Curs de Biofizic

V rugm: gndii!

5
Prof.dr. Cipriana tefnescu Disciplina de Biofizic i Fizic medical

Cromatografia
Metod de separare i identificare a componenilor unui amestec. 2 faze: faza staionar i faza mobil.
Mecanisme diferite de retenie - 4 tipuri de cromatografie: 1. De adsorbie 2. De schimb ionic 3. De permeaie 4. De afinitate

Coeficient de distribuie sau de partaj:

Definiie:

c1 Pc = c2

Concentraia component A n faza staionar Concentraia component A n faza mobil

Se bazeaz pe retenia diferit a componenilor amestecului n faza staionar: coeficient de distribuie sau de partaj.

Cromatografia: schem de principiu

(A)Sarcini electrice, (B)Filtrare prin pori, (C) Legturi covalente sau necovalente

A.Cromatografia de adsorbie
MikhaelTsvet, (18721919) botanist rus 1901, separarea clorofilei prin cromatografie de adsorbie pe coloan Retenia la suprafaa fazei staionare

B. Cromatografia de afinitate
n cromatografia de afinitate, un ligand care se cupleaz specific la o protein este fixat covalent de o matrice poroas (faza staionar)

Cnd un amestec de proteine traverseaz faza staionar: - Proteina de separat se cupleaz cu ligandul, iar celelalte proteine din amestec sunt eliminate din coloan fr a fi reinute deloc.
- Modificnd condiiile de eluie (pH acid) proteina

reinut se detaeaz de faza staionar i este eliminat (recuperat).

.
Ligand fixat la matrice Proteina cu afinitate pentru ligand

Alte proteine

Separarea unui anticorp dintr-un amestec prin cromatografie de afinitate

C. Cromatografie prin schimb ionic

Ex! Generatorul de 99m-Tc (v. Aplicatii radioizotopi)
Ioni legai electrostatic la un suport insolubil i chimic inert sunt nlocuii reversibil de ali ioni din amestecul de separat:
Suport+A- + IonSuport+Ion- + A-

Cromatografie prin schimb ionic

D.Cromatografie de permeaie - prin filtrare n gel

n cromatografia de permeaie sau de filtrare n gel, (cromatografie de excludere sau tamisaj molecular), proteinele sunt separate dup mrimea i forma lor.
Frecvent faza staionar este: dextran (Sephadex), agaroz sau poliacrilamid

Cromatografie de permeaie

Cromatografia de permeaie se poate folosi pentru estimarea masei moleculare

Exemplu: Purificarea nucleazei stafilococului prin cromatografie de afinitate - compusul reprezentat n (b) a fost legat covalent la faza staionar (agaroz)