MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR

- volumul III -

Patogeni alimentari
Ediie mbunatit i revizuit
Editura Asclepius
Bucureti, 2011
Coordonator:
Simona Ivana

Autori:
Alexandru T. Bogdan Iulian ogoe Gheorghe Cmpeanu
Simona Ivana Traian Enache Stelian Britreanu
Ipate Iudith Alexandru Popescu
ISBN electronic: 978-606-8236-26-1
2
Toate drepturile sunt rezervate editurii. Tiprit n Romnia. Nici o
parte din aceast lucrare nu poate f reprodus sub nici o form, prin nici un
mijloc, mecanic sau electronic sau stocat ntr-o baz de date, fr acordul
prealabil, n scris, al editurii.
All rights reserved. Printed in Romania. No part of this publication
may be reproduced or distributed in any form, by any means or stored in
a data base or retrieval system without the prior, written, permission of the
editor.
ISBN electronic: 978-606-8236-26-1
Editura Asclepius, Bucureti
Tel: 072.44.66.481, tel/fax: 021/242.11.01
Website: www.asclepius.ro, e-mail: editura@aslcepius.ro
Cuprins
CAPITOLUL 1
ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul ShIGEllA N PRo-
duCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 7
1.1. Caractere generale 7
1.2. Taxonomie 10
1.3. Ci de transmitere 12
1.4. Caractere de cultivare 13
medii uzuale i medii selective de cultivare. 13
1.5. Structura antigenic 13
1.6. Patogenitate 15
1.7. Epidemiologie 22
1.8. manifestri clinice 24
1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 25
1.10. Izolarea i identifcarea shigelelor 36
CAPITOLUL 2
ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul ESChERIChIA N PRo-
duCEREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 70
2.1. Caractere generale 70
2.2. Istoric 71
2.3. Taxonomie 72
2.4. morfologie 73
2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 73
2.6. Proprieti biochimice 74
2.7. Proprieti antigenice 75
2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu 77
2.9. Patogenitatea 78
2.10. Epidemiologie 87
2.11. detectarea EPEC, ETEC i EIEC n alimente i materiale pato-
logice 91
2.12. detectarea Escherichia coli o157:h7 din fecale i alimente 93
2.13. Infeciile naturale la animale 98
Colibaciloza vieilor 99
Colibaciloza purceilor 99
Colibaciloza psrilor 100
2.14. Infecii cu Escherichia coli la om 100
3
2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli 101
2.16. Strategii de prevenire i combatere 103
2.17. metode de izolare i identifcare a lui E. coli din alimente 106
CAPITOLUL 3
ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul YERSINIA N PRoduC-
EREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 124
3.1. Caractere generale 124
3.3. Specii ale genului Yersinia implicate n toxiinfeciile alimentare 127
3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis
(Pasteurella pseudotuberculosis) 127
3.3.2. Yersinia enterocolitica 131
3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia 132
3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09 i Yers-
inia pseudotuberculosis 132
3.4.2. Yersinia pestis 133
CAPITOLUL 4
ImPlICAIIlE BACTERIIloR dIN GENul VIBRIo N PRoduC-
EREA ToxIINfECIIloR AlImENTARE 143
4.1. Caractere generale 143
4.2. Taxonomie 144
4.3. Istoric 145
4.4. morfologie 146
4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale 147
4.7. Ecologie 150
4.8. factorii de patogenitate 150
4.9. Specii mai importante de vibrioni 150
4.10. metode de izolare i identifcare 154
a speciilor din genul Vibrio din alimente 154
4.11. Izolarea i identifcarea vibrionilor din produsele acvatice 163
Bibliografe 170
CAPITOLUL 5
ImPlICAIIlE CAmPYloBACTERIIloR N ToxIINfECIIlE AlI-
mENTARE 173
5.1. Caractere generale 173
5.2. Taxonomie 174
5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea
4
toxiinfeciilor alimentare 174
5.3.1. Campylobacter jejuni 174
5.4. Epidemiologie 176
5.4.1. distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex 177
5.4.2. Sezonalitatea 178
5.4.3. Cazurile importate 178
5.6. metode de izolare i identifcare a genului Campylobacter 181
din alimente 181
5.6.1. Prepararea probelor 181
5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter 183
5.6.3. Identifcarea speciilor de Campylobacter 183
5.6.4. Confrmarea campilobacteriilor 183
CAPITOLUL 6
ToxIINfECII AlImENTARE dE oRIGINE BACTERIAN Cu
INCIdEN REduS 194
6.1. Genul Aeromonas 194
6.1.1. Taxonomie 194
6.1.2. morfologie 195
6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale 195
6.1.4. Ecologie 196
6.1.5. diagnostic 197
6.2. Genul Plesiomonas 199
6.3. Genul Photobacterium 200
6.4. Genul Brucella 200
6.5. Genul Enterobacter 205
6.6. Genul Bacteroides 205
6.6.1. Bacteroides fragilis 205
6.7. Genul Klebsiella 205
6.7.1. Klebsiella pneumoniae 206
6.8. Genul Streptococcus 208
6.9. Genul Erysipelothrix 211
6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae 211
Capitolul 7
PRINCIPAlElE mICoToxINE ImPlICATE N PRoduCEREA
ToxIINfECIIloR AlImENTARE 226
7.1. Afatoxinele 228
7.2. Toxinele produse de Alternaria 234
5
7.3. Citrinin 235
7.4. ochratoxinele 237
7.5. Patulina 239
7.6. Acidul penicilic 241
7.7. Sterigmatocistina 241
7.8. fumonizinele 242
7.9. Sambutoxina 244
7.10. Zearalenonele 245
Capitolul 8
SCuRT PREzENTARE A PRINCIPlAlEloR VIRuSuRI CE SE
TRANSmIT PRIN AlImENTE 254
8.1. Virusurile hepatice enterice 257
8.1.1. Virusul hepatitei A 257
8.1.2. Virusul hepatitei E (hEV) 260
8.1.3. Virusul hepatitei f (hfV) 260
8.2. Norovirusurile 261
CAPITOLUL 9
PRINCIPAlII PRIoNI CE SE TRANSmIT PRIN AlImENTE 266
9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE) 266
9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJd, vCJd) 269
9.3. Boala cahectizant cronic (Chronic Wasting disease - CWd) 270
6
CAPITOLUL 1
ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL
ShIgELLA n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr
ALIMENTARE
1.1. Caractere generale
multiplicarea shigelelor pe suport alimentar, chiar la temperaturi de
10-19C, explic implicarea n declanarea toxiinfeciilor alimentare a unor
alimente contaminate iniial cu un numr subinfectant de germeni.
Produsele lactate au fost cauza unor focare familiale, ns controlul
curent al materiei prime n fabricile de lapte i a produsului fnit nainte
de comercializare reduce posibilitatea contaminrilor acestei categorii de
produse.
Alte produse alimentare de origine animal (oule, carnea i derivatele
lor) pot f contaminate cu germeni din genul Shigella spp. prin manipulare
i procesare neigienic.
la nceputurile investigaiilor tiinifce despre cauza mbolnvirilor
produse la om prin consumul alimentelor de origine animal, Paul Riegler a
publicat, n anul 1906, o valoroas lucrare despre Otrvirile cu carne, care
reprezint prima expunere tiinifc din ara noastr asupra toxiinfeciilor
alimentare la om, datorate consumului de carne contaminat cu germeni
patogeni din genul Salmonella (Enache T., i col., 2002).
Paul Riegler mpreun cu Victor Babe cerceteaz un episod grav de
mbolnviri (27 persoane din care 3 au murit), ca urmare a consumului de
carne de miel (infectat cu Salmonella Gartner) din care a izolat germenul,
identifcat apoi i la persoanele decedate.
medicii legiti suspectau iniial o otrvire colectiv. din analiza
chimic a probelor recoltate de la cadavre nu s-a descoperit ns nici o
substan toxic, dar serul bolnavilor din acest episod a aglutinat germenul
izolat, la un titru de 1/50 - 1/100, chiar i dup o lun de la debutul bolii.
din punct de vedere juridic, acest episod a benefciat de un diagnostic
corect care a nlturat cu argumente tiinifce prezumia de atentat criminal
7
prin otrvire, dezlegnd totodat o obscur problem a vremii: aa-zisele
otrviri cu carne.
datorit relaiilor comerciale, specifcului i tradiiilor culinare,
modului de preparare a alimentelor sau utilizrii mai frecvente a unor
produse disponibile n anunite zone geografce, alimentele se pot constituii
n verigi majore de diseminare a germenilor patogeni sau potenial patogeni
pentru oameni i animale.
Globalizarea industriei alimentare, comerul i transportul, implic
desfacerea i utilizarea alimentelor la distane mari fa de locul producerii
lor, ceea ce subliniaz posibilitatea diseminrii patogenilor care le
contamineaz la un moment dat. n acest context, bolile transmise prin
alimente dobndesc tot mai mult un caracter epidemiologic universal.
Riscul epidemiologic este mare i pentru faptul c alimentele nu
reprezint doar un vehicul, ele sunt i substrat nutritiv pentru multiplicarea
germenilor, producnd simultan toxiinfecii alimentare la mai muli
indivizi.
de la ogor pn la consumator, lanul producerii, procesrii i preparrii
alimentelor este foarte lung, greu de controlat i, cu ct alimentul trece prin
mai multe etape, cu att crete riscul de contaminare, ntruct orice etap
este susceptibil de a f contaminat.
n general produsele alimentare de origine animal (carne i derivate,
lapte i derivate, ou, pete, fructe de mare etc.) se pot contamina cu germeni
enteropatogeni dac:
animalele de mcelrie sunt purttoare de germeni enteropatogeni;
animalele de mcelrie sntoase sunt stresate naintea tierii, iar
manoperele de abator se fac neigienic;
nu sunt respectate condiiile de igien la procesare, depozitare i
transport, dar i n buctrii i la servire.
Prin urmare, contaminarea poate f primar (origine) sau secundar
(manipulare, prelucrare, depozitare etc).
metoda cea mai sigur de prevenire a mbolnvirilor la om rmne
prelucrarea termic (ferbere, etuvare, cuptor), cu condiia ca temperatura
de peste 100C s fe activ uniform, n profunzimea alimentului.
Alimentele de origine vegetal nu constituie substrat de supravieuire
i multiplicare a germenilor, dar se pot contamina prin praf, ape de irigaie,
sol, fertilizante organice. Riscul epidemiologic major l constituie faptul c
unele din aceste produse se consum crude (exemplu: salatele).
Alimentele mixte (de origine animal i vegetal), care de obicei
nu se prelucreaz termic i se consum ca atare (salate, creme, maioneze,
ngheat etc) se pot contamina, fe ca materii prime, fe n cursul preparrii,
8
depozitrii, servirii.
Riscul de contaminare a minilor persoanelor care manipuleaz
aceste alimente este corelat cu exercitarea profesiilor care asigur asisten
medical, paramedical, prim-ajutor, personalul din sectorul sanitar i sanitar-
veterinar, personalul care lucreaz la salubritate (att pentru ndeprtarea
reziduurilor solide, ct i la ntreinerea reelei de canalizare).
Importana minilor murdare n transmiterea bolilor infecioase este
infuenat de intensitatea contaminrii, de anumite deprinderi neigienice
individuale, de nivelul cultural i igienico-sanitar, ct i de condiiile de
supravieuire ale patogenilor pe suprafaa tegumentului.
Insectele joac rolul de vectori activi sau pasivi n transmiterea
patogenilor, dup cum germenii se nmulesc sau nu pe organismul insectei
vector.
Vectorii mecanici (biologic-pasivi) vehiculeaz doar microorganisme
care supravieuiesc pasiv pe suprafaa corpului lor sau n tubul digestiv, fr
a se multiplica.
musca domestic prin habitatul ei peridomestic, mobilitate, voracitate,
preferine coprofage, poate vehicula infecia la mari distane de locul
contaminrii iniiale.
Gndacii de buctrie (Blatella germanicus i Blatella orientalis) pot
vehicula pasiv enterobacterii, enterovirusuri, staflococi, ou i larve de
helmini etc.
furnicile pot transmite mecanic germenii Gram negativi.
Aceti factori biologici au rol important n transmiterea infeciilor n
locuine, colectiviti umane, sector alimentar, medical etc.
Cel de-al treilea element constitutiv al focarului epidemiologic
este reprezentat de organismul uman i de receptivitatea indivizilor care
alctuiesc o populaie.
Rezistena antiifecioas reprezint capacitatea natural a organismului
de a mpiedica ptrunderea patogenilor n organism, de a asigura distrugerea
i eliminarea lor din organism i de a neutraliza produii toxici care induc
boala.
Pentru om, riscul reprezentat de consumul crnii animalelor acvatice
este condiionat de mediul din care provin aceste vieuitoare. literatura
de specialitate cuprinde date relativ puine despre microbiologia acestor
produse.
Riscurile sunt mai mari la carnea animalelor acvatice provenite din
zonele tropicale unde bolile digestive evolueaz sub form endemic.
molutele sunt frecvent purttoare de germeni patogeni enterici, n
organismul lor concentrndu-se cele mai diverse bacterii i virusuri luate
9
din ap n timpul hrnirii. Pericolul pentru om l reprezint consumul n
stare crud sau numai dup o superfcial tratare termic a acestora.
Animalele acvatice crescute n condiii artifciale prezint un pericol
i mai mare pentru consumator, ntruct este frecvent contaminarea lor cu
microorganisme provenite din dejeciile umane deversate n cursurile de
ap.
n timpul hrnirii, molutele fltreaz i concentreaz n tubul digestiv
microorganismele din apa n care triesc. de aceea se impune controlul
microbiologic periodic al apelor n care triesc i din care se recolteaz
molute pentru consum uman (Brzoi d., Apostu S., 2002).
Produsele alimentare de origine animal se pot contamina cu fora
microbian prezent n mediul n care ele se prelucreaz, manipuleaz,
depoziteaz i se transport pn ajung la consumatori.
Izolarea i identifcarea microorganismelor patogene din alimente,
prezint, nc, unele difculti datorit posibilitilor de contaminare
simultan cu mai multe specii de germeni, dintre care numai unii au
capacitate patogen.
dintre agenii patogeni cunoscui i descrii care produc toxiinfeciile
alimentare, germenii aparinnd genului Shigella spp. au ocupat pn n
prezent un loc mai puin important, shigelozele find considerate aproape
exclusiv, infecii bacteriene, fr ca iniial s fe recunoscut rolul alimentelor
n transmiterea infeciei.
datele recente din literatura internaional de specialitate demonstreaz
ns implicarea frecvent a germenilor din genul Shigella spp. n declanarea
unor episoade grave de toxiinfecii alimentare la om, care, n afar de ap,
numeroase alte alimente de origine animal, dein o pondere crescnd.
dup datele statistice ale organizaiei mondiale a Sntii (omS)
boala diareic este considerat a doua cauz de deces la scar global dup
bolile cardiovasculare, find cel mai frecvent sindrom ntlnit n patologia
infecioas, caracterizat printr-o simptomatologie polimorf cu evoluie
foarte grav.
Este demonstrat faptul c Shigella spp. provoac sindromul diareeic
infecios denumit dizenterie bacilar, al crui diagnostic presupune mai
multe etape succesive foarte laborioase.
1.2. Taxonomie
Genul Shigella este component al familiei Enterobacteriaceae i
prezint multiple nrudiri cu genul Escherichia, ns nu face parte din fora
saproft a intestinului.
10
datorit numeroaselor asemnri metabolice i antigenice,
mecanismelor patogenice i nrudirilor antigenice cu speciile din genul
Escherichia, muli autori au propus ca aceste grupuri s fe reunite i s
constituie o grup unic: Escherichia-Shigella (farmer J.J. III, 1995).
Avndu-se n vedere i unele considerente practice, ambele grupe sunt
tratate separat, chiar dac taxonomic au sufciente elemente comune pentru
constituirea unui gen unic.
Tehnici mai noi, cum ar f hibridarea acizilor nucleici, secvenierea
acizilor nucleici i proporia dintre bazele purinice i pirimidinice, au
demonstrat c ntre speciile genurilor Shigella i Escherichia exist deosebiri
foarte mari, ceea ce a impus descrierea lor ca genuri complet diferite.
Coninutul n guanin + citozin, exprimat n moli % difer semnifcativ la
cele dou specii (Bergeys manual of determinative Bacteriology, ed. Ix,
1999; J.P. Euzby, list of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature,
2009).
Genul Shigella cuprinde specii de bacterii Gram negative, imobile,
facultativ anaerobe, chemoorganotrope cu metabolism respirator i
fermentativ, care se deosebesc de restul enterobacteriaceelor prin
incapacitatea de a produce fenilalanindeaminaz, ureaze, hidrogen sulfurat,
lizindecarboxilaz, acetil-metil-carbinol i de a nu hidroliza malonatul i
esculina.
Conform Taxonomic outline of the Procariotic Genera, din
Bergeys manual of systematic bacteriology ediia a II-a (2001), ncadrarea
taxonomic a genului este urmtoarea:
domeniul - Bacteria;
familia - B xII Proteobacteria;
Clasa III - Gammaproteobacteria;
ordinul xIII - Enterobacteriales;
familia - Enterobacteriaceae;
Genul - Shigella.
n prezent Genul Shigella spp. este caracterizat ca o grupare de
Enterobacteriaceae, constituit din bacili imobili care fermenteaz glucoza
fr gaz, nu produc hidrogen sulfurat, ureaz, lizindecarboxilaz i fenilanin-
deaminaz, nu cresc pe medii cu citrat ca unic surs de carbon.
Producerea de indol, betagalactoxidaz i ornitindecarboxilaz sunt
teste ce difereniaz ntre ele speciile de Shigella.
Astzi sunt recunoscute speciile: Shigella dysenteriae (grupa A), Shi.
fexneri (grupa B), Shigella boydii (grupa C) i Shigella sonnei (grupa d).
11
Shigella sonnei, denumit de unii autori n trecut ca S. pseudodysen-
teriae, are activitatea metabolic cea mai bogat, find spre deosebire de
celelalte specii lactozo-pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz prompt pozitiv
i constant productoare de ornitindecarboxilaz (Negu m, 1998).
la nivel mondial se estimeaz c numrul anual al toxiinfeciilor
alimentare umane, cu Shigella este de 6,5-8 milioane (mahon C, manuselis
G, 1995).
1.3. Ci de transmitere
Enterobacteriile din genul Shigella spp. sunt patogene numai pentru
om i primate non-umane, iar rspndirea lor este realizat exclusiv prin
aceste surse.
Contaminarea fecaloid intereseaz frecvent solul i apele de suprafa,
de unde se poate dispersa direct (irigaii) sau indirect (prin vectori: vegetale,
fructe, ape de suprafa, pete, fructe de mare i alte alimente), de unde
germenii pot ajunge la om (Adams m. R., moss m. d., 1995).
Alimentele de origine animal sunt contaminate n timpul procesri
(surse umane) sau prin transportul i manipularea neigienic (vectori i alte
surse).
n funcie de anumite condiii, Shigella se poate izola din ap, alimente
sau chiar de pe obiecte (Ballows A et al, 1992).
Shigella alturi de Salmonella, Escherichia coli i Yersinia spp. au
fost n mod clar demonstrate ca patogeni enterici (Cunin P et al. 1999; Gray
dl, 1995).
legumele i fructele se pot contamina cu Shigella n urma irigrii cu
ape poluate i prin manopere de recoltare, pstrare i distribuire neigienic
(Beuchat l R, 1996).
Shigella poate f izolat din legumele contaminate, att n stare crud,
ct i din cele gtite (frost J A et al., 1995).
ntruct acvacultura are o mare dezvoltare, contaminarea cu fecale a
apelor poate cauza infectarea cu Shigella a petilor i crustaceelor i apoi a
oamenilor prin consumul acestor vieuitoare (Bryan f. I. 1985).
Petii i alte animale marine pescuite/recoltate din ape de suprafa
contaminate consecutiv deversrilor de ape reziduale provenite din
canalizrile urbane, constituie o surs tot mai frecvent de contaminare a
oamenilor cu Shigella (Gessner Bd i Beller m, 1994).
12
1.4. Caractere de cultivare
medii uzuale i medii selective de cultivare.
Cultivarea pe astfel de medii permite o identifcare preliminar.
Pe agar nutritiv Shigella se dezvolt n 24-48 ore de incubare i
formeaz colonii:
de tip S, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, circulare, nepigmentate,
netede;
de tip R, de 2-3 milimetri n diametru, rotunde, plate, cu suprafa
rugoas i margini neregulate.
n bulion simplu tulpinile se comport astfel:
cele de tip S tulbur mediul uniform fr depozit;
cele de tip R cu sau fr turbiditate, prezint inel i depozit.
Pe agar cu snge Shigella crete la fel ca i pe agarul nutritiv.
Pe agar MC Shigella formeaz colonii incolore, transparente, uor
opace.
Pe AdCL, Shigella dysenteriae tip 1 formeaz colonii mici cu nuane
roz, Shigella sonnei formeaz colonii iniial incolore, ns dup cteva zile
apar nuane roz deschis, datorit fermentaiei tardive a lactozei.
Pe hE, Shigella formeaz colonii verzi.
Pe EmB, Shigella formeaz colonii semitransparente, incolore sau
roz pal.
morfologia coloniilor se observ prin iluminatul direct al plcilor.
Mediile selective nu permit dezvoltarea forei Gram pozitive;
Mediul MC permite dezvoltarea difereniat i a altor grupe de bacili
Gram negativi.
1.5. Structura antigenic
Grupele (sau speciile) de Shigella au fost extinse considerabil prin
identifcarea mai multor tipuri diferite din punct de vedere antigenic.
Genul Shigella spp. cuprinde patru specii (serogrupe) cu 34
serotipuri:
Shigella dysenteriae (grup A);
Shigella fexneri (grup B);
Shigella boydii (grup C);
13
Shigella sonnei (grup d), denumit de unii autori n trecut S.
pseudodysenteriae (Bergeys manual of determinative Bacteriology, ediia
a Ix-a, 1999; Negu m., 1998).
Speciile acestui gen sunt bacterii Gram negative ce se dezvolt bine pe
agar macConkey. Toate tulpinile de Shigella spp. sunt imobile.
Prin analiza de hibridare dNA-RNA, speciile de Escherichia coli i
Shigella spp. sunt similare fenotipic, cu excepia S. boydii.
Shigella sonnei are activitatea metabolic cea mai bogat, find spre
deosebire de celelalte specii, lactoz pozitiv (tardiv), betagalactoxidaz
prompt pozitiv i constant productoare de ornitindecarboxilaz.
Specia tip a genului este Shigella dysenteriae (Bergeys manual of
determinative Bacteriology, ediia a Ix-a, 1999).
Shigelele fermenteaz glucoza fr formarea de gaz, nu produc
hidrogen sulfurat, ureaz, lizin decarboxilaz i fenilalanindeaminaz
(Jay m. J., 1988). legturile evolutive a 46 tulpini de Shigella spp., care
reprezint fecare dintre serotipurile aparinnd celor patru specii de Shigella
(subgrupele dysenteriae, flexneri, Boydii, Sonnei) au fost determinate prin
secvenionarea a opt gene (gene housekeeping), din patru zone cromozomale.
Au fost identifcate trei grupe de tulpini, fecare incluznd tulpini de la
diferite subgrupe.
grupul 1 conine majoritatea tulpinilor de Shigella boydii i Shigella
dysenteriae (Bl-4, B6, B10, B14, B18, d3-7, d-9, d3-11), precum i de la
Shigella fexneri 6 i 6A.
grupul 2 cuprinde ase tulpini de Shigella boydii (B5, B7, B9, B11,
B15,B16 i Bl7) i tulpini de Shigella dysenteriae 2.
Grupul 3 cuprinde o tulpin de Shigella boydii (B12) i tulpini de Shi.
fexneri, serotipurile 1-5.
Tulpinile de Shigella sonnei i trei tulpini de Shigella dysenteriae (d1,
d8 i d10) sunt n afara celor trei grupuri principale de gene. Shigella boydii
13 se pare c are legturi cu Escherichia coli (nrudite, dar mai ndeprtat).
Tulpinile de Shigella spp., ct i unele tulpini patogene de Escherichia coli
nu au avut o evoluie singular, ci convergent, aa cum arat proprietile
fenotipice ale Shigella (Picking W. l., Coye l., osiescki J.C., Barnoski
Serfs A., Schaper E., Picking W.d. 2001).
Se estimeaz c cele trei grupuri principale de tulpini de Shigella sunt
cauza prezumtiv a celei mai timpurii boli diareice descrise la om nc din
antichitate.
Shigella find lipsit de cili (imobil) expune antigene somatice (o)
lipopolizaharidice care stau la baza identifcrii serologice. Avnd specifciti
de grup sau de tip, acestea sunt folosite n scheme corespunztoare fecrei
14
specii, ori serogrup, respectiv Shi. dysenteriae (grup A) 13 serotipuri, Shi.
fexneri (grup B) 6 serotipuri, Shi. boydii (grup C) 18 serotipuri i Shi. sonnei
(grup d) un singur serotip. Serurile destinate acestei tipizri sunt accesibile
i sunt utilizate mai frecvent n bacteriologia epidemiologic.
majoritatea antigenelor o de la Shigella sunt identice sau nrudite
cu cele o de Escherichia. din aceste motive identifcarea biochimic,
respectiv ncadrarea n gen, trebuie s precead obligatoriu tipizarea
serologic.
Inconstant, la Shi. dysenteriae, Shi. fexneri i Shi. sonnei pot f prezente
antigene de suprafa K, termolabile, ce pot include inaglutinabilitatea
o unor tulpini. Inactivarea timp de o or la 100C determin redobndirea
aglutinabilitii o.
1.6. Patogenitate
Elementele de patogenitate induse de Shigella spp., ca i cele produse
de Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC) se datoreaz capacitii acestor
microorganisme de a invada epiteliul intestinal, de a se multiplica intracelular
i de a se rspndi de la o un enterocit la altul (morris J. G. Jr. ferreccio C.,
Garcia J., lobos h., Black R. E., Rodriguez h., levine m.m., 1984, Page
A. l., ohayon h., Sansonett, P. J., Parsot C., 1999).
Capacitatea de a invada celulele epiteliale a fost demonstrat deopotriv
i pe modele experimentale pe animale i in vitro. Aceast capacitate se
poate verifca pe culturi celulare hela, prin numrarea coloniilor dezvoltate
n monostrat. Variantele de Shi. fexneri care nu au fost capabile s invadeze
culturile celulare, nu au determinat mbolnviri experimentale la maimu.
hibrizii de Shi. fexneri 2a i Escherichia coli K
12
, capabili de a adera
i invada celulele epiteliale i incapabili de se multiplica intracelular s-au
dovedit nepatogeni la maimuta Rhesus (Kumene N f et al., 1999).
Nu este ns sufcient ca Shigella s invadeze i s se multiplice
intracelular pentru a aprea leziunile caracteristice i pentru a declana
fenomenele clinice.
mutante de Shigella, capabile de a invada i a se multiplica intracelular,
s-au dovedit nepatogene, ntruct nu aveau capacitatea de a se transmite de
la o celul la alta (Sandlin R. C., maurelli A. T., 1999).
Aceste capaciti, care reprezint totodat markeri de virulen, sunt
expresia capabilitilor bacteriei, reglate genetic n succesiunea actului
patogenic. Controlul genetic al invazivitii este multifactorial, necesitnd
participarea ambilor determinani: plasmidic i cromozomal.
n ansamblu acest control este reglat de temperatura ambiental. la
15
temperaturi sub 30C mecanismele genetice ale invazivitii sunt inactive
(maguire hC et al., 1998).
o gen cromozomal vir R (hus) codifc un represor al exprimrii
virulenei, n timp ce alte dou gene (vir f i vir B) codifc activatorii
virulenei. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de
gene activatoare devenind funcional numai la 37C.
Participarea determinanilor plasmidici este dominant n reglarea
invazivitii. dou plasmide mari de 180 Kb la Shi. sonnei i 220 Kb la Shi.
fexneri sunt indispensabile invaziei (mc Cormick B h et al., 1999).
un grup de gene Ipa B, C, d, A (invasion plasmid antigens) sunt
eseniale pentru invadarea celulelor epiteliale de mamifere.
Produsele acestor gene sunt proteine asociate membranei externe
a celulei bacteriene i au rol n transmiterea semnalului ce precede
internalizarea shigelelor n celula gazd.
o alt gen Ipg C (invasion plasmid gene) este necesar n invazie,
prevenind ca Ipa B i Ipa C s formeze complexe n citoplasm bacterian.
Proteinele Ipa sunt secretate continuu n mediu. Cantitatea lor crete la
contactul bacteriei cu celula gazd i probabil ele joac un rol n generarea
semnalelor necesare ncorporrii de ctre enterocit. Produsul genei Ipa B
se consider c ar f responsabil de liza vacuolei ce conine bacteria dup
internalizarea acesteia.
Aceeai protein litic produs de Ipa B induce i apoptoza n
macrofagele infectate.
un grup de gene mxi/spa (membrane expression of invasion plasmid
antigens) secret peste 20 proteine care controleaz secreia proteinelor Ipa
i alte proteine de virulen asemntoare celor de la Salmonella sau Yops
de la Yersinia. Acest tip de virulen protein-dependent este recunoscut
astzi ca elementul esenial al patogenezei bacteriene la animale i plante
(Edwards B h, 1999).
un alt grup de gene desemnat Ies A (intracellular spread) nu are
relaie cu invazia ns este esenial pentru motilitatea intra i intercelular
(makino i col, citat de mahon C, manuselis G., 1995). Proteinele Ies A sunt
aezate la un singur pol al bacteriei. Polimerizarea monomerilor de actin sub
infuena lor reprezint fora care mpinge bacteria prin citoplasm. Sinteza
unui lipopozaharid (lPS) complet n peretele bacterian este responsabil
pentru localizarea unipolar a proteinelor Ies A. lPS necesit locusuri
specifce active (respectiv rfa i rfb) pe cromozomul bacterian.
de asemenea alte locusuri cromozomale codifc aerobactina, protein
esenial pentru multiplicarea intracelular a shigelelor i superoxid
dismutaza ce inactiveaz radicalii superoxid, protejnd astfel bacteria de
16
mecanismele celulare de aprare.
Temperatura poate infuena desfurarea mecanismului invaziv. la
temperaturi mai mici de 30C, mecanismele genetice ale invazivitii devin
inactive. Reglarea termic acioneaz la nivel transcripional, categoria de
gene activatoare devenind funcional numai la 37C.
o gen cromozomal vir R (hus) codifc un represor al exprimrii
virulenei, n timp ce alte dou gene (vir f i vir B) codifc activatorii
virulenei.
n reglarea invazivitii, un rol dominant l dein determinanii
plasmidici. Pentru invazie, plasmidele de 180 Kb, la Shigella sonnei i la
220 Kb, la Shi. fexneri (plasmide mari) sunt indispensabile.
Eseniale pentru invadarea epiteliului intestinal al mamiferelor sunt
genele Ipa, A, B, C, d (Invasion Plasmid Antigens). Aceste gene produc
proteine asociate membranei externe a celulei bacteriene i ndeplinesc
rolul de transmitere a semnalului care precede ptrunderea shigelelor n
celula gazd.
n invazie, un rol important l are i gena Ipg C (Invasion Plasmid
Gene), aceasta prevenind ca genele Ipa B i Ipa C s formeze complexe n
citoplasma bacterian.
Gena Ipa d este responsabil de ataarea unui receptor, specifc la
celula gazd. Genele Ipa d i Ipa C induc endocitarea bacteriei. Genele Ies
A i Ies B (Intracellular Spread) favorizeaz rspndirea intracelular.
Capacitatea de invadare a fost demonstrat pe modele experimentale
pe animale i in vitro.
Shigelloza este considerat boal autolimitant la aduli, dar poate f
fatal la copiii malnutrii.
Alturi de particularitile reactive ale gazdei, severitatea bolii depinde
esenial de virulena tulpinii infectate.
unele shigele exprim n bulion CYE (Casamino Acids Yeast Extract)
o hemaglutinin celular de suprafa. microscopia electronic a Shigella
dysenteriae 1, Shi. fexneri 2a, Shigella boydii 12 i a Shigella sonnei 1,
crescute n bulion CYE a evideniat acest strat celular care provoac
aglutinarea eritrocitelor. Subcultivarea repetat a Shi. boydii, Shi. sonnei i
a tulpinilor hemaglutinante negative de Shi. dysenteriae i de Shi. fexneri,
pe buliuonul CYE, induce proprieti adezive i hemaglutinante. Acestea
pot f inhibate de sodiul periodat, de acidul N-acetilneuraminic i de alfa-
glicoproteine, dar nu i de proteaze. Acest strat extracelular extras de pe
suprafaa celulelor de Shigella spp. are proprieti hemaglutinante ca i
lipopolizaharidul obinut de la aceleai tulpini, cu excepia Shi. dysenteriae
1 (hale T.l., 1991).
17
Studii funcionale au artat rolul potenial dual al funciilor miozinei
i modulului GAP al myr 5 pentru internalizarea bacteriei.
myr 5 este fxat n punctele de intrare a bacteriei. modul de fxare
seamn cu cel al Rho C sau al ezerinei, dar nu cu cel al Rho A, Rac sau
CdC 42, pe cnd, in vitro, activitatea GAP a myr 5 este asemntoare cu
Rho A, B sau C.
n procesul de internalizare bacterian, n celulele epiteliale intestinale
este implicat o miozin din clasa Ix i un antagonist Rho, i anume o
protein activatoare a GTP-azei (GAP), adic myr 5.
Analiza unor mutante de myr 5 a artat c activitatea de cuplare a
GTP-azei i a ATP-ului nu sunt necesare pentru fxarea acestei miozine
atipice induse de Shigella la locul de internalizare a bacteriei. Aadar,
Shigella induce rearanjri citoscheletale, asociate internalizrii (Graf B. et
al., 2000).
la locul de interaciune bacterie - celul gazd, Shigella induce
reorganizarea citoscheletal. Aparatul secretor de tip III al shigelelor
permite inseria unui por care conine proteinele Ipa B i Ipa C n membrana
celulei, inserie care permite translocarea captului terminus carboxi al Ipa
C, dar i al altor efectori ai shigelelor, cum ar f Ipa A n citosolul celulei.
Ipa C declaneaz polimerizarea actinei i formarea extensiei flopodiale
i lamelipodiale dependente de GTP-azele CdC 42 i Rac. Ipa A, pe de
alt parte, induce depolimerizarea flamentelor de actin. Ipa A i GTP-
aza Rho nu sunt necesare pentru polimerizarea actinei la locul de contact
bacterie-celul gazd, dar permite transformarea extensiilor induse de
Ipa C ntr-o structur necesar internalizrii ei. Rho este necesar pentru
fxarea la locurile de intrare a ezerinei, un liant citoscheletal necesar pentru
internalizare, dar i pentru tirozinkinaza Src. Activitatea tirozinkinazei Src,
necesar inducerii de ctre Shigella a polimerizrii actinei, este implicat
de asemenea i n rspunsul regulator, care coordoneaza activitatea Rho la
locul de intrare (Tjoa WS et al., 1997).
Sistemul secretor de tip III mxi-Spa este necesar i pentru evadarea
bacteriilor din formaiunile de protrusie. Vacuolele cu membran dubl
(double-membrane-bound vacuoles) Ipa secretate via mxi-Spa sunt
necesare n protrusia vacuolei, servind la liza dublei membrane (Sansonetti
PJ, 1992).
Sistemul regulator format din dou componente PhoP/PhoQ contro-
leaz transcripia mai multor gene virulente eseniale pentru supravieuirea
Shi. fexneri n fagozomul din celula gazd, chiar i atunci cnd acest agent
patogen scap din fagozom n citoplasma celulei gazd.
o mutant PhoP de Shigella a determinat infecia i a indus un rspuns
18
infamator acut pe dou modele experimentale pe animale diferite. Aceast
infecie s-a stins mult mai repede dect o infecie cu tipul slbatic de Shigella.
Gena mutant a fost mai sensibil la aciunea leucocitelor polimorfonucleare
(PmNs) i la alte peptide antimicrobiene extrase de la animale. mutanta
PhoP se rspndete intracelular, induce apoptoza macrofagelor i tolereaz
ph-urile acide extreme, ca i tulpina slbatic. Se consider c ea regleaz
susceptibilitatea bacteriei la moleculele antimicrobiene i la celule
polimorfonucleare, aspect important pentru stadiile trzii ale infeciei.
Shigelele ataate la celulele epiteliale foliculare i folosesc proprietile
endocitolitice pentru a intra n celule, unde o dat ajunse i lizeaz vacuola
endocitar i coopteaz actina i miozina pentru a forma o elice, care s
le propulseze pentru a putea penetra n continuare epiteliul prin suprafaa
bazolateral (Sayeed S et al., 2000).
Cei mai cunoscui determinani ai virulenei shigelelor sunt codifcai,
n majoritate, ntr-o plasmid mare, unic, la tulpinile virulente de Shigella
spp. i de Escherichia coli enteroinvaziv, aceste gene ocupnd 30-35% din
plasmida de virulen (Tsinzerling VA et al., 1997; Summary of Notifable
diseases in uSA, 1994).
Pentru Shi. fexneri 5a prin analiza secvenial complet a fost
determinat mrimea plasmidei de virulen: 210 Kb. S-au descoperit
286 locusuri de inserie (oRfs open reading frames). 53% dintre ele au
legtura cu secvenele de inserie (IS). Nu se cunoate nici o alt plasmid
care s aib o asemenea proporie de elemente IS. 50 de proteine putative
nu au artat o asemnare semnifcativ cu proteinele cu funcie cunoscut.
dintre acestea 18 au un coninut n guanin / citozin mai mic de 40%, tipic
pentru genele virulente cunoscute din plasmid. Cele 18 proteine constituie
gene potenial virulente necunoscute. dou alele ale Shet 2 i cinci alele ale
Ipa h au fost i ele determinate n plasmid. Astfel, o analiz secvenial
complet permite o caracterizare mai exact a noi poteniali determinani ai
virulenei bacteriilor genului Shigella spp. (Vaida T et al., 1996).
Shi. fexneri invadeaz celulele epiteliului intestinal prin internalizare
i diseminare. Principalii efectori ai intrrii, Ipa B i Ipa C, sunt necesari
i pentru activitatea hemolitic i eliberarea din fagozomi n macrofagele
infectate. Aceste proteine sunt stocate n citoplasm n asociaie cu Ipg C,
nainte de producerea lor de ctre un aparat secretor de tip III activat de
ctre celulele gazd. Astfel, pentru o diseminare efcient, alturi de Ipa B
i Ipa C, un rol important l are i Ipg C (operon citoplasmatic). Analizele
de microscopie electronic a celulelor infectate au artat c aceste proteine
au fost necesare pentru liza membranei (protruzie) i pentru rspndirea de
la o celul la alta (ollinger-Snyder R i matthews mE, 1996).
19
Studii recente au artat c migraia transepitelial indus de Shi.
fexneri leucocitelor polimorfonucleare este inhibat de cadaverin, care
este activat prin decarboxilarea lizinei. Shigella spp. devine patogen prin
achiziionarea genelor de virulen i prin tergerea celor de nevirulen.
folosind monostrat de celule T84 care imit epiteliul intestinal uman s-a
indus nglobarea Cad A (protein care encodeaz lizindecarboxilazei) n Shi.
fexneri, iar exprimarea acesteia a atenuat capacitatea bacteriei de a induce
infuxul de polimorfonucleare n epiteliul model, pe cnd asupra aceleiai
proprieti de a induce migrarea polimorfonuclearelor la Salmonella i
la Escherichia coli enteropatogeni nu a avut nici un efect. Toate acestea
sugereaz folosirea potenial a cadaverinei n tratamentul dizenteriei
(matsumoto m., Suzuki Y., Saito m., Yshikawa N., ohta m, 1998).
dei capacitatea de invazie a Shigella spp. este limitat pe traiectul
tubului digestiv, colitele cauzate de bacterie sunt relativ rare.
Penetrarea celulelor epiteliale de ctre shigele este caracterizat de o
reorganizare temporar a citoscheletului la locul interaciunii cu bacteria,
ceea ce conduce la nglobarea bacteriei prin procesul de macropinocitoz.
S-au efectuat studii care au artat c receptorul hialuronic Cd44 se asociaz
cu Ipa B, protein secretat dup contactul cu celula. Studiul a folosit
afnitatea cromatografc pe extracte de celule he la i a demonstrat c Ipa
se leag direct la domeniul extracelular al Cd44.
Experimentele de imunoprecipitare au artat i ele asocierea Ipa B
cu Cd44 n timpul internalizrii shigelelor. Cd44 este fxat la locurile de
intrare ale bacteriei i se localizeaz pe membrana plasmatic a extensiilor
celulare induse de Shigella spp. Efectul Cd44 de cretere a vitezei formrii
legturilor bacterie-celul i de internalizare sunt mult diminuate prin
pretratarea celulelor cu anticorpi monoclonali; acetia inhib i reorganizarea
citoscheletal indus de Shigella spp. Aadar, interaciunea Ipa B-Cd44
este necesar desfurrii mecanismului invaziv prin iniierea primilor pai
ai procesului de intrare n celula gazd (Sears and Kaper, 1996).
Ipa B (factor plasmidial de virulen, invazional) este necesar tuturor
evenimentelor eseniale din cursul patogenezei infeciilor produse de Shigella
spp.: invazia celulelor, eliberarea din fagozomi i inducerea apoptozei
macrofagelor. Inducerea apoptozei este dependent de cuplarea Ipa B cu
cystein - proteozo-caspase 1 (Casp 1). Activarea acestei enzime induce att
apoptoza, ct i eliberarea citokinei proinfamatorii inter-leukin l-beta. S-a
demonstrat c poriunea N-terminal a Ipa B este necesar pentru stabilirea
expresiei Ipa B. un domeniu putativ alfahelicoidal se pare c ar conserva
structurile Ipa B. S-au gsit 10 terminaii consecutive, cu terminaie aminic
a regiunii hidrofobe, care joac un rol n invazie, eliberarea din fagozomi i
20
citotoxicitate. Studiile au artat c asocierea Ipa B-Casp 1 este doar un pas
n declanarea apoptozei macrofagelor (Guichon A et al., 1997).
Se consider c o protein de virulen este responsabil de
glomerulonefrita indus de Shi. fexneri (mugochi T et al., 1999).
Sistemul secretor mxi Spa de tip III al Shi. fexneri direcioneaz de
la locul de contact o serie de invazine (Ipa s). S-a artat c Spa 33 este un
element mobil din cadrul mxi Spa care exercit un control al translocrii Ipa
n interiorul i n afara poziiilor membranei externe (om-outer membrane)
ale structurii secretorii. Spa 33 este un substrat al mxi Spa care este translocat
pe suprafaa celulei bacteriene dup inducerea secreiei de Ipa.
dintre proteinele efectoare (Ipa) ale Shi. fexneri, numai C are activiti
cuantifcabile in vitro care au legturi cu invazivitatea (Thurston f l et al.,
1998).
S-au efectuat studii genetice ale aparatului secretor de tip III, mxi Spa
i ale proteinelor Ipa A-d, care sunt encodate ntr-o plasmid de virulen.
Studii secveniale ale plasmidei de virulen pWR 100 a Shi. fexneri, tulpina
m90T (serotipul 5) au permis identifcarea genelor care encodeaz aceste
proteine i au artat c acest aparat secret circa 25 de proteine.
Analiza coninutului n guanin i citozin, mpreun cu alte informaii
despre localizarea i funciile acestor proteine au artat pWR100 conine
blocuri de gene cu origini variate, dintre care unele au fost iniial purtate de
patru plasmide diferite (Buchrieser C et al., 2000).
dintre componentele mecanismului secretor de tip III al shigelelor
compus dintr-o parte bazal i un vrf, care conine mxi d, mxi G, mxi
J, mxi h Spa 47, s-a demonstrat c mxih este componenta de vrf cea
mai important, find esenial n eliberarea proteinelor efectoare cu un rol
deosebit n creterea invazivitii. n translocaia invazinei un rol important
l deine i mxi m, o lipoprotein extramembran (Skoudy A et al., 2000).
Shi. fexneri are i ea o plasmid de virulen mare, pmYSh 6000, care
encodeaz un sistem killing postsegregaional (PSK) efcient (Sansonetti PJ
et al, 1982).
Studii recente au ntrit ipoteza conform creia concentraia vir f
(virulence-related-transcriptional-regulator) este factorul critic al reglrii
virulenei la Shigella spp., precum i faptul c rolul sistemului translaional
bacterian n reglarea exprimrii genelor de virulen este la fel de important
ca i reglarea n bune condiii a nivelului transcripional. modifcarea RNA t,
temperatura i superhelicitatea au aceeai int - expresia vir f - infueneaz
exprimarea genei regulatoare centrale vir B i astfel a virulenei bacteriei.
date recente arat c exprimarea citocromului bd, unul dintre cele dou
oxidaze terminale ale lanului respirator microbian care reduce oxigenul
21
molecular la ap, este absolut necesar pentru supravieuirea intracelular i
pentru exprimarea virulenei la Shi. fexneri (durand Jm et al., 2000).
localizarea unipolar a Ies A pe suprafaa Shi. fexneri este necesar
pentru formarea efcient a cozilor de actin i pentru protrusia n celulele
eucariote infectate. S-a demonstrat c localizarea unipolar a Ies A n Shi.
fexneri 2a nu depinde de determinanii plasmidici ai virulenei (Rducnescu
fl i Bica Popii V., 1986).
n exprimarea patogenitii bacteriilor enteroinvazive, un rol important
l joac i apy-aza, apy find un locus din plasmid de virulen a crui
expresie poate f controlat de temperatur (induce sinteza la 37C i o
represeaz la 30C) i de cascada vir f, vir B. Produsul genei apy este apy-
aza (ATP-difosfohidrolaza), (Berlutti R et al., 1988).
1.7. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 6.513 cazuri de shigeloz de ctre 26 state
membre ale uE i state EEA/EfTA (danemarca, frana, Italia i liechtenstein
nu au raportat). dintre acestea 6.410 au fost confrmate i rata notifcrii
medii la nivelul uE a fost de 1,7 la 100.000 locuitori. Aceste date sunt cu
24% mai mici dect raportrile din 2005 ale acelorai ri. Cea mai mare
rat a notifcrilor a fost realizat de Bulgaria (11,4 la 100.000 locuitori),
Slovacia (8,1 la 100.000 locuitori), lituania (5,9 la 100.000 locuitori) i
Suedia (4,7 la 100.000 locuitori). Raportul cazurilor de shigeloz importate
versus domestice variaz substanial de la o ar la alta. n finlanda, Suedia,
Norvegia, olanda, Irlanda, Germania i Regatul unit, 63%-92% din cazurile
de schigeloz sunt considerate de import sau asociate cltoriilor. Aceasta
este n contrast cu ri precum Grecia, Slovenia, Slovacia i ungaria, unde
87-100% din cazuri sunt domestice.
Tabelul 1.1.
numrul i rata notifcrilor cazurilor de shigeloz uman n UE i EEA/
EfTA, n 2006 (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
ara Tipul de raportare Total cazuri Cazuri confrmate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de oameni
Austria C 77 77 0,93
Belgia u 305 305 2,9
Bulgaria A 879 879 11,4
Cipru C 2 0 0,26
Republica Ceh C 289 276 2,7
danemarca u - - -
Estonia A 53 53 3,9
22
ara Tipul de raportare Total cazuri Cazuri confrmate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de oameni
finlanda C 74 74 1,4
frana u - - -
Germania C 814 814 0,99
Grecia C 30 26 0,23
ungaria C 93 73 0,72
Irlanda C 54 53 1,3
Italia u - - -
latvia C 87 73 3,2
lituania A 203 203 5,9
luxembourg C 13 13 2,8
malta u 0 0 0,0
olanda C 256 248 1,5
Polonia A 35 30 0,08
Portugalia C 2 1 0,1
Romnia C 559 559 2,6
Slovacia C 465 436 8,1
Slovenia C 43 36 1,8
Spania C 148 148 0,34
Suedia C 429 429 4,7
marea Britanie C 1425 1425 2,4
Total uE 6375 1,71
Islanda C 0 0 0,0
liechtenstein N - - -
Norvegia C 138 138 3,0
Total 6513 6410 1,73
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecifcat
distribuia shigelozelor pe grupe de vrst i sex
Rata notifcrilor a fost cea mai mare la grupa copiilor cu vrsta ntre
0 i 4 ani, cu 7,1 cazuri la 100.000 locuitori. Bulgaria i Slovacia au avut
rate ale notifcrilor mult mai mari, de 148,7 i respectiv 90,0 la 100.000
locuitori la grupa de vrst 0-4 ani.
Numai cteva state, cum ar f finlanda, olanda i Germania au avut
cele mai mari rate ale notifcrilor la grupa de vrst 25-44 ani.
Nu au fost semnalate diferene semnifcative ale ratelor de notifcare
n funcie de sex: din 4.514 cazuri cercetate brbaii au avut rata medie
a notifcrii de 1,3 la 100.000 locuitori, iar la femei de 1,4 la 100.000
locuitori.
23
Figura 1.1.
distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de shigeloz uman n EU i EEA/
EfTA n 2006 (n=142325 cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
/
1
0
0
.
0
0
0
Sursa: Raportri naionale. Austria, Belgia, Bulgaria, Cipru, Republica Ceh, Estonia, finlanda, Germania,
Grecia, ungaria, Irlanda, latvia, luxembourg, olanda, Portugalia, Slovacia, Slovenia, Spania, Suedia, m.B., i
Norvegia. malta i Islanda au raportat 0 cazuri
Sezonalitatea
un vrf al numrului total de cazuri raportate a fost observat spre
fnalul verii i n lunile de toamn.
Shigeloza nc are un impact major asupra copiilor de vrst foarte
mic, cu o rat a notifcrilor maxim la grupa 0-4 ani. n statele unde
rata maxim a notifcrilor a fost la grupele de vrst mijlocie, acestea
au fost cel mai adesea asociate cltoriilor, iar la aceste state majoritatea
cazurilor raportate au fost de import. de asemenea, variaia de la tiparul
sezonier general observat n unele state se poate datora tot cazurilor asociate
cltoriilor, din timpul vacanelor de iarn.
1.8. manifestri clinice
Tabloul clinic de baz are dou forme de manifestare: diareea apoas
asociat cu vom i deshidratare sau cu dizenterie (volum mic al fecalelor,
cu mucus, snge, crampe i tenesme), (djuretic T, col., 1996; Guerrant l.R.,
1995).
Semnele clinice apar la 24-48 ore de la ingerare n infecia acut,
cu limite ntre 7 i 36 ore, pn la 1-7 zile n transmisiile nealimentare.
durata bolii este n medie de 7 zile la adulii tratai i pn la 30 zile la cei
netratai.
24
dizenteria cauzat de Shigella spp. este marcat de penetrarea celulelor
epiteliului intestinal, cu ataarea shigelelor la suprafaa mucoaselor. urmeaz
infamaia local, cu descuamarea celulelor epiteliului intestinal i formarea
de ulcere. Infamaia intestinului (colonului) este mediat de citokine, care
produc necroza epiteliului intestinal. Germenii se multiplica mai nti n
intestinul subire, apoi se mut n colon, de unde pot f izolai n 1-3 zile de
la debutul clinic al infeciei (Schuch R., maurelli A.T., 2001).
Studiile efectuate pe voluntari arat c infecia poate f provocat
chiar i dup ingerarea unui numr redus de bacterii, cuprins ntre 10 i 100
microorganisme patogene.
la copii, diareea poate dura ntre 3 i 5 zile (evoluie scurt), 6-9 zile
(evoluie medie) i mai mult de 9 zile (evoluie cronic).
una dintre cele mai severe complicaii este ileusul, obstrucie
intestinal nsoit de balonarea abdomenului, prin blocarea tranzitului, care
poate duce la megacolonul toxic.
o alt complicaie este glomerulonefrita acut produs de Shi. fexneri,
nsoit de evidenierea unei proteine sub form de complexe imune
(mugochi T. et al., 1999).
una din complicaiile tardive, deloc de neglijat, aprut dup infecia
cu Shigella, la cea 3% din bolnavi, este sindromul Reyter, manifestat prin
artrit reactiv dureroas, uretrit i conjuctivit.
1.9. Sensibilitatea fa de factorii de mediu
Sensibilitatea shigelelor la factori fzici i chimici
Shigelele rezist un timp scurt n condiii de aciditate extrem (ph
2,5); la cldur, inactivarea se produce n 10 minute la 58-60C, iar la
lumin solar direct mor n cel mult 60 minute. Supravieuiesc n mediul
nconjurtor aproximativ 60 de zile la temperaturi sub 0C, iar la uscciune
maximum 20 de zile.
Shigelele sunt enterobacterii cu rezisten sczut, comparativ cu fora
fecaloid saproft din alimente i din mediul natural. din aceast cauz
probele de la pacieni i prelevatele alimentare trebuie prelucrate imediat
sau conservate n medii speciale, sau prin crioconservare (-20C).
n diferite alimente (lapte, brnzeturi, ou, crustacei, molute, suc de
roii) inoculate experimental cu un numr mare de germeni, shigelele au
supravieuit perioade de timp variind de la 3 sptmni la 3 luni.
n lapte inoculat experimental, Shi. fexneri s-a multiplicat semnif-
cativ la temperaturi de 19-37C, ns creterea a fost observat i la niveluri
25
mai joase 12C.
Rezistena shigelelor n condiiile mediului extern este mai redus ca a
salmonelelor, dar pot supravieui un timp sufcient de lung pentru a asigura
transmiterea infeciei.
unele specii de Shigella (Shi. fexneri, Shi. sonnei) pot contamina
laptele prin intermediul mutelor, prin minile mulgtorilor, procesatorilor
sau prin apa poluat cu dejecii umane. multiplicarea shigelelor este mai
intens n laptele pasteurizat din cauza lipsei forei concurente.
rezistena shigelelor la antibiotice
Rezistena shigelelor la antibiotice este condiionat de uurina cu care
aceast grupare achiziioneaz i transfer plasmidial rezistena multipl.
Rezistena intrinsec, adic rezistena unui grup dat la un anumit
antibiotic este rar la genul Escherichia i Shigella. Susceptibilitatea
varietilor izolate difer foarte mult i de aceea antibiogramele sunt folosite
adesea ca markeri epidemiologici. Aceast rezisten non-intrinsec este
uzual mediat plasmidic (du Pont h.l., 1995; Edwards Bh., 1999).
din cauza folosirii curente n clinica uman a unui numr mare de
antibiotice, Shigella spp. a devenit progresiv rezistent la cele mai rspndite
i mai accesibile antibiotice (tabelul 1.2).
Tabelul 1.2
Susceptibilitatea shigelelor la acidul nalidixic i la cele mai noi quinolone
(Toppley i Wilsons, sistematic Bacteriology, 1990)
Perioada ara
nr. cazuri
tratate
Antibioticul
Suscepti-
bilitatea (%)
Autorul
1977-1979 Suedia 43 Acid nalidixic 100 houstonetal. (1981)
1984-1987
M.B. 120
Acid nalidixic
100 lingetal. (1988)
Quinolone noi
1984-1989 olanda 1313 Acid nalidixic 99,8 Voogaletal. (1992)
1985-1986 Elveia 107 Acid nalidixic 98,0 Altweggetal. (1986)
1985-1986 SuA 252 Acid nalidixic 99,6 Tauneetal. (1990)
1985 Bangladesh 91 Acid nalidixic 100 musnshictal.(1987)
1986 Bangladesh 515 Acid nalidixic 68,7 munshietal. (1987)
1987 Bangladesh 58 Acid nalidixic 40,0 munshietal. (1987)
1987-1992 Israel 262 Acid nalidixic 98,1 Admonietal. (1995)
1989-1990 Germania 255 Acid nalidixic 100 Aleksieetal.(1993)
dobndirea uoar a rezistenei de la alte enterobacterii comensale,
poate face inefcient terapia iniial (intit prin testarea sensibilitii),
26
iar pe de alt parte poate induce enterobacterii rezistente implicate apoi n
complicaii secundare, reducnd gama antibioticelor active n terapie.
n terapia shigelozelor la om sunt recomandate trimetoprim, sulfa-
metoxazolul i quinolonele de toate generaiile, deoarece scurteaz evoluia
i portajul cronic.
fenomenul rezistenei transferabile, semnalat de Watanabe, 1963,
citat de Brzoi d., meica S., Negu m., 1999, s-a extins mult, find raportat
n procent ridicat n unele zone geografce (mexic, America Central,
Asia, India i Africa). Aceast rezisten multipl dobndit la sulfamide,
cloramfenicol, ampicilina i tetraciclin are dublu impact terapeutic.
rezistena shigelelor n alimente, ap i alte suporturi biologice
ntruct habitatul normal al shigelelor este tractul intestinal al omului
i maimuelor superioare, rspndirea acestora n natur este limitat
aproape exclusiv la om. Alimentele i sursele de ap contaminate de om au
semnifcaie de principal vector nespecifc.
Alimentele care nu sunt acide sau prea uscate sunt surse de risc potenial
pentru mbolnvirea omului, ntruct aceti germeni pot supravieui i se
pot multiplica pe acest substrat.
Cu toate c rezistena n condiiile mediului extern este mai redus
dect a salmonelelor, shigelele pot supravieui un timp sufcient de lung
pentru a asigura transmiterea infeciei.
n apele poluate shigelele triesc 2-4 zile, iar n apa sterilizat, infectat
experimental, 10-12 zile.
Pe alimentele cu ph apropiat de neutru acestea supravieuiesc i se
nmulesc. de exemplu, Shi. fexneri a putut f izolat din icrele de manciuria
cu ph 5,5 i concentraie de sare de 6%.
n produsele n care shigelele se af n asociaie cu Escherichia coli
supravieuiesc puin timp, ntruct sunt sensibile la produsele de metabolism
ale acestei bacterii i, desigur, sunt sensibile i la acidiferea substratului,
produs de Escherichia coli.
Shigelele au rezisten sczut la fora fecaloid sau saproft din
alimente sau din mediul natural.
n lapte, brnzeturi, crustacei, molute, suc de roii, ou, etc. shigelele
supravieuiesc ntre 3 sptmni i 3 luni.
n vinurile roii i albe, precum i n vinul mukumbi (vin tradiional din
zimbabwe), s-a observat c shigelele mor rapid, fenomen datorat aciditii
mai ridicate.
S-a observat c shigelele nu pot supravieui nici n pudra de sorg sau
27
n porrigde-ul fermentat sau gtit.
Potenialul shigelelor de a se multiplica pe alimente la temperaturi
de pn la 10C explic de ce unele alimente, iniial contaminate cu un
numr subinfectant de germeni sunt implicate n declanarea toxiinfeciilor
alimentare.
Shigelele pot supravieui i se pot multiplica i pe zarzavaturile crude
contaminate fe prin apa de la irigaii, fe prin manipularea lor neigienic de
ctre muncitorii purttori de germeni.
n praful uscat shigelele rezist aproximativ 10 zile, iar pe lenjerie
peste 2 sptmni.
n ap la temperatura de 7-10C shigelele supravieuiesc aproximativ
9 zile, iar n alimente 1-2 sptmni. n apa ngheat triesc circa 2 luni.
1.10. Prelevarea, ambalarea, transportul i conservarea probelor de
alimente de origine animal destinate investigaiilor microbiologice
Recoltarea, ambalarea, pstrarea i transportul probelor de alimente
de origine animal destinate examenelor microbiologice, trebuie s respecte
unele reguli procedurale obligatorii privind organizarea, prevzute n
Normele ministerului Sntii.
Proba prelevat trebuie s fe reprezentativ i, dac este posibil, n
cantitate sufcient pentru efectuarea tuturor investigaiilor necesare.
n toate manoperele se va evita contaminarea suplimentar a probei cu
ali germeni sau diveri ali ageni poluani care nu sunt implicai etiologic
n cazul cercetat, astfel nct rezultatul fnal al examenului de laborator s
nu fe denaturat sau infuenat.
Trebuie subliniat obligativitatea ca toate probele trimise pentru
investigaii de laborator s fe expediate sigilat pentru pstrarea integritii
lor, cu not de nsoire completat detaliat i semnat de cei care au solicitat
examenul. n interiorul coletului se va introduce un exemplar al avizului de
identifcare al fecrui produs n parte, de asemenea, semnat de fecare din
factorii autorizai.
Probele se recolteaz din unitile productoare, depozite, mijloace
de transport, reeaua de desfacere sau, n cazuri speciale, de la domiciliul
cumprtorului sau productorului unor asemenea produse, precum i de la
bolnavii suspeci de toxiinfecie alimentar.
Recoltarea probelor se face de ctre un medic veterinar ofcial de
stat sau de ctre o persoan mputernicit de lege i de medicii care acord
asisten clinic bolnavilor suspeci de toxiinfecie alimentar.
nainte de recoltarea probelor, medicul veterinar trebuie s se
28
informeze amnunit asupra produsului ce urmeaz a f expertizat, unitatea
productoare, data fabricrii, condiiile igienico-tehnologice de fabricare,
depozitare, transport sau desfacere, rezultatele controalelor sau analizelor
de laborator efectuate pn la acea dat, aspectul general al produsului sau
lotului, starea ambalajului, modul de etichetare sau tanare, dac asupra
produsului respectiv au existat litigii i modul de soluionare a acestora,
dac produsul se af n termenul de valabilitate, etc.
Probele recoltate trebuie s fe reprezentative, s reproduc n mic
imaginea real a lotului i s fe corespunztoare pentru examenul soli citat.
Se vor recolta n mod proporional, att probe din prile care par
suspecte, ct i din cele care par nemodifcate. Proba va cuprinde att pri
de la suprafa, ct i din centrul produsului i se va ambala n recipiente
curate i uscate care s permit o nchidere complet. n cazul recoltrii
probelor pentru examene bacteriologice fecare prob se va ambala n
recipiente sterile sau n pungi de polietilen nefolosite.
Recoltarea succesiv a mai multor probe trebuie s se fac astfel nct
s nu se amestece pri din acestea sau s nu se contamineze ntre ele, iar
pentru recoltarea fecrei probe se vor folosi alte instrumente sterilizate.
dup recoltare fecare prob se va individualiza prin etichetare corect,
se va ambala separat astfel nct s nu se deterioreze n timpul transportului
i se va sigila pentru a mpiedica substituirea produsului. Sigiliul pus pe
probe va f menionat n procesul-verbal de recoltare.
Produsele preparate i livrate n recipientele nchise ermetic (con-
serve, semiconserve) se vor recolta i expedia la laborator n amba lajele
originale, nedeschise. dac aceste produse au sigilii, banderole sau etichete
care servesc marcrii sau prezentrii, acestea vor rmne obligatoriu la
proba ce se trimite la laborator.
la ridicarea probelor se ncheie un proces-verbal de recoltare, care va
f semnat de medicul veterinar care recolteaz proba i va f contrasemnat
de un reprezentant al unitii asupra cruia se af n gestiune sau proprietate
produsul.
Procesul-verbal de recoltare va cuprinde numele i calitatea medi cului
veterinar care a ridicat proba, numele i calitatea reprezentantului unitii
care a asistat, denumirea produsului (cu specifcarea numrului standardului
sau al normei interne, dac este cazul), specifcaiile de marcare a produsului,
motivul recoltrii i analizele de laborator soli citate.
n cazul crnii i laptelui se va meniona dac acestea provin de
la animale tratate cu antibiotice, chimioterapice, substane hormonale,
biostimulatori, etc.
n procesul-verbal de recoltare a probelor se va meniona numrul
29
lotului, cantitatea sau numrul unitilor de ambalaj care constituie lotul
controlat, numrul probelor recoltate i cantitatea lor, temperatura pro-
dusului n momentul recoltrii, laboratorul la care se expediaz probele i
specifcaia sigiliului pus pe ambalajele cu probe, alte informaii etc.
Concomitent cu ridicarea probelor reprezentative se vor ridica i
contraprobe identice pentru expedierea la laborator. Analiza contra-probelor
se va face la solicitarea unitii deintoare, organelor de justiie, poliie sau
altor foruri ofciale.
Contraprobele din loturile de produse conservabile pe durat lung
(conserve, semiconserve) se pstreaz pn la expirarea termenului de
valabilitate.
Nu se rein contraprobe din produsele evident alterate sau din cele
care nu se pot conserva dect foarte puin timp.
Probele recoltate trebuie transportate la laborator imediat, n condiii
care s nu determine alterri sau modifcri ale nsuirilor avute n momentul
recoltrii.
lotul de alimente afat n litigiu se pune sub restricii sanitare
veterinare pn la terminarea tuturor analizelor de laborator i clarifcarea
situaiei. n toat aceast perioad, deintorul produselor alimentare este
obligat s asigure condiiile corespunztoare de conservare.
Trebuie menionat c n practica curent exist tendina de a se da
noiunii de lot cele mai diferite i incorecte sensuri i defniii ce pot
