ANALIZA SPECTRAL

1. Analiza spectral de emisie- punerea n eviden a sodiului n produsele biologice

Radiaiile electromagnetice n interaciune cu substane pot determina efecte diferite, la nivel atomic sau molecular. Aceste efecte pot fi explicate dac se iau n considerare urmtoarele aspecte: Undele electromagnetice includ n spectrul lor o gam larg de frecvene;

Din punct de vedere energetic, atomii pot exista doar n anumite stri energetice, bine definite, numite nivele de energie. Absorbia, respectiv emisia unei radiaii electromagnetice poate avea loc numai dac frecvena acestora corespunde diferenei de energie dintre cele dou nivele energetice ntre care are loc tranziia, conform relaiei urmtoare: (1)

unde: E= diferena de energie dintre cele dou nivele energetice; h= constanta lui Planck= 6,6256(5)* Js; v= frecvena radiaiei absorbit sau emis.

Fig. 1. spectrul electromagnetic: - lungimea de und; v-frecvena; -energia

n aceste condiii, trecerea de pe nivelul energetic inferior pe un nivel energetic superior se realizeaz prin absorbia unei radiaii ce satisface relaia (1) n ceea ce privete frecvena i energia; invers, revenirea la starea fundamental corespunde emisiei unei radiaii cu aceiai parametri (fig.2). Aceste radiaii poart numele de linii spectrale i sunt caracteristice fiecrei specii specii atomice, ceea ce permite identificarea acesteia ntr-un amestec. n producerea liniilor spectrale este respectat legea inversiunii liniilor spectrale: fiecare substan poate absorbi aceleai radiaii pe care le poate i emite, n condiii identice de temperatur i presiune.

absorbie

stare excitat stare

E2 E2>E1 E1

emisie

fundamental

fig.2. tranziiile electronice ce apar la emisia i absorbia radiaiilor

Tipurile de nivele de energie difer ca ordin de mrime dup cum urmeaz(tabelul 1):
a)

Nivelele electronice pot fi: interioare(mai apropiate de nucleu, cu energia mai mare); tranziiile de pe aceste nivele se pot produce doar prin interacii cu radiaii de frecven mare i periferice; radiaiile din vizibil i U.V. pot produce tranziii de pe aceste nivele.

b) Nivele de vibraie ale moleculelor corespund micrilor de vibraie ale nucleelor din molecul n jurul anumitor poziii de echilibru; tranziiile ntre aceste nivele realizeaz spectrele de vibraie. c) Nivelele de rotaie ale moleculelor corespund micrii de rotaie a ntregii molecule; tranziiile ntre ele dau spectre de rotaie, n IR ndeprtat. Totalitatea radiaiilor absorbite corespunztoare tranziiilor ntre diferite nivele energetice alctuiesc spectrul de absorbie al substanei respective.

Nivel de energie Rotaie Vibraie Electric

Ordin de mrime a energiei (kcal/ mol)

Domeniul de frecven al spectrului emisie/ absorbie(HZ) (microunde) (IR) (vizibil, UV)

Spectrele se pot clasifica dup cum urmeaz: 1. Spectrele de absorbie: cuprind totalitatea radiaiilor corespunztoare tranziiilor de pe nivelele energetice inferioare ale atomilor i moleculelor pe nivele energetice superioare, n condiiile penetrrii substanei cercetate de ctre un fascicul de radiaii electromagnetice cu spectru continuu, acesta atenundu-i pe parcurs intensitatea iniial. Spectrul de absorbie se prezint sub forma unor linii nnegrite ce apar n spectrul continuu iniial, corespunznd lungimilor de und ale radiaiilor lips. 2. Spectre de emisie: cuprind totalitatea radiaiilor emise n urma tranziiilor de pe nivele energetice inferioare, urmare a unor condiii potrivite de excitare. Un spectru de emisie se prezint doar sub forma acelor linii sau benzi colorate corespunztoare radiaiilor emise. Spectrele mai pot fi clasificate n: Spectre continue- sunt cele ce acoper n ntregime gama de frecvena a unui anumit domeniu. Spectre de band- sunt alctuite din anumite radiaii grupate n anumite zone ale gamei de frecvene ale domeniului respectiv. Spectre de linii- sunt compuse doar din radiaii monocromatice separate de intervale de lungimi de und libere, n domeniul respectiv. Din cele prezentate mai sus se poate deduce o alt clasificare a spectrelor: atomice i moleculare, iar n funcie de domeniul de frecvene cruia aparin spectrele se pot clasifica n: vizibil, UV, IR etc. Metoda fizic ce se ocup cu studiul spectrelor de emisie si de absorbie caracteristice elementelor i folosete la depistarea acestora n compoziia unui amestec se numete analiz spectral. Ea poate fi: calitativ/ cantitativ, de emisie/ absorbie. Are o larg utilizare, prezentnd o serie de avantaje comparative cu alte metode de analiz:

