UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

PROIECTAREA UNEI INSTALATII TEHNOLOGICE PENTRU OBTINEREA DE PROTEAZA

Prof.coord.:

OVIDIU POPA

STUDENT:

IACOB LORY

BUCURESTI 2012

GENERALITATI
Proteazele microbiene constituie un grup complex de enzime idrolitice! care di"er# prin speci"icitatea de substrat! mecanism de reac$ie! dependen$a acti%it#$ii enzimatice &i stabilit#$ii 'n "unc$ie de p( &i temperatur#) *c$iunea lor poate "i blocat#! acti%at#! sau in ibat# 'ntr+o anumit# propor$ie de agen$i "izici! c imici sau biologici) Produc$ia &i caracteristicile enzimelor microbiene pot "i in"luen$ate prin selec$ia tulpinii produc#toare &i alegerea condi$iilor de culti%are ale acesteia) Enzimele din categoria proteazelor idrolizeaz# ma,oritatea proteinelor comune cum ar "i- caseina! emoglobina! gelatina! albumina de ou! glutenul! proteina din soia &i alte proteine %egetale &i animale) Condi$iile de idroliz# precum &i randamentul opera$iei 'n sine depind 'ns# de natura! caracteristicile &i gradul de puritate al preparatului proteolitic utilizat)

DOMENII DE UTILIZARE
.umeroasele utiliz#ri ale enzimelor proteolitice! 'n cele mai di"erite domenii de acti%itate /industria alimentar#! "armaceutic#! agricultur#! industria detergen$ilor! medicin#0 au determinat demararea cercet#rilor 'n %ederea ob$inerii acestora pe cale biote nologic# $in1nd seama 'n acela&i timp de a%anta,ele pe care le o"er# utilizarea microorganismelor ca surs# biologic#! precum &i de propriet#$ile enzimelor microbiene)

PROPRIETATILE PROTEAZELOR
Proteazele sunt cele mai importante din punct de %edere economic! dintre toate enzimele produse pe cale industriala) Ele reprezinta circa 203 din productia totala de enzime) Proteazele sunt produse de bacterii si "ungi! iar in ultimul timp au dobandit importanta practica! proteazele de origine %irala) Cele mai multe proteaze comerciale! mai ales neutre si alcaline! sunt produse de g) Bacillus) Proteazele bacteriene neutre sunt acti%e la p( 4+5 si au toleranta termica scazuta) Se caracterizeaza prin a"initatea lor mare pentru sec%entele de aminoacizi idro"obi) Unele proteaze neutre sunt de tipulmetaloproteazelor! adica necesita ioni metalici bi%alenti pentru acti%itatea lor si sunt sensibile la prezenta ionilor c elatori! iar altele sunt serin+proteaze si acti%itatea lor nu este modi"icata de agentii c elatori) Proteazele bacteriene alcaline au acti%itate optima la p( alcalin /l00 si temperatura de 60o! proprietati care le "ac adec%ate pentru industria detergentilor) Proteazele "ungice au o di%ersitate mult mai mare decat cele bacteriene) 7e exemplu! *spergillus or8zae secreta proteaze acide! neutre si alcaline) Ele sunt acti%e la p( 2+11! au o speci"icitate larga de substrat! ca si cele bacteriene! dar rata reactiei si termotoleranta sunt in"erioare) Proteazele "ungice neutre sunt metaloproteaze! acti%e la p( 9 si sunt in ibate de agentii c elatori) Proteazele reprezint# un grup de enzime idrolitice! de obicei extracelulare! care scindeaz# molecula proteic# 'n "ragmente polipeptidice "ormate din c1$i%a aminoacizi uni$i prin leg#turi peptidice) *ceste polipeptide pot "i 'n continuare degradate de c#tre peptidaze p1n# la aminoacizii componen$i) Peptidazele! 'n "unc$ie de modul lor de ac$iune sunt de dou# tipuriendopeptidaze &i exopeptidaze) :a r1ndul lor exopeptidazele pot "i- aminopeptidaze care '&i 'ncep ac$iunea de la ni%elul extremit#$ii .(2 libere a polipeptidului! acti%itatea lor depinz1nd de prezen$a unor ioni metalici; carboxipeptidaze care '&i 'ncep atacul de la cap<tul C==( liber al peptidului /Scriban! 1>550)

CLASIFICAREA PROTEAZELOR

Clasi"icarea enzimelor proteolitice se "ace! con"orm recomand<rilor International Unit o" Bioc emistr8 'n &ase "amilii! di"eren$ele dintre ele dator1ndu+se sec%en$elor de aminoacizi care alc#tuiesc situsul acti%e) ?embrii "iec#rei "amilii se crede c# au rezultat dintr+o "orm# ancestral# comun#! 'n urma unui proces e%oluti% di%ergent) Serin proteazele includ dou# "amilii distincte- serin+proteazele de la mami"ere &i cele de origine bacterian#) 7e&i prezint# un mecanism enzimatic comun! cele dou# "amilii de serinproteaze di"er# ca sec%en$# de aminoacizi &i ca structur# tridimensional#) In mod similar! metalopreoteazele includ &i ele tot dou# "amilii 'n "unc$ie de originea lor &i de structura c imic#- de la mami"ere &i de la bacterii) Exist# &i alte enzime proteolitice identi"icate la di"erite grupe de organisme care nu pot "i 'ncadrate 'nc# 'n nici una dintre grupele de mai sus deoarece mecanismul lor de ac$iune &i situsul acti% nu este cunoscut cu exactitate) *cesta este cazul colagenazelor &i aminopeptidazelor) Proteazele bacteriene produse de tulpini de Bacillus subtilis sunt amestecuri de proteaze alcaline /subsubclasa @)2)21! proteaze serinice0 &i proteaze neutre /subsubclasa @)2)22! metaloproteaze0) Proteazele serinice au 'n centrul lor acti% serina &i istidina) *cest grup a "ost di%izat de ?ori ara 'n alte 2 subgrupeA proteaze similare tripsinei; A proteaze alcaline;