denatura nu numai noiunea n sine, dar pot genera confuzii i interpretri
cu implicaii epidemiologice, economico-sociale i juridice dintre cele mai
grave (Enache T., 2002).
de aceea pentru nlturarea acestor situaii echivoce s-a propus
acceptarea n unanimitate a defniiei ofciale a noiunii de lot dat de
dicionarul Explicativ al limbii Romne:
Grup de produse identice sau asemntoare fabricate simultan sau 5
succesiv;
Grup de produse identice sau asemntoare, expediate n acelai 5
timp sau sosite n acelai timp i/sau depozitate n acelai loc sau spaiu
comercial.
n continuare, n scopul unei orientri generale ct mai corecte
i complete asupra modului n care se face recoltarea (pentru analize de
laborator a probelor de alimente de origine animal) i chiar din considerente
didactice, se va prezenta aceast conduit general pe grupe de produse.
Preparate de carne. Recoltarea probelor se face din locuri diferite
maximum 2% din numrul batoanelor sau calupurilor, dar nu mai puin
de dou buci i nu mai mult de 6. din preparatele de carne prezentate
30
n ambalaje mici (sub 1 kg) se recolteaz din locuri diferite o cantitate de
1,5-2 kg. Batoanele sau calupurile recoltate sunt secionate longitu dinal
la faa locului, de ctre medicul veterinar, n jumti egale i se face un
examen organoleptic (aspect pe seciune, miros i gust). Pentru preparatele
n ambalaje mici (sub 1 kg) proba iniial se desparte n dou jumti egale.
Cele dou jumti rezultate constituie proba i contraproba reprezentativ.
dintr-o jumtate a batonului secionat se detaeaz de la mijloc i de
la capete cteva poriuni n greutate total de 300-800 g, care se trimit la
laborator pentru analize fzico-chimice i microbiologice.
Conserve. Recoltarea probelor se face pe loturi dup cum urmeaz:
cnd lotul are pn la 1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 1001-
5000 se recolteaz 5; de la 5001-10000 se recolteaz 10; de la 10001 - 50000
se recolteaz 20; de la 50001 -100000 se recolteaz 30 de recipiente.
Pentru fecare 100000 sau fraciuni de 100000 n plus se vor recolta
cte 15 recipiente.
din reeaua de desfacere se recolteaz de obicei 2% din cutiile de
conserve existente, dar pe ct este posibil s se in seama de sortimente.
Semiconserve din carne. V Recoltarea probelor se face pe loturi, n
funcie de mrimea acestora, dup cum urmeaz: cnd lotul are pn la
1000 recipiente se recolteaz 2 recipiente; de la 1001 -2000 se recolteaz
4; de la 2001-3000 se recolteaz 6; de la 3001-5000 se recolteaz 8; pentru
fecare 5000 recipiente n plus se recolteaz cte 5 recipiente.
Untur de porc i de pasre. V Se recolteaz la ntmplare 5%
din numrul ambalajelor unui lot. untura este ambalat n blocuri sau
preambalat n ambalajele de transport. din blocuri cu ajutorul unei sonde
se scot probe din toate straturile. la loturile formate din pachete de pn la
1 kg se recolteaz 1% din numrul pachetelor, dar nu mai puin de 5 i se
recolteaz cte 1 prob din fecare pachet. din probele recoltate astfel se
face o prob medie, din care se trimit la laborator 500 g.
Cnd lotul este format din ambalaje de pn la 500 g se expediaz la
laborator 1% din ambalajele originale luate la ntmplare, dar nu mai puin
de 2 i nu mai mult de 5.
Seu alimentar topit. V Se deschid la ntmplare 5% din ambalajele
aparinnd aceluiai lot, dar nu mai puin de 3 ambalaje, din care se recolteaz
probe din toate straturile cu ajutorul unui cuit sond. Se face o prob medie
dup topire pe o baie de ap din care, dup omogenizare, se iau 500 g, se
ambaleaz i se expediaz ctre laborator.
Pete. V Se recolteaz la ntmplare 5% din ambalajele unui lot.
Cnd greutatea individual a petelui nu depete 2 kg, cte V
2 exemplare din fecare ambalaj, unul de la suprafa i cellalt din
31
profunzime;
Cnd greutatea individual a petelui depete 2 kg, cte o bucat V
(de aprox. 1 kg) dintr-un pete de la suprafa i o bucat dintr-un pete
din profunzimea ambalajului. Cnd petele este n vrac se va recolta cte
o prob (de 1 kg) pentru fecare 1.000 kg, ns nu mai puin de 3 probe i
nu mai mult de 10. Probele se vor recolta att de la suprafa, ct i din
profunzime;
dac petele este ambalat n butoaie cu saramur, din fecare ambalaj V
controlat se recolteaz i o prob de aproximativ 200 ml saramur.
Icre. V Se desfac 10% din ambalajele lotului i se recolteaz cte o
prob (suprafa i profunzime) de aproximativ 250 g din minimum dou i
maximum 5 ambalaje deschise.
Crustacei i molute. V Se recolteaz 1% din numrul exemplarelor
care formeaz lotul, astfel nct greutatea probei s fe de 500-1000 g pentru
fecare lot. Probele se vor lua din diferite puncte ale lotului.
Pulpe de broasc (pui de balt). V Se recolteaz ambalajele originale
(brichete) n procent de 5%, dar nu mai puin de dou i nu mai mult de
cinci.
Pentru probele de ou. V Se deschid 10% din ambalajele care
formeaz lotul i din fecare ambalaj se recolteaz 12 ou din cutiile de 360
ou. Numrul total al oulor recoltate dintr-un lot nu va f mai mare de 100.
n cazul oulor preambalate se recolteaz 1% din numrul preambalajelor.
Pudr de ou sau produse de ou pasteurizate sau congelate (ou V
integral, glbenu, albu). Se recolteaz probe n procent de 2% din numrul
ambalajelor, dar nu mai puin de 5 i nu mai mult de 10.
Recoltarea probelor de lapte la locul de producie V se face n caz
de litigii pentru stabilirea fraudelor privind integritatea (mai ales cantita-
tea de grsime) sau calitatea igienic, n acest caz se vor recolta probe n
urmtoarele condiii:
Cel mai trziu la 3 zile de la ivirea litigiului: de la aceeai vac sau V
de la acelai numr de vaci i de la aceeai mulsoare sau de la acelai numr
de mulsori ca i proba n litigiu;
Se va controla dac alimentaia animalelor nu s-a schimbat ntre V
timp;
mulgerea va f complet i fcut n aceleai condiii ca i cea de V
la care s-a obinut laptele;
Pentru depistarea unor germeni n lapte se vor recolta probe V
individuale de la fecare animal direct n recipientul de recoltare, dup ce n
prealabil s-a asigurat dezinfecia ugerului i minilor muncitorului.
Probele se vor recolta de la nceputul mulsorii dup ce s-au nde prtat
32
primele 3-4 jeturi, cu excepia controlului pentru leucoz i tuber culoz,
cnd probele se recolteaz din mulsul fnal. Probele se recolteaz n prezena
unor martori.
n unitile de prelucrare industrial se controleaz laptele sub
aspectul integritii i al calitii igienice i se recolteaz probe la recep ie,
pe fuxul tehnologic de prelucrare i dup obinerea produsului fnit.
n unitile de desfacere, recoltarea probelor se face astfel:
Din cisterne, bazine i tancuri se recolteaz cu ajutorul unor
sonde speciale minimum 500 ml pentru fecare prob, dup o prealabil
omogenizare;
Din bidoane se formeaz o prob medie de 10% din bidoanele care
constituie lotul; din proba medie bine omogenizat se recolteaz 500 ml
pentru examen de laborator;
Din buteliile de sticl, pungi din material plastic, 2-3 uniti de
ambalaj din fecare lot. Probele recoltate trebuie s ajung la laborator n
maximum 4 ore de la recoltare, transportul lor fcndu-se n condiii de
refrigerare.
Produsele lactate acide se recolteaz n ambalaje originale n
procent de 1% din ambalajele care alctuiesc lotul, dar nu mai puin de 2 i
nu mai mult de 5.
Smntn ambalat n bidoane i pregtit pentru livrare. Se
deschid 5% din numrul bidoanelor i se recolteaz o prob medie de 250 g.
dac smntn este preambalat n uniti mai mici de 0,5 kg se recolteaz
1% din unitile de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Untul ambalat n lzi sub form de blocuri. Recoltarea probelor
se face la 10% din ambalajele care formeaz lotul, dar nu mai puin de 3,
cu ajutorul unei sonde speciale, recoltndu-se, att de la suprafa, ct i
din profunzime cte 200 g din care se face o prob medie. din proba medie
omogenizat se recolteaz 250 g pentru laborator.
Cnd untul este ambalat n pachete de pn la 200 g se recolteaz
pachete ntregi, n procent de 2% din numrul care formeaz lotul, dar nu
mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Laptele praf n ambalaje mari (peste 1 kg). Se recolteaz 10%
din numrul ambalajelor care formeaz lotul i se face o prob medie de
250 g. Recoltarea se face cu sonda, ndeprtndu-se stratul superfcial pe o
adncime de 5-10 centimetri.
Brnza proaspt de vac. Se deschid 10% din ambalajele care
formeaz lotul, n cazul ambalajelor mari (bidoane, tvi) se iau probe de la
suprafa i profunzime din care se formeaz o prob medie.
33
din proba medie se trimit la laborator 200 - 300 g. dac lotul este
format din ambalaje mici (pachete) se recolteaz 2% din numru unitilor
de ambalaj, dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5.
Pentru probele de cacaval i brnzeturi fermentate (diferite
sortimente) se deschid 5% din unitile de ambalaj care formeaz lotul,
dar nu mai puin de 2 i nu mai mult de 5. din fecare ambalaj deschis se
recolteaz pentru laborator cte o prob de 200-300 grame n felii sau cu o
sond special, astfel nct s cuprind att suprafaa, ct i profunzimea.
Pentru sotimentele ambalate n pachete mici de pn la 250 grame se
recolteaz pachete originale n procent de 1, dar nu mai puin de 3 i nu
mai mult de 10.
Brnza telemea n cutii sau bidoane. Se recolteaz o felie dintr-o
bucat de la suprafa i una dintr-o bucat din profunzime. de asemenea,
se recolteaz i 200-300 mililitri saramur.
Mierea de albine. Se deschid 10% din numrul ambalajelor din
fecare lot, ns nu mai puin de 3 i nu mai mult de 7. dup o omogenizare
atent se recolteaz din fecare ambalaj deschis aproximativ 250 grame
miere, fcndu-se o prob medie. dup omogenizare, din aceasta se
recolteaz pentru laborator 250 grame.
Trebuie menionat c n funcie de felul alimentului i al modului de
ambalare, probele recoltate pentru examen de laborator se refrigereaz la
1-4C, fr ns a le congela.
din alimente congelate, prezentate n ambalaje mici, probele se iau
ca atare, iar din cele prezentate n ambalajele mari se recolteaz probe prin
forare, tiere sau prin achiere cu instrumentar corespun ztor.
Prelevarea probelor de ap pentru identifcarea germenilor
din genul Shigella spp.
Se recolteaz ap de robinet din sursa de alimentare, ap din rezervoare,
bazine, lacuri, fntni, etc, n funcie de situaia existent.
Pentru proba de ap din reeaua de alimentare se fambeaz robinetul,
apoi se deschide complet i se las s curg ap 5 minute i aproximativ 10
secunde din rezervor. Se scoate dopul faconului pentru prob i se menine
sub jet pentru a se umple pn la aproximativ 2 centimetri sub dop. Sunt
necesare probe de 1-5 litri.
Probele se transport n lad izoterm pentru examinare n interval de
maxim 2 ore.
Examinarea se poate temporiza maximum 6 ore, dac proba este
34
refrigerat ab initio la 4C.
Alternativ, se pot folosi tampoane moore, meninute 48 ore sub jetul
lent de ap din conduct, dup care sunt transferate n recipient cu mediu
de mbogire.
Prelevarea probelor de ghea alimentar
din blocul de ghea se recolteaz calupuri de aproximativ 2 kilograme.
n laborator calupul se spal cu ap steril apoi, folosind instrumente sterile
se taie din profunzime cteva buci (aproximativ 0,5 kilograme), care se
menin n vas steril la temperatura camerei pn la topire, find supuse n
continuri protocolului obinuit de lucru, n cel mai scurt timp.
Prelevarea probelor de pe suprafeele de lucru
Este recomandat prelevarea cu tampoane sau burei. metodele de
amprentare sau incluzionare n mediu agarizat sunt contraindicate pentru
investigaii n focarul de toxiinfecie alimentar.
Cu mnui sterile i cu burete mbibat cu ap peptonat 0,1% se terge
o suprafa ct mai mare, apoi buretele se introduce n faconul cu mediu de
mbogire. Alternativ, se folosete pentru tergere tampon umezit cu ap
peptonat 0,1%.
dac se urmresc determinri cantitative, se delimiteaz suprafaa
investigat printr-un ablon metalic, cu aria de 100 cm
2
, sterilizat prin
fambare. n fnal se introduce buretele sau tamponul ntr-un volum msurat
de diluant.
Pentru prelevarea probelor de ap clorinat se folosesc facoane care
conin 10 mg tiosulfat de sodiu pentru fecare 500 ml de ap. dac suprafeele
investigate au fost deja dezinfectate se stropesc cu o soluie N/10 tiosulfat
de sodiu.
Probele se refrigereaz i se expediaz la laborator pentru examinare
n cel mai scurt timp.
Prelevarea probelor de la pacienii cu sindrom diareic acut,
de la purttorii cronici i de la personalul care produce,
manipuleaz i transport alimente de origine animal
n cazuri acute de toxiinfecii alimentare se vor preleva din colonul
sigmoid probe de fecale cu tampon rectal sau cu sonda Nelaton, dar i din
ulceraiile descoperite la rectoscopie. Nu se vor preleva probe de la pacienii
35
bolnavi de mai mult de 3 zile.
1.10. Izolarea i identifcarea shigelelor
Izolarea i identifcarea shigelelor din alimente
mbogirea la Shi. sonnei:
Se cntrete aseptic o prob de 25 de grame n 225 ml de bulion
Shigella cu novobiocin 0,5 mg/ml.
Amestecul se las 10 minute la temperatura camerei i se agit
permanent, dup care se toarn ntr-un balon Erlenmeyer steril de 500 ml.
Balonul se incubeaz anaerob ntr-un sistem Gas Pak, n baie marin,
la 44C, timp de 20 de ore.
Se omogenizeaz bine suspensia i se striaz n plci cu agar mac
Conkey. Se incubeaz 20-48 de ore la 35C.
mbogirea altor specii de Shigella:
Se procedeaz ca mai sus, dar se ncorporeaz o cantitate de novobiocin
de 3 mg/ml i se incubeaz anaerob n baie marin la 42C.
Izolarea shigelelor:
Se examineaz plcile cu agar mac Conkey. Coloniile de Shigella
apar roz palide i translucide. Coloniile suspecte se nsmneaz n bulion
cu glucoz, agar TSI, bulion cu lizin-decarboxilaz, agar pentru testarea
mobilitii i tripton.
Se incubeaz la 35C, 20-48 de ore, dar se examineaz la 20 de ore.
Se ndeprteaz toate culturile care prezint mobilitate, produc hidrogen
sulfurat, formeaz gaz, lizin-decarboxilaz, fermenteaz sucroza sau lactoza
i produc indol.
Identifcarea biochimic:
Shigelele pot f caracterizate biochimic astfel:
teste negative pentru: hidrogen sulfurat, ureaz, glucoz (gaz),
mobilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decarboxilaz (exceptnd Shi.
sonnei), sucroz, adonitol, lactoz (2 zile), salicin, inozitol, cianur de
potasiu, malonat, citrat, Voges-Proskauer;
teste pozitive pentru: manitol (excepie Shi. dysenteriae) i reacia
roului metil.
36
IdEnTIfICArEA gEnULUI ShIgELLA
225 ml bulion Shigella cu novobiocin
25 g aliment
Agar Mac Conkey
Agar TSI
Pant alcalin (roie)
Baz acid (galben); fr h
2
S
1. Amestecul
probei alimentare cu mediul
de mbogire
2. decantarea
supernatantului ntr-un balon
steril
3. Incubare
anaerob 20 de ore la 44C
(Shi. Sonnei) sau la 42C
(celelalte specii)
4. nsmnare
n placa Petri. Incubare la
35C, 20-48 de ore
5. nsmnare
pe mediul TSI i alte teste
biochimice
6. Confirmarea serologic
IdEnTIfICArEA gEnULUI ShIgELLA
225 ml bulion Shigella cu novobiocin
25 g aliment
Agar Mac Conkey
Agar TSI
Pant alcalin (roie)
Baz acid (galben); fr h
2
S
1. Amestecul
probei alimentare cu mediul
de mbogire
2. decantarea
supernatantului ntr-un balon
steril
3. Incubare
anaerob 20 de ore la 44C
(Shi. Sonnei) sau la 42C
(celelalte specii)
4. nsmnare
n placa Petri. Incubare la
35C, 20-48 de ore
5. nsmnare
pe mediul TSI i alte teste
biochimice
6. Confirmarea serologic
37
Izolarea
Izolarea shigelelor de la pacieni i purttori se face dup metodologia
general preconizat la investigarea sindromului diareic.
Izolarea de la pacieni n stadiul acut al bolii se realizeaz prin etalarea
materiilor fecale (omogenizate i suspensionate n soluii saline tamponate)
direct pe mediile selective (fr a trece pe medii de mbogire), datorit
densitii mari a shigelelor n fecale (aproximaiv 10
7
/g).
mediile selective recomandate sunt geloza macConkey (mC), agarul-
deoxicolat-citrat-lactoza (AdCl), geloza Salmonella-Shigella (SS) i
agarul xiloz-lizin-deoxicolat (xld) sau asocierea de medii din clase
selective diferite, slab selective: mC i moderat selective: AdCl, SS, xld.
Rezultatele cele mai bune au fost raportate cu xld.
Izolarea shigelelor din alimente de origine animal
Acest procedeu se realizeaz cu difcultate datorit mai multor
factori:
coninut mare de grsimi n alimente;
parametri fzici: ph, concentraia electrolitic;
for microbian alimentar de competiie;
numr redus de shigele n alimente;
starea fziologic a shigelelor la izolare (stres termic la
decongelare).
mbogirea 18-24 ore la 37 C pe medii fr inhibitori (bulion manit
sau pe medii preconizate pentru izolarea salmonelelor respectiv bulion
pentru Gram negativi (BGN) i bulion selenit) este necesar ntotdeauna la
izolarea shigelelor din alimentele de origine animal.
dispersia pe mediile selective din mediile de mbogire trebuie s fe
dens, datorit prezenei n cantiti reduse a shigelelor n alimente.
Izolarea shigelelor din ap
Izolarea shigelelor din ap se face, de asemenea, dup mbogire prin
fltrare i nsmnarea membranei fltrante n ntregime n bulion pentru
Gram negativi.
38
Identifcare biochimic
Identifcarea biochimic a coloniilor prezumtive de Shigella spp.
se poate face prin teste exoenzimatice asociate (metoda multitest) sau
individuale pe seturi de teste comerciale.
o asociere multitest de TSI (triple sugar iron) i mIlf (motilitate,
indol, lizin, fenilalanin) este larg utilizat datorit multiplelor avantaje pe
care le ofer. Celelalte metode de analiz biochimic, utile n caracterizarea
izolatului se pot face de pe TSI, prin metode macrotest ori microtest. la
acestea se adaug si testele de serotipizare sau de testare a sensibilitii la
antibiotice.
Identifcare serologic
Identifcarea serologic se face utiliznd suspensii antigenice inactivate
prin cldur (pentru a evita inaglutinabilitatea i a reduce riscul contaminrii
profesionale) cu seruri aglutinante ori latex aglutinante. ncadrarea de
serotip este obligatorie.
Markeri epidemiologici
oportunitatea investigaiilor epidemiologice a impus folosirea unor
metode de difereniere a serotipurilor, mai ales n cazul Shi. sonnei (serotip
unic) i Shi. fexneri 2a (serotip ubicvitar, larg rspndit geografc).
Biotipia, antibiotipia, fagotipia i bacteriocinotipia au fost preco-
nizate i utilizate de mai muli autori la investigarea unor focare cu areal de
evoluie foarte larg.
determinarea proflului plasmidic i caracterizarea dNA-ului
plasmidelor de rezisten se utilizeaz n investigarea epidemiologic.
Colicinotipia, antibiotipia i proflul plasmidic au o valoare limitat datorit
mobilitii mari a plasmidelor de rezisten la acest gen.
diagnosticul bacteriologic prin tehnici alternative
detectarea shigelelor direct n prelevatele patologice ori alimentare
prin mijloace rapide suscit un larg interes medical. metodele de diagnostic
bazate pe principii genetice i imunologice au fost aplicate deja n
diagnosticul dizenteriei acute.
39
metode bazate pe investigarea dnA-ului
plasmidelor de virulena
Hibridarea pe colonie. A fost introdus pentru evidenierea tulpinilor
invazive de cele neinvazive. Se utilizeaz sonde oligonucleotidice de sintez
marcate radioactiv care se sintetizeaz rapid, au timp de reacie scurt,
ntruct folosesc concentraii nalte de dNA, au interferen mai redus
(dNA-ul monocatenar), intesc o anumit gen (Ipa H), deosebit de util la
diferenierea tulpinilor invazive.
S-au utilizat i sonde ce folosesc un nucleotid conjugat cu fosfataz
alcalin. Specifcitatea a fost ns de numai 81%.
hibridarea prin amplifcare polimerazic (ErIC-PCr)
Tehnica ERIC-PCR (Enterobactenal-Repetitive-Intergenic Consensus-
Polymerase-Chain-Reaction) se aplic la prelevatele cu densitate redus de
shigele, chiar i la cele alimentare i reprezint o modalitate simpl i rapid
de tipizare a Shigella sonnei, cu un nivel nalt de discriminare echivalent
cu PfGE, dar mai mare dect cel al proflului plasmidic, al folosirii
endonucleazelor de restricie ale plasmidelor sau al ribotiprii.
n prezent, pentru detectarea proteinelor bacteriene care sunt markeri
de virulen, izolate din anumite medii se folosete tehnica mAldITof
(matrix-Assisted-laser-desorption-Ionization Time of flight).
la Shi. fexneri i Escherichia coli s-au detectat doi ioni markeri pentru
proteinele specifce asociate cu proprieti de virulen (acidorezisten).
Reacia ce utilizeaz primeri secveniali, corespunztori unor frag-
mente ale plasmidului hind III de 2,5 Kb este folosit att n determinri
clinice, ct i n experimente cu alimente. Pragul de detecie nu depete
10
4
bacterii/gram. Randamentul metodei s-a mbuntit prin introducerea
unei trepte de mbogire. metoda este mult mai sensibil i nu este radio-
activ.
un sistem universal care folosete amplifcarea genic prin PCR a fost
propus nu de mult timp pentru detectarea concomitent n alimente a 13
patogeni intestinali mai frecvent implicai n toxiinfeciile alimentare, ntre
care i Shigella spp.
metode imunoenzimatice
Tehnica imunoenzimatic (ElISA) de evideniere a markerilor de
40
invazivitate (complexul Ipa BCdA) are specifcitate redus n evidenierea
proteinelor implicate n patogenitate.
Prezena complexelor antigen-anticorp poate f vizualizat i
cuantifcat prin adugarea n mediul de reacie a conjugatului unui antigen
sau a unui anticorp cunoscut, cuplat cu o enzim i substratul cromogen
specifc enzimei de marcare.
n funcie de modifcarea activitii markerului enzimatic EIA (Enzyme
Imuno Assay) testele pot f clasifcate n reacii n faza omogen i reacii
n faza heterogen, acestea din urm find larg utilizate n microbiologia
clinic.
latex aglutinarea folosete diferite tipuri de latex (necolorat, colorat).
Testul este rapid (1-2 minute) i efectuat direct din suspensia de materii
fecale de la pacieni n stadiul acut, are o specifcitate cuprins ntre 92,6
i 99,2%. Sensibilitatea redus a metodei nu permite ns aplicarea ei i la
produsele alimentare.
Testele imunoenzimatice ElISA cu antigen proteic, marker de
virulen, dau rezultate foarte bune n testri pe prelevate clinice. Se poate
utiliza la investigri largi de screening i furnizeaz rezultate rapide (in
aproximativ 2 ore).
Examenul bacteriologic pentru izolarea shigelelor
din alimente de origine animal
Prima etap de lucru n examenul bacteriologic pe alimente, produi
de origine animal i ap const n efectuarea nsmnrilor din materialul
suspect pe medii uzuale, de mbogire, selective, speciale, dup care se face
examenul microscopic direct, urmat de examenul bacteriologic complex
pentru izolarea, cultivarea i identifcarea germenului.
Prelevarea, conservarea i transportul probelor de alimente i ap
pentru investigaii de laborator trebuie s se fac n condiii de umiditate i
temperatur sczut i ntr-un timp ct mai scurt posibil.
Identifcarea i tipizarea se realizeaz prin analizarea particularitilor
biologice, care permit stabilirea cu certitudine a agentului cauzal implicat n
procesul patologic, n funcie de care se pot institui corect msurile igienico-
sanitare i conduita terapeutic sau de combatere i proflaxie specifc i
nespecifc.
n controlul de rutin al salubritii produselor alimentare de origine
animal, apei i furajelor, ct i n expertiza medico-legal veterinar
examenul microbiologic este indispensabil, ntruct permite detectarea
contaminrii acestor produse cu germeni patogeni pentru om i animale.
41
Pe lng studierea caracterelor morfo-culturale i biochimice ale
tulpinilor microbiene izolate, examenul microbiologic se completeaz
cu antibiogram, pentru a determina sensibilitatea fa de antibioticele
cunoscute.
Sub aspect medico-legal veterinar, antibiograma este util i pentru
aprecierea corectitudinii cu care a fost aplicat terapia cu antibiotice desigur
cu un grad de subiectivism i relativitate inerente, care trebuie totui analizate
i acceptate ns cu prudena cuvenit. n litigiile\cauzele penale, justiia
cere verdicte categorice asupra eventualei inefciene a actului terapeutic
utilizat, care face obiectul cercetrii.
Este tiut c nu ntotdeauna izolarea unui germen microbian din
materialul patologic cercetat echivaleaz cu posibilitatea desemnrii lui ca
agent etiologic responsabil de mbolnvirile unor animale sau a oamenilor.
de aceea, se recurge i la testarea patogenitii germenului izolat pe animale
de experien.
Corobornd semnele clinice declanate la animalele de experien
cu durata infeciei, localizarea modifcrilor morfopatologice, tulburrile
funcionale i transmiterea n serie a germenilor specifci se poate stabili cu
precizie diagnosticul etiologic.
Executarea i examinarea frotiurilor din alimente
din probele de alimente se execut frotiuri colorate prin metoda Gram
dup o prealabil pregtire.
Alimentele lichide se omogenizeaz prin agitare, iar alimentele solide
se vor mojara n prealabil cu diluant steril (soluie salin izotonic peptonat
0,1% n proporie de 1:5).
frotiurile executate din alimente grase se vor degresa cu xilol timp de
30 secunde, de dou ori consecutiv i se vor usca nainte de colorare.
Se numr bacteriile din cel puin 10 cmpuri microscopice i se
calculeaz media pe cmp.
Shigelele apar ca bacili Gram negativi, subiri, cu margini drepte i
capete rotunjite, scuri sau mijlocii dar pot f i pleomorfce, flamentoase i/
sau cu o coloraie neuniform, izolate sau n perechi, nesporulate.
dac la coloraia Gram apar microorganisme cu proprietile morfo-
logice caracteristice genului Shigella spp., iar n culturi germenii nu se
izoleaz, acest lucru poate f rezultatul contaminrii reagenilor sau a altor
materiale, prezenei de ageni antimicrobieni sau diferite schimbri ale
microorganismelor n funcie de condiiile de mediu.
42
Izolarea shigelelor din alimente prin metoda recomandat de
Organizaia mondial pentru Agricultur i Alimentaie - fAO
Principiul metodei publicat n manual of food Quality Control
microbiological Analysis n 1992, const n parcurgerea succesiv a
urmtoarelor etape de lucru:
mixarea probei de aliment cu mediul de mbogire; 5
decantarea supernatantului n bulion steril; 5
incubarea anaerob a supernatantului 24 ore la 44C (pentru 5
Shigella sonnei i alte specii de Shigella spp. la 42C);
nsmnarea pe plci i incubarea la 35C, timp de 20-48 ore; 5
screening pe TSI i alte medii; 5
confrmarea serologic. 5
dup obinerea probei omogenizate din alimentul studiat se fac
diluii cu ser fziologic steril i, din diluii se pipeteaz 0,25 ml pe suprafaa
mediului cu xiloz solidifcat i se uniformizeaz cu o baghet de sticl n
form de l.
dup incubare se numr coloniile caracteristice din plcile care conin
pn la 300 colonii i se face calculul prezumtiv n funcie de diluie.
Coloniile suspecte au o culoare roie uniform.
Confrmarea biochimic se face dup inocularea coloniilr prezumtive
n mediile pentru identifcare i termostatare la 37C, timp de 24 ore.
ulterior, la culturile reinute se efectueaz testele serologice.
mbogirea pentru izolarea Shigella sonnei
Se cntresc aseptic 25 grame prob i se introduc n 225 ml bulion
Shigella cu novobiocin (0,5 micrograme/ml), sau bulion manit.
Suspensia se pstreaz 10 minute la temperatura camerei, agitndu-se
periodic.
Eluatul se transfer ntr-un balon Erlenmeyer de 500 ml care se
introduce ntr-un vas de anaerobioz cu catalizator proaspt, se insereaz
Gas Pak i se activeaz adugndu-se ap. Catalistul este bine s fe uscat
dup fecare folosire.
Se incubeaz 20 ore n baie de ap la 44C. Suspensia se agit i se
striaz pe plci cu agar macConkey.
Se incubeaz 20 ore la 35C.
43
mbogirea pentru izolarea altor specii de Shigella
modul de lucru este identic, dar se adaug 3 micrograme novobiocin/
militru i se incubeaz anaerob n baie de ap la 42C.
Izolarea
Se examineaz plcile cu agar macConkey.
Coloniile suspecte se inoculeaz n bulion glucozat, TSI n pant,
bulion pentru lizin-decarboxilaz, agar pentru motilitate i tripton. Se
incubeaz la 35C, timp de 48 ore, dar se examineaz i la 20 ore.
Culturile care exprim mobilitate, formare de gaz, fermentarea
glucozei, lactozei i lizin-decarboxilaz pozitiv se vor nltura.
Se nltur i culturile obinute prin incubarea bulionului de mbo gire
la 44C, dar se rein cele care formeaz indolul. Se vor reine i culturile
obinute la 42C, care pot f pozitive sau negative.
Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din alimente prin
mbogire pe medii fr inhibitori i dispersie pe medii selective
mediile selective cele mai recomandate pentru alimente sunt agarul
macConkey, agarul deoxicolat-citrat-lactoz, agar Salmonella-Shigella,
agarul xiloz-lizin-deoxicolat. Sunt recomandate asocieri de medii din
clase selective diferite, slab selective i moderat selective.
Identifcarea
Identifcarea biochimic
Se face inocularea coloniilor selectate pe mediile pentru teste
biochimice incubate la 35C i se examineaz dup 24 i 48 ore.
Comportamentul shigelelor poate f evaluat astfel: negativ pentru h
2
S,
ureaz, glucoza (gaz), motilitate, lizin-decarboxilaz, ornitin-decar boxilaz
(excepie Shigella sonnei, pozitiv), zaharoz, adonitol, lactoz (2 zile),
salicil, inozitol, KCN, malonat, citrat, V-P.
Cele mai multe shigele sunt pozitive pentru manitol (excepie Shigella
dysenteriae, negativ) i reacia Rm.
o alt metod de izolare a bacteriilor din genul Shigella spp. din
alimente se bazeaz pe un test prezumtiv prin cultivarea pe un mediu care
44
conine xiloz (xld).
Pentru efectuarea acestui test este necesar mediul cu xiloz, medii
pentru teste biochimice i ser fziologic steril.
Identifcarea serologic
Se suspend cultura n 3 mililitri soluie salin 0,85%. Se marcheaz
9 dreptunghiuri 3x1 centimetri pe o plac Petri. Se adaug picturi din
suspensie, antiser i soluie salin, n acord cu protocolul (tabelul 1.3).
Se amestec coninutul fecrui careu cu o ans i se agit plcile 3-4
minute pentru accelerarea aglutinrii.
Tabelul 1.3.
determinarea grupurilor serologice de Shigella spp.
dreptunghiul Suspensia Antiserul polivalent
1 + A Al B C CI C2 d A-d
2 + +
3 + +
4 + +
5 + +
6 + +
7 + +
8 + +
9 + +
Gradul de aglutinare poate f:
0 - nu apare aglutinare;
1+ - aglutinare detectabil;
2+ - aglutinare cu 50% clarifcare;
3+ - aglutinare cu 75% clarifcare;
4+ - foculare vizibil cu clarifcarea complet a lichidului de
suspensie.
Se reexamineaz suspensiile cu seruri monovalente, atunci cnd apare
una din urmtoarele reacii pozitive (2+, 3+, 4+).
Cnd reacia este negativ, suspensia se nclzete n baie de aburi 30
minute pentru hidroliza antigelului capsular interferent. Se reexamineaz n
45
antiser polivalent, iar dac aglutinarea este pozitiv se reexamineaz n ser
monovalent.
Nu se cunosc metode foarte sensibile pentru Shigella, iar metodele
recomandate pot s nu detecteze shigelele prezente n numr mic n
alimente.
dac proba nu poate f examinat n 24 ore, se va pstra prin
congelare.
Este necesar selectarea mai multor colonii din fecare plac cu agar
mC, deoarece multe bacterii enterice pot forma colonii asemntoare cu
cele de Shigella.
Examenul bacteriologic pentru izolarea germenilor din genul Shigella
spp. din fecalele bolnavilor cu sindrom diareic acut
din fecalele etalate pe o lam de sticl se face un frotiu n strat foarte
subire i se coloreaz Gram.
n frotiul de fecale se pot observa i leucocite WCBS (white cells
bloody stools), care indic o infecie prin invazivitate.
mucusul din fecale se omogenizeaz pe o lam ntr-o pictur de soluie
de albastru de metil loffer, apoi se acoper cu o lamel i se examineaz.
leucocitele din fecale sunt distruse n mediile de conservare sau
de transport, de aceea este indicat ca examenul microscopic s se fac n
momentul recoltrii.
n caz de toxiinfecie alimentar produs de Shigella se evideniaz
peste 50 polimorfonucleare neutrofle i eritrocite/cmp microscopic.
Izolarea germenilor din genul Shigella spp. din ap
prin metoda Istrati-Meitert
Cantiti diferite de ap (50 ml, 100 ml, 200 ml) sunt trecute prin fltru
Seitz pe care s-a montat pentru fecare prob de ap o membran fltrant cu
pori de 0,7 microni diametru.
Pentru fltrare, pe lama criblat a fltrului se monteaz 1-2 foi de hrtie
de fltru de form corespunztoare. filtrul astfel montat este sterilizat prin
autoclavare, timp de 30 minute la 120C.
membranele fltrante se ferb nainte de utilizare, de trei ori cte 5
minute n ap bidistilat steril, schimbnd apa de fecare dat. dup ce
hrtia de fltru din fltrul Seitz este umectat cu ser fziologic se aplic, cu
precauie, membrana fltrant.
46
dup golire, cilindrul fltrului Seitz este splat cu ser fziologic i cu
ap bidistilat steril.
membranele fltrante sunt aplicate pe un mediu selectiv, n plci Petri,
dup o prealabil uscare a suprafeelor acestora (20-30 minute la 37C cu
capacul ntredeschis), astfel nct s se evite formarea de bule de aer ntre
membrana fltrant i mediu.
dup 20-24 ore de incubare la 37C se vor examina plcile cu mediul
selectiv pe care s-au depus membranele fltrante.
dac pe acestea s-au dezvoltat colonii lactozo-negative se vor replica
i identifca.
Se recomand asocierea metodei cu textul biologic, prin inocularea
pe conjunctiva palpebral la cobai a culturii recoltate de pe suprafaa
membranelor fltrante.
1.11. Surse de contaminare ale alimentelor i apei cu Shigella sp.
materiile prime i ingredientele destinate fabricrii produselor
alimentare trebuie s fe condiionate cu respectarea tuturor normelor de
igien.
datorit posibilitilor de contaminare a alimentelor n timpul trans-
portului, precum i a faptului c exist modaliti sigure de prevenire a
acestor fenomene, transportul acestora este considerat un important factor
de risc.
la transportul materiilor prime i ingredientelor perisabile este
esenial inerea sub control a temperaturii pe toat durata transportului,
aceasta find un parametru critic pentru calitatea i inocuitatea produselor
alimentare.
un alt factor de risc la fabricarea produselor alimentare este recepia
calitativ, ntruct n acest moment se decide acceptarea sau respingerea
unui lot suspect, precum i destinaia lui ulterioar, pentru a nu f introdus
n mod fraudulos n consum.
la intrarea n fabric, produsele uor perisabile sau considerate
contaminate vor f izolate de celelalte categorii de produse i vor f
introduse n ciclul de fabricaie doar dup minuioase i complete verifcri
de laborator.
unele analize vor f efectuate chiar naintea descrcrii materiilor
prime din mijloacele de transport.
materiile prime nu vor f prelucrate pn cnd nu se cunosc rezultatele
tuturor analizelor de laborator.
47
Pentru realizarea testelor i analizelor de laborator, fabricile de
prelucrare vor f autorizate numai dup ce vor amenaja laboratoare de analiz
proprii, acreditate conform legislaiei naionale armonizat cu legislaia
veterinar a uniunii Europene.
Ali factori de risc din procesul tehnologic sunt practicile de lucru
ale muncitorilor i operaiunile de curire-dezinfecie. Aceste operaiuni
constituie puncte critice de risc n industria alimentar, datorit apariiei
unor toxiinfecii alimentare provocate de microorganisme ce au ca surs
purttorii cronici.
n timpul distribuiei produselor alimentare, condiiile de asigurare
a temperaturii de pstrare constituie, de asemenea, puncte critice de risc
epidemiologie.
Produsele refrigerate trebuie pstrate la temperaturi de 4-8C, iar cele
congelate, la temperaturi de -18C.
Este foarte important ca produsele s fe refrigerate, respectiv congelate,
nainte de a f ncrcate n mijloacele de transport, deoarece instalaiile
frigorifce ale mijloacelor de transport sunt proiectate doar pentru a menine
temperatura, nu pentru a rci produsul n cauz.
operaiunea de ncrcare a produselor trebuie s dureze ct mai puin,
pentru a nu permite creterea temperaturii n interiorul mijloa celor izoterme
de transport.
monitorizarea permanent a temperaturii n spaiile de depozitare
trebuie s asigure integritatea produselor att n reeaua comercial, ct i la
consumator, iar utilizarea vitrinelor frigorifce este obligatorie n comerul
cu produse alimentare refrigerate i congelate.
operaiunile de desfacere i servire a produselor alimentare se
desfoar n cantine, restaurante, spitale i n uniti de tip fast-food.
n toate unitile de alimentaie public trebuie supravegheat strict
temperatura de pstrare a alimentelor care s nu permit dezvoltarea
microorganismelor.
meninerea n stare cald a unor mncruri n cantine sau restaurante,
pentru un timp ndelungat, a determinat de nenumrate ori producerea de
toxiinfecii alimentare grave la consumatori.
n reeaua de desfacere a produselor alimentare prevenirea conta-
minrii ncruciate este un alt factor de risc. Trebuie evitat transferul
microorganismelor patogene de pe alimentele crude, ustensile sau de pe
minile personalului pe produsele fnite.
modul de preparare a alimentelor constituie factor de risc, n special
pentru carnea de pasre, picioare de broasc, pete, fructe de mare etc.
Valoarea minim a temperaturii ce trebuie atins la preparare n centrul
48
geometric al acestor produse este de minimum 72C.
Pe plan mondial, abordarea calitii n toate domeniile activitii
economice s-a fcut pornind de la principiile calitii totale i ale realizrii
sistemelor calitii, n concordan cu prevederile standardelor din seria ISo
9000 (echivalente EN 29000 sau BS 5750).
n industria alimentar, pe lng sistemele proprii de management al
calitii devenite clasice, exist un sistem hACCP specifc, care constituie
un sistem de management al calitii ce are ca obiectiv fabricarea de produse
sigure pentru consum.
Introducerea metodei hACCP n industria de prelucrare a petelui
i a produselor pescreti pornete de la identifcarea principalelor riscuri
aferente acestor tipuri de produse.
n acest scop, produsele pescreti au fost clasifcate n ordinea
descresctoare a gradului de risc n urmtoarele categorii:
molute, inclusiv scoici i stridii proaspete sau congelate, cu sau 5
fr carapace; aceste produse sunt consumate ca atare, fr a f gtite;
produse pescreti uor conservate (coninut de NaCl mai mic 5
de 6% n faza apoas, ph>5). Aceast categorie include produsele srate,
marinate, afumate la rece, care se consum fr a f gtite;
pete i crustacei, produse tratate termic (pasteurizate, ferte, 5
afumate la cald); unele dintre aceste produse se consum fr a f gtite;
produse tratate termic (sterilizate i ambalate n ambalaje erme- 5
tice), multe dintre acestea find consumate fr o alt pregtire culinar;
semiconservele de pete (cu peste 6% NaCl n faza apoas, ph 5
< 5, eventual conservani). Acest grup include petele srat sau marinat i
caviarul; se consum fr a f gtite;
pete uscat, pete uscat i srat, pete uscat i afumat; n mod 5
normal se consuma fr a f gtite;
pete i crustacei n stare proaspt i congelat; n mod normal se 5
consum dup gtire.
Numeroase date epidemiologice din literatura internaional de
specialitate fac tot mai des referire la implicarea produselor pescreti n
toxiinfeciile de origine alimentar.
Riscul nu const ns n simpla prezen a acestor microorganisme, ci
n dezvoltarea lor pe produs.
la obinerea i comercializarea petelui i fructelor de mare proaspete
i congelate, riscul de contaminare cu shigele poate f controlat n cadrul
unui program exigent de asigurare a calitii, utiliznd metode i dotri
corespunztoare.
49
Contaminarea petelui, fructelor de mare i a produselor din pete cu
microorganisme din mediu nu este considerat de unii specialiti un risc,
deoarece aceste microorganisme se gsesc n mod obinuit pe materiile
prime utilizate.
Trebuie subliniat c dac aceste microorganisme contamineaz spaiile
de fabricaie, ptrunznd n crpturi sau alte spaii, unde se dezvolt n
condiii favorabile de mediu, pot contamina i produsele fnite.
Este important s se reduc numrul de microorganisme n materiile
prime i n produsele fnite la minimum posibil, prin controlul condi iilor
igienice pe fuxul de prelucrare.
n marea Britanie, cerina de baz impus pentru obinerea de produse
refrigerate sigure pentru consum, conform recomandrilor Institutului de
tiin i Tehnologia Alimentelor, include:
selectarea unor furnizori siguri; V
proiectarea i construirea igienic a seciilor de fabricaie i a V
depozitelor;
proiectarea instalaiilor n vederea facilitrii unei igienizri V
corespunztoare;
programe de ntreinere, curenie, igienizare i dezinfecie; V
educarea i instruirea personalului pentru cunoaterea procedeelor V
de fabricare i de depozitare igienic a materiilor prime, materialelor i
produselor fnite.
depozitele, mijloacele de transport i vitrinele frigorifce pentru
comercializare trebuie proiectate i exploatate corespunztor, pentru a
menine produsele la temperatura de siguran, indiferent de temperatura
mediului ambiant.
Temperatura produselor trebuie verifcat, permanent la intrare n
depozitul frigorifc i la recepia lor n unitile de desfacere cu amnuntul.
Spaiile folosite pentru asamblarea i manipularea produselor tratate
termic trebuie separate de spaiile destinate depozitrii materiilor prime.
1.12. Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n alimentele de origine
animal i n ap
Evaluarea riscului epidemiologic prin izolarea tulpinilor de
Shigella spp din unele alimente de origine animal i ap
Evaluarea riscului de contaminare cu Shigella, prin intermediul unor
surse poteniale de contagiu, reprezint una dintre cele mai importante
verigi de control epidemiologic i de prevenire a toxiinfeciilor alimentare
50
produse de aceti germeni.
n acest context s-a inclus i studiul prevalenei, adic, evaluarea ntr-o
anumit perioad de timp a numrului total de cazuri de produse alimentare
de origine animal contaminate cu Shigella.
S-a insistat n principal asupra studiului de prevalen la grupele de
produse care sunt cel mai frecvent implicate n declanarea toxiinfeciilor
alimentare i care sunt cel mai bine studiate i redate n literatura mondial
de specialitate.
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n lapte i derivate din lapte
n perioada 2001-2003 a fost studiat prevalena tulpinilor de Shigella
spp. pe eantioane mari de lapte i derivate proaspete din lapte, provenite de
la productorii neautorizai care comercializeaz aceste produse obinute n
condiii precare de tehnologie i igien.
din cele 743 eantioane examinate, s-a izolat Shigella spp. din 5 probe
(0,6%), (tabelul 1.4).
Tabelul 1.4
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n laptele comercializat de productorii
neautorizai n pieele capitalei* (perioada 2001-2003)
felul produsului
numrul de probe
examinate
numrul de probe
pozitive
lapte proaspt nepasteurizat 320 12
Ca proaspt 120 3
urd dulce 46 -
Brnz proaspt de vaci 257 1
Total 743 5
* Productorii privai neautorizai de la care au fost prelevate probe proveneau din
mai multe judee limitrofe municipiului Bucureti
Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre
dezosat mecanic (mdm)
n perioada 2000-2003, n Romnia, s-au importat cantiti mari de
carne de pasre dezosat mecanic (mdm), din care mai multe loturi (care au
nsumat sute de tone de produs) au fost gsite contaminate cu Salmonella i
51
au fost distruse conform prevederilor legale referitoare la astfel de situaii.
Avnd n vedere faptul c produsele contaminate cu Salmonella se pot
contamina i cu Shigella spp., prin aceleai verigi, s-au investigat 6 loturi
nsumnd 609 tone carne de pasre dezosat mecanic (mdm).
Pe probele examinate nu s-a reuit izolarea de Shigella (tabelul 1.5).
Tabelul 1.5
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n carnea de pasre dezosat mecanic
(mdm) importat (perioada 2000-2003)
ara de
provenien
numrul de loturi
Cantitatea
(tone/lot)
numrul de probe
examinate
numrul de probe
pozitive
Belgia 20 1 -
SuA 99 3 -
Italia 29 2 -
frana 139 7 -
olanda 390 14 -
Brazilia 31 1 -
Total 609 28 -
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n prjituri i produse de
patiserie comercializate de uniti de alimen taie public
din studiul fcut rezult c aceast grup de produse (prjituri
i produse de patiserie), cu un risc potenial aparent nesemnifcativ n
producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella, prezint n mod cert un
pericol real pentru sntatea public.
din evaluarea surselor posibile de contaminare a acestor produse s-a
constatat c materiile prime folosite la prepararea prjiturilor i produselor
de patiserie nu sunt cauza contaminrii produsului fnit.
Sursa real de contagiu o reprezint prelucrarea neigienic a acestor
produse, prin nclcarea normelor generale de tehnologie i igien indivi-
dual a personalului (tabelul 1.6).
52
Tabelul 1.6
Prevalenta tulpinilor de Shigella sp. n prjituri i produse de patiserie
comercializate de uniti de alimentate public (perioada 2000-2002)
Anul
denumirea
produsului
Cantitatea
(buci)
numrul de
probe analizate
numrul de probe
pozitive
2000
Prjituri 785 20 -
Produse de
patiserie
524 12 1
2001 Prjituri 23404 10 -
2002 Prjituri 232 15 1
Total 24945 57 2
Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n semiconserve de pete
Rezultatele acestui studiu demonstreaz c petele i derivatele din
pete pot f surs de contaminare cu Shigella (tabelul 1.7.)
Tabelul 1.7.
Probe de semiconserve de pete (fabricate n romnia) analizate n cadrul
Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar (perioada 2000-2003)
denumirea produsului
Cantitatea
(kg/lot)
numrul de probe
examinate
Probe
pozitive
Salat de icre de crap 2573 17 1
Salat de icre hering 2135 11 2
Salat de icre cu adaosuri de legume 100 6 2
Salat nordic 30 1 -
Salat pescreasc 42 2 -
macrou afumat 3100 15
Total 7980 52 5
din salata simpl de icre de crap i hering i salata de icre cu adaosuri
de legume s-au identifcat un numr de 5 probe pozitive pentru Shigella.
Aceste produse au fost, probabil, contaminate cu Shigella de la
purttori, n condiiile nerespectrii de ctre acetia a normelor de igien
individual i tehnologic pe fuxul de procesare a materiilor prime, de la
recepie pn la ambalarea i desfacerea produsului fnit.
53
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze
i sosuri pe baz de maionez
n conformitate cu legislaia Sanitar Veterinar Naional i cea
aplicat n rile uniunii Europene, toate produsele alimentare de origine
animal, precum i cele care au n coninutul lor componente de origine
animal, provenite din import, se supun obligatoriu (nainte de a f puse
n consum) examenelor complexe de laborator pentru evaluarea riscurilor
acestor produse pentru sntatea public.
n tabelul 1.8 sunt prezentate loturile de maionez i sosuri pe baz de
maionez importate n perioada 2000-2002.
Pe probele examinate prin sondaj dintr-un import de aproximativ 32
tone din aceste produse nu s-a reuit izolarea de Shigella.
Tabelul 1.8
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n maioneze i sosuri pe baz de
maionez provenite din import (perioada 2000 - 2002)
Anul
ara de
provenien
denumirea
produsului
numrul
de loturi
importate
Cantitatea
(kg)
numrul
de loturi
examinate
numrul
de probe
pozitive
2000
Belgia maionez 12 2521 7 -
olanda
maionez 8 5795 5 -
sosuri pe baz de
maionez
23 2907 13
Polonia maionez 1 300 1 -
Italia
sosuri pe baz de
maionez
9 1440
4 -
Germania
maionez 11 1883 7 -
sosuri pe baz de
maionez
24 7012 21
2001 olanda
maionez 3 3750 3 -
sosuri pe baz de
maionez
6 3041 6 -
2002
Germania maionez 324 1 -
sosuri pe baz de
maionez
8 2701 6
Belgia
maionez 1 360 1 -
sosuri pe baz de
maionez
7 8
Total - 114 32036 75 -
54
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n ap din unele
tranduri i lacuri din Bucureti
Investigarea acestei zone cu potenial de risc epidemiologic este
interesant pentru evaluarea riscului de contaminare cu Shigella a persoanelor
care n sezonul estival fac baie n lacurile de agrement, dar i n trandurile
supuse controlului sanitar permanent.
Rezultatele investigaiilor efectuate pe o perioada de 3 ani (2001- 2003)
au dovedit c, pe fondul unei igienizri inefciente a bazinelor de not din
tranduri i clorinarea necorespunztoare a apei, este posibil supravieuirea
shigelelor provenite de la purttorii cronici.
n aceste condiii este posibil contaminarea pe cale oral, prin
intermediul apei, a unui numr mare de persoane receptive la aceast infecie
(tabelul 1.9).
Tabelul 1.9
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa din unele tranduri i lacuri din
Bucureti (perioada 2001-2003)
Sursa de ap din care s-au
recoltat probe
numrul de probe analizate
Probe pozitive pentru
Shigella
lacul floreasca 50 -
lacul Tei 76 -
lacul Toboc 70 2
lacul Colentina 60 1
trandul 1 60 :
lacul Snagov 60 -
Total 376 3
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn
Pentru a izola shigelele din apa de fntn, n perioada 2001-2003,
s-a studiat un set de probe de ap recoltate din zone geografce diferite,
reprezentnd un numr de 9 judee din ar.
Probele au fost prelevate numai n perioadele cele mai clduroase din
an (iulie-august), din fntni afate n incinta unor gospodrii rneti n
care latrinele erau amplasate n imediata lor vecintate.
faptul c s-a izolat Shigella din 3 fntni din cele 32 cercetate (afate n
55
judee diferite) demonstreaz ca infltrarea n pnza freatic a apei fecaloide
din latrine poate ajunge n apa fntnilor, devenind astfel surs de contagiu
pentru alte persoane din afara gospodriei prin consumul apei contaminate
(tabelul 1.10).
Tabelul 1.10
Prevalenta tulpinilor de Shigella spp. n apa de fntn din mai multe zone
geografce (perioada 2001-2003)
Judeul numrul de probe analizate
numrul de probe pozitive pentru
Shigella
Giurgiu 5 -
mehedini 2 -
Botoani 8 1
Clrai 4 1
Ialomia 2 -
dmbovia 1 -
Vaslui 3 -
Galai 1 -
Tulcea 6 1
Total 32 3
Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele deltei
dunrii
ntruct n literatura de specialitate din ar nu este fcut nici o referire
n ceea ce privete izolarea de Shigella din apa canalelor deltei dunrii, n
intervalul 2001-2003 s-a studiat un numr de 192 probe de ap n perioada
canicular iulie-august (Enache T., Enache T. Jr., 2005).
Probele au fost luate din zona de vrsare n marea Neagr a braului
Sulina, dar i din interiorul braelor Chilia, Sf. Gheorghe i Sulina, n
perimetrele n care sunt concentrate colectiviti umane care deverseaz, n
aceste zone apele menajere i haznalele din incint (tabelul 1.11).
56
Tabelul 1.11
Prevalena tulpinilor de Shigella spp. n apa din canalele deltei dunrii n
perioada 2001-2003 (Enache T. Enache T. Jr., 2005)
Locul de recoltare a probelor
numrul de probe
recoltate
numrul de pozitive
pentru Shigella
zona de vrsare a dunrii-Sulina 6 -
Braul Sulina 72 1
Braul Sf. Gheorghe 60 -
Braul Chilia 5
Total 192 4
din probele pozitive, suspectate de a f contaminate cu Shigella, dup
testarea biochimic i serologic, INCdmI Cantacuzino a confrmat o
singur tulpin atipic de Shi. fexneri.
Izolarea i identifcarea n premier a unei tulpini de Shi. fexneri din
apa canalelor dunrii este deosebit de util pentru evaluarea corect i critic
a surselor poteniale de contaminare a petelui i apoi a consumatorilor
acestui produs (Enache I, Enache T., Jr., 2005).
Screening privind portajul tulpinilor de Shigella spp.
la animale de ferm i n abatoare
Pentru a verifca datele din literatura de specialitate n ceea ce privete
portajul tulpinilor de Shigella spp., numai de ctre om, s-a fcut un screening
referitor la eventualitatea prezenei acestor germeni pe probe coprologice
recoltate de la bovine, porcine i psri din exploataii zootehnice din mai
multe judee din ar.
n perioada 2001-2003 s-au prelevat 582 tampoane rectale recoltate cu
predilecie de la animale i psri cu simptomatologie digestiv, manifestat
prin enterite dizenteriforme cu descrcri diareice acute i cronice, precum
i de la animale afate ntr-o stare aparent de sntate, dar care au coabitat
cu cele bolnave (tabelul 1.12).
57
Tabelul 1.12
Probe coprologice recoltate de la animale vii pentru evaluarea contaminrii
cu Shigella spp. (perioada 2001-2003)
Specie
numrul
de exploataii
controlate
numrul
de probe
analizate
medii de izolare folosite
Mac Conkey
cu lactoza
Agar Salmonella
Shigella
Agar xLd
Probe pozitive Probe pozitive Probe pozitive
Bovine 23 184 - - -
Porcine
Psri
16
9
128
270
- - -
Total 48 582 - -
n aceeai perioad de timp s-au studiat 101 probe de ap tehnologic
prelevat din reeaua de evacuare a unor abatoare de psri, porci, ovine i
bovine (tabelul 1.12).
Tabelul 1.13
Probe de ap tehnologic recoltate din reeaua de evacuare a unor abatoare
(perioada 2001-2003)
Locul de recoltare a probelor
numrul
unitilor
verifcate
numrul de
probe analizate
numrul de
probe pozitive
Abatoare de psri 3 36 -
Abatoare mixte (porcine, ovine, bovine) 5 65 -
Total 8 101 -
din apa tehnologic de la abatoare i de la animalele i psrile cu
sindrom digestiv acut i cronic nu s-a putut izola Shigella, confrmnd astfel
datele din literatura de specialitate care susin c animalele i psrile nu
sunt rezervor natural pentru aceast specie microbian.
1.13. rolul alimentelor de origine animal ca verig epidemiologic
n producerea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella spp.
Cu toate acumulrile de date noi rezultate n urma studiilor ntreprinse
pe plan mondial pentru cunoaterea particularitilor biologice i de
patogenitate a tulpinilor de Shigella spp. exist nc numeroase incertitudini,
dar i faete inedite ale acestui domeniu deocamdat nc insufcient
58
investigat.
n acest context, trebuie avut n vedere faptul c infeciile produse
de bacteriile din genul Shigella nu pot f nc controlate efcient, datorit
necunoaterii incidenei reale la bolnavii cu toxiinfecii alimentare, ntruct
prevalenta n produsele alimentare de origine animal i n ap nu este
evaluat corect i complet.
Pe acest teren, cu numeroase elemente incerte sau nc necunoscute,
n cadrul studiilor ntreprinse s-a urmrit investigarea, aprofundarea,
clarifcarea i completarea acestor date cu noi observaii de cert valoare
tiinifc i practic.
de aceea s-a cutat s se evidenieze i s se aprofundeze i alte
elemente revelatorii pentru clarifcarea rolului alimentelor de origine animal
ca verigi epidemiologice majore n declanarea toxiinfeciilor alimentare la
om.
Rezultatele obinute ofer posibilitatea formulrii unor concluzii
fundamentate pe baza analizei comparative a acestor date cu cele din
literatura internaional:
Pn n prezent n literatura de specialitate nu s-au comunicat nc
rezultate certe, bazate pe date aprofundate privind prevalena i incidena
acestor germeni, pe grupe de alimente i nu exist statistici ofciale rezultate
dintr-un amplu screening (derulat succesiv de la recol tare, prelucrare,
transport, stocare, desfacere i pn la consumul alimen telor), din care s
rezulte c produsele alimentare de origine animal constituie rezervorul de
Shigella cu risc epidemiologic recunoscut pentru consumatori;
Sub raportul problemelor de sntate public veterinar nu se
cunosc nc ndeajuns sursele reale de contaminare cu Shigella i factorii
care infueneaz i determin apariia i gravitatea evoluiei unor focare
de toxiinfecii alimentare, care nu sunt ntotdeauna diagnosticate rapid i
corect din punct de vedere etiologic;
Cu toate c germenii din genul Shigella spp. fac parte din punct
de vedere epidemiologic din grupa de risc n care este ncadrat toxiinfecia
alimentar produs de Salmonella, nu este nc legiferat i impus
obligativitatea investigrii curente, n ceea ce privete prezena de Shigella,
a tuturor alimentelor de origine animal de ctre laboratoarele veterinare
pentru controlul alimentelor de origine animal;
datele din prezenta lucrare dau numai o orientare general asupra
posibilelor surse de alimente de origine animal care constituie rezervor
de contaminare a consumatorilor cu Shigella, fr a f luat n considerare
uriaul potenial de contaminare pe care l reprezint zarzavaturile i alte
legume comestibile obinute de pe culturi irigate cu ap provenit din surse
59
poluate din ce n ce mai des cu dejecii umane;
din 53.304 probe de alimente de origine animal, examinate n
perioada 2000-2004 n laboratorul de Bacteriologie al Institutului de Igien
i Sntate Public Veterinar, s-au selectat i urmrit n direcia identifcrii
shigelelor 1.202 probe de alimente (2,25%). dintre acestea s-au selectat
i reinut pentru studiu i identifcare 58 tulpini din care, pe baza testelor
biochimice i serologice, s-au ncadrat n genul Shigella spp. 9 tulpini,
confrmate ulterior de INCdmI Cantacuzino;
Alimentele din care s-au izolat, identifcat i confrmat tulpinile
de Shigella spp. au fost reprezentate de lapte i derivate proaspete din lapte,
produse de patiserie i cofetrie, salat de icre simpl i cu adaos de legume,
crevei ntregi i decorticai i carne de scoici.
Se constat varietatea suporturilor alimentare din care s-au izolat
aceti germeni din vieuitoarele marine, care se consum tot mai mult i n
ara noastr i care fac parte din grupele de risc epidemiologic ca urmare a
contaminrii lor prin intermediul purttorilor, n condiiile lipsei de igien
la recoltarea, depozitarea i prelucrarea lor;
laptele crud i derivatele proaspete din care s-a izolat Shigella,
proveneau de la productori particulari care nu fac pasteurizarea laptelui
materie prim i care recolteaz, prelucreaz i transport aceste produse n
condiii precare de igien;
Tulpinile de Shigella spp. izolate din produsele de patiserie ar putea s
provin de la purttorii care au contaminat aceste produse n timpul lucrului,
prin nerespectarea condiiilor tehnologice i individuale de igien;
Salata de icre simpl i cu adaosuri de legume, este posibil s f
fost contaminat cu Shigella de ctre purttori, n condiiile nerespectrii
normelor de igien individual i tehnologic pe fuxul de procesare a
materiilor prime, de la recepie pn la ambalarea produsului fnit;
fructele de mare provenite din import, din care s-a izolat Shigella,
este posibil s f fost contaminate prin infltrarea sau chiar prin dever sarea
n bazinele de cretere intensiv a acestor vieuitoare a apelor menajere
poluate cu dejecii umane;
din cele 600 probe de ap recoltate din fntni, lacuri de agrement,
tranduri i din braele de vrsare ale dunrii (Sulina, Sf. Gheorghe, Chilia)
s-au izolat tulpini prezumtive de Shigella, din care au fost confrmate 5
tulpini;
Apa din unele fntni rurale este posibil s f fost contaminat prin
infltrarea deeurilor fecaloide umane, ca urmare a amplasrii latrinelor n
apropierea fntnilor, iar apa din tranduri este posibil s f fost contaminat
cel mai probabil direct de la purttorii cronici de Shigella n condiiile unei
60
clorinri inefciente a apei din bazinele de not;
Apa din lacurile de agrement din Bucureti i din braele Chilia,
Sulina i Sf. Gheorghe este posibil s f fost poluat cu Shigella prin
deversarea haznalelor de la colectivitile umane din perimetrele nveci-
nate;
Pentru verifcarea concordanei cu datele din literatura de specia-
litate, tulpinile confrmate de INCdmI Cantacuzino au fost analizate
pentru evidenierea elementelor de patogenitate prin testul ansei ligaturate
pe iepure.
ntruct criteriile de interpretare a testului clasic sunt susceptibile de
erori, care pot duce la obinerea unor rezultate neconcordante sau chiar
derutante, s-a propus modifcarea acestora, lundu-se n calcul numai
parametri obiectivi, rezultatul testului find reprezentat de raportul dintre
greutatea lichidului acumulat n lumenul ansei ligaturate i greutatea ansei
dup golirea complet (Enache T., Enache T. Jr., 2005).
n urma studiilor efectuate pe o perioad de 4 ani, pe un numr mare de
probe de alimente de origine animal i pe probe de ap prelevate din diferite
medii naturale (lacuri, fntni, bazine de not, etc.), se poate concluziona
c, din punct de vedere al problemelor de sntate public veterinar, n
Romnia trebuie fcute ample investigaii pentru a se cunoate prevalena
i incidena alimentelor cu potenial real de risc i factorii care infueneaz
i determin declanarea toxiinfeciilor alimentare cu Shigella.
Pe baza acestor rezultate este necesar ca n toate laboratoarele
veterinare pentru controlul alimentelor de origine animal s fe legiferat
obligativitatea diagnosticului curent pentru Shigella, ntruct aceti germeni
fac parte din punct de vedere epidemiologic din aceeai grup de risc din
care face parte toxiinfecia alimentar produs de Salmonella (Enache I,
Enache T. Jr., 2005).
61
62
Shigella sp. frotiu din fecale.
Shi. fexneri. microscopie electronic
63
S. boydii pe agar enteric Hektoen
Shigella sonnei. Agar mac Conkey
64
Shigella sonnei. Congo Red Agar.