 Sensibilitate mare; Necesit cantiti mici de substan cercetat; Permite determinarea simultan a aproape tuturor elementelor chimice prezente n prob i durat scurt de analiz. Ca urmare metoda este larg folositn biologie i medicin la depistarea unor elemente n cantiti infirme n tumorile organismului. Dup sistemul dispersiv aparatele spectrale se mpart n: Aparate cu prism; Aparate cu reea. Dup receptorul folosit ntlnim: Spectroscoape (receptor ochiu) Spectrografe (receptor-placa fotografic) Spectrometre (receptor fotoelectric, termoelectric) cantitativ. Partea practic Principiul metodei Sodiul este depistat ntr-un produs biologic lichid, dup aducerea n stare atomic prin volatizarea n flacr, cu ajutorul unui spectroscop cu prism, identificnd liniile spectrale de emisie caracteristice acestui element. Descrierea spectroscopului cu trei brae: Spectroscopul utilizat este alctuit din urmtoarele pri componente: O prism optic P din sticl Colimatorul este un tub cilindric prevzut la un capt cu o fant liniar, aezat n focarul lentilei. Deschiderea fantei este reglabil prin intermediul unui urub micrometric; Un alt colimator prevzut la un capt cu o scal gradat ce este proiectat de sursa luminoas pa faa de emergen a prismei; Luneta L folosete la observarea direct a rezelor luminoase; este compus din obiectivul Ob i ocularul Oc; Sursele de lumin i . Razele luminoase, ce ptrund prin fanta iluminat de sursa , dup trecerea prin lentil, cad pe faa pe inciden a prismei P, dup care sufer un fenomen de dispersie, fiind deviate invers proporionalcu . Fasciculul de

pentru

analiza

lumin ajunge prin intermediul lunetei la ochiul experimentatorului. Imaginea ce poate fi fi observat va cuprinde imaginea spectrului suprapus peste imaginea scalei gradate. Figura 3. Schema de principiu a spectroscopului cu trei brae

Timpii de lucru: 1. Etalonarea aparatului Se conecteaz sursa de lumin la reea Se conecteaz tubul luminescent cu vapori de mercur la reea; fanta colimatorului trebuie centrat n dreptul ferestrei dreptunghiulare practicat n nveliul acestuia. Acest tip de tub conine sticl sau silica. Electrozii ptrund n tubul nchis ermetic, iar vaporii sunt excitai de descrcrile electrice produse de diferena de potenial electric existent ntre cei doi electrozi. Acest tip de lmpi furnizeaz spectre de linii. Se regleaz lrgimea fantei F prin intermediul urubului micrometric astfel nct liniile spectrale s fie vizibile i suficient de nguste. Se regleaz ocularul aflat la extremitatea lunetei prin deprtarea sau apropiere, pentru claritatea imaginii scalei. n cmpul vizual apare spectrul mercurului(figura 4) peste care se suprapune imaginea

scalei gradate atunci cnd este acionat ntreruptorul ce comand sursa de iluminare a scalei. Privind prin luneta L se identific liniile spectrului de emisie al mercurului i corespondena lor cu diviziunile scalei i se trec ntrun tabel asemntor cu cel prezentat mai jos. Se nlocuiete lampa cu vapori de mercur cu un bec cu neon, procedndu-se n mod analog. Spectrul caracteristic neonului este prezentat n figura 5. Cu ajutorul valorilor tabelate se traseaz graficul, n sistem de coordonate XOY, reprezentnd pe abscis diviziunile scalei gradate i pe ordonat lungimile de und corespunztoare.
1 2 3 4 5 6

57 9

57 7

546

49 2

43 6

408

nm

Fig.4. spectrul mercurului: 1- galben; 2-galben; 3-verde; 4-verdealbastru; 5-indigo; 6-violet

64 0

614

585

nm

Fig.5. Spectrul neonului: 1- rou aprins; 2- rou oranj; 3- galben

(nm )

Diviziunile scalei

Fig.6. graficul de etalonare 2. Depistarea prezenei sodiului n produsele biologice:

Se aeaz becul de gaz la 10-15 cm de fanta F a colimatorului , se aprinde cu grij, reglndu-se arderea astfel nct flacra s fie incolor. Se conecteaz doar sursa la reea

Se depune produsul de cercetat pe plcua de azbest, apoi se introduce aceasta n flacr, cu ajutorul stativului

