic evoluţia intensităţii de linie în funcţie de durata lui p15. cu cât rata de creştere a unei astfel de curbe CP este mai mare şi oscilaţiile dipolare mai pronunţate (vezi curba CP corespunzătoare grupării CH comparativ cu cele pentru CH3. se recomandă de asemenea înregistrarea curbei până la valori ale pulsului de contact de 3 – 5 ms. să fie menţinut la o valoare rezonabilă. şi se manifestă prin apariţia aşa-numitelor oscilaţii dipolare în curbele CP-MAS corespunzătoare. 4 este prezentat un set de date bidimensional înregistrat utilizând tehnica descrisă mai sus în cazul particular al L-Alaninei. deoarece în interiorul acestui domeniu temporal caracterul coerent al procesului de transfer este dominant. Dacă transformata Fourier se aplică şi de-a lungul lui t1. CH3. Transformata Fourier s-a aplicat doar în dimensiunea directă. care afectează dinamica procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C la durate de ordinul milisecundelor. Pentru a putea caracteriza şi parametrii relaxării spin-reţea în sistemul rotitor. 5 – 10 μs).setul de date 2D. aşezate în ordinea crescătoare a duratei pulsurilor de contact p15 utilizate. ţinând cont de caracteristicile procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C. Pentru fiecare dintre liniile RMN din spectru. cu atât cuplajul dipolar heteronuclear asociat este mai puternic. 30-50. pentru durate ale pulsului de contact p15 cuprinse în intervalul 0 – 200 μs e preferabilă utilizarea unei eşantionări în paşi egali (de exemplul. în dimensiunea indirectă se obţin curbele de transfer de polarizare (CP) corespunzătoare fiecărei grupări chimice: forma specifică a fiecărei dintre aceste curbe reflectă tăria cuplajelor dipolare heteronucleare recuplate. Peste această valoare a lui p15 se pot utiliza creşteri cu paşi din ce în ce mai mari. În Fig. care coincide cu numărul de puncte ce definesc curbele CP-MAS înregistrate. Procedura descrisă mai sus face parte dintr-o clasă mai largă de metode RMN-S numite 221 .5-3 Å). cu cele trei linii de rezonanţă caracteristice grupărilor CH. dinamica procesului de transfer de polarizare de la protonii învecinaţi (în principiu.

şi de prezenţa sau nu a ordonării în probele investigate. În general. se obţine o recuplare eficientă a interacţiunii dipolare heteronucleare. însă extinde domeniul acesteia de aplicabilitate prin încorporarea unei noi secvenţe în perioada de preparare. în condiţii de rotire a probei la unghi magic. această secvenţă numită CPPI (Cross-Polarization Polarization-Inversion) are drept scop generarea unei 222 . tehnica CP-MAS de recuplare a interacţiunii dipolare heteronucleare este în general înlocuită cu tehnici mai sofisticate [4. cum ar fi metodele LG (Lee-Goldburg) sau FSLG (Frequency-Switched Lee-Goldburg). iar în dimensiunea indirectă sunt ilustrate curbele CP corespunzătoare acestor grupări. Figura 4: Set de date 2D obţinut în cazul compusului L-alanina.de tip SLF (Separated Local Field Spectroscopy): în cadrul acestora. Metoda Remote Protons CP-MAS O nouă metodă RMN-S 2D de separare este bazată pe experimentul anterior. În dimensiunea directă se aplică transformata Fourier şi se obţin liniile de rezonanţă ale grupărilor chimice din compus. care să ţină cont de detaliile structurale dorite. prin combinarea tehnicii de recuplare heteronucleară CP cu metode de decuplare homonucleară a protonilor. Aceste curbe au fost înregistrate după ce în prealabil puterile pe cele două canale rf au fost calibrate la condiţia n = -1 de matching Hartmann-Hahn. 5].

1m 1m if 1m ivp .remote protons CP-MAS experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 (p16 ph1):f1 (p16 ph6):f2 (vp ph1):f1 (vp ph8):f2 1u pl12:f2 . cum este cazul experimentului CP-MAS clasic. and p30 the pulse 223 . p15 şi p16. Noua stare iniţială constă într-o distribuie neuniformă a polarizării protonilor.0) .pl12 is used here with tppm.go=2 ph31 cw:f2 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu.stări iniţiale diferită de polarizarea uniformă 1H. care poate fi creată cu ajutorul configuraţiei experimentale formată din cele două blocuri CP ale secvenţei CPPI de durate bine determinate. iar faza celui de-al doilea bloc este inversată în raport cu faza primului.cp (TopSpin 2. Figura 5: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D „Remote Protons CP-MAS” de investigare a transferului de polarizare 1H-13C de la protonii nelegaţi chimic de catonii din probă # 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/rem_prot_cp" .pl12 is used here with cw .

lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph2= 0 ph4= 2 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

Alternând fazele celor două pulsuri CP care formează secvenţa CPPI se creează o stare iniţială de polarizare egală cu zero atât pentru nucleul 13C, cât şi pentru protonii direct legaţi chimic de acesta. Ca o condiţie necesară pentru ca în curbele de transfer de polarizare să fie cuantificat doar procesul de transfer de la protonii îndepărtaţi, secvenţa CPPI trebuie să aducă simultan la zero polarizarea spinului central 13C şi a protonilor direct ataşaţi, în timp ce polarizarea protonilor îndepărtaţi este menţinută la o valoare cât mai mare. Pentru a verifica în ce măsură această condiţie este îndeplinită, am efectuat simulări numerice utilizând programul Spinevolution. În acest scop, sistemul de spini ales este format dintr-un nucleu 13C înconjurat de 7 protoni, care aparţin moleculei de L-Alanina. Pentru cazul grupării CH rezultatele analizei sunt prezentate în Fig. 6: în aceste grafice este ilustrată evoluţia polarizării pentru fiecare spin din sistem în funcţie de creşterea timpului de inversie, p17, şi pentru trei valori diferite ale frecvenţei de rotaţie, νR = 5; 8, respectiv 15 kHz. Pentru sistemul de spini utilizat, primul bloc CP are o durata fixă, p16 = 70 μs, corespunzătoare transferului maxim de polarizare de la protonul legat chimic de spinul central 13C. Dependenţa curbelor de polarizare

Figura 6: Simulări ale dependenţei polarizării de spin de timpul de inversie τ2 din secvenţa de pulsuri CPPI pentru υR = 5; 8 respectiv 15 kHz, în cazul grupării CH din L-Alanina. Prin linie continuă sunt reprezentate curbele de inversie ale polarizării pentru spinul 13C (cu negru), respectiv a protonului legat chimic de acesta (cu roşu). Cu linie punctată este reprezentată polarizarea remanentă pe protonii îndepărtaţi, care aparţin grupării CH3 (albastru), respectiv NH3 (verde) din sistemul de spini considerat.

224

din Fig. 6 arată că polarizările din cadrul grupării CH (adică nucleului 13C şi a protonul sau direct ataşat) pot fi aduse simultan la zero pentru frecvenţe de rotaţie a probei mai mari decât 5 kHz, iar valoarea efectivă a duratei pulsului p17 pentru care această condiţie este îndeplinită depinde în mod explicit de valoarea frecvenţei de rotaţie: de exemplu pentru νR = 8 kHz se obţine un puls de contact p17 cu o durată de 42 μs. În măsura în care starea iniţială dorită poate fi generată cu ajutorul secvenţei CPPI, curbele de transfer de polarizare înregistrate experimental prin incrementarea duratei celui de-al treilea bloc CP din Fig. 5 se consideră ca reflectă doar contribuţia protonilor îndepărtaţi. Pentru a verifica acest lucru, predicţiile teoretice referitoare la procesul de transfer de polarizare de la protonii îndepărtaţi realizat prin noua metodă Remote Protons CP-MAS, au fost testate experimental [6]. În acest scop, am extins configuraţia utilizată în simulări numerice la un sistem de 10 spini (9 protoni şi un nucleu 13C) din L-Alanina, iar curbele CP simulate au fost comparate cu cele experimentale. Molecula de L-Alanina a fost alesă deoarece poziţiile protonilor, şi implicit distanţele H-H şi C-H, sunt determinate precis, prin difracţie de neutroni (cu precizie de ±0.003 Å). Simulările numerice au fost efectuate considerând două cazuri distincte şi anume: în primul caz se consideră gruparea NH3 ca fiind rigidă, iar în cel de-al doilea caz aceeaşi grupare se consideră în regim de rotaţie rapidă în jurul axei sale. În ambele situaţii gruparea CH3 este considerată a efectua o mişcare de rotaţie rapidă. Prin compararea curbelor CP-MAS simulate cu cele experimentale (Fig. 7)

Figura 7: Comparaţia între curbele CP/MAS teoretice şi experimentale corespunzătoare nucleului 13C din gruparea CH din L-Alanina, obţinute prin utilizarea secvenţei CP clasice (curbele roşii), respectiv a secvenţei de transfer de la protonii nelegaţi (curbele cu albastru). Curbele experimentale sunt reprezentate prin cercuri, iar cele simulate prin linie punctată (pe un sistem format din 8 spini), respectiv linie continuă (sistem format din 10 spini). Gruparea CH3 se consideră a efectua o mişcare de rotaţie rapidă în ambele cazuri, iar gruparea NH3 se consideră în aproximaţie rigidă în (a), respectiv în regim de rotaţie rapidă în (b).

225

se observă o foarte bună concordanţă în cazul în care gruparea NH3 este considerată quasi-rigidă. Totuşi, există unele mici diferenţe între curba calculată şi cea măsurată, diferenţe care cel mai probabil se datorează faptului că gruparea NH3 efectuează în realitate o mişcare de rotaţie lentă (la scală de timp a procesului de transfer de polarizare, de ordinul µs). Cea mai importantă concluzie care rezultă în urma comparării efectuate este sensibilitatea crescută a curbei Remote CP-MAS la dinamica moleculară prezentă în sistemul molecular studiat, în timp ce curba CP clasică nu este atât de sensibilă la detalii ale mişcării moleculare caracteristice grupării NH3.

3. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C
Metoda Proton Driven Spin-Diffusion Metoda RMN-S 2D numită Proton Driven Spin Diffusion (PDSD) este o metodă de corelare: după cum se observă din schema experimentală asociată acestui experiment (Fig. 8), pe durata ambelor perioade de evoluţie indirectă şi directă, t1 şi t2, magnetizarea transversală 13C evoluează în condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM aplicată pe canalul protonilor şi rotaţie a probei în jurul unghiului magic, astfel încât ambele dimensiuni spectrale în spectrul RMN 2D vor codifica preponderent informaţii cu privire la deplasările chimice izotrope ale carbonilor din sistemul molecular investigat (cu o lărgire reziduală determinată de imperfecţiunea metodei de decuplare). Pe durata perioadei de mixing, se generează o stare de polarizare longitudinală

Figura 8: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D „Proton Driven Spin-Diffusion” (PDSD) de investigare a transferului de polarizare 13C-13C mediat de interacţiunea dipolară cu protonii

226

diferenţială, care va fi transferată între spinii 13C între care există cuplaje dipolare suficient de puternice. Din această cauză, în afară de peakurile diagonale, în spectrul RMN 2D obţinut prin metoda PDSD apar şi cross-peakuri de corelaţie între oricare două poziţii chimice distincte între care se stabileşte transfer de polarizare (spin diffusion), cu intensităţi care depind de distanţa la care se află nucleele 13C corespunzătoare.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/sp-diff" ;cp (TopSpin 2.0) ;13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 pl4:f1 1u do:f2 (p1 ph4):f1 d5 (p1 ph5):f1 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit

; tau mix ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

ph3= 1 3 ph1= (4) 0 0 2 2 ph2= 0 ph4= 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2 ph5= 1 1 1 1 3 3 3 3 ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1

Transferul de polarizare 13C-13C în experimentul PDSD este iniţiat de interacţiunile dipolare homonucleare între spinii nucleari corespunzători, însă el se produce prin intermediul protonilor situaţi între aceşti carboni. Deoarece aceste cuplaje dipolare C-C sunt în general slabe, durata perioadei de mixing, d5 – în secvenţa de pulsuri ilustrată mai sus, trebuie să fie 227

relativ mare, între câteva sute de µs până la 10-100 ms, pentru a avea un transfer eficient în domeniul de distante 2-5 Å. Din această cauză, metoda este preponderent utilizată pe probe marcate uniform cu 13C: cu toate acestea, există şi câteva cazuri în care PDSD a fost demonstrat şi pe probe cu 13C în abundenţă naturală, însă în aceste cazuri este nevoie de durate de mixing de ordinul secundelor pentru a identifica cross-peakuri cu intensităţi măsurabile. Cu privire la implementarea practică a unui experiment RMN 2D, introduse prin acest exemplu, trebuie menţionate următoarele aspecte: (i) sintaxa ph1= (4) 0 0 2 2 utilizată în programul de pulsuri asociat secvenţei PDSD pentru faza pulsului de contact p15 pe canalul 13C specifică procedura numită TPPI (Time Proportional Phase Incrementation) aplicată pentru înregistarea semnalului în cuadratură pe dimensiunea indirectă – în practică înseamnă că la fiecare experiment nou în dimensiunea indirectă fazele vor fi incrementate cu 3600/4 = 900 faţă de experimentul anterior (adică dacă pentru primul FID din setul de date 2D se utilizează fazele 0 0 2 2 pentru pulsul p15, al doilea FID va avea fazele 1 1 3 3, şi aşa mai departe; (ii) pasul temporal în dimensiunea indirecta este denumit in0 (increment delay 0), iar durata totală de achiziţie indirectă este notată cu aq1, şi se calculează înmulţind incrementul in0 cu numărul de puncte al semnalului înregistrat în dimensiunea indirectă, respectiv td1.

Figura 9: Spectru 13C CP-MAS pe L-Tirozina HCl, şi o reprezentare schematica a atribuirii liniilor pentru cele 7 poziţii chimice distincte ale carbonilor din molecula

228

În final vom ilustra utilizarea metodei PDSD cu rezultatele experimentale obţinute în cazul particular al compusului L-Tirozina HCl, marcată uniform cu 13C. Mai întâi prezentăm în Fig. 9 spectrul 13C RMN-S 1D obţinut prin CP-MAS la o frecvenţă de rotaţie a probei de 10 kHz. Atribuirea liniilor spectrale corespunde indexării poziţiilor de carbon din reprezentarea schematică a moleculei de L-Tirozina inclusă în aceeaşi figură. Am ales acest caz particular pentru că ne permite comportaţii în cadrul unor domenii de distanţe internucleare 13C-13C scurte (1.5 Å – între carboni direct legaţi chimic), medii (3-4 Å, de exemplu între carbonii alifatici şi cei de pe inelul benzenic), şi respectiv lungi (4-5.5 Å, între C1 şi C7 sau C8). Posibilitatea de a estima astfel de distante C-C din spectre PDSD de corelaţie 13C-13C este ilustrată în continuare prin exemplele prezentate în Fig. 10. Primul corespunde unei durate de mixing scurte, de 300 µs, şi evidenţiază faptul că la această scală de timp transferul de polarizare este eficient doar pe distanţe scurte, între carbonii direct legaţi chimic. Utilitatea practică a unui asemenea spectru este evidentă, respectiv identificarea conectivităţilor chimice în cazul unui compus nou, şi pe această cale este un instrument extrem de util în procesul de atribuire spectrală.

Figura 10: Spectre RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina aplicând metoda PDSD; ele ilustrează dinamica procesului de transfer de polarizare la durate de mixing scurte (300 μs), şi respectiv lungi (5 ms)

Cel de-al doilea spectru PDSD ilustrat în Fig. 10 corespunde unei perioade de mixing mult mai mari, de 5 ms, şi este reprezentativ pentru situaţia în care transferul de polarizare se reduce pe distanţe mult mai mari, până la 5 Å, după cum se poate observa din prezenţa peakului de corelaţie C1-C7. Astfel de spectre sunt utile pentru a extrage constrângeri structurale utile pentru investigarea conformaţiei moleculare în sistemul investigat. 229

Metoda CHHC Metoda CHHC pe care o vom discuta în continuare permite determinarea distanţelor 1H-1H, cu rezoluţie înaltă datorită implementării în cadrul spectroscopiei RMN-S 2D de corelaţie 13C-13C. Metoda este demonstrată efectiv pe L-Tirozina·HCl sintetizată sub formă poli-cristalină şi marcată uniform cu 13C. L-Tirozina·HCl a fost aleasă drept sistem model deoarece spectrul 13C RMN-S 1D prezintă o rezoluţie suficient de bună pentru a putea separa liniile corespunzătoare tuturor grupărilor chimice din molecula (Fig. 9), iar structura sa cristalină este bine caracterizată. În Fig. 11 este ilustrată secvenţa de pulsuri asociată metodei CHHC. Experimentul începe cu prepararea unei stări iniţiale prin transfer de polarizare prin CP de la 1H la 13C. Polarizarea transversală astfel creată evoluează sub influenţa deplasărilor chimice izotrope al carbonilor pe durata perioadei de evoluţie indirectă, t1, în condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM pe canalul 1H. Polarizarea 13C care a evoluat cu deplasările chimice izotrope corespunzătoare fiecărei poziţii distincte din moleculă este apoi transferată prin intermediul unei perioade scurte (65 μs) de cross-polarizare (CP) a protonilor direct conectaţi chimic. Polarizarea transversală astfel obţinută este apoi adusă de-a lungul direcţiei z (este transformată în polarizare longitudinală) prin aplicarea unui puls π/2 asupra spinilor 1H. Deoarece polarizările 1H astfel obţinute nu au aceeaşi valoare la toţi protonii, pe durata perioadei de mixing, tmix, se va realiza o redistribuire a acestora prin intermediul aşa-numitului proces de schimb de magnetizare, şi se generează astfel cross-peakuri a căror intensitate este proporţională cu cantitatea de

Figura 11: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D CHHC de investigare a transferului de polarizare 1H-1H codificat în spectre de corelaţie 2D 13C-13C

230

polarizare schimbată de protonii corelaţi. Deoarece schimbul de magnetizare se datorează interacţiunilor dipolare 1H-1H, intensitatea fiecărui cross-peak obţinut codifică informaţii cu privire la tăria cuplajului dipolar dintre protonii implicaţi si, implicit, cu privire la distanţele internucleare dintre aceştia. După parcurgerea etapei de mixing urmează transformarea polarizării longitudinale în polarizare 1H transversală (prin aplicarea a incă unui puls π/2 pe canalul 1H), iar aceasta apoi transferată către nucleele 13C direct conectaţi chimic (prin intermediul unei perioade scurte de CP, similară celei prin care s-a realizat transferul 13C->1H iniţial). În final, polarizarea transversală 13C este detectată sub formă de semnal RMN pe durata perioadei de evoluţie directă, t2. Detecţia semnalului se face de asemenea în condiţii de înaltă rezoluţie, adică se urmăreşte evoluţia polarizării transversale 13C sub acţiunea deplasărilor chimice izotrope asociate carbonilor din probă, în condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chhc" ;cp (TopSpin 2.0) ;13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 1u do:f2 1u pl2:f2 (p16 ph5):f1 (p16 ph4):f2 1u pl3:f2 p3:f2 ph8 d5 p3:f2 ph9 1u pl2:f2 (p16 ph7):f1 (p16 ph6):f2 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu, 1m 1m if 1m in0

; tau mix

;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse

231

lo to 2 times td1 exit ph3= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph1= (4) 1 ph2= 3 3 3 3 0 0 0 0 ph4= 3 1 ph5= 1 ph6= 1 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph8= 0 ph9= 2 ph31= 3 1 3 1 0 2 0 2

Un spectru CHHC tipic este ilustrat în Fig. 12, unde este considerat cazul particular al spectrului 2D de corelaţie 13C-13C înregistrat la o valoare tmix de 50 μs, utilizând o fereastră spectrală care se limitează la carbonii protonaţi (indexaţi conform schemei din Fig. 9). Corelaţiile care se stabilesc între protonii asociaţi diferitelor poziţii de carbon din moleculă sunt identificate în spectrul CHHC prin apariţia cross-peakurilor care conectează poziţiile chimice corespunzătoare. Deoarece mecanismul de stabilire a corelaţiilor în spectre CHHC se bazează pe schimbul de magnetizare longitudinală 1H-1H determinat de interacţiunea dipolară, amplitudinea fiecărui cross-peak va fi o măsură a tăriei acestui cuplaj şi, implicit, a distanţei internucleare dintre protonii asociaţi poziţiilor de carbon corelate. Acest mecanism este exemplificat în Fig. 12 cu corelaţii ale carbonului A (a se vedea liniile punctate). În particular, se observă apariţia unui cross-peak intens între A şi carbonul C, însă este de remarcat de asemenea lipsa uni peak de corelaţie similar cu carbonul din poziţia B. Din punct de vedere calitativ, acest rezultat este în perfectă concordanţă cu distanţele intra-moleculare dintre protonii conectaţi chimic de aceştia, şi anume: 3.2 Å între protonii cei mai apropiaţi de carbonii A şi C, şi respectiv de 4.8 Å pentru ceilalţi doi protoni prezentaţi în exemplul din Fig. 12. O analiză cu caracter cantitativ relevantă pentru determinarea de distanţe 1H-1H cu ajutorul metodei CHHC trebuie însă să ia în considerare şi alte efecte care influenţează intensităţile cross-peakurilor din spectru: pentru aceasta am elaborat un model teoretic al dinamicii de spin în condiţii specifice experimentului CHHC [7]. Rezultatele modelării ne-au permis îmbunătăţirea procesului de analiză a datelor experimentale, prin introducerea de corecţii adecvate pentru o serie de procese perturbative, şi anume: (i) caracterul neselectiv al transferului de polarizare 1H<->13C pe durata blocurilor CP care “flanchează” perioada de transfer de magnetizate (tmix în Fig. 11), (ii) efectul protonilor care nu contribuie direct la semnalul RMN-S detectat (protonii care nu sunt legaţi chimic de carbon, şi respectiv protonii din molecule nemarcate izotopic cu 13C), şi 232

Figura 12: Spectru RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina marcată uniform cu 13C aplicând metoda CHHC; spectrul a fost obţinut pentru o durată de mixing de 50 µs şi ilustrează modul în care dinamica procesului de transfer de polarizare 1H-1H (si implicit distanţa dintre protonii implicaţi) este codificată prin intensitatea cross-peakurilor corespunzătoare din spectrul de corelaţie 2D.

Figura 13: Curbe CHHC reprezentative pentru protoni cu contacte intermoleculare scurte (de exemplu protonul legat de C5 de pe inelul aromatic), şi respectiv lungi (protonii ataşaţi lui C2) în urma împachetării moleculelor de L-Tirozina în reţeaua cristalină (figura din dreapta)

233

efectul multiplicităţii protonice pentru diferite grupări chimice din sistem (CH. am proiectat şi implementat practic un nou tip de experiment de corelare 13C-13C. adică spectre de înaltă rezoluţie. Informaţia codificată în acest tip de spectre se referă tot la cuplajele dipolare 1H-13C. Metoda CHCC Având în vedere rezoluţia spectrală limitată a protonilor în experimente RMN-S 2D de tip HETCOR.(iii). În această figură ilustrăm comportamentul observat pentru transferul de polarizare în care sunt implicaţi protonii ataşaţi poziţiilor de carbon C2. CH2. În mod similar cu metoda CHHC. şi respectiv C5 din molecula de L-Tirozină.cp (TopSpin 2. CH3). 13). Corecţiile introduse conduc la creşterea semnificativă a gradul de precizie cu care sunt estimate distanţele proton-proton din spectre RMN-S de tip CHHC. în particular prin intermediul aşa-numitelor curbe CHHC extrase dintr-un set de astfel de spectre înregistrate pentru diferite valori ale timpului de mixing (Fig. unde transferul de polarizare este utilizat pentru a codifica cuplajele dipolare 1H-1H.0) 234 . iar procesul care stă la baza experimentului CHCC este şi în acest caz transferul de polarizare proton-carbon. care sunt utilizate în mod tradiţional pentru investigaţii structurale bazate pe determinarea de distante C-H. Figura 14: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D CHCC de investigare a transferului de polarizare 1H-13C codificat în spectre de corelaţie 2D 13C-13C # 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chcc" . numit CHCC: acesta prezintă avantajul de a cuantifica pe ambele dimensiuni spectrale deplasări chimice ale nucleelor 13C. metoda CHCC se aplică în cazul compuşilor uniform marcaţi cu 13C.

. and p30 the pulse Secvenţa de pulsuri corespunzătoare metodei CHCC (Fig. Informaţii cu privire la eficienţa procesului de transfer de polarizare de la nuclee individuale 1H la toate nucleele 13C aflate în vecinătate sunt codificate în perioada de mixing. Pe durata celui de-al doilea bloc CP din secvenţa de mixing transferul de polarizare 1H-13C se realizează în mod clasic. 14) constă în trei blocuri CP distincte. atât în dimensiunea directă.13C-13C spin diffusion experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u cpd2:f2 1u pl12:f2 d0 1u do:f2 1u pl2:f2 (p16 ph5):f1 (p16 ph4):f1 (p17 ph7):f1 (p17 ph6):f2 1u pl12:f1 go=2 ph31 cpd2:f2 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu. 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph3= 1 3 1 3 1 3 1 3 ph1= (4) 0 ph2= 0 ph4= 1 ph5= 0 ph6= 1 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2 . polarizarea de spin va evolua în condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM. Primul bloc CP din perioada de mixing este unul de durată scurtă. 235 . astfel încât liniile de rezonanţă specifice fiecărei grupări chimice să fie separate. cât şi în cea indirectă. Pentru a obţine rezoluţie înaltă. astfel încât polarizarea fiecărui 13C este transferată în mod selectiv doar către protonul (protonii) direct legaţi.pl12 is used here with tppm. dintre care ultimele două formează perioada de mixing a experimentului.

5 ms (a). Deoarece selectivitatea metodei CHCC poate fi afectată de influenţa polarizării iniţiale a carbonului. spectrele 1D de mai jos reprezintă felii de-a lungul dimensiunii directe ce corespund poziţiilor de carbon C2 şi C8. şi respectiv 1 ms (b). conform programului de pulsuri asociat schemei experimentale din Figura 14. Ca şi în cazul celorlalte două metode de corelare prezentate mai sus.către toate nucleele de carbon aflate în vecinătate. (iii) incrementând durata ultimului puls CP (tmix) polarizarea 1H Figura 15: Spectru RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina marcata uniform cu 13C aplicând metoda CHCC pentru valori ale ultimului puls de contact (p17) de 0. Sz. Fig. informaţiile extrase în urma aplicării schemei experimentale CHCC sunt codificate în spectre 2D de corelaţie 13C-13C. urmat de evoluţia pe durata t1 a polarizării 13C sub acţiunea interacţiunii de ecranare chimică şi în condiţii de decuplare heteronucleră prin TPPM. Cross-peakurile CHCC sunt generate conform următoarei scheme: (i) primul pas este format dintr-un bloc CP standard. aleasă astfel încât polarizarea de spin să fie transferată de la nucleele de 13C doar la protonii direct legaţi. şi de polarizarea rămasă pe canalul carbonilor după pulsul CP scurt (din cauza că această polarizare nu se transferă în întregime protonilor direct legaţi) se impune ca asupra secvenţei CHCC să se aplice procedeul de ”phase cycling”. 15. în funcţie de distanţele carbon-proton individuale. (ii) aplicarea unui bloc CP de durată scurtă. iar prin asterisk este marcat în fiecare caz evoluţia cross-peakului specificat. 236 .

iar în dimensiunea directă ele dau naştere semnalelor izotrope corespunzătoare ambilor spini.5. spre exemplu C7-C5(C4) (pentru distanţa C7-H5(H4) de 2. 16. unde r este disţanta 1Hi .6(a). 4.se transferă atât nucleelor 13C direct legate de protonii polarizaţi. utilizând cuplajul J dintre diferite poziţii chimice în molecula investigată.68 Å). respectiv 1 ms sunt prezentate în Fig.9 Å). Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) – SQ (Single Quantum) Metoda INADEQUATE Metoda numită INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment) este o metodă RMN-S 2D de corelatie 13C-13C în cadrul căreia în perioada de preparare se generează coerente de două cuante (DQ – Double Quantum).13 Å (H7-C8). rata de transfer fiind proporţională cu 1/r3. În dimensiunea indirectă. de la 2. Experimentul generează polarizare transversală a spinilor 13C prin secvenţa CP-MAS: cu ajutorul pulsului de 900 aplicat după pulsul de contact pe canalul carbonului. Discuţia rezultatelor experimentale se va concentra doar pe distanţe intermoleculare proton-carbon mai mici de 6 Å. La o analiză atentă a spectrelor CHCC se poate observa că cross-peakurile cele mai intense (C7-C8. Distanţele intra-moleculare 1H-13C acoperă un interval larg de valori. situate în intervalul 2. C2-C4) corespund celor mai mici distanţe internucleare 1H-13C. Secvenţa INADEQUATE constă în două pulsuri de 900 separate de o evoluţie liberă pe durata perioadei de mixing.65 Å (H3-C8). 16b) pentru a genera coerenţele DQ. la 5. C3-C5. şi C2-C7 (4. 5. Secvenţa de pulsuri asociată experimentului INADEQUATE este redată în Fig. C3-C4 (3.5 ms. pentru a refocaliza evoluţia cu deplasarea chimică 13C la sfârşitul procesului de generare a coerenţelor DQ. În prealabil. ω1+ω2. cât şi celor aflate în vecinătate. adică ω1 şi ω2.20 Å. respectiv (b).7 Å). respectiv 1 ms) spectrele codifică informaţii structurale despre contactele intramoleculare scurte. Totuşi.13Cj. aceasta este transformată în polarizare longitudinală care apoi este utilizată pe durata aplicării secvenţei INADEQUATE (Fig. Acest lucru arată că pentru timpii de mixing aleşi (tmix = 0. cross-peakurile datorate corelaţiilor între spini aflaţi la distanţe mai mari sunt şi ele bine conturate. fiind în bună concordanţă cu datele teoretice (Figura 5. Eficienţa transferului de polarizare către nuclee 13C individuale este reflectată în intensitatea cross-peakurilor obţinute. aceste coerenţe evoluează cu o frecvenţă egală cu suma deplasărilor chimice asociată spinilor corelaţi.15 – 2. tmix. se mai aplică o dată secvenţa INADEQUATE care va reconverti coerenţele DQ care au evoluat pe durata lui t1 în coerenţe 237 .6 b). iar la jumătatea acestei perioade se aplică un puls de 1800. Spectrele bidimensionale CHCC ale L-Tyrozinei·HCl uniform marcate 13 cu C pentru timpi de mixing de 0.

cp (TopSpin 2.de tip Single Quantum (SQ).13C-13C INADEQUATE experiment 1 ze 2 d1 do:f2 1u pl3:f2 (p3 ph3):f2 (1u pl1:f1) (1u pl2 f2) (p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2 1u (pl12:f2) (pl4:f1) (p1 ph4):f1 1u cpd2:f2 (p1 ph5):f1 d5 (2p1 ph6):f1 d5 (p1 ph7):f1 238 . În cazul nucleelor 13C. 17 nu va apărea cross-peakul corespunzător coerentei ω1+ω3. adică între nucleele C1 şi C3. codificat în spectre de corelaţie 2D 13C-13C # 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/inadequate" . cuplajul J are valori semnificative pentru a produce coerente DQ în general între poziţii direct conectate prin legături chimice: din aceasta cauză.0) . în exemplul de spectru INADEQUATE prezentat în Fig. Figura 16: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D INADEQUATE utilizat pentru investigarea eficienţei procesului de generare a coerenţelor Double Quantum (DQ) 13C-13.

corespund formării unei coerenţe DQ care evoluează în dimensiunea indirectă cu frecvenţa ωi + ωj şi indică conectivitatea chimică directă între carbonii corespunzători 239 .d0 (p1 ph8):f1 d5 (2p1 ph9):f1 d5 (p1 ph10):f1 1m do:f2 wr #0 HaltAcqu. 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph3= 1 1 1 1 3 3 3 3 ph1= 0 ph2= 0 ph4= 3 3 3 3 1 1 1 1 ph5= (8) 0 2 4 6 ph6= (8) 0 2 4 6 ph7= (8) 4 6 0 2 ph8= 1 ph9= 1 ph10= 3 ph31= 0 2 0 2 2 0 2 0 Figura 17: Exemplu ilustrativ de spectru RMN 2D INADEQUATE: peakurile de corelaţie între două poziţii chimice. ωi şi ωj.

în abundenţă naturală. În urma analizei spectrului 2D INADEQUATE s-au determinat toate corelaţiile posibile între nucleele de carbon din moleculă. această moleculă prezintă o structură cristalină puternic ordonată.Datorită particularităţilor sale. în abundenţă naturală [8]. spectrul 13C unidimensional conţine 58 de linii RMN (fiecărei poziţii individuale a unui nucleu 13C ii va aparţine o linie de rezonanţă dublată). Un exemplu relevant pentru acest tip de aplicaţii practice ilustrat în Fig. în scopul stabilirii conectivităţilor chimice dintre diferitele grupări prezente în molecula investigată. Figura 18: Spectrul RMN 2D de corelare corespunzător acetatului de colesteril în abundenţă naturală (2 molecule pe unitatea asimetrică) obţinut cu ajutorul secvenţei de pulsuri INADEQUATE 240 . care conţine două molecule în unitatea asimetrică. concluzionându-se asupra acurateţei metodei INADEQUATE în caracterizarea conectivităţilor chimice în sisteme moleculare complexe. Datorită acestui fapt. majoritatea situate în regiunea spectrală 10 – 60 ppm. metoda INADEQUATE este intens utilizată în investigaţiile structurale din chimia organică. În stare solidă. 18 corespunde spectrului 13C INADEQUATE înregistrat pe acetatul de colesteril (C29H48O2).

Drept urmare. iar altele aplicarea de pulsuri rf intense: toate au însă în comun sincronizarea duratei secvenţei de excitare DQ cu perioada de rotaţie a probei în jurul unghiului magic. şi respectiv de a le reconverti la coerenţe SQ. unde rezoluţia spectrală este asigurată prin rotaţia rapidă în jurul unghiului magic. codificat în spectre de corelaţie 2D 1H-1H. unele implicând acţiunea continuă a câmpurilor rf. şi respectiv o versiune perfecţionată a ei. BABA2. care conţine două cicluri BABA cu fazele relative astfel proiectate încât să minimizeze efectul evoluţiei sub acţiunea deplasărilor chimice 1H pe Figura 19: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D 1H-1H DQ-MAS utilizat pentru investigarea eficienţei procesului de generare a coerenţelor Double Quantum (DQ) 1H-1H . În practică. pentru excitarea coerenţelor ilizează secvenţa numita BABA2 241 .Metoda 1H-1H DQ-MAS Metodele bazate pe excitarea coerentelor DQ se pot aplica şi în cazul protonilor. au fost dezvoltate numeroase metode de excitare DQ pentru protoni. singura deosebire fiind secvenţa de pulsuri aplicată pentru a genera coerenţe DQ. 19) este aceeaşi ca şi în cazul INADEQUATE. detectabile direct. schema generală a experimentului 1H-1H DQ-MAS (Fig. în cazul metodelor 1H-1H DQ-MAS coerenţele de două cuante se generează interacţiunile dipolare homonucleare 1H-1H recuplate pe durata perioadei de excitare şi reconversie cu ajutorul unor secvenţe de pulsuri specifice. condiţie necesară pentru a realiza o recuplare eficientă a interacţiunilor dipolare 1H-1H. În prezentul raport vom considera aşa-numita secvenţă BABA (Back to Back) [9]. Spre deosebire de experimentul INADEQUATE prezentat anterior.

1H-1H DQ-MAS experiment 1 ze 2 d1 1u pl1:f1 (p1 ph1):f1 d1 (p1 ph1):f1 1u (p1 ph2):f1 d1 (p1 ph3):f1 1u (p1 ph1):f1 d1 (p1 ph1):f1 1u (p1 ph3):f1 d1 (p1 ph2):f1 d0 1u (p1 ph4):f1 d1 (p1 ph4):f1 1u (p1 ph5):f1 d1 (p1 ph6):f1 1u (p1 ph4):f1 d1 (p1 ph4):f1 1u (p1 ph6):f1 d1 242 . 19 sunt tmix = 2tBABA = 2τR # 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/dq-baba" .0) . astfel încât duratele implicate în Fig. Fiecare ciclu BABA conţine două perechi de pulsuri de 900 alipite între ele.durata perioadei de excitare/reconversie. având o separare între ele egală cu o jumătate de perioadă de rotaţie.cp (TopSpin 2.

ω3) corespunzătoare coerenţelor DQ care se generează între protoni aparţinând grupărilor (CH3. evoluează cu o frecvenţă egală cu suma deplasărilor chimice asociată spinilor. 20. Deosebirile sunt legate de faptul că în spectre 1H-1H DQ-MAS pot apărea şi peakuri diagonale. Eficienţa maximă s-a obţinut pentru o singură secvenţă BABA2. Concret. asemănările sunt legate de faptul că liniile de rezonanţă corespunzătoare spinilor 1H corelaţi.ω2). în dimensiunea indirectă (DQ). În spectrul DQ-MAS al L-alaninei acesta este cazul pakurilor de corelaţie (ω1. NH3). ωi+ωj. frecvenţa de evoluţie în dimensiunea DQ va fi de 2ωj.ω3) şi (ω2. dar şi deosebiri. NH3). unde am utilizat secvenţa BABA2. Analizând spectrul se constată şi similarităţi cu un spectru tipic INADEQUATE. dar şi din cauza tăriei mari a cuplajelor dipolare 1H-1H care permit evidenţierea corelaţiilor dintre protonii CH (ω2) aparţinând la două molecule vecine (corelaţii intermoleculare): în cazul peakurilor diagonale ωj. (ω1. de exemplu ωi şi ωj în dimensiunea directă.(p1 ph5):f1 go=2 ph31 wr #0 HaltAcqu. datorită multiplicităţii protonilor dintr-o anumită grupare chimică. (CH3. 243 . considerând cazul relativ simplu al spectrului de corelaţie 1H-1H înregistrat pe L-alanina (Fig. la o frecvenţă de rotaţie a probei în jurul unghiului magic de νR = 30 kHz. cum este cazul grupărilor CH3 (ω1) şi NH3 (ω3) în spectrul din Fig. CH). şi respectiv (CH. 20). 1m 1m if 1m in0 lo to 2 times td1 exit ph1= (4) 0 2 4 6 ph2= (4) 2 4 6 0 ph3= (4) 4 6 0 2 ph4= 0 ph5= 1 ph6= 3 ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0 ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2 Aplicaţiile practice ale metodei 1H-1H DQ-MAS vor fi ilustrate în continuare.

Prin comparaţie. şi anume 19 u.a.a în cazul grupărilor CH-NH3 cu distanţa intramoleculara de ~2.a. pentru coerenţele de două cuante generate între grupările CH-CH3. corespunde unor distanţe intranucleare mici. peakului diagonal (2ω1. care formează o reţea compactă de spini. care implică o distanţă intramoleculară de ~2.a. ω2).Figura 20: Spectrul RMN 2D de corelare 1H-1H DQ-MAS achiziţionat utilizând secvenţa BABA2 pe L-Alanina.6 Å.5 u. intensităţile sunt comparabile. o analiză riguroasă a intensităţilor relative ale peakurilor din spectrul 2D 1H-1H DQ-MAS ne poate conduce la 244 . intensitatea de ~ 4 u. ω1) a cărui intensitate în unităţi arbitrare este de 20 u.. Pentru cross-peakurile (ω1+ ω2. În primul caz. de ~1.3 Å între protonii grupării CH aparţinând la două molecule vecine din reţeaua cristalină a L-Alaninei. reflectă o distanţă semnificativ mai mare de ~2. Informaţii mai cantitative cu privire la distanţele internucleare dintre protonii din probă se pot obţine din analiza spectrelor 1H-1H DQ-MAS comparând intensităţile relative ale peakurilor de corelaţie. între protonii grupării CH3. ω2). De exemplu. În consecinţă.7 Å. şi respectiv de 18.3 Å. ω2) şi (ω3+ ω2. obţinută pentru peakul diagonal (ω2.

J.K. 5. Magn. 4. Introduction to High-Resolution Solid-State NMR. D.R. Spiess. J. S. V. 199 (2009) 173. 5. A. Narasimhaswami. SolidSate Nuclear Magnetic Resonance 35 (2009) 2-11 R.G.cuantificarea tuturor proximităţilor proton-proton din proba investigată. Demco. A. X. K. Filip. A. Filip. Tripon. Phys. Ernst. R. 245 .E. M. Emsley. 3. Gullion. S. Magn. G. Opella.W. Chem. Griffin. T. M. Lee. Tripon.. C. H. Magn. Feike. 9. Bodenhousen. Brown. 183 (2006) 68. Reson. Aluas. Graf. Ramamoothy. C. 7. Ramamoorthy. T.M. D.. Griffin. Hafner. Aluas. Lett. M. 408 (2005) 118-122. A. Filip. G.. Ladizhansky. De Paepe. J. 6. S. Oxford University Press. L. S. Reson A 109 (1994) 270-272. C. R. J. P. ChemPhysChem 5 (2004) 869-875. J. Oxford 1987 C. rezultând caracterul aplicativ al acestei metode în caracterizarea structurală a compuşilor moleculari în fază solidă. 8. Reson. Steuernagel. X. Wokaun. Madhu. Elsevier Science 2007 P. Principles of Nuclear Magnetic Resonance în One and Two Dimensions. A 122 (1996) 214. Filip. Reson. Wu.J. Magn. Lesage. 2. Bibliografie 1.H. C.

............... Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente ...................253 3. dr............ doar acele spectroscopii care au scala lungimilor apropiată frecvenţelor de rezonanţă caracteristice... 246 .................................................. Deoarece legăturile chimice sunt asociate cu valenţa ionilor şi structura moleculară. vor răspunde acestor efecte..... Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu .. În scopul facilitării activităţilor de practică experimentală pentru utilizarea acestor echipamente de ultimă generaţie. 1..... Prezentarea principiului tehnicii experimentale Rezonanţa magnetică nucleară este un fenomen ce apare atunci când nucleele de un anumit tip se găsesc într-un câmp magnetic static şi sunt expuse la un al doilea câmp magnetic.......... precum şi înţelegerea modului în care acestea funcţionează şi a rolului fiecărei părţi...265 În dotarea Facultăţii de Fizică a Universităţii Babeş-Bolyai din Cluj-Napoca se află două spectrometre de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) performante şi anume: .......... prezentăm mai jos protocolul de lucru pentru aceste echipamente.264 4......... Bibliografie .... Prezentarea principiului tehnicii experimentale ........... cunoaşterea părţilor componente ale unui spectrometru.......... O particularitate importantă asociată cu tehnica RMN este sensibilitatea sa la mediul chimic........................... Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară are loc în regiunea undelor radio şi este asociată cu tranziţiile energetice ale spinilor nucleari......spectrometrul Bruker Avance 400 cu câmp central de 9..........Rezonanţa magnetică nucleară pe sisteme lichide Lect........... oscilant..spectrometrul Bruker Avance 600 cu câmp central de 14 Tesla şi posibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a celor solide Utilizarea acestor spectrometre de către studenţii Facultăţii de Fizică presupune o stăpânire temeinică a noţiunilor şi principiilor de bază din RMN....................246 2......................................................4 Tesla şi posibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a celor solide ... Mihai Vasilescu Cuprins 1..............

ca orice metodă spectroscopică.63 0.53 24. Proprietăţi RMN ale unor nuclee într-un câmp de 9. Domeniul corespunzător pentru C13 este 25-150MHz. în experimentele de RMN. Astfel se pot obţine date despre unghiurile dintre legături şi lungimea legăturilor. câmpul efectiv din zona nucleului este influenţat şi de câmpurile locale interne. Aceste diferenţe mari ale frecvenţelor de rezonanţă (unele exemple sunt date în Tabelul 1) fac posibilă observarea nucleelor diferitelor elemente relativ independent unele de altele. Tabel 1. presupune reprezentarea grafică a unui bilanţ energetic. despre atomii învecinaţi (din prima şi a doua sferă de coordinare). precum şi despre procesele dinamice. câmpul magnetic este în domeniul 2.37 0. în diverse medii chimice. ele vor fi multe de acest fel.145 Rezonanţa magnetică nucleară.108 99.395 T: Izotop 1H 2H 13C 14N 15N 17O 31P 35Cl 37Cl 43Ca Frecvenţa RMN (MHz) 400 61 100 29 40 54 161 39 32 27 Abundenţa naturală (%) 99.Spectroscopia RMN dă date despre toate nucleele rezonante din sistem.037 100 75. Spectroscopia RMN este o metodă foarte utilă pentru studiul structurii locale şi a dinamicii constituenţilor compuşilor. Pentru 247 .3-14 T. Valorile frecvenţelor cu care se lucrează în RMN fac însă folosirea lor foarte anevoioasă.98 0. Cele mai importante interacţii sunt interacţia de deplasare chimică pentru toate nucleele şi interacţia cuadrupolară pentru nucleele cu I>1/2. Toate nucleele cu moment magnetic sunt capabile să ofere informaţii detaliate despre ordinea locală. alte posibile nuclee rezonante fiind excluse prin reglarea spectrometrului pe domeniul de frecvenţe de interes. Într-un spectru RMN pot fi înregistrate semnale de la un singur tip de nuclee. Pentru proton aceasta corespunde unor frecvenţe de rezonanţă între 100-600MHz. simetria locală şi numerele de coordinare. tipic.47 0. De obicei. care conţin informaţii specifice structurii locale.015 1. Pe lângă câmpul magnetic static.

acesta va fi un sistem de bobine acordate. aceasta nu se face prin parcurgerea domeniului de frecvenţe. de frecvenţă fixată.simplificare s-a ales ca primă soluţie folosirea unor etaloane. de obicei. Deplasările chimice întâlnite în RMN sunt. A doua abordare demonstrează chiar mai clar distincţia dintre rezonanţa magnetică nucleară şi alte spectroscopii şi exemplifică folosirea descrierii clasice a câmpului de radiaţie. Pentru a observa semnalele pot fi urmate două strategii. De obicei. De obicei. substanţe de referinţă. Baza experimentului de rezonanţă magnetică este plasarea probei într-un câmp magnetic uniform intens şi asigurarea iradierii ei cu un câmp electromagnetic printr-un sistem potrivit de emisie şi recepţie a frecvenţelor radio sau de microunde. Îngustimea extraordinară a liniilor RMN este cea care face ca efectele deplasărilor chimice mici să fie măsurabile şi utile. şi modificând câmpul magnetic principal. Prima este similară ca şi concepţie cu alte forme dispersive de spectroscopii şi implică o analiză (“sweep”) spectrală în care fiecare condiţie de rezonanţă posibilă (echivalentă absorbţiei) este căutată secvenţial. Această abordare este mai uşoară din punct de vedere tehnic şi are la bază ecuaţia: ω0 = -γB0 echivalentă cu parcurgerea frecvenţelor. ci prin iradierea cu un câmp electromagnetic slab. În aceste 248 . Pentru a urmări experimentul este necesar să folosim un sistem de coordonate care se roteşte cu frecvenţa Larmor ω0. Ulterior s-a recurs la un artificiu. a căror frecvenţă de rezonanţă să fie considerată nivelul zero al scalei energetice. Îngustimea liniilor în cazul lichidelor se datorează mişcării moleculare rapide [1]. acum reprezentându-se în loc de scală energetică propriu-zisă. dar a devenit rară în spectroscopia RMN. Acesta este cunoscut ca sistemul rotativ (“the rotating frame”). o scală a deplasărilor chimice date de formula: δ = ν −ν 0 ν0 Unitatea de măsură pentru deplasările chimice este "partea per milion" sau "ppm". Această abordare este adesea utilizată în RES. de ordinul zecilor sau sutelor de ppm. ea fiind rezultatul energiei foarte joase implicate în experimentele RMN. pentru rezonanţa magnetică nucleară.

care este direcţia câmpului magnetic principal. Dacă radiaţia electromagnetică este de aceeaşi frecvenţă cu frecvenţa Larmor. (c) Magnetizarea după un puls de 900. Figura 1. în mod clar. aplicăm un puls cu durata jumătate. Când aplicăm B1 magnetizarea răspunde precesând în jurul lui B1 cu o frecvenţă ω1 dată de: ω1 = .condiţii magnetizarea nucleară poate fi descrisă de un vector paralel cu direcţia z. (b) Magnetizarea după un puls de 1800. Radiaţia electromagnetică este descrisă de componenta sa magnetică ca un vector la un anumit unghi faţă de direcţia câmpului. După un “puls de 180” sensul magnetizării se inversează complet. Revenirea la echilibru este caracterizată de un timp. Situaţia este ilustrată în figura 1(a) [2]. T1. În sistemul rotativ. Aceasta corespunde unei inversii a populaţiei nivelelor energetice şi este.γ B1 Unghiul la care se mişcă magnetizarea este θ.γ B1 t aşa că magnetizarea poate fi înclinată la orice unghi doar prin simpla aplicare a unui puls electromagnetic de putere şi durată cunoscute. atunci va părea statică în sistemul de coordonate astfel ales. (a) Magnetizarea (M0) în sistemul rotativ în prezenta câmpului de radiofrecvenţa (B1). dat de: θ = ω1 t = . atunci magnetizarea se roteşte cu 90 de grade în planul x’y’. Dacă. Figura 1(b) ilustrează acest proces pentru un unghi de 1800. B0 poate fi ignorat şi este necesar doar să considerăm efectele câmpului de radiaţie. o situaţie de non-echilibru. În această situaţie fiecare vector nuclear individual (vectori care sunt însumaţi pentru a da magnetizarea macroscopică) 249 . B1. cunoscut ca timp de relaxare spin-reţea sau timp de relaxare longitudinală. cunoscut ca plan transversal (fig 1c). în loc să aplicăm un puls de 180.

sistemul începe să se relaxeze. numit relaxare spin-spin sau transversală. oscilează cu o frecvenţa egală cu diferenţa dintre frecvenţa de referinţă şi frecvenţa de rezonanţă a semnalelor deplasate. Efectele de câmp aleatoare. numit timp de relaxare spin-spin sau timp de relaxare transversală. Acest proces. FID) şi poate fi transformat într-un spectru printr-un proces matematic cunoscut sub numele de transformare Fourier. Există o relaţie importantă între relaxarea transversală şi lărgimea liniei. (b). Semnalul obţinut prin relaxare se referă de obicei la relaxarea liberă a magnetizării (free induction decay. este ilustrat în figura 2. ν½ . atunci setul de spini nucleari. corespunzând liniilor deplasate. (a). care vor face ca vectorii nucleari individuali să se mişte cu viteze diferite faţă de viteza sistemului rotativ. Figura 2. Pentru o descreştere exponenţiala spre echilibru. prin: 250 . Pe măsura trecerii timpului suma vectorilor se va reduce la zero. vor produce variaţii aleatoare ale frecvenţei Larmor.este forţat de câmpul de radiaţie să se rotească coerent cu frecvenţa Larmor ω0. (c) şi (d) arată evoluţia în timp după un puls de 900. Acolo unde avem un număr de rezonanţe deplasate se obţine un semnal oscilator complicat al relaxării. această relaxare poate fi adesea caracterizată ca un proces exponenţial cu constanta de timp T2. Cum aceste câmpuri sunt aleatoare. Acest proces este ilustrat în figura 3. Când apar deplasarea chimică (“chemical shift”) sau rezonanţele cuplate scalar. vom avea tot atâtea nuclee ce se mişcă mai rapid ca şi numărul celor ce se mişcă mai lent. dependente de timp. Imediat după ce aplicarea pulsului încetează. În lichide. Relaxarea transversală – fiecare săgeată reprezintă un vector magnetizare nucleară. T2 este legat de lărgimea liniei la jumătatea înălţimii peak-ului.

toate frecvenţele sunt excitate în mod 251 . Transformarea Fourier a unui FID (a) într-un spectru (b) Tehnica transformării Fourier. În multe cazuri. cu atât linia observată este mai largă. cu cât relaxarea se produce mai rapid. respectând condiţia ca pulsul excitaţiei să acopere o lărgime de bandă potrivită. intensitate (a) timp (b) frecventa Figura 3.ν½ = 1/(πT2) de aceea. care este acum metoda aleasă în cele mai multe experimente RMN. Principiul unei astfel de metode este ca. este un exemplu de metodă multiplex. din cauza lărgimii liniei deplasarea chimică sau informaţiile privind cuplajul sunt obscure sau chiar pierdute.

atunci când se fac analize pe alimente. unde apa este adesea componentul majoritar şi poate domina spectrul. A doua problemă este direct legată de avantajul multiplexului. aceasta limitează metoda transformatei Fourier la doar un grup restrâns de sisteme. În cazul RES. iar partea iniţială a semnalului este distorsionată de revenirea sistemului de recepţie după pulsul de radiaţie. În RMN pot apare dificultăţi cu semnalele solidelor. Vedere generala asupra spectrometrului 252 . un semnal foarte intens în anumite părţi ale spectrului va creşte intensitatea tuturor punctelor din FID. Deoarece N este de obicei mii sau zeci de mii. În aceste condiţii s-ar putea să fie avantajoasă folosirea metodei CW cuplată cu tehnici de scanare rapidă. acest avantaj este foarte consistent. Ca rezultat al acestei metode. Metoda transformatei Fourier nu este însă lipsită de probleme. de interes. avantajul semnal/zgomot al metodei transformatei Fourier asupra metodei CW pentru acelaşi timp de achiziţie este N unde N este numărul de frecvenţe. atunci contribuţia semnalelor mici poate fi pierdută cu totul. de exemplu. Ca o consecinţă.egal şi toate contribuie la toate punctele din FID. în metoda undelor continue (continous wave. Dacă aceasta este foarte scurtă. CW tinde să fie mult mai lentă decât metoda transformatei Fourier. CW) frecvenţele sunt excitate secvenţial. În cazuri ideale. Aceasta poate fi o problemă importantă în spectrele RMN pentru protoni. Dimpotrivă. Figura 4. atunci liniile spectrale sunt foarte largi şi digitizarea devine o problemă. pot apărea probleme cu digitizarea semnalului. Dacă nu avem o rezoluţie suficientă în convertorul analog – digital. Cum toate frecvenţele contribuie la fiecare punct. cu linii foarte înguste. vor avea doar o mică contribuţie la FID. deoarece semnalele mici. Prima este durata FID-ului.

Analizele se fac utilizând recipienţi speciali pentru analize RMN. Secţiune schematică printr-un magnet RMN 2. anume a izotopilor 1H şi 13C. bobine helmholtz • heliu lichid (T = 4. 253 . Dizolvarea probelor se face în solvenţi deuteraţi. eprubete de quartz de 5 mm diametru. bobina. Interpretarea acestor spectre ne permite identificarea structurii probelor analizate. spectrometrul realizând fixarea câmpului cu ajutorul nucleelor de deuteriu.4 K) • straturi termoizolante şi ecranante • orificiu central vertical (îngust sau larg) Figura 5. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu Cel mai adesea analizele probelor lichide se concentrează pe studiul spectrului RMN corespunzător nucleelor de hidrogen sau carbon.2 K) • straturi termoizolante şi ecranante • azot lichid (T = 77.Magnetul • cea mai scumpă parte a spectrometrului • electromagnet din fire supraconductoare • câţiva km de fir • solenoid.

solvenţii au şi rol de referinţă. respectiv triplet la 77. Astfel: • CDCl3 (cloroform deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 7.032 ppm pentru 13C.512 ppm pentru 1H.78 ppm pentru 1H. respectiv 39. respectiv 30 ppm şi 206 ppm pentru 13C. • TMS (tetrametilsilandeuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 0 ppm pentru 1H. Proba: ciclohexan (C6H12) . respectiv 128. Solvent: CDCl3 Figura 7. Solvent: CDCl3 254 . respectiv 0 ppm pentru 13C şi 0 ppm pentru 29Si. • D2O (apa deuterată) are frecvenţa de rezonanţă de 4. • C6D6 (benzen deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 7.01 ppm pentru 13C.156 ppm pentru 1H.26 ppm pentru 1H.47 ppm pentru 13C. Proba: benzen (C6H6).16 ppm pentru 1H.În acelaşi timp. Redăm mai jos şi câteva exemple de analize 1H NMR pe probe relativ simple [3]: Figura 6. • C3D6O (acetona deuterata) are frecvenţa de rezonanţă de 2. • DMSO (dimetilsulfoxid deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 2.

Proba: toluen (C6H5CH3). Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3). Solvent: CDCl3 Figura 10. Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) . Solvent: CDCl3 255 .Figura 8. Solvent: CDCl3 Figura 9.

Solvent: CDCl3 Figura 12. Proba: apa (H2O) . Proba: etanol (CH3CH2OH) . Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3). Solvent: D2O Figura 13.Figura 11. Solvent: CDCl3 256 .

Figura 14. Proba: etanol (CH3CH2OH). Solvent: D2O Figura 15. Solvent: CDCl3 257 . Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH). Solvent: CDCl3 Figura 16. Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH).

Solvent: CDCl3 Figura 18.Figura 17. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ). Proba: t-butanol ((CH3 )3COH). Solvent: CDCl3 Figura 19. Proba: piridina (C5H5N). Solvent: CDCl3 258 .

Senzitivitatea spectrometrului RMN este o măsură a numărului minim de spini detectabili. în timp ce protonii grupării legate de CH2 dau semnal despicat (n+1). aşa cum se vede în figura 20: Figura 20. în general. deci triplet. senzitivitatea este îmbunătăţită de creşterea câmpului magnetic utilizat [5]. Redăm mai jos şi câteva exemple de analize 13C NMR pe probe relativ simple: 259 . Solvent: CDCl3 Raportul relativ al celor trei integrale este 2:3:3. Informaţii suplimentare se obţin dacă calculăm integralele liniilor de rezonanţă. diferenţa de populaţie poate fi crescută prin scăderea temperaturii probei. acestea reprezentând de fapt intensitatea relativă a semnalelor şi fiind. Pentru a identifica semnalele celor doua grupări CH3 vom ţine cont de faptul că protonii grupării legate de C=O dau semnal simplu (singlet). Analizele de tip 13C NMR vor utiliza diferite metode ce conduc la îmbunătăţirea semnalului RMN. corespunzător numărului de protoni legaţi de fiecare dintre nucleele de carbon. proporţionale cu numărul de nuclee care produc semnalele respective. identificarea corespondenţei celor trei semnale de rezonanţă este completă. Astfel. Cum semnalul RMN creşte odată cu creşterea diferenţei de populaţie dintre nivelele energetice. Integrarea semnalelor pentru proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3). De asemenea.Pentru aceste exemple identificarea corespondenţei între semnalele de rezonanţă şi poziţia protonilor în moleculă se face relativ simplu.

Solvent: CDCl3 Figura 23. Proba: ciclohexan (C6H12) . Proba: toluen (C6H5CH3). Solvent: CDCl3 260 . Proba: benzen (C6H6).Figura 21. Solvent: CDCl3 Figura 22.

Figura 24. Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3). Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3). Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) . Solvent: CDCl3 Fiurag 26. Solvent: CDCl3 261 . Solvent: CDCl3 Figura 25.

Figura 27. Solvent: D2O Figura 29. Solvent: CDCl3 262 . Proba: etanol (CH3CH2OH). Proba: etanol (CH3CH2OH) . Solvent: CDCl3 Figura 28. Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH).

Solvent: CDCl3 263 . Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH). Proba: t-butanol ((CH3 )3COH). Solvent: CDCl3 Figura 32. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ).Figura 30. Solvent: CDCl3 Figura 31.

4Tesla şi posibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a celor solide. 3. Proba: piridina (C5H5N). la nevoie se încălzeşte uşor eprubeta pentru a facilita dizolvarea. se află spectrometrul de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) Bruker Avance 400 cu câmp central de 9. • se dă comanda „lift on” de la BSMS pentru a crea perna de aer pentru eprubeta. • se agită pentru dizolvarea probei.4 grame proba).01 ppm. 264 . Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente În dotarea Facultăţii de Fizică a Universităţii Babeş-Bolyai din Cluj-Napoca.Figura 33. specială pentru analize RMN. acolo unde s-a utilizat ca solvent CDCl3. Solvent: CDCl3 În toate spectrele de mai sus. • se pune eprubeta în suportul special: • se aşează eprubeta cu suportul în dispozitivul special de reglaj al distanţei şi se aşează eprubeta astfel încât ulterior proba să fie în centrul câmpului magnetic. Etapele înregistrării spectrului RMN pe probe lichide la spectrometrul Bruker Avance 400 din dotarea laboratorului: • se ia o eprubeta de 5 mm diametru. peste probă.5 ml solvent). până când coloana de lichid are aproximativ 4 cm înălţime (circa 0. • se pune solventul în eprubetă.1-0. utilizabil pentru analiza probelor lichide. semnal foarte util şi pentru a calibra spectrul în funcţie de referinţă. se observă şi semnalul corespunzător solventului la 77. curată • se pune proba în eprubetă (circa 0.

făcându-se automat corecţiile variaţiilor externe. Chapman and Hall.edu/htbooks/nmr/ Mihai Vasilescu. p. Vol. Anterior înregistrării unui spectru este posibil ca parametrii de achiziţie să necesite o optimizare. se dă comanda „lock” şi se alege solventul potrivit. Joseph P.se aşează eprubeta pe perna de aer. 2. funcţie de structura moleculară. • se fazează corespunzător. NMR Basic Principles and Progress. la nevoie se modifică şi Z3. Annual Reports on NMR Spectroscopy. Introduction to Magnetic Resonance. Grimmer and B. 4. Blumich. Vol. • se dă comanda „efp” pentru a trece din semnal timp (FID) în semnal frecvenţa (spectru). se centrează semnalul de „lock” în fereastra de control a BSMS-ului. 5. Hornak. se dă comanda „lift off” şi proba coboară în magnet. • • • • 4. X sau Y. R. 3. Bibliografie 1. • se realizează reglajele de „shimm” făcând corecţiile necesare de la BSMS. Teza de doctorat. Z4. marcând peak-urile de rezonanţă.cis. • se dă comanda „wobb” şi din şuruburile speciale ale capului de sondă se reglează frecvenţa de rezonanţă pentru nucleul studiat. p. • se realizează măsurătoarea efectivă alegând un număr de achiziţii potrivit pentru obţinerea unui raport semnal/zgomot suficient de bun. modificând în principal câmpurile Z1 şi Z2. (1995). (1994). 1-60. http://www. 31. • se alege programul de pulsuri dorit şi nucleul pe care se doreşte realizarea analizei RMN.S. măsurând integrala lor şi atribuind în final semnalele nucleelor. Academic Press. A. McLachlan. 2007 Carrington. P. • se analizează spectrul. • se setează parametrii de achiziţie. deci câmpul va fi fixat şi stabilizat.rit. London (1967) 265 . 1-18. spectrometrul va intra în modul „lock”.D. Belton. 30. Aceasta se realizează cu comanda „popt” şi se referă în general la setarea duratei pulsului de excitare (p1) şi respectiv a timpului de relaxare dintre două achiziţii consecutive (d1). • se calibrează spectrul în funcţie de referinţa aleasă.

• puritatea şi compatibilitatea materialelor. • capacităţi calorice. de-vitrificare etc. cristalizare. MĂSURĂTORI TERMICE Analiză termică diferenţială.. reducerea. constantele de material detectabile sau măsurabile prin analiza termică sunt: • comportarea materialelor la topire.C. răcire. cristalizare. Fenomenele fizice şi chimice. • căldurile de topire. tratamente izoterme. • re-cristalizarea sticlelor metalice etc. etc. dr. Metodele de analiză termică diferenţială reprezintă varianta modernă a metodelor clasice de investigare a efectelor termice induse de variaţia temperaturii unui corp fiind pentru prima dată folosite de către W. Raluca Ciceo-Lucăcel Analiza termică a materialelor acoperă o categorie largă de metode prin care sunt determinate proprietăţile fizice şi chimice ale acestora. sublimare. fierbere. de reacţie etc.VII. în funcţie de temperatură sau timp pe baza efectelor termice care însoţesc transformările din probă în timpul supunerii acesteia la procese de încălzire. descompunerea. • tranziţii vitroase ale solidelor ne-cristaline. hidratarea – dehidratarea etc. Analiză calorimetrică diferenţială Conf. • temperaturile caracteristice ale transformărilor de fază. • cinetica reacţiilor şi a formării fazelor.Robert Austin în anul 1899. Termenul de “metoda diferenţială” provine de la fap266 ... călduri specifice. • oxidarea. • coroziunea metalelor în diferite atmosfere.

3. Programatorul de temperatură.tul că aceste tehnici permit determinarea diferenţelor dintre variaţiile unor mărimi fizice ale probei în raport cu cele ale unui etalon. 1. DTA poate fi folosită si pentru a studia proprietăţile termice şi transformările de faze care nu se produc cu modificarea entalpiei materialului. Suportul pentru probe conţinând termocuplurile şi containerele pentru probe plasate într-un bloc ceramic sau metalic. concomitent înregistrându-se continuu temperatura cuptorului T şi diferenţa de temperatură ΔT (la metodele DTA) sau de flux termic Δ (dQ / dτ ) (la metodele DSC) care apare între probă şi materialul de referinţă. Suprafaţa de sub aria curbei este proporţională cu modificarea entalpiei şi nu depinde de capacitatea calorică a probei. 1) sunt: 1. metoda constă în încălzirea sau/şi răcirea în condiţii identice a unei probe şi a unui material de referinţă inert din punct de vedere termic. Principalele componente ale unui sistem termic diferenţial Principalele componente ale unui sistem termic diferenţial (Fig. Linia de bază a unei înregistrări DTA prezintă astfel discontinuităţi la temperaturile de tranziţie. Cuptorul. Graficele obţinute în urma determinărilor se numesc curbe de analiză termică sau termograme. De aceea.[2] Figura. [1] Concret. 267 . iar panta curbei în orice punct va depinde de microstructura probei la temperatura respectivă. Analiza termică diferenţială (DTA) este suficient de sensibilă pentru a determina variaţii foarte mici de temperatură şi este capabilă să sesizeze transformările lente ce se produc în intervale largi de temperatură. 2.

nu de temperatură.4. 5. respectiv pozitivă a axei X. Efectul termic care se produce în cazul unei tranziţii termice sau a unui proces fizico-chimic este înregistrat ca diferenţă de flux caloric între probă şi referinţă şi la rândul lui este tradus în semnal electronic. 2). în scopul menţinerii unei atmosfere inerte în cuptor (pentru inhibarea oxidării probei. Sistemul de înregistrare.conform IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). eliminarea volatilelor şi asigurarea unui transfer termic cât mai bun). Orice proces endoterm sau exoterm (cum ar fi topirea sau cristalizarea) care are loc în probă la încălzire este înregistrat ca un peak în direcţia negativă. amplificat şi 268 . Figura. pe care este reprezentată diferenţa de temperatură (semnalul DTA) (Fig. Termenul calorimetrie se referă exclusiv la măsurarea căldurii. 2 Schema idealizată a unei curbe DTA Calorimetria dinamică diferenţială (DSC) este o tehnică în care diferenţa de energie dintre o substanţă (şi/sau produşii de reacţie) şi un material de referinţă este măsurată ca funcţie de temperatură (sau timp) în timp ce substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse unui program de temperatură controlat . Căldura poate fi o cantitate de energie schimbată sub forma unui flux de căldură între două corpuri într-un interval de timp. Sistemul de furnizare a gazelor. Calorimetrele cu baleiaj diferenţial sunt tehnici îmbunătăţite ale DTA (analiza termică diferenţială) în sensul că ele au fost calibrate pentru măsurători de energie calorică.