Shi.
fexneri.
Agar luria.
65
Bibliografe selectiv
Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr 1.
Infect dis 15:246-252
Ashkenazi S (2004) Shigella infections in children: new insights. Semin Pediatr 2.
Infect dis 15:246-252
Baird-Parker AC (1994) foods and microbiological risks. microbiology 140:687- 3.
695
Baird-Parker AC (1994) foods and microbiological risks. microbiology 140:687- 4.
695
Baylis, C. l., Penn, C. W., Thielman, N. m., Guerrant, R. l., Jenkins, C. and 5.
Gillespie, S. h., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice
of Clinical Bacteriology. Second Edition. S. h. Gillespie and P. m. hawkey Eds.,
John Wiley & Sons ltd, london: p 347-365.
Brian mJ, Van R, Townsend I, murray BE, Cleary TG, Pickering lK (1993) 6.
Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant
Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-feld gel electrophoresis and
plasmid dNA analysis. J Clin microbiol 31:2152-2156
Brian mJ, Van R, Townsend I, murray BE, Cleary TG, Pickering lK (1993) 7.
Evaluation of the molecular epidemiology of an outbreak of multiply resistant
Shigella sonnei in a day-care center by using pulsed-feld gel electrophoresis and
plasmid dNA analysis. J Clin microbiol 31:2152-2156
Caprioli A, morabito S, Brugre h, oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic 8.
Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res.
2005. 36(3):289-311.
Center for disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary. 9.
department of health and human services. National Center for Infectious diseases.
division of Bacterial and mycotic diseases. foodborne and diarrheal diseases
Branch. Atlanta, GA
Center for disease Control and Prevention (2002) Shigella. Annual Summary. 10.
department of health and human services. National Center for Infectious diseases.
division of Bacterial and mycotic diseases. foodborne and diarrheal diseases
Branch. Atlanta, GA
Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan mm., 2006, Subtractive hybridization and optical 11.
mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli h10407 chromosome: isolation of
unique sequences and demonstration of signifcant similarity to the chromosome of
Escherichia coli K-12. microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54.
Cheryl l. Tarr, Adam m. Nelson, lothar Beutin, Katharina E. P. olsen, and Thomas 12.
S. Whittam. 2008, molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene
66
Content in unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup o174 (ox3)
J. Bacteriol. 2008 190: 1344-1349.
de Sablet T, Bertin Y, Vareille m, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, martin C., 13.
2008., differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia
coli belonging to seropathotypes A and C., microbiology. 154:176-86.
delappe N, ohalloran f, fanning S, Corbett-feeney G, Cheasty T, Cormican m 14.
(2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates
from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin microbiol
41:1919-1924
delappe N, ohalloran f, fanning S, Corbett-feeney G, Cheasty T, Cormican m 15.
(2003) Antimicrobial resistance and genetic diversity of Shigella sonnei isolates
from western Ireland, an area of low incidence of infection. J Clin microbiol
41:1919-1924
devasia RA, Jones Tf, Ward J, Stafford l, hardin h, Bopp C, Beatty m, mintz 16.
E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxin-
producing Escherichia coli serotype o169:h41. Am J med. 2006 feb;119(2):168.
e7-10.
donnenberg, m. S., 2002, 17. Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile
pathogen, london, Academic Press.
duffy, G., Garvey, P. and mcdowell, d. A., 2001, Verocytotoxigenic 18. Escherichia
coli, Trumbull, Connecticut, food & Nutrition Press Inc.
duPont hl, levine mm, hornick RB, formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis 19.
and implications for expected mode of transmission. J Infect dis 159:1126-1128
duPont hl, levine mm, hornick RB, formal SB (1989) Inoculum size in shigellosis 20.
and implications for expected mode of transmission. J Infect dis 159:1126-1128
EfSA, 2007, monitoring of verotoxigenic 21. Escherichia coli (VTEC) andidentifcation
of human pathogenic VTEC types, Scientifc opinion of the Panel on BIoloGICAl
hAzARdS (Question No EfSA-Q-2007-036) The EfSA Journal.
hyams KC, Bourgeois Al, merrell BR, et al. (1991) diarrheal disease during 22.
operation desert Shield. N Engl J med 325:1423-1428
hyams KC, Bourgeois Al, merrell BR, et al. (1991) diarrheal disease during 23.
operation desert Shield. N Engl J med 325:1423-1428
Kaper, J. B. and oBrien, A. d., 1998, 24. Escherichia coli o157:h7 and other Shiga
toxin-producing Escherichia coli strains, Washington d.C, ASm Press.
Karmali, m. A., 2003, The medical signifcance of Shiga toxin-producing 25. Escherichia
coli infections. An overview. methods mol. med. 73: 1-7
le Gall T, darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, denamur E., 2005, Selection- 26.
driven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome
Res. feb;15(2):260-8.
lee Tm, Chang CY, Chang ll, Chen Wm, Wang TK, Chang Sf (2003) one 27.
67
predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four
sequential outbreaks in school children. diagn microbiol Infect dis 45:173-181
lee Tm, Chang CY, Chang ll, Chen Wm, Wang TK, Chang Sf (2003) one 28.
predominant type of genetically closely related Shigella sonnei prevalent in four
sequential outbreaks in school children. diagn microbiol Infect dis 45:173-181
lee Tm, Chang ll, Chang CY, Wang JC, Pan Tm, Wang TK, Chang Sf (2000) 29.
molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks
in school children. J med microbiol 49:355-360
lee Tm, Chang ll, Chang CY, Wang JC, Pan Tm, Wang TK, Chang Sf (2000) 30.
molecular analysis of Shigella sonnei isolated from three welldocumented outbreaks
in school children. J med microbiol 49:355-360
litwin Cm, leonard RB, Carroll KC, drummond WK, Pavia AT (1997) 31.
Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid dNA
analysis and pulsed-feld gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J
Infect dis 175:864-870
litwin Cm, leonard RB, Carroll KC, drummond WK, Pavia AT (1997) 32.
Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid dNA
analysis and pulsed-feld gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J
Infect dis 175:864-870
liu PYf, lau YJ, hu BS, Shyr Jm, Shi zY, Tsai WS, lin Yh, Tseng CY (1995) 33.
Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different
molecular typing methods. J Clin microbiol 33:1779-1783
liu PYf, lau YJ, hu BS, Shyr Jm, Shi zY, Tsai WS, lin Yh, Tseng CY (1995) 34.
Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different
molecular typing methods. J Clin microbiol 33:1779-1783
morabito S, Karch h, mariani-Kurkdjian P, Schmidt h, minelli f, Bingen E, Caprioli 35.
A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli o111:h2
associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin microbiol. 1998.
36(3):840-2.
Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, diarrheagenic 36. Escherichia coli. Clin. microbiol.
Rev. 1998. 11(1): 142-201.
Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of systematic 37.
bacteriology. G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New
York, NY, Springer,: 607-624.17
Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of 38.
systematic bacteriology, G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley
Eds. New York, NY, Springer,: 607-624.
Scheutz, f., Beutin, l., Pierard, d. and Smith, h. R., 2001, Nomenclature of Vero 39.
cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. duffy, P. Garvey and d. A.
mcdowell Eds. Trumbull, Connecticut, food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16
68
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460 40.
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 41.
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n 42.
micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-
5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor medicale, 43.
Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor 44.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor 45.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973- 46.
736-090-8
Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, 47.
ISBN: 978-973-736-089-2
Sussman, m., 1997, 48. Escherichia coli, mechanisms of virulence, Cambridge,
Cambridge university Press.
Traian Enache, tefan Nicolae, tefan Enache jr., felicia hlciuc, 2005, 49.
Toxiinfecii alimentare, prin alimente de origine animal contaminate cu Shigella
spp., Editura Coral Sanivet.
Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko d, Buckles El, 50.
liou SR, Boutin A, hackett J, Stroud d, mayhew Gf, Rose dJ, zhou S, Schwartz
dC, Perna NT, mobley hl, donnenberg mS, Blattner fR, 2002, Extensive mosaic
structure revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia
coli. Proc Natl Acad Sci u S A. dec 24;99(26):17020-4.
Wick lm, Qi W, lacher dW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic content in 51.
the stepwise emergence of Escherichia coli o157:h7, J Bacteriol. mar; 187(5):1783-
91.
Wickham, m. E., lupp, C., mascarenhas, m., Vazquez, A., Coombes, B. K., Brown, 52.
N. f., Coburn, B. A., deng, W., Puente, J. l., Karmali, m. A. and finlay, B. B, 2006,
Bacterial genetic determinants of non-o157 STEC outbreaks and hemolytic-uremic
syndrome after infection. J. Infect. dis. 194(6): 819-827
Yang J, Nie h, Chen l, zhang x, Yang f, xu x, zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007, Revisiting 53.
the molecular evolutionary history of Shigella spp. J mol Evol. Jan;64(1):71-9.
69
CAPITOLUL 2
ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL
ESChErIChIA n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr
ALIMENTARE
2.1. Caractere generale
Enterobacteriaceele sunt prezente n intestinul animalelor i al omului,
iar fecalele conin peste 10
10
per gram enterobacterii, de unde ajung n
mediul ambiant (sol, ap, plante, animale). Sunt cunoscute ca find agenii
etiologici ai sindromului diareic infecios.
Grupul coliformilor se limiteaz la bacterii care cresc n tractul
gastrointestinal al omului i al animalelor i include 5 genuri: Escherichia,
Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Raoultella - adugat de curnd,
formnd o parte din genul Klebsiella. Aceste bacterii prezint o mare
importan pentru microbiologia alimentar deoarece reprezint unul din
cei mai utilizai indicatori microbiologici sanitari care refect condiiile
de igien la prelucrarea i manipularea produselor, iar n multe situaii
refect modul de respectare al diferitelor tratamente termice (de exemplu,
pasteurizare) aplicate diverselor produse. Separarea bacteriilor coliforme
n cele de origine fecal i nefecal se face prin folosirea temperaturilor
ridicate.
Prin defniie grupul coliformilor fecali conine bacili sau cocobacili
Gram negativi, nesporogeni, aerobi i facultativ anaerobi, mobili prin
fageli peritrichi sau imobili care fermenteaz lactoza cu producere de gaz
i produc colonii nchise la culoare ce au suprafaa cu luciu metalic i refex
auriu-verzui n decurs de 48 de ore la 45,5C.
din genul Enterobacter, speciile mai importante pentru microbiologia
alimentar sunt: E. (Pantoea) agglomerans, care a fost transferat n genul
Pantoea i E. sakazakii.
Citrobacter produce colonii tipice pigmentate n galben, fermenteaz
lent lactoza i utilizeaz citratul ca unic surs de carbon. Specia prevalent
din alimente este C. freundii, care se gsete de obicei n legume i carnea
70
proaspt.
Klebsiella cuprinde mai multe specii trecute de curnd n genul
Raoultella: K. (Raoultella) terrigena, R. planticola, R. ornitinolytica, ce se
izoleaz din sol, ap, plante, dar i de la nivelul tubului digestiv. Contamineaz
frecvent alimentele, de obicei n asociaie cu alte microorganisme,
determinnd alterarea acestora.
Escherichia coli este larg rspndit n natur i reprezint microfora
dominant a intestinului gros, de unde prin intermediul fecalelor se elimin
n mediul exterior contaminnd solul, apa, furajele, alimentele, etc. Tulpinile
capabile de a provoca mbolnviri la om se situeaz ntr-una din cele 4
categorii de Escherichia coli enteropatogen:
1. Tulpini enteropatogene (EPEC);
2. Tulpini enterotoxigene (ETEC);
3. Tulpini enterohemoragice (EhEC);
4. Tulpini enteroinvazive (EIEC).
2.2. Istoric
Pentru prima dat n 1885 Theobold Escherich a izolat germenul din
fecalele unor copii sugari, cu diaree. Implicaiile lui n patologia veterinar
au fost recunoscute treptat, pe msura acumulrii cunotinelor dobndite n
acest domeniu.
Prezena n fltratele culturilor unor tulpini de Escherichia coli a unei
citotoxine necunoscute pn atunci, activ pe celulele Vero, a fost relatat
de Konowalchuk i colaboratorii n 1977.
un antiser preparat mpotriva unei citotoxine Vero (VT) parial
purifcate, obinut de la tulpina de Escherichia coli productoare de
VT (ECVT) prototip h30 (serotip o26:h11) a neutralizat activitatea
verotoxinelor provenite de la 8 din 10 tulpini pozitive pentru VT, dar nu
i pentru celelalte dou, sugernd existena unei heterogeniti serologice,
observaie care a fost confrmat ulterior.
apte tulpini ECVT au provenit de la pacieni cu gastroenterit,
sugernd faptul c VT a fost un factor de virulen n boala enteric.
n 1983, oBrien i la Veck au purifcat i caracterizat toxina h30
i au demonstrat c este un polipeptid subunitar similar toxinei produse de
Shigella dysenteriae tipul 1. de atunci a fost denumit Shigella-like toxin
(SlT-toxin asemntoare toxinei Shiga).
n 1983, Riley i colaboratorii, de la Centrul de Control al Bolilor
din Atlanta, au coordonat investigaiile epidemiologice n dou episoade de
71
boal, puin neleas, pe care au numit-o colit hemoragic, caracterizat
prin crampe abdominale severe, diaree hemoragic i absena unei febre
semnifcative. Au descoperit o legtur strns ntre boal i consumul de
hamburgeri, ntr-un lan comercial fast-food.
Investigaiile microbiologice au demonstrat asocierea dintre boal
i prezena unei tulpini de Escherichia coli aparinnd serotipului rar
o157:h7, care mai trziu a fost dovedit ca productor de VT.
Tot n 1983, Karmali i colaboratorii, n Toronto, au stabilit legtura
dintre infecia cu ECVT aparinnd ctorva serotipuri, inclusiv o157:h7 i
sindromul uremic hemolitic (Suh), o stare patologic a crei etiologie era
necunoscut i care fusese descris pentru prima dat n 1955.
Suh se manifest printr-o triad de caracteristici: insufcien renal
acut, trombocitopenie i anemie microangiopastic hemolitic, care, n
sindromul clasic apar la cteva zile dup declanarea diareei sangvinolente,
asemntoare unei colite hemoragice.
n ultimul deceniu s-au nregistrat progrese semnifcative n nelegerea
epidemiologiei i patogenezei infeciei cu ECVT, care a fost recunoscut
drept o infecie zoonotic major la om.
holt i colaboratorii (1994) grupeaz cele dou entiti taxonomice
nrudite, Escherichia i Shigella, ntr-un singur gen, numit Escherichia
Shigella.
2.3. Taxonomie
n cadrul genului sunt incluse 5 specii de Escherichia: Escherichia
coli (cu dou biovaruri: Escherichia coli normal i Escherichia coli inactiv),
Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia vulneris,
Escherichia blattae, Escherichia adecarboxylata, Escherichia albertii.
descoperirea unei toxine VT1, la Escherichia coli, care este virtual
identic toxinei Shiga, produs de Shigella dysenteriae, tip 1 nu este
surprinztoare.
Proprietatea produciei VT distinge ECVT de alte serotipuri de
Escherichia coli enterice, patogene, de tipul Escherichia coli enterotoxigen,
Escherichia coli enteroinvaziv, Escherichia coli enteropatogen i Escherichia
coli enteroagregativ.
mai mult de 150 de serotipuri oh ECVT diferite au fost pn acum
asociate cu boala de la om. multe altele au fost izolate exclusiv de la
animale.
Termenul Escherichia coli enterohemoragic (EhEC) a fost aplicat
acelor serotipuri VT EC, care au caracteristici clinice, epidemiologice i
72
patogenetice identice celor asociate tulpinii prototip de Escherichia coli
o157:h7.
Whittam i colaboratorii au investigat originea clonal a tulpinilor
ECVT o 157 prin testarea variaiei alelice la aproape 20 de loci enzimatici
diferii prin electroforeza multilocus enzimatic.
Tulpinile de Escherichia coli o157:h7 provenind de la diverse surse
constituie un grup clonal genetic distinct, care este mai slab nrudit cu ECVT
din alte serotipuri.
Pe de alt parte, n comparaie cu tulpinile EPEC, clona o157:h7 s-a
dovedit a f strns nrudit cu tulpinile clonei o55:h7, care au fost de mult
vreme asociate episoadelor de diaree infantil semnalate n ntreaga lume.
2.4. morfologie
Escherichia coli este o bacterie Gram negativ, de form bacilar
sau cocobacilar cu dimensiuni de 1-1,5/2-6 microni. Este nesporogen, n
general fagelat peritrich.
Exist tulpini capsulogene i necapsulogene. unele tulpini prezint
fmbrii i sunt hemaglutinante.
Au fost identifcate dou tipuri fmbriale: tipul 1, care sunt manoz-
sensibile i tipul 2, manoz-rezistente, caracterizate printr-o mare diversitate
antigenic.
fimbriile manoz rezistente mplinesc funcia unor factori de
patogenitate.
unele tulpini prezint plasmide f, find prevzute cu pil de sex,
detectabile serologic sau cu ajutorul fagilor sexuali.
2.5. Condiii de cultivare i caractere culturale
Escherichia coli este o bacterie aerob sau facultativ anaerob i se
dezvolt optim la 37C (temperatur la care sunt produse i exotoxinele,
enterotoxinele, hemolizinele). Se poate dezvolta i la temperaturi cuprinse
ntre 14-44C sau n anaerobioz.
n bulion, variantele S se dezvolt n 24 de ore i determin
turbiditate uniform, fr sedimentare, iar variantele R tulbur mai mult
sau mai puin mediul, formnd la suprafa inel sau vl i depozit, pe fundul
eprubetei.
Pe mediile solide variantele S formeaz colonii de 2-3 mm, rotunde,
bombate, umede, cu suprafa neted i margini regulate, iar variantele R,
colonii rotunde, plate, de mrime mijlocie, cu suprafa rugoas i margini
73
neregulate.
Exist i tulpini care dau colonii mucoide. Pe agar snge de iepure,
unele tulpini (n special cele izolate de la porcine) determin hemoliz
incomplet, fr legtur cu enteropatogenitatea.
longevitatea germenilor n culturi pe medii uzuale este de 2-3 luni.
Culturile bacteriene degaj un miros caracteristic de amoniac.
2.6. Proprieti biochimice
Escherichia coli produce indol, reacioneaz negativ la testul Voges-
Proskauer i pozitiv la testul cu rou metil, nu produce hidrogen sulfurat, nu
descompune ureea, nu lichefaz gelatina, fermenteaz glucoza i lactoza cu
producie de gaz.
Tabelul 2.1
Principalele caractere exoenzimatice ale speciilor din genul Escherichia
(dup Carp-Crare m., 1997)
Testul
Escherichia
coli
E.
fergusonii
E.
hermannii
E.
vulneris
E.
blattae
Indol + + + - -
lyzin decarboxilaza + + - (+) +
ornitin decarboxilaza d + + - +
mobilitate + + + + -
KCN - - + (-) -
malonat - d - (+) +
Glucoz gaz + + + + +
d-adonitol - - - - -
l-arabinoz + + + + +
d-arabinol - - - - -
Celobioz - + + + -
lactoz + d - (-) -
manitol + + + + -
d-sorbitol + - - - -
Voges-Proskauer - - - - -
h
2
S - - - - -
Catalaz + + + + +
Legend: + = 90-100% din tulpini reacioneaz pozitiv; - = 90-100% din tulpini
reacioneaz negativ; d = reaciile difer de la o tulpin la alta.
74
Importani liganzi la Escherichia coli sunt fmbriile Pap (pilli associated
with pyelonephritis), numite i pili P, pentru c au, ca receptor, antigenul
de grup sanguin P, prezent nu numai pe hematii, ci i pe uroepiteliu i n
mucusul urinar.
Avnd n vedere prevalena categoric a Escherichia coli de biotip
1 n totalul microorganismelor prezente n fecalele omului i animalelor,
organismele internaionale de specialitate au stabilit c ea reprezint
indicatorul sanitar cel mai important i cel mai fdel pentru aprecierea
contaminrii fecale a apei i alimentelor.
din aceleai motive Comitetul American Naional pentru Criteriile
microbiologice la Alimente (NACmfC) a introdus de civa ani Escherichia
coli biotip 1 (Escherichia coli generic) ca indicator igenico-sanitar i test
obligatoriu pentru verifcarea la nivelul abatoarelor a contaminrii fecale a
carcaselor animalelor de mcelrie i ale psrilor.
Acest test a fost introdus i n ara noastr i se regsete n Programul
Naional al Aciunilor Strategice Sanitar-Veterinare.
2.7. Proprieti antigenice
n cadrul speciei Escherichia coli exist o mare heterogenitate
antigenic.
Principalele antigene identifcate sunt urmtoarele:
antigene somatice, notate cu o;
antigene capsulare, notate cu K;
antigene fagelare, notate cu h;
antigene fmbriale, notate cu f;
antigene comune cu alte enterobacteriacee, notate cu m.
n cadrul fecrei categorii exist mai multe fraciuni antigenice, pe
baza crora au fost identifcate peste 173 de antigene o, 101 antigene K
i 56 antigene h.
Antigenele o difereniaz specia n serogrupe i sunt de natur
lipopoliglucidic. Antigenele somatice cresc persistena bacteriilor n
tractusul urinar.
Antigenele poliglucidice capsulare K au proprietatea de a proteja
colibacilii fa de complement i fagocite favoriznd aderarea lor la
enterocite.
Antigenele K se subdivid n trei tipuri A, B i l dintre care numai
cele de tip A (termostabile) sunt antigene capsulare adevrate, n timp ce
antigenele B (relativ termostabile) i l (termolabile) sunt de nveli.
Antigenele fmbriale (adezinele fmbriale), de natur proteic,
75
faciliteaz aderarea colibacililor la enterocitele jejunale i ileale, evitnd
evacuarea lor n intestinul gros prin peristaltism.
Adezinele fmbriale sunt notate cu f
1
, f
2
, f
3
, f
4
, f
18
, f
41
, f
165
. Primele
trei tipuri sunt specifce colibacililor patogeni pentru om. Antigenul f
4
este
sinonim cu K
88
, find prezent la tulpinile enterotoxigene pentru purcei, f
5