Privind prin luneta spectroscopului etalonat i reglat, n cazul prezenei sodiului n produsul de cercetat se vor observa cele dou linii spectrale caracteristice sodiului, foarte apropiate. Valoarea lungimilor de und corespunztoare diviziunilor scalei gradate se afl cu ajutorul graficului de etalonare: se noteaz numrul diviziunilor pe abscis, se ridic verticala pn la intersecia cu graficul, de unde se duce o orizontal pn la intersecia cu ordonata, punct n care se citete valoarea lungimii de und a radiaiei respective. Se trece apoi n tabel. Culoarea radiaiei violet Indigo Verde-albastru Lungimea de und (nm) 408 436 492 Diviziunea scalei

Nr. Crt. 1 2 3

Sursa de lumin Etalon Mercur

4 5 6 7 8 9 Etalon Neon

Verde Galben Galben Galben Rou-oranj Rou-aprins

546 577 579 585 614 640

Produsul de cercetat Materiale necesare Spectroscop cu trei brae; Sursa de lumin cu spectru cunoscut: o Tub luminiscient cu vapori de mercur; o Bec cu neon. Bec de gaz; Plac de azbest ce poate fi aezat pe stativ pentru aducerea la incandescen a sodiului; Produs de cercetat n stare lichid. Descrierea spectroscopului PASCO Spectroscopul produs de firma PASCO prezint urmtoarele pri componente: prism optic; un telescop pentru observarea razelor difractate; un colimator ce prezint la extremitatea bdreptat spre sursa de lumin o fant reglabil. Att masa pe care este fixat telescopul, ct i cea de fixare a colimatorului sunt reglabile

. Timpii de lucru: 1. etalonarea aparatului

Fig.7. spectroscopul PASCO 1. Colimator; 2. Prism; 3. Telescop; 4. Mas de fixare a telscopului; 5. Mas de fixare a colimatorului; 6. Clem de fixare a prismei.

se aeaz spectroscopul pe o suprafa perfect plan; se focalizeaz telescopul la infinit i se regleaz imaginea pn ce firele reticulare se suprapun ca n figura 8; se verific dac fanta colimatorului este parial deschis;

se analizeaz telescopul n direcie opus colimatorului, ca n figura 9; linia luminoas vertical ce trece prin fanta colimatorului s fie centrat pe intersecia firelor reticulare ale telescopului.

2.

Utilizarea prismei ca element de difracie are avantaje i dezavantaje comparativ cu reeaua de difracie: indicele de refracie este invers proporional cu lungimea de und incident.

Astfel, pentru msurarea lungimii de und folosind prisma trebuie realizat un grafic de coresponden ntre lungimea de und i unghiul de refracie folosind o surs de lumin cu spectru cunoscut. Lungimea de und necunoscut a unor linii spectrale poate fi determinat prin interpolarea graficului de etalonare. Telescopul poate fi rotit pentru observarea spectrelor emise, msurndu-se ulterior, foarte precis, unghiul de difracie. Cunoscnd valorile unghiului de difracie se pot determina lungimile de und ale sursei de lumin emitoare.

Fir reticular vertical

Fir reticular orizontal

Fig.8. dispunerea perpendicular a firelor reticulare Fig. 9. Alinierea telescopului

Msurarea unghiului de difracie Unghiurile de difracie se msoar utiliznd scala vernier (fig.10). aliniindu-se fa n fa telecopul i colimatorul unghiului citit este . Se rotete apoi telescopul pentru observarea liniei spectrale i se citete pe scala vernier unghiul . Diferena ( ) corespunde unghiului de difracie.

Fig.10 Citirea unghiului de difracie

Parte practic Principiul metodei Hemoglobina este o protein compus dintr-o fraciune pigmentar care conine fier(numit hem), combinat cu o protein- globina. n mod normal fierul se gsete n stare feroas permind o combinaie labil a hemoglobinei cu oxigenul oxihemoglobina-responsabil de transportul oxigenului n snge. Alturi de oxihemoglobin n unele stri patologice pot apare i compui anormali, stabili ai hemoglobinei cum ar fi: hemoglobina redus, methemoglobina, carboxihemoglobina, cianhemoglobina. Aceti compui nocivi ai organismului pot fi detectai calitativ prin analiza spectral de absorbie, prin evidenierea spectrelor de absobie caracteristice acestora prin intermediul spectroscopului liniar. Descrierea spectroscopului liniar

Dispozitivul respect schema general de alctuire a spectroscoapelor, n care elementul dispersiv, denumit prisma Amici i constituit dintr-un sistem de trei prisme (fig.11) are drept scop mrimea puterii de rezoluie cromatic. Pentru o lungime de und medie, raza emergent iese prin prisma Amici dup direcia razei incidente, motiv pentru care se numete i prism cu vedere direct.

fig. 11. Sistemul de prisme Amici

Pentru funcionarea spectroscopului sunt necesare dou surse de lumin:

- sursa de lumin cu spectru continuu situat lateral; spectrul su este proiectat la partea inferioar a spectrului de examinat; realiznd un spectru de control; - cu spectru continuu aezat n dreptul eprubetei cu soluia de cercetat, servete la realizarea spectrului de absorbie al acesteia.

