DETERMINAREA LIPIDELOR DIN ALIMENTE Lipidele sunt compui organici naturali larg rspndii n organismele vii.

Din punct de vedere al structurii lor, lipidele constituie o clas eterogen de compui, n general, esteri ai alcoolilor (trioli, steroli - monoalcooli secundari ciclici, care deriv de la o hidrocarbur policiclica, numit steran , alcooli superiori) cu acizi grai superiori. Lipidele se clasific n: - lipide simple subdivizate n: - gliceride - esteri ai glicerolului cu acizi grasi superiori - se numesc grasimi neutre, - steride - esteri ai sterolilor cu acizi grasi superiori, - ceride - esteri ai monoalcoolilor alifatici superiori cu acizi grasi superiori, - etolide - formate din hidroxiacizi superiori, esterificai intermolecular; gruparea carboxilic a unui hidroxiacid, reacioneaz cu gruparea hidroxilic a celuilalt acid; - lipidele complexe (heterolipide) subdivizate n: - glicerofosfolipide fr azot (acizi fosfatidici, inozitofosfatide) - glicerofosfolipide cu azot (gliceroaminofosfatide: lecitine, cefaline, serinfosfatide) - lipide derivate. Structura hidrofob apolar a lipidelor, explic insolubilitatea lor n ap i solubilitatea lor n solveni organici (eter, cloroform, benzen, tetraclorur de carbon, aceton, alcool) i n amestecuri ale acestora. Majoritatea metodelor de determinare a lipidelor din alimente se bazeaz pe extracia acestora cu solveni alei convenabil folosind metode gravimetrice, volumetrice i fizicochimice. Amestecul extras cu solveni, rmas dup ndeprtarea acestora, este constituit din lipide, ceruri, rini, uleiuri eterice, pigmeni vegetali .a. i constituie ceea ce se numete grsimi brute. 1. Metodele gravimetrice prezint dou variante: - metode indirecte - extracia se face cu poriuni repetate de solvent proaspt pn la epuizarea lipidelor, urmat de cntrirea probei delipidate. - metode directe - se face extracia repetat ca mai sus, i se cntresc grsimile din soluie, dup ndeprtarea solventului. Observaii: 1. Alegerea solventului se face astfel ca extracia lipidelor s fie total (att cele libere ct i cele legate). innd cont de faptul c lipidele pot fi slab polare (trigliceridele), puternic polare, respectiv pot fi legate (de exemplu de proteine), extracia total poate fi asigurat prin folosirea consecutiv a dou serii de solveni. n prima faz, se folosesc solveni nepolari (eter de petrol, hexan, etc.), apoi solveni polari (eter etilic, alcooli, solveni clorurai, etc.), sau n ordine invers (vezi tabelul 1.). Soluiile astfel obinute se reunesc, sunt evaporate, iar reziduul este apreciat gravimetric (prin cntrire). 2. Alegerea condiiilor (cald sau rece) - cldura faciliteaz extragerea lipidelor - se evit astfel, expunerea prelungit a extractelor lipidice la aciunea aerului, deoarece prin oxidare apar variaii de greutate.
1

Tab. 1. Polaritatea solvenilor High Polarity Water Acetic Acid Methanol Ethanol Propan-1-ol Acetonitrile Ethyl Acetate Acetone Dichloromethane Chloroform Diethyl Ether Toluene (Methyl Benzene) Cyclohexane n-Hexane Low Polarity

3. Deshidratarea prealabil a probei - apa restant poate fi antrenat de solvent afectnd precizia rezultatelor i poate iniia hidroliza lipidelor care le afecteaz greutatea; n cazul alimentelor bogate n zahr, deshidratarea se face prin mojararea probei cu sulfat de sodiu anhidru. 4. Digerarea acid a probei - nainte de extracie, o prob de 2-5 g se fierbere timp de 5 min. cu 20 ml HCl 6M. Soluia obinut se extrage prin agitare de 3-5 ori cu poriuni proaspete de eter etilic - eter de petrol sau alte perechi de solveni.