A proteaze ?8xobacter B+litice; A proteaze sta"ilococice) Proteazele similare tripsinei cuprind! 'n a"ar# de tripsin# &i c imotripsin#! enzime produse de specii de Streptom8ces! care idrolizeaz# leg#turile *rg22 C Dl82@&i :8s2> C *la@0 din lan$ul E+insulinic! aceast# speci"icitate de substrat "iind tr#s#tura distincti%#) *ceste enzime ac$ioneaz# la p( 5!0! au temperatura optim# de cataliz# 40FC! sunt in ibate de diizopropil"luor"os"at /7IGP0! pCcloromercurilbenzoic /PC?B0! tos8l+:+ lizinclorometilceton# /T:CH0! tripsin+in ibitorul din soia) *cti%itatea lor nu este in"luen$at# de etilendiaminotetraacetat /E7T*0 &i acid iod+acetic /I**0! 'n plus prezint# &i acti%itate esterazic# &i amidazic#) * doua grup# de proteaze serinice sunt proteazele alcaline; acestea pot "i produse de bacterii! dro,dii &i "ungi "iind prezente &i 'n $esuturile animale) In aceast# grup# se 'ncadreaz# &i proteazele alcaline produse de unele tulpini de B)subtilis &i cele "ungice din *spergillus or8zae) *ceste proteaze au ac$iune speci"ic# "a$# de resturile de aminoacizi aromatici sau idro"obi care particip# cu gruparea carboxil la leg#tura care se scindeaz#; %aloarea optim# a p( este cuprins 'ntre p( > &i p( 11! dar enzimele r#m1n acti%e 'n domeniul de p( 4C>; aceste proteaze sunt in ibate de 7IGP! de P?SG "iind 'ns# rezistente &a ac$iunea E7T* sau orto"enantrolinei) 7in acest grup "ac parte proteazele cunoscute sub denumirea de subtilizine sau subtilopeptidaze) S+a constatat c# aceste proteaze nu sunt exclusi% produse de B)subtilis ci 'n general de bacterii ale genului Bacillus ast"el 'nc1t s+a propus numele generic de

bacilopeptidaze) Respecti%ele enzime pot "i clasi"icate 'n dou# grupeA Bacilopeptidaze * care cuprind subtilizina Carlsberg /proteaza alcalin# produs# de tulpini de B)lic eni"ormis0 &i proteaza alcalin# produs# de B)pumilis; A Bacilopeptidaze B care includ subtilizina .=J= /proteaz# alcalin# sintetizat# de B)subtilis .RR: B@2110 &i subtilizina B.P /Bacterial Protease .agarse0! proteaz# alcalin# din B) subtilis %ar) am8losacc ariticus) ?etodele de examinare a amestecurilor de enzime produse de di"eri$i bacili au ar#tat c# bacteriile produc#toare de bacilopeptidaze * nu sintetizeaz# proteaze neutre sau amilaz#! 'n timp ce bacteriile produc#toare de bacilopeptidaze B sintetizeaz# 'n acela&i timp &i proteaze neutre &i amilaz# 'n acela&i timp) ?etaloproteazele sunt proteaze acti%ate de ionii metalici lega$i de centrul acti% al Enzimei)Ele pot "i metaloproteaze neutre &i metaloproteaze alcaline) Proteazele neutre con$in de obicei Kn &i prezint# speci"icitate "a$# de aminoacizii idro"obi implica$i cu gruparea amino 'n leg#tura peptidic#) Ele au un p( optim de ac$iune cuprins 'ntre p( 9 &i p( 5! sunt in ibate complet de E7T* /care complexeaz# atomul de Kn din structur#0 "iind sensibile la concentra$ii de E7T* sub 10+@?! orto+"enantrolin#! ne"iind a"ectate de 7IGP &i PC?B) ?etaloproteazele alcaline con$in! de asemenea! un ion metalic implicat 'n mecanismul de reac$ie catalitic#) Ele '&i mani"est# acti%itatea optim# 'n domeniul de p( 9C>! "iind mai pu$in in ibate de E7T* dec1t proteazele neutre! necesit1nd concentra$ii mai ridicate de 10

+2 ? pentru inacti%are) Proteazele neutre produse de Bacillus subtilis %ar) am8losacc ariticus sunt di"erite de proteazele neutre produse de Bacillus subtilis .RR: B@221 &i din acest moti% este necesar# speci"icarea exact# a pro%enien$ei proteazei neutre respecti%e) Producerea lor este supus# represiei exercitate de prezen$a 'n mediul de incubare a unor aminoacizi 'n cantitate mai mare /BaLden &i colab)!1>590) *ceste enzime sunt "olosite 'n prezent la "abricarea detergen$ilor la tratarea pieilor 'n industria piel#riei! "r#gezirea c#rnii! eliminarea depozitelor proteice din b#uturile "ermentate /Sasson! 1>550) :a aceste bacterii s+au realizat &i numeroase studii re"eritoare la determinismul genetic &i controlul producerii &i excre$iei acestor enzime 'n scopul ob$inerii prin clonare a unor tulpini superproduc#toare /?c Connell &i colab)! 1>560) S+a do%edit "aptul c# producerea de proteaze este supus# unor mecanisme reglatoare complexe! 'ntre care un rol c eie este ,ucat de sistemul 7egS+7egU precum &i de "actorii de reglare 7egR and 7egM /.agami and TanaNa! 1>56; TanaNa et al)! 1>59; =gura et al)! 1>>20) *ce&ti "actori reglatori se pare c# sunt implica$i 'n superproduc$ia de proteaze cel pu$in 'n cazul unor tulpini de B)subtilis) 7e asemenea! relati% recent! =gura et al /1>>20 au caracterizat alte dou# gene- proB /ce codi"ic# sinteza O+glutamil Ninazei0 &i pro* /codi"ic# sinteza glutamil+O+semialde id de idrogenaza0 ale c#ror produ&i par a "i implica$i 'n sporirea

capacit#$ii de biosintez# a exoproteazelor la o tulpin# de B)subtilis) *st"el! cele dou# gene au "ost clonate 'ntr+un %ector e clonare /p:C10 &i apoi introduse! 'mpreun# cu un alt %ector /p.C610 ce con$ine gena reglatoare prtR /degR0 'ntr+o tulpin# de B)subtilis) Trans"orman$ii ob$inu$i au prezentat o acti%itate proteolitic# mai mare dec1t a tulpinii parentale) 7ate "iind aplica$iile practice ale acestor enzime extracelulare! preocup#rile cercet#torilor %izeaz# sporirea ni%elului de biosintez# ca &i m#rirea stabilit#$ii enzimelor 'n di"erite condi$ii experimentale) *ceste deziderate se pot realiza pe mai multe c#i! printre care cele ce utilizeaz# metodele clasice de ameliorare a microoganismelor /prin tratament cu agen$i mutageni0 &i cele moderne! de inginerie genetic# /"uziunea de protopla&ti &i te nologia *7. recombinant0) Con"orm datelor de literatur#! mutagenii cei mai e"icien$i sunt nitrosometiluree! nitrosoguanidina! dietilsul"atul! precum &i agen$i "izici de tipul radia$iilor P sau a radia$iilor O) *st"el! prin mutagenez# s+a reu&it ridicarea ni%elului de biosintez# a tulpinilor de B)subtilis de aproximati% 5+10 ori) In cel de+al doilea caz! ma,oritatea tulpinilor superproduc#toare de proteaze care prezint# anumite caracteristici s+au ob$inut prin inginerie genetic#) *st"el! sunt "oarte cunoscute rezultatele ob$inute de cercet#torii ,aponezi care! pornind de la tulpini s#lbatice de B)t ermoproteol8ticus &i B)stearot ermop ilus au reu&it ob$inerea de tulpini produc#toare de