(K
99
), identifcat la tulpinile enterotoxigene de la viei, f
6
, sinonim cu 987
P.
Spre deosebire de antigenele somatice, capsulare i fagelare,
determinate de gene cromozomale, antigenele fmbriale sunt de regul
controlate de gene plasmidice.
Tabelul 2.2
Tipuri de antigene fmbriale la Escherichia coli
(dup Orskov)
Tipul de antigen fmbrial denumiri anterioare Asocieri patologice
f
1
Tipul I Antigene fmbriale comune
f
2
CfA I ETEC la om
f
3
CfA II ETEC la om
f
4
K88 ETEC la porc
f
5
K 99 ETEC la bovine
f
6
K 987 ETEC la porc
f
7
C 1212 ITu la om
f
8
C 1254-79 ITu la om
f
9
3669 ITu la om
f
10
C 1960-79 ITu la om
f
11
C 1976-79 ITu la om
f
12
C 1979-79 ITu la om
Pe baza structurii antigenice, colibacilii au fost clasifcai n serogrupe
i serotipuri. Grupele au fost constituite pe baza identitii de structur
antigenic somatic i se noteaz cu numrul antigenului precedat de
iniiala indicatoare o. Exist relaii ntre structura antigenic somatic i
patogenitatea tulpinilor pentru diferite specii de animale.
Pentru serotipizare se folosete reacia de seroaglutinare, iar pentru
identifcarea antigenelor fmbriale i a celor capsulare se poate aplica i
seroprecipitarea n gel.
n practica de laborator, pentru identifcarea serologic a tulpinilor
patogene de Escherichia coli se execut aglutinarea oK.
Tulpinile vii care posed antigene K nu sunt aglutinate de serul
76
omolog anti o. de aceea, se lucreaz cu tulpini tratate termic (pentru
distrugerea antigenelor de nveli K, care ar mpiedica aglutinarea
antigenelor o) atunci cnd se urmrete identifcarea antigenelor K.
2.8. Sensibilitatea fa de factorii de mediu
Escherichia coli rezist la 55C timp de o or i 15-20 minute la
60C. n fecale i gunoi de grajd, meninute ntr-un mediu umed, pot s
supravieuiasc 45 de zile, n sol 45-140 zile, n apa de canal 70-270 zile.
Este sensibil la aciunea dezinfectantelor uzuale (sod caustic 1-2%,
aldehid formic 1%, clorur de var cu 1-2% clor activ, etc.) i a coloranilor
din grupa trifenil metanului) ca verdele briliant i verdele de malachit.
Antibioticele cele mai active sunt tetraciclina, gentamicina, polimixina,
neomicina, amoxicilina, cloramfenicolul, colimicina, iar chimioterapicele:
sulfatiazol, sulfametazin, nitrofuran, furazolidon.
dobndesc cu uurin mutante rezistente la antibiotice datorit
prezenei unor plasmide (factor R), care se pot rspndi repede n populaia
de bacterii.
majoritatea informaiilor privind creterea i rezistena se bazeaz
n mod curent pe studiile asupra serotipului Escherichia coli o157:h7.
Cunoaterea rezistenei n mediu este limitat, dar s-a demonstrat c
o157 poate supravieui perioade ndelungate (> 40 zile) n ap i este
posibil ca mediile contaminate cu materii fecale s fe surse pentru aceste
microorganisme mai mult timp.
n alimente, tulpina o:157 este distins prin pasteurizarea de rutin
a laptelui sau la temperaturile de gtit, n mod similar multor altor bacterii
patogene.
Izolarea tulpinilor o:157 din carnea de vit tocat i congelat, dup
mai multe luni, sugereaz c aceste microorganisme pot persista, n mediu,
n condiii de iarn, perioade foarte lungi.
Capacitatea unor tulpini de a supravieui n condiii de ph sczut (4,5),
ntlnit n episoade asociate cu cidrul i maioneza au ndreptat investigaia
asupra supravieuirii acestor microorganisme n urma diferitelor metode de
preparare a hranei.
Investigaiile ulterioare asupra ecologiei i rezistenei acestui grup
complex de ageni patogeni vor f decisive pentru elaborarea msurilor
efciente de aprare a sntii publice.
n maioneza comercial E. coli 0157:h7 a supravieuit 35 de zile n
produsele depozitate ntre 5
o
C i 7
o
C, dar dup 72 de ore la 25
o
C bacteria
nu a mai fost detectat n acest produs. maioneza are un ph de 3,65, iar
77
inoculul de celule bacteriene a fost de ~10
7
utc/g.
n ceea ce privete tolerana la sare, tulpinile de E. coli 0157:h7
n bulion cu NaCl 4,5% s-a dublat timpul de generaie, n timp ce la
o concentraie de 6,5% NaCl n 36 de ore, timpul de generaie a fost de
31,7ore. Aceti cercettori au observat c dezvoltarea bacteriei este inhibat
la un ph de 8,5% NaCl.
Tulpinile EhEC sunt mult mai sensibile la aciunea temperaturii dect
majoritatea salmonelelor. un studiu recent asupra valorilor d de temperatur
ntre diferite produse de carne este notat mai jos:
- carnea de vit - 0,45-47
- carne de porc - 0,37-0,55
- carne de pui - 0,38-0,55
- carne de curcan - 0,55-0,58
Valorile d se mresc o dat cu creterea coninutului n grasime. un
studiu al valorilor d i z din carnea gras de vac arat urmatoarele:
- 30,5% grsime; d=0,45 minute; z=8,37
o
f
- 2,0%grsime; d=0.30 minute; z=8,30
o
f
ntr-un alt studiu pe carnea tocat cu un coninut mai mic de grsime
ce coninea tulpina 0157:h7 n inoculum de aproximativ 10
3
/g, aceasta a
fost distrus cnd temperatura intern a atins valoarea de 66
o
C, 68
o
C sau
72
o
C. din sucul de mere Escherichia coli 0157:h7 a fost distrus la 66
o
C
n 1,6 minute.
n ceea ce privete rezistena la radiaii a tulpinilor EhEC nu se
difereniaz de celelalte bacterii enterice. din carnea de pui tulpinile de
E. coli 0157:h7 au fost distruse la 5
o
C de radiaii d de 0,27 kGy, iar la
temperatura de -5
o
C de radiaii d de 0,42 kGy.
2.9. Patogenitatea
Escherichia coli este o bacterie condiionat patogen cu numeroase
fenotipuri patogene (patotipuri).
Genele cromozomale, dar mai ales resortarea variailor factori de
patogenitate prin transfer plasmidic i conversie lizogenic determin
constituirea numeroaselor sale patotipuri diareigene i uropatogene.
unele tipuri sunt predominant toxigene n timp ce altele sunt virulente
i invazive.
Pe baza mecanismului de aciune de la nivelul tubului digestiv, tulpinile
de Escherichia coli se mpart n enteroinvazice i enterotoxice.
Enteroinvazivitatea se datoreaz posibilitii bacteriei de a penetra
78
epiteliul intestinal, iar enterotoxicitatea se datoreaz producerii de
enterotoxine.
Enterotoxinele sunt exotoxine elaborate de colibacili in vitro i in vivo.
Au fost identifcate o enterotoxin termolabil i imunogen (lT) i dou
enterotoxine termostabile i imunogene (ST I i ST II).
Acestea sunt elaborate de tulpinile de Escherichia coli care posed
K88 i K99 i alte antigene cu rol n colonizarea colibacililor.
Enterotoxinele
Toxina lT este distrus la 60
o
C n 30 de minute, n timp ce ST poate
suporta 100
o
C, 15 minute.
Toxina lT este o protein cu o greutate molecular de aproximativ
91 kda, posednd o activitate enzimatic similar cu cea a toxinei holerice
(CT= cholera toxin). n timp ce CT este transportat din citoplasm la
exteriorul celulelor producatoare, lT este depozitat n periplasm. mai
mult, antiserurile pentru CT neutralizeaz lT, iar imunizarea cu CT induce
protecia, att mpotriva lui CT ct i a lui lT.
Aceste toxine sunt produse n faza timpurie de producere a tulpinilor,
cu o cantitate maxim de ST dup 7 ore de cretere ntr-un mediu cu extract
de drojdii cu 0,2% glucoz.
n mediu sintetic ST a aprut dup 8 ore, atingnd maximul de cantitate
produs dup 24 de ore, n condiii aerobe.
Cu toate c lT i ST se dezvolt n orice condiii care permit dezvoltarea
celular, eliberarea lui lT din celule ntr-un mediu mbogit a avut loc cel
mai favorabil la un ph de 7,5-8,5.
Toxina lT este compus din 2 protomeri:
- A: cu o greutate molecular de 25,5 kda, care atunci cnd se combin
cu tripsin devine A1 enzimatic activ i formeaz un lan polipeptidic de
21 kda legat printr-o legatur disulfdic cu un lan tip A2.
- B: de 59 kda format din 5 lanuri polipeptidice legate individual
necovalent; lTB constituie subunitatea de legatur, n timp ce lTA
stimuleaz sistemul adenilat ciclazei.
lTA i lTB posed proprietai imunologice similare subunitilor A i
B ale toxinei lui Vibrio cholerae. lTh i lTp desemneaz tulpinile umane
i porcine.
STa este solubil n metanol i provoac un rspuns secretor la oareci
infantili. Este un peptid format din 18-19 aminoacizi ce conine 3 legturi
disulfdice, avnd o legtur molecular de 1972 da. Stimuleaz guanilat
ciclaz intestinal. STb este insolubil n metanol find de origine porcin.
79
Este cea mai rspndit toxin asociat cu izolatele diareigene de origine
porcin i afecteaz intestinul subire i ileonul purceilor.
Genele pentru STb (EstB) au fost clonate i secvenializate. Toxina
STb sensibil la tripsin este sintetizat de 71 de aminoacizi, find clivat
pentru activarea unei molecule de 48 de aminoacizi cu 4 reziduuri de
cistein care strbat membrana intern i ajung n periplasm. Cu toate c
modul de aciune este nc neclar, s-a demonstrat c stimuleaz sinteza de
prostaglandin E
2
.
Receptorul celular n celulele intestinale de oarece este o protein cu
greutatea molecular de 25 kda.
modul de aciune al enterotoxinelor.
Gastroenteritele produse de tulpinile ETEC sunt cauzate de ingestia
de 10
6
-10
10
celule viabile per gram, care colonizeaz intestinul subire i
produc enterotoxine. factorii de colonizare sunt n general fmbriile i
pilii.
Sindromul se caracterizeaz n prima faz prin diaree nesangvinolent
fr exsudate infamatorii n fecale.
diareea este apoas, asemntoare cu cea produs de V. cholerae.
Aceasta apare din activarea adenilat ciclazei intestinale de ctre
enterotoxin.
n ceea ce privete lT, protomerul B mediaz legarea moleculei de celule
intestinale. lT se leag de gangliozide, n special de monosialogangliozide
(gangliozidele monosialice) (Gm
1
). CT se leag i el, de asemenea, de
gangliolizidele Gm
1
. Se tie c i lT mparte determinanii antigenici printre
protomerii corespondeni cu toate c nu produc reacii ncruciate. la legare
lanul polipeptidic A catalizeaz ribozilarea proteinei G care activeaz
adenilat-ciclaza i induce creterea AmPC-ului intracelular.
ST
A
se leag ireversibil la un receptor monogangliozid specifc
cu afnitate nalt i iniiaz un semnal transmembranar pentru activarea
guanilat-ciclazei declannd producerea de guanozin monofosfat ciclic
(GmP
C
). Nivelurile ridicate de GmP
C
din mucoasa intestinal duc la
pierderea de fuide i electrolii. ST difer de CT prin faptul c stimuleaz
numai forma particular de guanilat ciclaz. ST
b
crete cantitile luminale
de 5-hidroxitriptomina i postaglandina E
2
, ambele find mediatori pentru
secreiile intestinale. ST
b
crete cantitile luminale de prostaglandin E
2
i
S-hidroxitriptoamin, ambii find mediatori ai secreiilor intestinale.
STb crete cantitile luminale de S-hidroxitriptamin i prostaglandin
E2, ambele find mediatori pentru secreiile intestinale. ST
b
nu activeaz
guanilat-ciclaza. Genele care controleaz producerea ST
b
sunt nregistrate
80
subclonate i secvenializate.
mecanismele produse de Shigella, Stx
1
, Stx
2
, Stx
2e
i ricin sunt
asemntoare. Ele sunt N-glicozidaze ce cliveaz un reziduu de adenin
specifc din subunitatea 28S a RNA-ului eucariotic, ducnd la inhibarea
sintezei de proteine.
Capacitatea de a produce enterotoxine se evideniaz prin testul ansei
ligaturate, care de regul se face pe iepure, prin administrare intragastric la
oarece sau in vitro, respectiv prin teste serologice.
Endotoxina de natur lipopolizaharidic, prezent i la alte bacterii
Gram negative, favorizeaz diseminarea septicemic i particip la
producerea ocului endotoxic. Se identifc cu antigenele somatice o,
find determinante pentru ncadrarea n serogrupe. Este responsabil de
producerea septicemiilor, mamitelor, infeciilor urinare.
hemolizinele alfa i beta acioneaz asupra integritii membranelor
celulare. Sunt incriminate ca ageni etiologici ai bolii edemelor.
hemolizinele sunt codifcate plasmidic i acioneaz ca citotoxine
calciu dependente.
Sideroforii infueneaz aciunea colibacililor enteroinvazivi, ca
urmare a competiiei dintre celulele somatice i cele bacteriene, pentru
utilizarea ferului biodisponibil.
factorii de patogenitate toxici, cu efect necrozant CNf
1
i CNf
2
sunt
toxine de natur proteic, ce pot facilita rspndirea bilateral a tulpinilor
uropatogene din tractusul urinar spre i din torentul sangvin.
Acetia sunt:
Escherichia coli 1. enterotoxigen (ETEC), find grupa cu cea mai
important pondere n patologia enteritelor infecioase la animale.
Acioneaz prin inhibarea absorbiei apei i electroliilor fr lezionarea
mucoasei intestinale, n condiiile meninerii sau exacerbrii exorbiei,
ceea ce se soldeaz cu defcit n balana hidroelectrolitic (deshidratare,
acidoz).
Aceste tulpini se ataaz i colonizeaz intestiul subire prin intermediul
CfA
s
(colonization factor antigens = factor fenibrial (de colonizare)
Exist 4 tipuri de CfA mature cu I, II, III, IV care au fost clonate i
secvenializate.
CfA-urile sunt codifcate n general de aceeai plasmid care codifc
enterotoxina termostabil nefind produse sub 20
o
C. o data ataate ele
produc una sau dou enterotoxine. o dat ataate ele produc una sau dou
enterotoxine.
ntr-un studiu al tulpinilor ETEC izolate de la 109 pacieni ,cele care
au produs att ST ct i lT erau mai restricionate n serotipurile o:K:h
81
dect cele care produceau doar una dintre aceste toxine.
Spre deosebire de tulpinile EPEC (care cauzeaz diaree la persoanele
foarte tinere), tulpinile ETEC produc diaree atat la copii ct i la aduli.
Acestea reprezint principalele tulpini ce produc diareea cltorului.
Simptomele sunt rareori acompaniate de febr, iar diareea apare subit.
S-a estimat c pentru producerea diareei la aduli sunt necesari
10
8_
10
10
cfu.
Escherichia coli 2. enteropatogen (EPEC, AEEC) cuprinde tulpini
de Escherichia coli, care nu produc enterotoxine i nici verotoxine, dar
posed adezine, cu ajutorul crora ader la enterocitele vilozitare, pe care
pot chiar s le penetreze, producnd enterite.
i exercit patogenitatea prin ataarea la marginea n perie a
enterocitelor vilozitare, urmat de distrugerea acestora i implicit a capacitii
lor de absorbie (attaching and effacing AE), de unde i denumirea grupei
de AEEC).
Exist dou clase de tulpini AEEC:
care posed gene numai pentru AE; a)
care posed gene att pentru AE, ct i pentru producerea de toxine b)
Shiga.
Escherichia coli 3. enterohemoragic (EhEC), include tulpinile
care, la fel ca EPEC, ader la mucoasa intestinal i produc distrugerea
microvililor cu efect infamator, mai ales la nivelul intestinului gros.
Principala lor caracteristic este c elaboreaz verotoxine.
Identifcarea EhEC se face prin ncadrarea n serogrupul o157:h7
(pozitiv sau negativ) i, uneori, o26 sau o111 i determinarea capacitii
citotoxice asupra celulelor VERo, genelor care codifc SlT I i SlT II;
genei eae A, care codifc intimina (proteina responsabil de adeziunea
celular).
Escherichia coli 4. enteroinvaziv (EIEC) determin un sindrom
diareic dezinteriform.
Procesul invaziv are 4 faze:
penetrarea EIEC n celulele m din mucoasa colonului;
captate din aceste celule de ctre macrofage, bacteriile se elibereaz
subepitelial i se ataeaz la suprafaa celulelor intestinale;
bacteriile se multiplic activ intracelular i intercelular i se
rspndesc rapid n submucoas prin intermediul fagocitelor n care
supravieuiesc;
82
moartea celulelor intestinale, ca urmare a blocrii sintezei proteice,
precum i a leziunilor citoplasmatice ireversibile, ceea ce determin i
ulceraiile tipice pe fond infamator.
5. Escherichia coli enteroagregativ (EAggEC)
Aceast grup se inrudete cu EPEC, dar aderena agregativ
manifestat de aceast tulpin este unic.
Tulpinile ader la celulele hep-2 sub forma unor crmizi aezate
una peste alta (Stacked-Brick-Typ) i prezint o plasmid necesar pentru
producia de fenibrii responsabile de aderare i pentru producia unei
proteine specifce a membranei externe(omP).
Anticorpii specifci omP previn aderena la celulele hep-2.
o prob de dNA de EAggEC a fost construit prin folosirea unui
fragment de Kilobaza(kb) 1,0 din plasmida mda-60 a tulpinilor 03:h
2
, i a
fost gasit specifc pentru aceste tulpini n proporie de 99%.
unele tulpini EAggEC produc o enterotoxin termostabil care a fost
denumit EAST1. Gena plasmidic pentru EAST1 este ast A care codifc o
molecul de 38 de aminoacizi n contrast cu ast A care codifc enterotoxina
Sta de 72 de aminoacizi.
Aceste tulpini produc o enterotoxin /citotoxin de 108kda localizat
pe o plasmid de virulen. manifestarea chimic specifc tulpinilor
EAggEC este diareea persistent care poate dura mai mult de 14 zile, n
special la copii. Aceste tulpini nu reprezint ns cauza principal a diareei
cltorului.Nu este ns foarte clar dac aceste tulpini reprezint patogeni
alimentari.
Tabelul 2.3.
Cteva serotipuri O ale celor 5 tipuri de virulen
EAggEC EHEC EIEC EPEC ETEC
3 2 28 ac 18 ab 6
4 5 29 19 ac 8
6 6 112 a 55 15
7 4 124 86 20
17 22 135 111 25
44 26 136 114 27
51 38 143 119 63
68 45 144 125 78
73 46 147 126 80
75 82 152 127 85
77 84 164 128 ab 101
78 88 167 142 115
83
EAggEC EHEC EIEC EPEC ETEC
85 91 158 128 ac
111 103 139
127 113 141
142 104 147
162 111 148
116 149
118 153
145 159
153 167
156
157
163
Tabelul 2.4
Cazuri de gastroenterite alimentare provocate de Escherichia coli patogen
Anul ara Sursa alimentar
nr. de victime/
nr. de risc
Toxina/
Tipul tul-
pinii
Serotip
1947 Anglia salam 47/300 EIEC o124
1961 Romnia substitut de cafea 10/50 EPEC o86:B7:h34
1963 Japonia
ohagi - mncare
tradiional din orez
17/31 EIEC o124
1966 Japonia legume 244/435 EIEC o124
1967 Japonia sushi 835/1736 ? o11
1971 SuA brnzeturi importate 387/? EIEC o124:B17
1980 SuA carne de vit 500/3000 ETEC o6:h16
1981 SuA carne de vit 282/3000 ETEC (lT) o25:h+
1982 SuA carne de vit 26/? EhEC o157:h7
Verocitotoxinele (toxinele Shiga-like)
Verotoxinele cuprind o familie de proteine subunitare, nrudite, al
crei prototip VT1 este virtual identic toxinei Shiga.
A doua toxin major VT2 are un numr de variante strns nrudite,
incluznd VT2c i VT2e.
Verotoxinele sunt printre cele mai puternice substane biologice
cunoscute, toxice pentru celule n concentraii de pico la nanomolar.
utilizarea diferitelor denumiri pentru toxinele majore i subtipurile
84
acestora a condus la propunerea raionalizrii denumirii, astfel nct termenul
VT este interschimbabil cu SlT (Shiga-like toxin) i desemnarea subtipului
este identic. Astfel, SlTIIc este interschimbabil cu VT2c.
Receptorul funcional pentru toxina Shiga, VT1, VT2 i VT2c este
glico-lipidul de membran celular de mamifer, globotriosilceramida
(Gb3).
Aceste toxine sunt prin excelen inhibitori ai translaiei, activi la
concentraii de pico sau nanomolar.
Tipurile majore de toxine ale familiei VT au fost clonate i secveniate
la nivel transcripional.
o boal a ogarilor de curse denumit boala de Alabama sau
vasculopatia cutanat i glomerulorenal idiopatic, se aseamn izbitor
cu Suh de la om. Recent a fost demonstrat ca find asociat infeciei cu
ECVT.
fundamental, n leziunile microangiopatice observate la nivelul
glomerulilor renali ai pacienilor cu Suh este edemul caracteristic al
celulelor endoteliale din capilare, nsoit de depunerea de fbrin i ocluzia
lumenului vaselor.
Citokinele de tipul interleukinei-1 i factorul de necroz tumoral s-au
dovedit a mri potenialul citotoxic al VT pentru celulele endoteliale ale
venei ombilicale umane, n cultur, fapt corelat cu o expresie mrit de
receptor Gb3.
Rolul cert al VT include coagularea intravascular local,
trombocitopenia i anemia microangiopatic hemolitic.
Rolul VT n producerea diareei nu este clar. Nu exist receptori
pentru toxin la nivelul mucoasei epiteliale intestinale; totui, pe seciunile
intestinale umane de la pacienii cu Suh au fost observate: microangiopatie,
edem i hemoragie, care pot afecta proprietile de absorbie ale intestinului
rezultnd diareea.
Examenul histopatologic al biopsiilor intestinale, prelevate de
la pacieni sau al esuturilor de la animalele cu infecie natural ori
experimental cu EPEC, a demonstrat un model caracteristic al atarii
bacteriene la enterocite, care const n distrucia microvililor, nivelarea
membranei citoplasmatice i aderena intim a bacteriei la epiteliu, care
emite prelungiri ce nvelesc parial bacteria.
Acest aspect este denumit leziune de ataare-nivelare (attaching and
effacing AE).
dovezi recente indic faptul c mecanismele leziunii AE implic
interaciunea unor factori mediai plasmidic i cromozomal, care sunt supui
unui complex de reglare genetic i ambiental.
85
Aderena iniial a EPEC, anterior leziunii AE, const n ataarea
fmbrial la enterocite, care este mediat plasmidic prin formarea pililor
de legare (bundle-for-ming-pillus BfP). Totui ECVT nu exprim BfP i
eventuala faz de ataare fmbrial nu a fost stabilit cu certitudine.
Toi factorii de virulen necesari pentru formarea leziunii AE, att la
ECEP, ct i n cazul ECVT sunt codifcai de un locus mai mare cromozomal
de 35480 pb (insula de patogenitate), denumit lEE (locus for enterocyte
effacement locus de nivelare a enterocitului lNE).
una dintre genele structurale ale lEE, care este absolut important n
formarea leziunii AE este gena eae, care codifc proteina de ataare din
membrana extern, intimina de 94 Kda, responsabil de ataarea intim a
bacteriei la enterocit.
Alte dou gene, esp A i esp B codifc proteine (esp A i respectiv
esp B), care activeaz semnalul cilor de transducie, care la rndul lor
induc modifcrile de citoschelet n enterocit i fosforilarea proteinei hp 90,
aparinnd celulei gazd, protein ce se leag de intimin.
Studiile asupra ECVT au demonstrat c tulpinile aparinnd mai
multor serotipuri manifest leziuni AE in vitro i n modelele experimentale
animale, iar dovezile de pn acum indic faptul c mecanismele leziunilor
AE induse de ECVT i ECEP sunt similare.
Tabelul 2.5
Unele caractere ale Escherichia coli patogen productoare de toxiinfecii
alimentare
Grupa de
E. coli
rezervorul
cunoscut sau
presupus
Surse de
contaminare a
alimentelor
Alimente implicate n
toxiinfeciile alimentare
EPEC omul
prelucrtorii i
manipulatorii de
alimente;
apele de canal
carnea de porc;
apa;
nlocuitorii de cafea
EIEC omul -
brnza Brie;
brnza Camembert;
salata;
apa;
conserve de Salmonidae
ETEC omul -
brnza Brie;
carnea de curc;
maionez;
preparate de restaurant, cofetrie
86
Grupa de
E. coli
rezervorul
cunoscut sau
presupus
Surse de
contaminare a
alimentelor
Alimente implicate n
toxiinfeciile alimentare
EHEC
vacile de lapte i
alte animale
fecale de bovine
i de alte animale;
utilaje;
lptrii
carnea tocat de vit;
laptele nepasteurizat;
salata
Pentru demonstrarea enteropatogenitii tulpinilor de Escherichia coli
se folosesc mai multe metode, dintre care menionm:
testul ansei ligaturate;
inocularea la oareci sugari;
inocularea culturilor celulare;
hemaglutinarea, efectul hemaglutinant find determinat de prezena
pililor i corelndu-se cu existena antigenelor fmbriale.
Pentru alte proprieti patogene, cu valoare relativ, se folosesc i alte
criterii, cum sunt:
activitatea hemolitic fa de hematiile de cal, tulpinile patogene
find, de regul, hemolitice;
colicinogenia i colicinosensibilitatea, tulpinile izolate din procese
patologice find mai des colicinogene dect cele provenite din mediile
naturale.
2.10. Epidemiologie
Infeciile cu Vero/shiga toxin Escherichia coli (VTEC/STEC) din
2006 au nregistrat la nivelul a 27 de state membre ale uE i EEA/EfTA un
numr de 3.463 raportri cu 3.458 de confrmri, furniznd astfel o rat a
notifcrilor la nivelul uE de 0,74 la 100.000 locuitori.
Tabelul 2.6.
numrul i rata notifcrilor de cazuri VTEC/STEC raportate n UE i EEA/EfTA
n 2006
ara
Tipul de
raportare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de 100.000
de oameni
Austria C 41 41 0,50
Belgia C 47 47 0,45
Bulgaria u 0 0 0,0
Cipru u 0 0 0,0
87
ara
Tipul de
raportare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de 100.000
de oameni
Republica Ceh C 4 4 0,1
danemarca C 146 146 2,7
Estonia C 8 8 0,59
finlanda C 14 14 0,27
frana C 67 67 0,11
Germania C 1236 1236 1,5
Grecia C 1 1 0,1
ungaria C 3 3 0,1
Irlanda C 158 153 3,6
Italia C 17 17 0,1
latvia C 0 0 0,0
lituania u 0 0 0,0
luxembourg C 2 2 0,43
malta C 5 5 1,2
olanda C 42 42 0,26
Polonia C 4 4 0,1
Portugalia u - - -
Romnia u - - -
Slovacia C 8 8 0,15
Slovenia C 30 30 1,5
Spania C 13 13 0,1
Suedia C 265 265 2,9
marea Britanie C 1301 1301 2,2
Total uE 3412 3407 0,74
Islanda C 1 1 0,33
liechtenstein u - - -
Norvegia C 50 50 1,1
Total 3463 3458 0,74
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate pe
cazuri; - = fr raportare; u = nespecifcat
88
dup muli ani de evoluie ascendent a ratei notifcrilor de VTEC/
STEC la nivelul uE (aceasta este consecina unui complex de factori i nu
este obligatoriu o cretere real), rata notifcrilor a nceput s nregistreze
o scdere ncepnd cu 2004, aceasta probabil ca o consecin a creterii
tendinei de raportare corect numai a infeciilor confrmate de VTEC/
STEC, care difer substanial de toate infeciile cu Escherichia coli
patogene. o scdere a cazurilor raportate a fost observat n special n
Slovacia, Germania (cu toate c aceasta contribuie cu aproape o treime
din totalul cazurilor raportate) i Bulgaria, dar o cretere a fost notat n
Norvegia, Suedia, Irlanda i Regatul unit. Cea mai mare rat a notifcrilor
a fost observat n Irlanda (3,6 al 100.000) i Suedia (2,9 la 100.000). Toate
celelalte state membre ale uE i EEA/EfTA care au raportat date au avut rate
ale notifcrilor sub 3,0 la 100.000 (Portugalia, Romnia i liechtenstein nu
au raportat). majoritatea cazurilor au fost contactate domestic cu o medie
uE a cazurilor importate de 9%.
distribuia pe grupe de vrst i sex.
Rata notifcrilor a fost semnifcativ mai mare la grupa de vrst a
copiilor de 0-4 ani, cu o rat la nivelul uE de 7,5 la 100.000, urmat de
grupa copiilor de 5-14 ani cu o rat de 1,6 la 100.000. Nu au fost identifcate
diferene notabile ntre ratele celor dou sexe, att la brbai, ct i la femei
aceasta find de 1,0 la 100.000.
Sezonalitatea.
A fost observat o evident distribuie sezonier a cazurilor de TEC/
STEC. Acestea cresc progresiv de la nceputul anului atingnd un maxim
n lunile de var dup care descresc n timpul toamnei. o excepie a fost
semnalat n Norvegia unde numrul cel mai mare de cazuri a fost raportat
n februarie i martie datorit unui focar de boal asociat cu consumul unor
mezeluri contaminate.
Proporia serogrupurilor non-o:157 raportate n 2006 a crescut
substanial fa de anii precedeni i nregistreaz aproape jumtate din
serogrupurile cunoscute (serogrupuri raportate la 72% din cazuistica
analizat). n Regatul unit 78% din cazuri sunt asociate serogrupului o:157
(1275 cazuri). ase state au raportat cazuri confrmate de sindrom uremic
hemoragic: frana ungaria, Irlanda, olanda, Norvegia i Regatul unit, cu
un total de 126 cazuri. majoritatea cazurilor de sindrom uremic hemoragic
au fost la copii de 0-14 ani i au fost cel mai frecvent asociate cu serogrupul
o:154. un tipar sezonier al incidenei cazurilor de VTEC o:157 este evident,
dar acest lucru nu a fost observat i n cazul serogrupurilor non-o:157.
89
Figura 2.1
distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EfTA n 2006
(3323 cazuri) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
Ian Feb Mar Apr Mai Iun Iul Aug Sep Oct Nov Dec
Copiii mici sunt semnifcativ suprareprezentai n cadrul cazuisticii
VTEC/STEC i al cazurilor de sindrom uremic hemoragic (huS). o
explicaie a acestei situaii ar putea f aceea c ei sunt mult mai sensibili la
toxinele produse de aceste bacterii, dar aceasta poate s refecte o expunere
mai mare la VTEC/STEC. o alt motivaie este aceea c este mult mai
probabil ca la copii s se solicite investigaiile de laborator. ntr-un studiu
asupra factorilor de risc pentru bolile asociate infeciilor cu VTEC/STEC, n
Germania, factorul de risc a avut cea mai mare valoare pentru copiii sub trei
ani care s-au mbolnvit. n aceast investigaie laptele crud a fost singurul
aliment identifcat ca un factor de risc pentru acest grup de vrst. la copiii
cu vrsta de 10 ani sau mai mari doar produsele alimentare (ex: carnea
de miel i crnaii cruzi) au fost semnifcativ asociate cu mbolnvirile.
Alimentele sunt o surs bine cunoscut de infecie cu VTEC/STEC, n
special alimentele provenite de la rumegtoare cum sunt laptele, brnza i
carnea. n 2006, Norvegia a raportat un focar cu 17 cazuri de mbolnvire cu
Escherichia coli o:103 produs prin consumul de crnai afumai, din acetia
10 au dezvoltat sindrom uremic hemoragic. Cinsprezece cazuri au avut
vrsta cuprins ntre doi i opt ani. de asemenea, Regatul unit a raportat
cteva focare de infecii cu Escherichia coli o:157 sorbitol-fermentative.
dar sursa infeciei nu a fost identifcat. Cu toate c serogrupul o:157
nc este cel mai frecvent serogrup izolat n cazurile de sindrom uremic
hemoragic, i alte serogrupuri pot provoca boli severe aa cum s-a artat
mai sus n exemplul din Norvegia.
90
Figura 2.2.
distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/
EfTA n 2006
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
/
1
0
0
.
0
0
0
2.11. detectarea EPEC, ETEC i EIEC
n alimente i materiale patologice
Pentru distrugerea microforei de asociaie se impune folosirea
mediilor de mbogire i de izolare selective.
Ca medii de mbogire se folosesc bulionul cu bil, lactoz i verde
briliant (BBlV) sau bulionul cu lauril sulfat, iar ca medii selective, agarul
mac Conkey (VRBl = cristal violet, rou neutru, bil, lactoz) i agarul
EmB sau GEAm (eozin-albastru de metilen lactoz).
mediile de mbogire turnate n eprubete cu tub de fermentaie, se
inoculeaz cu materialul de cercetat i diluiile acestuia, se incubeaz, iar
cultura obinut (cu gaze sau fr gaze) se striaz pe suprafaa agarului mac
Conkey sau EmB.
dup incubare, 10 colonii lactoz pozitive i 10 colonii lactoz
negative se cerceteaz biochimic i asupra patogenitii.
n acest mod se prind tulpinile de Escherichia coli din toate cele trei
grupe (inclusiv tulpinile ETEC, care sunt lactoz negative).
dac se bnuiete c materialele de cercetat conin un numr foarte
mare de Escherichia coli, se poate renuna la faza de prembogire i se
striaz ca atare sau diluate, pe suprafaa mediilor selective.
n legtur cu izolarea Escherichia coli din grupele menionate
trebuiesc fcute cteva precizri:
folosirea temperaturii de incubare de 44-45C poate f nefavorabil
91
unor tulpini patogene, acestea nedezvoltndu-se i neproducnd indol;
mbogirea tulpinilor patogene n bulion lauril-sulfat la 44,5C
determin pierderea plasmidelor care codifc factorii de virulen i scad
efciena decelrii lor, rspunznd negativ la unele teste de patogenitate la
care se supun;
unele tulpini de EIEC nu se dezvolt pe agarul SS (Salmonella-
Shigella), motiv pentru care acesta nu trebuie folosit n lucrrile de detectare
a Escherichia coli;
ntruct marea majoritate a tulpinilor EIEC nu fermenteaz lactoza,
se va avea n vedere c agarul mac Conkey, folosit ca mediu selectiv de
izolare a Escherichia coli s se prepare cu glucoz, n loc de lactoz;
EIEC prezint unele particulariti biochimice de care trebuie s se
in seama. Ele sunt lizin-decarboxilaz negative, tartrat negative, incapabile
de a fermenta mucatul i de a utiliza acetatul, ca unic surs de carbon.
EIEC se aseamn din punct de vedere biochimic i antigenic cu
Shigella.
Pentru difereniere se execut urmtoarele teste: folosirea d-serinei,
d-xilozei, acetatului de sodiu i fermentarea mucatului. Tulpinile EIEC pot
da unul sau mai multe rspunsuri pozitive la aceste teste, n timp ce Shigella
d numai rezultate negative.
dup izolarea i identifcarea izolatelor de Escherichia coli, n mai
multe cazuri se impune determinarea patogenitii lor.
Aceasta se poate realiza prin mai multe teste, dintre care unele sunt
specifce numai unei serogrupe.
Astfel izolatele de EIEC se pot identifca prezumptiv prin determinarea
capacitii lor de a invada celulele hela i confrma, pentru potenialul
invaziv, prin testul Sereny.
Capacitatea ETEC de a produce enterotoxina lT se poate determina
prin testarea fltratelor culturilor pe culturi Y-1 sau Cho, iar a enterotoxinei
ST, pe oareci nou nscui sau prin ElISA, teste radioimune sau sonde dNA
specifce EAf.
o alt metod pentru detectarea ETEC o reprezint hibridarea dNA,
pentru identifcarea genelor care codifc lT i ST. Sondele de dNA marcate
cu 32P au un grad mare de specifcitate i sensibilitate, dar un timp scurt
de njumtire, cost ridicat i inactivarea isotopului. din acest motiv n
ultimul timp s-a recurs la marcarea neizotopic a acizilor nucleici sub form
de sonde de dNA biotinilat pentru lT i ST, dei sunt mai puin sensibile
dect primele.
deosebit de interesant i util pare aplicarea ElISA, n faza solid,
pentru numrarea Escherichia coli productoare de lT din alimente, metoda
92
asigurnd detectarea bacteriei i n cazurile cnd aceasta reprezint 1 din
totalul microforei prezente n aliment.
Nu exist nici o metod pe deplin fdel pentru detectarea direct a
EPEC n alimente.
2.12. detectarea Escherichia coli O157:h7 din fecale i alimente
datorit semnifcaiei patogene pronunate s-au pus la punct o serie
de metode efciente pentru detectarea acestei bacterii din fecale i alimente,
din care menionm:
Strierea direct a fecalelor pe suprafaa agarului mac Conkey cu
sorbitol.
dup o incubare de 24 de ore la 35-37C sau la 42C, coloniile sorbitol
negative (incolore) se transfer pe suprafaa agarului nutritiv nclinat, iar
cultura obinut se supune seroaglutinrii rapide pe lam cu ser anti o
157
.
dac aceast reacie este pozitiv se execut i reacia de seroaglutinare
rapid pe lam cu ser anti h
7
. dac cele dou reacii sunt pozitive se
apreciaz c bacteria izolat este Escherichia coli o
157
:h
7
.
Pentru a uura recunoaterea coloniilor specifce dezvoltate pe
suprafaa agarului mac Conkey cu sorbitol, la acest mediu se adaug
5 bromo-4 cloro-3 indolil--d-galactopiranosid de sodiu (BCIG) sau
ortonitrofenil-galactopiranosid (oNPG) pentru punerea n eviden a
-galactozidazei i 4-metilumbelifenyl--d-glucuronid (muG) pentru
evidenierea glucuronidazei.
Escherichia coli o
157
:h
7
nu elaboreaz -galactozidaz i, deci, nu
descompune substratul specifc, iar colonia va f incolor; de asemenea ea
nu elaboreaz -d-glucuronidaz i deci nu hidrolizeaz indicatorul (muG),
formnd colonii nefuorescente.
metoda strierii directe pe agarul mac Conkey cu sorbitol este efcient
pentru examinarea fecalelor de la pacienii n faz acut, dar nu i pentru
alimente, n care numrul acestei bacterii fa de cel al microforei de
asociaie este foarte mic.
detectarea toxinelor Shiga-like direct din fecale sau din fltratele
culturilor obinute se folosete n prezent n unele laboratoare.
Izolarea Escherichia coli o
157
:h
7
din alimente este mult mai
difcil din cauza numrului mic. dat find doza minim infectant, extrem
de redus, specialitii americani accept folosirea numai a metodelor foarte
sensibile, capabile s detecteze bacteria i din alimentele contaminate cu 3
celule bacteriene/g produs.
n acest scop s-au pus la punct mai multe metode de lucru, care
93
includ o faz de mbogire, una de izolare selectiv i alta de identifcare
i confrmare.
Pentru faza de mbogire se folosete bulion Escherichia coli
modifcat + novobiocin, pentru izolare, agarul mac Conkey cu sorbitol,
BCIG i muG, iar pentru identifcare i confrmare producerea de indol,
mobilitatea, seroaglutinarea cu ser anti o
157
i ser anti h
7
.
n scopul sporirii posibilitilor de izolare a bacteriei din alimentele
congelate, unii autori au folosit pentru prembogire un bulion Escherichia
coli modifcat, fr sruri biliare, incubat 2 ore la 25C i apoi mbogirea
selectiv la 42C, timp de 18 ore, n mediu cu sruri biliare i novobiocin.
deasemenea, ali cercettori au preparat o variant a agarului mac
Conkey cu sorbitol, cu cefxin i telurit (CT-SmAC), prin adugarea salicinei
i a 4 metilumbeliferil--galactopiranosidei. Acest mediu modifcat s-a
notat cu iniialele CT-SSmAC. din 101 tulpini de bacterii non-Escherichia
coli, izolate de pe ridichi i care pe mediul CT-SmAC formau colonii
incolore, ca i Escherichia coli o
157
:h
7
, 92 (91%) formau colonii roz-roii
sau -galactozidaz negative i fr culoare pe CT-SSmAC. Coloniile de
Escherichia coli o
157
h
7
pe CT-SSmAC sunt incolore i -galactozidaz
pozitive. deci, mediul CT-SSmAC s-a dovedit mai selectiv dect CT-
SmAC pentru Escherichia coli o
157
h
7
.
Pentru a mri sensibilitatea metodei i a reduce timpul de analiz se
aplic diferite tehnici intermediare, cum sunt separarea imuno-magnetic,
imuno-captarea (TECRA) i altele.
folosirea testelor imunologice i imunoenzimatice: tratarea
coloniilor transferate pe membrane de nitroceluloz, cu ser anti o
157
conjugat
cu fosfataz alcalin, latex-aglutinarea, ElISA (EhEC-Teck; Petriflm kit-
hEC).
detectarea verotoxinelor (VT) are o foarte mare valoare, deoarece
ntr-un substrat nu poate exista bacteria fr a nu f prezent verotoxina
liber.
Verotoxina poate f prezent, fr a se putea izola bacteria. din aceast
cauz se acord mare importan metodelor de detectare a verotoxinelor din
diferite substraturi (fecale, alimente, culturi).
menionm cteva dintre acestea:
testarea efectului citotoxic al VT pe linia celular Vero; o
tehnici ElISA; o
folosirea sondelor sintetice oligonucleotidice pentru detectarea o
genelor care codifc VT;
folosirea PCR. o
94
Tabelul 2.7
metode de identifcare a patotipurilor diareigene de Escherichia coli
(dup Negu m., 1999)
P
a
t
o
t
i
p
u
l
Metode in
vivo
Metode in vitro
ncadrare n
serogr.
Efect
citopatogen
Metode
genetice
Metode
imunologice
E
T
E
C
iepure:
- ans ligat.
- factorul de
perm. cut.;
oarece nou
nscut:
- inoculare
intragastric
neconclu-
dent pentru
incadrarea n
patotip
efect citopato-
gen pe celule:
- Cho (globu-
lizare);
- Y1 (picnoz)
amplifcare
genic (PCR);
detectarea genei
toxinei termola-
bile lTI (lt I);
detectarea genei
toxinei termos-
tabile ST (st I)
pentru LTI:
- latex agluti-
nare;
- ElISA;
- Imunodifuzie
(testul Biken);
pentru ST:
- ElISA
E
h
E
C
purcel:
-
enterocolit
hemoragic
letal
ser 0157:h7
(aglutinare;
coaglutinare;
latex
aglutinare)
efect citopato-
gen pe celule
Vero; leziuni
de tipul A-E
(aderen,
tergere a
microvililor)
amplifcare
genic (PCR):
detectarea gene-
lor SLT (slt IB):
- direct n scaun
a eae A;
- n colonii
izolate pe agar
mac Conkey cu
sorbitol
latex aglutinare
i ElISA pt. de-
tectarea separat
a toxi-nelor:
- SlT 1;
- SlT 2;
seroneutralizarea
efectului cito-
toxic pe celule
Vero
E
I
E
C
cobai:
inoculare n
sacul con-
junctival
(testul
Sereny)
aglutinare/
latex agluti-
nare cu seruri
polivalente i
monovalente:
28, 29, 124,
136, 143,
144, 152, 164,
167
efect citopato-
gen pe celule
hela: dezvol-
tare intracelu-
lar
amplifcare
genic (PCR):
detectarea genei
ipa H
-
E
P
E
C
-
aglutinare
cu seruri
polivalente i
monova-lente
oK: 26, 55,
86, 111, 114,
119, 125, 126,
127, 128, 142,
158
efect citopato-
gen pe celule:
hep-2:
aderen
difuz i
leziuni de tip
A-E (aderen,
tergere a
microvililor);
hela: ibidem
amplifcare
genic (PCT):
detectarea
operonului alfa;
detectarea genei
eae A
-
95
Episoade de infecie cu ECVT asociate serotipurilor o
157
:h
7
au fost
nregistrate n cel puin 14 ri din ase continente.
Alte serotipuri ECVT care au fost implicate n episoadele de infecie
cu Escherichia coli o
157
:h
7
au indus o
111
, o
145
:Nm i o
104
:h
21
.
n una dintre cele mai mari epidemii produs de Escherichia coli
o
157
:h
7
din America de Nord, aproximativ 500 de cazuri au fost nregistrate
n statele Washington, Idaho, California i Nevada.
un episod care se pare ca a implicat mii de cazuri, s-a petrecut n
sudul Africii n 1992.
n 1996, o epidemie produs de Escherichia coli o
157
:h
7
n Scoia
afectnd mai mult de 400 de persoane a fost legat de consumul produselor
de carne la un mcelar local i a fost asociat cu 151 de spitalizri i 18
decese (afectnd pacienii n vrst).
de asemenea, n 1996 s-a nregistrat un episod masiv al acestei infecii
presupus a f de origine alimentar, n Japonia, care a afectat 6309 copii
de vrst colar (19,4%) din 62 de coli elementare. la 102 copii a fost
nregistrat Suh, iar trei copii au decedat.
n general, n episoadele de infecie cu Escherichia coli o
157
:h
7