Receptorul este ochiul experimentatorului, care examineaz prin intermediul ocularului cmpul spectroscopului n care vor fi deci vizibile, simultan cu spectrul de examinat, i spectrul de control i scala gradat, etalonat direct n nm, permind, deci citirea direct a lungimilor de und.

Fig.12 schema de principiu a spectroscopului liniar: - surse de lumin alb; E- eprubet; F- fant reglabil; - prisma Amici; - scal gradat n nanometri

Timpii de lucru: 1. Reglarea spectroscopului Se conecteaz spectroscopul la reea Se examineaz lumina unei lmpi de sodiu

Se verific corespondena liniei spectrale a sodiului, aprut n cmpul ocularului, cu valoarea cunoscut din tabel, deplasndu-se eventual scala gradat pn la realizarea corespondenei.

2. Realizarea spectrelor de absorbie caracteristice hemoglobinei i derivailor si Se realizeaz o soluie de snge hemolizat: cteva picturi de snge heparinat sunt introduse ntr-un volum mare de ap distilat (aprox.50 ml);

Se realizeaz succesiv soluii de oxihemoglobin, hemoglobin redus, methemoglobin i se aaz n stativul special construit, observndu-se, pe rnd, intervalele de lungimi de und corespunztoare spectrelor de absobie ale fiecrei soluii.

a) Spectrul oxihemoglobinei: Mod de obinere: se separ ntr-o eprubet 5 ml de snge hemolizat, omogenizndu-se soluia pentru o bun oxigenare cu o baghet de sticl. Spectru: oxihemoglobina prezint dou benzi ntunecate caracteristice, una n regiunea verde i alta n regiunea galben.

b) Spectrul hemoglobinei reduse: Mod de obinere: n eprubeta n care s-a realizat oxihemoglobina se adaug cteva picturi dintr-un reductor- soluie Stockes sau soluie sulfat feros. Oxihemoglobina fiind un compus foarte instabil poate ceda n anumite condiii o parte din oxigen, rezultnd hemoglobina redus. Culoarea sngelui devine n acest caz mai nchis, cu o nuan albstruie. Spectru: este format dintr-o singur band ntunecoas ce ocup locul celor dou benzi ale oxihemoglobinei.

c) Spectrul methemoglobinei:

Mod de obinere: n eprubeta cu oxihemoglobina se adaug ferocianura de potasiu. Se realizeaz methemoglobina, compus mai stabil dect oxihemoglobina, n aceast combinaie fierul fiind trivalent. Methemoglobina apare n sngele subiecilor intoxicai cu anumite medicamnete ca: nitrai, sulfai, acetanilid, subnitrat de bismut, compui nitrobenzenici, precum i n methemoglobinemiile congenitale. n cazul prezenei sale, sngele este mai deschis la culoare. Spectru: methemoglobina prezint patru benzi de absorbie, dintre care o band caracteristic situat n rou ntre 642-624 nm, cu max. la 633 nm.

d) Spectrul carboxihemoglobinei: Mod de obinere: se barboteaz oxid de carbon ntr-o soluie de hemoglobin; culoarea sngelui devine cireie. Acest lucru se va realiza practic prin barbotarea gazului metan pentru cteva minute n soluie de snge. Spectru: prezint dou benzi de absorbie sensibil apropiate acelor caracteristici oxihemoglobinei. Diferena dintre oxihemoglobin i carboxihemoglobin se evideniaz cu reactivul Stockes: oxihemoglobina se reduce n prezena acestuia la hemoglobin redus cu banda sa caracteristic, m timp ce n cazul carboxihemoglobinei cu apare nici o modificare de spectru.

Rezultate experimentale Valorile lungimilor de und corespunztoare radiaiilor absorbite observate experimental se vor trece ntr-un tabel de rezultate. Se vor compara valorile obinute experimental cu cele menionate n literatura de specialitate, prezentate n tabelul alturat. Substana Valori teoretice Culoarea radiaiei oxihemoglobina Hemoglobin redus methemoglobina Carboxihemoglobina galben verde verde Rou Galben Verde Interval de lungimi de und 587-568 552-527 565-545 642-624 Max. 570 Max.539 Valori practice Culoarea radiaiei Interval de lungimi de und