termolizin#! o proteaz# "oarte di"erit# de celelalte proteaze neutre 'n ceea ce pri%e&te termostabilitatea &i mecanismul de ac$iune) In prezent! cunosc1ndu+se structura termolizinei precum &i genele r#spunz#toare de caracteristicile sale deosebite! se 'ncearc# ob$inerea de tulpini de B)subtilis! B)stearot ermop ilus modi"icate genetic! capabile s# produc# proteaze termostabile sau stabile la %alori di"erite ale p( sau la ac$iunea unor agen$i in ibitori) In cazul bacteriilor din genul Streptom8ces examinarea lic idelor de cultur# a unor tulpini produc#toare de antibiotice a dus la e%iden$ierea prezen$ei unui amestec de enzime dintre care! un loc important din punct de %edere cantitati% 'l ocup# proteazele /neutre &i alcaline0 &i peptidazele /aminopeptidaze0 /PoNorn8 &i Jitale! 1>500) Jitale &i colab)/1>500 au reu&it izolarea din "iltrat de cultur# de S)rimosus a unei serin proteaze care a prezentat un p( optim de ac$iune cuprins 'ntre 9 &i > &i al c#rei substrat de ac$iune este reprezentat de proteine sau de peptide mari! idroliz1nd 'n general esterii terminali simpli) Recent! RenNo &i colab)/1>5>0 au prezentat particularit#$ile unei proteaze de tip tripsinic /Qtr8psin+liNe proteinaseQ0 izolat# tot din "iltrat de cultur# de S)rimosus e%iden$iind "aptul c# aceasta este o proteaz# alcalin#! sensibil# la ac$iunea in ibitorului proteazic P?SG /speci"ic pentru serin+proteaze0 ca &i la cea a B+antitripsinei) *ceste enzime au acti%itate arginilaminopeptidazic# at1t asupra proteinelor c1t &i asupra peptidelor mai mici) Enzime similare au

"ost izolate &i caracterizate &i de la alte specii de Streptom8ces- S)"radiae! S)paromom8cinus! S)moderatus! S) 8groscopicus etc) = situa$ie oarecum special# o prezint# S)griseus care produce un amestec de proteaze neutre &i alcaline! produsul ob$inut "iind denumit pronaz#! el "iind studiat mai intens 'n scopul elucid#rii mecanismului de ac$iune &i a omologiei sale cu tripsinele %ertebratelor /Read &i colab)!1>520) *ceste studii au importan$# at1t teoretic# prin contribu$iile aduse la 'n$elegerea unor aspecte e%oluti%e! a taxonomiei serin+proteazelor dar &i practic#! aceste enzime put1nd 'nlocui tripsina 'n anumite reac$ii bioc imice) S+a do%edit de asemenea c# unele specii de streptomicete! cum ar "i de pild# S)rimosus! pot produce &i o alt# categorie de proteaze- metaloproteaze /Jitale &i colab)!1>590) *ceste enzime sunt "ie bazice "ie neutre! "iind acti%ate de ionii de calciu! mangan sau zinc! stabilizate de ionii de calciu &i in ibate de E7T*) ?etaloproteazele alcaline ac$ioneaz# doar asupra proteinelor! nu &i asupra peptidelor 'n timp ce metaloproteazele neutre degradeaz# 'n egal# m#sur# proteinele &i peptidele) In cazul acestora din urm# ac$iunea enzimatic# se mani"est# la extremitatea C==(! ceea ce permite 'ncadrarea lor printre dipeptidil+ carboxipeptidaze) 7e asemenea! s+a reu&it izolarea de la mai multe specii de Streptom8ces /S)rimosus! S)"radiae! S)peptido"aciens! S)griseus0 a unor peptidaze care! pe baza propriet#$ilor speci"ice /speci"icitatea

de substrat! in ibarea de c#tre E7T*! acti%are de c#tre ionii de calciu! magneziu! prezen$a leucinei la cap#tul .(2 terminal0 au "ost identi"icate ca "iind leucin+amino+peptidaze /Jitale &i colab)!1>560) Tin1nd cont c# 'n ultima %reme streptomicetele au 'nceput s# "ie utilizate drept gazde pentru clonarea de material genetic eterolog! este interesant de &tiut dac# tulpinile utilizate de obicei drept acceptori elaboreaz# sau nu proteaze) Producerea unor asemenea enzime la aceste tulpini constituie un serios impediment 'n ob$inerea produsului dorit) Pornind de la aceast# idee! *retz &i colab)/1>5>0 au studiat prezen$a enzimelor proteolitice la tulpina S)li%idans TH22! tulpin# recombinat# ob$inut# pentru prelucrarea &i secretarea unei proteine de "uziune /'ntre in ibitorul B+amilazei de la S)tendae &i proinsulina de la maimu$a ?acacca "ascicularis0) 7up# puri"icarea prin cromatogra"ie pe sc imb#tori de ion au "ost separate mai multe tipuri de enzime proteolitice- alanin+aminopeptidaze! leucin+aminopeptidaze! proteaze de tip tripsinic &i proteaze de tip c imiotripsinic) 7intre acestea! proteazele de tip c imiotripsinic /Qc emo+ tr8psin+liNeQ0 sunt cele care degradeaz# proteina de "uziune dar aceast# ac$iune poate "i in ibat# prin ad#ugarea 'n mediul de cultur#a unor s#ruri de zinc sau nic el) 7ac# 'n cazul bacililor au "ost izolate &i clonate genele ce codi"ic# sinteza a dou# subtilizine &i a unei proteaze neutre /?c Connell &i colab)!1>560! 'n cazul bacteriilor din genul