5. Digerarea alcalin a probei se face prin refluxare cu o soluie alcoolic de hidroxid de amoniu. n aceste condiii, proteinele precipit. Soluia obinut, se face utiliznd solveni cu polaritate diferit, ca mai sus. 6. Dac se folosete percolarea n locul extraciei manuale, soluia obinut la digerare se filtreaz, se spal sedimentul cu ap cald, se usuc filtratul la 100-105oC, iar dup rcire se trece la extracie, n extractor. 7. Pentru creterea suprafeei de contact cu solventul, care duce la extracie mai rapid probei este pulverizat i amestecat cu material inert (ex. nisip purificat). 8. Pentru facilitarea procesului de extracie se utilizeaz un dispozitiv numit extractor Soxhlet. Determinarea lipidelor totale dupa metoda Soxhlet http://www.chem-ilp.net/index.htm Extracia grsimilor n solveni se realizeaz cu ajutorul extractorului Soxhlet, iar determinarea se face prin dou metode: - metoda direct, care const n cntrirea reziduului dup extracie i dup ndeprtarea solventului; - metoda indirect, care const n determinarea fraciunii extrase ca diferena dintre masa probei nainte de extracie i dup extracie. Metoda direct - Se cntresc la balana analitic o prob (5) de 5-10 g din alimentul uscat anterior la 95oC (notat m1), i se introduc n cartuul extractorului Soxhlet (4), dup ce acesta din urm a fost adus la mas constant. - Se cntrete de asemenea, balonul de distilare (2) (mo), n care s-au introdus buci de porelan poros (1), pentru reglarea fierberii. - Se introduce n balon solventul ales pentru extracie intr-o cantitate care s realizeze o sifonare, i n plus, un exces de 20-30 mL. - Se monteaz cartuul de extracie i refrigerentul ascendent (9) i se ncepe nclzirea pe baia de ap nclzit electric.
2

Prin nclzirea balonului, vaporii de solvent ajung prin (3) n refrigerent, unde se condenseaz i cad n cartuul cu prob, extrgnd o parte din substanele solubile n solventul utilizat. - Nivelul solventului din extractor crescnd mereu, n momentul n care ajunge la 1: Granule de porelan nlimea cotului tubului de 2: balon de distilare (vas de sifonare (6) se va scurge, prin extracie) - volumul de solvent sifonare (7), atrennd deci i o n balonul de distilare trebuie s parte din lipidele (plus alte fie de 3-4 ori mai mare dect substane amintite) din prob. volumul cartuului de extracie - Solventul din balon distilnd, Soxhlet. va urma, n continuare, acelai 3: Distillation path drum (refrigerent-extractor) 4: cartu de extracie Soxhlet transportnd o nou cantitate de 5: Reziduu solid obinut dup substan extras. extracie - Dup 15-20 sifonri (3-4 ore) 6: racord (tub) de sifonare se ntrerupe nclzirea. 7: evacuarea braului de sifonare - Dup rcire se demonteaz 8: adaptor cu reducie balonul, se ndeprteaz 9: refrigerentul ascendent solventul, prin distilare, se 10: intrare ap de rcire usuc balonul ntr-o etuv la 11: ieire ap de rcire 105oC pn la mas constant - Dup prealabila rcire (cam 1/2 or) ntr-un exicator cu CaCl2 anh. se determin masa balonului ce conine substana extras (lipidele probei), prin cntrire la balana analitic. Calculul: Coninutul de substan extras reprezint diferena dintre masa balonului cu reziduul de extracie (mr) i masa balonului gol (mo), dinaintea extraciei. Raportat la 100 g material analizat, se obin % lipide (grsime brut). Pentru a verifica dac a fost extras ntreaga cantitate de lipide, este necesar repetarea operaiilor i compararea rezultatelor. Dac nu este cunoscut coninutul aproximativ de lipide al alimentului analizat i corelarea timpului de extracie (numrul de sifonri) cu acest coninut nu a fost corespunztoare, pot aprea erori. Metode automate de determinare a lipidelor Extragerea se face cu diclormetan din proba deshidratat cu microunde, ntr-un dispozitiv automat. Extractul este filtrat, iar reziduul este reuscat pentru ndeprtarea solventului remanent. Greutatea pierdut prin extracie este convertit n procente de grsime i poate fi citit pe cadranul digital al unui microprocesor.
3