Figura. drept pentru care linia serveşte ca şi referinţă şi este numită linie de bază. fluxul diferenţial de căldură de la cuptor spre probă şi referinţă este măsurat pe căi complet diferite.apoi prelucrat de componenta software a instrumentului. iar „power compensated” DSC transformă această diferenţă de temperatură în puterea calorică necesară restabilirii echilibrului termic dintre probă şi referinţă. Sistemul „heat flux” DSC înregistrează diferenţa de temperatură între probă şi referinţă care apare în cursul unei transformări fizico-chimice. 269 . Faţă de această linie se vor măsura intensitatea şi temperatura la care se manifestă procesele termice din probă. 3 Tipuri de procese care pot apărea într-o înregistrare DSC Există două tipuri de tehnici DSC utilizate în analizele termice: • calorimetre DSC cu flux de căldură („heat flux” DSC). Deşi în ambele tipuri semnalul măsurat reprezintă diferenţa de temperatură generată de senzori. Semnalul măsurat redat în termograma DSC este direct proporţional cu capacitatea calorică a probei. Dacă proba de analizat nu suferă o transformare fizico-chimică sau o tranziţie termică. În continuare vom prezenta pe scurt câteva detalii pentru fiecare tehnică in parte. Înregistrarea se redă sub forma unei curbe numită termogramă DSC care reprezintă o dependenţă a fluxului caloric măsurat funcţie de temperatură (analiză în regim dinamic) sau timp (analiză în regim izotermal). atunci semnalul DSC va arăta ca o linie dreaptă. astfel că orice diferenţă ce apare în capacitatea calorică a probei conduce la modificarea termogramei DSC. 3). Schematic este prezentată o termogramă DSC în care linia de bază prezintă multiple modificări datorate proceselor şi tranziţiilor termice din probă (fig. • calorimetre DSC cu compensarea puterii calorice („power compensated” DSC).

Dacă în probă au loc transformări de fază sau alte procese care se produc la o anumită temperatură. 4. 5) – măsoară diferenţa de flux termic proba-etalon indirect. iar în grafic apare o deviere de la linia de bază sub forma unor peak uri endoterme sau exoterme. iar graficul înregistrează aşa-numita linie de bază în funcţie de timp sau temperatură. este controlată în timp ce se înregistrează diferenţa de temperatură dintre cele două. prin diferenţa de putere electrică introdusă în rezistenţele de încălzire aşezate în imediata vecinătate a probei şi etalonului. Căldura transportată la probă şi referinţă printr-un platan din argint sau constantan. Semnalul măsurat este folosit ulterior la măsurarea diferenţei de flux de căldură. Dacă în cuptor fluxul de căldură este echilibrat. Figura. 270 . care este convertită în flux de căldură printr-o construcţie specială (Fig. Schema de principiu a metodei heat flux DSC Power compensated DSC (Fig. care este şi parte integrantă a sistemului de înregistrare a temperaturii. se modifică gradientul de temperatură al probei faţă de etalon. Proba şi referinţa sunt menţinute la aceeaşi temperatură printr-un sistem electric format din două rezistenţe de încălzire. 4). diferenţa de temperatură este zero. pentru a menţine diferenţa de temperatură zero. în funcţie de tipul procesului.Heat flux DSC – măsoară diferenţa de temperatură dintre probă şi etalon.

5. Principalii astfel de factori de influenţă sunt [3]: 1. însă pot apărea suprapuneri de peak-uri. Materialele ceramice utilizate la confecţionarea locaşurilor sunt 271 .Figura. La viteze de încălzire mai mari efectele termice sunt evidenţiate mai bine. Din punct de vedere experimental. La o viteză mai mică efectele termice au loc la temperatură mai joasă. Semnalul electric dat de diferenţa de putere dintre cele 2 rezistenţe este proporţional cu diferenţa de flux termic şi este înregistrat sub forma curbei de analiză termică. Influenţa vitezei de încălzire asupra curbelor se explică prin aceea că odată cu creşterea ei creşte şi cantitatea de produşi sub formă de gaz care generează o diferenţă de temperatură mai mare între probă şi cuptor. Viteza de creştere sau descreştere a temperaturii în cuptor: viteza de încălzire afectează înălţimea şi lăţimea efectelor termice înregistrate de curbele DTA şi DTG. există o serie de factori care influenţează în mod direct efectele termice analizate şi implicit forma termogramelor. pentru ca temperatura probei să nu difere de cea a referinţei se cuplează sau decuplează rezistenţa de încălzire a acesteia până la egalizarea temperaturilor. cu peak-uri mai înguste.sau endoterm). Schema de principiu a metodei power compensated DSC Dacă în probă are loc un proces (exo. 2. metalele nobile şi seminobile. oţelul inoxidabil la temperaturi înalte. dar peak-urile înregistrate sunt mai largi. Rolul formei şi al materialului din care este format locaşul pentru probe Materialele folosite la construcţia locaşelor sunt de două categorii: metalice sau ceramice. Metalele cele mai frecvente utilizate le temperaturi înalte sunt nichelul.

pe cât posibil. Un alt dezavantaj este acela că datorită structurilor poroase. în anumite cazuri. Dar dezavantajul lor este că intensitatea efectelor termice tinde să fie mică. cu probele descoperite. din cauză că transferul de căldură are loc încet prin pereţii lor. s-au impus două tendinţe: utilizarea locaşurilor în formă de blocuri şi utilizarea locaşurilor în formă de creuzet. În ceea se priveşte forma locaşelor pentru probe. sticle rezistente la temperatură şi. în cazul când în probă se află un compus care se topeşte. fapt ce denaturează foarte mult forma curbelor termice. iar suprafeţele efectelor termice sunt mai mici (cu excepţia oxidărilor). 5. Locaşurile metalice. fără ca această variaţie să aibă prea mare influenţă asupra rezultatelor. de multe ori.2 şi 1g. au avantajul că pot fi mult mai uşor de confecţionat. Influenţa gradului de mojarare a probei: cu cât granulaţia probei este mai mică cu atât temperaturile de descompunere sunt mai joase. aşezarea lor în cuptor este dificilă din cauza faptului că au o slabă conductibilitate termică iar atunci trebuie foarte bine centrate. deci ale liniei de bază a curbei DTA. nu sunt poroase şi dau mici deviaţii ale fluxului de căldură. argilă arse. pe de altă parte.alumină cu adaus de silice. Rolul acoperirii sau descoperirii probei Acoperirea probei poate să ajute. Densitatea sau gradul de tasare a probei în locaş: diferenţele în densitatea sau gradul de tasare a probei în locaş sunt cauzele cele mai obişnuite ale devierilor de la linia de bază a curbei DTA. Cum ar fi. din cauză că transferul de căldură care are loc se face rapid prin pereţii lor şi între aceşti pereţi şi masa probei. 3. ele pot influenţa forma efectelor termice sau să se impurifice. Cantitatea de probă luată în lucru: greutatea probei luată în lucru poate să varieze între 0. 4. Locaşurile ceramice. Cu toate acestea este bine să se lucreze. grafitul. dau efecte termice cu intensităţi mari. în decursul timpului. Dar au şi acestea dezavantajele lor . 6. care sunt mai frecvent utilizate. Această precauţie de a se lucra cu proba descoperită se ia pentru a nu influenţa admisia şi emisia gazelor şi a vaporilor de apă care însoţesc reacţiile termice şi care dacă ar fi într-un sistem închis ar duce la suprimarea unor reacţii. în timpul procesului termic. Cantitatea de probă ce trebuie luată în lucru este de 272 . la obţinerea unei linii de bază a curbei DTA sub forma unei linii drepte sau prin acoperirea probei se protejează unele reacţii violente ca de exemplu: fierberile sau descompunerile în urma cărora ar ieşi o cantitate de probă afară din locaş. pentru aceeaşi cantitate de material reactant ca şi în cazul celor metalice.

cu o rată de încălzire a cuptorului de 5-10ºC/min (uzual) în domeniul maxim de temperatură de la 23 ºC (sau temperatura camerei) până la 1600 ºC. 8. Se lucrează în atmosferă de azot şi aer la un flux de 70 ml/min. 9. Cele mai bune materiale inerte sunt acelea care au aceeaşi conductivitate termică ca şi materialul de cercetat. comparativ cu această substanţă termică inertă. Pentru temperaturi cuprinse între 100-2200˚C se folosesc termocuple confecţionate dintr-un fir de Pt şi celălalt dintr-un aliaj de Pt cu rodiu. sudaţi la un capăt între ei şi care au proprietatea ca prin încălzire la locul sudurii să dea naştere unui curent electric proporţional cu cantitatea de căldură aplicată. Institutului de Cercetări Experimentale Interdisciplinare în Bio-Nano-Ştiinţe deţine două aparate performante destinate analizelor termice.8 mm x h: 2. Măsurătorile de analiză termică diferenţială se realizează cu un derivatograf termic Shimadzu tip DTG-60/60H. între 100-800˚C se pot folosi termocuple confecţionate din aliaje speciale de Ni şi Cr. Materialul de referinţă şi probele de analizat sunt puse în celule standard din alumină (având dimensiunile Ø: 5. Acţiunea atmosferei din cuptor asupra desfăşurării reacţiilor: oricare ar fi procedeul experimental de reglare a presiunii din cuptor.obicei determinată de sensibilitatea aparaturii şi de intensitatea proceselor termice care au loc în substanţa cercetată. Materialul de referinţă şi probele de analizat sunt puse în celule standard din 273 . oricare ar fi materialul folosit. fiecare. Măsurătorile de analiză calorimetrică se realizează pe un calorimetru diferenţial Shimadzu tip DSC-60. Substanţa termică inertă. presiunea trebuie menţinută constantă pe tot parcursul determinărilor. Termocuplele ideale sunt cele constituite din metale nobile. În analiza termică se foloseşte o substanţă termică inertă în vederea determinărilor fenomenelor care au loc la încălzirea unui produs solid. 7. el trebuie să aibă aceeaşi mărime granulară şi să se ia aceeaşi cantitate în lucru ca şi proba de cercetat. Natura şi proprietăţile termocuplelor: un termocuplu este format din doi conductori de compoziţie diferită. dar.5 mm). care sunt rezistente la atacul termic şi au o durată de utilizare lungă în comparaţie cu cele confecţionate din metale inferioare. Alegerea substanţei termice inerte este foarte importantă.

Bucureşti. Centre de Cercetare partenere. Michael E. Informaţii importante privind proprietăţile termice ale unor materiale. 2.5 mm). Analiza termică a mineralelor. Ed. 2001. cercetătorilor din UBB sau din Universităţi. masteranzilor. dizertaţie . Tehnică. Presa Univ. Fizica Materialelor. doctoranzilor. Rata de încălzire a cuptorului este de 5-10ºC/min (uzual).8 mm x h: 1.. 2001. Ed. Introduction to thermal analysis: techniques and applications. 3. I. camerei) până la 600ºC. Bibliografie 1. O baie de azot lichid permite determinări la temperaturi scăzute (de la -150ºC). Brown.Pop. Clujeană.aluminiu Se lucrează în atmosferă de azot şi aer la un flux de 70 ml/min fiecare (având dimensiunile Ø: 5.Metode Experimentale. 1972. Second edition. Accesul la aceste aparate este deschis tuturor studenţilor. Jumate. Todor D. în domeniul maxim de temperatură 23ºC (sau temp. N. 274 .N. Chicinaş. Kluwer Academic Publishers. teze de doctorat si lucrări ştiinţifice cotate ISI (anexa I). Cluj Napoca. cadrelor didactice. V. obţinute prin măsurători efectuate la ICIBNS se regăsesc în o serie de lucrări de licenţă.

............................. Ghid de utilizare a aparatelor de analiză termică diferenţială şi analiză calorimetrică diferenţială....... Graficele obţinute în urma determinărilor se numesc curbe de analiză termică sau termograme. 275 2...................... camerei – 1500ºC • Acurateţea balanţei: ± 1% • Detectorii: termocuplu de Pt plus 10% Pt/Rh 275 ......... 285 1................... care prezintă pe abscisă timpul sau temperatura iar pe ordonată diferenţa de temperatura probă-referinţă (la DTA) sau diferenţa de flux termic (la DSC).... dr..............Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termică diferenţială si analiză calorimetrică diferenţială. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC ... Raluca Ciceo-Lucăcel Cuprins 1......... Analiza termică diferenţială simultan (DTA/TG) – aparat Shimadzu tip DTG-60/60H cu termogravimetria Specificaţii aparat: • Intervalul de temperatură pe care se pot face măsurători: temp........................ raportat la cele două aparate de măsura existente în cadrul Institutului de Cercetări Interdisciplinare în Bio-Nano-Ştiinţe.................... în încălzirea sau/şi răcirea în condiţii identice a unei probe şi a unui material de referinţă inert din punct de vedere termic.... Bibliografie ...... Ghid de utilizare a aparatelor de analiză termică diferenţială şi analiză calorimetrică diferenţială Metodele termice diferenţiale constau............ concomitent înregistrându-se continuu temperatura cuptorului T şi diferenţa de temperatură ΔT (la metodele DTA) sau de flux termic Δ (dQ / dτ ) (la metodele DSC) care apare între probă şi materialul de referinţă............. 279 3... ca principiu............................ În cele ce urmează sunt prezentaţi paşii necesari efectuării măsurătorilor DTA/TG şi DSC... Cluj Napoca.... Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG si DSC Conf.............

Se apasă o dată pe tasta [DISPLAY] când ecranul digital al aparatului afişajează valoarea masei. 4. Se deschid aparatele şi se aşteaptă 30 min pentru a permite gazelor să formeze o atmosferă inertă în cuptor. 8. Se deschide cuptorul apăsând tasta [OPEN/CLOSE]. • Se lucrează în atmosferă de aer şi azot la un flux de ~ 50-70 ml/min. Se pregătesc două creuzete curate: unul pentru proba de referinţă (α-alumina) altul pentru proba de analizat. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura atmosfera în cuptor. 6. iar creuzetul gol pe suportul din partea dreaptă. Se deschide cuptorul apăsând pe tasta [OPEN/CLOSE] de pe afişajul digital al aparatului. Se apasă tasta [OPEN/CLOSE] de pe afişajul digital al aparatului pentru a închide cuptorul.• • • Interval măsurabil semnal DTA: ± 1 la ± 1000 µV Nivel de zgomot: < 1µV Materialul de referinţă (α-alumina) şi proba de analizat se pun în cellule standard din alumină (având dimensiunile Ø 5. Se pune creuzetul cu materialul de referinţă pe suportul din partea stângă. • Rata de încălzire a cuptorului: 0. 1 g Paşi în efectuarea unei măsurători DTA: 1. apoi se apasă tasta [ZERO] pentru aducerea la valoarea zero a balanţei.5 mm). 3. 7. 5.1÷50.8 mm x h 2.0ºC/min pe un domeniu de temperatură de la temperatura camerei (minim) până la 1500 ºC (maxim). Se aşteaptă un timp pentru stabilizarea semnalului. • Cantitatea de probă folosită: max. 2. se ia creuzetul 276 .

identificare temperaturi evenimente termice etc. camerei – 500ºC sau minus 150ºC – 500ºC când se foloseşte baia de azot lichid. Analiza datelor (pierderi de masă.gol de pe suport şi se pune în el o cantitate optimă de probă. Aparatul este conectat la un sistem de purjare a unui gaz inert (în cazul de faţă azotul) care asigură o atmosferă inertă pentru protejarea probelor la oxidare. ca şi greutatea probei. 12. care se aduce la zero prin apăsarea tastei [ZERO]. Pornirea măsurătorii se face cu butonul [Start]. unde se poate alege numele fişierului şi directorul unde va fi salvat. ecranul digital al aparatului afişează valoarea semnalului DTA. Analiza calorimetrică (DSC) – calorimetru diferenţial Shimadzu tip DSC-60. fişierul de analiză fiind salvat automat în directorul specificat. Dacă se doreşte oprirea măsurătorii înainte de finalizarea programului stabilit se apasă butonul [STOP]. Oprirea măsurătorii se face în condiţii normale. 13. dar şi la un sistem de gaz care asigură evacuarea elementelor volatile. 11. 10. asistarea transferului de căldură şi protejarea detectorilor (în cazul de fază aerul). 9. Se închide cuptorul.) se poate face din programul de analiză TA60 care permite asemenea prelucrări ale termogramelor ca şi convertirea şi salvarea datelor în format text pentru prelucrări ulterioare în alte tipuri de programe de prelucrare date. Valoarea afişată după stabilizarea semnalului TG reprezintă masa de probă. Specificaţii aparat: • Intervalul de temperatură pe care se pot face măsurători: temp. Se deschide programul de analiză al aparatului. • Interval măsurabil semnal DSC: ± 40 mW • Nivel de zgomot flux de căldură: < 1µW 277 . TA-60WS Collection Monitor şi se introduc valorile parametrilor de analiză (programul de temperatură şi informaţii despre fişier) în fereastra [Measure] – [Setting Parameters]. apoi se pune din nou creuzetul pe suportul de probă. existând posibilitatea salvării datelor înregistrate până în acel moment. Se apasă de două ori pe tasta [DISPLAY].

3. TA-60WS Collection Monitor şi se introduc valorile parametrilor de analiză (programul de temperatură şi informaţii despre fişier) în fereastra [Measure] – [Setting Parameters].5 mm). 2. Se apasă tasta [ZERO] pentru aducerea la valoarea zero a semnalului. Se apasă o dată pe tasta [DISPLAY]. 6. iar creuzetul gol pe suportul din partea dreaptă. Se deschid aparatele şi se aşteaptă 30 min pentru a permite gazelor să formeze o atmosferă inertă în cuptor. • Proba: substanţe în formă solidă sau lichidă la temperatura camerei. Se deschide programul de analiză al aparatului. asistarea transferului de căldură şi protejarea detectorilor (în cazul de fază aerul). ecranul digital al aparatului afişează valoarea semnalului DSC. şi la sistemul de gaz care asigură evacuarea elementelor volatile. Şi acest aparat este conectat la sistemul de purjare a unui gaz inert (în cazul de faţă azotul) care asigură o atmosferă inertă pentru protejarea probelor la oxidare. 5. Într-un creuzet se pune o cantitate de referinţă (α-alumina). Se pune creuzetul cu materialul de referinţă pe suportul din partea stângă. 4. Se pregătesc două creuzete curate. • Se lucrează în atmosferă de aer şi azot la un flux de ~ 50-70 ml/min. iar în celălalt creuzet se pune proba. cântărită în prealabil pe o balanţă digitală. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura formarea atmosferei în cuptor. Paşi în efectuarea unei măsurători DSC: 1. 278 .8 mm x h 1.• Materialul de referinţă (α-alumina) şi proba de analizat se pun în celule standard din aluminiu (având dimensiunile Ø 5. • Rata de încălzire a cuptorului: 1 ÷ 50 ºC/min.

În mod identic cu datele obţinute de la analiza DTATG.7. cristalizare. • cristalizarea sticlelor metalice etc. reducerea. ca şi greutatea probei. • cinetica reacţiilor şi a formării fazelor. • căldurile de topire. Oprirea măsurătorii se face în condiţii normale. călduri specifice. • temperaturile caracteristice ale transformărilor de fază.. descompunerea. fierbere.. constantele de material detectabile sau măsurabile prin analiza termică sunt: • comportarea materialelor la topire. cristalizare. fişierul de analiză fiind salvat automat în directorul specificat.. de reacţie etc. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC La modul general. Dacă se doreşte oprirea măsurătorii înainte de finalizarea programului stabilit se apasă butonul [STOP]. sublimare. • capacităţi calorice. hidratarea-dehidratarea etc. fenomenele fizice şi chimice. • puritatea şi compatibilitatea materialelor. • oxidarea. existând posibilitatea salvării datelor înregistrate până în acel moment. Modificări subtile ale semnalului DTA pot indica prezenţa unui peak exotermic asociat cu o separare de faze. Pornirea măsurătorii se face cu butonul [Start]. În cadrul laboratorului de analize termice de la Institutul de Cercetare Interdisciplinară în Bio-Nano-Ştiinţe au fost abordate o parte din aceste tipuri de măsurători. rearanjarea atomic este un proces exotermic. 8. mai jos fiind prezentate câteva exemple semnificative cu scopul de a oferi o imagine cât mai exactă a modului de intepretare a datelor furnizate de metodele termice diferenţiale: 279 . Când probele cristalizează. 2. iar proba eliberează mai multă căldură decât în referinţa. datele salvate într-o măsurătoare DSC pot fi analizate cu programul TA60. • tranziţii vitroase ale solidelor ne-cristaline. de-vitrificare etc. unde se poate alege numele fişierului şi directorul unde va fi salvat. • coroziunea metalelor în diferite atmosfere.

identificate prin analiza XRD după un tratament termic la 500ºC.4ºC. 280 .00 8.094 % 20.00 6.5 TGA mg 12.38% Weight Loss -52% -52.37 C 10.382% -1.7ºC. fără pierdere de masă → topirea NH4NO3 • Tendo = 260ºC.8 169.00 260 100 200 Temp [C] 300 Semnalul DTA prezintă patru peak-uri endoterme: • Tendo = 58ºC. • Tendo = 132ºC. fără pierdere de masă → transformare structurală a NH4NO3 format în probă din precursorii azotaţi şi hidroxidul de amoniu introdus pentru cataliza bazică a hidrolizei din procesul sol-gel • Tendo = 169.00 274. fără pierdere de masă → începutul procesului de cristalizare a fazelor magnetit şi hematit.7 -10. eliminarea altor reziduuri volatile din probă.1.00 DTA uV -1.00 0.00 -20.00 132 57. • Texo = 274.00 274. pierdere de masă de ~ 52%→ suprapunerea unor evenimente termice cum ar fi: descompunerea NH4NO3.4 10. Analiza DTA/TG a unui sistem aluminosilicatic cu Fe60SiO2·20Al2O3·20Fe2O3 preparată prin metoda sol-gel la pH 8.38% → dehidratarea probei prin pierderea apei adsorbite pe suprafaţa probei. pierdere de masă în TG ~ 1.

respectiv topirea NH4NO3). Analiza DSC a unor sisteme aluminosilicatice cu Fe(80-x)[SiO2]· 20Al2O3· x[Fe2O3]. 281 .7ºC şi 171ºC → topirea NH4NO3 • Tendo = 221ºC şi 241ºC → suprapunerea unor evenimente termice cum ar fi: descompunerea NH4NO3. 20.6 0 100 200 300 Temp [C] 400 500 Semnalele DSC ale probelor prezintă cinci peak-uri endoterme: • Tendo = 54ºC şi 56ºC → dehidratarea probei prin pierderea apei adsorbite pe suprafaţa probei. la pH 8.6 169. Linia semnalului DSC pentru cele 2 probe ce conţin Fe este aceeaşi. rezultat din precursorul folosit pentru Al [Al(NO3)3·9H2O]: • NH4OH + HNO3 → NH4NO3 + H2O • Tendo = 128ºC şi 129ºC → transformare structurală a NH4NO3 • Tendo = 169.4 56 129 171 221 241.2.5) cu acidul azotic. 15. cele pentru 20% Fe fiind deplasate mai sus cu câteva grade. x = 0.4ºC → eliminarea apei rezultate din reacţia hidroxidului de amoniu (introdus în soluţie pentru obţinerea unui pH de 8. DSC mW x=0 129 230 93 128. indicând faptul că prezenţa în matrice a unei cantităţi mai mari de Fe influenţează schimburile energetice şi cauzează întârzierea producerii anumitor evenimente termice în probă. prin metoda sol-gel. diferind doar temperaturile la care au loc evenimentele (în special cele două evenimente care indică descompunerea.5. eliminarea altor reziduuri volatile din probă.7 x=15 55 x=20 93. HNO3. • Tendo = 93.

Si3Al4O12. fără pierdere de masă în TG.4ºC). având un maxim la 505ºC şi însoţit de o pierdere de masă de ~14 % din totalul masei probei. Dar pierderi continue de hidroxil sunt observate până la 900°C (~0.50 1046 0.542% -20. • În intervalul de temperatură 354–660ºC se observă un peak endoterm foarte larg. • În intervalul 977 ºC – 1007 ºC.00 DTA uV -0.00 6.3.50 0 500 Temp [C] 1000 • Pierderea iniţială de masă de ~0.00 7. corespunzător unei tranziţii structurale de stare solidă.00 -10. se transformă la temperatura la 995. o conversie structurală a metakaolinitului în altă stare polimorfă aluminosilicatică.5 ºC (unde apare peak-ul exoterm îngust) într-o fază aluminiu-siliciu spinel.765% 993. Faza dezordonată de metakaolin. care corespunde unui proces tipic de dehidratare prin dehidroxilarea caolinitului cu producerea fazei dezordonate metakaolinit. Analiza DTA/TG a unei argile minerale cu structură majoritară de caolinit TGA mg 8. Al2Si2O7.5%) şi pot fi atribuite deprotonării graduale prin oxolare a metakaolinitului.00 7. Al2Si2O7.353% -14.3% în intervalul de temperatură 30-109ºC corespunde dehidratării probei prin pierderea apei adsorbite la suprafaţa probei. care este considerată o structură tip γ-alumină [1]: 2 Al2Si2O7 –> Si3Al4O12 + SiO2 282 .4 10. semnalul DTA etalează un peak exoterm (cu maximul la 993.00 505 -0.

00 400.00 Temp [C] 600.00 -13.00 6.00 0.00 4.00 Semnalul DTA prezintă două peak-uri endotermice clare: • la 83.00 10.00 400.00 10.00 445. cu pierderi de masă în TG – dehidroxilare • la 491 ºC şi la 507 ºC.00 200. Analiza DTA/TG a unei probe de corn de cerb deproteinată TGA mg 9.00 0.00 -50.00 100 200.554% 507 507.00 -12.00 1000.786% 20.32C -6.00 DTA uV 371 371.4.00 83.00 -22.ºC şi 100ºC.417% 5.18C HA+50%Fe .00 800.00 -8.00 5.90C -13.00 283 . Analiza DTA/TG a două probe de hidroxiapatită (cu 30%Fe şi 50%Fe) – tratate termic la 450º C TGA mg -12.00 Temp [C] 600.530% 8.00 -10.5 491 491.026% 15.838% 50.00 85 84. cu pierdere de masă – descompunerea termică propriu-zisă în TCP (fosfat tricalcic) şi TTCP ( fosfat tetracalcic): Ca 10 ( PO 4 ) 6 ( OH ) 2 → 2 Ca 3 ( PO 4 ) 2 + Ca 4 P2 O 9 + H 2 O gas 5.907% -20.68C -30.t HA+30%Fe-t 0.94C 445 7.00 DTA uV 20.

eveniment dependent şi de gradul de hidratare al materialului. dar şi eliminării apei libere ataşate în matricea de hidroxiapatită. însoţite de pierderi de masă considerabile. apoi uscare în cuptor la 40ºC până la îndepărtarea completă a solventului. • un eveniment exoterm de intensitate mare în intervalul de temperatură 350–500ºC.Procedeul de deproteinare a probei a constat în degresare în acetonă timp de 48 h şi cu eter etilic timp de 30 min. asociat cu o scădere a masei probei în curba TG (pe intervalul 50ºC–150ºC).3. format din două peak-uri cu maximele la 371ºC şi la 446ºC. eveniment care ar corespunde denaturării structurii triplu helix a colagenului din matricea osoasă.[2. Aceste evenimente pot corespunde degradării şi respectiv arderii matricii organice a osului însoţită de volatilizarea compuşilor gazoşi rezultaţi din acest proces.4] 6. Analiza DTA/TG a unor materiale compozite polimer-sticle[5] Semnalele TG prezintă patru trepte de pierdere de masă: • I – intervalul de temperatură 20-400°C – volatilizarea apei de pe suprafaţa probelor 284 . Semnalul DTA etalează trei evenimente termice: • un peak endoterm având maximul la 85ºC.

Thermoanalytical characterisation of new dental ionomer biocomposites. Javidi. Ocotlan-Flores.. Journal of Ceramic Processing Research.. M. Artioli. Phys. T. Simon. 958-960. V. Lozano. S. cel mai probabil datorat formării unei faze cristaline în structura compozitelor. Bellotto.• • • II – intervalul de temperatură 400-500°C – însoţită în DTA de un peak exoterm cu maximul la ~T = 450ºC – o reacţie de dehidroxilare aferentă restructurării reţelei polimerice a compozitelor. 285 . Heredia. Bucio. 129-138. M. Pena-Rico. 10. S. Bahrololoom. acompaniat de o pierdere de masă. 3. Vol. S. C. V.E. Acesta este. M. 4 (2009). M. I. Băciuţ. No. Coman. vol. Simon.. A. M. L. Characterisation of natural hydroxyapatite extracted from bovine cortical bone ash. R. 1995. Simon. Journal of Optoelectronics and Advanced Materials.M. J. Prejmerean. A. 11. Vol. Tămăşan. no.Bibliografie 1. L. Radu. L. Pe de altă parte. Thermal kinetics analysis of bone tissue organic phase. Colceriu.A. J. 3. A. 10. Velazquez. C. intensitatea acestor peak-uri poate fi legată de efectul interacţiunii mutuale dintre produşii de hidratare cu polimerul utilizat în sinteză. G. Chem. 2. Thermal Analysis study of human bone. 4 (2008)..A. Menţionăm că toate aceste măsurători au fost publicate şi/sau prezentate în cadrul unor conferinţe naţionale/internaţionale de specialitate. Journal of Materials Science 38 (2003) 4777-4782 M. and Clark. 4. Part I: kaolinite dehydroxylation. A. Journal of Optoelectronics and Advanced Materials.F. 479-483. Belio. 2 (2009). Ma. Gomez-Cortes. 5. Kinetic study of the kaolinite-mullite reaction sequence. Tamas. No. Silaghi-Dumitrescu. Javadpour. Minerals 22. 207-214 . Gualtieri. V. III – intervalul de temperatură 500-800°C curba DTA prezintă la T ~ 740 °C un peak endotermic pronunţat care poate fi atribuit unui proces de disociere fără pierdere de masă IV – la aproximativ 810-830 °C apare un peak exotermic mic.

.....................................294 2...................................2.........2........................... Metode bazate pe analiza Rietveld ............................. Informaţiile care se obţin din difracţia de raze X pe pulberi ....................... 286 ..........300 3.....................303 1...........................4..... Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ...1..........1..........4.....................................................................3........................ DIFRACTOMETRUL DE RAZE X Difracţie de raze X pe pulberi C...286 2............. Metoda Scherrer ............. dr........ Metode bazate pe utilizarea de standarde ....297 2.................................... Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente .....................................2....................3............................. Această tensiune se aplică între catodul şi anodul tubului de raze X...4...............3............294 2.................................... Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld .......................290 2.............4..... Principiul metodei Difracţia de raze X este una dintre metodele cele mai utilizate pentru investigarea compuşilor în faza solidă cristalină.........2..............................1............4........................I........................... Gheorghe Borodi Cuprins 1...302 4......2.....292 2........................289 2............ Metoda de căutare în spaţiul direct.......................................299 2..289 2...3... Determinarea structurii cristaline din pulberi ..3..... Bibliografie .......................4.....S............................................................................................. Analiza calitativă de faze cristaline ..............292 2......... Principiul metodei ..........292 2................................................................ Indexarea Difractogramelor .295 2...................................... Metoda bazată pe analiza Rietveld .......2.3................................. Analiza microstructurală..................................293 2...........1..................................290 2..........................1.......................... Metoda Warren-Averbach..296 2.......................4................................................... Principiul de funcţionare a unui difractometru de raze X este următorul: Cu ajutorul unui generator de înaltă tensiune se obţine tensiune de ordinul zecilor de kV.................................................. Analiza cantitativă de faze ............. Rafinarea Pawley sau Le Bail ...............3.2.VIII..

Cea mai uzuală interpretare este difracţia Bragg pe planele cristalografice. Mo. Difracţia razelor X se poate explica în mai multe feluri. unghiul dintre radiaţia incidentă şi probă este egal cu unghiul dintre radiaţia difractată şi planul probei. b/k. Ag etc. Co. k. Cu are lungimea de undă intermediară şi este cel mai utilizat.Catodul tubului de raze X este alcătuit dintr-un filament care este de asemenea alimentat la o sursă de joasă tensiune şi care face ca filamentul să emită electroni. c/l. Acest lucru se realizează în cazul montajului θ . un anumit grup spaţial şi un mod de aranjare a atomilor în celula elementară. 2 θ . În celula elementară se pot construi diverse seturi de plane cristalografice fiecare set fiind caracterizat prin indicii Miller corespunzători. Monocromatizarea radiaţiei X se face cu ajutorul filtrelor de raze X sau cu ajutorul monocromatoarelor de raze X. Electronii respectivi sunt acceleraţi între catodul şi anodul tubului. Dintre lungimile de undă emise de un tub de raze X cea mai intensă este radiaţia K α . Astfel. Fe. Liniile caracteristice pentru elementele grele cum sunt Mo şi Ag au lungimi de undă mică. Orice compus cristalin cristalizează într-un anumit sistem cristalografic cu parametrii de reţea bine precizaţi. Pentru aplicaţiile practice de difracţie pe pulberi este necesar să folosim o radiaţie cât mai monocromatică. În timp ce proba se roteşte cu un anumit unghi. Cr. iar liniile caracteristice pentru Cr si Co au lungimi de undă mari. trece printr-un sistem de fante care sunt montate pe goniometru după care radiaţiile X ajung la detector unde este înregistrată. Proba este aşezată pe un suport plan. Se poate considera difracţia pe astfel de plane cristalografice după cum este arătat în figura următoare: 287 . Spectrul continuu nu depinde de natura anodului în schimb spectru caracteristic depinde de anodul folosit. Radiaţia X emisă de tubul de raze X intră într-un goniometru. Electronii care lovesc anodul fac să se emită radiaţii X sub forma unui spectru continuu şi a unui spectru caracteristic. l) dacă cel mai apropiat plan cristalografic faţă de origine intersectează axele cristalografice la distanţele: a/h. Anozii tuburilor de raze sunt din următoarele materiale: Cu. un set de plane cristalografice echidistante are indicii Miller (h. dar există şi alte tipuri de montaje experimentale. detectorul se roteşte cu un unghi dublu în aşa fel încât tot timpul unghiul de incidenţă este egal cu unghiul de reflexie.

iar rezultanta este dată de factorul de structură. Factorii de împrăştiere atomici scad cu unghiul de împrăştiere. Dacă radiaţia X cade pe probă. Pentru alte sisteme cristalografice avem alte formule de calcul a distanţelor interplanare. Expresia factorului de structură este dată de relaţia: Fhkl= ∑ fj exp π 2 i(hxj+kj+lzj) (2) Intensităţile de difracţie sunt proporţionale cu pătratul factorilor de structură. θ unghiul de difracţie. De aici rezultă că poziţiile maximelor de difracţie depind exclusiv de tipul reţelei cristaline şi de parametrii celulei elementare. atunci fiecare atom din celula elementară împrăştie radiaţiile incidente. de parametrii celulei elementare şi de indicii Miller. intensităţile de difracţie vor depinde de natura şi 288 .Condiţia de difracţie este dată de relaţia: 2dsin θ = λ (1) unde d este distanţa interplanară. Prin urmare. De exemplu. Distanţa interplanară este determinată de sistemul cristalografic. Radiaţia X constă din unde electromagnetice în care componenta vectorului câmp electric şi magnetic oscilează perpendicular pe direcţia de propagare a undei. Să vedem în continuare de cine depind intensităţile de difracţie. Dependenţa intensităţii factorilor de împrăştiere de sin θ / λ este dată în tabelele internaţionale sub forma unor relaţii empirice. radiaţii X. Aceste unde electromagnetice produse de atomii din celula elementară se suprapun şi se compun. iar λ lungimea de undă. iar în cazul acesta. Dar orice sarcină care oscilează produce la rândul ei unde electromagnetice. Factorii de împrăştiere atomici depind de numărul de electroni din componenta atomului dat. De aici se observă că fiecare set de plane cristalografice corespunde unui anumit unghi de difracţie. pentru sistemul ortorombic avem 1/d2 = h2/a2 + k2/b2 + l2/c2. Vibraţiile vectorului câmpului electric produc oscilaţii ale electronilor atomilor. Intensitatea radiaţiei X împrăştiate de către un singur atom este caracterizată prin factorul de împrăştiere atomic.

V. Analiza calitativă de faze cristaline Analiza cantitativă de compuşi chimici în faza solidă se poate face prin metode chimice. Pulberile constau din foarte multe cristalite mici de ordinul zecilor până la ordinul miilor de Å orientate haotic unele în raport cu altele. În concluzie. iar c viteza luminii. ω . poziţiile maximelor de difracţie depind de celula elementară. Deoarece în general λ . În felul acesta intensitatea de difracţie corespunzătoare unui set de plane cristalografice este dată de relaţia: Ihkl=K·m·Lp·A·T·I·Fhkl·I2 (4) În această relaţie s-a introdus şi m care este factorul de multiplicitate. numărul de cristalite care participă la difracţie este foarte mic.(e2/mc2)2·Vcr·I0·Lp·A·T·I·FhklI2 unde (3) λ este lungimea de undă ω viteza unghiulară cu care se roteşte monocristalul V volumul celulei elementare I0 intensitatea fasciculului incident Lp este factorul Lorentz-polarizare A factorul de absorbţie T factorul de temperatură. iar Fhkl este factorul de structură. Acesta rezultă din aceea că pot să existe mai multe plane cristalografice care să producă difracţie la acelaşi unghi θ .poziţia atomilor în celula elementară. I0 sunt constante pentru un experiment de difracţie. toate acestea se pot grupa împreună sub forma unei constante notată cu K. e fiind sarcina electronului. iar intensităţile de difracţie de poziţiile atomilor în celula elementară. m masa acestuia. Probele se pun de obicei pe suporturi plane. Vom obţine difracţie numai de la planele cristalografice care sunt paralele cu suprafaţa suportului de probă. Informaţiile care se obţin din difracţia de raze X pe pulberi 2. Astfel se demonstrează că intensitatea radiaţiei difractate de către un mic monocristal care se roteşte cu viteza unghiulară ω este dată de relaţia [1] : Ihkl = ( λ 3/ ω V2). Vcr. iar (e2/mc2) sunt constante universale. Intensităţile de difracţie depind şi de alţi factori. dar acestea necesită o abordare mai laborioasă şi timp mai mult.1. 2. De aceea. 289 .

2. cum se mai spune. 2. care ne dă datele cristalografice complete pentru compuşii care ne interesează. cu luarea în considerare a coeficienţilor de absorbţie a fazelor componente. Aceasta face ca fiecare fază cristalină să aibă intensităţile de difracţie şi unghiurile la care apar aceste intensităţi bine determinate. în special PDF-2. atunci putem să simulăm difractograma acelui compus şi să o comparăm cu difractograma experimentală. în diferite faze cristaline. 2. cât şi prin difracţie de raze X. ne interesează compoziţia procentuală a fiecărei faze din amestec. Obţinerea componentei procentuale a fazelor dintr-un amestec se poate face atât prin metode chimice. când avem un amestec de faze cristaline. Identificarea fazelor cristaline se bazează pe următoarele considerente: fiecare fază cristalină aparţine unui anumit sistem cristalografic. Metode bazate pe utilizarea de standarde Între intensităţile de difracţie şi fracţia în greutate Wα. Analiza cantitativă de faze În foarte multe cazuri. Analiza de faze cristaline se bazează pe compararea difractogramei de raze X experimentală cu difractogramele care se găsesc în bazele de date. PDF-4.1. iar dacă avem mai multe faze. difractograma rezultată va fi o suprapunere a difractogramelor individuale. din analiza de faze putem să identificăm o anumită fază numai dacă aceasta a fost catalogată în prealabil. aparţine unui anumit grup spaţial. are parametrii de reţea bine determinaţi sau care variază într-un interval relativ mic.2. iar atomii compusului se plasează în anumite poziţii în celula elementară. În anumite cazuri difracţia de raze X pe pulberi cristaline poate să fie o metodă rapidă şi eficientă. Compararea difractogramei experimentale cu cele din catalog se face utilizând bazele de date. Deci. deoarece proprietăţile fizico-chimice depind de compoziţia procentuală. pentru o anumită fază α există relaţia: 290 . Analiza cantitativă de faze se bazează pe faptul că fiecare fază cristalină produce propria difractogramă. Dacă avem la dispoziţie baza de date CSD sau o altă bază de date.În prezent. analiza calitativă de produşi chimici cristalini se face în cea mai mare măsură prin difracţie de raze X pe pulberi. Difracţia de raze X pe pulberi deosebeşte cu uşurinţă diferite forme polimorfice ale unui anumit compus. Se ştie că acelaşi compus chimic poate să se prezinte în diferite forme polimorfice sau.

iar μ m este coeficientul de absorbţie masic pentru întreaga probă [2]. I jsWd Fracţia Wα pentru faza necunoscută se determină în funcţie de fracţia Ws pentru proba standard. x ρα este densitatea fazei α. Pentru aplicarea acestei relaţii este necesară (i) determinarea constantei Ciα prin prepararea de standarde cu compoziţie procentuală a fazei α bine x a probelor determinată şi estimarea coeficientului de absorbţie masic μ m x pentru probe necunoscute. măsurarea lui Iiα şi estimarea lui μ m O altă metodă este aceea a standardului intern care presupune includerea unui standard intern în proba de compoziţie procentuală cunoscută Ws. Se defineşte RIRαs = I isWs . O altă metodă este aceea a raportului intensităţii de referinţă (RIR) (Reference Intensity Ratio). Intensitatea de reflexie Ijs este dată de relaţia: I js = C js Ws x ρsμm (6) Împărţind cele două relaţii rezultă: is Wα = K α sWs I iα I js (7) ij unde K α s = C js ρα Ciα ρ s ij poate fi determinat făcând un amestec cunoscut de fază standard şi Kα s fază de analizat. Ca standard extern se alege în general corundum.I iα = C i α Wα x ρα μ m (5) unde Ciα este o constantă pentru reflexie (sau un grup de reflexii) i a fazei α. şi de raportul dintre intensitatea liniei i a probei de analizat şi intensitatea liniei j a probei standard după relaţia: Wα = I iα W s I js RIRαs (8) 291 . standard (ii).

Analiza microstructurală Analiza microstructurală include determinarea dimensiunilor microcristalitelor şi eventual distribuţia acestora după dimensiune. Cu cât dimensiunile cristalitelor sunt mai mici cu atât liniile de difracţie sunt mai largi. 2. Într-o particulă pot să existe mai multe cristalite (monocristale) orientate diferit între ele. microabsorbţia. distribuite haotic unele în raport cu altele.1. numite cristalite. Intensităţile de reflexie pentru probele cu coeficient mai mare de absorbţie vor fi mai intense. Factorii care limitează precizia analizei de fază sunt: dimensiunea diferită pentru particulele aparţinând la diferite faze de analizat. se consideră că compusul respectiv este sub formă amorfă. liniile de difracţie de asemenea se lărgesc. Dacă reţeaua este mai deformată sau dacă avem mai multe defecte. Se ştie că pulberile cristaline sunt formate din mici monocristale.2. Astfel. din analiza Rietveld rezultă fracţia de faze din probă. Dimensiunile acestor cristalite sunt de ordinul zecilor până la ordinul miilor de Å. Metoda bazată pe analiza Rietveld Analiza cantitativă de faze se poate face şi cu analiza Rietveld [3]. Metoda Scherrer Scherrer a arătat pentru prima dată că dimensiunile cristalitelor sunt legate de lărgimea de difracţie prin relaţia [2]: D= Kλ β cos θ (9) D este dimensiunea microcristalitelor. β este lărgimea liniilor de difracţie 292 .2. Erorile sunt cu atât mai mici cu cât dimensiunea particulelor este mai mică şi cu cât coeficienţii de absorbţie vor fi mai mici. orientarea preferenţială a cristalitelor. a deformării reţelei cristaline şi a probabilităţilor de defecte. Dar la lărgimea liniilor de difracţie contribuie şi deformările reţelei cristaline şi probabilităţile de defecte. Dacă dimensiunile cristalitelor sunt sub 20 Å.2. Reducerea coeficienţilor de absorbţie se poate face prin utilizarea tuburilor de raze X cu lungime de undă mai mică. Se filtrează toţi parametrii de care depinde intensitatea de difracţie. 2.3. Trebuie menţionat că dimensiunile particulelor sunt diferite de dimensiunile cristalitelor.3. inclusiv procentul de fază necunoscută.

Pentru a obţine b. Lărgimea instrumentală se obţine din lărgimea de difracţie experimentală astfel: β = B-b. iar b este lărgimea de difracţie instrumentală. Cea mai utilizată valoare a lui K = 0. Ca măsură a lărgimii liniilor de difracţie se consideră lărgimea la semiînălţime. iar θ este unghiul de difracţie. deoarece cu cât dimensiunile sunt mai mari lărgimea liniilor de difracţie se apropie de lărgimea instrumentală şi depinde foarte mult cât de corect am ales lărgimea instrumentală. unde ε este un parametru care reflectă deformaţia reţelei cristaline şi reprezintă deplasarea medie a atomilor faţă de poziţia de echilibru.3. se foloseşte o probă foarte bine cristalizată şi se măsoară lărgimea maximelor de difracţie pentru unghiurile de difracţie apropiate cu cele ale probei de măsurat. Metoda Warren-Averbach Am amintit că lărgimea liniilor de difracţie scade atât cu scăderea cristalitelor cât şi cu creşterea deformaţiilor reţelei cristaline. Astfel avem relaţia: β cosθ = 0. K este o constantă care depinde de modul cum se defineşte dimensiunea D. precum şi de alţi factori. dacă profilul de difracţie este o funcţie de tip Gauss.89. În această relaţie B este lărgimea de difracţie măsurată. Precizia legată de determinarea dimensiunilor cristalitelor scade odată cu creşterea acestora. Unii autori iau ca lărgime a liniilor de difracţie lărgimea integrală. Domeniul pe care precizia determinării dimensiunilor cristalitelor se consideră acceptabilă este de la aproximativ 20Å. Lărgimea liniilor de difracţie creşte cu unghiul. dacă aceasta se defineşte ca fiind dimensiunea liniară sau rădăcina de ordinul 3 din volum. Dependenţa de unghiul θ a lărgimii liniilor de difracţie datorată dimensiunilor cristalitelor este diferită de dependenţa de unghiul θ a lărgimii liniilor de difracţie datorată deformării reţelei cristaline.9λ + 4ε sinθ D (10) în cazul în care profilul liniei de difracţie este de tip Lorentz.2. 293 .corectată de lărgimea instrumentală. 2. dacă profilul de difracţie este o funcţie de tip Lorentz şi β2 = B2 –b2. până la 1000Ǻ. care se defineşte ca fiind aria maximului de difracţie împărţită la intensitatea maximă pentru maximul respectiv.

Metode bazate pe analiza Rietveld O altă modalitate de determinare a dimensiunilor cristalitelor şi a deformării reţelei cristaline se poate face prin analiza [4] Rietveld. rezultă dimensiunile cristalitelor şi deformările reţelei. Numărul intensităţilor de difracţie care se pot obţine din difracţia pe monocristale este de ordinul zecilor de mii. Se obţin mai puţine intensităţi de difracţie deoarece liniile de difracţie pot să se suprapună şi de ase294 .3.Reprezentând grafic βcosθ în funcţie de sinθ. În continuare dimensiunile cristalitelor şi deformaţiile reţelei se calculează în funcţie de aceşti parametrii. W si P. Y. dacă considerăm diferite linii de difracţie. 2. U. Determinarea structurii cristaline din pulberi Determinarea structurii cristaline se face în general din datele de difracţie obţinute din monocristale. Dimensiunile cristalitelor se mai pot determina şi din analiza Fourier a liniilor de difracţie. astfel: ΓL = X + Y tgθ cosθ (12) pentru un profil de tip Lorentz. atunci avem relaţia: β 2 cos 2 θ = λ2 D2 + 16ε 2 sin 2 θ (11) Din reprezentarea grafică a lui β2cos2θ. De aici putem să determinăm ε şi D. Pentru un profil de tip Gauss avem: ΓG = Utg 2θ + Vtgθ + W + P cosθ (13) Din fitarea Rietveld rezulta X. ar trebui să obţinem o dreaptă.9λ . iar panta D dreptei reprezintă 4ε. în funcţie de sin2θ. dar poate ajunge şi până la 200. Ordonată la origine pentru această dreaptă reprezintă 0.4. 2. unde ΓL este lărgimea la semiînălţime. Numărul intensităţilor de difracţie care se pot obţine din pulberi cristaline este de ordinul zecilor. lărgimea la semiînălţime depinde de unghiul θ. V.3. Dacă profilul liniilor de difracţie este de tip Gauss. iar X si Y parametrii de fit. Conform formulei lui Caglioti.

c şi unghiurile dintre ele α. unele maxime de difracţie se suprapun în cazul pulberilor. După cum se ştie. b. În acest caz se apelează la determinarea structurii cristaline din pulberi. difracţia razelor X poate fi privită ca difracţia de pe planele cristalografice. Determinarea structurii cristaline pentru un anumit compus înseamnă determinarea sistemului cristalografic. Pentru o anumită celulă elementară putem să definim planele cristalografice. b/c si c/l de origine. a parametrilor celulei elementare. Din reflexiile interzise se pot atribui grupurile spaţiale cele mai probabile.1 Indexarea Difractogramelor A indexa o difractogramă înseamnă a determina sistemul cristalografic în care cristalizează compusul. Parametrii care caracterizează celula elementară se numesc parametrii celulei elementare. a determina parametrii celulei elementare şi a atribui fiecărui maxim de difracţie indicii Miller corespunzători. β. determinarea structurii cristaline este mult mai dificilă pentru pulberi decât pentru monocristale. α. Se obţin maxime de difracţie dacă este îndeplinită condiţia lui Bragg: Maximele de difracţie au intensităţi mai mari sau mai mici în funcţie de modul de distribuţie a atomilor în celula elementară. avem şapte sisteme cristalografice. γ. b. Se ştie că difracţia razelor X pe atomi poate fi privită ca difracţie pe planele cristalografice. Concordanţa dintre poziţiile maximelor de difracţie calculate şi obser295 . β. c. a grupului spaţial şi a poziţiilor atomilor în celula elementară.menea unele intensităţi de difracţie sunt foarte slabe şi nu se pot observa. Deoarece numărul de intensităţi de difracţie care se pot colecta din difractograma pe pulberi este mult mai mic decât pentru monocristale. l este un plan care intersectează axele cristalografice la distanţele a/h. γ. De asemenea. Etapele principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: 2. În funcţie de a. Numărul de maxime de difracţie în cazul pulberilor care se observă este foarte mic comparativ cu numărul de maxime de difracţie observate pentru monocristal. Numărul mai mic de maxime de difracţie observat în cazul pulberilor precum şi suprapunerea unor maxime provenite de la plane cristalografice diferite este motivul pentru care este mult mai dificil de determinat structura cristalină din pulberi faţă de monocristale.4. Dar există situaţii când anumiţi compuşi nu se pot cristaliza şi totuşi ne interesează structura lor cristalină. Un plan cristalografic de indicii Miller h. Orice compus este caracterizat de o anumită celulă elementară care este un paralelipiped cu muchiile a. k.

Suprapunerea exactă a intensităţilor de difracţie are loc mai ales pentru sistemele cristalografice de înaltă simetrie.2. iar <Q> este abaterea medie dintre liniile de difracţie calculate şi observate. Suprapunerea accidentală are loc atât pentru sisteme cu simetrie ridicată. Metoda Le Bail [11] de extragere a intensi296 . de Woolf [5]: M 20 = Q 20 2 < Q > N 20 (14) Q20 este valoarea lui Q pentru a 20-a linie de difracţie. N20 este numărul de linii diferite calculate până la linia corespunzătoare lui Q20.vate se caracterizează şi prin aşa numite figuri de merit. Cea mai utilizată figură de merit este M20. Există mai multe moduri de definire ale figurilor de merit sau gradului de încredere în indexarea respectivă. indexarea este probabil corectă. Una dintre figurile de merit se datorează lui P.4. Dacă avem M20 > 10. şi anume: Metoda Le Bail şi metoda propusă de Pawley. dar mai ales pentru sisteme cristalografice cu simetrie joasă şi se datoreşte creşterii numărului de reflexii independente. 2. reflexiile 333 şi 511 pentru sistemul cubic sau 43l şi 50l pentru sistemul tetragonal. care este valoarea în θ pentru limita superioară selectată.N (θg ) (15) unde N( θg ) este numărul de linii de difracţie calculate până la θ g. De exemplu.M. Au fost dezvoltate două metode de extragere a intensităţilor de difracţie din pulberi. metoda Dicvol [8] X-Cel [9] si metoda Treor [10]. Suprapunerea reflexiilor este cu atât mai probabilă cu cât celula elementară are volumul mai mare. rafinarea celulei elementare şi atribuirea grupului spaţial cel mai probabil. Există o suprapunere sistematică a intensităţilor de difracţie şi o suprapunere accidentală. < Δ 2 θ > este abaterea medie dintre liniile de difracţie calculate şi observate. Rafinarea Pawley sau Le Bail Rafinarea Pawley sau Le Bail este utilizată pentru extragerea intensităţilor de difracţie. Există mai multe metode de indexare dintre care cele mai importante sunt: Metoda Ito[7]. Un alt factor de încredere datorat lui Smith si Snyder [6] se defineşte astfel: FN= N < Δ 2θ > .

în care mărimile care trebuie determinate sunt intensităţile de difracţie. metoda Pawley rezolvă problema de extragere a intensităţilor de difracţie printr-o tehnică matricială. Pawley [12] a elaborat o metodă pentru determinarea intensităţilor de difracţie din difractograma de raze X fără a avea un model structural. Deşi procesul de rafinare este în general stabil. Experienţa arată că aceasta are loc când poziţiile a două maxime de difracţie sunt mai apropiate unele de altele cu 0. Rietveld a propus un algoritm simplu de evaluare a factorilor de structură observaţi pentru o suprapunere parţială sau totală a maximelor de difracţie. Ca intensităţi de pornire se pot considera valorile calculate ale intensităţilor de difracţie. Tipul unităţilor structurale care trebuie să fie localizate în celula elementară depinde de natura compusului.4. 297 .1.tăţilor de difracţie este inspirată din metoda Rietveld. Aceasta este o metodă de analiză prin cele mai mici pătrate.5 dintr-un pas de înregistrare a difractogramei. Dar cel mai important aspect care a contribuit la creşterea popularităţii metodei Le Bail este că aceasta poate să fie uşor încorporată în tehnica Rietveld de rafinare. maxime de difracţie foarte apropiate pot duce uneori la apariţia de maxime de difracţie negative. termenii nediagonali diferiţi de zero provin de la suprapunerea maximelor de difracţie vecine. În timp ce metoda Le Bail este o metodă iterativă. tetraedrii. Unii autori [13. Deşi metoda este în general robustă.3. Rezultatele intensităţilor de difracţie extrase nu depind de valoarea intensităţilor iniţiale.3. există şi cazuri când prezintă instabilităţi. octaedrii etc. mai ales atunci când fondul de difracţie este supraestimat. Metoda de căutare în spaţiul direct Metoda de căutare în spaţiul direct sau metoda grid search este o metodă de localizare a unităţilor structurale în celula elementară. Această metodă nu cere extragerea factorilor de structură din difractogramă. fragmente din molecule. Putem să avem atomi. Obţinerea unui model structural 2. ca de exemplu. 2. grupe de atomi aranjaţi într-o anumită configuraţie. molecule. Pentru compuşii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjaţi sub diverse forme. astfel ca difractograma calculată să se suprapună cât mai bine cu difractograma experimentală. Mărimea matricei nu este o problemă deoarece matricea este cvasidiagonală.4.14] au căutat să elimine maximele negative prin rafinarea mărimii factorilor de structură în schimbul intensităţilor de difracţie.

T fiind temperatura distribuţiei. dintre care amintim: Răcire simulată (simulated annealing). celelalte molecule fiind generate prin operaţiile de simetrie ale grupului spaţial care caracterizează compusul respectiv.Pentru moleculele organice ca unităţi structurale putem să considerăm întreaga moleculă ca fiind rigidă sau fragmente rigide din molecula care se mişcă unele în raport cu altele. dar în faza finală. probabilitatea de a găsi un alt minim este de asemenea mică. Pentru moleculele organice. când T este foarte mic. dintre care amintim Powder Solve [15]. atunci se reţine noua configuraţie. Există mai multe programe de calcul care au implementat această modalitate de determinare a minimului global. În timpul procesului de căutare temperatura se scade treptat. În cazul metodei de răcire simulată se generează configuraţii întâmplătoare în spaţiul parametrilor de căutare. Funcţia de cost CF se poate alege în diverse moduri. şi anume Parallel Tempering (PT) [18]. atunci se reţine noua configuraţie cu probabilitatea exp(. eventual a unghiurilor de valenţă şi a distanţelor dintre atomi. Fox [16. definit în felul următor: Σ i wi ( y Rwp=[ obd i − i y calc i )2 ]1/2 (16) Σ i wi ( y ) 2 obs Dacă funcţia de cost CF este mai mică decât cea precedentă. un alt algoritm a fost dezvoltat. În schimbul utilizării unui singur lanţ de configuraţii. pentru a evita să cădem într-un minim local. Totuşi. modificându-şi configuraţia prin modificarea unghiurilor de torsiune. cu descreşterea temperaturii se aleg de la 298 . o variantă a acesteia numită Parallel tempering şi Tehnica algoritmilor genetici. se testează potrivirea dintre difractograma calculată şi cea experimentală. Ca o măsură a potrivirii dintre difractograma calculată şi cea experimentală. Una dintre posibilităţi este să se aleagă ca fiind rezidiul R.Δ CF/T). se consideră funcţia de cost CF. Astfel pentru fiecare compus avem un număr de grade de libertate care trebuie să fie modificate până când difractograma calculată se suprapune cât mai bine peste difractograma experimentală. Astfel. în celula elementară putem avea o moleculă sau mai multe în unitatea asimetrică.17]. Există diverse tehnici Monte Carlo de căutare a configuraţiei optime. în faza iniţială a procesului de căutare a configuraţiei optime se poate uşor trece de la un minim local la un alt minim în scopul determinării minimului absolut. Probabilitatea relativă a celor două configuraţii de încercare respectă legea lui Boltzman: P1/P2 = exp[(CF2-CF1)/T]. Dacă CF este mai mare decât cea precedentă.

Cunoscând factorii de struc299 . Paşii care trebuie urmaţi sunt: corectarea intensităţilor de difracţie de diverşi factori. se obţine modulul factorilor de structură. intensităţile acestora se reduc cu un factor de temperatură. 2.început mai multe configuraţii (un număr mic de configuraţii). până la 3 sau 4 sute. Determinarea fazei factorilor de structură [19. Cu toate acestea. În felul acesta. factorul de polarizare. deci în acest caz factorii de structură sunt numere reale pozitive sau negative. posibilitatea de a se obţine minime locale este mai mică. Determinarea factorului de scală şi a factorului global de temperatură. pentru obţinerea modelului structural se poate urma procedeul care se foloseşte pentru monocristale. în unele cazuri s-au obţinut rezultate bune. dintre care amintim: Factorul Lorentz.4. se determină factorul de scală şi de temperatură. Dar factorii de structură sunt numere complexe. În timp ce pentru monocristale se pot colecta câteva mii de intensităţi. intervine un factor de scală K care trebuie determinat. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi După extragerea intensităţilor de difracţie prin metoda Le Bail sau Pawley. factorul de absorbţie. Datorită faptului că atomi oscilează în jurul poziţiilor de echilibru. Determinarea fazei factorilor de structură când se cunoaşte modulul factorilor de structură este cea mai complexă problemă în procesul de determinare a structurilor cristaline pentru monocristale. Sinteza Fourier şi sinteza Patterson. Dificultatea adaptării procedeului de calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea că metodele de calcul sunt metode statistice şi necesită un număr mare de intensităţi de difracţie. factorul de extincţie. Aceste corecţii pot să fie făcute şi în cadrul extragerii intensităţilor de difracţie. faza acestor numere complexe este arbitrară pentru structuri necentrosimetrice şi are valoarea 0 sau π pentru structuri centrosimetrice. numărul de intensităţi care se pot obţine pentru pulberi este de ordinul zecilor. Periodic se testează configuraţiile paralele şi se alege configuraţia optimă prin aceeaşi schemă ca în cadrul unui singur proces. fiecare configuraţie porneşte cu o anumită temperatură care scade treptat. Deoarece intensităţile de difracţie se măsoară în unităţi arbitrare. Metodele de determinare a fazei factorilor de structură se numesc în cristalografie metode directe şi se bazează pe metode statistice aplicate invarianţilor şi semiinvarianţilor.2. Dacă se fac corecţiile intensităţilor de difracţie.20].3.

după relaţia: P(u. z ) = 1 V ∑F hkl hkl exp( −2πi ( hx + ky + lz )) (17) Densitatea electronică de sarcină se exprimă direct în unităţi electronice astfel încât.4. unde densitatea electronică este mai mare. y . În cazul obţinerii modelului structural s-a făcut o căutare globală potrivindu-se parametrii de structură astfel încât difractograma calculată să concorde cât mai bine cu difractograma observată. k .l ∑F 2 h . Cu ajutorul sintezei Patterson putem localiza poziţiile atomilor grei din celula elementară dacă aceştia există.factorul de pondere şi este wi=1/yi. Pe baza densităţii electronice se poate construi un model structural aproximativ.4. Dacă nu s-au determinat fazele factorilor de structură şi avem numai modulul acestora. Dintre programele de calcul cel mai utilizat este GSAS [22]. deoarece nu sunt necesare variaţii mari ale acestor parametrii. de aceea este posibilă ajustarea parametrilor prin metoda celor mai mici pătrate. k . atunci putem face sinteza Patterson. există o probabilitate mai mare să avem atomi şi ne indică aproximativ şi numărul de atomi Z pentru maximul de densitate electronică respectivă. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld După obţinerea unui model structural este necesară rafinarea parametrilor de care depinde difractograma experimentală în aşa fel încât difractograma calculată să se suprapună cât mai bine peste difractograma experimentală [21]. 300 .v. În cazul metodei Rietveld de rafinare se presupune că suntem în apropierea unui minim. Funcţia ce trebuie minimizată este: S y = ∑ wi ( y i − y ci ) 2 i (19) unde: wi .l cos( 2π ( hx + ky + lz )) (18) Cu ajutorul acestei relaţii putem să determinăm distanţe dintre atomi şi mai ales distanţele dintre atomii grei. 2.w)= 1 V h . .Rafinarea modelului structural prin metoda celor mai mici pătrate. Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma experimentală se face prin metoda celor mai mici pătrate.tură. putem să determinăm densitatea electronică de sarcină în celula elementară cu ajutorul următoarei relaţii: ρ ( x.

yi . Calitatea rafinării se apreciază pe baza unor indici de rezidiu. mai ales dacă avem un număr mare 301 . V. Lărgimea la semiînălţime se notează cu FWHM (full width half maximum) şi are următoarea dependenţă unghiulară. în general trebuie impuse constrângeri. În continuare se rafinează parametrii de reţea după care urmează parametrii care descriu profilul liniilor de difracţie. La început se rafinează factorul de scală. exprimată prin funcţia lui Caglioti [23]: H 2 = U tan 2 θ + V tanθ + W (20) unde. şi factorul de polarizare. În ultimele etape. Din literatură şi din experienţă proprie am constatat că este necesar să se adopte următoarea strategie. fondul difractogramei se descrie cu un polinom a cărui grad poate fi între 10 şi 40. yci . factorul care descrie absorbţia razelor X. Pentru o reuşită în rafinarea Rietveld trebuie adoptată o anumită strategie referitoare la ordinea în care se rafinează diferiţi parametrii de care depinde difractograma[24]. H este lărgimea la semiînălţime şi U. W sunt parametri care se pot rafina. deformaţiile de reţea.intensitatea observată la pasul i. se rafinează poziţiile atomilor în celula elementară şi eventual factorii de ocupare pentru atomi. Profilul liniilor de difracţie depinde de parametrii ce caracterizează dimensiunile cristalitelor. factorul de temperatură şi coeficienţii polinomului care descriu fondul. Pentru o difractogramă oricât de perfectă maximele de difracţie calculate sunt uşor deplasate faţă de cele experimentale. factorii care descriu asimetria liniilor de difracţie etc. În general. Forma funcţiei de profil a liniilor de difracţie depinde şi de semilărgimea la semiînălţime a liniei de difracţie respective. Urmează rafinarea deplasării punctului de zero pentru difractogramă.intensitatea calculată la pasul i. În ceea ce priveşte rafinarea poziţiilor atomilor în celula elementară. care iau în considerare concordanţa dintre modelul calculat şi cel experimental şi care se definesc în felul următor: RP = ∑| y − y ∑y i i ci | (21) 1/ 2 RWP 2 ⎧ ⎪ ∑ wi ( y i − y ci ) ⎫ ⎪ =⎨ ⎬ 2 ⎪ ⎪ ⎩ ∑ wi ( y i ) ⎭ (22) unde wi=1/yi şi se numesc factori de pondere.

Difractometru este prevăzut cu o bază de date pentru efectuarea de analize calitative şi cu software pentru determinarea raportului cristalin-amorf. 3. Aceasta ar trebui făcută săptămânal. C–O pentru legături simple sau duble. Modul de aliniere şi calibrarea lunară se găsesc în documentaţia de folosire a difractometrului. Constrângerile slabe este necesar să fie impuse asupra distanţelor dintre atomi deoarece există distanţe standard dintre atomi. au fost adaptaţi alţi suporţi de probă care să permită difracţie pentru cantităţi foarte mici de probă. în procesul de rafinare a complecşilor de incluziune. Suporţii de probă aduşi de firmă nu au permis analiza unor cantităţi mici de probă. este necesar ridicarea unei difractograme pentru un etalon de siliciu. De exemplu. de aceea. De exemplu. Totuşi.de atomi pe celula elementară. aceste distanţe pot să varieze între anumite limite. Pentru analiza calitativă. de exemplu C–C. fiecare din cele şapte unităţi glicozidice care intră în componenţa ciclodextrinei împreună cu atomii de oxigen secundari au fost considerate ca “rigid body”. La fel se pot impune constrângeri slabe pentru unghiurile de legătură şi pentru unităţile structurale care sunt planare. Există două tipuri de constrângeri: constrângeri slabe sau “soft restrain” [25] şi “rigid body“ [26]. Pentru o mai mare siguranţă referitoare la punctul de zero al difractometrului. În cazul în care se fac măsurători pentru compuşi anorganici cu 302 . Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente Aparatura de difracţie disponibilă este un difractometru Shimadzu XRD–600 prevăzut cu un monocromator pentru fasciculul difractat. mai este necesară o calibrare mai complectă la fiecare lună. Acest fel de constrângeri urmăreşte să se reducă numărul parametrilor ce trebuie rafinaţi şi obţinerea unui model de structură realist. Constrângerile puternice sau “rigid body” se aplică atunci când urmărim ca o grupare de atomi să se mişte împreună sau să se modifice distanţele dintre atomi. pentru ciclu benzenic se impun constrângeri slabe referitoare la planeitatea acestui ciclu [27]. dar forma ansamblului să nu se schimbe. permiţând translaţia şi rotaţia acestora. Timpul de înregistrare pentru difractograme şi fantele folosite depind de tipul de măsurători efectuate. Unităţile glicozidice au fost legate între ele prin constrângeri slabe. Este recomandat ca difractometrul să fie aliniat în fiecare dimineaţă înainte de a începe experimentele. Pe lângă aceasta. timpul de înregistrare este suficient să fie 0 2 /minut.