Streptom8ces studiile re"eritoare la determinismul genetic al producerii de proteaze sunt mult mai pu$ine) *st"el! 7uez &i colab)/1>590 au reu&it izolarea! clonarea &i sec%en$ierea genei pentru o peptidaz# extracelular# de la Streptom8ces sp)R61 la S)li%idans! iar (enderson &i colab)/1>590 au caracterizat genele pentru proteazele * &i B de la S)griseus) In cazul unor tulpini de streptomicete au "ost e%iden$iate unele enzime proteolitice care degradeaz# pre"eren$ial colagenul /Qcollagenase+liNeQ0/?uN opad 8a8 &i C andra! 1>590) 7e&i nu au "ost izolate &i puri"icate /s+au utilizat "iltrate de cultur#0 enzimele de tip colagenaze de la Streptom8ces au e%iden$iat o acti%itate speci"ic# pe colagen din tendon bo%in &i piele de %i$el! la 25 grade Celsius &i p( 9!2+9!4! "iind in ibate de E7T* &i azid# de sodiu) 7e&i neobi&nuit#! producerea unor asemenea enzime de c#tre streptomicete nu este surprinz#toare dac# ne g1ndim la multitudinea de substrate nutriti%e pe care aceste bacterii le pot g#si 'n sol) 7atorit# utiliz#rii proteazelor pe scar# larg# a crescut interesul "a$# de ob$inerea industrial# aacestor enzime) *cest "apt a dus la cercet#ri 'n domeniu pentru ob$inerea de tulpini 'nalt producti%e! pentru ob$inerea acestor enzime 'n stare de puritate a%ansat# &i pentru stabilirea parametrilor optimide acti%itate)= serie de proteaze sunt ob$inute industrial &i comercializate ca preparate enzimatice caresunt utilizate 'n di"erite sectoare ale industriei alimentare! "armaceutice! etc) C eltuielile materiale destinate realiz#rii unui mediu de cultur# reprezint# o propor$iesemni"icati%# din c eltuielile de produc$ie ale unui preparat enzimatic! ceea ce a "#cut ca de+alungul timpului! ingredientele unui mediu industrial s# "ie alese nu numai pe baza necesit#$ilor "iziologice ale microorganismelor ci &i pe baza pre$ului &i disponibilit#$ii lor)Pentru a cre&te &i a+&i des"#&ura procesele metabolice! microorganismele au ne%oie desurse de carbon! azot! s#ruri minerale! "actori de cre&tere &i ap#)

Avantaje si dezavantaje ale obtine ii ! oteazelo din tes"t" i ani#ale$ve%etale$&at si ! in inte #edi"l #i& oo %anis#elo

Reac$ii enzimatice similare pot a%ea loc 'ns# &i cu enzime izolate sau cu sistemeenzimatice extrase din di%erse surse bogate 'n enzime &i introduse apoi 'n procesele te nologice'n scopul realiz#rii unor trans"orm#ri dorite) *ceste enzime sau sisteme enzimatice izolate dinmediile 'n care au "ost elaborate se numesc preparate enzimatice) Ele se caracterizeaz# printr+o puritate mai mic# sau mai mare 'n "unc$ie de cantitatea &i tipul compu&ilor pro%eni$i din sursaenzimatic# ce le 'nso$esc) Cu alte cu%inte! preparatele enzimatice pot "i mai mult sau mai pu$in pure)Preparatele enzimatice ca atare se ob$in din urm#toarele materii primeAResuturi animale- "icat! pancreas! mucoas# stomacal#! inim#! rinic i; AResuturi %egetale- semin$e! cereale germinate &i negerminate! r#d#cini! se%#!latexuri! "runze; A?icroorganisme- bacterii! dro,dii! mucegaiuri; Cea mai important# surs# de enzime o constituie microorganismele deoarece+se pot ob$ine 'n cantit#$i mari/biomasa0 prin culti%area 'n instala$ii speciale pemedii de cultur# ie"tine/t#r1$# de gr1u! extract de porumb! melas#! &roturi desoia sau "loarea soarelui0; +ciclul de dez%oltare al microorganismelor este "oarte scurt "a$# de cel al plantelor sau animalelor; +produc$ia de enzime de c#tre microorganisme poate "i m#rit# prin selectare &iutilizarea de tulpini mutante! 'nalt per"ormante/producti%e0 &i prin stabilireacondi$iilor optime "izice &i c imice pentru producerea de enzime; +preparatele enzimatice ob$inute pot a%ea acti%it#$i di"erite! cu predominan$aunei acti%it#$i) Sursele de enzime de origine animal# &i %egetal# prezinta urmatoarelea%anta,eSdez a%anta,e+sunt sigure din punct de %edere al inocuit#$ii preparatelor enzimatice care seob$in; +asigur# ob$inerea cu preponderen$# a unui anumit tip de enzim#; +sunt limitate cantitati%; +preparatele enzimatice ob$inute sunt mai termosensibile

Des& ie ea eta!elo te'nolo%i&e

Ste iliza ea #ediilo de &"lt" (

Pentru buna des"#&urare a proceselor de ob$inere a enzimelor cu a,utorulmicroorga nismelor este esen$ial s# se pre%in# contaminarea acestora cu microorganisme str#ine)Pentru a distruge sau 'ndep#rta microorganismele nedorite din mediile de cultur# se practic#sterilizarea acestora) 7e asemenea se sterilizeaz# bioreactoarele! conductele! ori"iciile de intrare&i e%acuare a gazelor! robine$ii de luare a probelor) Sterilizarea se realizeaz# prin autocla%e sau"iltrare sterilizant#) Sterilizarea este mai ie"tin# &i mai e"icient# dec1t alte metode de sterilizare!de aceea este larg utilizat# 'n industria ob$inerii de preparate enzimatice! pentru distrugereamicroorganismelor nedorite) In timpul steriliz#rii! ca urmare a temperaturii ridicate la care sunt'nc#lzite mediile de cultura! pot s# apar# probleme de pierdere a biodisponibilit#$ii carbonuluisau de apari$ie de compu&i toxici sau in ibitori)=ri"iciile bioreactoarelor se sterilizeaz# prin "iltrare! utiliz1nd "iltre cu c eramic# poroas#! carbon granulat sau membrane sintetice sau "olosind cartu&e "iltra nte cu membranemicroporoase) Sterilizarea termic# a mediilor de cultur# se realize az# 'ntr+un regimtemperatur#Stimp capabil s# asigure omor1rea celor mai rezistente microorganisme- bacteriisporulate) 7eoarece sporii bacterieni rezist# la temperaturi de 100TC! pentru omor1rea lor estenecesar# 'nc#lzirea mediilor de cultur# la temperaturi mai ridicate / 120)))))140TC 0) 7urata'nc#lzirii depinde de temperatura de 'nc#lzire &i de ni%elul de contaminare al mediului) ='nc#lzire inutil# trebuie e%itat#! at1t din moti%e economice! c1t &i pentru a minimal izadegradarea termic# a nutrien$ilor) Se consider# acceptat un tratament termic 'n care propor$ia desupra%ie$uire a microorganismelor contaminante s# "ie de 1 la 1000) C1nd 'ntreprinderile produc#toare de enzime au doar c1te%a bioreactoare 'n dotare! sterili zarea mediilor sedes"#&oar# direct 'n bioreactoare) In acest scop! se in,ecteaz# abur 'n manta sau direct 'n bioreactor) C1nd se atinge temperatura de 100TC! ori"iciul de e%acuare al aburului este 'nc is!ceea ce creeaz# o presiune poziti%# &i permite cre&terea temperaturii) 7up# sterilizare! mediuleste r#cit p1n# la temperatura dorit# prin introducerea de ap# rece 'n manta) Gormarea%acuumului este e%itat# prin introducerea de aer steril 'n partea superioar# a bioreactorului) Intimpul r#cirii! mediul este amestecat pentru a "acilita trans"erul de c#ldur#) *colo unde exist#mai multe "ermentatoare 'n dotare! mediul este des sterilizat separat &i apoi trans"erat princonducte sterile! 'n bioreactoarele de,a sterilizate) *ceasta procedur# aduce a%anta,e economiceapreciabile prin scurtarea perioadei de "unc$ionare a bioreactoarelor! utila,e a c#ror "unc$ionareeste costisitoare! durata de sterilizare a unui "ermentator gol "iind mai mic# dec1t a unuia plin cu mediu)