ratele de atac au variat de la 0,1 la 71%, iar locurile de izbucnire au inclus
restaurantele, azilele, creele, penitenciarele i casele personale.
Izolri sporadice de ECVT, de obicei Escherichia coli o
157
:h
7
din
cazuri de diaree sangvinolent sau Suh, au fost nregistrate n mai multe
ri.
majoritatea studiilor s-au concentrat asupra incidenei serotipului
o
157
:h
7
deoarece metodele de decelare pentru serotipurile non o
157
nu sunt
n uzul curent.
ntr-un studiu prospectiv important, efectuat pe 2 ani de ctre Alberta,
Pai i colaboratorii, care a inclus peste 5.000 de cazuri de diaree, prezentate
n spitalele din Calgary, n 1988, a izolat ECVT (n majoritate serotipul
o
157
:h
7
) la 3,7% din pacieni, comparativ cu Salmonella spp. la 2,7% i
Campylobacter spp. la 2,0%.
n alte studii, serotipul o
157
:h
7
a fost izolat la 0,6-2,5 din probele de
fecale examinate, de obicei reprezentnd a doua sau a treia bacterie patogen
frecvent izolat.
frecvena de izolare din probele de fecale sangvinolente a variat ntre
15-37%.
n Europa i America de Nord numrul de cazuri crete n lunile de
var, fapt care poate f corelat unei combinaii de factori, cum ar f consumul
crescut de hamburgeri, incidena mai mare a ECVT la vaci i ncrctura
bacterian mai mare n carnea tocat.
96
Vrful de frecven corelat cu vrsta a diareei asociate cu ECVT i
Suh este la copiii mici.
Principala complicaie a infeciei ECVT este Suh, care a fost
nregistrat cu o frecven de aproximativ 8% n mai multe episoade de
infecie cu Escherichia coli o
157
:h
7
, dei ntr-un episod care a afectat
pacienii mai n vrst dintr-un azil, aceast frecven s-a situat la 22%.
frecvena cazurilor sporadice de Suh n America de Nord este
de aproximativ 2-3 cazuri la 100.000 de copii cu vrsta pn la 5 ani, n
contrast cu incidena de aproape 10 ori mai mare la acest grup de vrst n
Argentina.
n Africa de Sud, Suh pare s fe mai frecvent la copiii albi, dect la
cei de culoare.
n Anglia, sindromul pare mai frecvent n zonele rurale, dect n cele
urbane. Cazurile acestor diferene regionale i/sau socioculturale rmn a f
stabilite.
factorii de risc majori pentru contactarea infeciei cu ECVT sunt
ingestia alimentelor sau a apei contaminate i contactul strns cu indivizii
afectai.
factorii de risc pentru dezvoltarea unei boli severe de tipul Suh includ
vrsta (foarte tineri sau btrni), gastrectomia anterioar, probabil mrimea
inoculului i posibila utilizare recent de antibiotic.
factorii de gazd de tipul imunitii preexistente antitoxice sau
antibacteriene, distribuia receptorilor i fenotipul antigenic P al hematiilor,
pot determina, de asemenea, natura i severitatea bolii, la fel cum le pot
determina i factorii bacterieni, fenotipul toxinic i factorii de colonizare.
Sunt necesare studii ulterioare pentru descrierea determinanilor bolii
i a gravitii acesteia.
Bovinele sunt, probabil, principalul rezervor animal pentru tulpinile
ECVT implicate n boala de la om, iar alimentele de origine bovin (n
special pateurile cu carne tocat de vit semigtit i laptele nepasteurizat)
constituie sursele majore ale infeciei la om.
Episoade asociate consumului de cidru, proaspt preparat au fost
probabil corelate cu utilizarea merelor contaminate cu fecale bovine.
un caz de infecie cu Escherichia coli o
157
:h
7
la un lactovegetarian a
fost presupus a se datora consumului de vegetale dintr-o grdin fertilizat
cu fecale bovine.
Alte alimente care au servit ca vehicul pentru infecia cu ECVT (fe ca
surse primare, fe n urma contaminrii de la o surs primar) includ friptura
de vit, apa, tartinele reci (curcan, unc i/sau brnz), cartofi cruzi i
iaurtul.
97
dovezi ale contaminrii cu ECVT a arjelor de carne tocat din
magazine au fost nregistrate n America de Nord i Thailanda i au variat de la
9 la 36,4% din probele testate, cu o frecven de izolare a microorganismului
de 5-10% (toate serotipurile) sau de 0-3,7% (o
157
:h
7
).
mai mult, n aceleai studii, ECVT au fost decelate n carnea de porc
(1-10,6%), pui (0-1,5%) i miel (2%), cu o frecven de izolare a Escherichia
coli o
157
:h
7
de 0-1,5%, 0-1,5% i respectiv 2%.
Nu este clar dac prezena ECVT n alimentele de alt origine dect
cea bovin reprezint starea de purttor a acestor specii i/sau contaminarea
de la sursele bovine n timpul prelucrrii.
ECVT au fost decelate de asemenea, la 1% din fltrele de lapte.
o dat cu recunoaterea faptului c infecia ECVT se transmite de la
individ la individ, persoanele infectate constituie n mod clar o alt surs
major de infecie ECVT.
Infecia poate f contractat prin contactul cu animalele infectate,
oamenii infectai i consumul alimentelor sau a apei contaminate.
A fost nregistrat i un caz de infecie n laborator contractat de un
tehnician.
frecvena relativ nalt a transmiterii infeciei cu Escherichia coli o
157