2. Metode volumetrice de determinare a lipidelor Metoda Gerber - este o metod de rutin pentru determinarea lipidelor din lapte - Probele sunt tratate cu acid sulfuric concentrat, care distruge o mare parte a compuilor organici, elibernd lipidele. Prin adugare de solvent (n cantitate mic), lipidele sunt extrase i separate. - n locul acidului sulfuric se mai utilizeaz amestec de acid percloric-acid acetic, evitnd astfel, apariia unor compui de carbonizare ai hidrailor de carbon sau a proteinelor. Determinarea grsimii din lapte prin metoda acidobutirometrc Gerber. Gerber's method: Butyrometric determination of fat content in untreated and pasteurized milk - The Gerber method is rapid testing method by which the fat content in milk is determined using a Butyrometer. Chemicals needed: - Sulphuric acid 90% - Amyl alcohol 98% Equipment: - Calibrated butyrometer with suitable stopper - Pipette for milk 10.75 or 11mL - Measuring tap for 10 mL H2SO4 - Measuring tap for 1mL amyl alcohol - Heatable centrifuge Preparation of the test specimen: Bring the milk sample to 20C and mixed well to get an homogeneous distribution of the fat on the sample. Let the sample stand for 3 minutes to allow any pockets of air to disperse. Procedure: The same milk specimen must be tested twice. Make ready two milk butyrometers and add 10 ml of sulphuric acid in each with the measuring tap without wetting the neck of the butyrometer. Then pipette 10.75 or 11 ml of milk into the butyrometer in such a way that the butyrometer neck does not get wet and the milk does not mixed with the sulfuric acid. Add 1ml of amyl alcohol with the measuring tap. Be careful to avoid mixing of the liquids. Close the butyrometer with the stopper carefully.
4

Place the butyrometer in a butyrometer stand and shake vigorously until all liquids are thoroughly mixed. When the liquids are mixed a considerable a mount of heat and gas are produced. This can cause the stopper to shoot out or the butyrometer to break. Immediately after mixing place the butyrometers inside the heated centrifuge upsidedown. The butyrometers must be placed exactly opposite each other. Centrifuge 65C at 1100 for 4 minutes. Remove the butyrometer from the centrifuge without turning them and read results. Reading the results: After removing the butyrometer from the centrifuge it should be held vertically at a high where the meniscus of the column of fat is at eye level. With the help of the stopper locate the line between the residual mixture and fat on a subdivision of the butyrometer scale and read off the high of the column of fat at the lowest point of the meniscus. The result should be given in mass percent. DETERMINAREA PRINCIPALILOR INDICI AI LIPIDELOR Lipidele sunt caracterizate printr-o serie de constante i indici (densitate, punct de solidificare, indice de refracie, indice de aciditate, de saponificare, de iod). 1. Determinarea indicelui de aciditate - Indicele de aciditate reprezint cantitatea de KOH, n mg, necesar pentru neutralizarea acizilor grai liberi dintr-un gram de grsime. Grsimile naturale sunt neutre. Aciditatea lor apare n timpul conservrii sau prelucrrii, ca urmare a aciunii O2, din aer i a vaporilor de ap. Indicele de aciditate stabilit la date diferite d indicaii asupra intensitii procesului de degradare a grsimii. Principiul metodei: Metoda se bazeaz pe reacia de neutralizare a acizilor grai liberi cu KOH de titru cunoscut, n prezena unui indicator (fenolftaleina). Reacia de baz: R-COOH +KOH = R-COOK +H2O Reactivi necesari: - soluie KOH 0,1 N; - amestec de alcool i eter 1:2 sau alcool i benzen 1:2; - soluie alcoolic 1% de fenolftalein. Modul de lucru: - ntr-un flacon Erlenmayer de 100-150 mL se cntresc 3-5 grame (sau un volum de 2 mL de ulei cu densitatea cunoscut), care se dizolv n 20 mL alcool + eter neutralizat. - Se adaug 2-3 picturi de fenolftalein i, sub agitare, se titreaz cu o soluie KOH 0,1 N pn la roz persistent timp de un minut. Dac n timpul titrrii amestecul se tulbur, se nclzete uor prin scufundarea vasului ntr-o baie de ap cald. 2. Determinarea indicelui de saponificare - Indicele de saponificare exprima numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru a saponifica total un gram de grasime. Cu cat este mai mare masa moleculara a gliceridei, respectiv a acizilor grasi, cu atat cantitatea de hidroxid de potasiu necesara saponificarii este mai mica. Deci valoarea indicelui de saponificare da indicatii asupra constitutiei chimice a grasimii cercetate.
5