Fe #enta ea !e s"bst at solid

Sistemul de "ermentare pe substrat solid simuleaz# "ermenta$iile produse spontan 'nnatura) *cest proces a "ost intens exploatat din punct de %edere economic 'n $#rile asiatice) Instatele occidentale! existen$a sa a "ost aproape complet ignorat# din momentul descoperirii"erment#rii submerse! la 'nceputul anilor 20) In ultimii zece ani 'ns#! interesul pentru acest tipde "ermentare a ren#scut &i procesul &i+a g#sit numeroase aplica$ii! care pot "i 'mpar$ite 'n dou#categoriiA*plica$ii socio+economice!ca ob$inere de compost din de&euri! ob$inerea de "ura,e!%alori"icarea subproduselor ligno+celulozice sau a celor rezultate la prelucrare a produselor alimentare de baz#; A*plica$ii cu pro"il economic! ca producerea de enzime! acizi organici &i alimente"ermentateSistemul de "ermentare pe substrat solid a "ost pre"erat celui submers! datorit# a%anta,elor sale! dintre care e%iden$iem urmatoarele+Condi$iile de dez%oltare a microorganismelor sunt mai asem#n#toare celor din abitatullor natural! din acest moti% ele sunt mai capabile s# produc# anumite enzime &imetaboli$i ce sunt de obicei ob$inu$i industrial prin culti%are 'n sistem submers) +Golose&te medii relati% simple) Substraturile solide ac$ioneaza ca surs# de carbon! azot!s#ruri minerale! "actori de cre&tere &i au capacitatea de a absorbi apa! ceea ce asigur#necesit#$ile "iziologice ale microorganismelor) +7eoarece sporii sunt utiliza$i direct 'n "ermentare! nu mai sunt necesare tancuri deinoculare &i nici ob$inerea de inocul %egetati%) Trebuie a%ut 'ns# 'n %edere s# seasigure o concentra$ie de spori de cca 104))))106Sg mediu) +.ecesarul de oxigen pentru cre&terea microorganismelor este asigurat de oxigenul dinaer &i 'ntr+o mic# m#sur#! de oxigen dizol%at 'n apa asociat# cu particulele solide)Germentatoarele 'n sistem solid nu mai necesit# existen$a unui sistem de aerare ca 'ncazul "ermentatoarelor 'n sistem submers! dar pentru ca trans"erul de oxigen s# "iemai e"icient! 'n substrat trebuie s# se asigure "ormarea de canale de aer) Jiteza detrans"er a gazelor este mult mai mare 'n "ermenta$iile pe mediu solid dec1t la cele 'nsistem submers! datorit# raportului mai mare existent 'ntre aria inter"e$ei solid+lic id&i %olumul de lic id) +Spa$iul necesar ec ipamentului de "ermenta$ie este mic comparati% cu randamentul procesului! deoarece se utilizeaz# mai pu$in# ap# &i substratul este mai concentrat) +Produsul dorit poate "i extras din "ermentator prin ad#ugarea direct# de sol%ent) +In cazul producerii de enzime! datorit# concentra$iei ridicate de enzim# 'n "aza lic id#!se realizeaz# un grad ridicat de recuperare cu un consum mic de energie)

+7atorita umidit#$ii sc#zute a mediului posibilitatea de contaminare cu bacterii este maimic#) +Complexitatea ec ipamentelor 'ntr+un laborator! sta$ie pilot! "abrica nu este mai mare dec1t cea pentru "ermentarea con%ec$ional#) +Consumul de energie la "unctionarea instalatiilor este mai mic comparati% cu cel al bioreactoarelor cu agitator):a ni%el industrial! "ermentarea pe substrat solid are loc 'n sisteme simple s auso"isticate! 'n "unc$ie de condi$iile existente la ni%el mondial)Instala$iile "olosite pentru ob$inerea preparatelor enzimatice sunt similare celor utilizatela ob$inerea produselor "ermentate) Cele mai utilizate instala$ii sunt+Germentatorul cu pl#ci; +Germentatorul cu strat "ix; +Germentatorul tip tob# rotati%#; +Germentatorul tip tanc cu agitare) Pentru aceast# "ermenta$ie %om "olosi "ermentator tip tanc cu agitare) Intr+un"ermentator tip tanc cu agitareexist# unul sau mai multe transportatoareelicoidale! care sunt plasate %ertical pentru a permite amestecarea s ubstratului) Uneori!trasportoarele se pot deplasa prin stratul de substrat pe &ine orizontale plasate deasupra tancului)= alt# con"igura$ie de tanc cu agitare se ob$ine cu o tob# care nu se rote&te! 'n care substratuleste amestecat cu a,utorul unor palete pe un ax coaxial! rotit cu a,utorul unui motor)Producerea de enzime la ni%el industrial trebuie realizat# cu e"icien$a c1t mai mare!moti% pentru care este de dorit ca durata procesului "ermentati% s# "ie c1t mai scurt#! enzima deinteres s# "ie ob$inuta 'n cantitate c1t mai mare! iar c eltuielile de produc$ie s# "ie c1t maireduse) In practic# este necesar s# se "aca un compromis 'ntre aceste deziderate! pentru a reu&is# se asigure microorganismelor condi$ii optime de dez%oltare) .ecesit#$ile nutri$ionale &i de aerare ale microorganismului produc#tor d e enzim#%ariaz# pe parcursul procesului "ermentati%! deoarece cantitatea de biomas# cre&te 'n timp iar condi$iile de mediu / concentra$ie de nutrien$i! p(! temperatur#0 se modi"ic#) Pentru a "i siguric# necesit$ile unei culturi sunt asigurate pe toat# durata procesului "ermentati %! trebuiecontrola$i "actorii care 'i in"luen$eaz# dez%oltarea) Un sistem de control automat al unui bioproces con$ine urm#toarele elemente-+ instrumente de urm#rire &i masurare-+ instrumente de control; instrumente de operare)7up# producerea enzimei de c#tre organismul dorit! procesul de "abricare a preparatelor enzimatice continu1 cu recuperarea enzimei &i puri"icarea ei! apoi cu stabilirea &i sandardizareaacti%it#$ii preparatului ob$ional) *ceste etape permit ob$inerea unui produs "init capabil s#satis"ac# di%ersitatea necesit#$ilor de utilizare a preparatelor