de la persoan la persoan, demonstrat n studii de familie, sugereaz c
doza infectant a acestui serotip este foarte mic, probabil chiar mai mic
de 100 de microorganisme. Acest fapt mrete importana procedurilor de
prevenire i combatere stricte ale infeciei n spitale i n alte instituii.
Sunt disponibile cteva metode pentru subtipizarea tulpinilor de
Escherichia coli o
157
care s uureze studiile epidemiologice, metode care
includ biotipizarea, tipizarea fagic, proflul plasmidic i polimorfsmul de
restricie cromozomal (RflP).
2.13. Infeciile naturale la animale
Se numesc colibaciloze i prezint urmtoarele trsturi caracteristice.
Gravitatea infeciilor colibacilare este infuenat de specie, vrst i starea
imunologic, precum i de nsuirile tulpinii de colibacili infectani, putnd
mbrca una din urmtoarele forme de exprimare anatomoclinic:
enterita colibacilar (diareea colibacilar, colibaciloza enteric,
colibaciloza enterotoxic);
enterotoxiemia colibacilar (boala edemelor, colienterotoxiemia);
septicemia colibacilar;
mamita colibacilar;
coligranulomatoza (granulomul lui hyarre).
98
Colibaciloza vieilor
Poate evolua ca enterit colibacilar (diaree colibacilar) sau ca
septicemie colibacilar.
Tulpinile de Escherichia coli care produc enterita colibacilar aparin
serogrupelor o8, o9, o101, o15, o115, dau pe medii glucozate colonii
mucoide, produc enterotoxine, posed antigenul A i l (ca factori de
adeziune), K
99
sau f
4
.
n etiologia septicemiei colibacilare, cel mai frecvent raportat, n toate
rile este o78, urmat de o15, o111 i o115.
Enteritele colibacilare reprezint rezultatul aciunii colibacililor
aparinnd fe patotipului ETEC (cel mai frecvent), fe patotipului EPEC,
EhEC sau EIEC.
n cazul lui ETEC i EPEC sunt prezente adezinele fmbriale f
5
(mai
frecvent) fe adezinele f
6
, f
41
, f
17
(rar).
n cazul colibacilozei septicemice, principalul factor de patogenitate l
reprezint endotoxinele, care dup ce se multiplic intravascular, genereaz
ocul endotoxic.
Colibaciloza purceilor
Se manifest sub urmtoarele forme:
diareea colibacilar (dC) sau enterita colibacilar (EC) sau
colibaciloza enterotoxic ntlnit la purcei n primele zile de via, find
cea mai frecvent i pgubitoare form.
Cele mai multe tulpini enterotoxigene izolate de la purcei posed
adezinele fmbriale f
4
(K
88
) i, mai rar f
5
(K
99
), f
6
(987) sau f
41
i aparin
serogrupurilor somatice o141, o147, o149, o157, o8, o9, o138, o64,
o10, o15 i altele.
o parte dintre acestea elaboreaz, n afara enterotoxinelor ST i lT i
verotoxinele care, de obicei nu posed adezine fmbriale.
diareea de nrcare (dI) apare n creterea intensiv, n primele
zile dup constituirea loturilor de tineret;
septicemia colibacilar (SC) apare la purceii sugari, dar n proporie
mai mic dect dC;
enterotoxiemia colibacilar, numit i boala edemelor (B.E.). de la
purceii cu B.E. se izoleaz, de regul, tulpini de Escherichia coli hemolitice,
care aparin serotipurilor o138 K81, o139 K82, o141 K85, care posed
adezine i au capacitatea de a produce verotoxine.
99
datorit similitii (dar nu identitii) cu verotoxina produs de
Shigella dysenteriae, la om, verotoxina produs de tulpinile de Escherichia
coli izolate din B.E. se mai numete i Shiga-like.
infecii cu localizare extraintestinal: mamita colibacilar, relativ
rar ntlnit la vaci i scroafe i ocup ca frecven, locul trei dup mamitele
streptococice i staflococice.
Colibaciloza psrilor
Escherichia coli produce colisepticemia (CS) i coligranulomatoza
(CG). Au fost izolate i identifcate din colisepticemia aviar peste 60 de
serotipuri, cele mai frecvente find: o
2
, o
1
, o
8
, o
15
, o
3
, o
18
, o
22
, o
23
, o
73,
o
109
, o
17
, o
119
, o
139
, o
141
, o
165
.
Au fost recunoscui ca factori de virulen la tulpinile de Escherichia
coli patogene pentru psri adezinele fmbriale f
1
(active n tractusul
respirator) i P (active n viscere), antigenul capsular K
1
i indirect sistemul
f
e
-dependent.
2.14. Infecii cu Escherichia coli la om
Infecia ECVT este asociat unui spectru larg de manifestri clinice,
care include:
colita hemoragic;
sindromul uremic hemolitic (Suh).
Colita hemoragic (colita ischemic). Se caracterizeaz prin apariia
brusc a crampelor abdominale severe, urmate n cteva ore de diaree
apoas.
Pacienii pot prezenta grea, dar voma nu este caracteristic. diareea
apoas progreseaz rapid spre faza caracterizat de eliminare sanguinolent
profuz, asemntoare hemoragiei intestinale inferioare.
febra este absent sau de mic intensitate. Coninutul n leucocite, din
snge poate f crescut, cu o uoar deviere spre stnga.
Boala este, de obicei, autolimitant i dispare n decurs de o sptmn.
forma mai grav poate f complicat de constricia intestinal.
Sindromul uremic hemolitic (SUh). Suh este defnit de o triad de
simptome: insufcien renal acut, trombocitopenia i anemia hemolitic
microangiopatic.
Cea mai comun form de Suh este cea clasic sau d + (asociat
100
diareei), care are cea mai nalt inciden la copii. de obicei, se manifest
n cteva zile de la declanare, printr-o diaree acut prodromal, care
este frecvent sanguinolent, cu trsturi indistincte de cele din colita
hemoragic.
Suh clasic rmne cauza major a insufcienei renale acute la copii.
Se pot ntlni complicaii grave, ca rezultat al bolii microangiopatice de
la nivelul altor sisteme organice, cum ar f sistemul nervos (SNC), cordul,
pulmonul i pancreasul.
Suh clasic i/sau Suh asociat ECVT, cu manifestri predominant
nervoase este frecvent denumit purpura trombotic trombocitopenic
(PTT).
Suh reprezint de asemenea complicaia major a dizenteriei Shiga,
asociat cu Shigella dysenteriae, tipul 1.
factorul responsabil n geneza Suh, aprut att n urma infeciei
ECVT ct i a dizenteriei Shiga este probabil aceeai exotoxin proteic,
denumit VT1 sau Shiga toxin (toxin Shiga), care este elaborat att de
ECVT, ct i de Shigella dysenteriae tipul 1.
la majoritatea pacienilor cu diaree i colit hemoragic, asociate
ECVT, boala este autolimitant, iar recuperarea total se obine prin msuri
generale de susinere.
Suh nregistreaz, de obicei, o rat a fatalitii cazurilor de aproximativ
50%.
Terapia intravenoas cu imunoglobuline a fost benefc n cazul unor
copii cu Suh, dei bazele acestui efect rmn a f elucidate.
2.15. Toxiinfecii alimentare produse de Escherichia coli
Tulpina prototip pentru sindroamele de mai jos este E. coli 0157 :h7.
Tipul h7 a fost izolat iniial n 1944 la un om cu diaree, n timp ce tipul
0157 a fost izolat si defnit 1972 din fecalele de la porci cu diaree. Tulpina
0157:h7 a fost pentru prima dat identifcat n 1975 la un pacient cu diaree
sangvinolent. Tulpinile producatoare de Stx de E.coli au fost identifcate
n 1977 n SuA i Canada.
huS este cauza de tulpini de E. coli producatoare de Stx. S-a estimat
c 2 pan la 7% din infeciile cauzate de E.coli 0157 :h7 vor produce huS.
Acesta const n anemie hemolitic, trombocitopenie i insufciena renal
acut. Cu toate c nu a fost legat direct de tulpinile EmEC pan n 1985,
huS a fost pentru prima dat descris n 1975.
ntr-un studiu german asupra perioadei de eliminare a tulpinii E. coli
157:h7 la 53 de copii cei 28 de copii care aveau diaree hC au eliminat
101
microorganismul ntre 2 i 62 de zile (media de 13 zile), n timp ce ceilali
25 care au contactat huS au eliminat germenii ntre 5-124 de zile (media de
21 de zile). huS este asociat mai mult cu tulpinile care produc Stx
2
dect
cu cele care produc Stx
1
sau ambele toxine.
ntr-un studiu efectuat n Anglia n perioada 1989-1991, 15% din 1275
de indivizi de la care au fost izolate culturi pozitive EhEC au facut huS.
Colita hemoragic (hC) ca boal de origine alimentar a aparut pentru
prima dat n 1982 n oregon i michigan, unde n ambele cazuri victimele
au consumat sandwichuri de la un fast-food care coninea carne de vit
gatit necorespunzator. Toti cei 43 de pacieni au avut diaree sangvinolent
i crampe abdominale severe, 63% manifestnd grea, 49% vom i
doar 7% febr. n alte epdemii, perioada de incubaie a variat ntre 3 i 8
zile. Scaunul sngeriu reprezint simptomul caracteristic bolii i refect
implicarea agentului etiologic n colon. febra apare rar, iar doza infectioas
se pare c este de doar 10 ufc.
Prima epidemie datorat altor toxine ST
x
dect cele produse de
E.coli 0157 :h7 n uS (din 1994) a fost serotipul 014:h21. Sursa a fost
reprezentat de laptele pasteurizat contaminat. Serotipul 0111:Nm a fost
izolat n Australia de sud (1995) din crnai semiuscai fermentai. n 1992
n Italia acelai serotip a produs pentru prima dat tulpini producatoare de
Stx asociate cu huS, iar moartea a avut loc la 1 din 9 copii.
n Japonia, au fost 29 de epidemii cu E. coli 0157 :h7 ntre 1991-
1995. n 1996 au fost 11826 de cazuri de gastroenterite cu 12 mori cauzate
de E. coli 0157 :h7.
Prevenirea:
Trebuie luate msuri speciale datorit consecinelor pe care boala le
poate avea asupra copiilor mici.
msurile de prevenire trebuie ndreptate n primul rnd asupra
toxiinfecilor alimentare produse la copii mici i a consecinelor pe care
boala le poate produce asupra acestora.
Aceti germeni sunt foarte sensibili la temperatura iar gastroenteritele
nu ar trebui s apar dac mncarea ar f gatit corespunzator. Se recomand
n cazul crnii de vit ca mncarea s fe gatit la 71
o
C sau ca temperatura
intern s fe de minimum 58,3
o
C pentru cel puin 15 secunde. Cu toate c
cea mai mare epidemie a fost asociat cu carnea de vit, toate crnurile crude
de pui, unele fructe i legume ar trebui considerate ca posibile vehicule ale
colitelor hemoragice.
diareea cltorului (Travelers diarrhea)
Escherichia coli reprezint principala cauz a acestei boli.
Printre voluntarii Peace Corps din Thailanda rural, 57% din 35 au
102
manifestat sindromul n timpul primelor 5 sptmni n ar i 50% au
manifestat evident simptomele infeciei cu tulpini ETEC.
n 1976 a fost raportat o epidemie pe un vas de croazier, cauzat de
serotipul o25:K98:Nm productoare de lT.
Alte microorganisme asociate cu acest sindrom sunt rotavirusurile,
novovirusurile, Entamoeba histolytica, Yersinia enterocolitica, Giardia
lamdia, Campylobacter jejuni/coli, Shigella spp., Aeromonas hydrophila,
Klebsiella pneumoniae i Enterobacter cloacae.
2.16. Strategii de prevenire i combatere
marele episod ECVT nregistrat n mai multe state din vestul SuA
n cursul anului 1992 a devenit punctul pivot n regndirea programelor de
siguran alimentar, n lumea ntreag.
S-a impus necesitatea unor strategii de siguran alimentar integrat,
care s implice toate verigile lanului alimentar de la ferm la mas.
Sistemele care se concentreaz, n special la nivelul prelucrrii,
comercializrii i al consumatorului pot f inadecvate, fr considerarea
sectorului din amonte, incluznd informaii asupra strii de sntate a
efectivelor i a fecrui animal.
Prevenirea expunerii bovinelor la ECVT n ferm ar genera o scdere
considerabil a numrului de animale care transport ECVT n abatoare i,
deci, o reducere a contaminrii produselor din carne.
Testarea prezenei ECVT n fecalele bovinelor naintea comercializrii
lor i reinerea acestora pn cnd nceteaz s mai elimine aceste bacterii
reprezint una dintre opiunile de combatere, dar trebuie depit costul
operaiunii i este necesar acordul prilor interesate.
Tratarea vitelor infectate, cu antibiotice, nu este efcient fnanciar i
poate genera dezvoltarea bacteriilor rezistente (ECVT i altele).
Vaccinarea bovinelor pentru reducerea colonizrii intestinale cu ECVT
ar putea f luat n studiu.
la abator, contaminarea crnii se poate produce atunci cnd coninutul
intestinal sau materiile fecale vin n contact cu suprafeele acesteia. Gradul
de contaminare poate f mrit n timpul operaiilor de dezosare i tocare.
orientarea actual pentru sisteme concentrate n sectorul de prelucrare
alimentar i distribuie rapid a generat laboratoare care produc un milion
de hamburgeri pe zi, cu distribuire n zone geografce mari. Acest fapt poate
genera mari episoade, atunci cnd se aplic proceduri improprii de preparare
sau manipulare la nivelul comercializrii sau al consumatorului. Pe de
alt parte, o astfel de concentrare de volum poate facilita implementarea
103
strategiilor de control de tipul programelor hACCP (hazard Analisys
Critical Control Points Analiza riscului n punctele de control critice), care
pot asigura producii de mare volum de hran de calitate nalt i sigur.
Este deosebit de important prevenirea transmiterii la nivelul preparrii
alimentelor prin manipulare i tratare termic adecvate.
Asocierea strns a infeciei cu ECVT i carnea tocat, spre
deosebire de carnea de vit tranat se datoreaz probabil diferenelor de
prelucrare. Atunci cnd carnea de vit tranat are suprafeele contaminate,
microorganismele pot f distruse uor prin gtit.
n pateurile cu carne tocat, totui, microorganismul se af amestecat
n carne i realizarea unor temperaturi interne de distrugere i timpul de
gtire devin foarte importante n reducerea riscului de infecie. o dat
preparat, orice surplus rmas trebuie imediat refrigerat sau congelat.
n plus, minile i orice material care a venit n contact cu carnea
crud (cuite, ustensile) trebuie splate cu ap ferbinte i detergent i s nu
intre n contact cu orice alt aliment crud.
datorit dovezilor tot mai abundente privind transmiterea infeciei cu
ECVT de la o persoan la alta sunt necesare proceduri efciente de prevenire
i combatere, a acesteia n spitale, cmine i alte instituii.
dezvoltarea i implementarea tehnicilor de diagnostic rapid, vor
conduce la recunoaterea din timp a infeciei cu ECVT i, astfel, vor putea
f aplicate, la timp, msuri de control pentru sntatea public.
dou posibile opiuni includ utilizarea vaccinurilor pentru prevenirea
colonizrii cu ECVT a mucoasei intestinale i utilizarea toxoizilor sau a
componentelor subunitare ale holotoxinelor pentru elucidarea consecinelor
toxiemiei VT sistemice.
Natura factorilor de colonizare i produii poteniali ai genei eae, aa
cum este intimina, sunt nelese de abia acum, iar cunoaterea rspunsurilor
locale sau sistemice n anticorpi fa de aceste proteine este nc limitat.
n urma infeciei cu tulpini ECVT care exprim una sau mai multe
toxine, numai unele persoane dezvolt anticorpi fa de VT1, n timp ce
rspunsurile imune specifce fa de VT2 i VT2c par s fe foarte rare.
motivul naturii inconsecvente a rspunsului seric antitoxic la pacienii
cu infecie ECVT productoare de VT1 rmne s fe elucidat.
Explicaiile posibile includ:
stimulul antigenic sczut, datorat unei toxine cu activitate biologic
nalt;
efectul imunosupresor al toxinei, cunoscut ca find in vitro
citotoxic pentru limfocitele B;
limitarea rspunsului imun la indivizii cu genotipuri specifce clasei
104
II a complexului major de histocompatibilitate;
epitopii moleculei VT1, fa de care are loc un rspuns imun mai
consecvent in vivo, probabil nu au fost expui adecvat n testul utilizat.
Absena rspunsului serologic nu exclude n mod necesar capacitatea
de inducere a proteciei dup imunizarea cu toxoid. Toxoidul VT1, i
componenii subunitii B-VT1 s-au dovedit a induce imunitate protectoare
la animalele de laborator.
n domeniul veterinar mac leod i Gyles (1991) au fost capabili
s protejeze purceii fa de testul de control cu VT2e purifcat, att prin
imunizare pasiv cu anticorpi neutralizani, ct i prin imunizare activ cu
toxoidul VT2e.
Programele de inspecie a crnii din ntreaga lume sunt n revizuire
i supuse unei schimbri de la o metod bazat pe metode organoleptice
la implementarea analizei de risc hACCP i a altor strategii cu accent pe
gestiunea total a calitii.
Integrarea sectorului zootehnic n programele de siguran alimentar
va genera probabil extinderea metodei de analiz a riscului hACCP i la
nivelul fermei.
Pe plan internaional, sistemele de control ale crnii sunt sub presiunea
tot mai mare a comerului pentru a corespunde standardelor internaionale
de tipul seriilor ISo 9000.
n multe ri reglementrile de sntate public indic temperaturile
minime de preparare care trebuie respectate i practicile de igien alimentar
care s asigure alimentele gata de consum de la nivelul vnzrii cu
amnuntul.
Alte metode de control propuse, includ utilizarea compuilor chimici
sau iradierea pentru scderea sau eliminarea ncrcturii microbiene din
produsele de carne.
detergenii de tipul fosfatului trisodic s-au dovedit a f promitori
n scderea numrului de coliformi de la nivelul carcaselor i sunt deja
acreditai ca mijloace de prelucrare n anumite ri.
un alt mijloc de reducere a ncrcturii microbiene este -iradierea.
Acest procedeu s-a dovedit a reduce efcient ECVT din hamburgeri i nu
pare s aib efecte adverse asupra produsului.
Comercializarea recent a puilor iradiai n Statele unite ale Americii
a demonstrat schimbarea de atitudine a consumatorilor i faptul c iradierea
poate f o metod util pentru reducerea contaminrii cu ECVT a alimentelor
comercializate cu amnuntul.
Aceste dezvoltri cuplate cu programele de educaie public privind
manipularea adecvat a alimentelor i tehnicile de preparare vor avea un
105
efect pozitiv n reducerea gradului de expunere a populaiei la ECVT prin
alimente contaminate.
n anumite ri sunt implementate programe de control pentru ECVT
la nivel de ferm, n special pentru o157:h7.
n multe ri, comercializarea laptelui nepasteurizat este ilegal, ceea
ce reprezint o msur efcace pentru reducerea episoadelor ECVT datorate
laptelui.
de asemenea, n multe state s-au stabilit reglementri privind
standardele temperaturilor interne de preparare, care trebuie atinse n
alimente i msurile sanitare de la nivelul comercializrii, care adecvat
realizate, constituie bariere importante pentru infecia nregistrat la om.
Supravegherea sntii publice privind infecia cu ECVT poate juca
un rol major n conturarea i implementarea msurilor de control.
n timp ce, n unele ri, raportarea ctre autoriti a cazurilor umane
de infecie cu ECVT (sau doar de infecie cu o157:h7) este obligatorie, n
alte ri ea nu este.
Raportarea consecvent n toate rile poate f o contribuie esenial
la supravegherea internaional i la conturarea unor strategii de prevenire
i combatere globale.
2.17. metode de izolare i identifcare a lui
Escherichia coli din alimente
Tehnica de lucru:
determinarea prezenei i a numrului de bacterii coliforme se poate
efectua att n medii lichide ct i pe medii solide, de izolare selectiv (fr
mbogire).
1. Se cntresc 50 g de prob ntr-un blender de nalt vitez. Se
adaug 450 ml de fosfat tampon Butterfeld i se omogenizeaz 2 minute la
10.000-12.000 rot/min. Astfel se obine diluia 10
-1
.
2. Toate diluiile zecimale se pregtesc cu 90 ml diluant + 10 ml
din diluia anterioar. diluiile pregtite depind de densitatea anticipat a
coliformilor. Se omogenizeaz bine fecare diluie.
3. Pentru testul prezumptiv se transfer cte 1 ml din fecare diluie n
cte 3 tuburi per diluie cu bulion lT (lauril-triptoz). Pipeta se ine n aa
fel nct marginea sa inferioar s fe sprijinit de tub.
4. Se incubeaz tuburile 24-48 de ore, la 35C. Se examineaz la 24 de
ore pentru producia de gaz n tubul durham.
5. Se reincubeaz tuburile negative nc 24 de ore i se examineaz
pentru a doua oar pentru producia de gaz.
106
6. Se efectueaz testul de confrmare pe toate tuburile prezumptiv
pozitive (productoare de gaz). Se consider c bacteriile coliforme sunt
prezente dac se observ att dezvoltarea bacterian ct i apariia gazelor
n tubul de fermentare, iar n urma coloraiei Gram, la examinarea frotiului
apar exclusiv bacili sau cocobacili Gram negativi. n acest caz, n funcie
de diluiile pozitive se raporteaz prezena sau absena coliformilor la o
anumit cantitate de produs. de exemplu: s-au confrmat bacterii coliforme
n diluiile 10
-1
, 10
-2
. Aceasta denot c bacteriile coliforme sunt prezente n
0,01 g prob, dar sunt absente n 0,001 g de prob.
Testul de confrmare pentru coliformii totali
1. Se agit uor fecare tub cu mediul lT (lauril-triptoz), care
elibereaz gaze i se transfer o ans din suspensie ntr-un tub cu mediu
BGB (bulion cu bil verde-briliant 2%).
2. Se incubeaz tubul BGB 48 de ore la 35C.
3. Se examineaz pentru producia de gaz i se nregistreaz.
4. Se consider reacie pozitiv atunci cnd prezena gazelor apare n
cel puin 1/10 din nlimea tubului durham.
5. Se calculeaz numrul cel mai probabil de germeni (mPN = most
probable number) pe baza combinaiei unor tuburi lT (m47), cu eliberare de
gaze confrmate de-a lungul a trei diluii consecutive. n funcie de numrul
de eprubete pozitive, din fecare diluie se raporteaz mPN per gram (ml)
produs, conform tabelului mc Crady. de exemplu: dac s-au confrmat
bacterii coliforme n 3 eprubete cu diluia 10
-1
, n dou eprubete cu diluia
10
-2
, i n dou eprubete cu diluia 10
-3
, se va obine combinaia de 3 cifre
322, n dreptul creia se va citi din tabelul mc Crady mPN-ul.
Testul de confrmare pentru coliformii fecali
1. Se agit uor fecare tub lT care elibereaz gaze i se transfer o
ans din fecare suspensie n tubul cu mediu EC.
2. Tubul cu mediul EC se incubeaz 48 de ore la 45,5C. Examinarea
produciei de gaz se face dup 24 de ore, iar dac testul este negativ se
examineaz din nou dup 48 de ore.
3. Se calculeaz mPN pentru coliformii fecali pe baza proporiei
tuburilor confrmate productoare de gaz pe mediul EC, pentru 3 diluii
consecutive.
107
Testul de confrmare pentru Escherichia coli
Se aplic o ans de suspensie din fecare tub eliberator de gaz, cu
mediul EC pe agar l-EmB (levine eozin albastru de metilen) (m 49).
Se incubeaz plcile timp de 18-24 de ore la 35C.
Se examineaz coloniile, iar cele tipice pentru Escherichia coli au
centrul ntunecat i suprafaa cu sau fr luciu metalic.
Se transfer 2 colonii tipice din fecare plac cu agar l-EmB pe pante
PCA (plate count agar) (m 8) pentru testele morfologice i biochimice.
Se incubeaz mediul nsmnat 18-24 de ore la 35C.
Se recolteaz 2 colonii din fecare plac.
Se efectueaz coloraia Gram din fecare cultur.
Pentru toate culturile Gram negative cu bacili scuri sau cocobacili se
urmrete n continuare: producia de indol; testul Voges-Proskauer; testul
roului metil, producia de gaz din lactoz.
Interpretarea reaciei: toate culturile care fermenteaz lactoza cu
producie de gaz n 48 de ore la 35C; sunt bacili sau cocobacili Gram
negativi asporogeni; i dau tipuri de ImViC de ++-- (biotipul 1) sau -+--
biotipul 2 sunt considerate a f Escherichia coli.
Se calculeaz mPN pe baza proporiei de tuburi cu mediu EC n 3
diluii succesive care s-au dovedit a f Escherichia coli.
metoda mUg pentru numrarea rapid a lui Escherichia coli
din alimente refrigerate sau congelate
Acest test se bazeaz pe determinarea glucuronidazei, enzim posedat
de majoritatea tulpinilor de Escherichia coli spre deosebire de celelalte
bacterii intestinale.
Substratul muG (4-metilumbeliferil beta d-glucuronidaz) se
ncorporeaz n bulionul lT. Tuburile inoculate se incubeaz n condiii
specifce i se examineaz n lumina uV pentru prezena ca produs fnal
a unei glucuronidaze fuorogene. fluorescena n mediul lT-muG (m 48)
termolabil indic prezena lui Escherichia coli.
Testul prezumptiv LT-mUg pentru Escherichia coli
1. Se prepar probele alimentare dup cum s-a descris la metoda
convenional.
2. Se prepar diluii zecimale ca la metoda convenional.
3. Se inoculeaz 1 ml n trei tuburi lT-muG pentru fecare diluie.
108
4. Se incubeaz tuburile 24 de ore la 35C i se examineaz: creterea,
producia de gaz i fuorescena. fluorescena se examineaz la o lamp cu
uV la ntuneric. dac aceasta este albstruie testul este pozitiv.
Testul de confrmare a LT-mUg
1. din fecare tub fuorescent, se nsmneaz prin striere o ans pe
agar l-EmB i se incubeaz 24 de ore la 35C.
2. Interpretare: toate culturile care devin fuorescente n mediul lT-
muG; fermenteaz lactoza cu producie de gaz n 48 de ore la 35C; apar ca
bacili sau cocobacili Gram negativi asporogeni; dau tipurile ++-- (biotipul
1) sau -+-- (biotipul 2), sunt considerate a f Escherichia coli.
Izolarea i identifcarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene
(enterotoxigene) din carne i preparate din carne
ncrctura cu E. coli a crnii, ca materie prim (porc, vit), ca i
a semi-preparatelor (salamuri, carne tocat, past de mici, slnin) i a
tampoanelor de sanitaie recoltate de pe diverse utilaje sunt redate n tabelul
2.9., sub forma numrului de tulpini de E. coli.
Acest studiu s-a efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar i
a INCdmI Cantacuzino n perioada 2008-2009.
Tabelul 2.8.
ncrctura cu E. coli a crnii i preparatelor din carne
Probe nr. probe nr. de E. coli nEC/g
Tampoane de pe utilaje 20 64,02
Carne de porc 17 27,12
Carne de vit 19 290,98
Slnin 5 0,22
Salamuri semiafumate fnite 8 12,2
Carne tocat 4 65,1
Past de mici 12 355,4
din totalul de 85 de probe prelucrate s-au izolat 15 tulpini de E. coli.
Rezultatele serologice referitoare la numrul de tulpini de E. coli izolate,
ncadrabile i nencadrabile sunt redate n tabelul 2.9.
109
Tabelul 2.9
Sortiment
nr.
probe
Tulpini
izolate
Tulpini ncadrate
serologic
Tulpini nencadrate
serologic
nr. % nr. % nr. %
Tampoane utilaje 20 5 25 1 20 4 80
Carne de porc 17 2 11 1 50 1 50
Carne de vit 19 1 5 0 0 1 100
Slnin 5 0 0 0 0 0 0
Salamuri
semiafumate fnite
8 3 37 1 33 2 66
Carne tocat 4 1 25 0 0 1 100
Past de mici 12 6 50 2 33 4 66
Total 85 18 21 5 27 13 72
datele privind structura antigenic a tulpinilor de E. coli izolate i
principalele serogrupe identifcate sunt prezentate n tabelul 2.10:
Tabelul 2.10
Principalele serogrupe de E. coli identifcate n materia prim utilizat la
prepararea mezelurilor, produselor fnite i a unor semipreparate
Probe
nr. tulpini izolate/
nr. tulpini
ncadrate
Serogrupe identifcate
07 08 010 015 020
nr % nr % nr % nr % nr %
Tampoane
utilaje
5/1 1 20 1 20 0 0 0 0 0 0
Carne porc 2/1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 50
Carne vit 1/0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Slnin 0/0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Salamuri
semiafumate
fnite
3/1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Carne tocat 1/0 1 50 0 0 0 0 1 100 0 0
Past mici 6/2 0 0 0 0 1 16,6 0 0 1 16,6
Total 18/5 2 11 1 5,5 1 5,5 1 5,5 2 11
Aspectele legate de unii factori de patogenitate cercetai la tulpinile
izolate sunt redate n tabelul 2.11.
110
Tabelul 2.11
Testarea patogenitii unor tulpini de E. coli izolate pe fuxul producerii
mezelurilor i a unor semipreparate
Testul
Tulpini
examinate
Tulpini
pozitive
globule
roii Obs.
nr. % nr. % oaie/om
Producia de hemolizine 85 100 2 23,52 -
1 = N
1 = 010
Prezena fmbriilor
RSAR 85 100 2 23,52 - 1 = N:K
99
f
41
latex aglutinare 1 1,17 1 = N: f
41
Testul ansei ligaturate
(purcel sugar nrcat)
pentru ST/lT 5 100 0 0
Producia de h
2
S 85 100 10 11,76
N = tulpin nencadrat serologic
Valorile individuale ale parametrilor analizai (numrul de E. coli)
variaz n limite largi, n funcie de prob, seria de probe i respectiv unitatea
din care s-au recoltat probele.
ncrctura cu E. coli (NEC/g) prezint urmtoarele valori: slnin
(0,35), carne de porc n lucru (45,12), salamuri (32,5), tampoane de pe
utilaje i mini personal (120,07).
la restul probelor se constat valori cuprinse ntre 380,57-1234,5.
din analiza acestor date se poate deduce faptul c materiile prime
ajung la fabricile de prelucrare cu o anumit ncrctur bacterian
dependent n principal de zestrea microbiologic a animalului nainte de
sacrifcare, condiii igienico-sanitare pe fux, condiii de pstrare a crnii
dup sacrifcarea animalelor, frecvena manipulrilor pe timpul pstrrii i,
respectiv, condiiile igienice n timpul transportului.
Se cunoate, de asemenea, c att carnea i, mai ales, semifabricatele
i respectiv compoziia de umplere prin contactul cu minile lucrtorilor, cu
utilajele de lucru, cu adaosul diferitelor ingrediente, i sporete ncrctura
bacterian, aspect confrmat i de investigaiile noastre.
Remarcm, de asemenea, rolul deosebit al proceselor de prelucrare
termic (ferbere i afumare), care n condiiile cnd sunt bine efectuate,
reduc ncrctura n bacterii E. coli la produsele fnite (prospturi i salamuri
semi-afumate), indiferent de ncrctura iniial a crnii i semifabricatelor.
Acest aspect dorit att de productori ct i de controlorii de calitate a fost
ntlnit pe ntreaga perioad a investigaiilor noastre. n condiiile noastre
de lucru s-au preparat 15 seruri anticolibacilare o pentru 15 serogrupe.
Examenul serologic al tulpinilor de E. coli izolate din materia prim,
semifabricate, produse fnite, unele semipreparate i tampoanele de sanitaie
111
ne-au permis ncadrarea serologic a unui procent de 18 tulpini din cele 85
de tulpini izolate. majoritatea sunt nencadrabile serologic 13 (72,22%),
fapt datorat n principal marii variabiliti genetice a germenilor din familia
Enterobacteriaceae, precum i din alte familii, aspect constatat i de ctre ali
autori. dintre serogrupele identifcate, menionm: o
7
= 2 tulpini (11,11%),
o
8
= 1 tulpin (55,55%), o
10
= 1 tulpin, o
15
= 1 tulpin, o
20
= 1 tulpin.
Serogrupele o
7
i o
10
sunt recunoscute pe plan mondial ca avnd
implicaii n patologia uman.
Serogrupele o
8
, o
15
, o
20
sunt implicate n patologia animal n septice-
miile nou-nscuilor.
Studiul factorilor de patogenitate prin reacia de seroaglutinare rapid
(RSAR) i latex aglutinare, cu un kit fimbrirex K
99
, f
41
ne-au permis
evidenierea prezenei fmbriilor de tip f
41
la o tulpin nencadrabil
serologic, izolat din carnea tocat.
datele din literatura de specialitate arat c tulpinile cu astfel de
fmbrii sunt tot mai frecvent implicate n forma enteric de colibaciloz la
viei, porci i miei.
Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul ansei ligaturate la purcelul
sugar/nrcat a unui numr de 5 tulpini de E. coli nu a evideniat prezena
enterotoxinelor termostabile (ST) sau a enterotoxinei termolabile (lT).
Testarea activitii hemolitice ne-a permis identifcarea a dou tulpini
(23,52%), una nencadrabil, izolat din carnea de mici i una aparinnd
serogrupei o
10
izolat din salam.
Activitatea de producere a hidrogenului sulfurat a fost identifcat la 10
probe (11,76%) din cele 85 analizate i la 2 probe (23,52%) din tampoanele
de pe utilaje i minile lucrtorilor.
Tulpinile de E. coli productoare de h
2
S nu au fost identifcate n
produsele fnite. Se cunoate c hidrogenul sulfurat determin o cretere
a motilitii intestinale, putnd determina deranjamente gastro-intestinale,
att la om, ct i la animale.
din studiul efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar i
INCdmI Cantacuzino s-au desprins urmtoarele concluzii:
Probele testate au fost reprezentate de carne de porc, vit, slnin, 1.
salamuri, carne tocat, past de mici, din diferite uniti de desfacere a
acestora.
Pentru examenul serologic al tulpinilor de 2. E. coli izolate au fost
ncadrate serologic un numr de 18 tulpini (21,17%) din cele 85 de tulpini
izolate. Serogrupele identifcate au fost: o
7
(11,11%), o
8
(55,55%), o
10