S. să fie curăţate. Pentru indexarea compuşilor şi determinarea parametrilor de reţea este indicat să se folosească şi standard intern deoarece în acest caz se poate evalua mai precis punctul de zero al difractometrului şi se pot determina mai exact poziţiile liniilor de difracţie. 252-255 (1977). M. 3. Powder diffraction. dacă este cazul. Visser J. R. A. Billinge. G. Nu este indicată achiziţionarea de tuburi de raze X care să nu se utilizeze deoarece tuburile de raze X se deteriorează în timp. măsurătorile trebuie să se facă aproximativ între 10 si 800. 9. iar pentru compuşi organici care au celula elementară mai mare între 3 si 450. este avantajos utilizarea tubului de Cr. Tubul de Cu dă fluorescenţă pentru probele care conţin Fe sau Mn. 4.Bish and J. Alexander X-Ray Diffraction Procedures J.M.C Publishing 2008. fantele trebuie să fie cât mai înguste. de Woolff. Boultif. D.Louer J. 8. J. 89 (1969). 24. Pentru analiza cantitativă de faze este indicat să se lucreze cu metoda standardului intern. este indicat să se controleze filtrele pentru apă odată la 3 luni şi. 10. eventual să se lase aparatul să funcţioneze şi peste noapte. 6. Fundamentals of crystallography. J.E. Post. 108-113 (1968).L. 36. adâncimea de pătrundere a razelor X este mult mai mică în cazul utilizării tubului de Cr. Neumann J. 4. Ed. 2. Appl. Inc 1974. ci doar înregistrarea maximelor de difracţie care trebuie să se facă cât mai precis. Ed. Giacovazzo. Cryst. Appl.S. Bibliografie 1. P. În cazul în care se încearcă determinarea structurii pentru un nou compus. Pentru analiza microstructurală nu este necesară înregistrarea difractogramei pe întreg domeniul. Dacă se lucrează cu probe care conţin Fe sau Mn este de dorit să se folosească tub de Cr care există în dotarea laboratorului. timpul de înregistrare trebuie să fie mare. 2. Smith and R. 987-993 (1991). adică timpul de înregistrare să fie în jur de 20 ore.E.J. 5. Cryst. de aceea.celula elementară mică.P.L. H. chiar dacă acestea nu funcţionează. Cryst. când dorim să vedem efectele structurale de suprafaţă sau când avem probă puţină. Powder Diffraction Reviews in Mineralogy Vol 20 1989.L. În acest caz.E.W. 7. Appl. 303 . C. Cryst. De asemenea. 356-365 (2003). 1. Din punct de vedere tehnic. Eds D. Oxford University Press 2002. Willey& Sons. Appl. Dinnebier and S. Snyder J. care poate fi chiar proba cântărită din etalonul de Si. Cryst. Appl. R. Klug and L.

357-361 (1981). Leuse. 20. H. P. Crystallogr. J. Ed.E. 1169 (1999). Cox.C.B. 219. 14. 24. 23. Fourquet Mater. Mavridis. Res.E. Cerny J. V. C. Giacovazzo. Harris. B47. H. K. Appl. 11. O. 27. M. Cryst. Report LAUR 86-748. R. 110. Crystallogr. 847-856 (2004).E. S.Scardi J. S. Phys. Le Bail. 18.B. Fundamentals of crystallography. Oxford Science Publications 1999. Louer and P. 32. R. 14. McCusker. 26. C. J. 2. 22. Favre-Nicolin and R. Leusen J. Ed.S. O. K. 447-452 (1988). M. Pawley J. 84-92 (1999). A. Cole Acta Cryst. Werner. Dinnebier Powder Diffraction 14. H. 15.L.Wilke. Von Dreele. Konig. Young Oxford University Press (1993). 12. Cryst.D. G. Appl. Deem J. Engel.10. Mentzafos. 367-370 (1985). Oxford University Press 2002. Koning. 16. D. G. Nowell. Favre-Nicolin and R. Tsoucaris Acta. NM. I. F. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Giacovazzo. 87545. 304 .J. Kristallogr. Bull. Le Bas. 17. 746-757 (1991).C. Appl. Appl.D. 65-71 (1969). 21. D. Cryst.M. F. Crystallogr. G. Larson & R.M Rietveld J. D. Westdahl J. 33. Appl. J.E. Direct phasing in crystallography. 734-743 (2002).A. Cryst.P.E. L. Cerny Z. Cryst. The Rietveld Method.M. 36-50 (1999). 13. Chem. Wike. 25.Engel. Duroy. 899-908 (2000). Falcioni. Appl. 19.Harris. 835-840 (2002). B B58. 35.Eriksson. R. Attfield and J. Appl. G. A.W. V. L. USA. Coelho J. Appl. Cryst. 18.B. G. Los Alamos National Laboratory. 32. 32. 1169-1179 (1999). 23. 1754-1766 (1999). M.

.... a grupului spaţial şi a poziţiilor atomilor în celula elementară...S.............. 306 1....3............. se obţin doar câteva zeci......................... structura cristalină se determină din monocristale.......2................. în cazul pulberilor................I....... Gheorghe Borodi Cuprins 1... 319 4.........2...1... foarte multe intensităţi de difracţie se suprapun.................... 312 2.......... Indexarea difractogramelor .... 307 1.......................................... Pentru orice compus nou preparat într-un anumit fel este de dorit să se determine structura cristalină..... A determina structura cristalină pentru un anumit compus înseamnă determinarea sistemului cristalografic în care acesta cristalizează....... Algoritmi de indexare ..............3...................... Determinarea structurii cristaline din pulberi este mai dificilă deoarece...... 319 4...... 311 2.................................... dar de foarte mare ajutor sunt metodele spectroscopice şi de modelare moleculară care pot să furnizeze informaţii structurale deosebit de utile.1........... Câteva metode uzuale de idexare ............. Exemple privind determinarea structurii cristaline din pulberi .............Determinarea structurii cristaline prin difracţie de raze X C..............2................................ Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld ..................................................... iar extragerea acestora este dificilă şi afectată de erori..... 322 5...... În cazul în care nu se pot obţine monocristale se încearcă determinarea structurii cristaline din pulberi.. 314 3..... Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluziune Atenolol + β ciclodextrina. Metoda de căutare în spaţiul direct ......................1....1................. ......... deoarece proprietăţile materialelor în stare solidă depind de structura cristalină şi moleculară a acestora............................................ 325 Determinarea structurii cristaline este foarte importantă.... în timp ce la monocristale se pot colecta mii de intensităţi de difracţie................. Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi ...... Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ..... atât în diferitele ramuri ale ştiinţei.... a parametrilor celulei elementare. 309 2....................................................... 316 4........................................................................................ În general...................................... Obţinerea modelului structural .....4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida.......... Bibliografie ........ 305 ...............1........... 307 1.......... Pe lângă aceasta............................. dr................ 311 2....... Structura cristalină pentru N-(5-etil-[1........................... Determinarea structurii cristaline se face în principal prin difracţie de raze X..................................... Totuşi................................2........... Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească o difractogramă pentru a putea fi indexată corect ...... cât şi în industrie şi tehnologie.......1.. Extragerea intensităţilor de difracţie............................................... 311 2....................

dacă poziţiile maximelor de difracţie ar fi determinate exact. trebuie menţionat că indexarea este cu atât mai dificilă cu cât simetria este mai scăzută. nu se poate determina structura cristalină. Dificultăţile în indexarea difractogramelor provin din erorile legate de determinarea poziţiilor maximelor de difracţie. cât şi direcţia pentru un număr foarte mare de vectori din reţeaua reciprocă. cu cât sistemul cristalografic are simetrie mai joasă. Aceasta este total diferită faţă de cazul determinării structurii cristaline din monocristale. foarte multe structuri cristaline au fost determinate din pulberi. Etapele principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: indexarea difractogramelor. dacă aceasta nu este făcută corect. datorită creşterii puterii de calcul şi rezoluţiei difractometrelor. cu atât are mai multe linii de difracţie. la difracţia pe pulberi se obţin doar câteva zeci de unghiuri de difracţie din care se determină modulul vectorilor corespunzători din reţeaua reciprocă. Astfel. De asemenea. dar se alege acea celulă care are volumul cât mai mic şi simetria cât mai mare. Indexarea difractogramelor este primul pas în determinarea structurii cristaline. în timp ce în cazul difracţiei pe monocristale se obţin mii de vectori din reţeaua reciprocă. Indexarea difractogramelor A indexa o difractogramă înseamnă a determina sistemul cristalografic. 1. unde se determină atât modulul. Deoarece în cadrul ICE există difractometru pentru pulberi ne vom ocupa doar de determinarea structurii cristaline din pulberi cristaline. cel mai dificil. obţinerea modelului structural şi rafinarea Rietveld a modelului obţinut. indexarea ar fi imediată. iar la final se vor da câteva exemple de determinare a structurii cristaline din pulberi. în cazul pulberilor. Dificultatea indexării provine din faptul că. cel mai uşor se indexează compuşii care cristalizează în sistemul cubic şi. Astfel. În general. atunci se obţin poziţiile tuturor atomilor din celula elementară. datele experimentale sunt proiecţia unidimensională a reţelei reciproce care este tridimensională. Astfel. Aceasta deoarece. compuşii care cristalizează în sistemul triclinic. din difractogramele pe pulberi se determină unghiurile de difracţie din care rezultă modulul unui număr limitat de vectori din reţeaua reciprocă din care se doreşte să se reconstituie întreaga reţea reciprocă. Vom descrie aceste etape. parametrii celulei elementare şi atribuirea fiecărei linii de difracţie a indicilor Miller corespunzători. o celulă elementară se poate defini în mai multe moduri. dintre care unele se suprapun 306 . Celula elementară este un paralelipiped în interiorul căruia se găsesc atomii sau moleculele şi dacă acesta se translatează după cele 3 direcţii.în ultimul timp.

unul dintre indicii Miller este tot timpul par din cauza reflexiilor interzise. Aceasta deoarece la unghiuri mici peak-urile de difracţie sunt mai rare şi şansele de a se suprapune sunt mai mici. ceea ce face ca să nu se poată determina precis poziţiile maximelor de difracţie. În general.parţial. dacă avem impurităţi. Erorile sistematice sunt mai nefavorabile pentru indexare decât erorile întâmplătoare. de exemplu. Cea mai precisă corecţie se face prin utilizarea de standard intern. Aceasta presupune introducerea în proba de analizat a unui compus pentru care se ştiu exact poziţiile maximelor de difracţie. b) Numărul de extincţii pentru maximele de difracţie la unghiuri mici să nu fie foarte mare. Acest lucru este foarte important deoarece nu se poate distinge între liniile de difracţie ale compusului şi liniile de difracţie ale impurităţii. Astfel. Cele mai importante erori sistematice sunt poziţia de zero a difractometrului şi deplasarea probei. d) Să nu existe impurităţi în proba de analizat. În cazul căutării în spaţiul direct. definirea celulei elementare pentru sistemul cubic depinde de un singur parametru. pentru sistemul ortorombic depinde de trei parametrii. În programele de calcul elaborate în ultimul timp se poate face indexarea chiar când există un număr mic de reflexii care aparţin impurităţilor şi acestea sunt excluse dacă celelalte linii de difracţie se potrivesc cu celula elementară găsită. Erorile sistematice pot să fie minimizate prin alinierea difractometrului. atunci la indexare s-ar putea să avem o celulă cu o constantă de reţea dublă faţă de cea reală. Indexarea difractogramelor se face în mod automat folosind diferiţi algoritmi de calcul[1]. 1. se variază parametrii celulei elementare într-un anumit mod şi se aleg acele 307 . cât şi standard intern. iar pentru sistemul triclinic depinde de şase parametrii. Pentru corectarea erorilor sistematice se poate folosi atât standard extern. c) Să avem o precizie mare pentru determinarea poziţiilor de difracţie. Dacă. obţinem o celulă elementară incorectă. Indexarea este cu atât mai dificilă cu cât simetria reţelei cristaline este mai joasă.1 Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească o difractogramă pentru a putea fi indexată corect sunt: a) Să existe linii de difracţie observabile la unghiuri cât mai mici.2 Algoritmi de indexare Există două abordări pentru algoritmii de indexare şi anume căutarea în spaţiul direct şi în spaţiul reciproc. 1.

10 şi se caută cea mai bună potrivire dintre poziţiile calculate şi observate ale unghiurilor de difracţie.b. Valoarea indicilor Miller variază între 0 308 . în special pentru sistemul triclinic şi monoclinic. merită menţionate următoarele: Autox [2]. este o metodă iterativă şi Monte Carlo ce utilizează poziţiile liniilor de difracţie pe baza descompunerii difractogramei şi extragere a intensităţilor de difracţie LSI (Least Square Indexing) and LP-Search [5]. Aceasta este tot o variantă a metodei Monte Carlo. pentru sistemul triclinic fiind 6. În cazul indexării. dacă se lucrează în spaţiul direct. Metodele de indexare care utilizează spaţiul reciproc sunt mai eficiente decât cele de căutare în spaţiul direct. Astfel. O altă posibilitate de căutare este utilizarea metodei Monte Carlo. Dintre programele de calcul care utilizează căutarea în spaţiul direct. mai ales în cazul compuşilor cu simetrie scăzută. Căutarea în spaţiul reciproc poate fi implementat în două variante. Există şi posibilitatea utilizării algoritmilor genetici pentru indexarea difractogramelor. utilizând spaţiul direct. McMaille [3] şi SVDIndex [4] care se bazează pe metode de căutare de tip Monte Carlo. Deci se cunosc un număr limitat de vectori ai reţelei reciproce şi se urmăreşte să se găsească vectorii elementari ai reţelei reciproce care să genereze întreaga reţea reciprocă. care se numeşte setul de bază şi care sunt liniile de difracţie cu cele mai mici unghiuri. β . γ cu 0. pentru sistemul cubic numărul unghiurilor din setul de bază este 1 pentru sistemul tetragonal.valori pentru care poziţiile maximelor de difracţie calculate se potrivesc cât mai bine cu cele observate.c cu aproximativ 0. se variază parametrii celulei elementare a. şi anume: metoda de încercare şi eroare şi metoda de căutare pe zone. Această metodă este metoda directă de căutare în spaţiul direct. este mult mai mare decât în spaţiul reciproc.01 Å şi unghiurile α. iar a doua variantă este mai eficientă pentru sisteme cu simetrie joasă. Vectorii reţelei reciproce sunt legaţi de unghiurile de difracţie prin relaţia (2sin θ )/ λ =1/d. Timpul de calcul. este 2 şi aşa mai departe. La căutarea în spaţiul reciproc se caută să se găsească vectorii elementari ai celulei reciproce folosind unghiurile de difracţie. Din vectorii elementari ai reţelei reciproce rezultă imediat vectorii elementari ai reţelei directe. O altă tehnică de indexare foarte puternică şi care este implementată în programul de calcul de către firma Bruker Topas. Prima este mai eficientă pentru sisteme cu simetrie ridicată de la cubic la ortorombic. Metoda de încercare şi eroare se bazează pe atribuirea de indici Miller la un număr minim de peak-uri de difracţie. Numărul unghiurilor de difracţie din setul de bază este egal cu numărul parametrilor ce caracterizează celula elementară.

l. 1. h. Metoda căutării pe zone începe prin căutarea zonelor unidimensionale.0. după care se calculează parametrii celulei elementare [6].k. Această metodă este o metodă de căutare în spaţiul reciproc şi se bazează pe atribuirea unor indici Miller la primele linii de difracţie. 0.0. dar cele mai bune rezultate se obţin pentru sistemele cu simetrie ridicată. Dacă difractograma experimentală are şi impurităţi. Având parametrii celulei elementare. care este de simetria cea mai ridicată şi termină cu sistemul triclinic. se generează toate poziţiile posibile ale maximelor de difracţie şi se verifică dacă poziţiile unghiulare ale maximelor de difracţie observate sunt incluse în cele calculate în limita unor erori de măsură. Programele de calcul care fac indexarea prin metoda Dicvol încep de la sistemul cubic. adică de tipul h. Se reţin acei parametrii de reţea pentru care unghiurile calculate se potrivesc cel mai bine cu unghiurile experimentale şi care indexează toate sau aproape toate unghiurile experimentale.l şi construirea zonelor tridimensionale utilizând liniile comune din zonele bidimensionale.0.0. km. Aceste valori sunt între 2 şi 4. 0. dacă în intervalul respectiv se găseşte soluţia elementară. l notate cu hm. se încearcă atribuirea indicilor Miller pentru toate reflexiile Bragg observate. adică de tipul h.k. Metoda Dicvol.k.3 Câteva metode uzuale de idexare Metoda Treor. atunci această metodă nu poate să facă corect indexarea deoarece nu are posibilitatea să dis309 .l şi bidimensionale. Operaţia se repetă atribuind alţi indici Miller primelor maxime de difracţie şi se ordonează soluţiile în ordinea descrescătoare a factorilor de încredere. lm.0. 0.0. Metoda Dicvol [7] este o metodă de căutare în spaţiul direct şi se bazează pe metoda dihotomiei care constă în variaţia lungimilor celulei elementare şi a unghiurilor dintre axe între anumite limite şi reducerea intervalelor respective. Se reţin acele valori ale parametrilor de reţea care se potrivesc cel mai bine cu valorile experimentale şi se calculează pentru acestea factorul de încredere. Se testează toate sistemele cristalografice începând de la sistemul cubic până la sistemul triclinic.şi valori maxime preselectate pentru h. Pentru fiecare permutare a indicilor se determină parametrii celulei elementare. după care se calculează factorul de încredere. Când o zonă tridimensională (reţeaua) a fost construită. se generează unghiurile de difracţie şi se verifică dacă unghiurile calculate se potrivesc cu cele experimentale.h. Cu acest program se poate indexa orice sistem cristalografic.

s-ar putea ca soluţia să fie corectă. b) Construirea reţelelor tridimensionale prin găsirea de zone bidimensionale care au o zonă unidimensională comună. Pentru fiecare combinaţie de parametrii ai celulei elementare se generează poziţiile maximelor de difracţie. realizează o căutare a zonelor în spaţiul reciproc şi transformare a axelor celulei pentru a găsi o celulă cât mai potrivită [9]. Cu această metodă de indexare se obţine şi grupul spaţial la care aparţine compusul. În general. Programul Ito este folosit în special pentru indexarea sistemelor cu simetria joasă. Un număr de 30-35 de reflexii Bragg este recomandat. c) Reducerea celulei găsite şi transformarea acesteia în una din cele 14 reţele Bravais. Pe lângă aceste programe de calcul am mai elaborat şi noi un program [10] care se bazează pe căutarea în spaţiul direct pentru parametrii reţelei cuprinşi într-un anumit interval şi cu un anumit pas. Pentru a se indexa cu această metodă se parcurg următorii paşi: a) Găsirea potenţialelor zone utilizând primele 20 unghiuri Bragg. dar aceasta trebuie confirmată. în special triclinic şi monoclinic. După indexare cunoaştem volu310 . împreună cu programul aferent. cu atât şansa de a obţine mai repede soluţia corectă la indexare este mai mare. din programele de indexare rezultă mai multe soluţii foarte diverse între ele. Metoda Ito. cu condiţia ca liniile de difracţie neindexate să fie de mică intensitate şi. Se ordonează soluţiile în ordinea descrescătoare a erorii medii. acestea să aparţină unor impurităţi. Programul cere cel puţin 20 de reflexii Bragg şi nu funcţionează cu mai puţine linii de difracţie.tingă între liniile de difracţie ale compusului şi ale impurităţilor. d) Atribuirea indicilor Miller pentru toate maximele observate şi calcularea figurilor de merit. O primă observaţie este că dacă nu au fost indexate toate liniile de difracţie. Cele mai comune versiuni sunt ITO13 şi ITO15. Ca o remarcă generală: cu cât poziţiile liniilor de difracţie sunt determinate mai precis şi cu cât proba de analizat este mai pură. Maximelor de difracţie experimentale li se pun în corespondenţă cele mai apropiate maxime de difracţie calculate. în acest caz. O metodă asemănătoare cu Dicvol şi care se bazează tot pe procedeul dihotomiei. Această metodă de calcul. se calculează eroarea medie dintre poziţiile maximelor calculate şi cele experimentale şi se trece la pasul următor. dar care nu este foarte sensibilă la impurităţi se numeşte X-cel [8]. rămânând una sau două linii de difracţie neindexate. Programul mai ţine cont de densitatea aproximativă a compusului şi de numărul posibil de molecule pe celula elementară. O altă observaţie în alegerea soluţiei corecte se referă la densitatea calculată.

atunci o putem compara cu densitatea calculată şi să confirmăm dacă indexarea poate fi corectă cu soluţia aleasă.mul celulei elementare şi dacă presupunem un anumit grup spaţial putem determina numărul de molecule pe celula elementară şi de aici densitatea.1 Extragerea intensităţilor de difracţie Metoda Le Bail de extragere a intensităţilor de difracţie este inspirată din metoda Rietveld. Densitatea calculată trebuie să aibă o valoare rezonabilă în funcţie de elementele care se găsesc în compus. Dacă indexarea se face cu Dicvol. Treor sau Ito. modelul structural obţinut nu va putea fi rafinat. Vom descrie pe scurt cele două metode. Le Bail a extins această metodă pentru estimarea valorilor absolute a factorilor de structură. Vom descrie pe scurt cele două tipuri de metode. se pot considera valorile calculate ale intensităţilor de difracţie. mai ales atunci când fondul de difracţie este supraestimat. Dacă s-a determinat densitatea experimentală. când nu există un model structural.1. şi anume: metode utilizate în cazul monocristalelor şi metode de căutare în spaţiul direct. Rezultatele intensităţilor de difracţie extrase nu depind de valoarea intensităţilor iniţiale. 2. Intensităţile de difracţie pentru iteraţia (r+1) se exprimă în funcţie de intensităţile de difracţie pentru iteraţia r. Obţinerea modelului structural Pentru obţinerea modelului structural există două posibilităţi. metoda Le Bail şi metoda Pawley. Un alt criteriu foarte important este valoarea figurii de merit. Le Bail a propus o metodă iterativă de determinare a intensităţilor de difracţie observate. Deşi metoda este în general robustă. figura de merit trebuie să fie neapărat mai mare ca 4. Dar cel mai important aspect care a contribuit la creşterea popularităţii metodei 311 . 2.1 Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi În acest caz. Ca intensităţi de pornire. Rietveld a propus un algoritm simplu de evaluare a factorilor de structură observaţi pentru o suprapunere parţială sau totală a maximelor de difracţie. Dacă indexarea este corectă. şi anume. atunci putem să mergem mai departe pentru a obţine modelul structural şi să-l rafinăm. există şi cazuri când prezintă instabilităţi. 2. mai întâi se extrag intensităţile de difracţie deoarece se ştie că în cazul difracţiei pe pulberi foarte multe intensităţi de difracţie se suprapun. Există două tehnici de extragere a intensităţilor de difracţie. în caz contrar.

în schimbul intensităţilor de difracţie. Paşii care trebuie urmaţi sunt: (i) Corectarea intensităţilor de difracţie. În timp ce pentru monocristale se pot colecta câteva mii de intensităţi. după ce au fost obţinute intensităţile de difracţie.Le Bail este că aceasta poate să fie uşor încorporată în tehnica Rietveld de rafinare. Mărimea matricei nu este o problemă deoarece matricea este cvasidiagonală. Dificultatea adaptării procedeului de calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea că metodele de calcul sunt metode statistice şi necesită un număr mare de intensităţi de difracţie. care nu necesită un model structural. Unii autori au căutat să elimine maximele negative prin rafinarea mărimii factorilor de structură.2 Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi După extragerea intensităţilor de difracţie prin metoda Le Bail sau Pawley. factorul de absorbţie şi factorul de extincţie. intensităţile acestora se reduc cu un factor de temperatură. Aceste corecţii pot să fie făcute şi în cadrul extragerii intensităţilor de difracţie. Metoda Pawley este o metodă pentru determinarea intensităţilor de difracţie din difractograma de raze X. termenii nediagonali diferiţi de zero provin de la suprapunerea maximelor de difracţie vecine. pentru obţinerea modelului structural se poate urma procedeul care se foloseşte pentru monocristale. metoda Pawley rezolvă problema de extragere a intensităţilor de difracţie printr-o tehnică matricială. Primul pas. se determină factorul de scală şi de temperatură şi se obţine modulul factorilor de structură. 2. în unele cazuri s-au obţinut rezultate bune.5 dintr-un pas de înregistrare a difractogramei.1. Datorită faptului că atomii oscilează în jurul poziţiilor de echilibru. (ii) Determinarea factorului de scală şi a factorului global de temperatură. (iii) Determinarea fazei factorilor de structură. numărul de intensităţi care se pot obţine pentru pulberi este de ordinul a zecilor până la 3 sau 4 sute. Deşi procesul de rafinare este în general stabil. Dar factorii de 312 . Experienţa arată că aceasta are loc când poziţiile a două maxime de difracţie sunt mai apropiate unele de altele cu 0. Cu toate acestea. Aceştia sunt: Factorul Lorentz. În timp ce metoda Le Bail este o metodă iterativă. este corectarea acestora de factori fizici sau geometrici care afectează intensităţile de difracţie. factorul de polarizare. Dacă se fac corecţiile intensităţilor de difracţie. maxime de difracţie foarte apropiate pot duce uneori la apariţia de maxime de difracţie negative.

(v) Rafinare Fourier. putem să determinăm densitatea electronică de sarcină în celula elementară.l cos( 2π ( hx + ky + lz )) V h . Modelele structurale obţinute prin metodele directe sau metoda Patterson sunt adesea incomplete chiar şi pentru monocristale. există o probabilitate mai mare să avem atomi şi ne indică aproximativ şi numărul de atomi Z pentru maximul de densitate electronică respectivă. v. Δ y. după relaţia: 2 1 P(u. k . dacă densitatea electronică este mai mare. faza acestor numere complexe este arbitrară pentru structuri necentrosimetrice şi are valoarea 0 sau π pentru structuri centrosimetrice. k . Cele mai importante tehnici de rafinare Fourier sunt: Sinteze Fourier succesive şi Sinteza Diferenţă. z ) = 313 .v. Metodele de determinare a fazei factorilor de structură se numesc în cristalografie metode directe şi se bazează pe metode statistice şi probabilităţi condiţionate. distanţele dintre atomii grei.structură sunt numere complexe. y . deci în acest caz factorii de structură sunt numere reale pozitive sau negative. Dacă nu s-au determinat fazele factorilor de structură şi avem numai modulul acestora. ρ ( x.l unde u. atunci putem face sinteza Patterson. dacă aceştia există.w) = ∑ Fh . iar pentru pulberi cu atât mai mult pentru că numărul de intensităţi experimentale este mult mai mic. Δ z. (iv) Sinteza Fourier şi sinteza Patterson. Cu ajutorul acestei relaţii putem să determinăm distanţe dintre atomi şi. Pe baza densităţii electronice se poate construi un model structural aproximativ. Cunoscând factorii de structură. mai ales. Pentru a îmbunătăţi şi completa modelul se apelează la tehnici de rafinare Fourier. cu ajutorul relaţiei: 1 ∑ Fhkl exp( −2πi(hx + ky + lz )) V hkl Densitatea electronică de sarcină se exprimă direct în unităţi electronice astfel încât. w reprezintă respectiv Δ x. Determinarea fazei factorilor de structură când se cunoaşte modulul factorilor de structură este cea mai complexă problemă în procesul de determinare a structurilor cristaline pentru monocristale. Cu ajutorul sintezei Patterson putem localiza poziţiile atomilor grei din celula elementară.

Astfel. în celula elementară putem avea o moleculă sau mai multe în unitatea asimetrică. Pentru moleculele organice ca unităţi structurale putem să considerăm întreaga moleculă ca fiind rigidă sau fragmente rigide din molecula care se mişcă unele în raport cu altele. astfel ca difractograma calculată să se suprapună cât mai bine cu difractograma experimentală. metoda Monte Carlo inversă [11]. rezultă că numărul total de configuraţii care trebuie să fie testat este de 10x10=1010. Această metodă nu cere extragerea factorilor de structură din difractogramă. ceea ce cere un timp foarte mare de calcul. Tipul unităţilor structurale care trebuie să fie localizate în celula elementară depinde de natura compusului. Să presupunem că avem doar o moleculă pe celula elementară. pentru fiecare compus avem un număr de grade de libertate care trebuie să fie modificate până când difractograma calculată se suprapune cât mai bine peste difractograma experimentală. grupe de atomi aranjaţi într-o anumită configuraţie. o variantă a acesteia numită parallel tempering şi tehnica algoritmilor genetici.2. La aceasta se adaugă gradele de libertate interne legate de modificarea configuraţiei moleculare prin modificarea unghiurilor de torsiune. Există diverse tehnici Monte Carlo de căutare a configuraţiei optime.2. de exemplu. tetraedrii. se generează configuraţii întâmplătoare în spaţiul parametrilor de căutare. mai rar. În cazul metodei de răcire simulată. Metoda de căutare în spaţiul direct Metoda de căutare în spaţiul direct sau metoda grid search este o metodă de localizare a unităţilor structurale în celula elementară. dintre care amintim: Răcire simulată (simulated annealing). fragmente din molecule. octaedrii etc. Pentru compuşii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjaţi sub diverse forme. Putem să avem atomi. modificându-şi configuraţia prin modificarea unghiurilor de torsiune. distanţe. Pentru moleculele organice. molecule. eventual a unghiurilor de valenţă şi a distanţelor dintre atomi. unghiurilor de legătură dintre atomi şi. avem în mod obligatoriu 3 grade de libertate de translaţie. Aceasta înseamnă că nu se pot testa toate configuraţiile şi de aceea se apelează la metode probabilistice. ca de exemplu. ca de exemplu. În acest caz. presupunem că pentru fiecare grad de libertate corespunde doar 10 zece paşi de căutare. 3 grade de libertate de rotaţie. celelalte molecule fiind generate prin operaţiile de simetrie ale grupului spaţial care caracterizează compusul respectiv. Să presupunem că la cele 6 grade de libertate (translaţii şi rotaţii) se adaugă doar 4 grade de libertate interne şi să avem în total 10 grade de libertate. se testează potrivirea dintre difractograma calculată şi cea expe314 . Dacă.

în scopul determinării minimului absolut. şi anume. fiecare configuraţie porneşte cu o anumită temperatură care scade treptat. în faza iniţială a procesului de căutare a configuraţiei optime. probabilitatea de a găsi un alt minim este de asemenea mică. cu probabilitatea exp(. Probabilitatea relativă a celor două configuraţii de încercare respectă legea lui Boltzman: P1/P2=exp[(CF2-CF1)/T]. atunci se reţine noua configuraţie. dintre care amintim. 315 . temperatura se scade treptat. În schimbul utilizării unui singur lanţ de configuraţii cu descreşterea temperaturii. definit în felul următor: Rwp=[ Σ i wi ( y obd i − i y calc i )2 Σ i wi ( y ) obs 2 ]1/2 Dacă funcţia de cost CF este mai mică decât cea precedentă. Pentru ca unităţile structurale să nu se apropie foarte mult unele de altele. şi anume. fiecare linie de difracţie fiind centrată corespunzător. un alt algoritm a fost dezvoltat. Difractogramele pot fi modelate ca o sumă de două funcţii. Periodic se testează configuraţiile paralele şi se alege configuraţia optimă prin aceeaşi schemă ca în cadrul unui singur proces. când T este foarte mic. Există mai multe programe de calcul care au implementat această modalitate de determinare a minimului global. În timpul procesului de căutare. dar în faza finală. Parallel Tempering (PT) [15].Δ CF/T). Dacă CF este mai mare decât cea precedentă.14]. Totuşi. Ca o măsură a potrivirii dintre difractograma calculată şi cea experimentală. se aleg de la început mai multe configuraţii (un număr mic de configuraţii). poate să se introducă ca şi criteriu pentru modelul obţinut. T fiind temperatura distribuţiei. Astfel. În felul acesta. Orientarea preferenţială poate fi descrisă prin funcţii de tip March-Dollase. Fox [13. Una dintre posibilităţi este să se aleagă ca fiind reziduul R. se poate uşor trece de la un minim local la un alt minim. se poate introduce un factor numit ‘anti-bump’. atunci se reţine noua configuraţie. Lorentziana sau pseudos-Voigt. în afară de potrivirea dintre difractograma calculată şi cea observată. posibilitatea de a se obţine minime locale este mai mică. minimizarea energiei potenţiale de interacţiune inter . Funcţia de cost CF se poate alege în diverse moduri. funcţia care descrie fondul (background) şi o funcţie care sumează liniile de difracţie. Profilul liniilor de difracţie se descrie de obicei prin funcţii standard de tipul Gaussiana.rimentală. În procesul de căutare a minimului global ca şi Cost Function.şi intramoleculară. se consideră funcţia de cost CF. Powder Solve [12]. pentru a evita probabilitatea să cădem într-un minim local.

3. yj. şi anume: de factorii de structură şi indicii Miller corespunzători factorilor de structură respectivi.factorul de structură pentru atomul j. Funcţia ce trebuie minimizată este: (1) S y = wi ( y i − y ci ) 2 ∑ i unde yi si yci sunt intensităţile observate şi calculate la pasul i. s-a făcut o căutare globală. de aceea este posibilă ajustarea parametrilor prin metoda celor mai mici pătrate. etc. Expresia factorilor de structură este dată de relaţia: Fhkl ⎛ B sin 2 θ ⎞ = ∑ N j f j exp[2Π(hx j + ky j + lz j )]exp⎜ ⎟ ⎜ − λ2 ⎟ j ⎠ ⎝ (2) unde: Nj . ϕ. pseudo-Voigt. Profilul liniei de difracţie.coordonatele atomului j. În cazul metodei Rietveld de rafinare se presupune că suntem în apropierea unui minim. cel mai utilizat este GSAS [17]. este necesară rafinarea parametrilor de care depinde difractograma experimentală în aşa fel încât difractograma calculată să se suprapună cât mai bine peste difractograma experimentală [16]. Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma experimentală se face prin metoda celor mai mici pătrate.factorul de temperatură (care se datoreşte vibraţiilor termice). Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld După obţinerea unui model structural. fj . care este descrisă ca fiind o combinaţie a funcţiei Gauss şi Lorentz: 316 . În cazul obţinerii modelului structural. cea mai utilizată este funcţia pseudo Voigt. factorul de scală. pV. potrivindu-se parametrii de structură astfel încât difractograma calculată să concorde cât mai bine cu difractograma observată.factorul de ocupare. Cu alte cuvinte. factorul Lorentz–polarizare. fondul de difracţie în punctul respectiv etc. zj . dându-se intensitatea de difracţie la fiecare pas. xj. se poate aproxima prin diverse funcţii: de tip Gauss. factorul de absorbţie. Dintre acestea. Dintre programele de calcul. iar wi=1/yi este factorul de ponderare. funcţia de profil pentru liniile de difracţie. deoarece nu sunt necesare variaţii mari ale acestor parametrii. yci este difractograma care se calculează la pasul i pentru că difractograma se calculează în paşi. Forma liniilor de difracţie este o convoluţie datorată probei şi efectelor instrumentale. Lorentz. yci depind de o serie de factori. B .

Forma funcţiei de profil a liniilor de difracţie depinde şi de semilărgimea la semiînălţime a liniei de difracţie respective.unghiul ascuţit dintre vectorul de împrăştiere pentru reflexia K şi direcţia preferenţială de orientare a planului cristalitelor faţă de planul probei. ca de exemplu. αK . L fiind funcţia Lorentz. unde 0 se referă la 100% orientare preferenţială a cristalitelor în probă şi 1 se referă la orientare complet întâmplătoare a cristalitelor. Aceasta face ca unele maxime de difracţie să fie mai intense.intensitatea măsurată. Calitatea rafinării se apreciază pe baza unor indici de rezidiu. H este lărgimea la semiînălţime şi U. Orientarea preferenţială are loc când cristalitele din probă tind să se orienteze preferenţial după anumite direcţii. W sunt parametri care se pot rafina. care iau în considerare concordanţa dintre modelul calculat şi cel experimental şi care se definesc în felul următor: RB = RP = ∑| I K ( obs ) ∑| y − y ∑y i i ∑I − I K ( calc) | (5) (6) K ( obs ) ci | 317 . Icor . V. exprimată prin funcţia lui Caglioti[18]: H 2 = U tan 2 θ + V tanθ + W (3) unde. Iobs .funcţia pseudo-Voigt . G . iar altele mai puţin intense faţă de cazul când nu ar exista orientare preferenţială.coeficientul March care variază între 0 şi 1. March-Dollase [19]: I cor = I obs (G 2 cos2 α K + 1 2 sin α K ) −3 / 2 G (4) unde. Lărgimea la semiînălţime se notează cu FWHM (full width half maximum) şi are următoarea dependenţă unghiulară. G funcţia Gaus iar η parametru de amestecare a celor două funcţii.pV = ηL + (1-η)G unde: pV . Orientarea preferenţială poate fi modelată matematic cu ajutorul unor funcţii. PK este funcţia care descrie orientarea preferenţială.intensitatea corectată pentru orientare preferenţială.

maximele de difracţie calculate sunt uşor deplasate faţă de cele experimentale. Constrângerile slabe este necesar să fie impuse asupra distanţelor dintre atomi deoarece există distanţe standard dintre atomi. Din literatură şi din experienţa proprie. C-O. Pentru o reuşită în rafinarea Rietveld trebuie adoptată o anumită strategie referitoare la ordinea în care se rafinează diferiţi parametrii de care depinde difractograma [20]. Pentru o difractogramă oricât de perfectă. Urmează rafinarea deplasării punctului de zero pentru difractogramă. În ultimele etape se rafinează poziţiile atomilor în celula elementară şi eventual factorii de ocupare pentru atomi. σ 318 este . mai ales dacă avem un număr mare de atomi pe celula elementară. wi=1/ σ 2 (yoi) . Dacă rafinarea se face ţinând cont de constrângerile slabe. deformaţiile de reţea. La fel se pot impune constrângeri slabe pentru unghiurile de legătură şi pentru unităţile structurale care sunt planare. De exemplu.RWP 2 ⎧ ⎪ ∑ wi ( y i − y ci ) ⎫ ⎪ =⎨ ⎬ 2 ⎪ ⎪ ⎩ ∑ wi ( y i ) ⎭ 1/ 2 (7) Cei mai utilizaţi indici sunt RP si RWP. mai trebuie să adăugăm şi termenii care iau în considerare constrângerile slabe. care trebuie minimizată. wj=1/ σ 2 (Roj) (8) (yoi) j unde yoi şi yci sunt intensităţile observate şi calculate la pasul i. funcţia ce trebuie minimizată este: SyR= ∑ w (y i i oi-yci) 2+C w ∑ w (R -R j oj cj(x)) 2 . La început se rafinează factorul de scală. pentru legături simple sau duble. atunci la funcţia din formulă (5). am constatat că este necesar să se adopte următoarea strategie. În general fondul difractogramei se descrie cu un polinom a cărui grad poate fi între 10 şi 40. aceste distanţe pot să varieze între anumite limite. În acest caz. factorii care descriu asimetria liniilor de difracţie etc. pentru ciclu benzenic se impun constrângeri slabe referitoare la planeitatea acestui ciclu. în general trebuie impuse constrângeri. Există două tipuri de constrângeri: constrângeri slabe sau “soft restrain”[21] şi “rigid body“[22]. În continuare se rafinează parametrii de reţea după care urmează parametrii care descriu profilul liniilor de difracţie. Profilul liniilor de difracţie depinde de parametrii ce caracterizează dimensiunile cristalitelor. Totuşi. de exemplu C-C. factorul de temperatură şi coeficienţii polinomului care descriu fondul. factorul care descrie absorbţia razelor X şi factorul de polarizare. În ceea ce priveşte rafinarea poziţiilor atomilor în celula elementară.

În cazul în care există şi grupări plane. constrângerile puternice “rigid bodies” sunt incompatibile cu constrângerile slabe. fiecare din cele şapte unităţi glicozidice care intră în componenţa ciclodextrinei. în procesul de rafinare a complecşilor de incluziune. cu atât constrângerile sunt mai puternice. Constrângerile puternice sau “rigid body” se aplică atunci când urmărim ca o grupare de atomi să se mişte împreună sau să se modifice distanţele dintre atomi dar forma ansamblului să nu se schimbe. ca de exemplu. Exemple privind determinarea structurii cristaline din pulberi 4. În general. Complecşii de incluziune cu β -ciclodextrina se folosesc pentru a îmbunătăţi biodisponibilitatea. se porneşte cu un cw mare. pentru ciclu benzenic.y. De exemplu. de ordinul miilor. şi se tot reduce în procesul de rafinare.z). cw este un factor de ponderare care permite să se varieze contribuţia constrângerilor în procesul de rafinare. aceasta înseamnă că atomilor care aparţin unui corp rigid nu le pot fi aplicate constrângerile slabe în acelaşi timp. 319 . În cazul programului de rafinare GSAS [17]. β -ciclodextrina este compusă din 7 unităţi glicosidice. împreună cu atomii de oxigen secundari. au fost considerate ca “rigid body”. Cu cât cw este mai mare.deviaţia standard a intensităţii lor măsurate. Acest fel de constrângeri urmăreşte să se reducă numărul parametrilor ce trebuie rafinaţi şi obţinerea unui model de structură realist. 4. una dintre aceste unităţi este prezentată în figura 1. Roj este valoarea aşteptată pentru mărimea stereochimică respectivă care poate fi lungime de legătură. unghiuri etc (aşa numita pseudo observabilă).1 Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluziune Atenolol + β ciclodextrina. permiţând translaţia şi rotaţia acestora. când în afară de constrângerile slabe se aplică şi constrângeri ca molecula să fie planară. Unităţile glicozidice au fost legate între ele prin constrângeri slabe. iar Rcj(x) este valoarea calculată din poziţiile atomilor (x. atunci este necesară aplicarea constrângerilor de planeitate [23]. δ (Roj) este deviaţia standard a pseudo-observabilei. solubilitatea şi stabilitatea diferitelor medicamente în soluţii apoase. Aceasta are o formă toroidală în care se pot încapsula diferiţi compuşi bioactivi şi se poate realiza eliberarea treptată a acestora.

celula elementară şi configuraţia moleculară. Configuraţia moleculară pentru β ciclodextrină a fost luată din baza de date Cambridge Structural Database [29]. configuraţia moleculară pentru atenolol a fost calculată cu ajutorul programului de modelare moleculară Cerius 2. celula elementară şi modul în care interacţionează şi se cuplează cele două molecule pentru a forma complexul de incluziune. În urma indexării s-a stabilit că. adică să determinăm sistemul cristalografic. Dar la interacţiunea cu atenololul structura cristalină se modifică total în sensul că se schimbă grupul spaţial. indexarea s-a făcut cu ajutorul programului de calcul Ito [9]. complexul de incluziune cristalizează în sistemul monoclinic având grupul spaţial C2 cu 4 molecule de 320 . Figura 2 Formula structurală pentru Atenolol După determinarea poziţiilor maximelor de difracţie. Formula structurală pentru Atenolol este prezentată în figura 2. De aceea. Structura cristalină pentru atenolol nu a fost cunoscută la acel moment.Figura 1 Unitate glicozidică din componenta β Ciclodextrina Noi am urmărit să determinăm structura cristalină pentru Atenolol cu β -Ciclodextrina. grupul spaţial.0 [20]. Structura cristalină pentru β Ciclodextrină se cunoştea.

În schimb.375g/cm3. c=15. background-ul. pentru restrângerile slabe este permisă mişcarea atomilor. s-a permis rotaţia şi translaţia.05 Å. a fost considerată ca “rigid bodies”. O.640. s-a pus condiţia ca toţi cei 7 atomi de oxigen O4 să fie aproximativ în acelaşi plan. Au fost aplicate restrângeri de planeitate pentru gruparea fenil din cadrul atenololului. De asemenea. cu ajutorul restrângerilor de planeitate. Volumul celulei elementare este V=6772. Pentru aceasta s-a utilizat programul de calcul GSAS. punctul de zero pentru 321 . fd fiind factorul de pondere pentru restrângerile de distanţe.ciclodextrină şi 4 molecule de atenolol pe celula elementară şi următorii parametrii de reţea: a= 18. Fiecare unitate glicozidică. Au fost rafinaţi de asemenea parametrii termici. Reamintim că în cadrul unui grup de atomi care au fost definiţi ca “rigid bodies” nu se permite nici o mişcare a atomilor din cadrul grupului.. iar fp pentru restrângerile de planeitate. fa pentru restrângerile de unghiuri.55Å3. Densitatea calculată este ρ =1. dar între anumite limite. În continuare. Pentru obţinerea unui model structural realist s-a procedat la aplicarea unor serii de restrângeri şi constrângeri. o valoare plauzibilă pentru compuşii organici care conţin C. Restrângerile slabe nu se pot aplica pentru atomii din cadrul unui grup aparţinand la “rigid body”. unghiurile de torsiune pentru molecula de atenolol. În urma modelării s-a constatat că molecula de atenolol intră în cavitatea β -ciclodextrinei.450Å. Ca grade de libertate au fost translaţiile şi rotaţiile pentru molecula de ciclodextrină şi molecula de atenolol. Pentru unităţile glicozidice. restrângerile slabe referitoare la planeitatea atomilor (O4)n a fost în cazul ciclodextrinei de 0. utilizând tehnica ”simulated anealling” şi ”paralel tempering”. Iniţial. Pentru funcţiile de profil s-au folosit 12 parametrii. au fost aplicate restrângeri slabe pentru toate distanţele dintre atomi şi unghiurile de legătura dintre aceştia. b=24. împreună cu atomii de oxigen O4. Profilul de difracţie a fost aproximat prin funcţii de tip pseudo-Void. N. Obţinerea modelului structural s-a făcut cu ajutorul programului de calcul. adică fondul de difracţie care a fost aproximat cu un polinom. factorii de pondere pentru restrângerile slabe au fost: fd=fa=fp=5000. β =110.914Å. α =900. parametrii de reţea. γ =900. unele în raport cu altele. iar oxigenii de la capătul grupărilor glicozidice au fost legaţi între ei prin restrângeri slabe (soft restrains). unghiurile de torsiune dintre unităţile glicizidice şi unghiurile dintre unităţile glicozidice. rigidizarea este cu atât mai mare cu cât factorii de pondere pentru restrângerile slabe sunt mai mari.649Å . s-a procedat la rafinarea modelului structural prin metoda Rietveld. H. De asemenea. Astfel.

4.difractogramă şi.8% şi Rwp=11. În final. care au fost în număr de 288. Se observă ca moleculele de ciclodextrină şi cele de atenolol se grupează între ele prin legături de hidrogen. formând un fel de dimeri. vedere după axa b şi c.2. s-a obţinut un rezidiu Rp=7.β CD. Figura 3 Configuraţia moleculară pentru complexul de incluziune atenolol.3. Structura cristalină pentru N-(5-etil-[1. bineînţeles.58%.4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida Structura cristalină pentru acest compus a fost determinată prin combinarea difracţiei de raze X pe pulberi cu informaţii obţinute din RMN pen322 .β -Ciclodextrina. Configuraţia moleculară pentru complexul de incluziune văzut după axa b şi după axa c este prezentată în figura 3. În mod asemănător s-a determinat structura cristalină pentru complexul de incluziune Acid Mefenamic. parametrii de poziţie.

utilizând programul de calcul GSAS [17] combinat cu interfaţa grafică EXPGUI [31] .5364Å. cel mai probabil grup spaţial a fost găsit ca fiind Pbca. s-a calculat densitatea ca fiind ρ =1. Profilul maximelor de difracţie de pe întregul interval 2 θ = 3. s-a utilizat radiaţia Cu K α 1 9 λ =1.tru 13C şi din modelare moleculară. unghiuri şi planeitate a grupării fenil. La acest grup spaţial corespund un număr de 8 poziţii generale. Noi vom descrie în special aportul difracţiei de raze X la determinarea structurii cristaline pentru acest compus. iar 4 la unghiurile de torsiune pentru moleculă.54056Å.5-500 au fost modelate cu funcţii de profil de 323 . s-au aplicat o serie de restrângeri slabe pentru distanţe. b=15. Menţionăm că. Deoarece nu există nici un motiv ca moleculele să se plaseze în poziţii speciale.072. Modelul structural de pornire a fost obţinut cu ajutorul programului de calcul Molden.914 Å3. ceea ce confirmă grupul spaţial ales din reflexiile interzise. unghiuri fa şi planeitate fp au fost reduşi treptat în cursul ciclurilor de rafinare de la 500 la 100. se obţin informaţii structurale foarte importante. Determinarea structurii cristaline s-a făcut prin metoda căutării în spaţiul direct.3846 Å şi volumul celulei elementare fiind V=2740. în cele mai multe cazuri.0148 Å si c=21. S-a obţinut un fit cu Rp=0. Cea mai bună soluţie corespunde sistemului ortorombic cu următorii parametrii de reţea: a=8. prin ajustarea a 10 grade de libertate. folosind programul de calcul Dash [30].05 şi Rwp=0. Deoarece deplasarea chimică obţinută din RMN pe solide este sensibilă chiar şi la mici modificări de împachetare moleculară şi modificare conformaţională din spectrul RMN. care reprezintă o valoare rezonabilă. D8 Advance. Pentru a avea un model structural realist în timpul rafinării. echipat cu un monocromator de Ge (111) pentru fasciculul incident pentru înlăturarea radiaţiei K α 2 şi.37g/cm3. prin urmare. Un factor de temperatură global a fost rafinat pentru toţi atomii. Indexarea compusului s-a făcut utilizând programul de calcul Dicvol [9]. S-a lucrat varianta geometria Bragg-Brentano θ -2 θ prin reflexie. Considerând 8 molecule pe celula elementară. Modelul obţinut în acest mod a fost în continuare rafinat prin metoda Rietveld. Factorii de pondere corespunzători restrângerilor pentru distanţe fd. Prin examinarea difractogramei cu ajutorul programului de calcul Checkcell [28]. Difractograma de raze X pe pulberi a fost obţinută cu difractometrul de raze X. dintre care 6 corespund pentru poziţia moleculei şi orientarea acesteia. rezultă că numărul de molecule pe celula elementară este 8. În continuare s-a făcut fitarea Le Bail a difractogramei experimentale pentru confirmarea grupului spaţial selectat. pentru un anumit grup de reflexii interzise corespund mai multe grupuri spaţiale.

În continuare. Figura 4 Împachetarea în celula elementară şi aranjarea supramoleculară Un alt compus pentru care s-a determinat structura cristalină prin combinarea difracţiei pe pulberi cu spectroscopie RMN şi modelare moleculară a fost Etoxiazolamida [27]. Rexp= 0.079. χ 2=6. modelul a fost îmbunătăţit utilizând tehnici de modelare moleculară combinată cu informaţii obţinute din măsurători de deplasare chimică din spectul RMN.053. s-au obţinut următorii factori care caracterizează figura de merit a modelului structural: Rp=0. Fondul de difracţie a fost modelat cu un polinom Chebyshev de ordinul întâi.113. 324 .71. În final. difractograma calculată şi diferenţa dintre difractograma calculată şi cea experimentală.tipul pseudo-Voight cu 18 termeni. În figura 4 este prezentată împachetarea în celula elementară pentru compusul studiat şi aranjarea supramoleculară sub formă de două şuviţe formate din molecule puse cap la cap. Se observă o potrivire foarte bună între cele două difractograme. deci modelul structural este corect. Rwp=0. În figura 5 este prezentată difractograma experimentală.

1169. 847-856.Wilke . Werner J.Appl. 219.Phys. (2004). (2002) V. F. 36. The Third Pharmaceutical Powder X-ray Symposium (PXRD-3). Monte Carlo indexing with McMaille. 3. Shankland. Borodi. Cryst. 325 . L. 16. A. P. J. R. Guagliardi. Crystallogr. 32.L. Bratu. Powder Diffraction. 36.W. Oxford. Cryst. in: Structure determination from powder diffraction data. Eds.Cerny Z.Simul. 2.Leusen.Appl. Moliterni. Giacovazzo. McCusker. Cryst. 8. P. (2004) M. Gh. L. 734. Bibliografie 1.359 (1988) G. 89 (1969) Gh. M. Le Bail. J. O.B.. A. Appl. and Ch. W. Appl. F. K.Harris . IUCr monographs on crystallography . Cryst. 15. Baerlocher. Oxford University Press. J.Mol. 1180 (2000). S.Cryst. 724 (2004) J. 13. K. 11. Appl. Altomare. 12.D. Cryst. Lou¨er. 69 (1992).A. 19. 6. 1754 (1999) H. David. A. A.Pusztai . 5 Comparaţie dintre difractograma observată şi cea calculată 5.Koning.Favre-Nicolin and R.Werner.J.-E.Engel. 65. 33. 2. Mihailescu. New York (2002) J. 110 .Favre-Nicolin and R. 356 (2003). Rizzi. 9.M.W.Chem. J.Kristallogr. Boultif and D.Deem J.Cerny J. Cryst. 4. 86 (2003). Gavira Roumanian Reports in Physics.Figura. 14. Visser.(1999) V.A. Appl. (1969) 2. 7. A. I. C.M Rietveld . 35. Kern. J.E. 51(7-10) 983 (1999) R. A.G. 10. 25.McGreevy. 5.G. Appl. 37.-E.Falcioni. 249 (2004) J.Appl. Coelho. Appl. I. Autoindexing. Cryst. 1.

(2010) 27. B66. Los Alamos National Laboratory. Acta Cryst. C. M. USA. David. Cryst. 19.C. F. Borodi and C. G.B. 31. Hernanz. M. Acta.Pop.I.B.Laugier. 116. E. Van de Streek. Dragan. J. 1041. Colaborative Computational Project Number 14 (CCP14).Appl. 21. Filip. Bogdan. J. A. R. Mentzafos. H.Am. 28. 29. De Ridder.C. 10. France. 746 (1991) 24. Laboratoire des Materaux et du Genie Physique de l’Ecole Superieur de Physique de Grenoble. J. C. Filip.70. Appl.39. Peschar. J..Chem. D.E. Dinnebier Powder Diffraction 14. 1036. R.Shankland. Oprean and C.A.F. H. (1001) 326 .H.B.17. L. G. 32. (2006). Borodi. W. Soc. 87545. B58. A. 84.C. The Rietveld Method edited by R. J.Appl. K. Borodi. Filip. (1986) 20. G. D. L. 34.A. Peschar. R. (2002).Nowell. G. Von Dreele. 267. Tripon. (1999) 23. Filip. Cryst. Tsoucaris. X.B B58 835.M.210.1039/c1cp21878f. R. Bratu. Attfield and J. I.Mavridis. G. Borodi. B47. Cox.Larson & R.P. T. 910.S.J. Phys.Bochu CHECKCELL. Helmbholdt. Chem.Louer and P. Young Oxford University Press (1993) 19. Report LAUR 86-748.E.5122. I. Spectrochimica Acta A. B. B. R. 18. X. Steiner and G. Morari. 26.A. J. K.Cole. Dollase.D. Acta Cryst.Cryst. Chem. D. Shenk Acta Cryst. Phys.Scardi J. G. Appl. Hangan. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). W.(1994) 30. Cryst. 36. le Bas.Cole. W. DOI. Motherwell..and B. Koeller J. 615. NM. A. Cryst.. J.Pidcock. Toby. Goubitz. (2008) 25. McCusker. D.(2002 22.

În 1931............ ceea ce înseamnă că două caracteristici aflate la o distanţă mai mică de 250 nm nu vor putea fi diferenţiate.. 327 2..... 250 nm)................. 338 1.. Doi ani mai târziu........ Microscoapele optice (figura 1) sunt instrumente mai complexe care conţin un set de lentile care măresc imaginea... Generalităţi . Ruska a creat primul microscop a cărui rezoluţie era superioară unui microscop optic...IX.............. Microscopia electronică de transmisie (Transmission Electron Microscopy – TEM) ....... obiect ce utilizează lentila pentru a focaliza lumina reflectată de un obiect într-o imagine mai mare... Accelerarea electronilor permite reducerea lungimii de undă a unui fascicul de electroni ceea ce face posibila vizualizarea detaliilor cele mai fine.... iar în 1939 primul microscop electronic de transmisie a fost produs în scopuri comerciale............................... Microscopia electronică de baleiaj (Scannig Electron Microscopy – SEM) ... Compania Siemens a patentat invenţia celor doi germani.... Rezoluţia este limitată de lungimea de undă a fotonilor utilizaţi ca sursă de iluminare a specimenului... 328 3... Pentru observarea detaliilor mai mici a fost necesar crearea unui microscop care să utilizeze o sursă de iluminare caracterizată printr-o lungime de undă mult mai mică..... Cel mai comun microscop este lupa. Printre alte surse se numără razele X şi neutronii..... Lucian Barbu-Tudoran Cuprins 1.... fizicianul Ernst Ruska şi inginerul Max Knoll au construit un microscop electronic prototip............. 327 ...... Generalităţi Microscoapele sunt instrumente utilizate pentru a facilita observarea unor obiecte la o mărire mai mare decât cea a obiectului observat. Limitările microscopiei optice constă în rezoluţia obţinută prin această tehnică (aprox... MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ ŞI DE TRANSMISIE Microscopia electronică şef lucrări dr...............

interacţionează cu aceasta în grosimea ei. Microscopul optic 2.1 – ocular 2 – revolver 3 – obiective 4 – viza macrometrică 5 – viza micrometrică 6 – platina 7 – sursă de lumină 8 . informaţiile aparţinând axei z se vor pierde. Ca limitare se aminteşte natura bidimensională a proiecţiei rezultate.diafragma şi lentila condensor Figura 1. Electronii pătrund prin probă. incluzând suprafaţa şi structurile interne. aceştia putând fi deviaţi sau nu. Microscopia electronică de transmisie (Transmission Electron Microscopy – TEM) Prin intermediul TEM imaginea observată este proiecţia probei în grosimea ei. Probele analizate trebuie să fie foarte subţiri deoarece ar absorbi o mare parte a fasciculului de electroni. Organizarea unui microscop electronic 328 . Astfel obiectele având structură internă diferită pot fi diferenţiate deoarece proiecţiile acestora vor fi diferite.

Electronii emişi au o distribuţie Boltzman a energiei şi trebuie să fie concentraţi pentru ca fasciculul rezultat să străbată coloana. 2500K) pentru a învinge ’’the work function’’ a metalului. un vârf Wehnelt şi un anod de extracţie. Pentru a modifica mărirea şi punctul focal al unei imagini se pot utiliza diferite lentile. Prin conectarea filamentului de partea negativă a generatorului de energie. de obicei tungsten sau hexaborid de lantaniu. se asigură convergenţa optimă a electronilor încă din momentul emisiei. prin probă. astfel circuitul fiind complet. Prin construirea unui cilindru Wehnelt. În interiorul coloanei se va stabili un vid înalt pentru a minimaliza interacţiunile dintre electroni şi molecuFigura 2 . circuitul de interferenţă (biasing circuit). Aceşti electroni vor penetra proba şi vor trece printr-o serie de lentile magnetice. Aperturile de pe traseul fasciculul de electroni au rolul de a schimba contrastul şi rezoluţia imaginii. care este încărcat mult mai negativ decât filamentul în sine. electronii pot fi pompaţi de către filament spre placa anodică şi coloana microscopului. Tunul de electroni Electronii sunt emişi de un filament supraîncălzit de un curent electric până când suficientă energie va fi produsă (aprox. În vârful coloanei există un emiţător de electroni cu voltaj înalt care va genera fasciculul de electroni care va traversa coloana. lentile şi aperturi.Secţiune prin coloana unui TEM lele de aer. 329 . Tunul de electroni are mai multe componente: filamentul.Principiile funcţionării unui croscop electronic de transmite nu diferă cu mult faţă de cele ale unui microscop optic. iar în final vor fi focalizaţi pe ecranul situat la capătul coloanei. Cele mai comune microscoape sunt cele de emisie termionică si FEG (Field Emission Guns).

Mărimea şi gradul de apropiere a câmpului electric cauzează desprinderea electronilor de pe filament. Emisia de electroni este asigurată de aplicarea unui puternic câmp electric imediat în vecinătatea vârfului filamentului.Figura 3. de aceea este mai eficient. Schema unui tun de electroni Tipuri de tunuri de electroni Tungsten: filamentul este fabricat din tungsten. Figura 4. FEG: filamentul nu este unul termic. pe măsură ce filamentul se încălzeşte electronii vor fi emişi. iar principiul de funcţionare se aseamănă cu cel al funcţionării unui bec. Tipuri de tunuri de electroni: filament de tungsten şi cristal de hexaborid de lantaniu 330 . Hexaborid de lantaniu: este tot un filament de emisie termionică. dar are ”the work function” mai mică.

apertura obiectiv. vor interfera distructiv. În cazul unui microscop performant se doreşte ca raportul ∆E/E să fie cât mai mic. A doua apertură. Funcţia unei aperturi este determinată de poziţia acesteia în coloana microscopului. Deoarece lentilele sunt reglate pentru o anumită lungime de undă acestea vor concentra electronii cu alte lungimi de undă mai puţin uniforme. iar fasciculul va pierde din intensitate. În cazul lentilelor electro-magnetice acestea pot roti fasciculul de electroni dacă sunt ajustate corespunzător. În cazul prismei lumina este refractată sub diferite unghiuri. Lentila obiectiv are rolul de a realiza primul pas de mărire şi focalizare a unei imagini. Coerenţa temporală. Deoarece electronii emişi sunt supraîncălziţi. apertura condensator. mărirea imaginii sau pattern-ul de difracţie. Dacă electronii sunt defazaţi. Cuplată cu apertura obiectiv va genera contrastul de amplitudine. Când acest fenomen are loc imaginea se va roti pe măsură ce vor fi introduse în coloană alte lentile.focalizează şi proiectează imaginea finală pe suprafaţa folosită pentru vizualizare. este localizată în vecinătatea tunului de electroni şi este utilizată pentru concentrarea electronilor şi menţinerea coerenţei fasciculului. ideal toţi electronii emişi ar trebui să fie în fază. 331 . Faza electronilor afectează coerenţa fasciculul. Prima apertură. Dacă electronii sunt în fază ei vor interfera constructiv. adică distribuţia energiei să fie o mică fracţiune din energia medie a electronilor. Dacă electronii emişi sunt paraleli atunci fasciculul va fi coerent o mai multă perioadă. Ultima lentilă – lentila proiector . prin poziţia şi puterea ei. Această apertură controlează contrastul unei imagini. Lentila intermediară controlează. distribuţia energiei nu este sub forma unui singur peak. Pentru formarea imaginii se folosesc 3 tipuri de lentile. lumina fiind descompusă în radiaţii cu lungimi de undă diferite. Se referă la intensitatea fasciculului. este localizată sub probă imediat după lentila obiectiv. Aperturile Aperturile sunt găuri de-a lungul coloanei microscopului care pot limita mărimea fasciculul de electroni. Lentilele Lentilele utilizate în microscopia electronică sunt bobine magnetice care au scopul de a focaliza şi direcţiona fasciculul de electroni. Coerenţa spaţială. Prin urmare în urma trecerii fasciculului printr-o lentilă acesta va suferi o scindare. în schimb distribuţia este de tip Boltzman şi diferă în funcţie de natura filamentului.Fasciculul de electroni se caracterizează prin coerenţă. Această aberaţie cromatică se aseamănă cu scindarea luminii când o rază traversează o prismă.

prin intermediul goniometrului. Dacă electronul nu loveşte un atom din probă acesta va avea o traiectorie nedeviată până la ecranul care va colecta imaginea. În cazul microscopiei electronice de transmisie proba analizată este depusă pe o grilă de metal. În cazul unei ciocniri inelastice electronul va ceda o cantitate variabilă de energie specimenului. luminozitatea fasciculului.Holder utilizat în microscopia electronică de transmisie Dacă se doreşte vizualizarea unei probe sub diferite unghiuri sau realizarea unei tomograme. Dacă electronul intră în contact cu atomi din probă poate suferi o ciocnire elastică. Acest holder de metal.5). voltajul curentului etc. Pe consolă se mai află butoane care controlează poziţia specimenului în interiorul coloanei.Exteriorul microscopului Consola utilizatorului constă dintr-un ecran pe care se vor afişa parametrii sub care funcţionează microscopul precum: mărirea. nu va pierde din energie. 332 . focalizarea şi mărirea. va asigura introducerea probei în vidul din coloana microscopului cu o scădere minimă a presiunii din interiorul coloanei. iar legea conservării momentului va determina unghiul la care acesta a fost deviat de la traiectorie. alinierea. Figura 5 . goniometrul se poate roti pentru a schimba unghiul probei. curentul. Microscoapele electronice de nouă generaţie au interfeţe cu computerele ceea ce conferă utilizatorului o mai mare flexibilitate şi control. iar aceasta într-un holder de metal (fig. Acest electron va conferi o rezoluţie înaltă imaginii. valoarea defocalizării. Principii ale formării imaginii În momentul în care fasciculul trece prin grosimea unui specimen au loc mai multe fenomene. astfel când electronul va ajunge la nivelul ecranului va avea energia diminuată şi un unghi de incidenţă necunoscut. Acest electron va cauza apariţia zgomotului în imagine.

333 . Un pattern de difracţie poate fi colectat din probe care conţin un motiv care se repetă. În cazul sferei goale gradientul va fi în direcţia opusă. proiecţiile acestora vor diferi (figura 6). de exemplu din cristale bidimensionale. iar contrastul este îmbunătăţit. marginea fiind cea mai închisă. Pattern-ul de difracţie se formează ” in the back focal plane” al lentilei obiectiv. dacă privim o sferă goală pe dinăuntru sau una plină. Aceste proiecţii diferă deoarece gradul de întunecare a unei imagini este direct proporţional cu capacitatea materialului de a absorbi electronii.Electronii pot fi deviaţi la unghiuri mai mari de 90°. Într-un microscop electronic de transmisie electronii trec prin probă înainte de a impresiona ecranul şi conţin informaţii cu privire la structura internă a acestei probe. Electronii cu deflecţie mare conţin informaţii importante legate de rezoluţie. Electronii care vor fi deviaţi de la traiectoria iniţială în urma interacţiunii cu atomii specimenului vor interfera constructiv sau distructiv cu fasciculul principal de electroni. Figura 6. astfel de electroni nu sunt folosiţi în microscopia electronică. Pentru a înregistra imaginea se utilizează negative care sunt impresionate de fasciculul de electroni sau camere CCD (Charge Coupled Device) care traduc în format digital interacţiunile electronilor cu senzorul camerei. Colectarea imaginilor se poate face în diverse moduri. Diferenţa dintre proiecţiile unei sfere solide şi a unei sfere goale în momentul vizualizării la TEM Microscoapele electronice pot fi utilizate pentru vizualizarea pattern-urilor de difracţie a probelor. Spre exemplu. Dacă se utilizează o apertură obiectiv mică electronii care sunt deviaţi sub un unghi mare nu vor contribui la formarea imaginii. intensitatea diminuându-se spre marginile discului. aceste informaţii fiind pierdute. Sfera solidă va genera un disc întunecat la interior. Lentila intermediară determină vizualizarea imaginii sau a pattern-ului de difracţie pe ecran. Contrastul dintr-o imagine ia naştere în urma interferenţei electronilor ce au unghiuri diferite. Observarea directă a imaginii de către utilizator are loc la nivelul unui ecran de fosfor.

Deasupra platoului pe care sunt aşezate cele două foiţe de mică se află un fragment de sfoară de carbon conectată la un circuit de mare voltaj. iar noile plăci sunt introduse cu partea proaspăt clivată în interiorul unei camere în care se va stabili un vid înalt. Filmele de carbon Probele trebuie depuse pe un film care este foarte stabil sub acţiunea fasciculului de electroni. hexagon). Ochiurile reţelei pot avea diferite dimensiuni şi forme (pătrat.Tehnici de preparare a probelor Grile În cazul microscopiei electronice de transmisie specimenele sunt depozitate pe grile. După stabilirea vidului un 334 . vedere superioară şi secţiune Filme de suport Filmul Formvar este un film de natură polimerică (formal de polivinil). Există două metode pentru depozitarea filmului pe grile: una implică aşezarea grilelor pe suprafaţa filmului flotat pe apă. Principiul evaporării carbonului este unul foarte simplu. Filmele de carbon sunt foarte stabile.05 mm care prezintă o reţea. O foaie de mică este proaspăt clivată. nichel. Figura 7. aur. Pentru a obţine un film continuu de Formvar o lamă de sticlă pentru microscopia optică este curăţată şi scufundată uniform în soluţia de Formvar. Substanţa se găseşte sub formă solidă şi este solubilă în solvenţi organici. Feţele proaspăt clivate ale micăi sunt perfect plate din punct de vedere atomic ceea ce îmbunătăţeşte proprietăţile filmului de carbon. cei mai utilizaţi fiind cloroformul şi dioxanul. platină) având un diametru de 3. Pe această grilă se va depozita un film care va conferi suport specimenului. Grilele sunt discuri de metal (cupru. Grilă de microscopie electronică. fiind des folosit în microscopia electronică. iar a doua depunerea pe grile a filmului flotat.