enzimatice) Etapa biologic# de biosintez# este urmat# de o serie de opera$ii! care conduc la separarea enzimelor) In cazul"ermenta$iilor des"#&urate pe substrat semisolid! biomasa agentului produc#tor de enzime se'ntrep#trunde cu componentele mediului! celulele "iind "ixate prin adsorb$ie+ absorb$ie de particulele solide! ceea ce 'mpiedic# separarea lor) In aceast# situa$ie! prin aplicarea unui regim bl1nd de uscare! ce pre%ine inacti%area enzimelor! se pot ob$ine preparate enzimatice brute! carecon$in un ec ipament enzimatic complex) C1nd se urm#re&te separarea unor enzime localizateintracelular se realizeaz# mai 'nt1i dezintegrarea pere$ilor celulari &i a membranelor! dup# carese aplic# opera$iile de extrac$ie &i separare a enzimei de resturile celulare) ?ediile lic ide dup#"ermentare pot s# con$in# enzime 'n propor$ie 1)))43 din substan$a uscat# ini$ial# a mediului!nutrien$i &i metaboli$i reziduali / 4))))103 din substan$a uscat# a mediului 0 &i o biomasaalc#tuit# din totalitatea celulelor inoculate &i dez%oltate 'n etapa de "ermentare! care poateconstitui 2)))103 s)u) a mediului de cultur#)Pentru separarea particulelor de dimensiuni mari se "olosesc "rec%ent opera$iile de tipulcentri"ug#rii! "iltr#rii! sediment#rii) *legerea uneia din aceste opera$ii este condi$ionat# de natura agentului produc#tor de enzime! de dimensiunea celulelor &i cre&terea %eget ati%#)Biomasa de mucegai se separ# cel mai "acil prin "iltrare) Separarea celulelor produc#toare deenzime de mediul nutriti% se poate realiza de la 'nceputul "ermenta$iei prin utilizarea demembrane de dializ#) *ceste culturi poart# denumirea de culturi Ude dializ#U) Ruperea pere$ilor celulari &i a membranelor reprezint# primul pas pentru eliberarea enzimelor din celule) *ceast#opera$ie poate "i realizat# prin metode "izice! c imice sau bioc imice / enzimatice 0)*legerea lic idului de extrac$ie depinde de enzim#! de solubilitatea ei! de tipul de $esut 'ncare se g#se&te aceasta &i de "aptul c# este sau nu legat# de membrana celular#) Jolumul deextractant "olosit trebuie s# "ie de aproximati% trei ori mai mare dec1t %olumul biomasei dincare se realizeaz# extrac$ia) Cea mai simpl# metod# de ob$inere a preparatelor enzimatice solideeste pul%erizarea &i uscarea concentratului enzimatic) Pentru a ob$ine un produs "init a%1nd o puritate &i o stabilitate satis"#c#toare! lic idului enzimatic trebuie s# i se aplice un num#r minimde tratamente! cu o pierdere minim# de acti%itate)Inainte de a "i o"erite spre %1nzare! enzimele sunt stabilizate! standardizate &i controlatedin punct de %edere al siguran$ei 'n manipulare &i pentru cele care %or "i utilizate la ob$inerea produselor alimentare! din punct de %edere al siguran$ei alimentare)

Ult a)ilt a ea
In multe cazuri! 'n special c1nd se preg#tesc de %1nzare enzimele extracelulare! solu$ialimpede con$in1nd enzima este simplu concentrat# apoi i se adaug# conser%an$ii &i produsulrezultat este %1ndut ca solu$ie sau ca preparat uscat) Procesul de concentrare %a "i cel mai ie"tin procedeu compatibil cu men$inerea acti%it#$ii enzimatice) Pentru unele enzime! se poate aplicae%aporarea 'n "iltre rotati%e! urmat#! dac# este necesar! de uscare prin pul%erizare) Cea mai popular#