Reactivi: - solutie alcoolica de hidroxid de potasiu aproximativ 0,5 N - se prepara dizolvand 32 g KOH in putina apa si completand la 1000 ml cu alcool 95. - fenolftaleina - soluie 1% in alcool 95 - soluie de acid clorhidric 0,5 N (solutie titrata) Modul de lucru: Intr-un flacon E de 150 - 200 ml se cantaresc 1 - 2 g prob, la care se adauga apoi 25 ml hidroxid de potasiu alcoolic. Se pune dopul flaconului, prin care trece un refrigerent ascendent racit cu apa. Flaconul se incalzeste pe o baie de apa fierbinte, 30 - 40 minute, dup care, solutia din flacon se titreaza cu acid clorhidric 0,5 N. Daca solutia este puternic colorata, se dilueaza cu alcool pentru a facilita observarea culorii roz a fenolftaleinei. Intr-un alt flacon se face o titrare martor cu 25 ml de hidroxid de potasiu alcoolic. Calcul: Diferenta dintre numarul de mililitri folositi la titrarea solutiei martor (V1) si a celor folositi la titrarea solutiei cu grasime (V2), da numarul de mililitri de hidroxid de potasiu intrebuintati la saponificarea grasimii luata in lucru. Se calculeaza apoi numarul de miligrame hidroxid de potasiu necesar pentru saponificarea unui gram de grasime, care reprezinta indicele de saponificare exprimat n (mg/mL). (V1-V2) . FHCl . T Indicele de saponificare = ---------------------m unde m - masa probei luata in lucru TKOH = 0,028 mg/ml 3. Determinarea indicelui de iod Substantele grase, in conditii determinate, pot fixa pe dublele legaturi ale acizilor grasi nesaturati, cantitati mai mari sau mai mici de iod sau de alti halogeni. Numarul de grame de iod pe care-l poate fixa o cantitate de 100 g substanta grasa se numeste indice de iod. Ca urmare, indicele de iod indic gradul de nesaturare al grasimilor si variaza intre limite destul de mari. In uleiurile vegetale, dupa marimea indicelui de iod, exista trei categorii de uleiuri: - uleiuri sicative (de in, canepa, mac, nuca etc.) care au indicele de iod cel mai mare - de obicei peste 120. - uleiuri semisicative (de rapita, bumbac), care au indicele de iod cuprins intre 100 si 120. - uleiuri nesicative (de migdale, masline) cu indicele sub 90, de obicei cuprins intre 30 i 60. Indicele de iod nu este o constanta in sensul strict al cuvantului, deoarece variaza, in limite nu prea largi, dup felul cum a fost procesat grasimea, dup gradul de maturare al fructelor sau semintelor din care a fost extras, dup modul de pastrare, dup vechime, etc. In general o influenta mare asupra acestui indice au condiiile de depozitare i vechimea, deoarece n timp, se pot fixa cantitati mai mari sau mai mici de oxigen la duble legaturi, proces numit rancezire.
6