Alte metode se bazează pe colorarea probelor pentru evidenţierea unor caracteristici. Coloraţia negativă În cazul microscopiei. Grilele sunt aşezate pe o sită de metal într-un vas plin cu apă. Pentru ca o coloraţie să aibă efect trebuie să se lege de preferenţial anumite părţi ale probei. În cazul probelor biologice care sunt formate din atomi precum carbon.curent se aplică sforii de carbon până când aceasta devine incandescentă. În cazul microscopiei optice se aplica contrastul de fază. Depozitarea filmului de carbon are loc prin evacuarea vasului de apă. Coloraţia în cazul microscopiei electronice de transmisie se bazează pe săruri de metale grele derivate din molibden. Plăcile de mică sunt imersate treptat în apă ceea ce permite filmului hidrofob să se desprindă. Coloranţii se bazează fie pe vopsele sau pe materiale foarte absorbante. contrastul specimenului este prea slab pentru ca ochiul uman să diferenţieze marginile şi detaliile probei observate. pentru o vizualizare mai bună. iar când voltajul este aplicat între anod şi catod potenţialul electronic ionizează aerul din încăpere. în cazul acestei tehnici lumina care penetrează proba suferă o schimbare a fazei. Aceasta se poate realiza fie prin tratarea cu UV a grilelor sau prin glow discarching. Pentru a îmbunătăţi contrastul se folosesc diferite tehnici. probele sunt impregnate cu săruri de metale grele. oxigen. iar dacă o picătură de apă este depusă pe suprafaţa unui astfel de film aceasta va avea tendinţa de a-şi micşora suprafaţa care întră în contact cu carbonul. această nouă rază va interfera cu fasciculul iniţial şi contrastul se creează. Carbonul este o substanţă hidrofobă. În cazul glow discharching grilele sunt introduse într-o cameră parţial evacuată. acestea nefiind foarte dense. După coloraţie. Ionii negativi se vor depozita pe suprafaţa filmului de carbon. Microscopia electronică de transmisie utilizează un fascicul de electroni de înaltă energie pentru a bombarda specimenul. cantitatea de energie absorbită este foarte mică comparativ cu energia fasciculului. uraniu sau tungsten. datorită descoperirii graphene-ului şi a remarcabilelor sale proprietăţi se investighează aplicaţia acestui film în microscopia electronică. proba se va usca şi va putea fi examinată la microscop. Ionii de 335 . azot şi hidrogen. Pentru a face filmele mai accesibile substanţelor aflate în soluţie apoasă carbonul trebuie hidrofilizat. De aceea. în acest moment carbonul se va evapora şi depozita pe mică formând un film continuu. În ultimii ani. În funcţie de cantitatea de energie absorbită intensitatea fasciculului care va impresiona ecranul diferă şi se va forma o imagine.

336 Contra În timpul colorării particulele pot fi distorsionate. Interacţiunea dintre un specimen (coloraţie negativă) şi fasciculul de electroni Avantaje şi dezavantaje ale coloraţiei negative Pro Contrast foarte mare. În figura 8 se observă o proteină colorată negativ. Rezoluţia este limitată la 20 Å în condiţii optime. Tehnica este una simplă: proba este depusă pe grilă şi lăsată câteva zeci de secunde urmată fiind de ‘’spălarea’’ grilei cu 3 picături de colorant. 4 minute). Figura 8. Pregătirea probei nu necesită aparatură şi nu ia mult timp (aprox. Excesul va fi îndepărtat cu ajutorul unei hârtii de filtru. iar apertura obiectiv îi va elimina pe cei care vor fi deviaţi la un unghi prea mare. . de aceea diferite regiuni ale probei pot avea diferite densităţi de electroni şi pot fi diferenţiate în proiecţiile obţinute. Contrastul optim se obţine când coloraţia înconjoară complet specimenul si zonele adiacente. Aceasta corespunde cu mărimea granulei sării folosite pentru coloraţia negativă. Ca urmare a distribuţiei inegale a coloraţiei pot să apară artefacte. Colorantul absoarbe electronii mult mai bine decât mediul înconjurător. electronii ce vor interacţiona cu atomii de metale grele vor fi puternic deviaţi. Contrastul apare în urma interacţiunii electronilor cu specimenul.metale grele vor interacţiona cu electronii. Alterarea datorită radiaţiei este irelevantă deoarece sărurile metalice nu sunt la fel de susceptibile la efectele electronilor precum molecule organice. Zona este neacoperită deoarece proba (proteina de exemplu) împiedică depunerea sării pe filmul de carbon. Coloraţia cu aceşti atomi grei se numeşte coloraţie negativă deoarece în microscop se va observa o zona neacoperită de colorant înconjurată de coloraţia negativă. ceea ce va determina contrastul şi rezoluţia imaginii. iar după uscare grila poate fi examinată. În timpul uscării specimenul îşi pierde învelişul hidratant. În cazul proteinelor menţinerea unei stări hidratate este importantă pentru păstrarea configuraţiei.

Proba poate să aibă o orientare preferenţială pe grilă în cazul Dezavantaje Raportul semnal/zgomot este foarte mic deoarece absorbţia electronilor e scăzută. sită o doză minimă de electroni penîngheţarea probei tru a evita alterarea probei datorită radiaţiei. Nu există colorant care să distorsioneze preparatul. De aceea se preferă utilizarea etanului lichid. Schemă a instalaţiei utilizate pt. Avantaje şi dezavantaje ale cryo-electronmicroscopiei faţă de coloraţia negativă Avantaje Specimenul este tot timpul în soluţie şi nu intră în contact cu suprafeţe. Azotul lichid are o temperatură ideală (aprox. -195˚). cristaline care va estompa detaliile specimenului. Îngheţarea se face prin dropping a unei grile pe care proba este deja depozitată. Înregistrarea imaginilor pentru tomografie e dificilă deoarece prin rotire stratul de gheaţă expus este prea gros. prin urmare forma observată este cea reală în stare nativă. apa din jurul probei va îngheţa. dar capacitatea calorică este foarte mică.Îngheţarea probei – metoda cryo Microscopia cryo este o tehnică prin care proba este îngheţată într-un refrigerent pentru o mai bună păstrare şi protecţie în timpul observaţiei. Doza recomandată e de 6-10 electroni/Å2. în momentul introducerii unei grile aflate la temperatura camerei fierbe ceea ce favorizează formarea gheţii cristaline. Pregătirea probelor necesită mult 337 . Pentru a vizualiza proba în cryo-electronmicroscopie trebuie foloFigura 9. iar proba va fi protejată. Procesul este laborios deoarece plonjarea grilei în recipientul de etan lichid trebuie să fie suficient de rapidă pentru a împiedica formarea gheţii cubice.

338 . de la jurnale ştiinţifice la reviste de popularizare şi filme. iar informaţiile privitoare la structura internă lipsesc. Deşi principala lui utilizare este de a obţine imagini topografice la o mărire cuprinsă între de 10-10000 de ori. Microscopia electronică de baleiaj (Scannig Electron Microscopy – SEM) În cazul SEM. 3. ceea se asigură prezervarea probei. Popularitatea SEM-ului e datorată capacităţii sale de a obţine imagini aparent tridimensionale ale suprafeţelor unei game largi de materiale. Prin intermediul microscopiei electronice de baleiaj se pot observa detalii de pe suprafaţa unui specimen. Fasciculul de electroni este concentrat şi utilizat pentru a scana suprafaţa obiectului observat. iar obţinerea gheţii vitroase în cazul cryo. Imaginile SEM sunt utilizate într-o mare varietate media. specimenele sunt acoperite cu un strat subţire de metal pentru ca electronii să fie reflectaţi. astfel se evită încărcarea electrică a probei. poate fi problematică. Microscopul electronic scanning (SEM) permite observarea şi caracterizarea materialelor organice şi anorganice heterogene la o scară cuprinsă între nanometri (nm) şi micrometri (µm).coloraţiei negative. Acest înveliş metalic asigură o suprafaţă conductoare. SEM-ul are o adaptabilitate mare. ceea ce se evită timp. Imaginea se formează pe un ecran datorită electronilor care sunt reflectaţi de învelişul metalic. Se foloseşte doza minimă de electroni.

se emit şi raze X caracteristice. Tipurile de semnale rezultate din interacţiunea fascicolului cu probă includ electroni secundari. Cele mai multe micrografii SEM se efectuează la măriri sub 8000 de ori. electroni reflectaţi. Emisia de electroni secundari. raze X caracteristice şi alţi fotoni cu energii variate. Aparenţa tridimensională a imaginii se datorează unei adâncimi mari a câmpului microscopului electronic. Cu cât e mai mare această adâncime a câmpului cu atât se furnizează mai multe informaţii despre specimen. cristalografia. O altă caracteristică importantă a SEM-ului este adâncimea câmpului.). aleasă la diferite valori ale energiei razei de electroni. Semnalele de imagine de cel mai mare interes sunt electronii secundari şi reflectaţi. Un motiv puternic pentru utilitatea SEM-ului este rezoluţia mare ce poate fi obţinută când sunt examinate obiecte voluminoase. precum şi efectului de umbră dat de contrastul electronilor secundari şi reflectaţi. Evoluţia SEM-ului şi capacităţile specifice ale instrumentelor comerciale moderne se vor discuta în cele ce urmează. care poate fi trecut în raster (linie cu linie) deasupra suprafeţei specimenului pentru a forma mai multe imagini. Capacităţi de imagistică Microscopul electronic scanning este unul dintre cele mai versatile instrumente disponibile pentru examinarea şi analizarea caracteristicilor microstructurale ale obiectelor solide. sau care poate fi static pentru a obţine analiza unei singure poziţii. care e cea responsabilă în parte pentru aparenţa tridimensională a imaginii specimenului. La SEM. rezoluţii instrumentale cu ordin de 1-5 nm (10-50 Å) se folosesc azi ca rutină la instrumente comerciale. suprafaţa de examinat sau microvolumul de analizat este iradiată cu un fascicol îngust de electroni. pentru că aceştia variază în primul rând datorită diferenţelor topografice. regăsiţi într-un volum foarte mic în apropierea zonei de impact a fascicolului. compoziţia etc. această calitate a SEM-ului fiind cea mai apreciată de către un utilizator. din regiuni ale unui specimen având mărimea de 1µm în diametru şi 1µm în adâncime (în condiţii normale de operare). Aceste semnale se obţin din emisii de volum specifice probei şi pot fi folosite pentru a examina multe caracteristici ale probei (topografia. permite formarea de imagini la o rezoluţie apropiată de cea a mărimii fascicolului de electroni. Analiza acestor raze emise de către probă poate scoate în evidenţă atât caracteristici calitative cât şi informaţii cantitative de element.La SEM. unde aparatul ope339 . ca şi rezultat al bombardamentului de electroni.

C. colectorul de electroni. Mc. W. Mc. pentru că imaginea SEM vine cu informaţii adiţionale imaginii obţinute la microscopul optic. prin comparaţie cu performanţele obţinute atunci cu TEM-ul în continuă perfecţionare.Mullan au construit primul lor SEM care până în 1952 a atins rezoluţia de 50 nm. proprietate foarte utilă în studii de criminalistică şi nu numai. Oatley şi Everhart au putut observa pentru prima dată contrastul de voltaj. Principalele componente ale SEM-ului sunt sistemele de lentile. A urmat apoi von Ardenne (1938) care a construit microscopul electronic scanning de transmisie (STEM) prin adăugarea unei lentile de baleiere la microscopul electronic de transmisie (TEM). (Smith. de către Everhart şi Thornley (1960). şi primul care a utilizat perechi 340 . În următorii câţiva ani. mai târziu Wells (1959) a făcut primele studii ale efectelor penetrării fascicolului cu scopul formării imaginii la SEM. şi a introdus amplificarea neliniară a semnalului. tunul.rează bine în limitele propriilor capacităţi de rezoluţie. SEM-ul are capacitatea de a analiza la măriri foarte mici.Mullan a fost urmat de Smith (1956) care a observat că procesarea semnalului ar putea îmbunătăţi micrografiile. Atât aspectele teoretice cât şi cele practice ale STEM-ului au fost explicate în detaliu de către von Ardenne. care a fost apoi transmisă printr-o ţeavă de lumină direct pe suprafaţa fotomultiplicatorului. Astfel. tubii catodici fotocolectori de raze. Autorii au realizat că emisia de electroni secundari este cea responsabilă pentru contrastul topografic. iar aparatul său includea multe instrumente care de atunci au devenit standard. (1942). Colectorul a fost înclinat pozitiv aproximativ cu 50 V înspre specimen şi al doilea curent acumulat în el a produs o cădere de tensiune de-a lungul unui rezistor. Spre exemplu. În plus. această metodă a fost considerată neincitantă şi dezvoltarea pe această ramură a stagnat. Prima lucrare recunoscută ca descriind conceptul de microscop electronic scanning este cea a lui Knoll (1935). Alte utilizări ale SEM-ului au fost dezvoltate în această perioadă. Primul SEM utilizat să examineze specimene dense a fost descris de Zwokyn şi col. Ei au adăugat un scintilator pentru a converti electronii în lumină. De asemenea a îmbunătăţit sistemul de scanare prin introducerea de scanare prin dublă deflecţie. Dar. Oatley şi studentul său D. astfel s-a obţinut o rezoluţie de aproximativ 50 nm. şi părţile electronice asociate. mecanisme de contrast mai slab ar putea fi mai bine studiate. 1956) Următorul pas înainte a fost refacerea detectorului secundar de electroni. Schimbarea multiplicatorului de electroni cu mult mai eficientul fotomultiplicator a crescut cantitatea semnalului colectat şi a rezultat un mai bun raport semnal-zgomot. şi a fost primul care a inclus un stigmator în SEM.

1972). Majoritatea SEM-urilor sunt dotate cu capacitatea de a stoca imagini digitale. obţinându-se astfel o rezoluţie mai bună. care conţinea şi sistemul detector Everhart-Thornley.. aceste microscoape şi-au găsit utilitatea în numeroase domenii de cercetare şi tehnologie în care rezoluţia înaltă şi energia mică a sursei sunt importante. şi astfel de nevoi cer o atenţie specială tehnologiei de vidare. oferă microscopistului o mare flexibilitate şi uşurinţă în utilizarea SEM-ului. D. s-a dezvoltat în aşa măsură încât poate fi acum folosită pentru imagini de cea mai înaltă rezoluţie. deşi în aparatele mai vechi imaginile încă se mai fac prin fotografierea tubului catodic de raze. Japonia. diferenţiere etc. Acest aparat a devenit primul prototip comercial numit . Imaginile pot fi observate pe un ecran. Cu această sursă o mai mare cantitate de electroni au putut fi concentraţi pe o suprafaţă mai mică. cu trei lentile magnetice. Marea Britanie. Olanda.. A.U. Disponibilitatea unor computere puternice şi ieftine dotate cu capacitate de stocare mare şi pachete de soft capabile de o varietate mare de procesări şi funcţii pentru imagini digitale. Odată stocată în format digital imaginea poate fi procesată în multe moduri. utilizată pentru prima dată la SEM în 1942. În anii ce au urmat mai mult de 50 000 de unităţi SEM au fost vândute de către producători din S. (Wells. 1960) Pease a construit un sistem cunoscut ca SEM V.Stereoscan” (Cambridge Scientific Instruments Mark I). G. Germania şi Franţa. una din ele fiind dezvoltarea surselor de lumină puternică precum catodul de hexaborid de lantan (LaB6). De la primul aparat comercial din 1965 s-au făcut numeroase îmbunătăţiri. Cu toate că au crescut costurile şi complexitatea SEM-urilor cu emisie de curent. Avantajul tunului de emisie este dimensiunea sa mică astfel încât poate fi obţinută o imagine a unei probe de 1 nm. Stewart şi coechipierii de la compania Cambridge Scientific Instrument au finalizat design-ul comercial şi împachetarea produsului (Oatley. 341 . Sursa de emisie de electroni. printate sau reţinute pe un CD sau alte unităţi de memorie.A. Această lumină puternică permite pătrunderea a de 1000 de ori mai mulţi electroni pe cele mai mici dintre probe.stereografice pentru a produce imagini tridimensionale la SEM. decât filamentele convenţionale de tungsten. Sursele de electroni au nevoie totuşi de vid de ordinul a cel puţin 10-8 Pa pentru a opera într-un mod de încredere. precum prin amplificare non-lineară. Alte avansări în utilizarea SEM-ului includ mecanismele de contrast precum contrastul prin canalizarea electronilor produs prin variaţii în orientarea cristalografică şi contrast magnetic produs din domenii magnetice din materiale uniaxiale şi cubice. la nivel de rutină.

Analiza structurală Una din cele mai promiţătoare dezvoltări din domeniul SEM-ului este abilitatea de a determina structura cristalină şi orientarea lor pe suprafaţa specimenelor preparate. slabi conductori. Probele biologice sunt ideale pentru studiul la acest aparat. În formatul său modern. Majoritatea materialelor biologice sunt umede. În plus. dezvoltările în domeniul biologic au depins de avansarea în prepararea specimenului. suprafaţa specime342 . Mai târziu Thornley a prezentat imagini SEM ale materialelor uscate prin îngheţare şi analizate la 1 keV pentru a evita încărcarea electrostatică.Printre primele micrografii scanate au fost câteva materiale biologice precum carcasa unor insecte sau fibre lemnoase. pentru că mediul înconjurător specimenului nu mai este nevoie să fie la vid înalt (Danilatos.2. VPSEM-ul poate detecta electroni secundari şi retroîmprăştiaţi la fel de bine precum razele X. şi acoperirii lor cu un strat subţire de material conductor. 1991. Mediul poate fi alcătuit din vapori de apă sau alte gaze în intervalul de 25-2500 Pa (0. Au apărut echipamente care permit evaluarea cantitativă a suprafeţei şi urmărirea în timp real şi de înaltă rezoluţie a specimenului prin intermediul SEM-ului.20 torri). Dimensiunea mare a adâncimii câmpului întâlnită la SEM face posibilă observarea tridimensională a obiectelor utilizând stereoscopia. 1993). S-a dat multă atenţie la stabilizarea materialelor organice delicate. termolabile.. 2000). care au fost suficient de puternice pentru a rezista procesului de vidare fără să se deformeze (Smith şi Oatley. se pot efectua experimente în aparat în care suprafaţa specimenului poate interacţiona cu atmosfera gazoasă. aşadar. Imaginile tridimensionale permit interpretarea corectă a caracteristicilor morfologice şi măsurarea lor. Această capacitate se foloseşte de difracţia electronilor reflectaţi de pe suprafaţa specimenului (Schwartz şi col. îndepărtării sau imobilizării fluidelor celulare. 1955). 1992). Totuşi. Una dintre cele mai importante descoperiri recente este microscopul electronic scanning cu presiune variabilă (VPSEM). Pentru a colecta maximum de intensitate în modelul de difracţie. şi este cunoscută sub numele de difracţie electrono-reflectată (EBSD). Dezvoltarea procesărilor la temperaturi scăzute a ajutat la reducerea pierderii de masă şi a distrugerilor termice la specimenele sensibile (Echlin. sensibile la radiaţii. de contrast mic şi emisivitate de electroni slabă şi sunt. Acest tip de aparat permite examinarea suprafeţelor a aproape oricărui tip de specimen. Un sistem diferenţial de pompare a vidului este folosit pentru a menţine tunul de electroni la vid înalt în timp ce specimenul este sub o presiune mai mare. uscat sau umed.

microsondă electronica”(Castaing.U. adăugarea 343 . Cea mai recentă descoperire în aplicaţia modelului Kikuchi la volume de analizat este dezvoltarea sistemului de înregistrare a modelului folosind o cameră video de înaltă sensibilitate sau mai recent o cameră video tensio-cuplată (CCD). Recunoaşterea complexităţii transformării intensităţii razelor X în compoziţie chimică a dus la perfecţionarea analizei cantitative de către numeroşi investigatori pe parcursul ultimilor 50 de ani. Deşi conceptul de analiză locală cu raze X este în sine un stimulent pentru folosirea microanalizatorului. Intensitatea modelului reflectat Kikuchi este relativ mică. Dezvoltarea unui instrument de analiza chimică localizată a probelor solide (EPMA) s-a produs deodată cu apariţia SEM-ului. cei doi oameni de ştiinţă treceau fascicolul brusc pe suprafaţa probei. În teza sa de doctorat. Cosslett şi Duncumb (1956) au construit primul microanalizor electronic scanning de probe la Laboratoarele Cavendish în Cambridge. şi de abia în 1949 R.1 µm pe specimen.1. Analiza elementală SEM-ul poate fi utilizat pentru a obţine informaţii legate de compoziţie folosind razele X caracteristice. Conceptul unui microanalizator electronic de probe a apărut în anii 1940 (Hillier. Aceste pattern-uri sunt mai apoi analizate printr-o metodă de indexare asistată de computer.Guinier au descris şi construit un instrument numit . Dacă până atunci microprobele electronice operau cu fascicole statice de electroni. dar a şi subliniat modul în care această informaţie poate fi cuantificată. De asemenea mai făcea parte din aparat şi un microscop optic pentru găsirea corectă a punctului de analiză şi una sau mai multe spectrometre WDS pentru analizarea intensităţii radiaţiei X emise în funcţie de energie. Optica electronică era formată dintr-un tun electronic urmat de lentile convergente ce formau o sondă electronică cu un diametru de 0.A. Castaing nu numai că a demonstrat că o analiză chimică localizată poate fi desfăşurată pe suprafaţa specimenului. de aceea e nevoie de camere ultrasensibile şi senzori fini de captare a contrastului. 1947).. Castaing sub îndrumarea lui A. aşa cum se face azi în SEM-rile actuale..nului este dintr-o dată răsucită la un unghi de 70º faţă de orizontală. Indexarea automată a modelelor şi cartarea orientării straturilor de cristale asistată electronic permite identificarea fazelor de cristalizare şi arată orientarea greşită printre limitele cristalelor. iar primul aparat comercial a fost introdus de CAMECA în Franţa în 1956. precum şi contrastul semnalului. 1951). În timpul anilor 1950 câteva aparate EPMA au fost dezvoltate în laboratoare din Europa şi S.

Sistemul EDS oferă o modalitate rapidă de analiză a elementelor constituente în probă. SEM-ul şi EPMA-ul au fost considerate aparate separate pentru încă un deceniu. Un EPMA modern are în mod normal capacităţile unui SEM. După ce pentru mulţi ani principalele linii de concentrare au fost în direcţia dezvoltării tehnologiilor existente. dar azi EPMA-ul este considerat a fi un echipament aparţinând SEM-ului. două sau mai multe spectrometre de lungime de undă (WDS). O altă însuşire importantă a SEM-ului cu EDS şi WDS este capacitatea de cartare compoziţională folosind raze X caracteristice. pe când WDS-ul este utilizat pentru detecta razele X ale elementelor minore (<10 wt%) sau chiar pentru a le recunoaşte în probă. câteva descoperiri recente au dat noi tendinţe în conceptele de detectori şi design. un microscop optic pentru observarea suprafeţei specimenului şi un fascicol de curent de electroni care se stabilizează prin analiza de raze X.. prin spectrometrie EDS de raze X se mai poate realiza şi o analiză cantitativă foarte fină. având şi lentile optice şi una şi mai multe unităţi WDS. Într-un SEM tipic echipat cu detectori EDS şi WDS. printre care o descoperire a fost de mare importanţă: difracţia cristalelor din moleculele organice cu spaţieri mari interplanare 344 . la curenţi tipici utilizaţi la imagistica electronică secundară a SEM-ului. Proba este analizată fără a fi afectată şi analiza cantitativă poate fi obţinută la o rezoluţie spaţială de 1 µm pe probă. Detectorii de raze X se bazau pe o formă solidă de silicon derivat de litiu [Si (Li)]. Atracţia acestei forme de acumulare a informaţiei este detaliul microcompoziţional ce poate fi corelat cu metalografia optică şi electronică. s-au făcut numeroase îmbunătăţiri. Marea majoritate a SEM-urilor vândute azi sunt echipate cu capacităţi EDS. EDS-ul e utilizat pentru a analiza razele X caracteristice elementelor majore (>10 wt%). Spectrometrele dispersive de energie moderne sunt capabile de detectarea razelor X caracteristice ale tuturor elementelor cu număr atomic mai mare decât 4. În plus. Pentru probe plate şlefuite. Câteva dintre acestea cuprind microcalorimetria în raze X. pe lângă analiza calitativă rapidă.conceptului de scanare a fost o contribuţie foarte semnificativă.1968). detectorii din derivaţi de silicon. Adăugarea unui spectrometru EDS la microanalizorul electronic pentru a măsura razele X a atras atenţia asupra nevoii utilizării lui şi în cadrul SEM-ului (Fitzgerald şi col. toate găsind o tot mai mare utilizare în cadrul SEM-ului. şi utilizarea de spectrometre de cristale plate împreună cu optică capilară X-ray. În anii ce au urmat de la prima apariţie a EPMA-ului. printr-o analiză normală cu fascicolul de electroni se obţine o acurateţe de 1-2% (5-10% la probele biologice) din cantitatea respectivului element prezent.

Utilizarea tot mai intensă a computerului împreună cu SEM-ul a crescut calitatea şi cantitatea de informaţii adunate prin intermediul aparatului. a apărut ipoteza folosirii şi altor tipuri de fenomene de excitaţie. În plus. Ele se bazează pe analiza unor secţiuni subţiri.(Henke. Totuşi materialele biologice sunt mult prea uşor afectate de fascicolul de electroni şi astfel că în deceniile trecute s-a depus mult efort în instrumentare precum şi în procedurile preparative şi analitice cum sunt analiza la temperatură scăzută. Măsurarea catoluminiscenţei a devenit azi o parte importantă a SEM-ului mai ales în industria microelectronicelor. De exemplu. în primul rând datorită faptului că unii parametri de corecţie sunt funcţie de concentraţie şi. 1965). O) ce pot fi măsurate de spectrometre dispersive de lungime de undă. 1965). S-au creat programe care pot să convertească raportul intensităţii razelor X în compoziţii chimice. Recent au fost dezvoltaţi difractori mari de spaţii interplanare ce utilizează depunerea fizică alternativă de straturi de vapori de elemente grele şi uşoare. deşi intervine problema contaminării cu carbon din cauza vacumizării slabe a SEM-ului. produsă din interacţiunea electronilor cu specimenul a fost asociată cu prezenţa unor impurităţi în material (Long şi Agrell. în plus preparatorul trebuie să fie foarte atent ca elementele pentru măsurat să rămână în cadrul punctului de analiză şi să nu se îndepărteze sau să dispară pe parcursul preparării. După ce s-a observat capacitatea de măsurare a razelor X care poate fi extinsă şi la specimene nonmetalice. În ultima vreme. Microanaliza în raze X a materialelor biologice şi polimerice întâlneşte aceiaşi problemă în examinarea probelor la SEM. Efectele de suprafaţă pot fi mai uşor de măsurat. C. 1966). Deşi prepararea specimenului biologic este mult mai exactă decât procedura pentru alte ştiinţe. N. se mai poate studia şi emisia de fotoni vizibili din recombinarea excesului de perechi de goluri de electroni dintr-un semiconductor (Kyser şi Wittry. prin urmare. în care efectele absorbţiei şi de fluorescenţă sunt neglijabile. metodele cantitative sunt în principiu simple. Aceste cristale eliberează raze X cu lungime mare de undă din elementele cu număr atomic mic (B. culoarea luminii vizibile (catodluminiscenţa). aparatele au fost construite să permită posibilitatea unei analize de încredere cu fascicol de electroni si raze X de energie mică. Avantajul energiei mici a fascicolului de electroni este că apare posibilitatea minimizării dimensiunii sursei de raze X şi a minimizării efectului de absorbţie în procedura cantitativă. fac aproximările succe345 . Capacitatea de a detecta elemente cu număr atomic mic le dă utilizatorilor de EPMA posibilitatea de a investiga numeroase noi probleme ale aparatului.

iar hărţile pot fi corelate cu imagini SEM preparate prin oricare alt fel de semnal.sive necesare. Dezvoltarea cartării compoziţiei cantitative este un alt punct forte în legătura dintre imagistică. capacitatea de analiză cantitativă a elementelor şi utilizarea automatizată computaţională a SEM-ului. pentru fiecare rază discretă din suprafaţa scanată. şi spectrometrele. la cartarea cantitativă de compoziţie. În acest fel analistul poate să revadă analizele corespunzătoare fiecărui pixel sau şir de pixeli. Se face câte o analiză completă executată de calculator. Automatizarea e de mare ajutor în operaţiunile repetitive. creşte numărul analizelor efectuate. În plus programele pot acum să controleze fascicolul de electroni. mişcarea specimenului. şi îi permite operatorului să se concentreze pe evaluarea analizelor. Imaginile rezultate sunt hărţi compoziţionale şi au la fiecare element constitutiv (pixel) valoare numerică completă a concentraţiei. 346 . Valorile concentraţiilor corespunzătoare poziţiei razelor pe specimen sunt asamblate într-o imagine digitală cu un procesor de imagini prin codificarea axelor concentraţiei cu nuanţa de gri corespunzătoare. Aceste programe derulează calcularea compoziţiei în câteva secunde şi astfel operatorul se bucură de mai multă flexibilitate în obţinerea rezultatelor.

. virusuri cu ultrastructuri similare pot fi diferenţiaţi cu sensibilitate mare...... Lucian Barbu-Tudoran Cuprins 1.... luarea în calcul a tratamentelor la care este supusă proba până la ajungerea în faza de examinare.... gradul alterării probei depinzând foarte mult de tehnica de pregătire a materialului biologic.. răspunzătoare de acurateţea interpretării imaginilor.. fiind una din cele mai uşoare şi mai rapide proceduri pentru detectarea virusurilor..................5 – 2..... ce oferă un contrast superior şi mai multe tipuri de informaţii simultan sau prin utilizarea câmpului întunecat într-un TEM convenţional... Microscopia electronică de transmisie.. problemele preparării probelor biologice au rămas mult în urma îmbunătăţirilor aduse performanţelor microscoapelor electronice... iar înţelegerea acestora este esenţială pentru extrapolarea detaliilor oferite de microscop la situaţia existentă in vivo. acestea sunt acceptate....... Atâta vreme cât artefactele inevitabile sunt interpretabile.......... 359 Din păcate.... performanţă uşor de atins acum pentru materiale anorganice.. deci... absolut necesare pentru obţinerea unor imagini utilizabile...... Depăşirea barierei de 1..5 nm pentru specimenele biologice s-ar putea realiza prin utilizarea acestui STEM...Microscopia electronică .... Pe lângă metodele clasice de contrastare a probelor biologice............... organitelor celulare izolate (inclusiv membrane) şi macromoleculelor......... virusurilor. Dezvoltarea unui microscop electronic de baleiaj şi transmisie (STEM) de înaltă rezoluţie (0....... în timp ce detaliile probelor biologice.... Plaja efectelor induse de diferitele tratamente premergătoare analizei electronomicroscopice este foarte largă..partea a II-a şef lucrări dr........ eliminându-se astfel nevoia contrastării.. 349 2........2 nm) a permis vizualizarea unui singur atom de metal greu. în general. nu sunt mai bune de 1... fiind necesară.... coloraţia negativă este cea mai utilizată metodă pentru vizualizarea topografiei şi structurii bacteriilor.....0 nm............................ Când microscopia imunoelectronică este folosită în conjuncţie cu coloraţia negativă.. Microscopia electronică de baleiaj ........ iar marcarea antigenilor de suprafaţă se poate realiza cu uşu347 .. O imagine electronomicroscopică este diferită de situaţia reală din organismul viu...

Fixarea pieselor de dimensiuni mari prin metode convenţionale prezintă un gradient de calitate a fixării. esenţiale funcţiilor biologice. Marcarea imunogold în combinaţie cu coloraţia negativă au un potenţial considerabil în detectarea virusurilor. Undele electromagnetice sunt radiaţii neionizante ce produc deplasări moleculare prin migrarea ionilor şi rotirea moleculelor dipolare. Unele din acestea pot fi evitate prin fixarea cu aldehide într-un cuptor cu microunde. crioelectron . 348 . în special.microscopia probelor colorate negativ este o metodă importantă pentru investigarea structurii tridimensionale a proteinelor cristalizate. artefactele dependente de timp. picornavirus şi parvovirus. sunt o alternativă la fixarea chimică. obişnuit. apar destul de des. energie prea mică pentru a afecta legăturile covalente. cu o frecvenţă de 2. cum ar fi contractarea sau umflarea probelor şi extracţia componentelor celulare datorate difuziei lente a fixatorilor. cromatina este mult mai distinctă în ţesuturile tumorale. straturile superficiale pot fi suprafixate. vitrificarea nefiind uşor de realizat. astfel. dilatarea excesivă a secţiunilor anumitor ţesuturi (limfoid). iar ca dezavantaje: deteriorarea eritrocitelor din ţesuturile nefixate. oscilaţia dielectrică a moleculelor de apă şi o energie a fotonului de 10-5 eV. În plus. dar suficientă pentru a interacţiona cu cele necovalente cum sunt legăturile sterice (legături de H şi interacţiuni van der Waals). scopul acestora fiind de a stabiliza ultrastructura celulei aşa cum există in vivo. pe lângă beneficiile crioprotecţiei. chiar la 370C.rinţă prin colorarea imunonegativă.4 cm. în timp ce cele din zona profundă vor fi subfixate. deşi.45 GHz (1 GHz = 109 cicluri / sec) şi prezentând o lungime de undă de 12. Criotehnicile. şi aici există pericolul producerii de artefacte în intervalul de temperatură dintre cea fiziologică şi cea de imobilizare. respectiv. antigenilor virali şi a anticorpilor. fixarea cu glutaraldehidă într-un cuptor cu microunde. ce includ răcirea ultrarapidă a celulelor şi ţesuturilor. Coloraţia negativă a probelor deshidratate prin îngheţare ar putea evidenţia ultrastructura virusurilor şi a membranelor fără colapsul specimenului. O altă abordare este utilizarea coloraţiei negative în combinaţie cu vitrificarea pentru realizarea unui contrast crescut. De asemenea. Cea mai bună soluţie rămâne combinarea celor două metode. Un marker de aur coloidal este util. Dintre avantajele fixării cu căldura microundelor menţionăm: capilarele pulmonare interstiţiale nu colapsează cum se întâmplă în cazul fixării cu formaldehidă. pentru detecţia virusurilor foarte mici. precum şi în cazul nivelelor scăzute de virusuri. Microundele sunt unde electromagnetice generate.

principalul agent de fixare utilizat în microscopia electronică de transmisie. fragmentele recoltate la rece (pe gheaţă). fixarea. se trec rapid pe glutaraldehidă 2. Se prelevează fragmente suficiente pentru prepararea a câte 3 blocuri/probă (adică cel puţin 6 cuburi). Rezultate foarte bune se obţin dacă. nepermiţându-se deteriorarea arhitectonicii ultrastructurale. Începând cu această etapă. cu ajutorul unor agenţi capabili să creeze legături încrucişate între moleculele constitutive ale materialului prelucrat. Dimensiuni mai mari nu ar permite penetrarea pieselor de către tetraoxidul de osmiu.7-3% (primul agent fixator).5 mm. includerea. Pentru decuparea cuburilor se recomandă folosirea a două lame de ras noi. sunt următoarele: recoltarea. A. încapsularea. acţionate în sens contrar pentru a se evita lezarea mecanică (zdrobirea/sfâşierea) ţesutului. secţionarea. cu doi agenţi fixatori la 4ºC. modelarea. înainte de prelevarea acestuia din organismul animal. Din fragmentele aflate pe glutaraldehidă se taie foarte repede cuburi mici. până la secţionare. înainte de recoltare. Este indicată pipetarea soluţiei de glutaraldehidă peste organul ce urmează a fi recoltat. examinarea şi developarea suporturilor fotografice. Prefixarea Prefixarea se efectuează cu o soluţie de glutaraldehidă 2-6% (2. Acesta nu fixează corespunzător la o profunzime mai mare de 0. toate celelalte operaţii. deshidratarea. Pentru menţinerea neschimbată a ultrastructurii – deci păstrarea ei identică cu cea din momentul sacrificării animalului. datorită toxicităţii mari a reactivilor cu care se lucrează.1 M.1.7%) în Tampon fosfat 0. Se realizează o fixare chimică a pieselor. se pipetează soluţia de glutaraldehidă pe suprafaţa organului de inte349 . cu latura de maxim 1 mm. FIXAREA Procesul de fixare asigură stabilizarea structurii biologice cât mai aproape de starea nativă. contrastarea. se vor desfăşura sub nişă. RECOLTAREA Recoltarea fragmentelor de ţesut trebuie efectuată foarte rapid (1-2 min) după sacrificarea animalelor pentru a se împiedica instalarea unor alterări morfo-funcţionale la nivelul ţesutului. Microscopia electronică de transmisie Principalele etape de a căror acurateţe depinde foarte mult obţinerea unor informaţii cât mai apropiate de situaţia reală din celula vie.

După obţinerea cuburilor de ţesut. prepararea soluţiei 2.7% preparată extemporaneu după reţeta: . conferind astfel o mare stabilitate structurilor celulare cu care vine în contact. în soluţie apar polimeri ai glutaraldehidei. acestea sunt trecute în tuburi de sticlă şi păstrate timp de 15-30 minute în 1-1. respectiv introducerea fixatorului în circulaţie. urmate de spălare abundentă cu apă distilată).(din moleculele proteice) şi imino-. iar fixarea se va face la 4ºC. Glutaraldehida este primul fixator utilizat curent. Există. permite o mai uşoară manipulare a preparatului. la 280 nm. Deci glutaraldehida 25% (sau 50%) stoc se va păstra numai la frigider. Ele se acoperă cu dop (de cauciuc rezistent) – care nu se va fărâmiţa sub acţiunea substanţelor ce se vor folosi.4 . asigurându-se astfel o răspândire rapidă a acestuia la nivelul ţesuturilor. formând punţi încrucişate şi punţi intermoleculare. Prin urmare va prezerva foarte bine ultrastructura celulară şi activitatea enzimatică a celulelor.Tampon fosfat 0.7% se va face extemporaneu.154 g (18. Glutaraldehida pură prezintă un singur vârf de absorbţie în UV.Apă distilată Tamponul fosfat 0. de asemenea.56 g) 7.1 M pH 7. care vor avea un nou vârf de absorbţie la 235 nm. Glutaraldehida se utilizează în soluţie apoasă 2. După 15-30 minute se schimbă glutaraldehida şi se continuă fixarea timp de încă 1-2-3 ore în funcţie de consistenţa ţesutului. Glutaraldehida [O=CH-(CH2)3-CH=O] are proprietatea de a lega grupările active de hidrogen.036 g) Până la 500 ml 2 ml 10 ml 4. Tuburile de sticlă cu care se lucrează vor fi foarte curate (bine spălate cu detergent şi amestec sulfocromic. posibilitatea perfuziei ţesuturilor cu fixator.Glutaraldehidă (25%) pentru microscopie electronică .apă distilată 350 1.37 g (1.1 M se prepară după reţeta: . pătrunde mai uşor şi acţionează rapid asupra ultrastructurii preparatului.2 ml . Dacă este ţinută la temperatura camerei.Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 · 12H2O) .5 ml glutaraldehidă.NaH2PO4 · H2O (NaH2PO4 · 2H2O) . în special de la alcooli şi grupările amino. deoarece este mai puţin toxic.res.

după care se lasă 24 ore la 4ºC pentru dizolvarea completă. dacă urmele de aldehide nu sunt eliminate din ţesut. Se închide sticla şi se agită puternic până la spargerea fiolei.1 M. este foarte important a se înlătura prin spălare orice urmă de glutaraldehidă. Postfixarea Postfixarea se realizează cu tetraoxid de osmiu (OsO4) 1-4% în funcţie de consistenţa ţesutului de studiat. pH 7. Prin reacţia posibilă între cele două substanţe fixatoare aplicate succesiv. Prin procedura de fixare menţionată se urmăreşte stoparea proceselor metabolice din ţesturi. Se înlătură această soluţie. dar şi de a mări contrastul la nivelul ultrastructurii ţesutului. prezervarea structurii fine a celulelor şi stabilizarea acestora pentru a face posibile etapele ulterioare de preparare în scopul vizualizării în microscopul electronic de transmisie. Tamponul fosfat 0. Există cazuri când fixarea a fost prelungită peste noapte pentru fiecare fixator. 351 . la post-fixare lipidele din membrane nu se vor fixa bine cu OsO4. pe care o colorează prin depunerea osmiului. După înlăturarea tamponului fosfat.4.139 g) . se adaugă o soluţie proaspătă de OsO4 în care piesele vor mai sta timp de 85 minute. Rolul acidului osmic este de a stabiliza atât proteinele cât şi bistraturile lipidice.4 în 4 băi succesive a câte o oră (în a patra baie piesele se pot ţine peste noapte). Se va evita contactul soluţiei cu obiecte metalice. şi anume. pentru 15 minute.apă distilată Până la 500 ml OsO4 2% se prepară astfel: 1 g OsO4 se trece într-o sticlă foarte curată. Spălarea După prefixare. şi spălarea se va face în aceleaşi condiţii.15 M pH 7. C. poate rezulta un precipitat electron-dens care dăunează calităţii preparatului. iar trecerea soluţiei în alte flacoane se va face numai prin răsturnare. În plus. o soluţie 1% (sau 2%) de OsO4 în Tampon Fosfat 0. în tuburile cu piesele prefixate şi spălate se adaugă cel de-al doilea agent fixator.366 g) . Culoarea unei soluţii proaspete de OsO4 este galben pal. pH 7.B.064 g (2. Dacă prefixarea s-a făcut la frigider.765 g (27. ale cărei reziduuri vor împiedica legarea osmiului.Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 · 12H2O) 10.15 M se prepară după reţeta: . După îndepărtarea glutaraldehidei se adaugă peste piese (care nu vor rămâne niciodată neacoperite) tampon fosfat 0. cu dop rodat. conţinând 50 ml tampon fosfat 0.4.15 M.NaH2PO4 · H2O (NaH2PO4 · 2H2O) 2.

70% timp de 30 minute. pH 7. Când se ajunge la etapele finale. înlocuirea solventului trebuie făcută foarte rapid. în 4 băi succesive de câte o oră (în a patra baie piesele se pot ţine peste noapte). cu urmări asupra polimerizării blocurilor la includere. este necesar ca toată apa introdusă în timpul spălării în piese să fie extrasă fără a produce modificări în structura moleculară a celulelor. 50% timp de 15 minute. 80% timp de 30 minute. dioxan sau toluol în etapele finale. Cantitatea de soluţie folosită pentru fiecare etapă de deshidratare trebuie să fie de 2-5 ml în funcţie de numărul pieselor din fiecare flacon. în soluţii apoase de concentraţii crescătoare: 30% timp de 15 minute. Dacă fixarea s-a făcut la frigider. 100% (anhidră) timp de 15 minute. şi spălarea se va face în aceleaşi condiţii.15 M. Spălarea După terminarea procesului de fixare pe cale chimică trebuie să urmeze imediat spălarea pentru înlăturarea totală a excesului de fixator din ţesut. 100% (anhidră) timp de 15 minute.D. pentru o cât mai bună includere. Pentru deshidratare se utilizează acetona (pentru epon se poate folosi şi alcoolul etilic) şi în unele cazuri oxidul de propilen. Prezenţa urmelor de fixator în ţesut facilitează reacţii între acesta şi soluţiile de solvenţi organici folosite la deshidratare. DESHIDRATAREA În vederea includerii pieselor (pentru a se putea efectua secţiunile ultrafine) se utilizează răşini epoxidice: Vestopal W sau Epon 812 care sunt substanţe organice hidrofobe. În cazul fixărilor succesive duble. 100% (anhidră) timp de 15 minute. Deci.4. deoarece alcoolul sau acetona se evaporă uşor şi piesele pot suferi procese 352 . Până la concentraţia de 70% se lucrează la temperatura de 4ºC după care tuburile vor putea fi păstrate la temperatura camerei. Extragerea apei se face treptat şi în timpi scurţi pentru ca procesul să nu fie însoţit de alterări structurale (eventuale extracţii de proteine din ţesut). 90% timp de 30 minute. spălarea trebuie efectuată după fiecare fixator folosit. După îndepărtarea tetraoxidului de osmiu se adaugă peste piese (care nu vor rămâne niciodată neacoperite) Tampon Fosfat 0. La includerea în Epon 812 pot urma două băi de oxid de propilen de câte 15 minute fiecare.

urmate de modificări nedorite. ceea ce se poate realiza introducând în vase o cantitate oarecare de sulfat de sodiu anhidru. În paralel cu deshidratarea se prepară soluţie de Vestopal sau Epon pentru includere. dar care. Toate operaţiile de includere şi încapsulare se desfăşoară în nişă. Specimenele sunt infiltrate în toată masa lor cu materialul de includere. acest solvent trebuie evitat deoarece inhibă unele enzime. 3:1 şi în Vestopal (Epon) pur. A. care înlocuieşte substanţa în care se efectuează deshidratarea. Din categoria mediilor de includere hidrofobe fac parte cele pe bază de metacrilat. În cazul includerii cu răşini epoxidice.de strângere. În cazul cercetărilor de localizare enzimatică. INCLUDEREA Obţinerea secţiunilor ultrafine care. Există şi medii de includere hidrofile. din aceeaşi clasă mai fac parte lacul poliesteric ME 6611. etc. Între soluţiile de deshidratare şi cele de includere este bine să se intercaleze câteva băi cu solvenţi de tranziţie. fiind foarte fluid şi miscibil cu aceste răşini. Dintre răşinile poliesterice. selectronul etc. care nu necesită deshidratarea pieselor după fixare şi spălare. rigolacul. 1:1. răşini poliesterice şi unele răşini epoxidice. prepolimerizaţi împreună până la starea unui 353 . Este recomandabil ca alcoolul sau acetona folosite în ultimele băi să fie anhidre. să nu altereze structurile. cel mai bun intermediar este oxidul de propilen care acţionează ca deshidratant şi fixator şi. cel mai frecvent utilizat este Vestopalul W. Dintre răşinile epoxidice se pot enumera: Araldita. DER 332 – DER 732. 2:1. prin infiltrarea în ţesut. respectiv acetona (sau dacă este cazul – alcoolul etilic). Din această categorie pot fi amintite: durcupanul. Vestopal W Vestopalul W este o răşină poliesterică – un copolimer format dintr-un poliester nesaturat şi stiren. peste noapte. Epon 812 –Araldită. fără dop. glicol-metacrilatul sau aquonul. Eponul 812. Tot ca intermediar este recomandat xilolul sau toluolul. prin grosimea lor redusă să permită transmisia electronilor şi deci obţinerea imaginilor în TEM este condiţionată de includerea pieselor într-un mediu suficient de dur care să faciliteze secţionarea pieselor. Pentru includera în Vestopal sau Epon piesele sunt ţinute câte 1 oră în soluţii de Vestopal (Epon)/acetonă (anhidră) în concentraţii crescătoare: 1:2. Maraglas 655 – DER 732. fiind mai volatil. asigură o foarte bună infiltrare a ţesuturilor.

iniţiatorul şi activatorul.Vestopal W . Ca amestec de includere. chiar la rece. stirenul. uşor gălbui. duritatea blocurilor poate fi modificată după dorinţă. Cel care expiră mai repede este activatorul. îşi pierd activitatea în decurs de o lună. altfel blocurile vor fi moi şi de slabă calitate. se secţionează uşor cu cuţitul de sticlă. În timp ce răşina poate fi păstrată câteva luni la rece. Vestopalul W nu este miscibil cu alcoolul. iar secţiunile sunt foarte rezistente la fascicolul de electroni. ţesuturile au un contrast ridicat şi sunt excelent prezervate. Pentru includere şi încapsulare. se pot monta pe grile fără pelicule suport şi permit obţinerea unei înalte rezoluţii. pătrunde repede în ţesuturi.sirop consistent. B. Fiind parţial polimerizat. după care se pun în tuburi.Octoat de cobalt preparat astfel: 1 ml α-metil stiren + 7 picături de octoat de cobalt 15 g 150 mg 8 picături (0. se omogenizează din nou foarte bine şi se adaugă 8 picături de activator (la 3 probe) (octoat de cobalt) cu o pipetă la care 1 ml corespunde pentru 20 de picături. se adaugă Vestopal în cantitate de 1 g/bloc. care îşi schimbă culoarea. obţinută prin condensarea epiclorohidrinei cu glicerol. nu produce procese de strângere a ţesuturilor. cristale care se răzuiesc şi se mărunţesc. deoarece amestecul este exploziv. Secţiunile sunt rezistente la fasciculul de electroni. aceştia din urmă trebuie reînnoiţi în fiecare lună. Blocurile se pot secţiona uşor cu cuţitul de sticlă. În timpul lucrului se va avea grijă să nu se amestece direct iniţiatorul cu activatorul. De aceea. Pentru 3 probe (15 blocuri) reţeta de preparare a Vestopalului este următoarea: .Peroxid de benzoil . şi pentru deshidratare trebuie să se folosească acetona. dioxanul sau chiar glicometacrilatul. 354 . se prepară vestopalul astfel: se adaugă în puţin Vestopal peroxidul de benzoil (iniţiator al polimerizării Vestopalului) pentru predizolvare şi se amestecă foarte bine cu o baghetă de sticlă. Epon 812 Eponul 812 este o răşină epoxi-alifatică pe bază de glicerol. Atât răşinile cât şi iniţiatorul şi activatorul se pot păstra la rece.4 ml) Peroxidul de benzoil se activează în prealabil prin recristalizarea din cloroform. Substanţa activată se depune sub formă de cristale incolore pe pereţii vasului respectiv.

sau chiar la spargerea acestora. raportul de combinare A:B = 5:5 la care se adaugă 150 μl DMP 30 (2. conţinând în interior piesele – de culoare neagră. transparente. Raportul 5:5 duce la obţinerea unor blocuri potrivit de dure. În urma polimerizării se obţin blocuri dure. ÎNCAPSULAREA Încapsularea specimenelor se face în capsule de gelatină foarte bine uscate (ţinute câteva ore la etuvă la 60°C) – în fiecare capsulă se pune o picătură de mediu de includere şi apoi câte două cuburi dintr-o probă pentru fiecare bloc. Temperatura mai ridicată poate duce la polimerizarea neomogenă. sub o lupă binoculară cu posibilităţi de mărire de 70-100×. pentru ca blocul să fie relativ scurt. spre a intra aproape în întregime în suportul ultramicrotomului. blocurile vor fi mai moi. Înainte de amestecarea celor două soluţii. Pentru două probe (6 blocuri). 355 .6-dimetil-aminometil fenol) – acceleratorul polimerizării. MODELAREA BLOCURILOR Blocurile de răşină se fasonează cu ajutorul unei lame de ras nouă. ele trebuie scoase de la frigider şi ţinute la temperatura camerei timp de câteva ore pentru a evita condensarea vaporilor de apă pe ele. ceea ce ar afecta polimerizarea.Reţeta de preparare a Eponului este următoarea: Soluţia A Epon 812 (Epitoke 212) DDSA (anhidrida dodecenil-succinică) ml 66 100 Soluţia B (dă duritatea) Epon 812 NMA (anhidrida metil-nadică) ml 100 84 Soluţiile A şi B pot fi păstrate timp de peste 6 luni la 4ºC în sticle bine închise şi ferite de umezeală. Se completează cu Vestopal (Epon) circa 3/4 din volumul capsulelor. cu preponderenţă la periferia blocurilor. blocurile vor fi mai dure. Se amestecă foarte bine cu o baghetă de sticlă şi apoi se centrifughează pentru eliminarea bulelor de aer. dacă predomină soluţia A (7:3). deci includerea corectă. În vârful blocurilor. După încapsulare se induce polimerizarea mediului de includere prin introducerea capsulelor la etuvă la o temperatură de 60ºC timp de 24-48 de ore.4. iar dacă predomină soluţia B (3:7). Ulterior se face etichetarea capsulelor (pe etichete se scrie cu creionul chimic pentru Vestopal şi cu creion obişnuit pentru Epon – pentru a se evita ştergerea simbolurilor la contactul cu mediul de includere) şi completarea concomitentă a tuturor capsulelor de gelatină.

Înainte de confecţionarea cuţitelor. de aceeaşi intensitate pe toată linia de tăiere. sticla pentru cuţite. în timp ce zonele învecinate prezintă dinţi de fierăstrău. S-a demonstrat că dacă nu există sticlă specială pentru cuţite. Din cauza tensiunii de fracturare. rezultând câte două cuţite de formă triunghiulară. Se modelează câte două blocuri pentru fiecare probă. aşa-zisa linie Wallner.2 mm. şi la fracturare sticlei se produc tensiuni care afectează calitatea cuţitului. deoarece acestea pătrund prea adânc. strălucitoare. pentru care se foloseşte ca materie primă. cu ajutorul căreia se poate detecta zona utilă a cuţitului. asigurându-se astfel o tăiere uşoară şi o rupere a benzilor de sticlă fără tensiuni. cu grosimea de 5-8 mm. Apăsarea pe foaia de sticlă trebuie să fie uşoară. la o mărire de 50-100×. SECŢIONAREA Această operaţie este necesară pentru obţinerea secţiunilor ultrafine. prismatică. Cuţitele selecţionate pentru secţionare se păstrează ferite de praf.5 mm. lungi de 400 mm. apare ca o linie albă. pe diagonala cărora se va face o nouă tăietură. Pentru tăierea sticlei nu se folosesc cuţite de diamant.1-0. cu atât tensiunea de accelerare a electronilor va trebui să fie mai mare pentru a se putea obţine imaginea pe ecranul fluorescent al microscopului. câte un bloc fiind păstrat ca rezervă. sub formă de bare. Aceasta începe în punctul unde linia Wallner se curbează: zona cea mai ascuţită examinată la microscopul stereoscopic al ultramicrotomului. barele de sticlă se curăţă uşor cu un tampon de vată cu acetonă anhidră după care se şterg cu o bucată de tifon curat. poate fi folosită orice sticlă albă plană. cuţitele pot avea muchia de tăiere oblică. Cu cât secţiunile sunt mai groase. Înainte de folosire este necesară pregătirea suplimentară a cuţitelor. Operaţiunea de modelare a blocurilor este necesară pentru ca în momentul secţionării să se obţină secţiuni trapezoidale care vor forma benzi rectilinii.la nivelul probei se execută un trunchi de piramidă care să poarte în vârf o suprafaţă trapezoidală cu laturile de aproximativ 0. La marginea 356 . Folosirea knife-maker-ului are ca rezultat obţinerea de cuţite cu tăiş drept. late de 25 mm şi groase de 5. Pentru secţionare se pot folosi cuţite de diamant sau cele de sticlă. mult mai accesibile. cu o grosime care să permită străbaterea lor de către fasciculul de electroni acceleraţi la tensiuni de 50-100 kW în TEM. Tăierea se va face pe o folie de cauciuc. Cele mai potrivite sunt rondelele de metal din comerţ. Din barele de sticlă se vor tăia în prima fază pătrate. Pentru realizarea cuţitelor se poate utiliza aparatul special conceput pentru aceasta (knife maker). imediat sub tăişul cuţitului se formează o linie curbă. în cazul tăierii manuale. Se poate întinde înainte de tăiere o urmă de petrol cu ajutorul unui tampon de vată.

Blocurile se montează astfel ca baza mare a trapezului din vârful piramidei să fie perfect paralelă cu lama cuţitului. Secţiunile obţinute vor pluti la suprafaţa apei distilate din baia cuţitului (care formează oglinda). Se apropie cât mai mult posibil cuţitul de bloc prin manevrarea voxelor macrometrică. La nivelul bazinului se va ajusta cantitatea de alcool 10% astfel încât. ceea ce ar putea determina udarea blocului şi compromiterea secţionării. Cuţitul se instalează în ultramicrotom raportat la limitatorul din stânga locaşului cuţitului şi la un unghi de 3º. oglinda de apă trebuie să fie orizontală. Pentru secţionare blocurile se montează pe rând în dispozitivul barei de înaintare al ultramicrotomului LKB. pe o suprafaţă cât mai mare posibilă (ideal este completă) a acesteia. piramida realizată la nivelul probei trebuie să se afle la nivelul gurii cuţitului (în plan vertical). Se spală de cel puţin 3 ori cu alcool (10% sau acetonă 10%) sau cu apă distilată. egală cu grosimea secţiunii (500-1000 Å). În poziţia blocată a barei de înaintare. După fiecare mişcare de tăiere. în zona cea mai ascuţită a acestuia. bara înaintează cu o distanţă reglabilă. bara de înaintare în sus şi în jos prin acţionarea manuală a acesteia – de la viza de pe panoul de comandă. prin reglarea poziţiei lămpii fluorescente.prismei unde se află suprafaţa de secţionare se construieşte un bazin prin lipirea unei benzi adezive în poziţie perfect orizontală. astfel încât suprafaţa de secţionare a blocului cade pe faţa de tăiere a cuţitului de sticlă sau de diamant. temperatura camerei trebuie să fie cât mai scăzută posibil. Bara de înaintare va efectua mişcări succesive în plan vertical. să nu prezinte menisc. reflexia luminii să se realizeze cât mai uniform la suprafaţa băii. De asemenea. În cazul ultramicrotomului LKB avansul este controlat prin dilatarea termică a unei tije metalice (aliaj de nichel). grosimea acestora fiind apreciată după culoarea lor: Cenuşie Cenuşiu-argintie Argintie Argintiu-gălbuie Galben pai 100-200 Å 300-400 Å 500 Å 600 Å 650-700 Å Galben intens-maroniu Maro Maro – albăstrui Albăstrui Verde 700-800 Å 800-850 Å 900-1000 Å 1000-1100 Å 1300-1500 Å 357 . mişcând uşor. Pentru aceasta. apoi se face oglinda. şi apoi micrometrică a ultramicrotomului. Pentru realizarea acestui lucru se reglează angrenajele intermediare care ajută la fixarea suportului care poartă blocul de bară de înaintare a ultramicrotomului. în paralel.

însă în mod curent sunt folosite grile cu 100-200 de ochiuri. cu atât dispersia electronilor şi implicit contrastul imaginii sunt mai mari. Pentru obţinerea peliculei de parlodion. contrastul acestora este foarte scăzut. Contrastul imaginii obţinute în microscopul electronic depinde de numărul atomic al elementelor din care este alcătuit specimenul: cu cât acest număr este mai mare. Grilele electrolitice sunt reţele de cupru cu cadrul de 3 mm. În cazul de faţă contrastarea se face în două etape. Pe această peliculă se aşează grilele. Uscarea grilelor se face cu hârtie de filtru prin tamponarea laterală a grilelor. Secţiunile sunt preluate pe grile electrolitice de cupru (200 mesh) acoperite în prealabil cu o peliculă fină de parlodion. se trece la acoperirea cu carbon (un strat de circa 100 Å) a grilelor într-un evaporator cu vid (metalizor). H). pentru a le evidenţia sunt contrastate cu săruri ale metalelor grele. Grosimea secţiunilor se va alege şi ţinând cont de caracteristicile microscopului în care se va face examinarea.Acetat de uranil . După uscarea peliculei la temperatura camerei. Deoarece moleculele din structurile biologice sunt constituite din atomi cu număr atomic mic (C. N. CONTRASTAREA Ţesuturile biologice incluse în mase plastice.Pentru cercetări de rutină. şi ca urmare. datorită fineţei lor şi a compoziţiei chimice.Alcool etilic 50% în apă distilată 358 2. cu doi contrastanţi diferiţi: A. Soluţia de acetat de uranil se prepară după reţeta: . Grilele se păstrează în cutii Petri cu capac pentru a fi ferite de praf (pe hârtie de filtru pe care se trec simbolurile corespunzătoare specimenelor). Stratul de carbon are rolul de a proteja pelicula de parlodion de acţiunea distrugătoare a fasciculului de electroni. Numărul de ochiuri pe care le poate avea o grilă variază între 50 şi 1000. cu faţa în jos. secţiunile de culoare argintie sunt foarte convenabile. Grilele sunt apoi scoase cu ajutorul unor rondele de hârtie. Contrastarea urmăreşte creşterea capacităţii de împrăştiere diferenţiată a electronilor de către materialul biologic secţionat. Contrastarea cu acetat de uranil. au putere mică de împrăştiere a electronilor. în mijlocul unui cristalizor cu apă bidistilată se pipetează o picătură de parlodion. O. obţinute prin electroliză.6 g 20 ml . Se evaporă diluantul rămânând o peliculă de 100 Å grosime. grilele fiind ferite de praf. Din fiecare bloc se vor culege secţiuni pe cel puţin câte 2 grile.

iar colorarea să se facă în apropierea câtorva granule de NaOH care să absoarbă CO2. În microscopul electronic de transmisie clasic imaginea se formează în întregime. imaginea se formează punct cu punct în forma rasterului.Se pipetează acetatul de uranil în godeurile unei plăci de parafină (ceară). după care se spală la jet de apă distilată. interacţiune în urma căreia apar următoarele semnale: 359 . se numeşte raster. care se compune din numărul total al liniilor. filtrată. într-un sistem cu mai multe lentile. Raza primară (incidentă) a electronilor acceleraţi şi concentraţi ce cade pe suprafaţa probei. Electronii emişi de tunul de electroni al microscopului şi acceleraţi de o tensiune înaltă (0.5–30 kV) sunt concentraţi. pe suprafaţa probei cercetate. Contrastarea cu citrat de plumb. după care se lasă grilele cu secţiunile în jos pe picăturile de contrastant.410 g 8 ml Se dizolvă în 30 ml apă distilată şi se agită puternic timp de 5-10 minute 2. Imaginea finală. Microscopia electronică de baleiaj Microscopul electronic de baleiaj sau scanning (SEM) diferă fundamental de microscopul electronic de transmisie în privinţa modului de formare a imaginii. Soluţia de citrat de plumb se prepară după reţeta: Citrat de plumb (GM 1053. după care s-au lăsat grilele cu secţiunile în jos pe picăturile de contrastant. Se ţin grilele pe citratul de plumb maxim 9 minute (timp după care apar precipitate). se va evita contactul contrastantului cu aerul atmosferic. Se ţin grilele pe acetat de uranil 15-20 minute după care se spală la jet de pisetă cu apă distilată-alcool şi se iau pe hârtie de filtru spre a nu adera la vârful pensei fine cu care se lucrează. B. sub 10 nm. într-un fascicul îngust al cărui diametru în locul de încrucişare are.85) NaOH 1N Se agită timp de 5 minute Apă distilată Se aduce pH-ul la valoarea 12 Se completează până la 50 ml 1. Cel mai bine este să se folosească o soluţie proaspătă preparată. în timp ce la cel de baleiaj. interacţionează cu materialul. Se pipetează citratul de plumb în godeurile plăcii de parafină (ceară). simultan. Pentru evitarea apariţiei precipitatelor (reprezentate de carbonatul de plumb ce apare la contactul citratului de plumb cu CO2 atmosferic).

îndepărtându-se orice urmă de solvent sau a vreunei substanţe volatile din materialul biologic. a patra peste noapte. 360 .4 .• Electroni secundari (SE) • Electroni reflectaţi (BE) • Electroni Auger • Electroni absorbiţi de probă (AE) • Electroni transmişi prin probă (TE) • Fotoni • Radiaţii X. în condiţii de vacuum înalt. . . Timpii de lucru ai acestor etape vor fi adaptaţi tipului de ţesut organic şi. capabil de a genera electroni secundari sub impactul fasciculului incident provenit din filamentul microscopului. dimensiunilor probei. pentru SEM dimensiunile preparatelor pot depăşi 3 cm grosime. Neavând de a face cu electroni transmişi prin probă.1M.4 timp de 75-90 minute.îndepărtarea fixatorului în exces prin trecerea probei în tampon fosfat 0. de asemenea. examinarea desfăşurându-se. DESHIDRATAREA LA PUNCT CRITIC Deshidratarea la punct critic reprezintă o metodă de eliminare a oricărei substanţe volatile. suficient de profunde pentru a nu mai înregistra un aspect normal al acestora.7% în tampon fosfat 0. Pentru fixarea probelor biologice cu conţinut ridicat de apă se foloseşte aceeaşi combinaţie de fixatori ca şi pentru microscopia electronică de transmisie: . dar pentru probele biologice este necesară acoperirea acestora cu un strat foarte subţire de metal (prin evaporare în vid). de asemenea la 4 0C.15M. Ca şi în cazul TEM. limitarea fiind dată doar de mărimea incintei probei. pH 7. pH 7. generatoare de vapori (ce pot diminua nivelul vidului din microscop) dintr-o probă biologică în vederea examinării acesteia la microscopul electronic cu baleiaj.prefixarea cu glutaraldehidă 2. o deshidratare naturală a materialului biologic produce alterări ale suprafeţei probelor datorate tensiunii superficiale.postfixarea cu acid osmic (Os O4) 1% în tampon fosfat 0.4 pentru 60 – 90 minute la 4 0C. şi aici probele trebuiesc deshidratate. pH 7. toate la 4 0C. Deşi rezoluţia acestui microscop nu permite observarea unor detalii de ordinul celor din TEM. în special.trei băi consecutive a câte 60 minute fiecare.15M.

Prin creşterea temperaturii gazului lichefiat. 361 . intervenţia aşa-numitei continuităţi de fază sugerează o metodă de deshidratare pentru care tensiunea superficială poate fi redusă la zero. suprafaţa lichidului devine foarte instabilă şi. care prezintă o tensiune superficială la aer foarte mare. evitând astfel posibilitatea apariţiei deformărilor datorate tensiunii superficiale. dar se pot folosi şi alte gaze lichefiate ca şi fluid de tranziţie. metodă superioară sublimării apei în vid. proba fiind supusă forţelor prezente la limita fazei lichid – vapori. unde aceasta este de câteva ori mai mică. cauza primară a acestora fiind efectele tensiunii superficiale. în final. studierea morfologiei suprafeţelor probelor biologice implică prezervarea detaliilor de suprafaţă.În 1952. Dacă proba biologică a fost în lichid. În acest sens. va parcurge această tranziţie spre un mediu gazos “uscat” fără a fi în contact cu suprafaţa. trece în faza de gaz. spre deosebire de acetonă. indicând o reducere a tensiunii superficiale. Dacă tensiunea superficială scade foarte mult. meniscul devine plat. aşteptându-se deformări minore ale suprafeţei probei în timpul deshidratării. Cel mai comun mediu al probelor biologice este apa. Deshidratarea normală prin evaporare la temperatura camerei induce deformări ale majorităţii specimenelor. Anderson a dezvoltat această metodă folosind CO2 lichid. cu păstrarea nealterată a detaliilor de suprafaţă. Când este atins punctul critic este posibilă trecerea de la faza de lichid la faza de gaz fără modificări dramatice. Tensiunea superficială poate fi redusă prin substituirea cu un lichid ce are o tensiune superficială mult mai mică decât a apei. Totuşi.