metod# de concentrare este totu&i ultra"iltrarea/ procedeu prin care apa &i moleculelecu mas# molecular# redus# sunt 'ndepartate prin trecerea sub presiune prin membrane care re$inenzima0) Ultra"iltrarea di"er# de "iltrarea con%en$ional# &i de micro"iltrare 'n ceea ce pri%e&tedimensiunile particulelor care sunt re$inute) Ultra"iltrarea utilizeaz# membra ne cu poriasimetrici sub$iri! sus$inute de structuri rigide) ?embranele cu capacitatea de re$inere a proteinelor cu mas# moleculara de 1000))))100000 7a sunt utilizabile l a presiuni de p1n# la2?pa)Celulele de ultra"iltrare sunt cilindrice &i sunt pre%#zute cu agitator magnetic pentru acombate polariz#rile) ?embrana este "ixat# pe un suport la baza %asului) *cest tip de celule deultra"iltrare nu este potri%it pentru a "i utilizat pe scar# larg#! dar este "olositor 'n studii preliminare &i pentru concentrarea eluan$ilor din coloanele de separare de laborator) Celulele deultra"iltrare industriale prezint# membrane tubulare cu diametre de 1)))2 cm! care sunt grupate 'nm#nunc iuri) *ceastea nu sunt la "el de compacte ca sistemele capilare &i sunt scumpe! dar mai pu$in susceptibile la colmatare cu particule de dimensiuni mari)Sisteme ie"tine cu canale "ine sunt disponibile &i sunt utilizate camembrane suprapuse 'n di"erite moduri pentru a produce curgerea laminar# a lic idului prinmembrane &i pentru a minimaliza polariz#rile) ?embranele capilare reprezint# u n tip deultra"iltrare relati% ie"tin &i a%1nd popularitatea 'n cre&tere! care utilizeaz# m embranemicrotubulare cu 0!2))))1!1 mm a%1nd supra"a$a mare de membran# 'ntr+o unitate de %olummic#) ?embranele sunt de obicei montate 'n module pentrumanipulare con%enabil#) *ceast# con"igura$ie a membranelor poate "i u&or marit# la scar#)?odelele comerciale disponibile permit ultra"iltrarea cu %iteza mare! de 600 dm@per )Continua 'mbun#t#$ire a per"orman$elor! durabilit#$ii &i siguran$ei membranelor a "ostun ade%#rat cadou pentru enzimologi! 'ncura,1nd larga utilizare a di"eritelor con"igura$ii deultra"iltrare) Problemele de colmatare pot "i dep#&ite prin tratarea membranelor cu detergen$i! proteaze sau a%1nd gri,#! cu acizii sau baze) Costul ini$ial al membranelo r este ridicat! dar membranele moderne sunt rezistente &i e"iciente) Ultra"iltrarea produce pierderi "oarte mici ale acti%it#$ii enz8matice)

S&'e#a te'nolo%i&a de obtine e in &onditii de labo ato a ! e!a at"l"i enzi#ati&

S&'e#a te'nolo%i&( de ob*ine e a ! oteazelo de As!e %ill"s o +zae

PRED*TIRE* ?E7IU:UI 7E

&" ino&"l

PRE(I7R=:I K* TER?IC* *cid sul"uri cS carbon at de sodiu *VUST*RE p(

STERI:IK* RE R*CIRE

I.=C U:

BI=SI.TEK * E.KI?E:=R PR=TE=:ITI SEP*R* RE

GI:TR* RE SUB JI7 EPTR*C T PR=TEIC T=T*: U:TR*GI:TR* RE

BI=?*S * GU.DIC *

PER?E* T

SEP*R*R E

CR=?*T=DR*GI E PE SC(I?B 7E I=.I XY62 3 PR=TE* KE *:C*:I. PRECIPIT* RE R*CIR E CE.TRIGUD* RE SUPER.*T* .T 7I*:IK * GI:TR*RE STERI:IK* T* PREP*R*T E.KI?*TIC

PR=TE* KE .EUTRE

*CET= .* 923

BI=?*S*

,ilant"l de #ate iale

?ediul de cultura- +"aina de soia 2!43 +amidon solubil 2 g 3 +extract de porumb 0!43 +H(2P=2 2? +?gS=2W9(2= 0!012g3 +apa

100g mediu culturaZ2!4 g "aina de soiaZ2g amidonZ)0!4g extractZ)2? N(2P=2)))0!012g ?gS=2Z11g apa 1400g mediu culturaZx1ZZZZZZZZZ))x2ZZZZZZZ)x@ZZZZZZZZZZZ x2ZZZZZZZ)x4ZZZZZZZ)x6 P1Y@9!4 g "aina soia P2Y@0 g amidon P@Y9!4 g extract porumb P2Y@0 ? H(2P=2 P4Y0!15 g ?g S=2 P6Y164 g ap*

?E7IU 7E CU:TUR*

STERI:IK*RE

?E7IU STERI:

PIER7ERI 0!43 ?ediuculturaY1400 g ?ediu

steril

Y1400+1400[o!43Y12>2!4\12>@g

?E7IU STERI:

R*CIR

?E7IU RECE PIER7ERI 0!43

?ediureceY12>@+12>@[0!43Y1256g

?E7IU STERI: RECE GER?E.T*TIE

?E7IU :IC(I7 7E GER?E.T*RIEWI.=CU :*RE PIER7ERI 13

CU:TUR* ST*RTER

CU:TUR* ST*RTERY43[?E7IUY43[1256Y92!@

?E7IU STERI: RECEW CU:TUR* Y?E7IU GER? W PIER7ERE 1256W92!@Y?E7IU GER? W12!56 ?E7IU GER?Y1424!22\1424 g BI=?*S* ?E7IU GER? CE.TRIGUD* RE :IC(I7 CU:TUR*: PIER7ERI 0!43

:IC(I7 CU:TUR*:Y?E7IU GER?WBI=?*S*WPIER7ERI BI=?*S*Y103 [ ?E7IU GER?Y103[1424Y142!4 g :IC(I7 CU:TUR*:Y1424+142!4+9!9@Y1@52!99\1@5@ g

:IC(I7 CU:TUR*:

GI:TR*R E

PIER7ERI 1!43

PREP*R*T E.KI?*TIC

PREP*R*TU: E.KI?*TICY:IC(I7 CU:TUR*+PIER7ERI PREP E.KY1@5@+20!92Y1@62!26\1@62 g ?*TERI*:E I.TR*TE .R)CR T 1 2 7E.U?IRE G*I.* S=I* *?I7=. S=:UBI: EPTR*CT P=RU?B H?2P=2 ?gS=2 g 9!4 @0 0!15 @ 2 4 U? C*.TIT*TE ?*TERI*:E IESITE .R)CR T) 1 2 7E.U?IRE ?E7IU STERI: PIER7ERI ?E7IU STERI: RECE PIER7ERI ?E7IU GER?E.T* g 1256 9!26 1424 U? C*.TIT*TE*

@9!4 @0

12>@ 9!4

@ 2 4

TIE 6 9 5 > *P* ?E7IU CU:TUR* ?E7IU STERI: CU:TUR* ST*RTER ?E7IU STERI: RECE ?E7IU GER?E.T* TIE :IC(I7 CU:TUR*: 164 1400 12>@ 92!@ 6 9 5 > PIER7ERI BI=?*S* :IC(I7 CU:TUR*: PIER7ERI PREP*R*T E.KI?*TIC PIER7ERI 1424 11 12!56 142!4 1@5@ 9!9@