Exista mai multe metode de determinare a acestui indice. Diferenta dintre acestea consta in modul de preparare a solutiei de iod si timpii de actiune. Determinarea indicelui de iod dup metoda Hanus. Principiul metodei - se utilizeaz o solutie de monobromura de iod n acid acetic, care are durata de actiune de numai 15 minute. Proba de grasime se tratreaza cu exces de reactiv, iar iodul ramas nefixat se titreaza cu o solutie de tiosulfat de sodiu. Ca indicator se foloseste o solutie de amidon. Tiosulfatul de sodiu reactioneaza cu iodul, conform reactiei: I2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6 Reactivi necesari: - reactiv Hanus: 6 g iod fin pulverizat se trece intr-un balon cotat de 500 ml cu putin acid acetic glacial, se adauga apoi 4 g brom si se agita pana la dizolvarea completa a iodului. Se completeaza la semn cu acid acetic glacial. - Tiosulfat de sodiu solutie 0,1 N (solutie titrata) - Iodura de potasiu - Cloroform - Amidon (solutie 0,1% indicator) Modul de lucru: Intr-un flacon Erlenmayer cu dop slefuit se cantaresc: - 0,1 0,2 g ulei cu indicele 120 sau - 0,2 0,4 g grasime cu indicele 80- 120 sau - 0,4 0,8 g grasime cu indicele 80 Aceast mas se noteaz (m). Se adauga apoi 15 ml cloroform, 15 ml reactiv Hanus si se lasa la intuneric 15 minute. Se adauga apoi 10 ml iodura de potasiu i se titreaza cu tiosulfat de sodiu. Spre sfarsitul titrarii, cand culoarea solutiei se deschide la galben, se adauga 3-5 picaturi solutie de amidon, cnd solutia se coloreaza in albastru. Se continua titrarea agitand mereu foarte energic, pana la disparitia culorii albastre. In aceleasi conditii se titreaz si o proba martor. Din diferenta dintre valoarea inregistrata la titrarea probei martor (V1), i cea inregistrata la titrarea probei de grasime (V2) se calculeaza masa de iod fixat de 100 g grasime, respectiv indicele de iod (Tiod = 0,0127 g/ml). (V1 V2) . FNa2S2O3. Tiod . 100 Indice de iod = -----------------------------------------------m 4. Determinarea indicelui de peroxizi Indicele de peroxizi indic gradul de rancezire al unei grasimi si se exprima prin volumul de tiosulfat de sodiu 0,002N (exprimat n mililitri) consumat de un gram de prob. Datorita unei configuratii electronice deosebite, oxigenul molecular poseda o inertie chimica relativa, care poate fi invinsa in urma activarii in anumite conditii si producerii unor specii inalt reactive cum ar fi oxigen singlet, superoxid, hidroxil. Peroxidarea constituie etapa initiala si principala a mecanismului de autooxidare care are loc sub actiunea oxigenului.
7

Obs: Acizii polinesaturati sunt sursa principala a rancezirii oxidative a grasimilor. Modul de lucru: Se cantareste circa 1 g grasime si se introduce intr-un flacon Erlenmayer cu dop rodat. Se adauga 20 ml amestec de acid acetic glacial si cloroform 2:1 si 1 ml solutie saturata de iodura de potasiu si se agita bine. Se pregateste in paralel si o proba martor, cu aceeasi cantitate de reactivi, insa fara grasime. Probele se tin 3 minute la intuneric, dupa care se adauga 20 ml apa distilata si se titreaza cu solutia de tiosulfat de sodiu, in prezenta amidonului ca indicator, procedand ca in cazul determinarii indicelui de iod. Calcul: Indicele de peroxizi se calculeaza pe baza relatiei: 5(V V1) Indice de peroxizi = -----------------m unde V - volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titrarea probei cu grasime (ml) V1 - volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titrarea probei martor (ml) m - masa probei de grasime luata pentru determinare (g) 5 - factorul de transformare a solutiei 0,01 N in 0,002 N

10

11

4. Determinarea indicelui de aciditate Indicele de aciditate reprezinta numarul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor grasi liberi dintr-un gram de grasime. Se determina prin titrare cu o solutie bazica, in prezenta fenolftaleinei ca indicator. Reactivi necesari: - hidroxid de sodiu sau de potasiu 0,1 N - amestec alcool-eter etilic 1:2 neutralizat - fenolftaleina, solutie alcoolica Mod de lucru: Se cintaresc 5-10g grasime care se dizolva in 40 ml amestec alcool-eter. Se adauga 2-3 picaturi fenolftaleina si se titreaza cu sol.de NaOH pina la culoarea roz. Calcul: I = 5,61 x V / m unde V - vol. soluiei de NaOH folosit la titrare m - cantitatea de grasime

12