în consecinţă. de regulă. în cazul probelor biologice la unele dintre acestea ar interveni modificări termice suplimentare.1 MONOXID DE CARBON -141. o continuitate de stare.5 OXIGEN -118 AZOT -146 DIOXID DE CARBON +31. proprietăţile stării de lichid şi ale stării de gaz (vapori) ale aceleiaşi substanţe. Înaintea acestor etape se realizează fixarea probei. aşa încât presiunea critică să poată fi atinsă la temperatura critică. o substanţă poate fi clasificată drept gaz doar deasupra temperaturii critice. tensiunea superficială fiind zero având. Dacă lichidul a fost încălzit într-o incintă închisă. aceasta fiind temperatura critică căreia i se asociază o presiune critică.1 oC pentru CO2. deci. stadiul intermediar implică deshidratarea probei biologice cu ajutorul lichidului intermediar: (proba umedă) H2O > Acetonă > CO2 > DPC (proba uscată) 362 . astfel. apa din proba biologică trebuie înlocuită cu un alt fluid miscibil cu CO2. Aşa cum s-a menţionat. tipic pentru microscopia electronică. Chiar dacă valorile critice ale diferitelor substanţe pot fi atinse practic. cel mai utilizat fiind. unde poate fi lichefiată.1 APĂ +374 Presiunea critică (atm) 20 50 33 73 36 219 Deci. sub această valoare. Nefiind miscibil cu apa. CONSTANTE CRITICE Substanţa Temperatura critică (oC) HIDROGEN -234. valori la care are loc tranziţia. Acest fapt este realizat pe izoterma de 31. la atingerea punctului critic (caracterizat de valori ale presiunii şi temperaturii foarte precise). CO2 rămâne cel mai utilizat mediu pentru deshidratarea la punct critic şi este numit fluid de tranziţie.Graficul indică faptul că. în final. Deasupra acestei temperaturi gazul nu poate fi lichefiat prin aplicarea presiunii. deşi se pot utiliza şi variante cu două fluide intermediare. procedura glutaraldehidă – osmium. Acest fluid intermediar. schimbă apa din ţesut şi este miscibil cu CO2. coincid. devin similare şi. orice menisc vizibil va dispărea. dioxidul de carbon. este mult mai precis termenul de vapori.

fixarea probei cu glutaraldehidă 2. substituirea acetonei cu CO2 lichid sub presiune – operaţie repetată în funcţie de dimensiunile probelor. _______________acetonă________________________ H2O > 30% > 50% > 60% > 70% > 80% > 90% > 100% > CO2 ¤ ------------------. 4. culminând cu înlocuirea completă a apei din ţesut cu acest fluid. 6. În absenţa stratului de acoperire.trei schimbări FLUIDE INTERMEDIARE / DESHIDRATANTE Substanţa ETANOL ACETONĂ FREON (113) APĂ Tensiunea superficială (dyne/cm) 23 24 19 73 Principalele etape ale deshidratării la punct critic: 1. Această acoperire este necesară pentru eliminarea sau reducerea încărcării electrice ce se instalează rapid la suprafaţa unei probe neconductive la baleierea acesteia de către un flux de electroni de energie înaltă. încălzirea incintei până la atingerea punctului critic. 3. Materialul uzual pentru acoperirea probelor este aurul. imersia probei în acetonă în incinta aparatului. specimenul poate acumula o încărcătură suficient de mare pentru a decelera fluxul primar. ACOPERIREA CU METALE Toate probele neconductive necesită acoperirea cu un film subţire de material conductiv. fiind mai puţin susceptibil deformărilor datorate evaporării fluidului de tranziţie ce-l va înlocui. proba acţionând în acest caz ca oglindă pentru electroni. specimenele nonconductive examinate la parametri optimi prezintă invariabil fenomenul încărcării electrice ce conduce la distorsionarea imaginii şi la distrucţii termice. 5. deoarece prezintă o tensiune superficială foarte scăzută.Specimenul este trecut prin diferite concentraţii crescătoare ale fluidului intermediar.câte 10 minute fiecare ---------------------¤ . 2. având drept rezultat pierderi semnificative de material din probă. În situaţii extreme.7% şi OsO4 1% în tampon fosfat. eliberarea vaporilor de CO2. deshidratarea cu acetonă. 363 .

palpi (insecte). Pulberile. vor fi presărate pe suportul adeziv. aurul este cel mai utilizat element pentru acoperirea probelor. Astfel. abia apoi realizându-se acoperirea cu metale a acestora. putându-se realiza chiar hărţi cu distribuţia fiecărui element chimic în zona luată în studiu. imaginile fiind preluate în format digital sau clasic pe film. pe baza radiaţiei X (specifică fiecărei specii chimice) generate din probă. Probele astfel pregătite se introduc în microscop si se examinează la diferite măriri. de câteva sute de nanometri. la celelalte probe este obligatorie uscarea la punct critic pentru prevenirea deformărilor datorate unei deshidratări brutale în aer. antene. Orientarea probei pe suport în aceasta fază este foarte importantă. pot fi aranjate în ordine pe un singur suport. aşa încât zona de interes să fie expusă direct fasciculului de electroni ce balează proba. dispozitiv instalat într-o incintă ce menţine un nivel de vacuum (10-2 Pa) suficient pentru a asigura o depunere a atomilor de aur într-un strat uniform şi foarte subţire. în timp ce.Când scopul analizei nu este achiziţia unui spectru de raze X. 364 . O anexă importantă a SEM este sistemul de microanaliza elementală cu raze X (EDX). Acoperirea se realizează prin evaporarea metalului în vid. Probe biologice de tipul insectelor chitinoase. ţinând cont de posibilitatea limitată de înclinare a probei în microscop. sporii sau alte probe ce nu pot fi manipulate cu pensa. probe de tipul microfosilelor (foraminifere) sau segmente de aparate bucale. Detectorul special al EDX identifică. montarea probelor se va realiza sub lupa binocular unde. ce presupune legarea metalului la polul pozitiv şi a probei la cel negativ. precum şi cele cu un conţinut nesemnificativ de apă (frunze uscate) pot fi montate pe suport şi metalizate fără deshidratare. compoziţia chimică a probei analizate atât calitativ cât şi cantitativ. la capete aplicându-se o tensiune continuă de 1 – 3 kV. EXAMINAREA DIFERITELOR PROBE IN SEM Probele pentru examinarea în SEM sunt montate pe suporturi conductive din cupru cu ajutorul unor discuri de carbon adezive pe ambele feţe. surplusul fiind îndepărtat în momentul introducerii în vid pentru metalizare.

. Bibliografie ...... Binnig......................... 376 Quantum mechanics predicts an exponential dependence of tunneling current with a separate distance between the two electrodes............................... 371 5.................. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ Microscopia de forţă atomică Conf.................. Microscopia de Scanare a Probei Microscopia cu scanarea probei (Scanning Probe Microscopy ... Weibel in 1981 was marked as the invention of STM...... 1...................................................................... se poate vizualiza dintr-un eşantion maxim 150 X 150 um dacă rugozitatea în zona scanată este 365 Figura 1...... 375 8......... Avantajele şi Limitele Microscopiei de Forţă Atomică ... Rohrer........... 369 3.................... Spectroscopia de Forţă Atomică .............................. . Ioan Burda Cuprins 1...................................... 373 6....... Ch.......... Imagine SEM x1000 pentru un cantiliver – tip............................X................................. dr.......................... 365 2..................................................... Microscopia de Scanare a Probei ................. Nanolitografie cu Microscopul de Forţă Atomică ...............................SPM) este o microscopie mecanică ce acoperă câteva tehnici de vizualizare a suprafeţei unui eşantion (morfologia suprafeţei) cu o rezoluţie la nivelul moleculelor sau a grupurilor de atomi........................... Gerber and E.. Microscopia de Forţă Atomică ... H........ 371 4........... Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de Forţă Atomică ........ An observation of this dependence between a W-tip and Pt surface by G..................... Aplicaţii ale Microscopiei de Forţă Atomică .................................. În cazul celor mai performante echipamente SPM disponibile în prezent................................. 374 7.

Un alt element de bază al unui SPM este scanner-ul piezoelectric. respectiv cu polaritatea acesteia. astfel încât să poată fi urmărit profilul suprafeţei scanate. tip) şi eşantionul scanat.mai mică de 10 um. De performanţele mecan. iar z este distanţa pe care cantilever-ul a suferit o Figura 2. Y şi Z iar cu ajutorul lui se poate poziţiona proba (tip-ul) cu extremă precizie în 3D (3 Dimensiuni). Scanner-ele sunt caracterizate Figura 3. În prezent. atât cât se extinde sau contractă un material piezoelectric per volt. Cu ajutorul unui astfel de sistem de detecţie este posibilă măsurarea indirectă a forţei dintre tip şi suprafaţa eşantionului studiat. Scanner-ul SPM este realizat din material piezoelectric (PZT) care se expandează şi contractă proporţional cu tensiunea aplicată.electrice ale scanner-ului piezoelectric depind în ceea mai mare măsura performanţele întregului SPM. Acest fascicul laser se reflectă de partea opusă tip-ului (fabricat din Si sau Si3N4) pe un fotodetector sensibil la poziţie (Figura 2). cele mai multe sisteme SPM utilizează un fascicol laser pentru a determina deflexia cantilever-ului. Acest tip este ataşat de o grindă (cantilever) flexibilă. Tehnologia SPM are la bază un concept simplu: scanarea unei suprafeţe cu ajutorul unui vârf (tip) foarte ascuţit (sharp. importantă pentru interpretarea imaginilor SPM sau pentru a determina proprietăţi mecanice locale ale eşantionului. se definesc tehnicile SPM. Pentru a calcula forţa de interacţie utilizăm legea lui Hook (F = kz). Scanner piezoelectric de forma prin sensibilitatea lor (raportul dintre tubulara. Detecţia deflexiei cu ajutorul deflexie. Pentru valori mari ale tensiunii. deplasarea nu este 366 . se poate spune că este singurul element puternic limitativ în evoluţia viitoare a microscopiei mecanice. În funcţie de mecanismul de interacţiune dintre probă (vârf. De regulă. Cunoaşterea acestor forţe este unui fascicul laser şi a unui fotodetector. unde k este constanta de elasticitate a cantilever-ului. deplasarea pe o direcţie şi tensiunea aplicată pe acea direcţie) adică. vârf cu raza de curbură de circa 3-50 nm. scanner-ul este construit sub forma unui tub (Figura 3) cu electrozi pentru deplasarea pe X. Mai mult. Figura 1).

Din această cauză. Cu toate acestea. Această situaţie experimentală este posibilă în cazul unor suprafeţe conductoare curate (practic fără rugozitate) precum şi în lipsa vibraţiilor ambientale. cu un diametru mai mic decât lungimea de undă. magnetice si mecanice. Practic. Poate cel mai neplăcut lucru legat de scanner este procesul exponenţial de îmbătrânire ce determină o scădere a sensibilităţii în timp. Proba (un tip de fibră optică plus o apertură) trebuie să fie foarte aproape de suprafaţa eşantionului. poate fi obţinută o rezoluţie dincolo de limita de difracţie. • Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) utilizează o sursă de lumină de foarte mici dimensiuni ca mecanism de formare a imaginii. Pentru a putea măsura efectul de tunelare distanţă dintre cei doi electrozi trebuie să fie de aproximativ 1 nm. AFM-ul a fost dezvoltat în ultimele decenii pentru a măsura o mare varietate de proprietăţi pe suprafaţa eşantionului cum ar fi proprietăţile electrice. Prin utilizarea unei surse cvasi-punctiforme. toate eşantioanele de material de orice tip (inclusiv de natură biologică) pot fi investigate/măsurate cu AFM. Desigur că acest efect poate fi limitat prin aplicarea unei tensiuni neliniare pentru scanare (identificată în procesul de calibrare a scanner-ului). Efectul final al acestei situaţii este identificat prin rezultate diferite funcţie de direcţia de scanare. Cele mai comune tehnici SPM sunt: • Scanning Tunneling Microscopy (STM) este tehnica SPM de bază care a generat întreg domeniul acoperit azi de microscopia mecanică. Această diversitate este bazată pe principiul de funcţionare care implică existenţa unui tip (probă) în contact sau foarte apropiat de suprafaţa eşantionului. o recalibrare frecventă a scanner-ului se impune mai ales în primul an de utilizare. fiind extrem de utilă în multe domenii de cercetare. • Atomic Force Microscopy (Microscopia de Forţă Atomică) a apărut ca o extensie în utilizarea microscopiei mecanice (1986) pentru eşantioanele nu foarte conductoare. această tehnică a cunoscut o dezvoltare rapidă (în comparaţie cu STM). 367 . Pentru a limita efectele date de procesul de îmbătrânire. orice interacţiune dintre tip şi suprafaţa eşantionului este măsurabilă. Principiul STM-ului este dat de efectul de tunelare al electronilor între doi electrozi în prezenţa unui câmp electric.liniară cu tensiunea aplicată şi această dependenţă diferă de la scanner la scanner. aşa că. fabricantul utilizează cel putin 48 de ore scanner-ul înainte de a fi livrat pentru o aplicaţie. Pe lângă morfologia suprafeţei.

topografie. În funcţie de modul de obţinere a imaginii. Pentru a vizualiza imaginile. • Reflexie: lumina care vine prin apertura probei se reflectă pe suprafaţa eşantionului. Această regiune limitată de proba şi eşantion este numită “Near-Field” de unde şi numele acestei microscopii. structura chimică si stress-ul local. De regulă. pentru a menţine o distanţă de lucru dintre probă şi suprafaţa eşantionului. Dimensiunea punctului de lumină determină rezoluţia maximă ce poate fi obţinută. cât şi de colectarea luminii reflectate. indice de refracţie. sunt necesare eşantioane transparente. şi în acest caz. O prima metodă este echivalentă cu cea din cazul AFM. iar proba colectează lumina reflectată. feedback-ul necesar în sistem. sunt utilizate câteva mecanisme de contrast: polarizare. se realizează prin două metode. prin intermediul unei fibre optice. • Iluminare/Colectare: Proba este responsabilă atât de iluminare. mecanismele de contrast pot fi uşor adaptate pentru studierea diferitelor proprietăţi. Tipic. cum ar fi indicele de refracţie. birefringenta. tub fotomultiplicator sau CCD (Charge Coupled Devices). Un al doilea mod este un mod rezonant (tuning fork) şi este monitorizată amplitudinea oscilaţiei când tip-ul se mişcă deasupra suprafeţei eşantionului. Rezoluţia imaginii este limitată de dimensiunea aperturii detectorului şi nu de lungimea de undă a luminii incidente.mai aproape decât lungimea de undă. parcurge o apertură realizată prin acoperirea ei cu metal (cum ar fi Al) şi microfabricată la fel ca o probă AFM. La fel ca în orice microscopie optică. lumina laserului. dependenţa de lungimea de undă şi reflectivitate. În acest caz. 368 . • Colectare: eşantionul este iluminat dintr-o sursă externă cu arie mare de iluminare. eşantionul poate fi opac. adică prin intermediul unui cantilever şi a unui sistem de detecţie al deflexiei cu fascicul laser. Detecţia semnalului se realizează prin: spectrometru. avem mai multe moduri de operare: • Transmisie: lumina care vine prin apertura probei este transmisă prin eşantion. Mutarea laterală a tip-ului este denumită “shear-force” feedback. fluorescenţă. dar intensitatea lumini este scăzuta si dependentă de forma probei. În cazul NSOM. în cazul unui NSOM avem o rezoluţie laterală de circa 20 nm şi o rezoluţie verticală de 2-5 nm. APD (Avalanche Photo Diode).

Versatilitatea AFM-ului a dus în timp la o diversitate de moduri de operare şi adaptări. Se poate. sticle şi materiale biologice. În acest scop. care sunt determinate de neomogenităţile materialului. Marele avantaj al AFM-ului este capacitatea acestuia de a investiga practic orice tip de suprafaţă inclusiv polimeri. Acesta a fost de altfel primul mod de operare AFM implementat ca o adaptare la STM. ceramici. Relativ la natura forţelor implicate şi interacţiunea dintre tip şi suprafaţa eşantionului definim cele mai importante moduri AFM de operare (clasice): • Contact Mode (modul contact). de asemenea. Potentialul Lennard-Jones versus modurile de operare AFM. Capabilitatea de a urmării suprafaţa eşantionului în acest mod este limitată doar de circuitul de feedback. • Microscopia de Forţă Laterală (Lateral Force Microscopy . materiale compozite. tocmai de aceea. tip-ul este menţinut (de obicei) la o forţă constantă puternic de respingere. de a măsura prin microscopie mecanică eşantioanele neconductoare.2. Microscopia de Forţă Atomică Microscopia de Forţă Atomică (AFM. Tip-ul este în contact puternic cu suprafaţa eşantionului şi în modul distanţă constantă este posibilă rezoluţia atomică. în medii chimice corozive sau medii biologice termostatate. Potenţialul Lennard-Jones (Figura 4) este un model aproximativ pentru cazul izotropic (repulsie şi Figura 4. modificări la situaţii specifice: măsurători in lichide. cantilever-ul este foarte subţire. LFM este util în vizualizarea forţelor de frecare pe suprafaţa eşantionului.LFM) măsoară forţele de frecare dintre tip şi suprafaţa eşantionului. iar cantilever-ul este mutat în sus sau în jos pe timpul scanării. precum şi pentru a pune în evidenţă muchiile de pe suprafaţa eşantionului. dacă eşantionul este special preparat. atracţie) al forţei Van der Waals ca o funcţie de distanţă. Modul de operare LFM este 369 . pentru suprafeţe ale eşantionului cu rugozitate scăzuta să se opereze în modul distanţă constantă. Aceste forţe sunt măsurate indirect prin deflecţia laterală (twist) a cantilever-ului. cantilever-ul este optimizat pentru sensibilitate mare la forţele de frecare laterală. 1986) a fost dezvoltată ca o soluţie tehnică pentru STM.

NonContact Mode este un concept ce descrie familia modurilor AC (moduri de curent alternativ). Contact Intermitent (Dynamic Force. Force Modulation este un mod AFM de operare ce se referă la utilizarea proprietăţilor materialului probei pentru a controla interacţiunea cu suprafaţa eşantionului. Desigur că forţele de interacţiune dintre tip şi suprafaţa eşantionului sunt foarte mici. În acest caz. dar nu este în contact cu aceasta. cantilever-ul este oscilat în apropierea suprafeţei eşantionului. în fiecare an se adăuga noi moduri de operare sau noi versiuni ale acestora. în aşa fel încât. vîscoelastice). Acest mod de operare este un mod măsurat simultan cu modurile AC enumerate mai sus. Modurile de operare din Microscopia de Forţă Atomică sunt rezumate în Tabelul 1 cu referire la forţa de interacţiune pentru fiecare mod. Acest shift de fază se corelează cu proprietăţi specifice suprafeţei eşantionului (frecare. Tabelul 1 este departe de a fi complet (doar modurile esenţiale) şi mai mult. dar părţi ale oscilaţiei sunt extinse în regimul de respingere. Şi în acest mod. tip-ul intră intermitent în contact cu suprafaţa eşantionului. Detecţia se bazează pe măsurarea diferenţelor de cuplaj cu suprafaţa eşantionului care determină schimbarea frecvenţei de rezonanţă a cantilever-ului şi/sau a amplitudinii de oscilaţie. Phase Imaging este un mod în care sunt culese informaţii despre shift-ul de fază a cantilever-ului aflat în oscilaţie în raport cu semnalul de excitaţie. cantilever-ul este oscilat îin regim de atracţie. 370 . ceea ce înseamnă că tip-ul este apropiat de suprafaţa eşantionului. tipul este în contact constant cu suprafaţa eşantionului. Aceste date pot fi culese simultan cu topografia suprafeţei eşantionului. Avantajul acestui mod de operare este legat de rezoluţia laterală mai ridicată fără apariţia unor forţe de dragare. de ordinul pN.• • • • un mod derivat din modul de operare Contact Mode. Prin acest mod de operare AFM se pot determina şi compara simultan morfologia şi proprietăţile locale. Tip-ul este oscilat şi pus în regim de respingere. Tapping Mode) este denumirea clasică. forţa-distanţă este măsurată determinând astfel elasticitatea eşantionului. adeziune. iar slop-ul. iar mai recent este denumit DFM (Dynamic Force Mode). în acest caz.

Spectroscopia de Forţă Atomică poate fi implementată ca şi deflexie statică sau mai recent în mod dinamic. AFM-ul poate aplica un stres mecanic controlat pe suprafaţa eşantionului (raza de curbură a tip-ului este de câţiva nm aşa că P = F/A determină presiuni ridicate. Force Spectroscopy) şi se referă la măsurarea directă a interacţiunii dintre tip şi suprafaţa eşantionului în funcţie de distanţa de separare. forţe Van der Waals. Aplicaţii ale Microscopiei de Forţă Atomică Datorită faptului că AFM-ul poate investiga practic orice tip de material fără o preparare specială a eşantionului.vibrarea probei puternică de respingere .1 nm. situaţie în care cantilever-ul este vibrat (metoda AC). O altă metodă modernă de investigare mediată de AFM este nanoidentarea (nanoidentation). iar distanţa pe axa Z este mai bună de 0. Spectroscopia de Forţă Atomică O altă aplicaţie majoră AFM este Spectroscopia de Forţă Atomică (FS. megapascali) care produce un shift în semnalul Raman corelat cu stresul aplicat. 4. tip-ul este împins în faţă şi apoi retras de la suprafaţa eşantionului. În această metodă. această tehnică experimentală a devenit în timp cea mai utilizată tehnică în studierea macromoleculelor sau 371 . Limita de măsurare este în domeniul pN. Mod de Operare contact mode non-contact mode intermittent contact mode lateral force mode magnetic force thermal scanning Forţa de Interacţie puternic de respingere – forţa constantă sau distanţa constantă slabă de atracţie . iar deflexia cantilever-ului este monitorizată în funcţie de deplasarea scanner-ului. Această metodă este utilă în măsurarea contactului la dimensiune nano (legături atomice. 3. forţe Casimir) cum ar fi forţa de rupere a moleculelor de suprafaţa eşantionului.Tabelul 1. Aceasta tehnică inovativă este combinată cu probe specializate şi este corelată cu intensitatea spectrală (Raman) în timp real pentru a vizualiza legăturile chimice.vibrarea probei forţele de frecare exercită o torsiune a cantileverului folosit în scanare câmpul magnetic de la suprafaţa eşantionului poate fi vizualizat distribuţia conductivităţii termice pe suprafaţa eşantionului este vizualizată.

este importantă cunoaşterea formei tip-ului (geometria acestuia) pentru o interpretare corectă a imaginilor obţinute. La rezoluţii ridicate. circuite integrate). este frecvent utilizată în studierea suprafeţelor în industria electronică (Silicon wafers. medii de stocare a datelor. Marii producători de echipamente de microscopie mecanicp au reuşit în ultimul timp să elimine o mare parte din limitările anterioare prin îmbunătăţirea componentelor mecanice şi electronice. răşini naturale). Vizualizarea cu AFM a suprafeţelor pentru eşantioane cu relief înalt implică utilizarea unui 372 . liniaritatea scanner-ului şi vibraţiile ambientale. Reţinem din aceste timpuri istorice câteva distorsiuni induse de forma tip-ului care merită înţelese. imaginea obţinută este practic convoluţia dintre forma tip-ului şi morfologia locală. precum şi în studierea unor nanostructuri (suprafaţa polimerilor.eşantioanelor biologice (proteine. ceramici. Murdăria şi efectele de capilaritate induse de apa de pe suprafaţa eşantionului vor avea un rol dominat si. În aceste situaţii. Acest lucru nu este posibil în cazul AFM şi este limitat atât fizic (Van der Waals). dar va deforma mai puţin sau deloc eşantioanele moi. ceea ce vedem într-o imagine AFM este mai degrabă o imagine mediată a morfologiei suprafeţei eşantionului. încât multe din articolele ştiinţifice de ieri au devenit azi automatizare. deoarece poate produce o contaminare a tip-ului sau poate îndepărta material de pe suprafaţa eşantionului. bacterii). cât şi tehnologic prin limita de ascuţire a tip-ului. ¾ Restaurarea Imaginii (Deconvoluţia Probei). reţele de difracţie. de exemplu. dar nu este o alegere potrivită pentru suprafeţele moi. în final. Pentru a vizualiza atomi sau molecule este necesar ca interacţiunea să fie numai între tip şi atomul/molecula cea mai apropiată (acest lucru se poate realiza pentru rezoluţia atomică numai în tehnologia STM). Modurile AC (cu vibrarea probei) sau intermitente au fost imaginate pentru a investiga suprafaţa unor eşantioane biologice. De asemenea. în general. Aşa că. Modul de lucru AFM trebuie ales în funcţie de caracteristicile ce prezintă interes în investigare. vor degrada calitatea imaginii obţinute. precum şi de natura suprafeţei eşantionului. Calibrarea automată tridimensională a uşurat mult munca operatorului. Dacă alegem un contact apropiat atunci AFM-ul va deveni foarte sensibil la zgomote (vibraţii) externe. calitatea tip-ului. Modul contact este o bună alegere pentru suprafeţele dure. ¾ Distorsiuni ale imaginii induse de probă. Performanţele unui AFM sunt limitate de un număr de factori dintre care amintim: capacitatea elementelor mecanice de a muta tip-ul cu precizie şi de a măsura poziţia acestuia. ADN. cromozomi.

Trebuie menţionat că pe lângă nanolitografia de scanare a mai fost dezvoltată în ultimul timp şi litografia vectorială. ceea ce vedem poate fi imaginea tip-ului reflectată de suprafaţă. atomi individuali pot fi manipulaţi prin utilizarea tip-ului unui STM. În aceste situaţii. o descriere sumară a principalelor tehnici este utilă: • Scanning Probe Lithography (SPL) este o unealtă/tehnologie promiţătoare pentru realizarea de pattering la scală nano. În caz contrar. 5. Figura 5. Patter-ul poate fi creat manual sau automat. Nanolitografie vectorială de la procedeu (a) la rezultat (b). litografie AFM (5 um). Nanolitografie cu Microscopul de Forţă Atomică Nanolitografia se referă la fabricarea de structuri nanometrice mai mici de 100 nm.tip foarte ascuţit. 373 . aşa că. se pot vedea câteva exemple clasice de nanolitografie. această tehnică de utilizare a unui AFM este utilizată (nu foarte frecvent) în realizarea de circuite integrate (nanocircuite) sau de sisteme nanoelectromecanice (NEMS). Metoda efectivă de deconvoluţie depinde de caracteristicile suprafeţei eşantionului şi de geometria tip-ului (un subiect frecvent prezent în literatura ştiinţifică). În prezent. • Atomic Force Microscopic Nanolithography (AFMN) este o metodă de pattering pe o suprafaţă chimică-mecanică pentru AFM. trebuie să apelam la metode matematice pentru a restaura imaginea (deconvoluţie). De exemplu. Dip-Pen Nanolithography (DPN) a fost prima metodă SPL disponibilă comercial pentru AFM. Nanolitografia nu se rezumă la utilizarea AFM. În figura 5.

După cum am menţionat. Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de Forţă Atomică Diverse structuri nanometrice. cum ar fi nanotuburi şi nanofire care sunt pe suprafaţa unui eşantion. Trebuie menţionat că AFM-ul poate fi utilizat ca un robot 3D (manipulator 3D) care are spaţiul de lucru la scală nano. Nanomanipularea unor particule de latex cu diametrul de 100 nm. Un exemplu de nanomanipulare a unor particule de aur (nano cuburi) cu diametrul de 100 nm pe o suprafaţă de sticlă se poate vedea în figura 6. implicate în manipularea lor. pot fi manipulate pentru a realiza circuite electrice sau pentru a măsura proprietăţile lor mecanice. sau mai recent. 374 . nanomanipularea poate deveni o operaţie relativ uşor de realizat. Un alt exemplu de nanomaipulare este prezentat în figura 7 a unor particule de latex cu diametrul de 100 nm într-o structură complicată. pattern-ul poate fi realizat manual sau automat. Prin utilizarea AFM-ului ca sistem nanorobotic. Figura 7. Nanomanipularea unor nano cuburi de aur pe o suprafaţă de sticlă. Figura 6.6. prin utilizarea unei interfeţe haptic şi a unei aplicaţii de realitate îmbunătăţită.

este importantă în luarea unei decizii corecte înainte de a apela la acest echipament pentru investigarea unui eşantion. Ambele mecanisme (tunelarea sarcinii. Microscopul de Forţă Atomică are în aceeaşi măsură avantaje şi limite.6 nm) care se repetă. respectiv a avantajelor. Mai mult. Nanomanipularea ADN-ului pe o placă de polycarbonat (aria de scanare este de 5 um). Elucidarea acestor situaţii nu se poate face decât prin experienţe de nanomanipulare a ADN-ului. în ultimul timp. hopping termal) au fost studiate şi verificate indirect experimental. Molecula de AND are un diametru de circa 2. un exemplu este prezentat în figura 8. în literatura de specialitate ADN-ul rămâne pentru moment un subiect neelucidat. 7. În acelaşi timp. Figura 8. cum ar fi realizarea unor circuite electronice (motivată de studierea proprietăţilor electrice). în cazul AFM avem un profil 3D. pentru aplicaţii în nanotehnologie. alte rezultate îl prezintă ca fiind un semiconductor.AFM-ul ca nano robot este extrem de util în nanomaipularea unor celule sau molecule. Aceste molecule cunoscute de mai mult de o jumătate de secol au atras atenţia. Microscopia concurenta SPM (AFM) este SEM (Scanning Electron Microscopy) dar spre deosebire de SEM unde avem o proiecţie 2D sau mai exact o imagine 2D pentru eşantion. Avantajele şi Limitele Microscopiei de Forţă Atomică La fel ca orice alt echipament. iar altele ca un izolator. unele rezultate sugerează că avem un bun conductor (chiar supraconductor la temperaturi joase). Cunoaşterea acestor limite. în special nanomanipularea moleculelor ADN.4 nm şi este în esenţă o structură scurtă (3. eşantionul nu necesită un tratament special (acoperirea cu metal sau carbon) care poate compro375 . După aproximativ 15 ani de controverse relativ la mecanismul de conducţie (transfer de sarcină) este acum bine demonstrată dependenţa de distanţă (tunelarea într-un singur pas sau hopping termic mai mulţi paşi).

Este. mai recent. Hoffmann. cu posibilitatea de scanare simultană a unor arii diferite. AFM cu rata de scanare video. toate acestea la o viteză mult mai mare. această post-filtrare poate elimina unele caracteristici ale eşantionului. de asemenea.Z care necesită refacerea în software a imaginii. eşantionul. distorsionate de efectul de hysteresis al materialului piezoelectric. 3. Aceste limitări au fost eliminate în cazul microscoapelor AFM moderne prin scannere în bucla închisă sau scanner-e ortogonale. Bibliografie 1. "Advances în atomic force microscopy". făcând lipsită de precizie măsurarea unor structuri. S (Nov 2005). Proceedings of the Royal Society a Mathematical Physical and Engineering Sciences 457: 1161. Q (1993). 8. Roiter.mite. Aceste limitări sunt un subiect fierbinte în cercetarea instrumentală din acest domeniu şi câteva succese au fost obţinute prin utilizarea în paralel a mai multor cantilevere sau. "AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: în situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains". G. drift-ul termic poate induce distorsiuni pe imagine. La fel ca şi în orice altă tehnică bazată pe realizarea de imagini este posibilă apariţia de artefacte care pot fi induse de tip-ul instabil sau mediul ambiental impropriu sau chiar de eşantionul studiat. Datorită faptului că timpul de scanare în cazul AFM-ului este mare. bine cunoscută limitarea puternică indusă de existent pe eşantion a unor pereţi drepţi sau şanţuri foarte adânci şi înguste a căror morfologie nu poate fi pusă în evidenţă decât prin utilizarea unor tip-uri speciale şi extrem de scumpe. "Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy". care în cazul SEM este de ordinul milimetrilor.Y. Reviews of Modern Physics 75: 949. precum şi de efectele de mixare între axele X. lucru foarte important pentru eşantioanele biologice. Franz J. asigurând în principiu o rezoluţie mai bună decât SEM. M. de asemenea. 376 . Imaginile obţinute cu AFM pot fi. Peter (2001). "Direct measurement of interatomic force gradients using an ultra-low-amplitude atomic force microscope". Un alt avantaj este posibilitatea de a investiga eşantionul în condiţii ambientale. 4. (2003). Surface Science Letters 290: L688. Giessibl. în unele situaţii. Y. Din păcate. Marele dezavantaj al AFM faţă de SEM se referă la aria scanată. Journal of the American Chemical Society 127 (45): 15688–9 Zhong. Minko. Ahmet Oral. 2. Ralph A. comparabilă cu rezoluţia unui TEM (Transmission Electron Microscopy).

October. D: Appl. "Automatic lateral calibration of tunneling microscope scanners". N. Taiwan. J C Wolfe and B P Craver. Lapshin (1998). J.M. Proceedings of International Symposium on Smart Structures and Microsystems. N. 41 (2008) 024007 (12pp) 7. Ning Xi “Micro/Nano Motion Control for Biological Specimen Handling”. Phys. W. 2003. M. 6. May. Xi. Phys. F. F. Salam. B.5.Y. H. R.Gilgenbach. 2000. 377 . 8. Fung. C. Hummert. Proceedings of the 2001 1st IEEE Conference on Nanotechnology 10. R. "Chemomechanical surface patterning and functionalization of silicon surfaces using an atomic force microscope". 82 (5): 808–810. Wang. Yu. Hong Kong. V. K. Davis et al. Salam. (2003). Ayres. G. Review of Scientific Instruments (USA: AIP) 69 (9): 3268–3276. Phys.Saglik and D. Goolsby. 9. Appl. Proceeding of the 2003 IEEE International Conference on Robotics and Automation. V. “SPM-Based Investigation of Site Specific Biological Interactions”. Xi. K. 3-D nanomanipulation using atomic force microscopy. Li. V. "Neutral particle lithography: a simple solution to charge-related artefacts în ion beam proximity printing". M. Ayres. H. Lett.

...Microscopia de forţă atomică – partea a II-a Conf.............. Dintre acestea.... Bibliografie ................... în microscopia modernă prelevate odată cu informaţia topografică...................378 2...... scattering etc) or fluorescence 200nm – 1mm 500nm – 10 mm 1nm-10 mm 1Å-100μm What is studied Complicated sample preparation optical slice optional 10 nm-1 mm limited by ultratome (10 nm-1 μm) surface real thin slice necessary necessary surface optional 378 ......................................................................................... de regulă... Tehnici Experimentale ............. dr.... Optical microscope Scanning electron microscope Electron scattering Transmission electron microscope Electron absorption Atomic force microscope Forces of probe-sample interaction 1Å-200 μm 0.. Implementarea Noilor Tehnologii..........385 3......... în primul rând merită remarcată informaţia 3D reală a topologiei suprafeţei dublată de măsurarea unor mărimi fizice pe suprafaţă....Scanning Probe Microscopy .......... Bibliografie ................ Tabel 1........393 1.............5Å-20 μm Mechanism of contrast formation Range in XY Range in Z Light absorption (diffraction...............................................................Scanning Probe Microscopy Introducere................. O evaluare obiectivă a tehnicilor microscopice (Tabelul 1) pune în evidenţă elemente de performanţă favorabile pentru SPM (Scanning Probe Microscopy)............................ Tehnici Experimentale .. polarization.............. Ioan Burda Cuprins 1.....................................386 4.

Sistemul optic nu are alt rol decât de a măsura deflexia cantileverului. Consecinţa acestei situaţii se reflectă în performanţa finală a experimentelor în care apelăm la un SPM şi putem spune că în mare măsură performanţa este dependentă de iscusinţa experimentatorului. …). respectiv amplitudinea de oscilaţie sau fază. Merită să reţinem că detectorul este mecanic şi de asemenea. 379 . atmosferă controlată. să reţinem că acest detector mecanic este capabil să pună în evidenţă atomii. SPM-urile moderne pot pune în evidenţă un singur atom. nu de puţine ori. Rezoluţia sistemului este asigurată de sistemul de control (electronic. Digital Anolog Converter DAC) cantilever şi sondă (tip). Scaning Probe Microscope. nu ne putem aştepta să vedem diferite domenii în moleculele de proteină. dar în cazul unor eşantioane biologice (molecule). ne obligă să apelăm la o preparare complexă a eşantioanelor. acest lucru nu este posibil datorită lipsei de rigiditate a acestora.1) de un sistem opto-electronic bazat pe reflexia unui fascicul laser pe cantilever. Performanţa sistemului de control şi achiziţie este esenţială în performanţa finală a SPM-ului. atunci cuvântul „optional” nu sugerează întotdeauna ceva facil.Dacă ne referim la modul de preparare a probelor pentru SPM. respectiv apelarea la instrumente SPM complexe (izolare la vibraţii avansată. În condiţii experimentale adecvate. orice material (de exemplu. Fasciculul este poziţionat în centrul unui foto-detector cu patru cadrane (fotodiodă). Tehnica experimentală la nivel de detecţie a interacţiunii dintre un tip (sondă) şi eşantion se bazează pe un cantilever. Obţinerea unor imagini unice în conţinut si performanţă. un fir de păr) este suficient de potrivit dacă nu are o rugozitate comparabilă cu capacitatea de deplasare a scanner-ului pe direcţia Z (perpendicular pe eşantion). mari schimbări de conformaţie (myosin) sau forme spiralate ale moleculelor DNA. Mărimea specifică de interes într-o situaţie particulară este detectată (Figura 1. subsistem pentru (din construcţie). temperatură scăzută. La o extremă. dar nu poate elimina limitările mecanice Figura 1. Viteza de scanare depinde de caracteristicile mecanice ale scanner-ului şi tot de calităţile mecanice ale acestuia depinde şi aria maximă ce poate fi scanată.1. nici limitădetectia inneractiuni sonda (tip) si esantion. Aşa că.

rile induse de proprietăţile materialelor folosite la construcţia SPM-ului. cu o mai Figura 1. Helicobacter Pilory). respectiv imagine 3D. Informaţiile care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu cu ajutorul unui SPM. sau imagine şi spectroscopie Raman. acestea fiind parte din limitele fizice ale unui SPM. Proteine (Seleno Protein. imagini SNOM. interacţiunile respective latice MoTe2. cum ar fi: AFM plus microscopie laser confocală. Specific şi unic în cazul SPM este capacitatea acestuia de a pune în evidenţă topoFigura 1. imaginea celulelor. Tocmai de aceea. Bacterii (Anabaena Variabils. Această situaţie este produsul unei lungi evoluţii a tehnologiilor de laborator şi asigură maximul de informaţie posibil în acest moment. Tehnologia experimentală actuală se bazează masiv pe conceptul de imagine. Latice HPOG (stanga) grafia moleculară. SPM poate include în platforma sa tehnici optice în special în cazul AFM. o imagine mai bună este echivalentă cu mai multă informaţie. moleculare. reconstrucţia 3D şi nanomanipularea. după cum rezultă din Tabelul 1.2. 380 .3. performanţa unei tehnici experimentale sau a unui echipament modern este complet definită de imaginea obţinută pentru un eşantion dat. în general. nu pot fi considerate complementare cu alte tehnici experimentale. Treponema Pallidum (Tp) antigens). Virus Ebola. DNA (sus).

3). Interacţiunea dintre sondă (tip) şi eşantion. adică toate mărimile fizice istorice se regăsesc în final în calitatea imaginii.2 se poate vedea la rezoluţie atomică o latice de MoTe2.y). dat fiind interesul crescut pentru biologie şi biotehnologii. exemple cu ceea ce poate „vedea” un SPM (Figura 1. este uşor de pus în evidenţă curba forţă– distanţă atunci când o legătură specifică apare.bună calitate. SNOM şi spectroscopiei Raman întregeşte această tehnică modernă. În acest sens. Într-o măsurătoare locală. cu un mai bun raport semnal zgomot. De mare interes sunt imaginile ce pot fi obţinute pe eşantioane biologice. SPM are un rol bine definit prin capacitatea sa unică de a putea asigura o rezoluţie ridicată pentru eşantioane superficial pregătite (Figura 1. cu o mai bună liniaritate în sistemul de măsură. 381 .4. eşantionului. b) între sondă şi suprafaţa Figura 1. într-o poziţie dată (x. SPM-ul a fost primul echipament (STM) care a pus în evidenţă atomii şi acest lucru este posibil fără echipamente complexe pe eşantioane cu rugozitate scăzută (monostrat atomic). Nu exista adesiune (jos). Lărgirea platformei cu elemente specifice microscopiei optice. două situaţii distincte pot fi observate în interacţiunea dintre sondă (tip) şi eşantionul studiat: a) nu există o adeziune la suprafaţa eşantionului. În Figura 1. respectiv HOPG. capacitatea de nanomanipulare simultană a acestor eşantioane asigură premisele unui nano laborator într-un singur echipament. adesiune intre sonda si suprafta esantionului. baza funcţionării SPM-ului.4. După cum se poate vedea în Figura 1. este exploatată şi în spectroscopia locală de distanţă. În acest sens. este pusă în evidenţă o adeziune.3). sunt prezentate în continuare. De asemenea. prin imagini.

În Figura 1. generând astfel un nou şi performant echipament în acest domeniu. avem câteva reguli generale. numai pe baza acestor informaţii topografice. S-a dovedit că receptori independenţi pot fi recunoscuţi de un vârf AFM funcţionalizat cu anticorpi. cum sunt receptorii. proteoglicani.5 este reprezentat schematic un astfel de experiment care printr-o tehnică specifică permite discriminarea unor receptori pe suprafaţa unei celule. se poate imagina un sistem de recunoaştere moleculară. cum ar fi: a) celula este un sistem prea labil pentru a putea observa o singură proteină pe suprafaţa ei. este cel mai recent echipament şi singurul 382 . tuia. Cu toate acestea. depind în mod esenţial de experienţa utilizatorului. Platforma Integrată pentru Nanotehnologii combină toate tehnologiile cunoscute în Scanning Probe Microscopy (SPM) într-un singur produs. în final. are multe elemente particulare care. b) acest lucru este dificil şi în cazul unei topologii moleculare. Discriminarea unor receptori pe suprafaţa unei perspectiva utilizării acescelule. Toate aceste rezultate au fost obţinute prin observarea unor probe corespunzător preparate pe suprafeţe substrat şi nu în condiţii fiziologice. printr-o tehnică de cartare a forţei. Tehnica sondă-ligant şi analiza unei situaţii particulare prin intermediul curbelor locale forţă – distanţă sunt de mare folos în diferite experimente de recunoaştere a proteinelor. sonda funcţionalizată (molecula ligant) interacţionează cu un eşantion biologic special preparat. tehnica funcţionalizării cu anumite biomolecule (proteine.5. Deoarece interacţiunea dintre liganzi şi receptori este foarte specifică.Bazat pe observaţia anterioară. fiecare experiment în care este implicat SPM – ul. glicani. din Figura 1. acizi nucleici) a unui vârf AFM a deschis o cale promiţătoare pentru recunoaşterea unor molecule particulare. Sistemul NTegra produs de NT-MDT Inc. În general. Sunt încă dificil de recunoscut proteine specifice. plecând de la tăria adeziunii pentru o situaţie dată. Progresele recente privind rezoluţia spaţială a tehnologiei AFM au făcut din obţinerea unor imagini topografice a unei singure proteine o operaţiune de rutină.

chiar dacă sistemul este foarte complex. Rezultatul acestui concept permite reconfigurarea sistemului pentru orice aplicaţie particulară (Figura 1. doar prin program (mouse . trebuie menţionate metodele avansate de litografie disponibiFigura 1. in microscopul optic.7. astfel încât.7). current).click). Sistemul NTegra se prezintă utilizatorului ca fiind o soluţie completă pentru cercetare. Ntegra. inclusiv procesarea de imagine 3D. Laboratorul de Nanotehnologii Fizice are în dotare un sistem NTegra Vita care integrează două microscoape optice performante. de la achiziţia de imagine la arhivarea acesteia. Subsitem scanner integrat le (scratching. Sistemul NTegra (Figura 1. acesta este uşor de înţeles şi utilizat.pe plan mondial care poate fi încadrat în conceptul de NanoLaborator. Aproape toate setările sistemului sunt controlate de programul NOVA.6. Programul NOVA (NT-MDT) controlează întreaga platformă. Acest concept este sugerat şi prin numele echipamentului format din grupul de litere cheie NT care sunt prescurtarea de la NanoTechnology şi un al doilea grup de litere cheie care sunt prescurtarea de la intEGRA. 383 . care înseamnă perfect. îmbiFigura 1. Nu în ultimul rând. În acest moment. Programul de aplicaţie înglobează lunga experienţă NT-MDT Inc.6) a fost special proiectat pentru a permite înglobarea unor tehnici de analiză ştiinţifică (spectroscopie si/sau prepararea probelor) pe lângă cele specifice SPM. în producerea de echipamente şi programe pentru nanotehnologii. Toate sistemele integrate în platforma NTegra utilizează acelaşi suport electronic şi acelaşi program. cu posibilitatea schimbării acestuia pe durata măsurătorilor).Vita. măsurarea caracteristicilor probei şi generarea automată de rapoarte. pentru litografie. industrie şi nanotehnologie. Sitemul nând simplitatea utilizării cu facilităţile oferite. un sistem SPM şi un controler de temperatură pentru măsurarea probelor biologice în aer sau lichid (inclusiv în mediul de cultură.

Electrostatic Force Microscopy. Lithography: AFM (current). cât şi unele performanţe ale sistemului NTegra Vita sunt enumerate in Tabelul 2. procesare imagine şi generare de rapoarte. sau între experimente. prin Vbscript. realizarea unor extensii sau automatizarea unor secvenţe de genul măsurare. 384 . semi-contact. Metodele de bază SPM. 15 mm in height by probe by sample up to 14x14x2.005˚ C (typically). programul poate fi extins pentru orice aplicaţie utilizator fără a fi nevoie de cunoştinţe de programare avansată. Kelvin Probe Microscopy. utilizăm intensiv facilitatea open software a programului NOVA care permite. STM by sample Φ 40 mm.0. facilităţi de generare automată de imagini sau mai mult.programul NOVA are aplicaţii. Ntegra Vita are facilitaţi de excepţie pentru investigarea de probe biologice cum ar fi: incinte închise/deschise stabile chimic care pot opera cu discuri Petri. non-contact). Force Modulation.0. LFM (Lateral Force Microscopy). pot fi preluate imagini „gray level” şi transpuse pe suprafaţa de investigat. Tabel 2 SPM methods in air and liquid AFM(contact. AFI(Adhesion Force Imaging). Phase Imaging. controlul temperaturii pentru lichide.01 ˚ C in air only Sample size in air in liquid Scan Range Temperature control (for operation in fluid environment ) Range Stability O pagină help bine documentată cu descrierea funcţiilor de bază şi câteva exemple de utilizare asigură accesul utilizatorului la semnale de bază din sistem. diverse tipuri de încălzitoare pentru lichid şi măsurarea probelor biologice cu schimbarea lichidului cu flux controlat pe parcursul experimentului. 15 mm in height and Φ 100mm . În proiectele noastre. AFM Lithography (scratching). Scanning Capacitance Microscopy. Spreading Resistance Imaging. În acest fel. <= +/. Forces-Distance Curves STM/MFM (Magnetic Force Microscopy).5 mm and by probe up to 15x15x3 mm 100x100x10 μm up to 200x200x20 μm in DualScan mode from RT to 60˚ C +/.

1995. 18. Pan H. Surf Interface Anal. Chem Phys Chem. 193-196. 127-138. Molecular self-assembly and nanomanipulation . 78-92. Yan SH. 129. Anselmetti D.2. 124-126. Bibliografie 1. 377-405. Nanomanipulation by atomic force microscopy. Strick TR. 2006. A combined atomic force/fluorescence microscopy technique to select apatamers in a single cycle from a small pool of random oligonucleotides. 1994. 1173-1175. Hards A. 14. Heckl WM. Stephens BJ. Nature. 451. Mavroidis C. Polak JM. Guthold M. Single-molecule cut-and-paste surface assembly. Inc. Positioning scission of single DNA molecules with nonspecific endonuclease based on nanomanipulation. 2005. An H. Gao HB. 2008. Wang Y. Lu JH. 998-1004. J Mater Chem. present. 12. Winfree E. proliferation. and PCR amplification of single DNA molecules. 9. Virtual reality and haptics for nanorobotics. Hu J. Golden handshake. Science. 528-529. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. J Am Chem Soc. Hu J.Eur J Physiol. Kufer SK. 2008. Hoboken. Surf Interface Anal. Gaub HE. 17. 11. Popescu O. Hench LL. Bonin K. 7. 1998. Cai Y.two key technologies in nanoscience and templating. Hu Q. 2004. 38. Nature. Adv Eng Mater. 2002. 237-245. Ann Rev Biophys Biomol Struct. Ferreira A. 2006. 2005. Manipulation. 69. Gang O. Simultaneous AFM manipulation and fluorescence imaging of single DNA strands. IEEE Robot Autom Mag. 70. Li MQ. 21. Liu F. Effect of crystallinity of calcium phosphate nanoparticles on adhesion. Zhang Y. 20. 385 . dissection. Hu J. Bionanotechnology: lessons from nature. Revyakin A. 2004. Molecular nanomachines: physical principles and implementation strategies. Zumbusch A. Peng L. Ebright RH. Nanodissection. 6. Li H. Dammer U. Wiley-Liss. and lithography using modified tapping mode atomic force microscope. 2004. Cubicciotti R. 843-847. Lu J. 2. 1014-1017. Hinterdorfer P. Bishop AE. Recent progress in AFM molecular recognition studies. Song Y. 4690-4698. Wagner P. Seitz M. Heckl WM. 6668-6669. Drexler KE. Tang R. Misevic GN. Li MQ. Single-molecule DNA nanomanipulation: Improved resolution through use of shorter DNA fragments. Li X. 13. Li Z. Dufrene YF. Pflugers Arch . 1068. 456.. Microsc Res Tech. Guntherodt HJ. 19. Nanomanipulation of single DNA molecules and its applications. Zhang Y. 2007. Microsc Res Tech. Li B. Nykypanchuk D. Wenzler LA. 2005. 2. 16. 5. isolation. 534-540. and future. Brauchle C. Wang L. Hartmann U. 2008. Zhang M. 594-596. Third-generation biomedical materials. 23. Adv Eng Mater. Gumpp H. Maye MM. 394. Zhang Y. New Jersey. 2007. Sun L. Liu Y. 8. and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Crocker JC. Ye M. Nat Methods. 267. Science. 13. Puchner EM. Rubio-Sierra FJ. 2007. 549-552. 3. van der Lelie D. Zhou C. Science. Li B. 36. Seeman NC. Liedl T. Xu X. DNA-guided crystallization of colloidal nanoparticles. 17. Stem cells and tissue engineering: past. Wei G. 4. 6. Stark RW. Polak JM. 10. Ann NY Acad Sci. Goodsell DS. Nature. 6. 539-544. 451. 2006. 319. Li M. 7. Liu Z. 1010-1013. Tan Z. 295. 2008. Tao J. Binding strength between cell adhesion proteoglycans measured by atomic force microscopy. 352–366. 372-381. 15. 2006.

O problemă majoră legată de sistemul tactil uman constă în faptul că nu este foarte bine cunoscut. privim comportamentul lucrurilor care se mişcă sau se schimbă. biomecanicii şi elemente neurologice ale percepţiei haptice. utilizatorul primeşte informaţii despre forţe sau coliziuni ale mâinilor sale. Nevoia unei interacţiuni om-maşină naturale. urmată de încorporarea acestor cunoştinţe în ingineria interfeţelor haptice. privim către lucruri din diverse unghiuri. putem lua lucrurile pentru a le rearanja şi putem interacţiona cu acestea pentru a vedea răspunsul lor. simţim lucruri interesante cu ajutorul mâinilor. Această metodă va asigura cercetătorului posibilitatea de a se concentra pe investigarea suprafeţei şi proprietarilor asociate şi nu asupra programării unei interfeţe. Când noi suntem prezenţi undeva. Sistemul de control va translata mişcarea uneltei în mişcarea sondei SPM-ului şi va translata parametrii măsuraţi ai suprafeţei sub forma unei forţe aplicate uneltei simultan cu informaţii vizuale şi/sau audio despre parametrii suprafeţei. noi vom avea mult de învăţat despre lumea la scală 386 . Deoarece cercetările iniţiale au fost promiţătoare. Aceste dispozitive bazate pe interfaţa haptica prezintă o mare oportunitate în dezvoltarea unor aplicaţii generic asistative care să permită manipularea nano-obiectelor precum şi imersia totală în realitatea virtuală a utilizatorului. privim în jurul nostru. pentru a crea acestuia o percepţie naturală. acestea au generat o adevărata competiţie în încercarea de a dezvolta o interfaţă haptică naturală. Mişcarea naturală a capului sau mâinilor poate fi utilizată pentru a investiga şi modifica suprafaţa care este afişata la scala cercetătorului. Când este utilizat un astfel de sistem. Aceste maşini sunt denumite interfeţe haptice. În viitorul apropiat. Implementarea Noilor Tehnologii Introducere. În acelaşi timp. Motivare. intuitive şi a unui feedback senzorial multi-modal a determinat proiectarea unor maşini care asigură utilizatorului generarea unor comenzi prin mişcarea mâinilor. unde prin haptic înţelegem ştiinţa pipăitului. cercetătorul percepe că poate interacţiona direct cu suprafaţa de investigat. Interfaţa ideală dintre om şi SPM trebuie să prezinte utilizatorului suprafaţa investigată ca o reprezentare 3D mărită pe care să o poată pipăi şi care să poată fi modificată cu ajutorul unor unelte controlate de mână. vorbirea sau sistemul motor. Dezvoltarea unor interfeţe şi dispozitive haptice moderne necesită studii extensive pentru a înţelege legătura dintre fenomenele perceptuale şi măsurătorile biologice. spre deosebire de alte modalităţi de interacţiune: percepţia vizuală. Studiul abilitaţilor tactile umane este o încercare recentă şi multe din sistemele disponibile astăzi nu incorporează cunoştinţe din domeniile psihofizicii.3.

Semnificaţia interfeţei de realitate virtuală a SPM-ului este aceea de a simula prezenţa cercetătorului pe suprafaţa de investigat. Beneficiile unei asemenea tehnologii sunt: 387 . Scopul unei interfeţe SPIDAR este de a asigura cercetătorului imersia virtuală în lumea la scală nano. precum şi un control natural al funcţiilor acestuia. Prin combinarea unui SPM cu o interfaţă de realitate virtuală asigurăm o afişare intuitivă a datelor produse de instrument. Figura 3.nano. Interfaţa SPIDAR. Nanomanipularea dă o semnificaţie aparte acestor probleme. Sistemul de Nanomanipulare. oferindu-ne posibilitatea de a investiga individual nano-obiecte cu facilitaţi de excepţie obţinute prin combinarea caracteristicilor unor proprietăţi fizice cu informaţiile structurale.1) cu feedback de forţă împreună cu controller-ul şi o reţea de calculatoare PC cu facilităţi grafice avansate. Figura 3. Acest cluster local format din cel puţin trei calculatoare comunică printr-o reţea IP. inclusiv despre modul cum proprietăţile mecanice. precum şi legat de interfaţa cu obiectele la scală nano. oferind cercetătorului posibilitatea de a fi virtual în dimensiune nano.1. transportul de sarcină şi dinamica acestor proprietăţi sunt afectate de structura la scală atomică a nano-obiectelor. un dispozitiv SPIDAR (Space Interface Devices for Artificial Reality. Interfaţa utilizator avansată va juca un rol crucial prin modul transparent de a experimenta la scală nano. Nanomanipulatorul este obţinut prin integrarea unui microscop de scanare a probei împreună cu controller-ul.

Microscopul de scanare a probei (SPM) este un instrument extrem de rafinat pentru explorarea şi manipularea la scală nanometrică. Câţiva dintre aceşti parametri sunt reprezentaţi natural pe canalele vizuale ca informaţie de culoare sau înălţime. urmat de un feedback al parametrilor pe durata modificărilor şi utilizând pseudo-culori sau imagini ale liniilor. proprietăţi magnetice (MFM – magnetic force microscopy). Acestea includ măsurători de conductanţă şi măsurarea de curbe curent/distanţă (STM). Pentru vizualizarea ştiinţifică. dar această afişare nu permite cercetătorului să vadă corelarea dintre aceste informaţii şi topografia suprafeţei. într-un mod nerealist. SPM-ul poate colecta multe alte date despre parametrii fizici specifici eşantionului. pe măsura ce se colectează datele. Pe lângă datele despre topografia suprafeţei. utilitatea unei tehnici este mult mai importantă decât realismul. c) abilitatea de a observa procese dinamice aproape în timp real d) şi posibilitatea de a modifica interactiv suprafaţa. Multe experimente au fost realizate prin controlul preprogramat sau în buclă deschisă a probei SPM-ului. 388 .a) îmbunătăţirea percepţiei structurilor 3D. b) explorarea efectivă a suprafeţei de investigat. dar într-o manieră utilă.1. forţe laterale şi de adeziune (AFM). În acest caz. este util să afişăm aceşti parametri într-un spaţiu virtual. transmisia laser a diverse lungimi de undă şi polarizări (NFOM – near field optical microscopy). temperatură sau alţi parametri fizici. Figura 3. Interfaţa SPIDAR.

389 . pe măsură ce datele sunt achiziţionate de SPM.2. Au fost studiate şi dezvoltate câteva moduri de vizualizare a unor seturi de date. setul de date pentru o abordare prin interfaţa SPIDAR este de fapt topografia suprafeţei (Figura 3. În această etapă tehnologică. efectiv o vedere cu raze X utilizatorului. unghiul de vizualizare şi scalarea. prin combinarea unui rendering grafic computerizat cu elementele ascunse. O procesare de imagine 3D utilizează un mixaj de imagini într-un head-mounted display (HMD). Interfaţa SPIDAR in timpul unei operaţii de nano-manipulare. ca un exemplu a consideraţiilor implicate. tehnologie bine cunoscută în câteva aplicaţii de avionică. introduce conceptul de realitate îmbunătăţită. Implementarea unei componente de vedere cu raze X la programul nanomanipulatorului SPM. Acest concept generează noi aplicaţii în nanomanipulare şi asigură. Se poate asigura interacţiunea în timp real cu parametrii de vizualizare cum ar fi direcţia iluminării.Sistemul Multimodal. a feedback-ului de forţă. Utilizând procesarea de imagine 3D. este acum posibil să creăm un rendering în timp real al suprafeţei. O afişare naturală a unui set de date 3D este posibilă prin iluminarea direcţionată a suprafeţei.2). Figura 3. Într-un caz simplu. pe timpul unor situaţii complexe. A fost revăzută problema relativ simplă a rendering-ului 3D pentru o suprafaţă. prin interfaţa haptică. acest concept este foarte elegant în simplitatea sa şi foarte util pentru o unitate de nanomanipulare.

Folosirea umbrelor este echivalentă cu desenarea suprafeţei. din păcate. netezite micile fluctuaţii cauzate de zgomotul conţinut în imaginea suprafeţei. utilizând numai o lumină ambientală cu intensitatea funcţie de înălţime. imaginile pseudo-colorate au dedicat întreg domeniul de intensităţi pentru a evidenţia aceste diferenţe. o suprafaţă plată are un mare conţinut de zgomot şi acesta este exprimat ca o fracţie. Conceptual. de regulă o vedere prin pseudo-culoare este superioară unei vizualizări 3D prin umbre. micile caracteristici de pe suprafaţă conţinute în alte mari variaţii sunt mai bine puse în evidenţă prin utilizarea unei hărţi de culoare şi iluminarea puternică a suprafeţei 3D (acestea ar fi imperceptibile într-o reprezentare 2D). Este neaşteptat să ne imaginăm că putem acum oferi posibilitatea cercetătorului nu numai de a vedea nano suprafeţe cu ajutorul SPM. Acest lucru este adevărat din două considerente: pseudo-colorarea dedică întreg domeniul de intensitate adâncimii şi sunt. dar imaginile din lumea reală conţin întotdeauna zgomot. acest sistem este echivalent cu un sistem tele-robotic care operează între două scale foarte diferite. Poziţia o-ring-ului în spaţiu poate controla diferite caracteristici afişate. Pentru imaginile SPM. spre deosebire de sistemele tele-robot utilizate în chirurgie. uneori reuşind.Vizualizarea 3D nu este întotdeauna cea mai bună soluţie pentru suprafeţe cu mici denivelări. cum ar fi controlul unghiului de vizualizare a suprafeţei. grafica 3D bazată pe umbre cu hărţi de culoare iluminate puternic. dar să şi acţioneze asupra lor şi să le atingă. Asigurând afişarea stereoscopică şi nu cea monoscopică. Acest zgomot va determina o fluctuaţie a iluminării caracteristicilor cu aceeaşi magnitudine. un feedback de forţă asigură un control intuitiv al probei şi permite sesizarea contururilor de pe suprafaţă. de asemenea. Percepţia spaţială 3D a datelor SPM cu acurateţe face posibilă pentru cercetător utilizarea cunoştinţelor sale ştiinţifice la recunoaşterea unor structuri şi caracteristici de interes. din caracteristicile imaginii. Această tehnologie poate lucra bine pentru imagini lipsite de zgomot. Noi utilizăm o interfaţă haptică cu feedback de forţă care sesizează poziţia 3D a o-ring-ului SPIDAR (cu capabilităţi adiţionale pentru a sesiza 3DOF – grade de libertate) şi aplică forţele de la nivel nano adecvat scalate în mâna utilizatorului. De asemenea. pe perioada modificărilor suprafeţei. Această abilitate 390 . pentru cercetător este mai uşor să perceapă adâncimea obiectelor virtuale apropiate. Abilitatea cercetătorului de a recunoaşte structuri moleculare specifice în prezenţa zgomotului este îmbunătăţită prin vedere stereoscopică. Pentru caracteristicile care sunt semnificative numai prin diferenţa mare de înălţime faţă de suprafaţa imaginii. De asemenea. să le facă neobservabile.

Un sistem automat cu abilitatea de a face o predicţie despre cum simţim obiectele de tipul celor reprezentate prin valori ale pixelilor are multiple aplicaţii în generarea automată a datelor haptice. noi putem face o predicţie despre caracteristicile lui tactile cu o acurateţe rezonabilă. De exemplu. Acest fişier poate fi redat mai târziu pentru a revedea întregul experiment. numai dacă privim un obiect. Percepţia Multimodală şi Intermodală. Utilizatorului ii este extrem de util să revadă experimentul pentru a vedea ce decizii a luat pe parcursul desfăşurării acestuia (analiza post-expriment). o limitare majoră a percepţiei tactile este dată de dimensiunea kinesferei. Studiile efectuate pe persoane nevăzătoare arată că au abilitaţi eficiente în câteva activităţi spaţiale. recunoaşterea obiectelor şi descrierea acestora. în special în discriminarea texturilor.3) este extrem de importantă în activităţile zilnice cum ar fi conducerea maşinilor. Feedback-ul de forţă este esenţial în găsirea structurilor ce urmează a fi modificate. navigaţia şi aşa mai departe. fedback-ul de forţă asigură utilizatorului posibilitatea de a localiza obiecte şi caracteristici ale suprafeţei. iar cercetările psihologice au arătat că aceste modele nu sunt adaptate pentru percepţia de stimuli la distanţă. În al doilea rând. sistemul de nanomanipulare înregistrează toate datele. corelarea dintre văz . inclusiv corelarea cu proprietăţile măsurate cu o up-datare a imaginilor structurii. persoanele nevăzătoare construiesc modele intercorelate între canalul auditiv şi cel haptic. auz şi senzaţiile tactile determină redundanta în reprezentarea spaţială care asigură fiecăruia dintre noi utilizarea transferului intermodal şi coordonarea mecanică pentru activităţile spaţiale. O abilitate deosebită a oamenilor este aceea de a dezvolta capabilităţi de coordonare intermodală şi de procesare a modelelor. discriminarea formelor. Un astfel de sistem poate fi de exemplu unul care construieşte nano-blocuri şi un dispozitiv care asistă cercetătorul şi asigură generarea de date haptice despre nano-mediul apropiat. Cu toate acestea. Vederea asigură fiecăruia abilitatea de a plănui şi executa activităţi spaţiale (zonă cunoscută ca fiind kinesferă). 391 . în descrierea acestora.asigură controlul precis al suprafeţei şi deschide calea unor noi experimente. aşa cum avem în cazul văzului. În final. Abilitatea de a sesiza şi percepe obiecte dincolo de zona accesibilă (Figura 3. Mai mult. cum ar fi conductanţa cu secvenţa de timp pe care o numim fişier stream. incluzând topografia suprafeţei şi canalele externe. De asemenea. găsirea traseului pentru modificare şi asigurarea unei atingeri fine care să permită începerea unui ciclu experimental în secvenţa scanare-modificare-scanare. descrierea formelor. simţind când proba SPM se apropie de punctul de la care sunt posibile modificările.

Explorarea haptică a nano-obiectelor se referă în esenţă la mişcarea mâinii.Figura 3. în faza de antrenament. Nevoia de noi experimente şi dezvoltarea de algoritmi care pot îmbunătăţi percepţia în lumea de scală nano prin stimulare în timp real vizual. audio şi haptic este un domeniu fascinant de cercetare. utilizatorul urmează să categorisească perceptual forma. Aceste modele computaţionale sunt dezvoltate pe baza modelelor neuropsihologice şi cognitiv psihologice ale analizei caracteristicilor vizual-haptice. dimensiunea. Captura vizuală SPM poate fi ajutată prin stocarea profilului haptic sau de atingere al unui obiect sub forma miscărilor mâinii. Gesturile utilizate de cercetător pentru a percepe caracteristicile unui nano-obiect au o structură logică şi asigură înţelegerea caracteristicilor unui nano-obiect. textura şi materialul nano-obiectului haptic. greutatea. Odată ce un obiect a fost capturat vizual. Modelele computaţionale sunt dezvoltate la nivelul tehnologic actual ca şi prototipuri vizual-haptice. Feedback-ul de forţă capturează procese din SPM şi acest lucru este denumit în literatura „explorare haptică a nano-obiectelor”. Aceste prototipuri stocate într-o bază de obiecte haptice împreună cu strategiile de explorare haptic 392 . utilizată de cercetător pentru a percepe un nano-obiect.3. Interfata SPIDAR in timpul unei operatii de recunoastere haptica a unei structuri create anterior prin nano-manipulare. Aceste structuri de date care stochează atât caracteristicile vizuale cât şi pe cele haptice ale obiectului sunt baza dezvoltării unor cartografieri automate dintre diferite caracteristici vizuale şi haptice.

Jean-Marc Victor.. Sled-Type Motion on the Nanometer Scale: Determination of Dissipation and Cohesive Energies of C60. Microanal. and Superfine. Terence R Strick. Nature Structural & Molecular Biology 13. Meyer.. 1998. 2. Ullrich Pietsch. Washburn. 66136616..1981.. and Guntherodt.. 444 .. 4. Gaudeline Wagner. Falvo.450 (01 May 2006). A. 1999.. Resch. Jean-François Allemand. R. fiind suportul oferit de tehnologia actuală pentru viitoare aplicaţii în nano-robotică. W. Peter Karageorgiev. P. Baur. pp. Structural plasticity of single chromatin fibers revealed by torsional manipulation.. Tubular Graphite Cones. S. R.. 699 . Taylorr II. H. Xin Jiang. From anisotropic photo-fluidity towards nanomanipulation in the optical near-field.. a Scrunching Machine. Richard H Ebright. S. Guangyu Zhang.. and Superfine. A. A.. 8. Science 17 November 2006 314: 1097-1098. R. E. Taylor II. H. R. Ludwig Brehmer. Natalia Conde e Silva. Roberts. 7. Nalwa. B.. Building and manipulating three-dimensional and linked two. Helser..138 (01 Feb 2005). M. Luthi. A. Microsc. S. Howald. Jean-Louis Viovy. Burkhard Stiller. Paulson. M. Maria Barbi.dimensional structures of nanoparticles using scanning force microscopy. C. in Handbook of Nanostructured Materials and Nanotechnology. Aurélien Bancaud.. 3.. 6. Michael Giersig.. 393 . Nature Materials 4. Koel. Madhukar. E. Dieter Neher. and Will. J. Requicha. A. Bugacov.. P. 1994. S. Jeffrey W. New York.. 271-308. Christophe Lavelle. R.. Andrey Revyakin. Vincent Croquette. R. and Enge Wang. Academic Press. Nanomanipulation experiments exploring frictional and mechanical properties of carbon nanotubes.. BIOCHEMISTRY: RNA Polymerase. Chi. 4. V. Burkhard Schulz. 9.. Clary. 4. Science 266 (December 23). L. Julien Mozziconacci. Brooks Jr. H. G.asigură baza de date pentru nano-spaţiu.703 (01 Sep 2005). Haefke. Bibliografie 1. 5. 504-512. 1998. Science 18 April 2003 300: 472-474. Nature Methods 2. Langmuir 14 (23). 127 . 1979 . G. Single-molecule DNA nanomanipulation: Improved resolution through use of shorter DNA fragments. Advanced Interfaces to Scanning Probe Microscopes.. F.. M. Ariel Prunell. Gutmannsbauer.