10

1256

10

1@62

11

20!92

12 T=T* :

1@5@ 9941!25 9251!9>

Utilaj"l ! in&i!al-des& ie ea &onst "&tiv( .i )"n&*ional(

Bioreactorul corespunz#tor realiz#rii "ermenta$iei este )e #entato "l ti! tan& &" a%ita e)Un bioreactor este un dispoziti% 'n care un substrat de %aloare mic# este utilizat decelule %ii sau enzime pentru a genera un produs de %aloare mai mare) Bioreactoarele sunt larg"olosite pentru prelucrarea produselor alimentare! "ermenta$ie! tratarea de&eurilor! etc)El este un rezer%or mare din o$el inoxidabil "olosit pentru a cre&te microorganismele produc#toare 'n produc$ia industrial# de enzime &i alte substan$e c imice) 7up# ce rezer%oruleste sterilizat cu abur! un inocul de celule de produc#tori este introdus 'ntr+un mediu care estemen$inut de sonde! 'n condi$ii optime de temperatur#! presiune! p( &i ni%elul de oxigen pentru produc$ia de enzime) Un agitator amestec# mediul! care este 'n mod constant aerat) Este esen$ialca mediul de cultur# s# "ie steril &i s# con$in# cerin$ele nutri$ionale corespunz#toare pentrumicroorganisme) C1nd nutrien$ii au "ost utiliza$i produsul este separat ; 'n cazul 'n careprodusuleste un compus extracelular! mediul poate "i eliminat 'n cursul "azei de cre&tere a microorganismelor!dar un produs intracelular trebuie s# "ie recoltat atunci c1nd cre&

tereaculturilor lot se opre&te) Unele bioreactoare sunt proiectate pentru culturi continue)

Bioreactor tip tanc ce foloseste deflectoarele i un agitator pentru amestecarea optim i recicleaz biomas

Caracteristicile de"initorii ale bioreactoarelor continue este un proces de r#nire perpetuu) Un mediu de cultur# care este "ie steril sau cuprins din microorganisme este alimentatcontinuu 'n bioreactor pentru a men$ine starea de ec ilibru) 7esigur! prod usul este! deasemenea! tras continuu din reactor) Jariabilele reac$iei &i a parametrilor de control r#m1ncoerente! stabilind o constant# de timp 'n interiorul reactorului) Rezultatul este producti%itateacontinu# &i produsul)*ceste sisteme o"er# un num#r de a%anta,e! inclusi%A Cre&terea poten$ialului pentru automatizarea procesului) A Reducerea c eltuielilor "or$elor de munc#! datorit# automatiz#rii A ?ai pu$in timp non+producti% c eltuit 'n golire! umplere &i sterilizare reactor ) AProdus de calitate datorit# parametrilor de "unc$ionare in%ariabili A Riscurile de toxicitate sc#zute la personal! datorit# automatiz#rii) A Reducerea stresului pri%ind instrumentele pentru sterilizare) 7eza%anta,ele bioreactoarelorcontinueAGlexibilitate minim#! deoarece sunt posibile numai u&oare %aria$ii 'n proces/compo zi$ia mediului! concentra$ia de oxigen &i temperatura0) AUni"ormitatea materiei prime de calitate este necesar# pentru a se asigura c# procesulr#m1ne continuu) AIn%esti$ii &i costuri mai ridicate 'n control &i ec ipamente de automatizare &i crescc eltuielile pentru sterilizarea continu# a mediului)

Di#ensiona ea bio ea&to "l"i

7in bilan$ul de materiale pentru "ermentare a"l#m %olumul de lic id din bioreactorJ:IC(I7Y?S] J:IC(I7Y1400S2222Y0!61 m@ Jom alege coe"icientul de umplere 'ntre %alorile- cu Y 0!9 )) 0!5) Jaloarea aleas# este cu Y 0!5)Jolumul reactorului se calculeaz# ast"elJTYJ:IC(I7SCU JTY0!61S0!5

JTY0!9m@

CONCLUZII
Preparate e e!"#$at#ce pot f# o%&#!'te d#! ('r(e )e*eta e+ ('r(e a!#$a e+ $#cro%#o o*#ce.St'd## e pr#)#!d o%&#!erea protea"e or ac#de a' de$arat ,! a!' -./0+ c1!d a' fo(t o%&#!'te protea"e ac#de+ ter$#(ta%# e+ c' (pec## ter$of# e a e *e!' '# M'cor 2 c' te$perat'ra opt#$3 dede")o tare 44..../05C 6. 7!cepa!d d#! -.80 a' fo(t #!#&#ate (t'd## pr#)#!d o%&#!erea de protea"eac#de c' $'ce*a#'r# d#! *e!' A(per*# '( 2 A. N#*er+ A. Or9"ae6 pr#! c' t#)area ,! (#(te$ SSF pe ore" (a' *r1'. Preparate e e!"#$at#ce o%&#!'te ('!t co$p e:e+ co!&#! pe 1!*3 protea"e (#a$# a"e+ ce ' a"e. Protea"e e ac#de (e o%&#! #!d'(tr#a pr#! c' t#)area ,! (#(te$ SSF. De;# (e poate adopta pe!tr' %#o(#!te"3 ;# procede' c' t'r# or ('%$er(e+ ,! ace(t ca" ra!da$e!te e deo%&#!ere a preparat' '# e!"#$at#c ('!t $a# (c3"'te. 7! *e!era + co!d#&## e opt#$e de %#o(#!te"a a protea"e or ('!t d#fer#te de co!d#&## e opt#$e de cre;tere+ pe!tr' f#ecare a*e!t prod'c3tor #$p'!1!d'<(e opt#$#"area co!d#&## or fer$e!tat#)e.Mater#a pr#$3 fo o(#t3 ,! o%&#!erea e!"#$e or e(te A(per*# '( N#*er. Ace(t *e! pre"#!t3'! deo(e%#t #!tere(+ pe de o parte dator#t3 ap #ca&## or %#ote=!o o*#ce prec'$ ;# dator#t3 fapt' '#c3 '!## repre"e!ta!&# ('!t c'!o(c't# ca pato*e!#.A(per*# '( e(te ('r(a de ac#"# or*a!#c#+ e!"#$e ;#fer$e!ta&#e. Fo o(#rea $#croor*a!#($e or ca pr#!c#pa a ('r(3 de e!"#$e (e datorea"3 fapt' '# c3(e pot o%&#!e ca!t#t3&# $ar# de %#o$a(3 ,! t#$p re at#) (c'rt ;# ,! co!d#&## %#!e co!tro ate+ c1t ;#fapt' '# c3 (e pot rea #"a !#)e e e!"#$at#ce cre(c'te pr#! #!ter)e!&## a('pra $ed#' '# de c' t'r3;# a para$etr# or de %#oproce( (a' a('pra $ater#a ' '# *e!et#c a $#croor*a!#($' '# ,! proce(e efer$e!tat#)e f#e ,! (#(te$ ('%$er(+ f#e pe ('%(trat'r# (o #de.