112
(55,55%), o
15
(55,55 %), o
20
(55,55%).
Examenele bacteriologice efectuate din carnea de bovin i porcin 3.
(materie prim), din unele preparate i semipreparate din carne, au condus
la izolarea i identifcarea unor serotipuri de E. coli enteropatogene.
mediile folosite n cadrul testrii prezumptive au fost reprezentate 4.
de: bulionul glucozat (B.G.) i mediul levine (GEAm).
Prin testarea tulpinilor pentru evidenierea fmbriilor s-a constatat 5.
prezena fmbriilor de tip f
41
la o tulpin nencadrabil serologic, izolat din
carnea tocat.
Studiul prezenei enterotoxinelor prin testul de ans ligaturat la 6.
purcel sugar sau nrcat, la un numr de 5 tulpini de E. coli nu au evideniat
prezena enterotoxinelor lT (termolabil) sau ST (termostabil).
Prezena activitii hemolitice a fost constatat la dou tulpini de 7.
E. coli (23,52%) din carne de mici i din salam.
Au fost identifcate n produsele fnite 10 tulpini de 8. E. coli (11,76%)
productoare de hidrogen sulfurat.
Pentru testele de confrmare s-au folosit un agar nutritiv nclinat, 9.
bulion-bil-lactoz-verde-briliant (BBlV) i ap tripeptonat.
113
dETErmInArEA COLIfOrmILOr TOTALI
1. Se amestec
proba alimentar
ntr-un blender
rotativ de nalt
vitez.
2. Se dilueaz
omologatul de
prob alimentar.
3. Test prezump-
tiv. Se incubeaz
la 35C pentru
24-48 de ore
4. Test de confir-
mare.
Se incubeaz la
35C 48 de ore
5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz mPN din tabele.
50 g aliment se amestec la
10.000-12.000 RPm pentru 2 minute
450 g diluant tampon fosfat
Butterfield
90 ml
diluant
Bulion lauril-triptoz
Bulion BGB 2%
dETErmInArEA COLIfOrmILOr TOTALI
1. Se amestec
proba alimentar
ntr-un blender
rotativ de nalt
vitez.
2. Se dilueaz
omologatul de
prob alimentar.
3. Test prezump-
tiv. Se incubeaz
la 35C pentru
24-48 de ore
4. Test de confir-
mare.
Se incubeaz la
35C 48 de ore
5. Interpretare: Se numr tuburile gaz-pozitive i se calculeaz mPN din tabele.
50 g aliment se amestec la
10.000-12.000 RPm pentru 2 minute
450 g diluant tampon fosfat
Butterfield
90 ml
diluant
Bulion lauril-triptoz
Bulion BGB 2%
114
Escherichia coli o157:h7. microscopie electronic
Escherichia coli o157:h7. Se remarc prezena fagelilor i a fmbriilor.
115
Escherichia coli o157:h7. microscopie electronic - Suh (sindromul urohemolitic)