Concepte de bază .................. Componente .............3............... 412 1...........1.......... Spectroscopia fotoelectronică cu radiaţie UV (UPS) ......... Sistemul de lentile ......3........ 395 1....... Principiu de funcţionare...... Multiplicarea Electronică ............................................ Mecanismul de tăiere a orbitei ..........2............................................ Răcirea cu apă ...................................... 423 394 . 417 2..... Coerenţa între şi pas ................................................... 417 2...... Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M) ......2... 417 2............................... 395 2.............................................2.................................................................................................................. 405 1.................. Informaţii generale în legătură cu sursa XR 50 M ..... dr................................ Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS .....2...... SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X (XPS) ŞI ULTRAVIOLETE (UPS) Spectroscopia fotoelectronică C........................... 402 1...................................................................... Caracteristici generale ..................5.. 422 3............2..............4............................................... Monocromatorul ................................................................................1...........2.....III.......................................S...... 398 3.......1...........................................................5...................... Spectroscopia fotoelectronică de raze X .................... 402 1... 415 2....................................2......................................................................................3.....2............... Maria Teodora Radu Cuprins I.......................... Spectrele UPS şi energia de rezoluţie .......2........... 416 2................................ 414 1............ 421 2....... 410 1.2................ Descrierea sursei ............2.... Detector Multicanal MCD ............ 422 4........................... Caracteristici generale ................1...... Descrierea Analizorului .................................................................................2................. Bibliografie ............................................. 401 1....... 396 2.... Analiza de suprafaţă ........................ 421 2......2....... Informaţii generale ........1...XI........... 397 2..1........................................1................ Modul de focalizare...................................2.................... Principiile Detecţiei ....2........................................ 412 1............. 400 II......... 414 1...........2......................... Analizorul Emisferic (HSA) ................1..3. Flood-Gun 15/40 .................................................. 422 3......... 422 3...........................2.......2............................ 416 2........................ 402 1..................2............5............................. Generarea fotonilor de raze X ....1............. Izolarea Magnetică ...........3..... Design-ul şi principiul de funcţionare al spectrometrului de electroni ..................5................ 415 1....2..........................................................................................................1.........

6 eV) sau magneziul (Mg Kα1. Această separare se bazează în principal pe cele două tipuri diferite de sursă de excitare cvazi-monocromatică disponibile în laboratoarele de cercetare şi anume: spectrul liniei UV a lampei de descărcare pentru energii în domeniul de aproximativ 10-50 e.2: 1486. folosirea unui monocromator suplimentar poate fi un avantaj atât pentru energia de rezoluţie cât mai ales pentru suprimarea background-ului şi a intensităţilor sateliţilor care pot să apară în spectru. Deşi lărgimea liniei este de obicei suficient de mică pentru multe aplicaţii.I. la energii de legătură mai mari. pentru că proprietăţile fotoelectronilor emişi reflectă în principal stările electronice proprii ale sistemului investigat.2:1253. câţiva meV pentru lampa de descărcare şi aprox. 1 eV pentru anozii sursei de raze X. Electronii cu energia de legătura EB pot fi excitaţi deasupra nivelului E de către fotoni cu energia hν > EB + Φ0.1 Această figură simplificată arată atractivitatea spectroscopiei de fotoemisie. Mai mult.82 eV) şi liniile ceraracteristice ale unei surse de raze X care utilizează de obicei ca materiale pentru anod aluminiul (Al . cu gaze rare ca heliu (He I: 21. de ex. suprapunerea dintre rezultatele experimentele de spectroscopie de fotoemisie şi teorie este necesară pentru investigarea a numeroase proprietăţi a stării solide. Principiul fundamental al procesului de fotoemisie este prezentat schematic în fig. are pe scară largă implicaţii practice în diferite domenii ca de exemplu fizica şi chimia suprafeţelor sau ştiinţa materialelor.Kα1. În general. Analiza de suprafaţă Spectroscopia fotoelectronică a fost stabilită ca una din cele mai importante metode de studiu a structurii electronice a moleculelor. În principiu se poate face distincţie între fotoemisia cu radiaţie în ultraviolet (UPS) utilizată în principal pentru investigaţii ale stărilor din benzile de valentă şi spectroscopia de fotoemisie cu raze X (XPS) care permite identificarea atomilor la suprafaţa solidelor şi determinarea deplasărilor în energiile de legătură ale core-level-urilor care sunt legate de diferite moduri de legături chimice. şi a contribuit semnificativ la înţelegerea principiilor fundamentale din fizica corpului solid [1-5]. Distribuţia fotoelectronilor I(Ekin) poate fi măsurată de analizor şi reprezintă în prima aproximaţie o imagine a densităţii stărilor electronice ocupate N(EB) în proba analizată.6 eV).23 eV si He II: 40. Concepte de bază 1. inclusiv dispersia benzii de valenţă magnetismul 395 . solidelor şi suprafeţelor [1-2].V.

În acest context. gap-ul supraconductor al unui supraconductor conven396 .Figura 1. 2.d. Mai mult. Investigarea experimentală a acestor proprietăţi necesită o energie de rezoluţie de ordinul meV. Spectroscopia fotoelectronică cu radiaţie UV (UPS) Această tehnică este folosită pentru a studia nivelele de energie din banda de valenţă şi legăturile chimice corespunzătoare. În prezent. Prezentare schematică a procesului de fotoemisie în modelul uni-particulă. De asemenea.v. tehnic în domeniul spectrometrelor de înaltă rezoluţie. UPS joacă un rol important în obţinerea structurii benzii de valenţă a unui număr mare de solide şi suprafeţe. trebuie menţionate câteva exemple pentru caracteristici “many-body” ce pot fi puse în evidenţă pe scala meV în spectrele de fotoemisie UPS a sistemelor solide: (111) stări de suprafaţă de tip Shockley pentru Cu(1 1 1) [7-8]. şi suprafaţa Fermi. în cazul chemosorbţiei metoda ne permite studierea nivelelor electronice de energie derivate din orbitali moleculari ai sistemului substrat absorbit. Metoda a fost dezvoltată iniţial în 1962 de David W. în ultimii ani s-au efectuat îmbunătăţiri remarcabile d. aproape la fel ca difracţia de neutroni.p. furnizând informaţii despre dispersia fononilor în solide. Turner pentru studierea moleculelor în faza gazoasă[6] şi ulterior dezvoltată până la nivelul actual.

1. unde (4) I. În prima aproximaţie unghiul solid rezultă din zona iluminată a probei şi distanţa dintre capilar şi probă: Ω= π + r2 d2 (2 ) (3 ) R= d (1 − 2d*cr ) R .distanţa de la capilar la probă (aprox 40 mm). unde (1) Φ. Iph .fluxul fotonilor (sec-1). 2.densitatea fotonilor (sec-1sr-1). η . Figura 2.curentul fotonic pe probă. dc .raza ariei excitate din proba. Schema pentru aproximaţia unghiului solid Fluxul de fotoni poate fi calculat folosind formula: Φ= 1 e*r . d . Ω.diametrul capilarului (1.unghiul solid (sr-1).ţional (V3Si). Caracteristici generale Fluxul fotonilor emişi de sursa de-a lungul axei optice poate fi determinat utilizând formula Φ = I ph * Ω .randamentul total de electroni 397 . (CeCu2Si2) [10-11].3 mm). [9] şi rezonanţă Kondo în sistemele cu fermioni grei. Aceste exemple sunt reprezentative pentru înţelegerea unor probleme mult mai complexe în fizica stării solide cum ar fi supraconductivitatea de temperatură înaltă (HTSC) şi compuşii cu fermioni grei.

Determinarea funcţiei de lucru. Figura 3.2. forma şi structura lor. cu UPS 398 . în plus faţă de XPS. sau< 12 eV energie a fotonilor) spectrele fotoelectronilor UV excitaţi. densitatea fotonilor este calculată ca fiind: Iph= 8. Φ. Descărcarea VUV acoperă un interval de energie al fotonilor de la 10 la 50 eV. depind puternic de energia fotonilor excitanţi. În intervalul VUV de energii joase (<20 ev. Lăţimea liniei de excitare. 0. este în general de câţiva meV de aceea monocromatizarea suplimentară nu este necesară în cele mai multe cazuri.Din (1) si (4) rezultă: ⎛ d ⎞ 2 ⎟ I ph = I * ⎜ ⎜ 1 − dc ⎟ / e *π * r *η ⎝ 2*r ⎠ 2 (5) Pentru o arie iluminată a probei de aprox.01 eV) ceea ce permite rezolvarea structurilor vibraţionale moleculare. Datorită caracterului cvasimonocromatic al liniilor de excitare se poate obţine energie de rezoluţie înaltă (aprox. şi folosite pentru determinarea unor informaţii specifice suplimentare în analiza de suprafaţă.22 mm diametru şi un curent pe proba de 55 nA. Dacă energia fotonilor este 40 eV structurile d-like sunt generate cu o probabilitate de excitare mare. Pentru energiile fotonilor VUV în intervalul 20 . Spectrele UPS şi energia de rezoluţie Sursa UV de tipul UVS 10/35 este în principal utilizată pentru studiul densităţii de stări a electronilor de valentă.3 * 1015 fotoni sr-1sec-1 2. 2. De aceea.40 eV structurile electronilor de valenţă s-like sunt suprimate în comparaţie cu orbitalii p-like. spectrele UV ale fotoelectronilor exciţi pot fi comparate cu rezultatele teoretice obţinute din calculul structurilor de benzi.

pentru energia de legătură şi energia cinetică avem: EB= 0 Emax= h * ν – Φ. Determinarea funcţiei de lucru.Φ) (7 ) unde. Pentru un electron emis de la nivelul Fermi (figura 3B). În general.nivelul de energie al vidului.Emin) (11) 399 . unde Emax este cea mai mare energie cinetică. hν este energia fotonului. EF. Prin urmare. Un electron emis de la un nivel de energie Ex < Ef (figura 3C) are o energie cinetică minimă (Emin= 0).EF. unde (6 ) Evac. Φ. este exprimată astfel: Φ= Evac .Potrivit figurii 3.Emin adică: Emax . Acest electron ar apărea în poziţia A în figura 4. pentru un electron emis de la un nivel de energie EB < EF: Ekin= h * ν – (EB .nivelul Fermi. funcţia de lucru.Emin= h * ν – Φ (10) Această diferenţă este egală cu distanţa de la A la B. (8 ) (9 ) Figura 4. funcţia de lucru poate fi calculată folosind formula: Φ= h * ν – (Emax . adică lăţimea spectrului cu ΔE= constant în figura 4. Φ. prin măsurători UPS Diferenţa dintre energiile cinetice ale electronilor la poziţiile A şi B este Emax .

în general suntem preocupaţi de o formă specială de fotoemisie. Acest lucru poate fi realizat prin emisia unui foton de raze X. Energia fotoelectronului emis este apoi analizată de un spectrometru de electroni şi datele sunt prezentate ca un grafic de intensitate funcţie de energia fotoelectronilor emişi. Spectrul de fotoelectroni va reproduce structura electronică a unui element destul de precis. Odată ce fotoelectronul a fost emis. contribuie la vârfurile caracteristice în spectru. spectrul este suprapus pe o structură electronică schematică a plumbului pentru a studia modul în care fiecare orbital dă naştere la linii fotoelectronice. atomul ionizat trebuie să se relaxeze. unde. Spectru fotoelectronic al plumbului care arată modul în care electronii scapă din solid. acest lucru va fi efectuat de către sistemul de control sau de sistemul de date asociat cu spectrometrul. care este considerată mai adecvată. sau pot suferi pierderi de energie şi să contribuie la fundal. cei care sunt supuşi unei împrăştieri inelastice şi suferă pierderi de energie. Energia cinetică a electronilor (EK) este experimental măsurată cantitativ de spectrometru.Spectroscopia fotoelectronică de raze X În XPS. Energia de legătură a electronilor (EB) este parametrul care identifică specificul electronilor. Acest lucru este ilustrat în figura următoare.3.EK . unde hv este energia fotonilor.W. Figura 5. Operatorul doar selectează o scală de energie cinetică sau de legătură. cunoscut sub 400 . deoarece toţi electronii cu o energie de legătură mai mică decât energia fotonilor vor fi cuprinşi în spectru. Cantităţile din dreapta relaţiei sunt cunoscute sau măsurabile. EK este energia cinetică a electronilor şi W (cst) este funcţia de lucru a spectrometrului. Relaţia dintre parametrii implicaţi în XPS este: EB = hv . Aceşti electroni care sunt excitaţi şi scapă fără a pierde energie. spectrul XPS al plumbului este suprapus pe o reprezentare a orbitalilor electronici. contribuie la fondul spectrului. dar acest lucru depinde de energia fotonilor razelor X implicate şi de aceea nu este o proprietate a materialelor intrinseci. În practică. adică de emiterea unui electron de la un nivel de bază datorită acţiunii unui foton de raze X de energie hv. contribuind la vârfuri discrete.

poate conduce la informaţii chimice valoroase despre un atom. Design-ul şi principiul de funcţionare al spectrometrului de electroni Figura 6. cu toate că nu se practică la scară largă. Un sistem computerizat este folosit pentru achiziţia datelor şi de procesarea ulterioară. sistem de tăiere a probelor. Camera de vid si de preparare poate fi dotată cu diferite instalaţii pentru prepararea probelor şi facilitaţi analitice auxiliare (neutralizator de sarcină.).numele de fluorescenţă de raze X. Sistemul de analiză a suprafeţelor SPECS În cel mai simplu mod. spectrometrul de electroni conţine următoarele componente: • Analizor de energie a electronilor de tip PHOIBOS 150 • Sursa de raze X. X-AES. adesea denumit X-AES (X-ray induced Auger electron spectroscopy). II. sistem de curăţare cu ioni de Ar etc. XR50 • Sursa de raze X cu monocromator FOCUS 500 • Sursa UV UVS 10/35 • Sursa sputter IQE 11/35 cu ioni de Ar • Neutralizator de tip Flood Gun FG 15/40 Acestea sunt cuprinse într-o cameră de vid. în general cu catodul de aluminilu (Al Kα) sau catodul de magneziu (Mg Kα). Astfel. O altă posibilitate o constituie ejecţia unui electron Auger. care funcţionează în regim de vid ultra-înalt (UHV). electronii Auger sunt produşi ca urmare a procesului XPS. Sursa de radiaţii primare pentru spectroscopia fotoelectronilor de raze X face uz de razele X. 401 .

Generatorul HSA3500 pentru analizatorul PHOIBOS este controlat în totalitate cu ajutorul computerului. Voltajul emisferelor (intre -40 si 40 V) ţi voltajul de întârziere (între -40 şi 40 V) sunt schimbate independent. 1. . Caracteristici generale Analizorul SPECS de energie emisferic electrostatic de tip PHOIBOS permite înregistrarea spectrelor de energie pentru particulele negative (electroni) şi particulele pozitive (ioni) în intervalul energiilor cinetice de la 0 eV la 3. Voltajul emisferelor (între . Toate componentele sunt controlate de un program SPECS. Voltajul emisferelor (între -400 şi 400 V) şi voltajul de întârziere (între -400 şi 400 V) sunt schimbate independent. nefiind necesară intervenţia celui care o foloseşte.Intervalul 3500 V. Acesta are patru moduri de operare pentru diferite intervale de voltaj: . .1. este echipat cu 9 canale detectoare. Toate aceste 402 . Lentilele de intrare sunt proiectate pentru a se potrivi cu o gamă largă de aplicaţii. Un mecanism de tăiere a orbitei şi o lentilă multi-mod fac selectabile zona de pe proba de analizat şi unghiul de recepţie. Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS 1. Analizorul PHOIBOS 150. Descrierea Analizorului Analizorul PHOIBOS este format dintr-un sistem de vidare şi patru componente majore interne care sunt arătate în figurile de mai jos. Toate părţile sunt integrate într-o singură cutie compactă din aluminiu protejată RF.1.Intervalul 1500 V. De aceea. Unitatea poate fi folosită şi pentru aplicaţii la nivele mai mari de energie folosind un mod de operare corespunzător.400 şi 400 V) variază cu voltajul de întârziere (între -3500 şi 3500 V). analizorul permite măsurători rezolvate spaţial cu un diametru minim de 100 µm şi. un numerator şi o interfaţă bus. de asemenea. . Voltajul emisferelor (între -400 şi 400 V) variază cu voltajul de întârziere (între -1500 şi 1500 V).Intervalul 400 V.2. Partea electronică de detecţie este alimentată împreună cu unitatea analizoare de control. un preamplificator.5 keV. Analizorul de acest tip poate detecta energii ale electronilor şi ionilor în intervalul 0-3500 eV cu o lărgime minimă a pasului de 7 meV. cercetarea unor suprafeţe largi asociate diferitelor unghiuri de recepţie ale lentilelor. Un ansamblu de lentile de transfer în doi paşi poate fi folosit în diferite moduri pentru rezolvarea spaţială şi unghiulară.Intervalul 40 V. Partea electronică pentru detecţie include un discriminator. Toate modurile lentilei pot fi setate electronic.

Figura 7. pentru a evita ciocnirea particulelor emise de pe suprafaţa probei cu moleculele de gaz.componente sunt introduse într-un mediu de vid ultra-înalt (UHV). 403 . U0 = –Ekin(kinetic energy) + Ep(pass energy) + WF(work function). Schema de conectare a componentelor PHOIBOS Figura 8: Principalele componente ale analizorului şi principiul voltajului U0 – voltajul principal de întârziere. Uchannel HV/ Base – potenţialul pe anod/catod pentru canale.

S1 – intrarea de tăiere a capacitorului emisferic. • Ansamblul detector pentru particule individuale. unde sunt întârziate în lentile pentru o analiză energetică ulterioară. pentru recepţionarea particulelor încărcate.detectori mono/multi-canal de colecţie discretă (1. Succesiunea de lentile defineşte suprafaţa de analiză şi acceptanţa unghiulară prin imagistica particulelor emise la intrarea în analizor. Particulele care trec prin lentile sunt focalizate în poarta de tăiere S1. ioni. trec mai întâi printr-un sistem de lentile electronic care taie fasciculul de particule. În plus. În modurile de amplificare rezolvarea unghiulară este realizată cu o apertură iris în planul de difracţie al sistemului de lentile. LA…LE – potenţialele pe lentile. Sistemul de lentile de intrare include zece segmente de lentile. Sistemul de lentile electronic şi părţile tăiate (intrarea şi ieşirea) au efecte importante asupra împrăştierii energiei detectate de analizor. T1…T10 – electrozi ai lentilei de transfer multi-mod. OH – emisfera interioară/exterioară. Componentele interne sunt: • Sistemul lentilelor de intrare. • Mecanism de tăiere a orbitei cu o interconexiune rotaţională exterioară. S2 – planul de ieşire al capacitorului emisferic. • Analizorul emisferic de 180° (HSA) cu un diametru de 150 mm pentru măsurători spectroscopice de energie. Sistemul de lentile poate fi operat în diferite moduri pentru situaţii de rezolvare spaţială şi unghiulară pentru a adapta analizorul la diferite cerinţe. 404 .UHV–UBase – voltajul detectorului. r0 – raza nominală a capacitorului (100 sau 150 mm). IH.5 sau 9 canale). C1…C9 . Pentru obţinerea unei imagini nedegenerate. sau electroni. Pentru analiza cu un spot mic este disponibilă o rezoluţie colaterală de până la 100 µm. dar de obicei se folosesc razele X sau alte tipuri de fotoni. panourile de lentile definesc acceptanţa unghiulară şi suprafaţa pentru o anumită mărime a tăierii de intrare. Sursa excitatoare depinde de tehnica folosită. • Apertură iris cu interconexiune rotaţională exterioară. Toate modurile lentilei pot fi setate electronic. Înainte ca particulele să treacă prin analizorul semisferic. folosind modul de amplificare puternică si o apertură iris corespunzătoare. sistemul de lentile nu conţine sau nu are interfranje. UChannelBase-U0 – voltajul de conversie.

Preamplificatorii sunt citiţi de către detectorii multi-canal (MCD). Distanţa standard de lucru de 40 mm şi partea frontală de formă conică la un unghi de 44° al lentilei furnizează accesul optim la probă pentru toate tipurile de surse excitatoare. Particulele cu o energie cinetică mai mare sunt focalizate mai departe spre exterior. cu înregistrarea simultană a unei benzi de energie în jurul valorii de trecere optime a energiei.2. Poziţia radială a imaginii tăiate în planul S2 depinde de energia cinetică a particulelor în capacitor. particulele care intră în S1 sunt focalizate în planul de ieşire al capacitorului S2. sunt focalizate mai în interiorul planului S2. fiecare canal este conectat la un preamplificator separat. Sistemul de lentile Ansamblul de lentile de transfer în doi paşi a fost conceput pentru a oferi randament de transmisie foarte bun şi proprietăţi optice bine definite.1. Rezoluţia colaterală este înrăutăţită şi suprafaţa de recepţie nu este definită în mod normal de lentile. cu interfaţa pentru programul de achiziţie de date SPECS. Un sistem de lentile cu un mecanism variabil de tăiere a orbitei este necesar pentru: • a vizualiza planul probei pe intrarea plană HSA. iar particulele cu o energie cinetică mai mică. Ele sunt focalizate pe poziţia centrală radială a ieşirii plane S2. Acesta poate fi folosit în diferite moduri care pot fi setate electronic. În capacitorul semisferic. La nivelul lentilei particulele ce ies de pe pro405 . informaţia dată de unghiurile de emisie este obţinută uşor. pentru rezolvarea spaţială şi unghiulară. suprafeţelor Fermi sau experimente similare. Aceste moduri sunt concepute pentru schiţarea benzilor UPS. montat în afara vidului. 1. • a accelera/decelera particulele la energia de trecere. În modurile unghiulare dispersive. Particulele care trec prin planul de ieşire al capacitorului S2 sunt accelerate în sistemul de detectori C. • a defini zona probei analizată şi unghiul solid de recepţie de pe probă. distribuţia emisiei după unghiuri este vizualizată în locul imaginii reale. dar. Aceasta permite posibilitatea folosirii detectorilor multi-canal. Modurile de transmisie sunt optimizate pentru transmisii înalte la mărimi diferite ale spotului. rezoluţia unghiulară poate fi ajustată continuu menţinând suprafaţa de recepţie a probei constantă. Cu detectorul multi-canal.Folosind irisul. Toată rezoluţia colaterală este pierdută. Particulele de pe traiectoria centrală au energia de trecere optimă.

Amplificarea este schimbată electric. Gradul de difuzie creşte. conectând la electrozii lentilelor voltajul optim. pentru o amplificare dată. Ekin este negativă pentru electroni şi pozitivă pentru ioni. datorită aberaţiei sferice a intrării lentilei. ţinând aberaţia sferică la o valoare cunoscută şi acceptabilă. Aceasta înseamnă că zona observată în planurile focale ale intrării sistemului de lentile este tot mai împrăştiată cu creşterea unghiului. Sistemul PHOIBOS poate funcţiona într-un nivel stabilit de întârziere (fixed retarding ratio – FRR) sau în transmisie stabilită de analiză (fixed analyzer transmission – FAT). Amplificarea înaltă. (figura 9). voltajul aplicat pe emisfere este dat de ecuaţia: Epas = (-q)kΔV În modul FRR. Din această cauză unghiul de recepţie al lentilei este selectabil prin modurile de amplificare. este în mod special potrivită pentru studii de rezolvare spaţială. Utilizatorul poate defini zona de recepţie a analizorului cu ajutorul intrării de tăiere deoarece traiectoriile electronilor emişi 406 .ba S sunt vizualizate în intrarea de tăiere S1. Cu toate acestea. de exemplu. În interiorul primei lentile. conform teoriei. atunci. cu unghiul de recepţie al intrării lentilei. Mărimea reală a suprafeţei probei de analizat DS este în principiu dată de ecuaţia (1). Planul imaginii probei este în coincidenţă cu planul intrării analizorului. În modul FAT. particulele trec printr-o imagine intermediară înainte să fie focalizate în intrarea de tăiere S1 a capacitorului emisferic (figura 4). Valorile voltajului sunt dependente de voltajul spectrometrului U0 care este preponderant egal cu Ekin . suprafaţa vizualizată a probei va avea dimensiunea DS egală cu: DS = D1 / M (1) Puterea de amplificare a planului de lentile poate fi selectată. proba fiind în planul focal al sistemului de lentile.Epas + funcţie de lucru. R fiind rata de întârziere. imaginea în planul de intrare este difuză. Dacă S1 are diametrul D1. 40 mm în faţa primului electrod al lentilei T1. energia de trecere are valoarea: Epas = Ekin / R. rezultând astfel dimensiuni mai mari ale probei decât cele date de ecuaţia (1). La nivelul S1 particulele sunt întârziate de diferenţa de energie dintre particulele cu energia cinetică preponderentă Ekin şi energia preponderentă de trecere Epas.

pot să găsească un drum spre intrarea analizorului. razele care intră în lentilă depărtate faţă de axa ei la unghiuri mari. menţinând zona de recepţie a probei constantă. Mod de arie medie de către probă sunt influenţate de către câmpurile electrice din jurul probei. Modurile de amplificare au fost optimizate pentru a permite unghiuri foarte mari de recepţie pentru surse punctiforme cu transmisie puternică (moduri de transmisie punctiformă). Mai mult.Figura 9. Datorită aberaţiilor lentilei. utilizând modul de amplificare înaltă şi apertură iris. În aceste moduri. Razele apropiate de axa 407 . Mod de transmisie înaltă Figura 10. Folosind irisul. apertura iris poate fi utilizată pentru ajustarea unghiului de recepţie a analizorului. Cu o apertură iris. aceste raze rele pot fi eliminate. o rezoluţie laterală de până la 100 µm este disponibilă. rezoluţia unghiulară este realizată cu ajutorul aperturii iris în planul de difracţie al sistemului de lentile. Pentru analiza cu spoturi mici.T1 având un potenţial fix care este setat ca fond la schimbarea sursei de alimentare. rezoluţia unghiulară poate fi încontinuu ajustată între ± 10 şi ± 90 .

lentilei (raze paraxiale) sunt focalizate în focarul Gaussian. electronii care părăsesc proba la o anumită distanţă unghiulară sunt focalizaţi pe aceeaşi 408 . Focalizări mici sub lentilă. Asta face ca modurile de transmisie punctuale să fie cele mai potrivite pentru AES. în planul imaginii. De aceea este realizat un unghi mare de recepţie. converg mai puternic. dar rezoluţia spaţială este înrăutăţită. Modul de amplificare înaltă Tabelul 1: Unghiul de recepţie versus diametrul irisului pentru o sursă punctiformă Unghiul de recepţie ± 1º ± 2º ± 3º ± 4º ± 5º ± 6º Diametrul irisului 3. ISS şi studii de sincroton. Figura 11. Razele care intră în lentilă la unghiuri mai mari. Discul cu cea mai mică dezordine se află unde tubul de raze emergente are cel mai mic diametru.5 mm 17.5 mm 7 mm 10 mm 13 mm 15.5 mm În noul mod de suprafaţă medie cu unghiuri rezolvate. implică deplasarea discului de cea mai mică dezordine.

apertura iris poate fi folosită pentru micşorarea suprafeţei de analizat. dar cu intensităţi mai mari în regiunile de margine. Figura 12. Folosind apertura iris. La PHOIBOS. Folosind apertura iris.zonă a intrării analizorului indiferent de poziţia lor din probă. Setările lentilelor pot fi combinate cu diferite combinaţii ale tăierii. fără restricţionarea unghiului de recepţie. Profilul tipic intensitate-poziţie cu apertură iris Cozile de intensitate mică formează un disc. Pentru o analiză cu spoturi mici. Există mai multe combinaţii diferite disponibile. aceste intensităţi pot fi suprimate. amplificarea şi apertura unghiulară sunt selectabile. aceste intensităţi pot fi suprimate. Cu un sistem de detecţie 2-D se pot obţine unghiuri de rezoluţie mare pe direcţia dispersiei. Intensitatea sa integrată poate atinge acelaşi ordin de magnitudine ca intensitatea peak-ului. acest mod este alegerea ideală pentru studii de dependenţă unghiulară. a analizorului. Suprafaţa de analizat a fost definită pentru a include între 90-99% din totalitatea semnalului fotoelectric. Funcţia intensitate-poziţie a analizorului este o Gaussiană. rezultând astfel un număr de combinaţii egal cu produsul dintre modurile de setare a lentilei şi numărul de tăieri. Modurile unghiulare permit utilizatorului să optimizeze rezoluţia unghiulară până la ± 0. 409 .050 cu mecanismul de tăiere a orbitei. Setarea optimă a aperturii iris depinde de mărimea tăierii şi de calitatea dorită a suprafeţei de analizat.

Există contribuţii în plus la lărgimea liniei observate în spectru. Această valoare (S) este o constantă a analizorului.1. FWHMtotal observat este dat de convoluţia FWHM . pentru lărgimea Gaussiană a liniilor: (6) FWHMtotal =(ΔEan 2 +ΔElevel2 +ΔEphoto2 )1/2 =ΔE 410 . Dacă HSA acceptă jumătatea unghiului α pe direcţia dispersiei. Intrarea de tăiere S1 şi planul de ieşire S2 sunt centrate în jurul razei R0: R0 = R in + R out = 150 mm 2 (2) Pentru un gradient fix al câmpului electric.75 R0. q – sarcina electrică a particulei.urilor individuale. numai particulele cu energie cinetică cuprinsă într-un anumit interval. Acele particule care intră în HSA perpendicular pe S1 şi se mişcă prin emisfere pe o traiectorie circular centrală.2. ΔV – diferenţa de potenţial aplicată pe emisfere (Vout . parcurgând un arc de cerc de rază R0. rezoluţia HSA sau FWHM (full width at half maximum). pot să treacă integral prin devierea unghiulară de la intrarea de tăiere S1 la planul de ieşire S2. k= R in R out = 0. au energia de trecere preponderentă Epass: Epass = (-q) kΔV. Razele emisferelor PHOIBOS sunt 1. Analizorul Emisferic (HSA) Analizorul emisferic PHOIBOS (HSA) cu o rază R0 (100mm/150mm) măsoară energia particulelor încărcate.Vin). Pentru liniile de fotoemisie cele mai importante contribuţii adiţionale sunt: a) Lărgimea proprie a liniei pentru nivelul atomic ΔElevel (de exemplu O 1s. Particulele încărcate care intră în HSA prin intrarea de tăiere S1.9375 2R0 (Rout − R in ) (3) (4) Aceste particule ajung pe S2. k – constanta de calibrare.25 R0 şi 0. sunt deviate pe traiectorii eliptice de câmpul electric radial între emisfera internă Rin şi emisfera externă Rout. C 1s). Al Kα). b) Lărgimea naturală a liniei pentru radiaţia caracteristică folosită la excitare ΔEphoto (de exemplu Mg Kα. a liniei transmise ΔEan este dată de : ΔEan S α2 = + Epas 2R0 4 (5) unde S = (S1 + S2)/2.2. de exemplu. Particulele cu energie cinetică mai mare se vor apropia de emisfera exterioară în timp ce particulele cu energie cinetică mai mică sunt deviate spre emisfera interioară.

De aceea. Ele sunt constante ale unde analizatorului. Intensitatea creşte cu creşterea energiei cinetice: I ∼ Ekin . gradul de întârziere R este definit ca: R= Ekin Epas (10) În acest mod toate particulele sunt decelerate cu acelaşi factor constant. cu costul unei mari pierderi în intensitate.FWHMtotal este de obicei stabilit folosind o probă de argint curăţată prin împrăştiere ionică şi înregistrarea nivelului Ag 3d5/2.9 eV este de obicei suficientă pentru măsurători la rezoluţie mare. o rezoluţie de 0.65 eV este de obicei suficientă pentru studii de înaltă rezoluţie cu o excitare monocromatică a Al Kα. În practică. Ecuaţia rezultă din teorema lui Liouville. o rezoluţie de 0.8 eV (7) În practică. în timp ce rezoluţia energetică scade.44 eV Pentru a atinge rezoluţia extremă de 0. după extracţia liniară a fondului. : Ekin Ekin (9) sunt valorile de recepţie pentru HSA. Pentru o rezoluţie mai mare a instrumentului. Pentru radiaţia monocromatică. suprafaţa de recepţie a probei AS şi rezoluţia HSA.44 eV. Pentru radiaţie Al Kα monocromatică şi pentru nivelul Ag 3d5/2 rezoluţia extremă este: (8) FWHMextreme = 0. de unde rezultă valori mai mici pentru FWHMextreme. datorită îngustării lărgimii liniei proprii a nivelului Si 2p. energia de trecere este proporţională cu energia cinetică. FWHM-ul razelor X trebuie să fie foarte mic. de exemplu radiaţie Al Kα monocromatică în mare parte. Analizorul poate fi operat în două moduri diferite: a) Gradul de întârziere fix (Fixed retarding ratio (FRR)). este posibilă folosirea radiaţiei X monocromatice de excitare. Pentru excitarea Mg Kα. (11) 411 . ΔEan : I:ΔEan ΩSAS =ΔEan Ω0A0 Epass Epass 2 . FWHMtotal este uneori determinat înregistrând nivelul Si 2p3/2 în loc la Ag 3d5/2. Intensitatea semnalului integral I al particulelor măsurate (suprafaţa cuprinsă în interiorul peak-ului până la nivelul fondului) este proporţională cu produsul dintre unghiul solid de recepţie ΩS. folosind doar o mică parte din suprafaţa spotului monocromatic de radiaţii X (datorită dispersiei energiei pe suprafaţa spotului). rezoluţia HSA la nivelele joase ale energiei de trecere pentru Ag 3d5/2 este : HMMgKa= 0.

Inelul de intrare poate fi poziţionat direct prin rotirea cadranului (vezi fi412 .2. Semnalele date de toate particulele. tăierea maximă posibilă poate fi selectată. (inclusiv câmpul magnetic al pământului) de aceea este esenţial să eliminăm aceste câmpuri în volumul închis al analizatorului. rezultă că: I ∼ Epass 2 1.3. acestea sunt construite. Mecanismul de tăiere a orbitei Mecanismul de tăiere a orbitei este folosit pentru a schimba manual deschiderea intrării şi ieşirii analizorului.5 mm grosime µ-metal pentru a ecrana câmpurile magnetice la un nivel minim. ISS şi este preferabil pentru măsurători ale survey-ului. Pentru o performanţă maximă a analizatorului şi sistemului de lentile. Analizatorul. Factorul de izolare pentru regiunea analizatorului este de aproximativ 35. sistemul de lentile şi detectorul sunt înconjurate de un strat de 1. 1. Există unele aplicaţii în care unul dintre ele este de obicei preferabil. în timp ce tăierea anterioară serveşte la compararea împrăştierii unghiulare pentru analizor. Raza de intrare este definită de două secţiuni care sunt la circa 6 mm depărtare. Dacă Ekin este constantă şi acelaşi peak este măsurat pentru diferite energii de trecere. Pentru o rezoluţie energetică dată. indiferent de energia lor cinetică. Izolarea Magnetică (13) Particulele încărcate sunt influenţate de câmpul magnetic rezidual.4.2. Mecanismul poziţionează o deschidere de intrare şi ieşire de o mărime adecvată în planul de intrare şi ieşire al analizorului. Tăierea posterioară se află în planul intrării şi defineşte energia de rezoluţie a analizorului (vezi ecuatia (5)). în întregime.b) Transmisie fixă a analizorului (fixed analyzer transmission(FAT)). din materiale non-magnetice într-o carcasa de µ-metal. sunt măsurate cu aceeaşi scădere a rezoluţiei şi intensităţii cu energia cinetică: I∼ 1 Ekin (12) Cele două moduri sunt disponibile pentru toate tipurile de măsurători. Modul FRR este folosit cel mai mult în AIS. Modul FAT este folosit preponderent în XPS şi UPS. unde este necesară o informaţie detaliată şi rezoluţia nu trebuie să depindă de energie. o zonă de analiză tolerată şi un unghi de recepţie. Aceasta face posibilă cea mai mare rată de numărare permisă pentru aceşti parametrii şi de aceea rezultă un timp scurt de măsurare şi un raport bun semnal-zgomot. în care Epass şi ΔEan din ecuaţia (5) sunt constante ajustabile.

gura 10). folosind acelaşi sistem rotaţional. Aceşti indicatori corespund celor care apar în setările programului de control al analizatorului SpecsLab2. Aranjamentul propriu-zis în analizor apare în secţiunea de tăiere a programului de control livrat împreună cu analizorul. Analizorii PHOIBOS. poziţiile trebuie introduse în zona de editare a datelor. sau A. Când deschiderea intrării şi ieşirii este schimbată. Prin acest aranjament se pot alege puterile de intrare şi ieşire independent. Poziţiile tăierii de intrare sunt indicate cu numere (1-8) pe cadranul rotaţional exterior.B sau C). începând cu ieşirea 5. Poziţiile tăierilor de ieşire sunt indicate cu litere (A-B. Figura 13. Pe de altă parte. Selecţia fantei de ieşire 413 . au 8 tăieri de intrare şi 2 de ieşire în configuraţia standard. inelul de ieşire este poziţionat indirect prin intermediul inelului de intrare (vezi figura 11).

1. de voltaj înalt. rezultând numărul total de particule pentru fiecare energie cinetică.5. Detector Multicanal MCD Detectorul este format din următoarele părţi: • Un aranjament de multiplicatori de electroni MCD • O punte ceramică multi-pin. traiectoria electronului este mutată între fiecare analizor pas cu pas. sunt cercuri concentrice. având diferite energii în HSA. este selectată pentru a corespunde cerinţelor unei diferenţe de energie cinetică constantă între canalele vecine ΔEk. 414 . în principal datorită câmpurilor de refringenţă existente pe marginea analizorului. situată în vid • Preamplificatori MCD. 5 sau 9 spectre paralele sunt înregistrate simultan. Numărul particulelor Nn care sosesc la fiecare colector Cneste numărat separat. iar aceste numere sunt stocate şi procesate într-o unitate de achiziţie a datelor. numărul particulelor din fiecare canal. este dată de: R − R0 Ek − Epass D = × R0 E pass R0 unde D este dispersia la HSA.5. Energia cinetică En a particulelor ce ajung la colectorul Cn. poate fi adăugat. cu 9 ieşiri de tăiere în cercuri concentrice în planul de ieşire. în planul ieşirii pentru electroni monocromatici cu energia preponderentă de trecere Epass. Principiile Detecţiei Datorită simetriei sferice a HSA. există o imagine 1:1 a intrării circulare de tăiere cu o rază de curbură R0. 1.2. Detecţia multicanal se realizează aranjând corespunzător 9 CEMs (multiplicator de electroni cu canale) ca şi colectori. Schimbând tensiunea spectrometrului U0. fiind ştiută din ecuaţia (16). aparţinând aceleiaşi energii cinetice. baleând spectrul odat peste suprafaţa detectorului.2. Imaginile electronilor. Valoarea teoretică a lui D este: D = 2R0 (16) (17) Valoarea experimentală determinată pentru dispersie poate fi puţin diferită. În principiu. Într-o primă aproximaţie raza de poziţie R a electronilor cu energia cinetică Ek. şi în acest fel fiecare colector înregistrează un spectru corect.1. cu o compensare fixă a energiei între canalele vecine. Distanţa radială între ieşiri de tăiere vecine ΔR.

se numeşte câştigul G.2. Coerenţa între Epass şi pas Din ecuaţia de dispersie energetică pentru analizor. Numărul mediu de electroni care pleacă din ansamblul CEM pe particula incidentă. este: ΔEk = ΔR D D ΔR Epass (18) sau: Epass = ΔEk (19) unde D este dispersia pe analizor.2. Impactul particulelor încărcate formează electroni secundari care sunt eliberaţi din peretele CEM. şi eliberează noi electroni secundari prin impactul în continuare de-a lungul peretelui CEM. un “nor electronic” se formează la ieşirea din CEM. Algoritmul este uniechivoc. Aceşti electroni sunt acceleraţi de către voltajul înalt. Acest efect este repetat succesiv. cum ar fi electronii şi ionii. Materialul rezistiv devine o dinodă (o serie de electrozi incorporaţi într-un fotomultiplicator) continuă când un potenţial este aplicat la capetele acestui tub. la energia cinetică nominală. până când. CEM este format dintr-un tub mic şi curbat de sticlă. un program calculează numărul de particule Nn în canalul Cn. Multiplicarea Electronică Un multiplicator de electroni cu canale (CEM) este un dispozitiv de achiziţie înaltă pentru detectarea particulelor energetice.1. prin interpolarea între numerele măsurate în canalul Cn la energiile măsurate cel mai apropiat dedesubt şi deasupra energiei nominale. la distanţa ΔR unul de celălalt. în final. Pentru detectarea unei singure particule. unde energia de trecere se schimbă în spectru (şi diferenţa de energie dintre canalele învecinate).2. Programul validează valorile la cele mai apropiate valori. câştigul trebuie selectat destul de înalt pentru a folosi CEMs în modul 415 . sau radiaţia. Datorită procesului de interpolare.5. diferenţa de energie Δ între canalele vecine. Peretele interior este căptuşit cu un material de rezistenţă înaltă. 1. Performanţa acumulatorului (DAC steps. În special în modul FRR. un calcul al energiei detectate a particulelor este necesar. Pentru asta.5.3. etc) limitează lărgimea şi distanţa posibilă a paşilor. deoarece nu există niciodată mai mult decât o energie nominală între două poziţii ale energiei măsurate. nu există o restricţie a pasului energiei datorată performanţei analizorului. conectat la CEM.

74 eV. Cum este menţionat mai sus. de exemplu. 2. Toate CEMs sunt montate într-o unitate paralelă pe o flanşă cu rol de punte. a cărui sarcină este independentă de micile schimbări în voltajul multiplicator.3 eV. iar XR 50 M trebuie să fie mutat cu 16 mm. Selecţia între anodul 1 şi anodul 2 accesează fie radiaţia Al Kα la 1486. spotul sursei de raze X pe anod este de 3. ca o componentă de multiplicare electronică pentru analizorii PHOIBOS. La fel ca şi XR 50.4 eV pentru Al Kα. un nor electronic format din mai mult de 107 electroni părăseşte CEM. Datorită mărimii mici a sursei. rezoluţia maximă a monocromatorului de 0. câştigul minim pentru operaţia de saturare este de aproximativ 107. De obicei. Unul sau un grup de CEM este folosit într-un aranjament special. în detectarea unei singure particule. mărimea spotului de raze X pe anod este de 3. modul focalizare/non-focalizare este utilizabil pe amândoi anozii. şi pulsul sarcinii purtate de norul electronic este detectat ca provenind de la una din particulele incidente şi numărate în canalul preamplificatorului.1. această sursă este o sursă cu doi anozi. fie radiaţia Ag Lα la 2984.5 x 0.2 mm2 pe probă). fiecare particulă incidentă eliberează un nor electronic la ieşirea aranjamentului CEM.5 x 0. având ca materiale constituente Al şi Ag.5 x 4 mm2 (corespunde la 3. monocromatorul este folosit în reflexia Bragg de ordinal 2. de exemplu. Puterea maximă este restricţionată la 150 W în modul de focalizare. 416 . Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M) 2.5 x 1 mm2 pe probă) şi sursa de raze X poate fi operată la puterea maximă de 400 W ( 600 W pentru Ag Lα) la lărgimea liniei de 0.5 mm2 (corespunde la 3. Principiu de funcţionare Monocromatorul FOCUS 500 de raze X este echipat cu o versiune specială a sursei de raze X XR-50. Particulele ce trec de ieşirea aperturii. sunt accelerate la o energie cinetică corespunzătoare în interiorul CEM. este accelerat în electrodul conectorului CEM. numită XR 50 M. Fiecare anod poate fi operat în modul de focalizare sau non-focalizare. Norul electronic emis. În modul de non-focalizare.25 eV poate fi atinsă pentru Al Kα. Operaţia de saturare este necesară pentru o reflexie a zgomotului suficientă. Dacă anodul de argint este activat.saturat. Dacă modul de focalizare este activat de către acumulatorul XRC 1000 M.

Aceasta este reflectată după legea lui Bragg pe oglinda elipsoidală din cuarţ în monocromatorul FOCUS 500 şi focalizată pe probă. are loc un proces de ionizare al nivelelor electronice. Descrierea sursei 2. Conectorii de filtrare rapidă permit îndepărtarea rapidă a liniilor de răcire cu apă şi HV (de înaltă tensiune). În afară de aceste două procese.1. Figura 14. Voltajul de focalizare este generat de către un amplificator XRC 1000 M şi este transferat la sursa de raze X printr-un cablu de filament prin cele 4 punţi. de către electronii întârziaţi.2. Monocromatorul Radiaţia caracteristică este generată pe anodul XR-50 M şi pleacă de la sursă sub un unghi de 15°. Modulul XR-50 M (cu alimentarea de apă şi protecţia HV scoase) poate fi încălzit până la 250°C. vor fi generate raze X sau electroni Auger. amplasată în capul sursei. care nu există în XR-50 standard. 2.2. Diagrama bloc a sursei de raze X este prezentată mai jos. Dacă aceste locuri vacante sunt umplute cu electroni cu o caracteristică energetică mai înaltă.Efectul de focalizare este obţinut cu ajutorul unei lentile electronice adiţionale. Generarea fotonilor de raze X Dacă un material în stare solidă este bombardat cu electroni de înaltă energie. arătând voltajul şi curenţii pe sursă. permiţând o operaţie UHV.2. Diagrama bloc a principiului de funcţionare a sursei 2.2. va fi produsă şi o radiaţie cu o frecvenţă continuă a spectrului. 417 .

Figura 15. • Un background mai mic. Este folosit pentru poziţionarea oglinzii în vederea obţinerii unui fascicul de raze X monocromatic. Monocromatorul aduce următoarele avantaje sursei de raze X: • Distribuţia energetică a razei X cu benzi energetice înguste îmbunătăţeşte selectivitatea chimică. cu plane de cristal monoatomice orientate precis. Sursa este alimentată de către un acumulator XRC 1000 M şi de către o unitate de răcire CCX60. Oglinda este făcută dintr-un suport monolitic de încălzire. • Eliminarea Bremsstrahlung şi a radiaţiei termale de la sursa de raze X. care reduce semnificativ uzajul indus asupra sursei. care simplifică analiza spectrală. îngustând peak-urile spectrului.A) Descrierea generală a monocromatorului: Ansamblul cristalului este compus dintr-o oglindă din cristal de cuarţ şi un manipulator al oglinzii. 418 . Manipulatorul oglinzii poate genera trei moduri de mişcare: translaţie (focalizare) şi două direcţii de înclinare.3 eV). Sursa de raze X XR 50 M este montată pe un manipulator după cele trei axe.74 eV) sau Ag Lα (2984. • Eliminarea razelor X nedorite de la sateliţi şi impurităţile anodului. Prezentarea schematica a monocromatorului FOCUS 500 În anodul dual sunt produse raze X Al Kα (1486. • Un spot de raze X focalizat pe probă creşte sensibilitatea în XPS pe probe mici.

unghiurile de incidenţă θ1 şi unghiurile de reflexie θ2. Cercul Rowland este o condiţie geometrică pentru reflexie.096°.B) Monocromatizarea prin difracţia pe cristal Figura 16. focarul şi suprafaţa oglinzii.851243 nm. Toate punctele de pe suprafaţa cristalului. O sursă de raze X divergentă. are loc o interferenţă constructivă după împrăştiere numai dacă drumurile parţiale ale undelor pe plane diferă printr-un număr întreg de lungimi de undă. Situaţia este explicată de ecuaţia lui Bragg: 2d cosθ = n λ În termenii energiei avem: 2dE cosθ = n 1239. de lungime de undă λ cad pe cristal sub unghiul de incidenţă θ. trebuie să fie constante. Toate punctele de pe suprafaţă şi unghiul de reflexie 2θ al razei. Când razele X. 2θ = 25. 2. va fi focalizată dacă sursa. trebuie să fie la fel ca şi cele din planul de reflexie. 419 . se află pe un cerc.149° şi pentru Ag Lα. Există două cerinţe pentru ca difracţia de raze X să aibă loc în concordanţă cu legea lui Bragg: 1. luând 2d = 0.8419 nm eV Din cele două ecuaţii rezultă. pentru Al Kα unghiul de difracţie 2θ = 23. Configuraţia monocromatorului cristalin elipsoidal Cristalele de cuarţ individuale sunt folosite în procesul de monocromatizare.

unde se produce o lărgire datorată diametrelor finite ale spotului sursei de raze X. iar pentru Ag Lα este de 344 meV. Legea lui Bragg presupune ca unghiul de reflexie să fie independent de punctul reflexiei. Sursa de raze X. Pentru fluxuri înalte.7 eV Pentru Al Kα. XR M 50 este echipată cu o lentilă electrostatică care focalizează electronii pe anod. Ansamblul cristalului poate fi înclinat în două direcţii şi mutat pe direcţia y pentru a duce suprafaţa cristalului pe cercul Rowland. Poate fi operată în două moduri diferite. poate fi operată în modul non-focalizare. 420 . Există numeroase ajustări date pentru montajul optic. iar planele reflectoare ale cristalului să fie concave. Pentru monocromatorul elipsoidal FOCUS 500 sunt folosite doar cristale cu Δθ = ±10" . Diferenţa din ecuaţia Bragg duce la expresia pentru rezoluţia intrinsecă a oglinzii: Rezoluţia energetică intrinsecă la o anumită aliniere a planurilor cristalelor este ΔE=n Δθ (cosθ)2 1456. Ambele condiţii sunt îndeplinite doar pentru reflexia simetrică din punctul c. Profilul Gaussian al peak-ului de difracţie al unei raze monocromatice (Al Kα) Curba intensitate-unghi de difracţie pentru un anumit tip de cristal este cunoscută sub numele de “rocking curve”. lărgirea datorată sursei este neglijabilă.Condiţia de reflexie necesită ca sursa şi proba să se afle pe cercul Rowland. În modul de focalizare. Aliniatorul sursei de raze X îi dă voie utilizatorului să poziţioneze anodul pe cercul Rowland. Figura 17. cu raza egală cu diametrul cercului Rowland şi să fie tangenţiale la cercul Rowland în punctul c (figura 15). rezoluţia energetică intrinsecă a FWHM este 167 meV.

3. Ag non-focalizat (anod 1N). Modul de focalizare În contrast cu sursa standard XR-50. pot fi setate în interiorul sursei XRC 1000 M. mărimea spotului de raze X pe anod este 3.2. Dacă modul de focalizare este activat. Pentru condiţiile optime de focalizare. Această relaţie este setată automatic de către sursa XRC 1000 M.1.5 x 0. UL: Figura 18.3. Al non-focalizat (anod 2N).5 x 4 mm2 şi sursa de raze X poate fi folosită la putere maximă.2. 3. Al focalizat (anod 2F). rezoluţia maximă a monocromatorului de 0. Datorită mărimii mici a sursei. 2. Această lentilă poate focaliza electronii care se fixează pe anod şi astfel este obţinut un spot de raze X de mărime variabilă. sursa XR-50 M este echipată cu o lentilă electronică în capul sursei. Figura următoare arată lărgimea spotului pe probă în funcţie de tensiunea de focalizare. UL trebuie să varieze liniar cu tensiunea pe anod. Informaţii generale în legătură cu sursa XR 50 M 2.5 mm2. spotul sursei de raze X pe anod este de 3. Lărgimea spotului de raze X în functie de Puterea maximă şi tensiunea corespunzătoare UL pentru anozii de Al şi Ag.2. Ag focalizat (anod 1F). În modul non-focalizare. 421 . Fiecare anod poate opera în modul de focalizare sau non-focalizare. Aceasta dă un total de patru moduri de operare pe anod: 1. 4.25 eV poate fi atinsă pentru Al Kα.

3.3. Temperaturile înalte au ca şi consecinţă suprasolicitarea. 2.2.1. . Informaţii generale Flood-Gun–ul FG 15/40 a fost conceput pentru neutralizarea generală a sarcinilor probelor.1. Disiparea maximă de putere pe anod a sursei de raze X.5 l/m. de exemplu evaporarea materialului anodului sau în cel mai rău caz.5-3. Diagrama operaţională şi conexiunile electrice ale Flood-Gun-ului sunt arătate în figura următoare: Figura 19. Lentile extractoare.2. sau semiconductorilor. Flood-Gun 15/40 3. şi este folosit special pentru aplicaţii XPS. 3. fisurarea anodului şi eliberarea apei în camera de vid.1. a izolatorilor încărcaţi pozitiv. 3. Curentul de emisie poate varia de la 0 la 5 mA. Componente: 1. Răcirea cu apă Ca agent de răcire pentru XR-50 M se foloseşte apa. Anod. Tensiunea şi curenţii necesari pentru operaţia FG-ului sunt asigurate cu PS FG 20. Diagrama operaţională • 422 Energia este controlată manual.5 bar (de obicei 5-6 bar) şi dacă debitul este de aproximativ 2. Temperaturi mai mici decât temperatura camerei vor duce la condensarea apei şi fenomene de descărcare în interiorul conductei de apă sau al învelişului de protecţie. poate fi obţinută doar dacă presiunea de răcire a apei este mai mare decât 3. Fasciculul de energie poate varia între 0 şi 500 eV. Filament.2.

Schmidt S and Hüfner S 2004 The electron-phonon selfenergy of metallic systems determined by angular resolved high resolution photoemission Physica B 351 229-34 10. Davison S G and Steslicka M 1992 Basic Theory of Surface States (Oxford: Oxford University Press) 9. Matzdorf R. Nicolay G. Fitton B and Willis R F 1978 Photoemission and the Electronic Properties of Surfaces (Chichester: Wiley) 4. Al (1962). I. D..Theory and Current Applications (Studies în Surface Science and Catalysis) 74) (Amsterdam: Elsevier) 5. Forster F.Principles and Applications 3rd edn (Berlin: Springer) 3. Meister G and Goldmann A 1993 Temperature-dependent photoemission spectra from Cu(1 0 0) and Cu(1 1 1) surfaces Surf. Ashcroft N W and Mermin N D 1988 Solid State Physics (Philadelphia. Rev. Hüfner S 2003 Photoelectron Spectroscopy. The Journal of Chemical Physics 37:3007 7. W. Curentul de emisie este independent de energie şi este controlat manual 4. Schattke W and Van Hove M A (ed) 2003 Solid-State Photoemission and Related Methods: Theory and Experiment (Weinheim: Wiley-VCH Dec. PA: Saunders College) 11. M. Kevan S D (ed) 1992 Angle Resolved Photoemission . 423 . Eltner B. "Determination of Ionization Potentials by Photoelectron Energy Measurement".• • Voltajul de extracţie nu este selectabil de către utilizator. Turner. 286 56-65 1. Reinert F. Feuerbacher B. Shockley W 1939 On the surface states associated with a periodic potential Phys. 56 317-23 8. Jobory. Sci.) 6. Bibliografie Cardona M and Ley L (ed) 1978 Photoemission în Solids I (Topics în Applied Physics vol 26) (Berlin: Springer) 2.

........ Înregistrarea energiei cinetice şi a numărului de electroni emişi de la suprafaţa materialului datorită acţiunii razei X de energie hν duc la obţinerea spectrului XPS........... dr................. C......... Fiecare element determină un număr caracteristic de vârfuri XPS la valori caracteristice ale energiei de legătură care ne permit identificarea directă a elementelor care există pe suprafaţa investigată...S.........424 2................ mai exact cei care pleacă din material de la o adâncime de aproximativ 10-12 nm... De asemenea se poate folosi în analiza modificărilor care apar în chimia suprafeţei unui material după ce acesta a fost supus unor tratamente fizico-chimice. Instrumentul de bază pentru măsurarea numărului de 424 .........................III. Această metodă permite determinarea elementelor care contaminează o suprafaţă şi uniformitatea compoziţiei elementale la suprafaţă sau în adâncime (depth profiling)....... Bibliografie ....... Emilia Sabina Varga Cuprins 1.................436 1................. Este important de reţinut că XPS detectează numai acei electroni care ajung în vidul din incinta echipamentului.. 1-5 µm) sunt recapturaţi sau blocaţi în diferite stări de excitare în interiorul materialului........... Teodora Maria Radu...... măsurătorile XPS trebuie efectuate în condiţii de vid ultra-înalt (UHV) din cauza distanţei la care se află instrumentele de detecţie în instalaţiile XPS........ Pentru majoritatea aplicaţiilor este de fapt o metodă nedistructivă prin care se determină chimia suprafeţei oricărui material.S.. Pentru a detecta numărul de electroni la fiecare valoare a energiei de legătură (energie cinetica) cu eroare minimă...dr....... faţă de suprafaţa iradiată cu raze X....Studiul prin spectroscopie fotoelectronică de raze X a suprafeţelor diferitelor tipuri de materiale C................................... Introducere Spectroscopia XPS este o tehnică de analiză foarte utilă în domeniul cercetării avansate în ştiinţa şi tehnologia materialelor....... Introducere ................ Toţi electronii fotoemişi de la adâncimi mai mari în urma penetrării materialului de către radiaţia X (aprox...... La baza cuantificării unui spectru XPS obţinut stă presupunerea că numărul electronilor înregistraţi este proporţional cu numărul de atomi într-o stare dată...........

Y%C. Trebuie menţionat că acest tip de analiză se realizează maximizând semnalul obţinut (sensibilitatea) cu preţul degradării rezoluţiei. crescând rezoluţia energetică. prin aceasta micşorând transmisia analizorului şi. y%Si3+. proba se va încărca relativ la suportul de probă având ca efect apariţia unui câmp electric de întârziere la suprafaţa probei care determină deplasarea spectrului spre energii cinetice 425 . Spectrele de înaltă rezoluţie se înregistrează pe domenii energetice restrânse (10-15 eV) micşorând fereastra energetică. În marea majoritate a cazurilor primul pas în analiza probei este acela de a înregistra spectrul pe scala energetică maximă disponibilă a spectrometrului pentru a determina elementele prezente pe suprafaţă (survey analysis). Cu ajutorul acestor spectre (“high resolution” spectra) se identifică stările chimice ale elementelor detectate (deplasările chimice) din poziţia şi forma liniilor spectrale. z%Si2+. calibrarea cu exactitate a scalei energetice şi a scalei de intensitate este crucială. Mai mult. Resursele software ajută la o analiză cantitativă (concentraţia relativă a tuturor elementelor prezente pe suprafaţă ) cu o precizie acceptabilă după 2-3 baleiaje a scalei energetice. Aşadar. t% C-C). În figura 1 este ilustrat un spectru survey analizat folosind un tabel de cuantificare din baza de date a software-ului de prelucrare a datelor (Casa XPS) pentru regiunile selectate. În acest caz numărul de “scan”-uri pe această plajă energetică îngustă va fi mai mare (10–20 baleiaje) pentru că sensibilitatea scade cu creşterea rezoluţiei. etc. Cu excepţia cazului când electronii emişi sunt înlocuiţi. z%O. în consecinţă.electroni înregistraţi pentru o stare atomică este regiunea de cuantificare. concentraţiile relative ale stărilor de oxidare ale unui singur element ( x% Si4+. În aceste spectre de înaltă rezoluţie apar structurările secundare care ne permit studiul complex al elementelor în înconjurarea lor chimică şi structurală. din spectrele XPS se pot obţine concentraţiile relative ale elementelor pe suprafaţă ca de exemplu: x%Si.. capacitatea de calibrare a scalei de energie este dependentă de capacitatea de compensare a sarcinii pozitive acumulate la suprafaţa probei în timpul măsurătorii şi de disponibilitatea unei linii spectrale la o energie de legătură cunoscută care să poată constitui un etalon pentru deplasarea scalei de energie. Obiectivele principale ale regiunii de cuantificare sunt: definirea domeniului de energie în care semnalul poate fi atribuit tranziţiei de interes şi specificarea tipului de aproximaţie adecvat pentru eliminarea semnalului de fond care nu aparţine vârfului de interes. t%Si1+) sau concentraţiile relative ale stărilor chimice prezente pe suprafaţă (x%Si4+. Z%O. Pentru a realiza măsurători de încredere şi pentru a putea face intercompararea rezultatelor cu alte laboratoare. Y%Si3+.

v. Ca. energia masurată pentru o linie fotoelectrică poate varia în funcţie de energia cinetică a electronilor.un tun de electroni de energie joasă (flood gun) pentru a restabili o stare de echilibru d.d. figura 2 prezintă spectrul unei probe înregistrat înainte şi după compensarea de sarcină [1]. B.p.Figura 1 Exemplificare spectru XPS cuantificat pe o probă cu conţinut de C. Pentru ilustrarea acestui efect. Este important de menţionat că. mai mici (energii de legătură mai mari). pentru materialele izolatoare electronii emişi trebuie înlocuiţi de la o sursă externă . Linia spectrală a carbonului. Pentru probe conductoare conectate electric la suport echilibrul de sarcină este restabilit uşor. forma liniilor spectrale sa fie cea mai bună concomitent cu asigurarea că distanţa dintre vârfuri între tranziţii este inde426 . este deplasată cu 120 eV între cele doua situaţii (cu compensare de sarcina şi fără). Si şi Mg. C1s. î. În absenţa compensării efective de sarcină . O. electric. compensarea de sarcină nu înseamnă neapărat neutralizarea suprafeţei probei ci mai mult stabilizarea suprafeţei probei a.

Un experiment în care compensarea de sarcină este făcută corespunzător necesită de obicei deplasarea în energia de legătură folosind pagina “ Calibration property” din programul de cuantificare al spectrelor. Mai mult. concretizate deja în lucrări ştiinţifice importante. Straturile de oxid pe materialele metalice pot transforma un material conductor într-o suprafaţă izolatoare care astfel necesita tratarea lor ca un material izolator. Obţinerea unei energii de legătură corecte pentru o tranziţie cunoscută nu e neapărat un indicator al unei bune neutralizări de sarcină. Casa XPS. vârfurile sunt largi. [1]. Figura 2 Efectul compensării de sarcină în spectrul XPS. Măsurătorile au fost realizate cu ajutorul unui echipament de tip SPECS PHOIBOS 150 MCD echipat cu o sursă AlKα monocromatică (hν=1486. vârfurile au forma foarte îngustă Măsurătorile XPS prezentate mai jos reprezintă sinteza unor studii complexe pe diferite tipuri de materiale. Si şi O: a) În absenta neutralizării (flood gun off).pendentă de energia la care sunt măsuraţi electronii. aceste măsurători furnizează informaţii relevante despre limitele şi posibilităţile de îmbunătăţire ale acestei tehnici de analiză. Avantajele utilizării monocromatorului sunt: reduce semni427 . pe o proba cu conţinut de C.6 eV). metalul Al oxidează chiar şi în vid iar stratul subţire de oxid se comportă ca un izolator. cu scopul de a pune în evidenţă performanţele tehnice ale echipamentului folosit. spectrul este deplasat cu 120eV şi distorsionat b) În prezenţa neutralizatorului de sarcina dar cu parametrii de lucru selectaţi incorect. acumularea de sarcina este compensată insuficient c) Suprafaţa probei neutralizată corect. însă forma vârfurilor este bună şi poziţiile relative ale vârfurilor sunt stabile. De exemplu.

875 Intensitate ( u. Autorii au propus descompunerea spectrelor O1s obţinute pentru acest sistem în două componente : O1 – asociată legăturilor de tip B-O-B şi O2 atribuită legăturilor B-O-Bi şi Bi-O-Bi.ficativ fondul de radiaţie. Presiunea în camera de analiză este în intervalul 10-9. prezenţa O1s as prep x=0. temperatură de topire joasă. î.3a prin linia punctată. ) x=0.875 O1s as prep x=0. 3a este prezentată descompunerea spectrului O1s urmărind scenariul propus în literatură. transmisie în ultraviolet (UV) şi caracteristici optice.6 x=0. spectrul O1s se deplasează spre energii de legătură mai mici. Materialele oxidice cu structură vitroasă pe bază de Bi2O3 prezintă interes foarte mare atât din punct de vedere ştiinţific cât şi tehnologic deoarece prezintă proprietăţi fizice mai bune decât alte sticle: coeficienţi de expansiune termică mari.6 x=0. cu cele obţinute şi publicate recent [2] în literatura de specialitate cu un echipament similar. cu creşterea lui x. elimină sateliţii din spectru (vârfuri secundare care însoţesc tranziţiile de interes) . În acest studiu sunt comparate rezultatele XPS obţinute pentru sistemul (1-x) B2O3·xBi2O3 cu x = 25 – 65 cu echipamentul descris mai sus. Proba care urmează a fi analizată este fixată pe un suport de molibden cu ajutorul unei benzi dublu adezive de carbon. indicată în fig. Se observă că.375 O3 O2 x=0.10-10 mbar. (b) propusă în studiul nostru 428 . a. Prin măsurarea probei B2O3 autorii au determinat poziţia vârfului O1s la o valoare a energiei de legătură de 533. Măsurătorile se realizează utilizând o sursă de raze X de putere 250 W. a. În Fig.2 eV. pe acelaşi tip de probe.375 (a) O1 (b) 540 535 530 525 520 Energie de legatura (eV) 540 535 530 525 520 Energie de legatura (eV) Figura 3 Deconvoluţia spectrului O1s de înaltă rezoluţie: (a) aşa cum a fost sugerată in literatură. asigură o rezoluţie energetică şi spaţială foarte bună.

pentru proba cu x = 0. nu mai poate fi clar evidenţiată. cu creşterea conţinutului de Bi. î. 4B). spre deosebire de [3].5 eV şi cel corespunzător oxigenului în reţeaua SiO2 (Si-O-Si) observat la 532.monocromata) în laboratorul nostru. O2 şi O3 atribuite legăturilor de tipul B-O-B. În Fig. Spectrul O1s pentru această probă constă din două componente atribuite legăturilor de tipul Bi-O-B şi Bi-O-Bi. Astfel. şi de valorile energiilor de legătură ale oxigenului în B2O3 şi Bi2O3 raportate în literatură [3]. 4A. la 532. 3b este prezentată deconvoluţia spectrului O1s cu trei componente: O1. iar spectrul de înaltă rezoluţie corespunzător Ti 2p pentru substratul de Ti:Si 1:2 (Fig. Se observă că. această componentă nu mai poate fi pusă în evidenţă. deoarece prezintă o fotoactivitate mult crescută faţă de oxidul de titan pur. 4C). indicând o segregare a celor doua faze. 4D). Si şi Gd.componentei B-O-B în spectru.875. în timp ce componenta atribuită legăturilor de tip B-O-B scade continuu a. Fotopicul O1s prezintă o formă complexă. după cum se poate observa din spectrul survey prezentat în Fig. 5] în special pentru aplicaţii de fotocataliză. Bi-O-B şi Bi-O-Bi. 4B).83 eV pentru cea tratată la 1400 eV. O categorie de probe pe care au fost efectuate măsurători XPS în scopul evaluării modificărilor structurale induse la suprafaţa acestor sisteme prin aplicarea tratamentelor termice o reprezintă nanocompozitele pe bază de Si şi Ti preparate prin combinarea metodei sol-gel cu metoda uscării prin pulverizare. vârful corespunzător oxigenului din reţeaua TiO2 (Ti-O-Ti) prezent în jurul valorii de 530. Acest tip materiale a atras o atenţie deosebită în ultimii ani [4. indică prezenţa TiO2 evidenţiat 429 .8 eV sunt bine separate (Fig. concentraţia legăturilor de tip Bi-O-Bi creşte.84 eV pentru proba netratată termic. Rezultatele XPS obţinute pentru sistemul cu raport Ti:Si 1:2. Analiza fotopicului Si 2p (102 eV) identifică formarea SiO2 (Fig. indică prezenţa oxigenului şi a carbonului de contaminare. Bi2O3 devine aşadar formator de reţea vitroasă ceea ce determina creşterea stabilităţii chimice a probelor. cu preponderenţa fazei de siliciu la suprafaţă. Începând cu proba tratată termic la 700°C. Prin creşterea temperaturilor de tratament termic acesta se deplasează de la 530. Ţinând cont de echipamentul de înaltă rezoluţie utilizat în achiziţionarea acestor spectre (sursa -AlKα. împreună cu Ti. asimetrică datorită suprapunerii mai multor componente specifice oxigenului din structura sistemului investigat (Fig. acest studiu confirmă faptul că rezoluţia spectrelor înregistrate are un rol foarte important în analiza şi modul de interpretare a datelor. s-a reuşit o analiză mult mai detaliată a tipurilor de legături şi a modificărilor care apar la nivelul acestora în probe cu creşterea conţinutului de Bi.

cum sunt atomii de Si în reţeaua SiO2. reflectându-se astfel o substituţie a atomilor de Ti de către atomi cu o electronegativitate mai mare şi polarizabilitate mai mică. în timp ce cantitatea de Si 2p creşte de la 16. (C) Si 2p. Formarea celor doi oxizi (SiO2 şi TiO2) este confirmată şi de forma vârfului O 1s (Fig.Spectrele XPS de înaltă rezoluţie corespunzătoare (B) O 1s.89 % pentru proba tratată termic la 1100°C. pentru (a) proba netratată termic precum şi pentru probele tratate termic la (b) 350°C. respectiv tratat termic la (b) 350°C. 4B).a. (e) 1100°C şi (f) 1400°C. După cum se poate observa din Tabelul 1.a. (e) 1100°C şi (f) 1400°C . (D) Ti 2p.) (f) (e) (d) (c) (b) (a) 110 105 100 95 90 470 465 460 455 450 Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV) Figura 4A: Spectrele XPS survey pentru sistemul Ti:Si 1:2 (a) netratat termic. dar mai ales separării celor două faze. Acest fapt poate fi explicat printr-o migrare a titanului de la suprafaţă spre interior şi a siliciului din interior spre suprafaţă. 430 . (c) 700°C. (c) 700°C.Ti LMM C KLL Gd 3d O KLL O 1s Gd 4d (A ) Si 2p C 1s (B) (f) (e) (d) (c) (b) (a) 545 540 535 530 525 Intensitate (u.) Ti 2p (f) (e ) (d ) (c ) (b ) (a ) 1200 900 600 300 0 E n e r g ie d e le g a t u r a ( e V ) Energie de legatura (eV) (C) (D) (f) (e) (d) (c) (b) (a) Intensitate (u. la 2.87 % la 38. cantitatea de Ti 2p la suprafaţă descreşte de la 12. Cantitatea de oxigen la suprafaţa probelor descreşte odată cu creşterea temperaturii de tratament.05 %. prin peak-ul de la 459. fapt datorat îndepărtării oxigenului specific compuşilor organici sau grupărilor OH.5 eV (Ti 2p1/2).0 eV (Ti 2p3/2) şi 464. (d) 900°C.28 % pentru proba netratată termic. (d) 900°C.

excepţie făcând fotopicul de C 1s (Fig.281 11.684 62. Spectrul XPS survey înregistrat înainte de imersie prezintă doar fotopicuri corespunzătoare elementelor care intră în compoziţia sistemului (Y 3p. Experimentele de adsorbţie a proteinelor s-au realizat prin imersarea compusului aluminosilicatic în lichid biologic simulat (SBF) îmbogăţit cu BSA.76 29. pentru sistemul Ti:Si 1:2.9 eV pentru proba tratată termic la 1400°C. Fe 2p.640 58. Temperatura de tratament termic (ºC) Netratat termic 350 700 900 1100 1400 Compoziţia elementală (% at.18 0.260 9.428 62. Pentru măsurători ulterioare pe probe funcţionalizate cu diverse tipuri de proteine este reco431 .procente molare).894 5. 4B) sunt de asemenea deplasate spre energii de legătură mai mari.148 0. Ceramicele vitroase aluminosilicatice sunt foarte stabile în organism iar prin adăugarea oxidului de fier şi ytriu ele pot fi optimizate pentru aplicaţii simultane de hipertermie şi radioterapie [6]. Motivul acestei deplasări este corelat cu deplasarea spectrelor O1s şi cu migrarea atomilor de Si spre suprafaţă odată cu creşterea temperaturii de tratament termic. Prezenţa carbonului se explică prin expunerea probei la atmosferă. 5 (A.498 Si 2p 16.057 34.Tabel 1.875 24.15 0. înainte şi după tratamentul termic. XPS ne permite de asemenea studiul biocompatibilităţii diferitelor tipuri de materiale. B)).43 eV pentru proba netratată termic la 102.798 Gd 3d 0. de la 101.) O 1s 70.37 Spectrele de înaltă rezoluţie corespunzătoare Si 2p (Fig.688 64. probele spălate şi uscate au fost analizate cu ajutorul spectroscopiei XPS. Si 2p şi Al 2p) pentru toate probele investigate.653 38.164 27. Biocompatibilitatea este dictată de modul în care proteinele se adsorb la suprafaţa materialului odată ce acesta intră în contact cu mediul biologic. precum şi în soluţie tampon fosfatică (PBS) îmbogăţită cu Fg.156 0.22 0.331 Ti 2p 12. Concentraţia relativă a principalelor componente. dar şi datorită benzii dublu adezive de carbon pe care a fost imobilizată proba pentru măsurare. După procedura de imersie.549 2. Pentru exemplificare sunt prezentate caracteristicile de adsorbţie a albuminei serice bovice (BSA) şi a fibrinogenului (Fg) la suprafaţa unui compus aluminosilicatic cu conţinut de Fe şi Y preparat prin metoda sol-gel (60%SiO220%Al2O310%Fe2O310%Y2O3 .829 59.367 7. BSA şi Fg reprezintă principalele componente plasmatice şi proteinele relevante care se adsorb la suprafaţa biomaterialelor care intră în contact cu sângele.

47 25. denotă o ataşare rapidă a proteinei la suprafaţa compusului. Si 2p şi Al 2p a fost mai puţin evidentă datorită stratului de proteină format (Tabel 1.a.77 25.16 2.67 Compoziţia elementală (% at.43 28.2 şi 400 eV.2 respectiv 0. caracteristice grupărilor C-NH2. Deoarece.) Fe 2p Y 3p Intensitate (u. centrate la 398. Deconvoluţia spectrelor de N 1s (Fig. detecţia elementelor Y 3p.46 0.18 0. Fotopicul N 1s înregistrat la aproximativ 400 eV este tipic pentru azotul din compuşii organici [8]. O 1s O KLL C KLL N 1s Y 3p C 1s Si 2s Si 2p Al 2p (A) O KLL C KLL Fe 2p O 1s C 1s (B) N 1s Intensitate (u.68 6. Măsurătorile XPS de concentraţie de azot pot fi utilizate şi ca metodă indirectă de determinare a cantităţii de proteină adsorbită la suprafaţă [7].03 Y 0. Rapoartele N:C de 0. concentraţia de azot a fost practic zero înainte de imersie în soluţiile cu proteină (Tabel 2.7 37. înregistrate deja după un timp de imersie de 5 minute.3 2.04 0.08 37.42 432 . 2 ore (c) şi 24 ore (d) de imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi PBS/Fg (B). analiza spectrelor survey indică fotopicuri corespunzătoare N 1s. Timpul de imersie 0 5 min 2 ore 24 ore C 6.54 36.21 N 5. Fe 2p.) O Al Si 53. datorită azotului prezent în fiecare aminoacid component al proteinelor. 3).21 35.49 0.93 33. 6) de înaltă rezoluţie scoate în evidenţă două componente.mandată utilizarea benzii de In în locul celei de C. Este de remarcat faptul că pentru suprafeţele funcţionalizate cu proteine. Tabel 2.71 1.19 1.5.2 23 Fe 0. În acelaşi timp. azotul poate fi utilizat ca un indicator sigur al ataşării proteinelor.46 6. înainte şi după imersia în soluţiile de SBF/BSA.75 0.a. 2).) (d) (c) (b) (a) Si 2s Si 2p Al 2p O 2s (d) (c) (b) (a) 1200 800 400 0 1200 1000 800 600 400 200 0 Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV) Figura 5 Spectrele XPS survey înainte de imersie (a) şi după 5 minute (b).92 28. Concentraţia relativă a principalelor componente. Rezultate similare au fost obţinute pentru ambele proteine (BSA/Fg) utilizate pentru funcţionalizare.

02 0.) 405 400 395 Energie de legatura (eV) 390 (a) 410 405 400 395 390 410 405 400 395 390 Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV) Figura 6 Deconvoluţia spectrelor XPS de înaltă rezoluţie ale N 1s pentru BSA/Fg liofilizat (a) după 5 minute (b).1 Si 36.02 10.18 0.92 43. (BSA).83 Al 2. Timpul de imersie 0 5 min 2 ore 24 ore Compoziţia elementală (% at.52 O 53. Concentraţia relativă a principalelor componente.25 27.5 13.53 N 10.02 Fe 0.96 13.a. În plus.3 0. Intensitate (u.69 11.77 15.Tabel 3. 433 .75 0. produce un semnal de azot mai intens decât proteina mai mică.01 Y 0. şi 24 ore (c) imersie în soluţiile de SBF/BSA (coloana stângă) şi PBS/Fg (coloana dreapta).a. (Fg).11 51.16 - Analizele XPS confirmă creşterea conţinutului de azot după diferite perioade de imersie. aşa cum este de aşteptat.) (c) (c) 410 405 400 395 390 410 405 400 395 390 Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV) (b) (b) Intensitate (u.a.) C 6.41 0.08 29.8 0.26 23.81 48. înainte şi după imersia în soluţiile de PBS/Fg.) 410 405 400 395 390 410 Energie de legatura (eV) (a) Intensitate (u. proteina mai mare.

În cazul probelor imersate în soluţiile cu proteină. o cantitate de 14% N.3 eV.8).) (e) (d) (c) (b) (a) 292 288 284 280 276 272 Energie de legatura (eV) 292 288 284 280 276 272 Energie de legatura (eV) Figura 7 Spectrele XPS de înaltă rezoluţie ale C 1s înainte de imersie (a). pe baza componentei BSA-ului de la 530. este un indicativ al formării unui monostrat complet de proteină [9]. evidenţiind ataşarea proteinelor la suprafaţa materialului şi totodată biocompatibilitatea materialului investigat [10-12].) (e) (d) (c) (b) Intensitate (u.) (e) (d) (c) (b) (a) Intensitate (u. 434 .a.2 eV (Fig. 2 ore (d) şi 24 ore (e) imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi PBS/Fg (B). ale C 1s pentru BSA/Fg liofilizat (b) precum şi după 5 minute (c). datorită ataşării la suprafaţă a BSA/Fg-ului cu un conţinut scăzut în oxigen faţă de compusul oxidic utilizat (Fig. 2 ore (d) şi 24 ore (e) imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi PBS/Fg (B). După imersia în soluţiile cu proteină.Potrivit rezultatelor publicate anterior privind adsorbţia proteinelor. semnalele de înaltă rezoluţie ale C 1s (Fig.8B) Astfel spectroscopia XPS a fost utilizată cu succes în acest studiu. După imersia în soluţiile cu proteine.a. ale O 1s pentru BSA/Fg liofilizat (b) precum şi după 5 minute (c). (A) Intensitate (u. conţinutul semnificativ diminuat al O 1s (Tabel 2. 7) sunt mai largi şi prezintă o formă asimetrică. fotopicul O 1s este evident lărgit şi se deplasează spre energii de legătură mai mici. (A) (B) Intensitate (u.a. 3) corespunde în mare parte oxigenului peptidic constituent al proteinelor. respectiv Fg-ului la 531.) (B) (e) (d) (c) (b) (a) 545 540 535 530 525 545 540 535 530 (a) 525 Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV) Figura 8 Spectrele XPS de înaltă rezoluţie ale O1s înainte de imersie (a).a. semnalând formarea unor noi tipuri de legături specifice carbonului în proteine [8]. în cazul Fg-ului (Tabel 3).

ce deschid noi oportunităţi în medicină. 300 şi 500°C. (b) Spectrul XPS al benzii de valenţa (Au 5d) obţinut pe aceleaşi probe. Au0 şi Auδ+.3 0. Au4f δ0 ΔE 0.6 T (°C) Au 5d T(°C) 500 δ+ 500 0.Biomaterialele dopate cu particule nano ( Au.72 şi 85.5SiO2·30. Spectrul Au4f este caracterizat de două componente spin-orbită.6 0. Au 4f7/2 şi Au 4f5/2. Acest studiu publicat recent. Aceste rezultate furnizează dovezi experimentale complete pentru corelaţia dintre dimensiunea şi structura electronică a nanoparticulelor de Au care a fost prezisă teoretic.7P2O5] tratată termic la 110.7[61.0 0.în fiecare proba. având despicarea. Deconvoluţia spectrului Au4f înregistrat pentru probele tratate termic la 300 şi respectiv 500 °C prezintă trei dubleţi la energiile de legătură: 82.6 Intensitate (u.3 0. are importanţă ştiinţifică mare datorită faptului că demonstrează foarte clar legătura care există între dimensiunea nanoclasterilor care se formează în matrice şi modificările observate în spectrul Au4f şi cel al benzii de valenţă cu creşterea temperaturii de tratament a probei.95 eV. 435 . Deconvoluţia liniilor spectrale indica prezenţa speciilor de Au Auδ+. Ag) prezintă un interes crescut datorită caracteristicilor remarcabile ale acestora. Acest tip de materiale furnizează avantaje valoroase şi în diagnosticarea cancerului sau imagistica biomedicală. Linia gri reprezintă spectrul obţinut pentru fiecare din cele trei probe fără nanoparticule de Au. atribuiţi la trei specii de Au diferite: Auδ-. ) 300 300 0.3Au2O3·99. 83. Mai jos sunt prezentate rezultatele XPS cu privire la nucleaţie şi procesul de creştere a nanoparticulelor de Au în sticla bioactivă CaO-SiO2-P2O5 tratată termic la diferite temperaturi.67 eV. Au0 şi Auδ. ΔE = 3.8CaO·7.0 16 (b) 110 (a) 92 90 88 86 84 82 110 80 12 8 4 0 Energie de legatura (eV) Energie de legatura ( eV ) Figura 9(a) Spectrul XPS obţinut pentru Au 4f pe proba 0. a. Identificarea speciilor de Au prezente în probe este foarte importantă deoarece studii recente au demonstrat faptul că toxicitatea nanoparticulelor de Au în tratamentul cancerului depinde de sarcina acestora [13].3 0. [14].0 0.

Vanea. 16. Kjellin. Benea. 8. No. A.1063/1. 180. Mocuta. Langmuir 2005. Small 7. 10. Dahl O. V. Arcangeli G. doi:10. Glasses. Bickford. Neumann. 7. R. P. R. N. J. Serro. 43. Dimitrov et al.. Phys. 9. Ponta and S. R. J. 2006. Vanea. Simon. A New Era for Cancer Treatment: Gold-Nanoparticle-Mediated Thermal Therapies. (2008) 2325 Oana Ponta. 257(2011) 2346-2352 L.C. V. Simon. M. 2009. Textor. Stenport. PhD Thesis. S. 163. et al. Solid State Ionics. 436 . Castner. Simon.. J. L. Structural characterization of some silicate xerogels and microspheres. Radu. 5. Drezek. Saramago. Simon. Neumann. G. Arvidsson. West. J Biomed Mater Res. M. 11. O. Ponta. A.L. S. Chem. E. Opt. E. Simon. 2008.. Hulshof MCCH. Martins. R. vol. E. Sul. P. 13. S. 10. Mat. A. Simon. Simon. 4.32-40. Lewinski. D. 764–76. 2. M. Michel. L. O. D.T. Gispert. Applied Surface Science. V. 55. Vanea. 169-183. 12. Kennedy. 25:323-334. B. M. J.2. Prinz. V. Gonzalez Gonzalez D. Y. Mella O. S. 21:12327–12332. Hu. XPS study of protein adsorption onto nanocrystalline aluminosilicate microparticles.P. Honma et al. F. 3. M. European Cells & Materials. 100-112 (2002). Coughlin. S1.78A:581-589. Brogueira. “Dual-Beam” Charge Neutralisation for monoXPS T. Phys. P. V. 2002. S. Appl. 6. H. Currie. of Solid State Chem. M. Ciceo-Lucacel. V. 9.. Neumann. A. Day. Pasche S. R. Y. J. J Mater Sci: Mater Med. Bibliografie 1. M. Prinz. Cavalu. Int J Hyperther 2009.3681307 14. M. December 2010 Overgaard J. Simon. S. C. 2009. A. Colaco. Adv. S. 2011 T. Cavalu. 20:1869-1879. E.

................................................ 447 3............. Milica Todea 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 m agnetic field Cuprins 1............ 441 2................. 449 4........XII...................... Bibliografie ... 447 3....... dr.......... 437 1......................................... Obţinerea şi analiza spectrelor RES ................................. Exemple de spectre RES achiziţionate cu ajutorul spectrometrului portabil ADANI PS8400 ..............................................................S.... 451 1........... Metoda constă 437 .......................2.........................................................1.3................................................................... 447 3.............................................................. Consideraţii teoretice ..... Hamiltonianul de Spin ...........1........................................................................ Caracterizarea instalaţiei experimentale RES ................................. Consideraţii teoretice Rezonanţa electronică de spin este o metodă larg utilizată în descrierea stărilor fundamentale şi caracterizarea efectelor vecinătăţii asupra nivelelor energetice ale centrilor paramagnetici........................... 438 1................................................... Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400 ............................. Interacţiunea Zeeman ..... SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ ELECTRONICĂ DE SPIN Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin C.............2..... RES este o metodă sensibilă la poziţiile atomilor în structură şi permite studiul simetriei locale.... 443 3.................. Principiul de funcţionare al unui spectrometrul RES...................................

atomii interstiţiali dintr-un cristal sau matricea unei sticle. Sisteme cu stare fundamentală de triplet (cu doi electroni neîmperecheaţi care interacţionează puternic). Prin utilizarea unor tehnici specializate variate (cum ar fi metoda capcanelor de spin şi a radicalilor nitroxidici. geologie. procesele de cinetică. Frecvenţa de ordinul gigahertzilor (GHz). procesele electrochimice. Astfel. În cazul experimentelor de Rezonanţă Magnetică Nucleară (RMN). cel mai cunoscut din această clasă este centrul F. Radicalii liberi în stare solidă. etc. Solidele. 5. suficient de depărtaţi unul de altul. De-a lungul anilor. 2].1. este folosită în cazul experimentelor RES. Ioni ai metalelor tranziţionale şi ai pământurilor rare [1. 4. 2. Aceste câmpuri de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiţilor nuclei care pot fi prezenţi în vecinătăţi (de exemplu. Aceasta se datorează faptului că momentul magnetic de spin al electronului neîmperecheat este foarte sensibil la câmpurile magnetice locale din interiorul probei. în domeniul microundelor. etc. 3.).în studiul tranziţiilor dintre nivelele electronice ale atomilor în prezenţa unui câmp magnetic extern [1. antropologie. lichidă sau gazoasă. Sisteme cu electroni de conducţie (metale şi semiconductori). Sisteme cu trei sau mai mulţi electroni neîmperecheaţi. ştiinţele medicale. sub acţiunea unui câmp de microunde cu o anumită frec438 .2]. 1. Biradicalii (molecule ce conţin doi electroni neîmperecheaţi. De exemplu. frecvenţele utilizate sunt de ordinul megahertzilor (MHz) din domeniul vizibil la cel ultraviolet. spectroscopia RES a fost cu succes aplicată în diverse domenii ca biologie. ESEEM şi ENDOR) în conjuncţie cu RES este posibil să se obţină informaţii detaliate privind unele teme de interes ştiinţific. lichidele şi gazele sunt deopotrivă accesibile spectroscopiei RES. cataliza şi reacţiile de polimerizare au fost toate studiate cu mare succes. Sistemele tipice care pot fi studiate prin RES sunt: 1. schimbul electronic. un electron prins într-o vacanţă ionică negativă. chimie. ştiinţa materialelor. astfel încât interacţiunea lor să fie slabă). 6. 7. structura cristalină. Defecte punctuale (imperfecţiuni localizate în cristale) în solide. Interacţiunea Zeeman Metoda RES constă în studiul tranziţiilor induse între două subnivele Zeeman vecine. spectroscopia RES este capabilă să furnizeze detalii de structură moleculară inaccesibile altor metode analitice. fizică.

Asemenea tranziţii corespund la o schimbare în momentul unghiular de spin de ( ± ). iar γ este raportul giromagnetic electronic. În urma absorbţiei de energie electronii trec de pe nivelul de energie inferior pe unul superior. Energia interacţiunii Zeeman a unui electron într-un câmp magnetic aplicat B este dată de relaţia: E Zeeman = − μ s ⋅ B = g ⋅ β ⋅ B⋅ M S unde β este magnetonul Bohr. iar MS este numărul cuantic mag= ± 1 2 . Diferenţa de energie în spectroscopia RES este predominant datorată interacţiunii electronilor neîmperecheaţi din probe cu câmpul magnetic produs de un magnet.este momentul cinetic de spin. Diferenţa dintre cele două direcţii ale spinului. Astfel. orientarea spinului trecând din cea paralelă cu câmpul în poziţia antiparalelă cu acesta. paralelǎ sau antiparalelǎ cu câmpul magnetic.venţă numită frecvenţă de rezonanţă [1]. Introdus într-un câmp magnetic static B. Ca urmare a acestei rotaţii electronul posedă un moment cinetic de spin S căruia i se asociază un moment magnetic μ S : → → μ S = −g ⋅γ ⋅ S → → (1) unde g este factorul Landé care pentru electronul liber are valoarea 2. ⎛ 1⎞ E↓ = −⎜ ⎟⋅ β ⋅ g ⋅ B ⎝ 2⎠ (3) Regula de selecţie pentru tranziţia unui spin electronic este Δ M S = ± 1 . Din această cauză dacă Δ M S = + 1 când un foton este absorbit M I (numărul cuantic magnetic nuclear) trebuie să rămână neschimbat pentru ca momentul unghiular total să se conserve. se cunoaşte faptul că electronul posedă o proprietate cuantică numită “spin”. Astfel. 439 . S . spinul electronului poate avea două orientări. care este privită clasic ca o rotaţie în jurul propriei axe.0023. Astfel regulile de selecţie impuse sunt Δ M S = ± 1 şi Δ M I = 0 . ecuaţia (2) poate avea doar două forme pentru o orientare dată a câmpului magnetic B: ⎛ 1⎞ E↑ = +⎜ ⎟ ⋅ β ⋅ g ⋅ B ⎝ 2⎠ . în energie. depinde de intensitatea câmpului magnetic aplicat. netic de spin care poate lua valoarea M S → → (2) β = γ ⋅ . Un foton are momentul unghiular intrinsec egal cu . efect denumit efect Zeeman.

Spectrul de absorbţie măsurat la condiţia de rezonanţă este schematic reprezentat în partea de jos a figurii. iar B câmpul magnetic aplicat. Rezultă de aici condiţia de rezonanţă: h ⋅ν = g ⋅ β ⋅ B (4) unde h este constanta lui Planck. având o frecvenţă fixă de oscilaţie ν şi deci energia (h·ν). Parametrul g determină poziţia liniei de absorbţie. Această energie.Cu alte cuvinte. de obicei se obţine de la o sursă de energie electromagnetică. 440 . De asemenea. 1) sunt reprezentate schematic energiile Zeeman funcţie de magnetizarea câmpului aplicat B. Nivelele energetice şi absorbţia de rezonanţă RES pentru interacţia Zeeman a unui electron (S = 1/2) În (Fig. Figura 1. De obicei linia de absorbţie nu este singulară apărând uneori un spectru de multipleţi datorită existenţei nucleelor magnetice în specia paramagnetică. într-un câmp magnetic exterior. figura ilustrează tranziţia între nivelul de energie inferior « spin jos » şi nivelul de energie superior « spin sus » indusă prin introducerea probei în câmpul de microunde de frecvenţă ν. ν frecvenţa de rezonanţă. în cazul unui electron neîmperecheat (S=1/2). spectrul RES măsoară energia necesară tranziţiei electronului (ΔE) între cele două nivele energetice.

HLS – este interacţiunea spin – orbită. iar ultimii doi sunt termenii ce dau structura fină.2. ƒ HC – termenul câmpului cristalin şi reprezintă influenţa câmpului electrostatic cristalin. H0 . rămân în hamiltonian numai termenul Zeeman şi termenul în D. termenul E fiind 0. Toţi coeficienţii tensoriali din expresia hamiltonianului de spin se exprimă prin matrici care pot fi diagonalizate. Hamiltonianul de Spin Fenomenul RES poate fi tratat teoretic prin două metode: tratarea clasică cu ajutorul teoriei lui Bloch şi tratarea cuantică. ƒ HN – reprezintă termenul interacţiunii hiperfine. D şi E reprezintă constantele de despicare în câmp nul. Folosind teoria perturbaţiilor se ajunge la forma bine cunoscută a hamiltonianului de spin: 1 ⎤ 2 2 2 Hs = β ⋅ ( g xx S x Bx + g yy S y By + g zz S z Bz ) + D ⋅ ⎡ ⎢S z − 3 S (S + 1)⎥ + E ⋅ (S x − S y ) (6) ⎣ ⎦ Primul termen din acest hamiltonian este aşa numita interacţiune Zeeman. axială. Hamiltonianul de spin conţine o serie de coeficienţi care sunt mărimi tensoriale. Dacă simetria este axială. respectiv rombică. Cel mai simplu formalism pentru interpretarea spectrelor RES este cel al hamiltonianului de spin. În esenţă hamiltonianul de spin este un operator echivalent care acţionează numai asupra coordonatelor de spin conducând la aceleaşi rezultate ca şi hamiltonianul total al sistemului. ƒ HZ – reprezintă interacţiunea electronului cu câmpul magnetic exterior (termenul Zeeman). ƒ HQ – interacţiunea electrostatică cu momentul de cuadrupol q al nucleului. 441 (5) ƒ ƒ ƒ . HSS – reprezintă interacţiunea de structură fină în aproximaţia de ordin II (sau termenul de despicare în câmp nul). şi anume: H=H0+HLS+HSS+HZ+HN+HQ+HD+HC unde.1. Starea unui ion paramagnetic având spinul nuclear nenul.reprezintă energia ionului liber care nu depinde de spin. introdus într-o reţea cristalină şi aşezat într-un câmp magnetic static. ƒ HD – descrie proprietăţile diamagnetice. deci depind de forma funcţiei de undă şi de câmpul cristalin. este descrisă printr-un hamiltonian compus din mai mulţi termeni [1].

Ordinul de mărime al energiei hiperfine este de 0 ÷ 10-2 cm-1. descrisă de hamiltonianul de mai sus. Acest termen reprezintă interacţiunea momentului cinetic de spin I cu momentul de spin electronic S . Tocmai această interacţiune produce structura hiperfină a nivelelor energetice de spin. BX este componenta câmpului magnetic de-a lungul direcţiei perpendiculare (x). Pentru un singur electron cu g anizotrop hamiltonianul de spin este mai complicat din cauza diferiţilor operatori ai proiecţiei spinului. cât şi Ai sunt mărimi tensoriale. în cazul unor simetrii nesferice atât g. Hamiltonianul de spin care descrie starea energetică a unui centru paramagnetic electronic în interacţiune cu n nuclee cu spinul nuclear diferit de zero va fi: H = → → ~⋅ S + S ⋅ A ⋅ I i β ⋅ B⋅ g ∑ i i =1 → → n → ~ → (10) unde. şi are următoarea formă: H = g ⋅ β ⋅ B ⋅ SZ (7) unde direcţia câmpului magnetic este aleasă ca fiind axa z. De exemplu. SZ este operatorul de spin corespunzător proiecţiei acestuia după axa z. fără interacţiuni hiperfine corespunzător ecuaţiei (4). Termenul HN (ecuaţia 5) reprezintă termenul interacţiunii hiperfine. Hamiltonianul de structură hiperfină produce o despicare simetrică a nivelelor energetice şi are următoarea formă: HN → ~ → = S⋅ A ⋅ I (9) unde A este tensorul interacţiunii hiperfine. Dacă câmpul magnetic este direcţionat paralel cu direcţia axelor moleculare atunci situaţia este identică cu relaţia (7).Cea mai simplă formă a hamiltonianului de spin este pentru un singur electron cu g izotrop. Interacţiunea dintre momentul magnetic de spin şi un moment magnetic nuclear se numeşte interacţiune hiperfină. pentru o simetrie axială hamiltonianul de spin are următoarea formă: H = g // ⋅ β ⋅ B Z ⋅ S Z + g ⊥ ⋅ β ⋅ B X ⋅ S X (8) unde BZ este componenta câmpului magnetic de-a lungul axei z (paralel). 442 .

În felul acesta în sisteme cu un electron neîmperecheat şi legătură π. având în vedere posibilităţile de absorbţie şi de a da semnal RES al sticlei obişnuite. Valoarea lui g definită prin 443 . abaterea factorului g de la valoarea 2. Pentru un electron liber. valoarea factorului g este ge = 2. Obţinerea şi analiza spectrelor RES În experimentele RES cele mai utilizate benzi de frecvenţe de microunde sunt benzile X (∼ 9. obţinând o valoare a lui Δg pozitivă sau negativă. În sistemele chimice. provocat de mişcarea orbitală. Acest câmp perturbator se poate adăuga sau scădea la câmpul exterior.5 GHz) şi Q (∼ 35 GHz). Pentru radicalii liberi. electronii neîmperecheaţi ocupă un orbital care poate fi localizat pe un singur atom sau poate fi delocalizat pe o întreagă moleculă sau pe un radical. se datorează unui slab câmp perturbator indus. pentru probe sub formă de soluţii. dificultăţi de obţinere a omogenităţii câmpului (δH/H) la frecvenţe mari.2. În expresia factorului g. Cu toate acestea în probele care conţin centri paramagnetici intervin o serie de factori care abat valoarea factorului g de la valoarea amintită mai sus. Tuburile au diametre de câţiva milimetri şi lungimi de ordinul centimetrilor. g rămâne apropiat de valoarea electronului liber. Deoarece sensibilitatea instrumentului creşte proporţional cu pătratul frecvenţei. în afara unei mărimi constante intervine o mărime care dă abaterea factorului g de la valoarea corespunzătoare electronului liber. Totuşi. Probele se introduc de obicei în tuburi şi. soluţii îngheţate. Măsurătorile RES se pot efectua pe probe gazoase. pulberi şi monocristale. ceea ce duce la scăderea sensibilităţii. momentul de spin şi cel orbital se pot combina.0023.0023. Unul din factori este datorat faptului că electronul posedă în plus un moment unghiular orbital căruia i se asociază un moment magnetic. Spectrul RES al unui centru paramagnetic cu spinul ½ este bine definit dacă se cunosc tensorii g (factorul de despicare spectroscopică) şi A (constanta de despicare hiperfină). Factorul g este o mărime tensorială caracterizată prin trei valori principale. În celelalte cazuri. rezultă că se obţine o rezoluţie spectrală mult mai bună o dată cu creşterea frecvenţei de microunde. este indicat a se folosi cuarţul. există limitări tehnice legate de utilizarea benzilor de frecvenţă ridicate: folosirea de probe de dimensiuni mici. trebuie luate în considerare contribuţiile la momentul magnetic ale mişcării orbitale a electronului. Astfel. Aceşti tensori dau cele mai importante informaţii cu privire la structura centrului paramagnetic studiat. creşterea absorbţiei o dată cu creşterea frecvenţei. notată Δg.

se poate introduce în cavitatea de rezonanţă pe lângă proba de studiat şi un etalon. mai rar scade mult sub această valoare. pentru care g = 2. Liniile de rezonanţă ale probelor solide sunt considerabil distorsionate de anizotropia factorului g sau de cuplajul dintre spinii electronici şi nucleari. pentru semnale cu g ~ 2. utilizând valorile măsurate ale frecvenţei şi câmpului la rezonanţă. De obicei se lucrează în banda X. fiind necesar un câmp magnetic de ∼ 3300 G. iar această ecuaţie reprezintă formula lui Lande.0.00 sau mai mult. În experimentele RES uzuale efectuate în undă continuă se fixează frecvenţa şi se variază inducţia câmpului magnetic aplicat. factorul g este calculat din condiţia de rezonanţă. S – numărul cuantic de spin. valoarea lui g pentru un sistem paramagnetic oarecare se calculează utilizând următoarea relaţie: g = g etalon ⋅ B etalon B proba (12) Există posibilitatea de a combina metode în care pot fi îndeplinite mai multe condiţii de rezonanţă pe lângă cele referitoare la spinul electronic. deoarece ambele depind de saturaţie [3]. 444 . Astfel. dar poate ajunge la 9. poate fi β ⋅B diferită de 2. de exemplu ENDOR (Electron Nuclear DOuble Resonance) şi ELDOR (Electron Electron DOuble Resonance). cunoscută şi sub denumirea de g efectiv (gef ). L – numărul cuantic orbital. cât şi de condiţiile experimentale. Prezenţa anumitor tipuri de interacţiuni are ca efect lărgirea sau îngustarea liniei de rezonanţă. Pentru a determina valoarea factorului g mai uşor. Valoarea lui g depinde de orientarea câmpului magnetic extern în raport cu cel electric cristalin şi este o mărime tensorială. L şi S astfel: g =1+ J ⋅ ( J + 1) + S ⋅ ( S + 1) − L ⋅ ( L + 1) 2 J ⋅ ( J + 1) (11) unde J – numărul cuantic total. Astfel. Impurităţile paramagnetice pot de asemenea distorsiona semnalul RES. Cel mai uzual radical utilizat ca etalon pentru marcarea câmpului magnetic este DPPH (difenilpicrilhidrazil).relaţia g = h ⋅ν . În ceea ce priveşte forma şi lărgimea semnalului RES. în particular prin alterarea timpului de relaxare spin-reţea. acestea sunt influenţate atât de caracteristicile fizico-chimice ale substanţei paramagnetice. Acestea sunt exemple de tehnici neliniare.00 . În acest caz valoarea factorului g depinde de numerele cuantice J.0036.

Liniile lărgite neomogen. apărute în urma unor fluctuaţii dinamice în sistemul de spini (variabile în timp).Dintre factorii instrumentali care pot influenţa forma semnalului RES. Pentru sistemele reale. saturarea sistemului de spini cu o putere excesivă. Cauzele lărgirii neomogene sunt fluctuaţii spaţiale de câmp magnetic şi sunt datorate prezenţei unor interacţiuni hiperfine.2). Liniile lărgite neomogen sunt înfăşurătoarele liniilor lărgite omogen corespunzătoare diferitelor pachete de spini. difuzia de spin. atunci când lărgirea nu este provocată de interacţiunile anizotrope. absorbind cuantele la o valoare bine determinată a câmpului magnetic. neliniaritatea amplificatorului sau a detectorului. atunci linia este lărgită neomogen. În cazul lărgirii omogene toţi spinii din probă răspund ca o unitate acţiunii cuantelor de microunde. linia de rezonanţă are în general o formă intermediară între cele două cazuri limită. fluctuaţiile datorate mişcării spinilor în câmpul magnetic local. anizotropiei tensorilor g şi de structura fină. linii care au maxime de absorbţie uşor diferite între ele datorită distribuţiei de câmp magnetic local în probă. Cauzele care determină lărgirea neomogenă sunt : interacţiunea dipolară între spinii de acelaşi tip. neomogenităţilor câmpului magnetic static. diversele scheme de modulaţie utilizate pentru a creşte detecţia. Lărgirea liniei RES poate fi omogenă sau neomogenă. sunt simetrice şi au o formă aproximativ Lorentziană (Fig.2 Forma Lorentzianǎ şi gaussianǎ a liniilor RES Dacă numai anumite grupuri de spini sau pachete de spini din probă pot absorbi direct cuantele de o frecvenţă particulară. 445 . interacţiunea dintre spinul electronic şi câmpul de microunde. Figura. dipolare dintre spini cu frecvenţe Larmour diferite. avem: neomogenitatea câmpului magnetic static B0. Această linie este îngustă în zona centrală şi are o descreştere lentă spre extreme. se apropie de o formă Gaussiană. Liniile lărgite omogen. relaxarea spin – reţea.

Valoarea factorului de despicare spectroscopică g apropiată de cea a electronului liber. arată că la radicalii liberi există o interacţiune spin-orbită foarte slabă şi electronii cu spinii neîmperecheaţi au un grad mare de localizare. intensitatea lor şi valoarea despicării hiperfine depind de numărul nucleelor cuprinse în orbita electronului paramagnetic. de faptul dacă aceste nuclee sunt identice sau nu. Numărul liniilor de structură hiperfină. caracterizate printr-un număr cuantic I. III. Fiecare radical liber are o structură hiperfină caracteristică. Când orbita electronului cuprinde cu egală probabilitate un număr n de nuclee identice.0023). 446 . structura hiperfină permite.(2In+1) linii de egală intensitate. şi de densitatea de electroni cu spini neîmperecheaţi la fiecare dintre aceste nuclee. foarte precise. spectrul va avea (2nI+1) linii de structură hiperfină.. Prin aceasta. Prezenţa unei structuri hiperfine caracteristice. care permite în multe cazuri identificarea radicalilor liberi. Factorul de despicare spectroscopică g are valoarea foarte apropiată de cea corespunzătoare electronului liber (g = 2. structura hiperfină a spectrelor RES (când este bine rezolvată) furnizează informaţii mai importante despre radicali decât valoarea factorului g. II. deoarece majoritatea radicalilor detectaţi sunt radicali centraţi pe carbon sau azot. Factorul g nu permite identificarea radicalilor liberi.În cazul radicalilor liberi generaţi prin iradiere γ în sisteme biofarmaceutice şi de interes biomedical. dar situate la intervale neegale. Lărgimea liniei este de obicei mică. În cazul când electronii paramagnetici înconjoară mai multe nuclee cu spini nucleari diferiţi. au reuşit să pună în evidenţă dependenţa factorului g de structură într-o serie de substanţe organice [2]. o serie de particularităţi [1]: I. Prezenţa structurii hiperfine la radicalii liberi se datorează interacţiunii magnetice a electronului cu spin neîmperecheat cu momentul magnetic al nucleelor cuprinse în orbita acestui electron. I. structura fină lipseşte pentru că spinul este egal cu ½ . II. determinată de numărul de nuclee cuprinse în orbita electronului şi de gradul de localizare al electronului la fiecare dintre aceste nuclee. identificarea radicalului liber studiat. căci apar (2I1+1)(2I2+1)…. iar poziţia spectrelor este aproximativ aceeaşi în câmpul magnetic [4]. în majoritatea cazurilor. Studiile efectuate au pus în evidenţă la spectrele de rezonanţă ale radicalilor liberi. descifrarea structurii hiperfine a spectrelor este destul de complicată. aşezate la intervale egale şi cu intensităţi care sunt mai mari în centrul spectrului şi descresc spre margini. totuşi unele măsurători RES.

Interacţiunea hiperfină izotropă sau interacţiunea hiperfină de contact (interacţiunea de contact Fermi). 3. spectrometrul RES se compune dintr-un electromagnet capabil să creeze un câmp magnetic static B. în general despicarea hiperfină fiind mai mare decât lărgimea componentelor hiperfine. deoarece în multe cazuri interacţiunea hiperfină anizotropă nu se rezolvă şi are ca efect doar o lărgire a liniilor de rezonanţă sau o anizotropie a formei şi lărgimii liniei. Structura hiperfină a spectrelor apare în special în cazurile când electronii cu spin neîmperecheat sunt electroni s sau σ. Interacţiunea hiperfină izotropă este partea principală a interacţiunii hiperfine în radicali liberi.1 GHz ÷ 9. o cavitate de microunde şi un sistem computerizat pentru înregistrarea şi observarea fenomenului de rezonanţă. un detector. Astfel. Principiul de funcţionare al unui spectrometru RES Funcţionarea spectrometrului se bazează pe înregistrarea într-un câmp magnetic static al polarizării induse de o probă electromagnetică în câmp de microunde datorită tranziţiilor cuantice între nivelele Zeeman ale particulelor paramagnetice. 3. are loc între nucleul cu moment magnetic nenul şi electronii cu spini neîmperecheaţi. Caracterizarea instalaţiei experimentale RES 3. Interacţiunea hiperfină anizotropă este interacţiunea de tip dipol magnetic între electronul cu spin neîmperecheat şi nucleul cu moment magnetic diferit de zero.2. De asemenea lărgimea mică a liniilor facilitează studiul structurii hiperfine. Spectrele RES se înregistrează la temperatura camerei cu ajutorul spectrometrului “ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400”. Toate aceste elemente se găsesc cuplate prin intermediul probei de studiat care se află sub acţiunea câmpului magnetic static şi al câmpului de microunde. a căror densitate la locul nucleului este diferită de zero. Structura fină lipseşte în cazul radicalilor liberi cu un singur electron neîmperecheat. III. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400 În cazul tuturor experimentelor. un generator de microunde. Lărgimea liniei fiind mică permite determinări foarte precise de concentraţie a radicalilor liberi şi separarea efectelor diferiţilor radicali prezenţi în acelaşi timp în proba studiată. măsurătorile se efectuează folosind capilare speciale de sticlă.Există două tipuri de interacţiuni hiperfine: interacţiunea hiperfină anizotropă şi interacţiunea hiperfină izotropă. care operează în banda X (9.6 GHz) şi 447 . cu lungimea de 20 cm şi diametrul interior de 1mm.1. în care se introduce proba.

Parametrii spectrometrului utilizaţi la achiziţionarea spectrelor RES sunt diferiţi. Sursa de microunde este reprezentată de un oscilator “GUNN”. Modulaţia se realizează cu un semnal de frecvenţă ν = 100 kHz. Sensibilitatea spectrometrului RES tip “ADANI PS8400” este 5×106 spin /Gauss.800mmHg) (Fig. O baleiere a câmpului este divizată în 4096 de paşi discreţi. Sursa de radiaţie electromagnetică şi detectorul de află într-o cavitate numită “punte de microunde”.3). Valorile de “offset” ale câmpului magnetic şi timpul de baleiere sunt controlate de către sistemul de achiziţionare computerizat. Factorul de calitate este dat de relaţia Q = ν res . (630 mmHg . sensibilitatea spectrometrelor creşte. Schema bloc a spectrometrului portabil “ADANI PS8400” este redată în (Fig. iar Δν lărgimea la semiînălţime a rezonanţei. Canalul de semnal cuprinde partea electronică necesară detectării senzitive în fază. computerizat.07 Gauss /cm. Spectrometrul poate opera în următoarele condiţii : temperatura mediului cuprinsă între (+18°C) şi (+28°C) . în funcţie de probele care urmează a fi studiate. Factorul de calitate Q indică cât de eficient stochează cavitatea energia de microundă.care este echipat cu un sistem de achiziţie al datelor. 4). umiditatea relativă între 20% şi 80%. 3 ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400 Cavitatea de microunde este de formă rectangulară. iar rezoluţia este de 0. 448 . lucrează în modul TE102 şi are un factor de calitate Q = 5000. “ADANI PS8400” Figura. Puntea de microunde este o cutie de metal care ajută la amplificarea semnalelor slabe provenite de la probe. Cu creşterea factorului de calitate Q. şi presiunea atmosferică (840 GPa – 1066 GPa). unde νres este frecvenţa Δν de rezonanţă.

3. Toate aceste componente lucrează împreună pentru achiziţionarea unui spectru de rezonanţă electronică de spin (RES). Exemple de spectre RES achiziţionate cu ajutorul spectrometrului portabil ADANI PS8400 a) spectrele RES ale unor probe de hidroxiapatită cu fier 449 . Rata de baleiere este controlată prin varierea timpului de aşteptare între paşii individuali.4 Schema bloc a spectrometrului “Portable ADANI PS8400” La fiecare pas. o tensiune de referinţă corespunzătoare valorii de “offset” a câmpului magnetic este trimisă către acea parte a controlerului care reglează bobinele de baleiere.Figura.3.

a.a.3 x (mol %) 70 60 g = 4.b) spectrele RES ale unor probe vitroase şi vitroceramice care conţin fier [5]: g = 4.3 x (mol %) 70 60 Intensitate (u.0 30 20 10 Camp magnetic (G) 1000 2000 3000 4000 5000 Camp magnetic (G) c) spectrele RES ale unor medicamente: spectrul experimental spectrul experimental spectrul simulat spectrul simulat 3250 3300 3350 B(G) 3400 3450 3250 3300 3350 B(G) 3400 3450 d) spectrele RES ale unor radicali liberi [6]: T im p (zile) 7 E (92 z) 5 1 E (ini) 0 3320 3340 3360 B (G ) 3380 3400 3250 3300 3350 B (G) 3400 3450 450 .) 50 40 30 20 10 1000 2000 3000 4000 5000 50 40 g = 2.) Intensitate (u.

S. 2007 451 . 352. Simon. (1965) Al. 28-29. 4. Presa Universitară Clujeană. Cluj-Napoca. Chimie Nouvelle. Rezonanţa electronică de spin. Rezonanţa electronică de spin.Ursu. Cozar. Todea. M. J. David. Rezonanţa magnetică. 2. V. O. Damian. Editura Didactică şi Pedagogică. Spectroscopic study on iron doped silica-bismuthate glasses and glass ceramics. 61-64 (1980) L. (1994) S. Dina Petrişor. 3. 6. submis la Radiation Physics and Chemistry. Non-Cryst. Study of radicalizing mechanisms of irradiated drugs (Radiosterilization of pharmaceuticals: radicals). G. (2001) A-S.S. Bibliografie 1. (2006) 2947. Bucureşti. Chiş. C.România.4. 5. Academiei R. Gamma-irradiated ExtraVit M nutritive supplement studied by EPR spectroscopy . Simon. Solids. Crucq. Nicula. 12: 1356 -1359. Ed. Crăciun. I.

.. folosită pentru caracterizarea ordinii locale şi a interacţiunilor magnetice în materiale organice si anorganice....................... pulberilor policristaline..........S.................. Spectrele RES înregistrate de asemenea în cazul: sistemelor necristaline... Rezonanţa electronică de spin este o metodă larg utilizată în descrierea stărilor fundamentale şi caracterizarea efectelor vecinătăţii asupra nivelelor 452 .....................454 4. soluţiilor congelate sau în cazul soluţiilor lichide aduc contribuţii importante cercetărilor din domeniul materialelor...... non-distructive si non-invazive.......................................453 3......a C..... Milica Todea 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 m agnetic field Cuprins 1............................. mineralogiei si geologiei........... biologiei....................... Centrii paramagnetici........................................ Introducere .. Bibliografie: ................................................. Aplicaţii ale spectroscopiei de rezonanţă electronică de spin (RES) .... Exemple de aplicaţii ale rezonanţei electronice de spin ........465 1... Introducere Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin (RES) este una dintre cele mai eficiente metode..............Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin – partea a II..... fizicii........... dr. chimiei.... care pot fi investigaţi prin RPE sunt ionii metalelor de tranziţie şi elemente ale pământurilor rare sau centrii asociaţi cu sarcinile electrice sau cu defectele neutre..........452 2....... monocristalelor...

În domeniul biologiei. NO în sisteme biologice • fotosinteza 453 . studiul materialelor.2]. geologie. biologie. 2. În domeniul fizicii • concentraţii de spin • ioni paramagnetici ai metalelor de tranziţie. Metoda constă în studiul tranziţiilor dintre nivelele electronice ale atomilor în prezenţa unui câmp magnetic extern [1. centrii de culoare. aplicaţiile industriale etc. radicali ai oxigenului. medicinii şi mediului • markeri de spin • antioxidanţi şi agenţi de contrast • oximetrie • radicali liberi în ţesuturi. nanoştiinţelor. Aceasta se datorează faptului că momentul magnetic de spin al electronului neîmperecheat este foarte sensibil la câmpurile magnetice locale din interiorul probei. mediu. RES este o metodă sensibilă la poziţiile atomilor în structură şi permite studiul simetriei locale. În domeniul chimiei • radicali liberi • cataliza • procese de oxidare si reducere • stări de triplet a moleculelor • compuşi organo-metalici şi zeoliţi • cinetica de reacţie şi reacţii de polimerizare c. pământurilor rare şi actinidelor • defecte paramagnetice. Aplicaţii ale spectroscopiei de rezonanţă electronică de spin (RES) Spectroscopia RES are aplicaţii în cadrul cercetărilor din diferite domenii cum sunt: fizică. spectroscopia RES este capabilă să furnizeze detalii de structură moleculară inaccesibile altor metode analitice. Astfel. medicină. Aceste câmpuri de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiţilor nuclei care pot fi prezenţi în vecinătăţi. Cu ajutorul rezonanţei paramagnetice electronice (RES) pot fi studiate: a. nanomateriale. chimie.energetice ale centrilor paramagnetici. deformări locale • electroni de conducţie în conductori şi semiconductori • interacţii magnetice şi cristaline • procese de recombinare la temperaturi scăzute b.

strat superficial ale nanoparticulelor magnetice • proprietăţi ale nanoparticulelor şi nanofirelor magnetice • interacţii magnetice dipolare şi de schimb: efectele dimensiunii • nanometrologie: dimensiune medie a nanoparticulelor metalice şi magnetice • caracterizare nanotuburi de carbon. metabolism şi toxicitate • factori poluanţi d.1 GHz – 9.• detecţie de droguri. geologie • detecţia radicalilor în polimeri iradiaţi şi procese de coroziune • prospeţimea uleiurilor vegetale • controlul calităţii sticlelor optice speciale • procese oxidative în vopsele utilizate în industria auto e. Exemple de aplicaţii ale rezonanţei electronice de spin Spectrele RES au fost înregistrate pe pulberi la temperatura camerei cu ajutorul unui spectrometru portabil RES “ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400”. care operează în banda X (9. fullerene şi compuşi derivaţi • proprietăţi ale conducţiei electrice şi transportului polaronic 3. nanocompozite • efecte miez interior . În domeniul nanomaterialelor şi nanoştiinţelor • efecte ale reducerii dimensionalităţii • dinamica de spin în nanomateriale. În domeniul aplicaţiilor industriale • controlul calităţii produselor alimentare iradiate • dozimetrie pentru procesele de iradiere • vârste şi datări de materiale cu aplicaţii în arheologie. În domeniul caracterizării materialelor • proprietăţi ale polimerilor • defecte în fibre optice • materiale laser • conductori organici şi anorganici cu dimensionalitate redusă • influenţa impurităţilor şi defectelor în semiconductori • proprietăţi ale noilor materiale magnetice • proprietăţi ale materialelor utilizate în spintronică. optoelectronică • manganiţi cu magnetorezistenţa colosală • supraconductori oxidici cu temperatură de tranziţie ridicată • semiconductori f.6 GHz) şi este 454 .

în timp ce liniile cu gef>2.3 x (mol %) 70 60 Intensitate (u. Liniile de la gef=2. Îngustarea liniei de 455 . 12].echipat cu un sistem de achiziţie a datelor.3 se îngustează pe măsură ce înlocuim Bi2O3 cu SiO2 (Fig. computerizat.3 este specifică tuturor sticlelor ce conţin ioni Fe3+ ca impuritate sau ca dopant în concentraţii mici [5-8]. Exemplul1. sunt reprezentate în figura 1.) 50 40 30 20 10 1000 2000 3000 4000 5000 Camp magnetic (G) Figura. Sticlele şi vitroceramicile studiate conţin ionul paramagnetic Fe3+ (3d5 6S5/2). 1 Spectrele RES înregistrate pentru probele netratate termic Caracteristicile spectrului RES pentru diferite rapoarte Bi2O3/SiO2 sunt complet similare pentru toate probele netratate termic (Fig. g = 4.0. Observăm că linia de rezonanţă de la gef=4.0 sunt atribuite ionilor paramagnetici aflaţi în poziţii caracterizate de câmp cristalin relativ puternic unde termenii de câmp cristalin sunt comparabili sau mai mari decât termenii Zeeman [9.99[xSiO2·(100-x)Bi2O3]. 1) arătând că vecinătatea ionilor Fe3+ nu depinde foarte mult de compoziţia matricilor vitroase. Dependenţa lărgimii acestor linii de la gef ≅ 4. pentru probele vitroase din sistemul 0.0 sunt atribuite ionilor paramagnetici izolaţi în poziţii caracterizate de câmpuri cristaline relativ slabe.01Fe2O3·0.a. Fe3+ Spectrele RES înregistrate. acesta fiind în stare S şi frecvent utilizat în investigaţiile RES ale sticlelor. Funcţionarea spectrometrului se bazează pe înregistrarea într-un câmp magnetic static a polarizării induse de o probă paramagnetică în câmp de microunde datorită tranziţiilor cuantice între nivelele Zeeman ale centrilor paramagnetici. 2.3 de compoziţia probelor este ilustrată în Fig. 2).3 şi o linie foarte slab rezolvată la gef ≅ 2. Linia de la gef ≅ 4. pentru care termenul Zeeman este dominant . Spectrul conţine o linie principală de rezonanţă relativ largă cu gef ≅ 4.

4. scade cu x aşa cum se observă în Fig.3 este înregistrat pentru toate probele şi lărgimea liniei este de aproximativ 200 G pentru toate compoziţiile. este caracterizată de un câmp cristalin relativ puternic şi poate fi asociat cu poziţiile fierului în reţeaua necristalină bogată în siliciu. Forma liniilor RES descrie şi dezordinea din jurul ionilor de fier rezonanţi şi caracteristicile structurale ale matricilor vitroase în care sunt încorporaţi aceşti ioni de fier. din jurul ionilor Fe3+ responsabili pentru acest semnal.0 este slab evidenţiat iar linia dominantă fiind cea de la gef ≅ 4. Acest rezultat indică faptul că ordinea la scurtă distantă.0 cât şi cea de la gef ≅ 4. 2 Dependenţa lărgimii liniilor de rezonanţă de la gef ≅ 4. atât cea de la gef ≅ 2.0. 230 220 210 200 ΔB (G) 190 180 170 160 10 20 30 40 50 60 70 x (mol%) Figura. 3) arată schimbările apărute în ordinea locală în jurul ionilor de fier. înregistrată pentru probele cu un conţinut scăzut de SiO2.3.0 în timp ce linia mai puţin intensă se situează la gef ≅ 4.3. semnalul de la gef ≅ 2. Pentru un conţinut scăzut de SiO2 (x ≤ 30) linia dominantă se găseşte la gef ≅ 2. 4.rezonanţa pentru x>20 indică o vecinătate a ionilor Fe3+ mai uniformă în sticlele bogate în siliciu. Lărgimea liniei de la gef ≅ 2. În probele tratate termic.3 de compoziţia probelor Pentru probele cu un conţinut mai ridicat de SiO2 (40 ≤ x ≤ 50) şi în cazul cărora a fost identificată prin difracţia de raze X faza cristalină Bi5. 456 . În cazul probelor cu conţinut ridicat de siliciu (60 ≤ x ≤ 70) sunt prezente ambele linii.5O9. spectrele RES ale Fe3+ (Fig. Caracteristicile spectrelor RES pentru ionii Fe3+ în probele tratate termic sunt evident modificate aşa cum se poate vedea în Fig.3.6Si0. 3. Semnalul de la gef = 4.

3 x (mol %) 70 60 Intensitate (u. este de aşteptat ca ionii Fe3+ să ocupe poziţiile Bi3+ din faza cristalină Bi12SiO20. Luând în considerare razele ionice pentru ionii Bi3+ şi Fe3+ şi starea lor identică de valentă. Remarcăm de asemenea că linia se îngustează cu creşterea conţinutului de SiO2 (Fig. până la x = 30 şi este atribuit ionilor Fe3+ situaţi în poziţii cu câmp cristalin slab cu simetrie octaedrală.g = 4.a.0 este linie rezolvată numai pentru conţinut scăzut de SiO2 .) 50 40 g = 2.0 30 20 10 1000 2000 3000 4000 5000 Camp magnetic (G) Figura. 3 Spectrele RES pentru probele vitroceramice Linia cu gef = 2. 4) ceea ce denotă tendinţa de ordonare structurală în jurul ionilor Fe3+ rezonanţi dispuşi în aceste poziţii.0 de compoziţia probelor 457 . 4 Dependenţa lărgimii liniei de la g ≅ 2. 160 150 140 ΔB (G) 130 120 110 100 90 10 20 30 x (mol %) Figura.

Linia de rezonanţă slab rezolvată atribuită ionilor de fier dispuşi în câmp cristalin slab pentru probele vitroceramice cu 40 ≤ x ≤ 50 mol % arată că doar o mică parte dintre ionii de Fe3+ sunt situaţi în poziţiile Bi3+ ale fazei δ (Bi5. pe lângă asemenea poziţii.8 2. Astfel.9 2. În probele în care se dezvoltă faza cristalină de tipul Bi2SiO5 ( x = 60. vacante de oxigen Spectrele RES înregistrate în cazul microsferelor netratate termic sunt dominate de o linie largă centrată la g ≈ 2. 2.14 x = 0.4). dacă în probele cu x = 0 şi x = 0.5 4. Exemplul 2: Gd3+ a) Analizele de rezonanţă paramagnetică electronică au pus în evidenţă compoziţii diferite ale ionilor de gadoliniu în probe cu conţinut mai mare de bismut (Fig. 6).4 (Fig.8. Acestea indică faptul că există poziţii în matricea amorfă unde ionii de Gd3+ se află în 458 .33 x = 0.33 x = 0. 10. dar se observă şi linii mici la ≈ 5.5O9.3 x = 0.8 5.0 5.6Si 0. gadoliniul ocupă poziţii in regiuni cvasicristaline în acord cu modificarea difractogramelor acestor probe. 4.3 specifică ionilor de Fe3+ în poziţii cu câmp cristalin intens din matrici necristaline. După tratamentul termic la 400oC ionii de gadoliniu ocupă poziţii în interiorul fazei cristaline de tip Bi5. Probabil că majoritatea ionilor Fe3+ să fie dispuşi în faza rămasă necristalină bogată în Si [13. 14].5O9.9 2.6Si0. vecinătatea lor fiind puternic distorsionată [3. cât şi o linie largă la g ≅ 2.0 specifică ionilor din poziţii în câmp cristalin slab dar în vecinătate distorsionată sau între care se manifestă interacţiuni dipolare [15].0 x=0 x=0 x = 0. 70) spectrele RES prezintă atât linia cu g ≅ 4. 11]. Ti3+.9 şi2. odată cu creşterea conţinutului de bismut.0 care reflectă o vecinătate relaxată în matricea amorfă.14 spectrele RES ale ionilor de Gd3+ sunt similare şi reflectă o vecinătate relaxată a acestora în matricea amorfă.5 1000 2000 3000 4000 5000 B(G) 1000 2000 3000 4000 5000 B(G) Figura 5 Spectrele RES ale probelor preparate prin metoda sol-gel Figura 6 Spectrele RES ale probelor tratate termic 30 minute la 400oC b) Gd3+.14 x = 0. 5).

0 din spectrele RES. specific matricelor policristaline dezordonate care conţin ioni de Gd3+ destul de omogen distribuiţi. care reflectă în mod direct schimbările în rata de relaxare spin-reţea şi cel mai important în dinamica medie a anizotropiei factorului g. se modifică în intervalul de temperatură investigat. iar celălalt atom de Ti se relaxează într-o configuraţie planar trigonală. 700 şi 900°C ne indică că ionii de Gd3+ sunt preponderent dispuşi în faza reziduală necristalină. care creşte în intensitate odată cu creşterea temperaturii de tratament. Prin aplicarea tratamentului termic.câmp intermediar. la g ∼ 2.0 din spectrele probelor tratate termic la 350. Se observă şi spectrul în ‘‘U’’ cu linii la g ≈ 5. 7-14).8. Lărgimea liniei de la g ≈ 2.9. Linia largă de la g ≈ 2. g ≈ 2. Unul dintre aceşti atomi de Ti captează un electron şi rămâne în configuraţia tetraedrală. g ≈ 2. În conformitate cu Kolodiazhnyi şi Petric am atribuit aceste linii vacanţelor de oxigen la titan (VTi) cu spin electronic neîmperecheat. în câmp cristalin slab. rezultat în urma relaxării structurale dar încă cu un grad mare de dezordine în jurul lor. legaţi anterior de atomul de oxigen. Spectrele RES prezintă o uşoara asimetrie a liniei de rezonanţă (se abat de la o funcţie pur Lorentziană) care poate fi explicată prin prezenţa unei anizotropii uşoare şi/sau a unui fundal de rezonanţă relativ larg de o foarte joasă amplitudine. care reflectă în mod direct schimbările în rata de relaxare spin-reţea şi cel mai important în dinamica medie a anizotropiei factorului g. suprapus peste componenta spectrală. Lărgimea liniei spectrelor RES. Spectrele RES pentru microsferele tratate termic în intervalul 350 – 1400°C sunt caracterizate printr-un semnal îngust. În timp ce atomul de O difuzează el generează doi atomi de titan cu configuraţie incomplete. în timp ce titaniul difuzează de la suprafaţă spre interior. Linia de la g ≈ 4.3 este atribuită fierului (III) şi apare datorită tuburilor de sticlă în care se pune proba pentru a efectua măsurătoarea RES. oxigenul difuzează din interior spre suprafaţă şi se formează în regiunea de sub-suprafaţă vacante de oxigen. Modificările structurale induse în probele titano-silicatice amorfe prin tratamentele termice sunt bine puse în evidenţă în spectrele RES ale probelor parţial şi total cristaline (Fig. 459 .0. se modifică în intervalul de temperatură investigat [16]. unde se formează ionii de Ti3+.

Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:1 Ti:Si 1:1 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 Figura 9 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 700°C.2. 460 .9 4.004 1.8 2. 30 minute. (a) (b) 2.3 Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:1 Ti:Si 1:1 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 Figura 7 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel. 30 minute.0 5. 30 minute. Figura 8 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 350°C. Figura 10 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 900°C. (b) 600 G.004 1.98 Ti:Si 1:1 Ti:Si 1:1 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 3000 3200 3400 B(G) 3600 3800 Figura 11 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1100°C. utilizând un baleiaj de (a) 4000 G.98 Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:2 2. 30 minute.

(a) o 1400 C o 1100 C o 900 C o 700 C o 350 C (b) 2.004 1. atribuit ionilor de Ti3+.18]. (b) 600 G. utilizand un balaj de (a) 4000 G. (a) o 1400 C 1100oC o 900 C 700oC o 350 C as-prep. (b) 2.(a) (b) Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:2 Ti:Si 1:1 Ti:Si 1:1 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 3000 3200 3400 B(G) 3600 3800 Figura 12 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1400°C. 30 minutes.98 o 1400 C o 1100 C o 900 C o 700 C as-prep. Spectrele RES ale probelor tratate termic la 1400°C sunt caracterizate doar prin semnalul din jurul valorii g∼1. utilizand un baleaj de (a) 4000 G si respectiv (b) 600 G.004 1. neexistând vacanţe de O din cauza atmosferei reducătoare.98. utilizând un baleiaj de (a) 4000 G şi respectiv (b) 600 G. 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 3000 3200 3400 B(G) 3600 3800 Figura 14 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:1 preparate prin metoda sol gel şi supuse diferitelor tratamente termice. 461 .98 1400oC 1100oC 900oC 700oC 1000 2000 3000 B(G) 4000 5000 3000 3200 3400 B(G) 3600 3800 Figura 13 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2 preparate prin metoda sol gel si supuse diferitelor tratamente termice. dar au mai fost detectaţi în literatura de specialitate [19] la temperatura camerei. Centrii de Ti3+ sunt de obicei detectaţi la temperaturi sub 120K [17.

cât şi de către Feng şi col. deoarece sistemul Ti:Si 1:1 nu prezintă modificări esenţiale.Din spectrele RES prezentate în Fig. Nakamura şi col.004 poate fi atribuit vacanţelor de oxigen.004) si Ti3+ (pentru g∼1.004) şi Ti3+ (g∼1. cel mai probabil un electron captat la o vacanţă de oxigen. În Figurile 13 si 14 sunt evidenţiate evoluţiile vacanţelor de oxigen (pentru g∼2.004 detectat pe plasma de TiO2 tratată termic provine de la un electron captat la o vacanţă de oxigen. peak-ul de la g∼2. 900 si 1100°C. în urma tratamentelor termice. Au mai fost raportate astfel de semnale RES de către Li şi col. [26] în probe de TiO2 dopat cu N.98) este similară cu cea discutată anterior. Serwicka [21] a observat un astfel de semnal la g∼2. Figura 16 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 350°C. în bună concordanţă cu literatura de specialitate şi rezultatele obţinute prin spectroscopie Raman unde a fost obţinut un semnal de fluorescenţă în cazul probelor tratate termic până la temperatura de 900°C. [20] au raportat faptul că semnalul RES la g∼2. Acest studiu este focusat în special pe efectul adiţiei oxidului de galiu în sisteme. În cazul microsferelor tratate termic la 350. iar Serpone [27] a atribuit semnalele din intervalul g = 2. Vor fi prezentate doar spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2. ambele sisteme având o dependenţă oarecum similară în raport cu tratamentul termic. În cazul microsferelor cu conţinut de galiu se dezvoltă după tratamentul termic la 1400°C o nouă faza. În cazul microsferelor preparate prin metoda sol gel. deoarece evoluţia defectelor: vacanţe de oxigen (g∼2. semnalul RES provine numai de la ionii de Gd3+. 14 se observă faptul că tratamentul termic joacă un rol important în formarea de centrii paramagnetici adiţionali. [22] la g∼2. Semnale similare au fost observate şi în TiO2 – anatase dopate cu C [22-24]. Spectrele RES evidenţiază integrarea ionilor de Ti3+ în această fază.003 pe TiO2 redus în vid şi l-a atribuit unui defect. după ce au fost folosite în teste fotocatalitice. cât si în TiO2 dopat cu B [25].98). Pentru microsferele tratate termic la 1100°C si 1400°C se observă efectul galiului în sensul prevenţiei formării vacanţelor de oxigen. Ga2TiO5. Ga2O3 Ga2O3 20% 10% 5% 1% 0% 20% 10% 5% 1% 0% 1000 2000 3000 4000 5000 1000 2000 3000 4000 5000 B(G) B(G) Figura 15 Spectrele RES ale microsferelor preparate prin metoda sol gel.13.003 – 2. în concordanţă cu difracţiile de raze X. 462 . 700.005 unui electron captat la o vacanţă de oxigen.0055 în spectrele RES în probe de titan dopat cu C.

Ga2O3 (a) Ga2O3 (b) 20% 10% 5% 1% 20% 10% 5% 1% 0% 1000 2000 3000 4000 5000 0% 3000 3200 3400 3600 3800 B(G) B(G) Figura 19 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 1100°C. Ga2O3 (a) 20% (b) 20% 10% 10% 5% 5% 1% 0% 1000 2000 3000 4000 5000 1% 0% Ga2O3 3000 3200 3400 3600 3800 B(G) B(G) Figura 18 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 900°C. (b) 600 G. 463 .Ga2O3 (a) Ga2O3 (b) 20% 20% 10% 5% 10% 5% 1% 0% 1% 0% 3000 3200 3400 3600 3800 1000 2000 3000 4000 5000 B(G) B(G) Figura 17 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 700°C. (b) 600 G. utilizand un baleaj de (a) 4000 G. (b) 600 G. utilizand un baleaj de (a) 4000 G. utilizand un baleaj de (a) 4000 G.

distanţa medie dintre ionii de gadoliniu este mai mică decât în cazul distribuţiei uniforme în întregul volum şi se confruntă cu interacţiuni magnetice puternice. considerând că gadoliniu ar fi distribuit omogen în întregul volum de probă. ceea ce înseamnă că aceştia nu sunt incluşi în reţeaua silicatică sau germanată unde au avut o vecinătate mult mai distorsionată [28]. Diferenţele observate în forma liniilor. c) Gd3+ Prin rezonanţa paramagnetică electronică a fost investigată ordinea structurală din jurul ionilor de Gd3+ si interacţiunea magnetică dintre ei.Ga2O3 (a) Ga2O3 (b) 20% 20% 10% 10% 5% 5% 1% 1% 0% 0% 1000 2000 3000 4000 5000 3000 3200 3400 3600 3800 B(G) B(G) Figura 20 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 1400°C. În acest caz. în funcţie de compoziţia matricii şi este utilă în caracterizarea locurilor în care s-ar putea distribuii alte pământuri rare neparamagnetice. Liniile largi preconizate pentru o concentraţie atât de scăzută (0. Spectrele RES ale probelor investigate sunt prezentate în figura 21. Această lărgire a liniei de rezonanţă este în mod normal atribuită interacţiunii dipol-dipol dintre ionii de Gd3+. 464 . în funcţie de compoziţia probelor. utilizand un baleaj de (a) 4000 G. Prezenţa în probe a ionilor de Gd3+ ne dă informaţii cu privire la modificările structurale care au loc în vecinătatea lor. sprijină ipoteza distribuţiei sale pe suprafaţa nanoparticulelor. unde efectul interacţiunii de schimb este clar evidenţiat [33]. dar şi dezordinii locale [29-32]. fiind mult mai grupată pentru probele cu raportul Si/Ge 1:2 şi 1:3.5% mol Gd2O3). arată că această distribuţie pe suprafaţa nanoparticulelor nu este uniformă. (b) 600 G.0 fapt ce denotă că vecinătatea ionilor de Gd3+ se confruntă cu câmpuri cristaline slabe. introduse în aceeaşi matrice. Spectrele constau din linii relativ largi cu g = 2.

Yahiaoui. 6. Typek. Japan 59 (1986) 259. 13. S. G. T. Optoelectronics and Advanced Materials. 9. M. Y. 11. Ber. Takeuchi. Todea.C. C. N.H.S. Volume 20.H.M. P. Lett. Bucureşti. Nanba. Lips. 5. Berger. S. Soc. 404 (2005) 25–29. Phys. J. Kubokawa. S.. Y.Ursu. Serwicka. A. N. 10-13 September 2001 T. R. Ardelean. 21.P. S. J.005Gd2O3·0. K. V. Seraji. 61-64 (1980) A. I. F. 7. Optoelectronics and Advanced Materials. T. Figiel. J. C. Guskos. M. Adv. Simon.J. (1993). Solids. Simon. 621-624. Chem. Mol. 1. 4. J. 947-949(3). 12. Sugihara. Coldea. Negishi. 3. Non-Cryst.Figura. A . Notz. Schlichter. W. 13 (1985) 287–293.. Thurnauer. I. Tabuchi. M. 97. M. Chimia 12 (2007) 61.S. K. Forbess. Glass Sci. Kim. 22. 2004. Phys. Cao. 23 (2010) 189-195. (1965) Al. P. J. Sci. Zhang. A. Rezonanţa electronică de spin. J. Wu. Chem. 3 (2000) 1503 I. S. Bissey. A. Glass.P. 8. 32 (1960) 668d Y. Trifunac. Tokyo. V. Simon. Ed. Number 10. Nicula. Mater. D. Witkowska. Kisch. A. Biedunkiewicz. Chem. Sakthivel. 19. Bibliografie: 1. Zinsou. 465 . 9 (2007). M. R. Hwang. M. 352 (2006) 2947.Konstantiniva. Y. Peteanu. Beziade.J. E. 90. Limmer. Non-Cryst. A. Y. Gdańsk – Poland. Simon.. J. Todea. C. A: Chem. K. Newell. J. Karkas.995[(1−x)SiO2·xGeO2] 4. Todea. M. N. 20. Solids. Academiei R. 331 (2003) 1 R. P. Non-Cryst. M. S. 27Oct. Simon. E. Phys. Castner. Rezonanţa magnetică. Simon. A. Phys. Solids 180 (1995) 151 T. 14. Li. Nguyen. 10. C. O. J. Vol. Stößer. I. Yabuta. 10. 16.-C. Guskos. Rev. Anagnostakis. Rev. Bull. Japan. P-10-011 R. Rybicki. 112. Ciorcas. Kokorin. A. Congress. E. J. V. Catal.. M. Simon. M. Ghosh. J. Sept. Journal of Materials Science Letters. 7277. Appl. S. Technol. Nakamura. 2. G. No. Anpo. Miura. 15. Kliava. Phys. S. J. A. 21. Micic. H. 2001.România. H. Kodama. 12 (2008). Colloids Surf. 99 (1955) 1222 R. Ihara. 18. Cromack. D.S. Phys. 161 (2000) 205–212. V. DiCicco. S. Spectrele RES ale probelor aparţinând sistemului 0. Zolnierkiewicz. Ioncu. Kutsuna. 3336 – 3340. Sands.J. 67 (1994) 156 S. Chem. 17.K. 6-thInternational Conference on Intermolecular Interactions în Matter. Editura Didactică şi Pedagogică. K. Glastechn. E. Lee. Pop. Holton. I. Proceedings of XX Int. Chou. J. S. 10 (2001) 5296 Pan. J. Chem.

Bruckental. Serpone. A. Phys. New J. Magn. Zarubina. R. S. Garcia. Simon. 24. Wu. Chem. Materials Science and Engineering B 172 (2010) 68–71 466 . J.A. Feng. Rogatis. T. Mater. G. V. E. Wang. J. A. Malakhovskii. Jin. T. R. 116 (2000) 83–86. R. N. Bruckental. Fittipaldi. Z. Petrakovskaja. Berger. Raftery. G. Mater. J. 32. Graziani. E. Y.V. Sun. Optoelectr. I. C 113 (2009) 15110–15123. 27. 26. Fornasiero. P.M. Rev. Zhang. Yeshurun. Fornasiero. Montini. M. D. Y. Y. Petrakovskaja. A. I. R.23. Edelman. J. Phys. N. 339 (2007) 111–123. Cosma. P. S. Melnikova. I. Edelman. Barreca. Kliava. Zhang. Berger. 272–276 (2004) 1647–1649. Kliava. Solid State Nucl.V. Yeshurun. D. E. Gombac. Reson. A. A. T. S. I.V. K. J. Bruckental. Potseluyko. 8 (2006) 99–101. J. Phys. D. Y. Y. C. Adv. Zhang. T. Malakhovskii. Yeshurun. Potseluyko. Filip. L. Z. Chem. Phys. E. I. Petrakovskaja. T. S. Diana-Louisa Trandafir. Matter 15 (2003) 6671–6681. Zarubina. V. A. B 71 (2005) 104406. 29. Montini.S. Graziani. Inorg. A. Kuznetsov. Gombac. S. S. Chem. 31. Balducci.: Condens. 30. I. Tondello. Vicario. Y. 28.F. 35 (2009) 74–81. Mag. R. A. Bratu. Kliava. Petrovskii. I. J. Ardelean. Edelman. Chim. Turcu. 32 (2008) 1038–1046. Simon. V. R. Acta 361 (2008) 3980–3987. 25. M. 33. Malakhovskii. Gil. Simon. E. Z. Potseluyko. G. Magn. M. Gasparotto. Zarubina. Solid State Commun. I. J.

.. 474 6........................... * voltametrie ciclică (CV).......... 471 4........................ de la o limită inferioară la o limită superioară a potenţialului............. există două tipuri de metode voltametrice: * voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV).. în care curnetul este măsurat ca o funcţie de potenţialul aplicat şi este utilizată la studiul cineticii reacţiei de transfer de electroni şi proprietăţile de transport ale reacţiilor......... Voltametria ciclică (sau CV) . de obicei........ testarea şi verificarea protocoalelor de practică experimentală pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice Conf...... 488 1............................................... Voltametria ciclică fără cuplu redox activ............................... aşa cum se arată in figura 1..... 467 2........Voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV) În voltametria cu baleiaj liniar de potenţial (LSV). În principal............................ Bibliografie ...................................................... ing.... METODE ELECTROCHIMICE Elaborarea............. 467 ................ Introducere Metodele electrochimice moderne oferă chimistului electroanalist o varietate de tehnici pentru a rezolva problemele analitice. 474 5.... Introducere .............................................. Voltametria ciclică cu un cuplu redox activ............................ 2...................................... potenţialul este baleiat într-un domeniu fix de potenţial cu o viteză constantă..................... dr..........................................................................XIII....... Graziella Liana Turdean Cuprins 1.......................... Voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV) .... 467 3.. Una dintre aceste metode este voltametria................

* reactivitatea chimică a speciilor electroactive. unde E este diferenţa de potenţial aplicat şi Eo este potenţial standard de electrod. Pentru a înţelege acest comportament. Caracteristicile voltamogramei înregistrate (figura 2) depind de o serie de factori. Exemplu: Rezultatul măsurătorilor de LSV este rRESezentarea grafică a curentului obţinut versus potenţialul baleiat cu o viteză constantă. Figura 2. Când potenţialul este baleiat spre dreapta (spre valori de reducere).Figura 1. Pentru sistemul Fe3+/Fe2+. ecuaţia lui Nernst este cea care prezice relaţia dintre concentraţie şi potenţial (diferenţă de potenţial). Prin urmare. Voltamograma cu baleiaj liniar de potenţial. viteza reacţiei de transfer de electroni este mai rapidă în comparaţie cu viteza de baleiaj a potenţialului. Dacă avem în vedere reducerea electrochimica a Fe3+ la Fe2+. la suprafaţa electrodului se stabileşte un echilibru identic cu cel prezis de termodinamică. În echilibrul electrochimic. unde iniţial nu este curent. unda aparută se datorează reacţiei 1. trebuie să se ia în considerare influenţa potenţialului asupra echilibrului stabilit la suprafaţa electrodului. În mod clar prin schimbarea timpului necesar pentru a baleia domeniul de potenţial se modifică viteza de baleiaj (scanare). conform ecuaţiei 2: 468 . poate atinge şi un maxim înainte să scadă. începe să apară un curent care. eventual. (1) Presupunem că scanarea începe din partea stângă a graficului curent/potenţial. * viteza de baleiaj a potenţialului. Forma semnalului de excitare în voltametria cu baleiaj liniar de potenţial. cum ar fi: * viteza reacţiei de transfer de electroni. Viteza de scanare (v) se calculează din panta dreptei din figura 1.

poziţia de echilibru se deplasează continuu în sensul conversiei reactantului. Peak-ul (vârful. Fiecare curbă are aceeaşi formă. echilibrul la suprafaţa electrodului începe să se modifice şi. datorită dimensiunilor stratului de difuzie şi a 469 . ca urmare. În această situaţie curentul începe să scadă. conform ecuaţiilor 3: (3) Aşa cum curentul creşte cu potentialul. maximul) apare deoarece la un moment dat stratul de difuzie a crescut suficient încât fluxul de reactant la electrod nu este suficient de rapid pentru a satisface cerinţele impuse de ecuaţia lui Nernst. poziţia de echilibru se modifică de la nici o conversie (la V1) la conversia completă (la V2) a reactantului la suprafaţa electrodului. Forma exactă a voltamogramei poate fi înţeleasă prin luarea în considerare şi a efectelor potenţialului şi transportului în masă. De fapt. În cazul în care se modifică viteza de baleiaj. Figura 3. apare un curent. alura voltamogramei se modifică şi ea (Figura 3). Influenţa vitezei de baleiaj asupra voltamogramelor cu baleiaj liniar de potenţial. scăderea curentului urmează acelaşi comportament ca şi cel estimat prin ecuaţia Cottrell. Când potenţialul este baleiat de la valoarea iniţiala V1.(2) Deci. dar este evident că curentul creşte cu creşterea vitezei de baleiaj. când potenţialul este baleiat de la valoarea V1 la V2.

viteza de balaiaj a potenţialului (şi. La o viteză de baleiaj mică. Cum mărimea curentului este proporţională cu fluxul spre electrod. timpul necesar pentru a înregistra o voltamogramă) influenţează puternic comportamentele observate. O altă observaţie este poziţia curentului de peak: este clar că peak-ul apare la aceeaşi valoare de potenţial (figura 3) şi aceasta este o caracteristică a reacţiilor de electrod. deoarece 470 . În aceast caz. Acest lucru evidenţiază un punct important atunci când se examinează LSV (şi CV): deşi nu există o axă a timpului pe grafic. voltamograma se va obţine mai încet. stratul de difuzie va creşte mai mult în comparaţie cu cazul în care viteza de scanare este mare. faţă de cele de la viteze de baleiaj mari. Figura 4 arată o serie de voltamograme înregistrate la o singură viteză de baleiaj pentru diferite valori ale constantei vitezei reacţiei de reducere (kred).timpului necesar pentru a înregistra voltamograma. cu cât viteza de baleiaj este mai mică. În mod clar. Prin urmare. Conditii experimentale: viteza de baleiaj identica. potenţialul aplicat nu va duce la generarea concentraţiilor la suprafaţa electrodului conform estimărilor din ecuaţia Nernst. prin urmare. valoarea curentului va fi mai mică la valori mici ale vitezei de baleiaj. reacţiile sunt menţionate ca reacţii cvasi-reversibile sau ireversibile de transfer de electroni. Voltamograma cu baleiaj liniar de potential. fluxul de la suprafaţa electrodului este considerabil mai mic la viteze de baleiaj mici. Aceste procese rapide sunt adesea menţionate ca reacţii reversibile de transfer de electroni. Pentru aceste cazuri. În consecinţă. grosimea stratului de difuzie de la suprafaţa electrodului va fi diferită în funcţie de viteza de baleiaj folosită. pentru diferite constante ale vitezei reactiei de reducere. Figura 4. care au o cinetică rapidă de transfer de electroni. În consecinţă. se poate formula întrebarea referitoare la ce s-ar întâmpla în cazul în care procesele de transfer de electroni au fost "lente" (în raport cu viteza de baleiaj a potenţialului).

poziţia curentului de peak/maxim se schimbă în funcţie de constanta vitezei de reducere (şi. Această inversare se poate produce de mai multe ori în timpul unui singur experiment. pentru a studia proprietăţile electrochimice ale unui analit într-o soluţie. în cazul CV. de asemenea. deşi potenţialul este baleiat tot între două valori (V1 şi V2). astfel. se va ajunge la potenţialul la care se va reduce produsul format în prima reacţie de oxidare şi se va produce un curent de polaritate inversă faţă de scanarea directă. dar apoi va scădea deoarece concentraţia analitului se va epuiza în vecinătatea suprafeţei electrodului. În voltametrie ciclică. peak-ul de reducere va avea o formă similară cu peak-ul de oxidare. echilibrele nu sunt stabilite rapid (în comparaţie cu viteza de baleiaj). care se încheie atunci când se ajunge la un potenţial stabilit (V2). dar spre deosebire de reacţia reversibilă.cinetica de reacţie este "lentă" şi. De obicei. când potenţialul atinge V2 sensul de baleiaj este inversat. iar curentul este măsurat între electrodul de lucru şi electrodul auxiliar. După cum se observă în voltamograma din figura 6. de viteza de baleiaj a potenţialului). Ca urmare. Acesta are loc deoarece curentul apare mai încet decât în cazurile reversibile. Curentul va creşte pe măsură ce potenţialul atinge potenţialul de oxidare a analitului. atunci curentul de peak 471 . Într-un experiment de voltametrie ciclică. în scanarea în sens direct se obţine un curent de peak pentru orice specie care poate fi oxidată în domeniul de potenţial baleiat. panta dreptei fiind cunoscută ca viteza de baleiaj (v [V/s]). ca şi în cazul voltametriei liniare. Voltamograma ciclică obţinută este rRESezentarea grafică a curentul obţinut la electrodul de lucru (i) faţă de potenţialul aplicat (E). Spre deosebire de voltametria cu baleiaj linear. Potenţialul este măsurat între electrodul de referinţă şi electrodul de lucru. potenţialul electrodului de lucru este baleiat liniar în funcţie de timp.Voltametria ciclică (sau CV) Este metoda electrochimică potenţiodinamică foarte similară cu LSV. din astfel de experimente se obţin informaţii despre potenţialul redox şi despre vitezele reacţiilor electrochimice. Voltametria ciclică este folosită. forma generală a voltamogramei înregistrate este similară cu cea de mai sus. atunci când potenţialul aplicat este invers. potenţialul de electrod este baleiat liniar faţă de timp (figura 5). În cazul în care cuplul redox este reversibil. iar potenţialul este baleiat înapoi la V1. În această situaţie. în general. Dacă transferul de electroni la suprafaţă este rapid şi curentul este limitat de difuzia speciilor spre suprafaţa electrodului. 3.

Semnalul de excitare în cazul voltametriei ciclice. Când sensul de baleiaj este inversat. poziţia echilibrului se modifică în sens invers. Curentul apare din nou datorită speciilor din soluţie care difuzează spre electrod şi are sens invers decât procesul din prima etapă. Se pune întrebarea dacă un curent poate apărea dacă nu există nici o specie în soluţia care poate transfera electroni la suprafaţă electrodului. convertind produsul (Fe2+) înapoi la reactant (Fe3+). O interfaţă electrod-soluţie. înregistrată pentru o reacţie reversibilă monoelectronică. aşa cum se arată în figura 8. În soluţie. O voltamogramă ciclică tipică. Voltamograma ciclică pentru un rectant participând la o reacţie monoelectronică de transfer de electroni. iar pentru descrierea sistemelor electrochimice se preferă acest model 472 . Când potenţialul electrodului este variat. Curentul de la suprafaţă este generat prin transferul de electroni de la electrod la speciile redox. la potenţialul de interes? Răspunsul este că un curent tranzitoriu poate circula deoarece interfaţa electrod-soluţie se va comporta ca un condensator. Răspunsul la baleiajul în sens direct este identic cu cel de la LSV. Reacţia de electrod şi capacitatea electrodului Figura 7 descrie procesul care are loc în reacţii de electrod simple. curentul este transportat prin migraţia ionilor. ionii se mişcă spre suprafaţa electrodului pentru a forma un strat dublu electric. în absenţa unui cuplu redox nu este un condensator cu plăci paralele pur. Figura 6. Figura 5. În cazul reducerii. este prezentată în figura 6. ci se comportă mai degrabă ca şi cum ar fi. Această relaţie este descrisă de ecuaţia Cottrell.(vârf) va fi proporţional cu rădăcina pătrată a vitezei de scanare. primeşte un electron şi difuzează de la suprafaţă. specia (Ox) capabilă de a primi un electron de la electrod difuzează spre suprafaţă.

se diferenţiază ecuaţia (1) în raport cu t şi presupune că capacitatea este o mărime constantă: dQ dE =C dt dt (6) 473 . iar A este aria de electrod. Figura 8. Cea mai simplă descriere a capacităţii electrochimice este dată de modelul Helmholtz: C εε 0 = A (5) unde: ε este constantă dielectrică a materialului de separare a plăcilor. numim această mărime curent de încărcare. Destul de logic (şi fără imaginaţie). pentru un condensator cu plăci paralele. Figura 7. Pentru a calcula mărimea acestui curent. Schema stratului dublu electric. Capacitatea este un factor esenţial în experimentele electrochimice pentru că dă naştere la un curent în timpul de încărcare al condensatorului. Acest model nu descrie în mod adecvat toate interfeţele electrochimice dacă capacitatea depinde atât de potenţial. cât şi de electrolitul suport. Sistem electrochimic care include transferul de electroni şi circuitul echivalent corespunzător.care permite să se înţeleagă comportamentul electrozilor în absenţa unui cuplu redox. sarcina condensatorului (Q) este proporţională cu căderea de tensiune în condensator (E): Q=CE (4) Constanta de proporţionalitate C este capacitatea mediului. ℓ este distanţa de separare între plăcile paralele. εo este permitivitatea spaţiului liber. Astfel.

iar când se opreşte scanarea. Curentul faradaic depinde de doi factori: cinetica transferului de electroni şi viteza la care specia redox difuzează spre suprafaţa electrodului. atunci când se aplică o treaptă de potenţial. Figura 9. care se menţine atât cât se menţine variaţia de potenţial. Experiment de voltametrie ciclică. 474 . în absenţa speciei redox active. La inversarea vitezei de scanare. prin măsurarea curentului de încărcare la o anumită viteză de scanare. Voltametria ciclică fără cuplu redox activ Dacă se consideră cazul foarte simplu al voltametriei ciclice. Voltametria ciclică cu un cuplu redox activ Deşi curenţii capacitivi în voltametrie ciclică sunt o realitate. se obţine: I = C*v (7) Prin această derivare simplă. Astfel. De obicei. se poate determina capacitatea sistemului. se obţine o expresie pentru curentul de încărcare în stare staţionară. voltamograma obţinută are forma din figura 9b. curentul revine la zero. 5. Dacă nu există nici o posibilitate de transfer de electroni între soluţie şi electrod (nu există un cuplu redox). Curentul atinge o stare de echilibru. se vor folosi condiţii în care curentul capacitiv este mic în comparaţie cu curentul de transfer de electroni (denumit curent faradaic). curentul îşi schimbă semnul.Identificând dQ/dt ca o expresie a curentului şi dE/dt cu viteza de baleiaj a potenţialului (v). puterea reală a acestei tehnici constă în capacitatea sa de a investiga mecanismul reacţiei de electrod. şi se aplică semnalul de excitare a potenţialului având forma din figura 9a. Rezultatul excitării sistemului este o creştere bruscă a curentului din cauza schimbării bruşte a vitezei de scanare (ν). 4. în care nu este prezent nici un cuplu redox activ (experimentul prezentat în figura 9). atunci acest curent este singurul care va fi observat.

. curentul i care este măsurat când potenţialul scade va fi direct proporţional cu fluxul speciilor oxidate care difuzează spre suprafaţa electrodului. cu cât este mai mare gradientul de concentraţie. concentraţia de Fe(CN)63. Dacă presupunem că concentraţiile de la suprafaţa electrodului sunt reglementate prin ecuaţia lui Nernst. 706 şi Anal. C* este concentraţia de specie oxidată în volumul soluţiei. (Detalii cu privire la simulări în voltametria ciclică pot fi găsite în Anal.trebuie să scadă la suprafaţa electrodului.→ Fe(CN)6 4. 37. Se poate observa că. 1351). Chiar şi în cazul asumării comportamentului nernstian. rRESoducerea fidelă a voltamogramei cuplului Fe(CN)63-/4(figura 6) necesită o soluţie analitică la două ecuaţii diferenţiale. Interpretări calitative. 36.356 V vs. concentraţia de specii oxidate la suprafaţă va scădea odată cu negativarea potenţialului. (dC/dx)x=0 este gradientul de concentraţie la suprafaţa electrodului. prin reacţia de reducere la Fe(CN)64-. 475 . Chem. 1964. care participă la reacţia 8 a cărei cinetică de transfer de electroni este destul de rapidă. Chem. εo’ = 0.Pentru cuplul redox Fe(CN)63-/4-. prin urmare. ENH (8) (9) E = E o' − 0. Presupunând că viteza de transfer de electroni este foarte rapidă. cu atât este mai mare curentul catodic. cu atât este mai mare fluxul J şi. şi Cx=0 este concentraţia sa la suprafaţa electrodului. După cum se observă din ecuaţia 11.şi Fe(CN)64.respectă ecuaţia lui Nernst 9: Fe (CN)6 3.. conform ecuaţiei 10. 1965. concentraţiile de Fe(CN)63. deoarece potenţialul aplicat devine mai negativ. conform ecuaţiei 10: i=nFAJ Fluxul este guvernat de legea lui Fick: (10) (C * −C x = 0 ) ⎛ dC ⎞ ≅D J = −D ⎜ ⎟ Δx ⎝ dx ⎠ x = 0 (11) unde: D este coeficientul de difuzie a speciilor.+ 1 e. x este distanţa de la suprafaţa electrodului.0592 log 4− [Fe(CN)6 ] − [Fe(CN)3 6 ] unde: E este potenţialul aplicat şi E0’ este potenţialul formal de electrod. aşa că se presupune că la suprafeţele electrodului.

Cu cât scade gradientul de concentraţie. în cadrul experimentului de CV (numai baleiaj negativ). Dacă se inversează potenţialul de scanare (nu este arătat în figura 10). În momentul în care se aplică un potenţial. prin urmare. Dacă se va continua negativarea potenţialului. Parametrii electrochimici caracteristici. Această concentraţie mai mică la suprafaţă dă un gradient de concentraţie mai mare (cel puţin iniţial). În cele din urmă. În acelaşi timp. dar concentraţia de suprafaţă începând să crească. iar soluţia are concentraţia uniformă din faza de volum C*. cu atât va scădea fluxul spre suprafaţa electrodului şi curentul va începe să scadă. nu există nici un gradient de concentraţie. concentraţia speciei oxidate se epuizează la suprafaţă. încă mai există un strat epuizat de specie oxidată. faza de volum a soluţiei care este epuizată în specia oxidată va creşte şi gradientul de concentraţie va începe să scadă. Apoi sistemul va trece prin intermediul profilelor de concentraţie similare pentru speciile reduse. 11). Se va obţine un curent de peak negativ şi apoi curentul va scădea în amplitudine. Profilul de concentraţie la diferite momente de timp. Toate acestea vor duce la obţinerea unei curbe curent-potenţial care are forma din figura 11. Alura voltamogramei ciclice pentru o reacţie electrochimică nernstiană. Figura 10. 476 . fluxul spre suprafaţă şi. vom ajunge la o regiune unde curentul anodic începe să domine (figura 11). curentul va scădea în continuare. Figura 11. cu cât epuizarea stratului de specie redusă va creşte. curentul catodic vor fi mai mari. astfel încât în conformitate cu legea de difuzie a lui Fick (ec.Schimbarea gradientului de concentraţie pentru regiunea catodică din voltamograma ciclică este prezentată în figura 10. Înainte ca un potenţial să fie aplicat la electrod (t = 0). concentraţia speciilor oxidate la suprafaţa electrodului va tinde spre zero.

Simulările cantitative arată mai multe aspecte pentru un sistem nernstian. la 25 °C: ip = (2.687 *105) n3/2 A D1/2 v1/2 C* (13) unde: ip este curentul de peak (în A). conform reacţiei 12: Ox + e- → Red (12) Toate voltamogramele reversibile arată la fel şi au forma tipică indicată în figura 11. De asemenea. care se cuantifică conform figurii 11. Un peak reversibil se obţine atunci când un analit este redus sau este oxidat pe un sens al baleiajului de potenţial şi apoi este reoxidat sau redus pe sensul invers al baleiajului. 13). v este viteza de baleiaj (în V/s) şi C* este concentraţia în faza de volum a speciei (în mol/cm3). este foarte de dorit ca analitul să prezinte peak-uri reversibile. Analitul trebuie să fie o specie redox în domeniul de potenţial experimentat. Următorii parametrii sunt folosiţi pentru a caracteriza voltamograma ciclică a unui proces reversibil: a. Proces redox reversibil Utilitatea voltametriei ciclice este foarte dependentă de analitul studiat. D este coeficientul de difuzie (în cm2 s-1). Curentul de peak într-o voltamogramă ciclică care conţine o singură specie este descrisă de ecuaţia Randles-Sevcik (ec. Dacă un sistem redox rămâne în echilibru pe întreg domneiul de potenţial scanat. procesul redox este numit reversibil (echilibru impune ca concentraţiile de suprafaţă de Ox şi Red să fie menţinute la valorile prezise prin ecuaţia Nernst). Chiar şi cuplurile reversibile conţin suprapotenţiale de polarizare şi astfel prezintă o histereză între potenţialul absolut de reducere (Epc) şi de oxidare (Epa). O descriere teoretică a suprapotenţialului de polarizare este inclusă în ecuaţia Butler-Volmer şi ecuaţia Cottrell. la 25 oC. Acest suprapotenţial reiese dintr-o combinaţie a vitezelor de difuzie a analitului şi bariera intrinsecă de activare a transferului de electroni de la electrod la analit. la toate vitezele de scanare. Parametrii importanţi pentru o voltamogramă ciclică sunt potenţialele de vârf (Ep ) şi curenţii de vârf (ip). A este aria electrodului (în cm2). În 1964. Separarea potenţialului de peak ΔEp (= Epc .Caracterizarea Aceasta a fost o descriere foarte calitativă a voltametriei ciclice.Epa) = 59/n [mV]. n este numărul de electroni transferaţi. Nicholson şi Shain au efectuat simulări cantitative ale voltametriei care au dus la schimbări majore în domeniul electrochimiei. Este foarte dificil pentru a atinge o sepa477 .

poate fi explicată ca şi în cazul LSV. se pot determina informaţii termodinamice. Raportul curenţilor de peak este unitar (ipa/ipc = 1) la toate vitezele de scanare. Curenţii de peak (ip) sunt proporţionali cu rădăcina pătrată a vitezei de scanare (v).rare a peak-urilor în valoare de 59/n [mV]. funcţia ip/v1/2 este independentă de v. în experimentele de stripare sau în prezenţa unui fenomen de nucleaţie. cât şi de transportul de masă. c. este de 56. Procese redox cvasi-reversibile Pentru sistemele cvasi-reversibile (cu 10-1> k °> 10-5 cm/s). În cazul în care valorile constantelor de difuzie pentru speciile oxidate şi reduse sunt similare. Aceasta este o funcţie de pregătire a electrozilor. valoarea Eo’ poate fi estimată ca media aritmetică a valorilor potenţialelor de peak anodic şi catodic (Eo’ = (Epa + Epc )/2). g. ilustrat în figura 12. b. ca funcţie de grosimea stratului de difuzie. Diferenţa între potentialul de peak (Ep) şi potentialul la care curentul este jumătate decât la Ep. Influenţa vitezei de baleiaj asupra voltamogramelor ciclice ale unui cuplu redox monoelectronic reversibil. curentul este controlat atât de transferul de încărcare. precum şi de viteză de scanare). Poziţia potenţialului de peak nu se modifică cu viteza de scanare. Figura 13. 478 . Influenţa vitezei de scanare asupra curentului pentru un transfer de electroni reversibil. cum ar fi: potenţialul de semi-undă (E01/2). (Ep/2). Figura 12. pe majoritatea electrozilor solizi. d. e. Voltamograma pentru o reacţie cvasi-reversibilă pentru diferite valori ale constantelor vitezelor de reducere şi de oxidare. Acest raport poate fi perturbat pentru cuplurile reversibile în prezenţa unei reacţii chimice. Atunci când se obţin peak-uri reversibile. iar conform ecuaţiei 13.5/n [mV] la 25 °C. f. (Se consideră o valoare mulţumitoare aceea de 70 mV. unde: n este numărul de electroni transferaţi.

1) Cinetica transferului de electroni lent Aşa cum s-a menţionat anterior. la valorile cerute de ecuaţia lui Nernst. atunci procesul se spune că este cvasi-reversibil. se poate demonstra rolul esenţial pe care îl joacă curăţenia electrodului prin compararea voltamogramelor obţinute cu electrodul curat şi modificat. care scade când cuplurile redox nu sunt în măsură să ajungă la suprafaţa electrodului.Forma voltamogramei ciclice este funcţie de raportului k°/(πνnFD/RT)1/2. Când se efectuează o voltamogramă ciclică pe un electrod modificat cu un monostrat auto-asamblat. Cu toate acestea. potenţial de peak în comparaţie cu un sistem reversibil. viteza de transfer de electroni are o şansă mai mare de a fi mai rapidă. comparativ cu difuzia. reversibilitatea impune ca cinetica de transfer de electroni să fie suficient de rapidă pentru a menţine concentraţiile de suprafaţă ale Ox şi Red. reversibilitatea depinde de valorile relative ale constantelor de viteză a transferului de electroni eterogen (ks) şi viteza de schimbare a potenţialului (viteza de scanare. sistemele devin mai lente şi sunt apte să prezinte control cinetic. Pe măsură ce acest raport creşte. Comportamentul unui electrod se poate apropia de cel al un sistem nernstian prin încetinirea vitezei de scanare. În aceste cazuri se observă că separarea de peak este o funcţie de viteză constantă a transferului de electroni. De asemenea. procesul se apropie de cazul reversibil. Cu cât curentul este mai mic. În general. Prin urmare. Dacă raportul ks/v este suficient de mic încât concentraţiile nernstiene nu pot fi menţinute. sistemul va prezenta un comportament ireversibil. Un proces cvasi-reversibil se caracterizează prin: A) Separarea potenţialelor de peak are o valoare care depaşeşte 58/n mV şi care creşte cu creşterea v (ΔEp > 58/n mV). v). Deviaţiile de la comportamentul reversibil sunt identificate prin variaţii de la parametrii expuşi anterior (a-g). Atâta timp cât reversibilitatea depinde de valoarea raportului ks/v. este posibil ca în scopul de a schimba un proces cvasi-reversibil într-unul reversibil să se micşoreze viteza de baleiaj v (ceea ce permite ca într-un timp mai îndelungat concentraţiile superficiale să se ajusteze la noile valori ce479 . voltamogramele unui sistem cvasi-reversibil sunt mai extinse şi prezintă o separare mai mare. Sistemele nernstiane de transfer de electroni la electrod complete sunt greu de găsit în practică şi moleculele redox-active sunt adesea destul de lente. pentru valori mici ale acestuia. Există două cazuri de comportament ireversibil descrise mai jos. dacă electrozii nu sunt curăţati (sau sunt acoperiţi cu monostraturi).

prima curbă prezintă cazul în care constantele de viteză ale proceselor. separarea potenţialelor de peak nu mai este fixă. B) Din păcate. afectată de reacţii chimice care urmează după transferul de electroni. C) Atunci când peak-urile sunt semi-reversibile. Din nou. În plus. ks poate fi calculată din variaţiile Ep cu v. de asemenea. prin urmare. curentul de peak variază în funcţie de rădăcina pătrată a ratei de scanare. acest lucru poate fi înţeles în termeni de echilibru la suprafaţă care nu este stabilit atât de rapid.rute de schimbările de potenţial). În mod similar cu cazul de reversibilitate. cât şi de reducere sunt încă rapide. dar variază în funcţie de viteza de scanare. Prin analizarea variaţiei potenţialului de peak. valoarea ΔEp rezultată creşte cu creşterea curentului. Prin urmare. atunci mai mult Red trebuie generat pentru a compensa pierderea de Red. În aceste cazuri. De exemplu. în cazul în care reducerea de la Red la Ox este urmată de conversia lui Red la P. Dacă această valoare este mare. prin compensare electronică cu feedback pozitiv şi prin manipularea ulterioară a datelor. 2) Reacţiile chimice ale Ox şi Red Valorile de echilibrul pentru Ox şi Red pot fi menţinute în timpul unui experiment de voltametrie ciclică. ΔEp depinde de valoarea ks/v şi. în timp ce valoarea ks este independentă de concentraţia de analit). Cele două efecte pot fi distinse prin varierea concentraţiei de analit (scăderea potenţialului datorită rezistenţei necompensate a soluţiei şi astfel. În plus. cauzată de rezistenţa necompensată a soluţiei (Ru). creşterea ΔEp cu creşterea v poate fi. este posibil să se determine mai multe informaţii. în special despre procesul cinetic care urmează după cel electrochimic. când constantele de viteză sunt reduse. 480 . raportul ipa/ipc este mai mic decât unitatea (din moment ce doar o parte din moleculele care au fost reduse prin baleiajul direct sunt disponibile pentru reoxidation prin baleiajul invers). potenţialele de peak se deplasează spre valori mai pozitive/negative. În figura 13. Efectul unei reacţii chimice depinde de valoarea raportului k/v (unde k este constanta de viteză a reacţiei chimice). viteza de reducere creşte şi potenţialul de peak (Epc) se deplasează spre o valoare mai pozitivă. cu toate acestea. Efectul Ru poate fi minimizat printr-un design experimental atent. de asemenea. atât de oxidare. Valoarea curentului poate fi. adică raportul ipa/ipc este diferit (mai mare sau mai mic) de 1. în funcţie de viteza de scanare este posibil să se obţină o estimare pentru constantele vitezelor de transfer de electroni. dacă ambele specii Ox şi Red sunt stabile în timpul experimentului.

b. în timp ce un efect mai redus apare în cazul în care acest raport este mai mic. cel mai frec481 . raportul dintre curentul de peak faradaic şi curentul de încărcare scade cu creşterea v (în timp ip este proporţional cu v1/2). atunci constantele de viteză pentru aceste procese nu pot fi calculate folosind metode de simulare. cu toate acestea el necesită adesea existenţa de cantităţi egale de analit. Într-adevăr. De asemenea. plasând o limită superioară a lui v decât poate fi utilizată. fie prin investigarea efectului vitezei de baleiaj asupra raportului ipa/ipc. Deşi voltametria ciclică este foarte utilizată pe scară largă pentru caracterizarea speciilor redox (de exemplu: potenţiale redox şi stabilitatea diferitelor stări de oxidare) şi de investigare calitativă a reacţiilor chimice care însoţesc transferul de electroni. exprimat prin vCdl (unde: Cdl este capacitatea la interfaţa electrodului de lucru). Valoarea lui k poate fi calculată fie prin studii de simulare. Efectele transferului eterogen de electroni lent şi reacţiile chimice nu pot fi separate. Când peak-urile sunt ne-reversibile este imposibil să se determine parametrul E01/2. voltameteria ciclică nu poate determina dacă peak-ul este la potenţialul său termodinamic sau s-a deplasat la un potenţial mai extrem. există o serie de dezavantaje inerente în cadrul acestui procedeu: a. voltametria ciclică este foarte potrivită pentru o gamă largă de aplicaţii. Dacă ambele efecte sunt prezente. există diferenţe considerabile în ceea ce priveşte parametrii voltamogramei. Acest fapt restrânge limita de detecţie la aproximativ 10-5 M. în unele domenii de cercetare. Dacă este acesta cazul. Procese redox ireversibile (control de transfer de sarcină) În cazul transferului de electroni ne-reversibil. prin cresterea v. datorită unui suprapotenţial. Prin urmare. Acesta poate fi însă determinat. este posibil să se elimine efectul reacţiei chimice (deci să se restabilească reversibilitatea). Cuplul redox ar putea fi ireversibil din cauza unui proces chimic care urmează. în ambele stări de oxidare. este posibil ca peak-ul să fie ireversibil din cauza unui proces fizic. voltametria ciclică este una din tehnicile standard utilizate pentru caracterizare. un exemplu comun pentru metale tranziţionale este o schimbare în geometria sferei de coordonare. atunci viteze mari de scanare pot arăta peak-uri reversibile. În plus. În ciuda acestor limitări.atunci reacţia chimică are un efect semnificativ. Când un peak este ne-reversibil. Există un curent rezidual de încărcare în timpul experimentului.

Această stratificare a analitului poate izola suprafaţa electrodului. Figura 14. evidenţiind propria activitate redox în scanările ulterioare sau. De obicei. Combinaţia dintre solvent. poate modifica 482 . este uzual pentru analitul redus sau oxidat să precipite pe electrod. cu toate acestea. o formă de precipitare. de obicei. Unele speculaţii pot fi făcute în ceea ce priveşte peak-urile ireversibile. În timpul voltametriei ciclice. Agitarea soluţiei între trasarea voltamogramelor este importantă pentru ca să furnizeze suprafaţei electrodului analit proaspăt în fiecare nou experiment. după reducere sau oxidare.vent. de asemenea. Condiţii experimentale Metoda utilizează o combinaţie de trei electrozi: electrodul de lucru. electrolit şi electrodul de lucru specific determină intervalul de potenţial baleiat. ca o parte din analit să rămână. un electrod de referinţă şi un contraelectrod (figura 14). electrolitul este adăugat la soluţia de testat pentru a asigura o conductivitate suficientă. sarcina analitului. cel puţin. acolo unde poate afişa în continuare activitate redox. Celula electrochimică pentru experimentul de voltametrie liniară sau ciclică. Deoarece voltametria ciclică modifică. electrozii sunt statici şi aşezaţi în soluţii negitate. Solubilitatea unui analit se poate schimba drastic dacă se schimbă sarcina totală a acestuia. Această metodă permite. ele sunt în general în afara domeniului de aplicare al voltametriei ciclice. Această metodă cu soluţie staţionară are ca şi consecinţă apariţia caracteristicilor de peak controlate de difuzie.

sub numele de electrod auxiliar. Celula electrochimică conţine 10 ml soluţie de analit şi este echipată cu 3 electrozi: electrod de lucru din grafit. ceea ce duce la denaturarea formei voltamogramei. având doar un disc expus la unul dintre capete. Pentru interpretarea rezultatelor de voltametrie ciclică este important ca electrodul să posede o arie a suprafaţei controlată cu o formă definită. fluxul spre suprafaţa electrodului este realizat prin agitare. Din acestea sau alte motive. ipa/ipc. Remarci Voltametrie ciclică nu este o tehnică hidrodinamică. Reacţiile care apar la suprafaţa contraelectrodului sunt lipsite de importanţă. ceea ce le limitează la voltametria cu baleiaj liniar de potenţial. Pentru a minimiza curentul şi rezistenţa. care au ca rezultat creşterea rezistenţei. în general. atâta timp cât este asigurată o conducţie bună a curentului. Electrozii de referinţă uzuali sunt cei de calomel sau de Ag/AgCl saturaţi cu KCl.şi să se determine parametrii electrochimici: Eo’. Utilizând voltametria ciclică să sa investigheze comportamentul cuplului redox Fe(CN)63-/4. uneori separaţi de soluţia testată prin capilare Luggin care să împiedice infestarea electrolitului cu KCl. contraelectrodul de platină şi electrodul de referinţă Ag/AgCl/KClsat. Vitezele mari de scanare creează peak-uri având intensităţi mari de curent. Materialele uzuale pentru electrozii de lucru sunt: cărbunele sticlos. 483 . pot fi folosiţi ultramicroelectrozi. pompare a soluţiei sau rotaţia electrodului. Un electrod de lucru obişnuit are o rază de un ordin de mărime de câţiva mm. platina şi aurul. de asemenea. precum şi D. Exemplu Se realizează o soluţie de hexacianoferat de potasiu 0. Aceşti electrozi sunt. Contraelectrodul cunoscut. ΔEp. Într-o tehnică hidrodinamică. încastraţi într-un material izolator inert. cum este în cazul electrozilor disc-rotitor şi disc-inel-rotitor. care apar oricum indiferent dacă baleiajul se face dinspre valori pozitive sau negative. Aceste tehnici ţintesc condiţiile de stare de echilibru. poate fi orice material care conduce cu uşurinţă şi nu va reacţiona cu volumul soluţiei.5 mM K3Fe(CN)6 prin dizolvarea cantităţii corespunzătoare de sare în 100 ml de KCl 1 M.suprafaţa electrodului. Pentru a executa experimente de voltametrie ciclică la viteze de scanare mari este insuficient un electrod de lucru obişnuit. Pentru a menţine curentul observat la contraelectrod. adesea este necesară curăţarea electrozilor între scanări. se vor oxida sau reduce adesea electrolitul sau solventul.

se fixează şi parametrii pretratamentului (depinde de sistemul studiat).Procesele de electrod sunt: reducere: oxidare: [FeII(CN)6]3. În fereastra «Edit Procedure» se fixează parametrii experimentului: potenţialul de start. numărul de cicluri şi viteza de baleiaj. Olanda) pilotat de computer (figura 15). Eventual. Figura 16. La rularea softului GPES se deschid 3 ferestre (figura 16). Potenţiostat Autolab PGStat 10.+ e. Softul GPES pentru pilotarea potenţiostatului. după ce s-a dat comanda “Start”. 484 . potenţialul de întoarcere.+ e(13) (14) Aparatura folosită este un potenţiostat Autolab PGStat 10 (EcoChimie. Figura 15. În fereastra «Manual Control» se bifează toată gama de curenţi pentru ca rRESezentarea grafică on-line să se autoscaleze. În fereastra «Data presentation» va apărea voltamograma on-line.→ [FeIII(CN)6]4[FeII(CN)6]4.→ [FeIII(CN)6]3.

00050 anodic catodic 1E-3 0.253 Ipa (A) 1. -0.6 10 E/ V vs. care scade exponenţial cu timpul.2 0.1 M. KClsat.253 0. Curentul obţinut (figura 19) are două componente: un curent datorat încărcării stratului dublu (figura 20) şi altul datorat transferului de electroni.023e-4 2. tampon fosfat 0. Ca şi toate tehnicile cu puls de potenţial. Tabelul 1.00025 -0.0 0.818 Din datele prezentate în tabelul 1. curentul faradic rezultat la electrod este monitorizat ca funcţie de timp. Din panta rRESezentării log I vs log v (figura 18) se stabileşte puterea lui v şi astfel se verifică posibilitatea de a utiliza ecuaţia Randles-Sencik pentru calculul coeficientului de difuzie.1 M. Cronoamperometrie Cronoamperometria este o tehnică electrochimică în care potenţialul electrodului de lucru este variat după un semnal tip treaptă.00050 -0. -0.1 V/ Ag/AgCl. 2 cicluri. tampon fosfat 0. cronoamperometria generează un curent mare. Dependenţa log I vs. pH = 6. Condiţii experimentale: electrolit. pH = 6.050 0. reversibile (conform Anexei 1).255e-4 -2.00000 0. Condiţii experimentale: electrolit. KClsat log v Figura 17.254e-4 Ipc (A) -1.8.0188:1)-Nafion în 5 mM K3[Fe(CN)6] + 1 M KCl.8. 485 . Ag/AgCl. potenţial de start.303 0.1 V/ Ag/AgCl.Pentru sistemul studiat. Log v pentru electrodul CV/NP (0.00075 20 mV/s 50 mV/s 70 mV/s 100 mV/s 200 mV/s 0. la diferite viteze de baleiaj. KClsat.4 0.278 ΔEp (V) 0. se observă ca mărimile ΔEp şi ipa/ipc au valori care plasează sistemul studiat în cazul sistemelor monoelectronice. Figura 18.00075 log I 1E-4 I/A 0. 2 cicluri.0188:1)-Nafion în 5 mM K3[Fe(CN)6] + 1 M KCl. se obţin voltamogramele din figura 17. Voltamograma ciclică pe CV/NP (0. potenţial de start.815 0.278 0. ca orice circuit RC.753e-4 Eo’ (V) 0. 0. v (mV/s) 50 100 Epa (V) 0.050 ipa/ipc 0.00025 -0. Parametrii electrochimici ai sistemului studiat în figura 17.303 Epc (V) 0.

Această situaţie este prezentată în Figura 21. concentraţia de Ox din vecinătatea electrodului este redusă la zero faţă de concentraţia iniţială. se extinde. dar în sens opus există pentru Red. ∂Ci/∂x. Aşa cum s-a discutat anterior. Aceasta duce la formarea unui gradient de concentraţie pentru Ox. unde este imediat redusă la Red.: 1 mM. Cronoamperograma Figura 20. potenţialul este modificat după un semnal de tip treaptă până la o valoare semnificativ mai negativă decât E0’ pentru cuplu redox (Es). Un gradient similar. cu atât stratul de difuzie sărăcit în Ox. pe măsură ce trece timpul. La un moment t0. iar forma Ox din vecinătatea electrodului este imediat transformată (după o cinetică reversibilă) la forma Red.Figura 19. Profilul curentului stratului dublu electric Considerând o situaţie în care un electrod solid este cufundat într-o soluţie care conţine forma oxidată (Ox) a unui cuplu redox la concentraţie iniţială cunoscută (C0). Ca urmare a transformării. în faza de volum de 1 mM. Astfel. evaluate la x = 0. curentul faradaic în condiţii controlate de difuzie este direct legat cu gradientul de concentraţie. un exces de electrolit inert. şi se lucrează în acele condiţii experimentale care să asigure că fluxul spre electrod să fie strict controlat de difuzie. asigurându-ne că doar Ox este prezent în soluţie. Cu cât electrodul rămâne mai mult la acest potenţial de reducere. prin care Ox din cea mai mare parte a soluţiei trebuie să difuze la suprafaţa electrodului. acelaşi lucru se va observa şi în cazul curentului. în faza de volum. care după formarea sa este liber să difuzeze departe de suprafaţa electrodului. electrodul este fixat la un potenţial (Ei) mult mai pozitiv decat ale E0’ a cuplului Red/Ox. cum panta profilului de concentrare pentru Ox scade cu timpul în urma excitării sub formă de treaptă de potenţial. 486 . de ex. Iniţial. de asemenea. Soluţia conţine.

În exemplul de mai sus.gr/applets/AppletDiffus/Appl_Diffus2. 487 2 3 . pot fi găsite la (http://www. în urma unui trepte de potenţial într-o reacţie redox reversibilă (sau la suprapotenţial mare) în funcţie de t-1/2.uoa. Semnalul de excitare in cronoamperometrie si evolutia profilului de concentratie la suprafata electodului. există şi cele cu treaptă dublă de potenţial. în care numai curentul rezultat este înregistrat.Figura 21. În general.chem. Curentul datorat încărcării stratului dublu.485 C/echivalent).html). la potenţialul Es. această influenţă poate fi evitată numai luând în considerare datele i-t în ultimele 90% din timp. Informaţii suplimentare cu privire la formarea de gradienţilor de concentrare. F = constanta Faraday (96. i = n F A Co Do1/2 π-1/2 t-1/2 [A] 2 (15) unde n = numărul de electroni implicaţi în reactie. A = aria electrodului (cm ). Prin natura lui acest curent capacitiv. C0 = concentraţia speciei electroactiv (mol/cm ). scade ca funcţie de 1/t si are valori semnificative numai în perioada iniţială (de câteva ms) imediat după aplicarea semnalului treaptă. Pe lângă cel mai frecvent experiment de cronoamperometrie. care descrie curentul observat (electrodul planar) în orice moment. adică cel cu o singură treaptă de potenţial. cu raportul 100:1 ajungând la o valoare de 118 mV mai negativă decât E0’. ic. Acesta poate fi uşor înregistrat prin efectuarea experimentului într-o celulă care conţine doar electrolit. în care potenţialul revine la o valoare finală (Ef) după ce este menţinut o perioadă de timp τ. contribuie la curentul total observat după aplicarea unei treapte de potenţial. concentraţia de Ox la suprafaţă a atins imediat valoarea zero pentru o treaptă de potenţial mult mai negativă decât E0’ a cuplului redox. pentru un sistem reversibil (de reducere). Ecuaţia cea mai utilă în cronoamperometria este ecuaţia Cottrell. si D0 = constanta de difuzie pentru specia electroactiv (cm /s). raportul [Red] la [Ox] la suprafaţa electodului este dat de ecuaţia lui Nernst la orice potenţial. De obicei.

M. Faulkner L. Metoda dublei trepte de potenţial este deseori aplicată în măsuratori de constante de viteză pentru reacţii chimice (inclusiv produşi de adsorbţie) care apar în urma primei trepte de potenţial. USA.Cronoamperometria cu pas dublu de potenţial este ilustrată în figura 22. 6. În general. 488 . New York. R. Curentul apărut la treapta de întoarcere este conceptual mai dificil de explicat decât cel de la prima treaptă. curentul observat pentru prima treaptă scade cu t-1/2. 2. 1993. Semnalul de excitare şi răspunsul în cronoamperometria cu treaptă dublă . cât şi electrochimic.. valorile curentului măsurat la un moment egal cu τ/2. după fiecare treaptă (notat ir şi if în figura 22) pentru un astfel de sistem ar duce la o valoare egală cu 0. Brett C. J. Bard A. În partea stângă a figurii este arătat felul cum se aplică treapta de potenţial de la Ei la Es. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications.. sunt uşor de realizat măsurători. Brett Oliveira A.Bibliografie 1. Figura 22. Un sistem simplu. Electrochemistry: Principles.293 pentru raportul dintre [-ir (2τ)/if (τ). Oxford University Press. . A. Cu o suprafaţă de electrod cunoscută. fie de n. după fiecare treaptă de potenţial. În acest exemplu. fie de D0 pentru o specie electroactivă. unde este menţinut un timp τ. De exemplu. John Wiley and Sons Publishers. 2001. Pentru cei interesaţi detaliile se află în Bard şi Faulkner. Cum era de aşteptat din ecuaţia Cottrell.Prezenţa unei reacţii chimice după etapa de transfer de electroni va duce la un raport diferit de această valoare teoretică.. Co si Do cunoscute]. M. pentru ca apoi să revină la Ef = Ei. reversibil poate fi identificat prin compararea valorile curentului direct şi invers măsurat în acelaşi interval de timp. transferul de electroni este reversibil atât chimic. curentul din perioada de întoarcere este înregistrat tot pentru un inte rval de timp τ. Cronoamperometria se pretează bine la măsurarea exactă a ariei electrodului (A) prin utilizarea unui cuplu redox bine-definit (cu n. Methods and Applications.

. Chem.. Nicholson R . 190.N. se calculeaza D na = număr de 1/2 o ⎞ ⎛ 1/2 ⎞ RT ⎛ αn F ⎞ 1/2 . 371 + XII p. Scholz. 1351 (https://twiki. Nicholson R.(ISBN 978-0470843642) 4. se calculeaza k ⎜ 0.7 [mV].Ep = (Λ . se calculează D Sisteme reversibile 28. 36. Š.S. V.E p/2 = 489 . Shain I.. In: Monographs in Electrochemistry (F.. Anal. 37. M.Epa) = 59/n ipa/ipc = 1 Sisteme cvasi-reversibile ⎛ nF ⎞ i p = nFAC* D1/2 Ψ(E) v1/2 Ox ⎜ RT ⎟ ⎝ ⎠ ⎛ RT ⎞ Ep/2 .. edt) Springer-Verlag.3. Komorsky-Lovrić. Theory and Application. G. Chem.109⎜ ⎟=− n ⎝ nF ⎠ RT 28.co.09⎜ ⎟ = E1 / 2 + n ⎝ nF ⎠ ΔEp (= Epc .. Shain I. Anal. 37. 37(11). 2008. Singapore. Nicholson R. Ltd.687 *105) n3/2 AD1/2 v1/2C* [A]. 1965. ISBN 981-270-625-9 5.78 + ln ⎜ D Ox ⎟ + ln ⎛ electroni transferaţi în E p = E o' ⎜ a ⎟ + lnv ⎟ o ⎜ ⎟ ⎜ ⎟ αn a F ⎝ RT ⎠ ⎝ k ⎠ etapa determinată de ⎝ ⎠ viteză 47. Nicholson R. Chem. E. 7. Chem.ogt. S. 8. Anal...uk/twiki/pub/People/ElectrochemistryPapers/TheoryandApplicationofC yclicVoltammetryforMeasurementofElectrodeReactionKinetics. Understanding voltammetry.5 [mV] ⎛ RT ⎞ E p .. 1965. Nicholson R. John Wiley & Sons... se calculeaza αna αn a [Pentru identificarea notaţiilor şi detalii vezi: Nicholson. Chem. 178. Criterii de identificare pentru voltametria ciclică cu specia redox în soluţie ip = (2. Compton R.1. Mirčeski. Lovrić: Square-Wave Voltammetry. Shain I.. 706. 10. 37.. S.. 1964. Bartlett P. 6. S. Anal. 2007.. 9. (Editor) Bioelectrochemistry: Fundamentals.99 *105) n(αna)1/2 A D1/2 v1/2 C* [A]. se calculează ks s ⎟ ⎟ ⎜ ⎜D ⎟v −1 / 2 Ψ = ⎜ ⎝ Re d ⎠ 1/2 ⎜ ⎡ nF ⎤ ⎟ D π ⎜ ox ⎥ ⎟ ⎜⎢ RT ⎦ ⎟ ⎠ ⎝⎣ Sisteme ireversibile.. 1351] E p . 37. Banks C.pdf) Anexa 1. ISBN 978-3-540-73739-1.E1/2 = . 667. Anal. Berlin. 1965. S. 2007.5 [mV] ⎛ ⎞ E p/2 = E1/2 + 1. 1965. Chem. 1965. Experimental Techniques and Applications. ip = (2. α )⎜ ⎟ ⎝ nF ⎠ ⎛ ⎜ ⎜ ko Λ=⎜ nF ⎜ ⎡D1−α Dα ⎜ ⎢ Ox Red RT ⎝⎣ ⎞ ⎟ ⎟ 1/2 ⎟ ⎤ v⎥ ⎟ ⎟ ⎦ ⎠ 1/2 ⎛ ⎛ D ⎞α/2 ⎞ ⎜ ⎜ ox ⎟ k ⎟ . Anal. World Scientific.

........................... Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de platină pentru estimarea coeficientului de difuzie.................4. .....................................................499 3..................................... 490 ..........Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă redox (pe bază de fier) în soluţie ..502 3....354 V..... Influenţa pHului asupra comportării sistemului G//Fe(III)P pe electrod de grafit .....2........................... Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei in soluţie (G//Fe(III)P) pe electrod de grafit.......2...501 3.............................109 V. Ec = 0...............1 M KCl ca şi fond electrolitic pentru îmbunătăţirea conducţiei (Figura 1A).........................987..................................495 3.....155 mA si Ipc = 0.............506 6......................................................3.......................... prin experimente realizate în K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj............................................. Graziella Liana Turdean Cuprins 1................................... Anexă ......... Concluzii ..... Studiul integrităţii filmului de Fe(III)P pentru sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion prin calculul ariei suprafeţei active ..... Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion ..... Bibliografie .....245 V...............................................................157 mA) având parametrii electrochimici (ΔE = 0. Eo’ = 0................................494 2.......................... Ipa = 0.. dr...............493 2....... Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei adsorbită (G/SWCNT–Fe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit ................300 V si Ipa/Ipc = 0................Electrochimia unei substanţe cu potenţial biologic activ....505 5. prin experimente realizate în K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj........................5.......497 3.. Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă redox (pe bază de fier) imobilizată în polimeri ...... Estimarea stabilităţii sistemului G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion la funcţionare continuă ............... Studiu de caz Conf..............504 4.490 2.................................................................... a................. Comportamentul redox al acestei substanţe considerată standard este descris de ecuaţia 1: Fe(CN)6 + e -3 - → Fe(CN)6 -4 (1) şi se manifestă prin apariţia unei perechi de picuri bine conturate (poziţionate la Ea = 0.. Influenţa pH-ului asupra comportării sistemului adsorbit (G/SWCNT– Fe(III)P-Nafion) pe electrod de grafit .......................................................507 1........................... ing.......1.. Se trasează voltamogramele ciclice la diferite viteze de baleiaj pe electrodul de platină în soluţia de 5 mM K3[Fe(CN)6] care conţine 0.498 3........1............... pentru o viteză de baleiaj de 50 mV/s........ Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de platină pentru estimarea coeficientului de difuzie...

0 0 . log v (figura 1B).8 1/2 catodic 1 . Condiţii experimentale: potenţial iniţial. ESC. Analiza datelor prezentate în tabelul 1 indică că specia redox studiată. 1980]: Ip = 2. (C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului de peak I pentru voltamogramele din fig 1A.6 0 . n = numărul de electroni.2 0 . v1/2. cu ajutorul curenţilor de peak anodic şi catodic (Ipa. Panta acestor regresii ne dă indicii despre tipul de transfer de sarcină difuziv (specia în soluţie. (B) Dependenta log I vs. I.2 0 . Intensitatea curentului de peak (Ip) depinde de viteza de baleiaj (v) în conformitate cu ecuaţia Randles-Sevcic (ecuatia 2) pentru un sistem reversibil sub control difuziv [Bard A.4 0 . respec491 .0 v 1 /2 / (V /s ) b. D0 = coeficientul de difuzie (cm2/s).. panta în jur de 0.5.2 V vs. 500 / μA anodic 400 300 200 100 I / μA I 0 -1 0 0 -2 0 0 -3 0 0 -4 0 0 0 .69*105 n3/2 A D01/2 v1/2 Co* (2) unde: Ip = curentul de peak (A). log v pentru voltamogramele din fig 1A. v = viteza de baleiaj (V/s) . –0. Ecuaţiile regresiei liniare sunt prezentate în tabelul 1. ESC (C) Figura 1. K3[Fe(CN)6]. conform ecuaţiei Randles Sevcik) sau transfer de sarcină eterogen (specia adsorbită.4 0 .2 (B) 5 m V /s 1 0 m V /s 2 5 m V /s 5 0 m V /s 7 5 m V /s 1 0 0 m V /s 2 5 0 m V /s 5 0 0 m V /s 7 5 0 m V /s 9 0 0 m V /s anodic catodic I / μA I/A 1E-4 10 100 1000 -1 v / (mV *s ) 0 . se află în soluţie. se trasează dependenta log I vs.1 M KCl pe electrod de platina. iar intensitatea curentului. C0* = concentraţia soluţiei în fază de volum (mol/cm3).0 0 . (A) Voltamograma ciclica a 5 mM K3[Fe(CN)6]+ 0. J. Astfel.(A) 800 600 400 200 0 -2 0 0 -4 0 0 -6 0 0 -0 .6 E / V vs. dependenţa I vs. panta în jur de 1). A = aria electrodului (cm2). Ipc).

552 ± 0. unde d= diametrul electrodului. anodic log Ia = (-4. Atentie. pentru a putea utiliza ecuaţia Randles Sevcik la calculul coeficientului de difuzie.858e-5) v1/2 /V/s R = 0.132 e-5 ± 4.7)2]/4 D01/2 5 10-6 = 0. Astfel.33 10-6 cm2/s.131 10-4)2/(0. Având stabilită dependenţă log I vs.69*105 (1)3/2 [π (0.007) log v Ia /A= (2. în rRESezentarea I vs.tă dependenţa Randles-Sevcik faţă de v1/2.817e-4 ± 2.00517 102 D01/2 de unde: D0 = a2/(0. I vs. Astfel: n = numărul de electroni este 1 în conformitate cu reacţia 1.00517 102)2 Adică: Do.011) + (0.9992. A = aria electrodului (cm2) este (πd2)/4. 2004].7)2]/4 D01/2 5 10-6 v1/2 analoaga unei ecuaţii liniare y = a x. v1/2. C0* = concentraţia soluţiei de K3[Fe(CN)6] în fază de volum (mol/cm3). D.9 10-5 cm2/s obţinut cu o soluţie 5 mM K3[Fe(CN)6] [Ye J.518 ± 0. Se înlocuiesc în ecuaţia Randles Sevcik (ecuaţia 2) parametrii cunoscuţi.9982 n = 6 catodic c. adică d = 0.5 10-6 cm2/s obţinut cu o soluţie 20 mM K3[Fe(CN)6] [Hrapovic S. log v se poate trasa dependenţa I vs. unde a este panta.415 ± 0. d. Datele obţinute sunt în concordanţă cu cele din literatură care variază între: D = 6.90e-6) – (6.265 10-6 cm2/s si Do. iar Dmediu = 1.a = (5. v1/2 (figura 1C) şi estima panta regresiei liniare. ecuaţia 2 devine: Ip = 2.013) + (0..41 10-6 cm2/s.648e-5 ± 3.00517 102)2 = 1.220e-6) + (5. Tabelul 1.-S.s log v şi respectiv.131e-4 ± 1. 492 . Valorile parametrilor regresiei liniare I vs. Regresii liniare pentru dependenţele log I v. n = 6 R =0. v1/2 sunt prezentate în tabelul 1. v.9976. Prin urmare panta regresiei liniare este: a = 2.9994. 2003] si D = 5. adică 5 mM = 5 10-6 mol/cm3. pentru a putea utiliza corect rezultatele.7 cm.00517 102)2 = 1. valorile curentului trebuie să fie în amperi (A) şi ale vitezei de baleiaj (v) în (V/s).69*105 (1)3/2 [π (0. n=6 R = 0.817 10-4)2/(0.009) log v Ic /A= (-1.c = (6. n=6 R = 0..438 ± 0.008e-5)v1/2 /V/s log Ic = (-4.

2. termenii sunt uneori echivalenţi. uneori prin crampe. sulfamidele si fenitoina.3 μm).500 V vs. Peak-urile au fost atribuite unui comportament reversibil monoelectronic al cuplului redox Fe(III)/Fe(II) coordinat în inelul porfirinic (Figura 3A). care Porfiria este o boală ereditară cauzată de o tulburare a sintezei hemului (fracţiunea neproteică a hemoglobinei) şi caracterizată prin acumularea în ţesuturi a unor substanţe intermediare ale acestei sinteze. printr-o slăbiciune musculară şi prin tulburări psihice. 11 Porfiria intermitentă acută se manifestă de cele mai multe ori la vârsta adultă prin dureri abdominale acute. porfirinele. 13 Haemophilus influenzae sunt cocobacili Gram negativi. 17 – tetrametil . nu formează spori. este protoporfirina IX care conţine un ion de fier feric (Heme b) şi un ligand clorură.Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă redox (pe bază de fier) în soluţie Hemina (denumirea IUPAC: cloro[3.f. în special în porfiria intermitentă acută11. Voltamogramele ciclice ale Fe(III)P în soluţie obţinute la diferite viteze de baleiaj pe electrod de grafit arată o pereche de peak-uri bine definite plasate la un potenţial formal standard (εo’)14 care se plasează între – 0. se află la originea acestor crize. Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan”. 1998]. cu bacili scurţi. hématine [Dicţionarul explicativ al limbii române.→ Fe(II)P Din 10 (3) conţine parametrii electrochimici ai tabelul 2. denumirea comercială: Panhematina) este o porfirină cu conţinut de fier (figura 2). Este folosit în gestionarea atacurilor de porfirie10. Numeroase medicamente. în funcţie de pHul soluţiei. drepţi. cu capete rotunjite. facultativ anaerobe. Academia Română.2. în conformitate cu reacţia 3: Fe(III)P + e. hematine. mici (1 . influenzae13.350 to .1. 7. 12. Cu toate acestea. 14 Potenţialul formal standard se calculează ca media aritmetică a potenţialelor de peak anodic şi catodic. Este non-motil. Mai exact. (s. 12 Hematină.0. Porfiriile sunt boli foarte rare. Hematina este considerată "factorul X" necesar pentru creşterea Haemophilus Figura 2. KClsat. Editura Univers Enciclopedic. 13 – divinilporfirin . pleomorfic. 493 . 18 –dipropanoato (2−)]fier(III). Se distinge de hematină12 care are o grupare hidroxid în loc de clorură.5/0. – din fr.) pigment care provine din sânge şi conţine fier. contraceptivele orale. ca barbituricele. Structura heminei. Ag/AgCl.8. Urinele devin roşii atunci când sunt lăsate să aştepte.

Ca urmare. Ag/AgC l. Condiţii experimentale: electrolit. TRIS 0. log v pentru voltamogramele din fig 3A. log v (figura 3B) a permis estimarea pantelor. descris de o ecuaţie în care v este la puterea 1. potenţial initial. (C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului de peak I pentru voltamogramele din fig 3A. (A) Voltamogramele ciclice ale 0.85 V vs. care având valori în jur de 1 (tabelul 3). indiferent de pHul soluţiei.5 mM Fe(III)P pe electrod de grafit (sistem G//Fe(III)P). caracteristic speciilor adsorbite. KC lsat -500 -250 0 10 100 1000 log v (C ) Figura 3. pentru specia considerată standard. 200 / μA I /μA I cat an 100 0 -1 0 0 -2 0 0 -3 0 0 0 500 1000 1500 v / m V *s -1 494 . (A) 300 200 100 v v v v v v v = = = = = = = 10 m V*s -1 20 m