Escherichia coli. Coloraia Gram.
Preparat din cultur

Escherichia coli. Coloraia Gram.
Preparat din cultur


Escherichia coli.
Coloraia Gram. Preparat din cultur

Escherichia coli.
Coloraia Gram. Preparat din cultur
116


mediul mac Conkey.
Colonii lactoz pozitive, roz-mate
Mediul Leifson. Colonii roii de
Escherichia coli.

mediul mac Conkey.
Colonii lactoz pozitive, mucoide.
Identifcate cu ajutorul testului API pentru
diferenierea de Klebsiella pneumoniae

Plac cu agar mac Conkey inoculat
cu Escherichia coli (lactoz
pozitiv) i Serratia marcescens
(lactoz negativ, de culoare rou
aprins)
117
Bibliografe selectiv
Baylis, C. l., Penn, C. W., Thielman, N. m., Guerrant, R. l., Jenkins, C. and 1.
Gillespie, S. h., 2006. Escherichia coli and Shigella spp., In Principles and Practice of
Clinical Bacteriology. Second Edition. S. h. Gillespie and P. m. hawkey Eds., John Wiley
& Sons ltd, london: p 347-365.
Caprioli A, morabito S, Brugre h, oswald E., 2005. Enterohaemorrhagic 2.
Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. Vet Res. 2005.
36(3):289-311.
Chen Q, Savarino SJ, Venkatesan mm., 2006, Subtractive hybridization and 3.
optical mapping of the enterotoxigenic Escherichia coli h10407 chromosome: isolation
of unique sequences and demonstration of signifcant similarity to the chromosome of
Escherichia coli K-12. microbiology. Apr;152(Pt 4):1041-54.
Cheryl l. Tarr, Adam m. Nelson, lothar Beutin, Katharina E. P. olsen, and 4.
Thomas S. Whittam. 2008, molecular Characterization Reveals Similar Virulence Gene
Content in unrelated Clonal Groups of Escherichia coli of Serogroup o174 (ox3) J.
Bacteriol. 2008 190: 1344-1349.
de Sablet T, Bertin Y, Vareille m, Girardeau JP, Garrivier A, Gobert AP, martin 5.
C., 2008., differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia
coli belonging to seropathotypes A and C., microbiology. 154:176-86.
devasia RA, Jones Tf, Ward J, Stafford l, hardin h, Bopp C, Beatty m, mintz 6.
E, Schaffner W., 2006. Endemically acquired foodborne outbreak of enterotoxin-producing
Escherichia coli serotype o169:h41. Am J med. 2006 feb;119(2):168.e7-10.
donnenberg, m. S., 2002, 7. Escherichia coli virulence mechanisms of a versatile
pathogen, london, Academic Press.
duffy, G., Garvey, P. and mcdowell, d. A., 2001, Verocytotoxigenic 8. Escherichia
coli, Trumbull, Connecticut, food & Nutrition Press Inc.
EfSA, 2007, monitoring of verotoxigenic 9. Escherichia coli (VTEC)
andidentifcation of human pathogenic VTEC types, Scientifc opinion of the Panel on
BIoloGICAl hAzARdS (Question No EfSA-Q-2007-036) The EfSA Journal.
Kaper, J. B. and oBrien, A. d., 1998, 10. Escherichia coli o157:h7 and other
Shiga toxin-producing Escherichia coli strains, Washington d.C, ASm Press.
Karmali, m. A., 2003, The medical signifcance of Shiga toxin-producing 11.
Escherichia coli infections. An overview. methods mol. med. 73: 1-7
le Gall T, darlu P, Escobar-Pramo P, Picard B, denamur E., 2005, Selection- 12.
driven transcriptome polymorphism in Escherichia coli/Shigella species. Genome Res.
feb;15(2):260-8.
morabito S, Karch h, mariani-Kurkdjian P, Schmidt h, minelli f, Bingen E, 13.
Caprioli A., 1998, Enteroaggregative, Shiga toxin-producing Escherichia coli o111:h2
118
associated with an outbreak of hemolytic-uremic syndrome. J Clin microbiol. 1998.
36(3):840-2.
Nataro J. P. and Kaper, J. B., 1998, diarrheagenic 14. Escherichia coli. Clin.
microbiol. Rev. 1998. 11(1): 142-201.
Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. Bergeys manual of 15.
systematic bacteriology. G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds.
New York, NY, Springer,: 607-624.17
Scheutz, f. and Strockbine, N. A., 2005, Escherichia. In Bergeys manual of 16.
systematic bacteriology, G. m. Garrity, d. J. Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley Eds. New
York, NY, Springer,: 607-624.
Scheutz, f., Beutin, l., Pierard, d. and Smith, h. R., 2001, Nomenclature of 17.
Vero cytotoxins. In Verocytotoxigenic Escherichia coli, G. duffy, P. Garvey and d. A.
mcdowell Eds. Trumbull, Connecticut, food and Nutrition Press Inc: 447-452. 16
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 18.
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 19.
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere 20.
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6;
ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor 21.
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor 22.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor 23.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978- 24.
973-736-090-8
Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, 25.
ISBN: 978-973-736-089-2
Sussman, m., 1997, 26. Escherichia coli, mechanisms of virulence, Cambridge,
Cambridge university Press.
Welch RA, Burland V, Plunkett G 3rd, Redford P, Roesch P, Rasko d, Buckles 27.
El, liou SR, Boutin A, hackett J, Stroud d, mayhew Gf, Rose dJ, zhou S, Schwartz dC,
Perna NT, mobley hl, donnenberg mS, Blattner fR, 2002, Extensive mosaic structure
revealed by the complete genome sequence of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl
Acad Sci u S A. dec 24;99(26):17020-4.
Wick lm, Qi W, lacher dW, Whittam TS, 2005, Evolution of genomic 28.
content in the stepwise emergence of Escherichia coli o157:h7, J Bacteriol. mar;
187(5):1783-91.
119
Wickham, m. E., lupp, C., mascarenhas, m., Vazquez, A., Coombes, B. K., 29.
Brown, N. f., Coburn, B. A., deng, W., Puente, J. l., Karmali, m. A. and finlay, B.
B, 2006, Bacterial genetic determinants of non-o157 STEC outbreaks and hemolytic-
uremic syndrome after infection. J. Infect. dis. 194(6): 819-827
Yang J, Nie h, Chen l, zhang x, Yang f, xu x, zhu Y, Yu J, Jin Q., 2007, 30.
Revisiting the molecular evolutionary history of Shigella spp. J mol Evol. Jan;64(1):71-9.
Erickson, J.P., J.W. Stamer, m. haycs, d.N. mcKenna, and l.A. van Alstine. 31.
1995. An assessment ol Escherichia ,,,/, 0157:h7 contaniinaiion risks in commercial
mayonnaise Iroin pasicurized eggs and environmcntal sourccs. and behavior in Iow-ph
dressings. J. foodProtect. 58:1059-1064.
fenton, l.l., l.W. hand, T.G. Rehberger, f.K. Ray, and T.G. harbolt. 1995. 32.
fate of Escheruhia coli ol 57:h7 in theniially processed low fat ground becf pattics. Proc.
Inst. food Technol. 36.
ficlding, l.m., P.E. Cook, and A.S. Grandison. 1994. The effecl of electron 33.
beam irradiation and modifed ph on the survival and recovery of Escherichia coli. J. Appl.
Bacteriol. 76:412-416.
fisher, T.l., and d.A. Golden. 1998. fate of 34. Escherichia coli ol57:h7 in ground
apples used in cider production. /. food Proiect. 61:1372-1374.
frantz, J.C., l. Jaso-fricdman, and d.C. Robertson. 1984. Binding of 35.
Escherichia coli heat-stable enterotoxin to rat intestinal cells and brush border membranes.
Infect. Immun. 43:622-630.
Glass, K.A., J.m. loeffelholz, J.P. ford, and m.P. doyle. 1992. fate of 36.
Escherichia coli 0157:h7 as affected by ph or sodium chloride and in fermented, dry
sausage. Appl. Environ. microbiol. 58:2513-2516.
Gonthier, A., V. Gue>in-faublee, B. Tilly, and m.-l. delignette-muller. 2001. 37.
optimal growth temperature of 0157 and non-0157 Escherichia coli strains. lett. Appl.
microbiol. 33:352-356.
Griffn, P.m., and R. V. Tauxe. 1991. The epidemiology of infections caused by 38.
Escherichia coli 0157:h7, other enterohe-morrhagic Escherichia coli, and the associated
hemolytic uremie syndrome. Epidemiol. Rev. 13:60-98.
Gross, R.J.. l.V. Thomas, T. Cheasty, N.P. day, B. Rowe, m.R.f. Toledo, and 39.
l.R. Trabulsi. 1983. Enterotoxigenic and enteroinvasive Escherichia coli strains belonging
to a new o Group, 0167. J. Clin. microbiol. 17:521-523.
herriott, d.E., d.d. hancock, E.d. Ebel, l. V Carpenter, d.h. Rice, and TE. 40.
Besser. 1998. Association of hercl man agement factors with colonization of dairy cattle by
Shiga toxin-positive Escherichia coli 0157../. food Proiect. 61:802-807.
hitotsubashi, S., Y. fujii, and K. okamota. 1994. Binding protein for 41. Escherichia
coli heat-stable enterotoxin II in mouse intestinal membrane. fEmS microbiol. lett.
122:297-302.
hitotsubashi. S., Y. fujii. and h. Yamanaka. 1992. Some properties of purifed 42.
120
Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect Immun. 60:4468-4474.
harrison, J., and m. harrison. 1995. fate of 43. Escherichia coli 0157.h7, Listeria
monocytogenes, and Salmonella Ty-phimurium during preparation and storage of becf
jerky. Proc. Inst. food Technol. 30.
hathcox, A.K., l.R. Beuchat, and m.P. doyle. 1995. death of enterohemorrhagic 44.
Escheruhia coli 0157:h7 in real mayonnaise and reduced-caloric mayonnaisc dressing
as infuenced by iniial population and storage temperature. Appl. Environ. microbiol.
61:4172-4177.
hobbs, B.C., m.E.m. Thomas, and J. Taylor. 1949. School outbreak of 45.
gastroenteritis associated with a pathogenic paracolon bacillus. lancet 2:530-532.
Itoh, Y., Y. Sugita-Konishi, f. Kasuga, m. Iwaki, Y. hara-Kudo, N. Saito, Y. 46.
Noguchi, h. Konuma, and S. Kumagai. 1998. Enterhemorrhagic Escherichia coli 0157:h7
present in radish sprouts. Appl. Environ. microbiol. 64:1532-1535.
Janisiewicz, W.J., W.S. Conway, m.W. Brown, G.m. Sapcrs, R fratamico, and 47.
R.l. Buchanan. 1999. fate of Escherichia coli 0157:h7 on fresh-cut apple tissuc and its
potenial for transmission by fruit fies. Appl. Environ. microbiol. 65:1-5.
Jordan, d., and S.A. mcEwen. 1998. Effect of duration of fasting and a short- 48.
term high-roughage ration on the concentration of Escherichia coli biotype 1 in cattle
feces. J. food Proiect. 61:531-534.
Karch, h., h. Russmann, h. Schmidt, A. Schwarzkopf. and J. heeseman. 1995. 49.
long-term shedding and clonal turnover of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:h7
in diarrheal diseases. J. Clin. microbiol. 33:1602-1605.
Klipstein, f.A., R.f. Engert, and R.A. houghten. 1983. Properties of synthetically 50.
produced Escherichia coli heat-stable enterotoxin. Infect. Immun. 39:117-121.
Konowalchuk, J., J.l. Speirs, and S. Stavric. 1977. Vero response to a cytotoxin 51.
of Escherichia coli. Infect. Immun. 18:775-779.
Kudva, I.T., K. Blanch, and C.J. hovde. 1998. Analysis of 52. Escherichia coli
0157:h7 survival in ovine or bovine manure and manure slurry. Appl. Environ. microbiol.
64:3166-3174.
Kunkel, S.l., and d.C. Robertson. 1979. Purifcation and chemical 53.
characterization of the heat-labile enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia
coli. Infect. Immun. 25:586-596.
lallier, R., S. lariviere, and S. St-Pierre. 1980. 54. Escherichia coli heat-stable
enterotoxin: Rapid method of purifcation and some characteristics of the toxin. Infect.
Immun. 28:469-474.
lee, C.h., S.l. moseley. h.W. moon, S.C. Whipp. C.l. Gyles, and m. So. 55.
1983. Characterization of ihe gene encoding heat-stahle toxin II and prelitninary molecular
epidomiological siudies of tnttrotoxigenic Escherichia coli heat-stahle toxin II producers.
Infei i Immun. 42:264-268.
leJeune, J.T.. T.E. Besser. d.h. Rice. J.l. Berg. R.P. Stilborn, and d.d. hancock. 56.
121
2004. longitudinal study ol fecal shedding of Escherichia coti ()157:h7 in feedlot cattle:
Predominante and persistence of specifc clonal typcs despite massive cattle population
turnover. Appl. Environ mu robioi. 70:377-384.
leyer. G.J.. l.-l. Wang. and E.A. Johnson. 1995. Acid adaptation of 57. Escherichia
coli 0157:h7 increases survival in acidic foods. Appl. Environ. microbiol. 61:3752-3755.
line. J.E.. A.R. fain, Jr.. A.B. moran. l.m. martin. R.V. lechowich, J.m. 58.
Carosella, and W.l. Brown. 1991. lethality of heat to Escherichia coli 0157:h7: d-value
and r-value determinations in ground beef. J. food Protect. 54:762-766.
lior. h. 1994. 59. Escherichia coli0\51\hl and verotoxigenic Escherichia coli
(VTEC). dairy food Environ. Sanil. 14:378-382.
louise, CB., S.A. Kaye. B. Boyd, CA. lingwood, and T.G. obrig. 1995. Shiga 60.
toxin-associated hemolytic uremie syndrome: Effect of sodium butyrate on sensitivity of
human umbilical vein endothelial cells to Shiga toxin. Infect. Immun. 63:2766-2769.
machino. h.. K. Araki, S. minami, T. Nakayama, Y. Ejima. K. hiroe, h. Tanaka, 61.
N. fujita, S. usami, m. Yonekawa. K. Sadamoto, S. Takaya, and N. Sakai. 1998. Recent
outbreaks of infections caused by Escherichia coli ol57:h7 in Japan. In Escherichia coli
0157.h7 and other Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Strains, ed. J.B. Kaper and
A.d. oBrien, 73-81. Washington. dC: ASm Press.
marier. R., J.G. Wells, R.C Swanson, W. Callahan. and I.J. mehlman. 1973. 62.
An outbreak of enteropathogenic Escherichia coli foodborne disease traced to imported
french cheese. lancet 2:1376-1378.
mazaitis, A.J., R. maas. and W.K. maas. 1981. Structure of a naturally occurring 63.
plasmid with genes for enterotoxin production and drug resistance. J. Bacteriol. 145:97-
105.
merson. m.h., f. orskov. I. orskov. R.B. Sack. I. huq. and f.T. Koster. 1979. 64.
Relationship between enterotoxin production and serotype in enterotoxigenic Escherichia
coli. Infect. Immun. 23:325-329.
montenegro, m.A., m. Buhe. T. Trumpf, S. Aleksic, G. Reuter, E. Bulling, and 65.
R. helmuth. 1990. detection and charac terization of fecal verotoxin-producing Escherichia
coli from healthy cattle. J. Clin. microbiol. 28:1417-1421.
mundell. d.h., C.R. Anselmo, and R.m. Wishnow. 1976. factors infuencing 66.
heat-labile Escherichia coli enterotoxin activity. Infect. Immun. 14:383-388.
Neill. m. A.. P.I. Tarr. d.N. Taylor. and m. Wolf. 2001. Escheru hia coli. In 67.
foodborne disease handbook: diseases Caused by Bacteria, ed. Y.h. hui. m.d. Pierson,
and J.R. Gorham, 2nd ed., 169-212. New York: marcel dekker.
oBrien. A.d., m.R. Thompson. J.R. Cantey. and S.B. formal. 1977. Production 68.
of Shigella dysenteriae-uke toxins by pathogenic Escherichia coli. Abstr.. Amer. Soc.
microbiol. 32.
oBrien, A.d.. and R.K. holmes. 1987. Shiga and Shiga-like toxins. 69.
microbiol. Rev. 51:206-220.
122
oBrien, A.d.. V.l. Tesh, A. donohue-Rolfe, mP Jackson, S. olsnes, K. 70.
Sandvic, A.A. lindberg, and G.T. Keusch. 1992. Shiga toxin: Biochemistry, genetics,
mode of action, and role in pathogenesis. Curr. Top. microbiol. Immunol. 180:65-94.
oelschlaeger, T.A., T.J. Barrett, and d.J. Kopecko. 1994. Some structures and 71.
processes of human epithelial cells involved in uptakc of enterohemorrhagic Escherichia
coli 0157:h7 strains. Infect. Immun. 62:5142-5150.
omisakin, f. m. macRae, I.d. ogden, and N.J.C Strachan. 2003. Concentration 72.
and prcvalence of Escherichia coli 0157:h7 in cattle feces at slaughter. Appl. Environ.
microbiol. b9\2444-2<WI.
0rskov. I., f. 0rskov, B. Jann. and K. Jann. 1977. Serology, chemistry, and 73.
genetics of o and K antigens of Escherichia coli. Bacteriol. Rev. 41:667-710.
ostroff, S.m., P.I. Tarr. m.A. Neill, J.h. lewis, N. hargrett-Bean, and J.m. 74.
Kobayashi. 1989. Toxin genotypes and plasmid profles as determinants of systemic
sequelae in Escherichia coli ()157:h7 infections. J. Infect. dis. 160:994-998.
Palumbo. S.A., J.E. Caii. f.J. Schultz, and A.C. Williams. 1995. minimum and 75.
maximum temperatures for growth and verotoxin production by hemorrhagic strains of
Escherichia coli../. food Protect. 58:352-356.
Park. S.. R.W. Worobo, and R.A. durst. 1999. 76. Escherichia coli 0157:h7 as an
emerging foodborne pathogen: A literatura review. Crit. Rev. fd. Sa Nutr. 39:481-502.
70 Picken, R.N.. A.J. ma/aitis. W.K. maas. m. Rey, aud II heyneker. 1983. 77.
Nuclcotide sequence ofthe gene lor hcat-stable enterotoxin II of Escherichia coli. Infect
Immun. 42:269-275.
123
CAPITOLUL 3
ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL YErSInIA
n PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE
3.1. Caractere generale
A fost constituit n 1944 la propunerea lui Van loghem.
Cuprinde 13 specii, dintre care, cele mai importante n patologia
veterinar i uman sunt: Yer. pseudotuberculosis (cu dou subspecii:
pseudotuberculosis i pestis), Yer. pestis, care este agentul etiologic al ciumei
la om; Yer. pseudotuberculosis, care produce yersinioza la multe specii de
animale; Yer. enterocolitica (subsp. enterocolitica i palearctica), care este
agentul etiologic al unei enterite grave la om i animale, dar care se izoleaz
i din intestinul porcilor sntoi; Yer. ruckeri, care produce la salmonide
infecia numit gura roie.
Bacterii din genul Yersinia, sunt Gram negative, au form bacilar,
sunt facultativ anaerobe, imobile la 37C, mobile la 25-30C (cu excepia
lui Yer. pestis i Yer. ruckeri, care sunt ntotdeauna mobile). Sunt oxidaz
negative, catalaz pozitive, testul Voges-Proskauer negativ la 37C, nu
produc hidrogen sulfurat, nu fermenteaz lactoza, ureaz pozitivi.
Se dezvolt pe medii de cultur ca: snge, mac Conkey, bulion-cord,
agar SS, la temperatura camerei sau la 39C i n ser fziologic, tamponat,
la 4C.
Coloniile sunt foarte mici, dup 24 de ore, dar bine vizibile dup 48
de ore.
3.2. Epidemiologie
n 2006, au fost confrmate 9.067 cazuri de yersinioz uman din
9.075 notifcri provenide de la 25 state (frana, Grecia, olanda, Romnia
i liechtenstein nu au raportat). Aceste notifcri sunt cu 4,5% mai mici
dect cele raportate cu un an n urm de ctre aceleai state. Rata medie a
notifcrilor pentru 2006 a fost 2,3 la 100.000 locuitori.
distribuia yersiniozelor pe grupe de vrst i sex.
124
Aceast distribuie a fost furnizat de 19 state pentru un total de 8.608
(95%) cazuri raportate. Cel mai afectat grup a fost grupa de vrst 0-4
ani cu 2.799 (31%) cazuri, tot acest grup a avut i cea mai mare rat a
notifcrilor, respectiv de 14,8 la 100.000.
Figura 3.1.
distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de yersinioz n 2006 (8608cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
/
1
0
0
.
0
0
0
Informaiile referitoare la sexul persoanelor afectate au fost diponibile
la 8.646 (95,3%) din cazuri. Analiza acestora nu a scos n eviden diferene
semnifcative ntre brbai (2,4 la 100.000) i femei (2,1 la 100.000).
Sezonalitatea
Cazurile de yersinioz nu expun un adevrat tipar sezonier, chiar dac
majoritatea cazurilor au fost raportate spre a doua jumtate a anului 2006.
Tabelul 3.1.
numrul i rata notifcrilor yersiniozelor non-holerice raportate n UE i EEA/
EfTA n 2006
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Austria C
158 158 1.9
Belgia C
264 264 2.5
Bulgaria C
5 5 0.06
Cipru U
0 0 0.0
125
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Republica Ceh C 535 534 5.2
Danemarca C 215 215 4.0
Estonia C 42 42 3.1
Finlanda C 795 795 15.1
Frana U - - -
Germania C 5161 5161 6.3
Grecia U - - -
Ungaria C 38 38 0.38
Irlanda C 1 1 0.1
Italia U 0 0 0.0
Latvia C 94 92 4.0
Lituania A 411 411 12.1
Luxembourg C 5 5 1.1
Malta U 0 0 0.0
Olanda U - - -
Polonia C 110 110 0.29
Portugalia U 0 0 0.0
Romnia U - - -
Slovacia C 83 82 1.5
Slovenia C 80 76 3.8
Spania C 375 375 0.86
Suedia C 558 558 6.2
Marea Britanie C 59 59 0.10
Total UE 8989 8981 2.4
Islanda C 0 0 0.0
Liechtenstein N - - -
Norvegia C 86 86 1.9
Total 9075 9067 2.3
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate
pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecifcat
126
Figura 3.2.
distribuia sezonier a cazurilor de VTEC/STEC n EU i EEA/EfTA n 2006
(n=8660) (Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
Ian Feb Mar Apr Mai Iun Iul Aug Sep Oct Nov Dec
C
a
z
u
r
i
Investigaiile efectuate pentru evaluarea incidenei Yersinia spp. la
diferite tipuri de animale i produse alimentare, inclusiv carne de porc i vit
au artat c Y. enterocolitica este identifcat rar. Izolarea i identifcarea Y.
enterocolitica creaz o serie de probleme, ntruct identifcarea tulpinilor
virulente pentru oameni solicit att stabilirea biotipului, ct i a serotipului.
n Europa cea mai frecvent izolat Y. enterocolitica este biotipul 4 (serotip
o:3) i, mai rar biotipul 2 (serotip o:9).
3.3. Specii ale genului Yersinia implicate
n toxiinfeciile alimentare
3.3.1. Yersinia pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis
(Pasteurella pseudotuberculosis)
Istoric
Germenul a fost descris n 1883 de malassez i Vignal, care
inoculeaz la cobai materialul patologic din leziunea unui copil i reproduc
o infecie asemntoare morfopatologic cu tuberculoza. Pfeiffer (1889) a
fost primul care a descris Bacillus pseudotuberculosis, pe care l-a rebotezat
Pasteurella pseudotuberculosis, n 1929. n 1935 a fost denumit Shigella
pseudotuberculosis, iar Smith i Thal (1965) au plasat-o n genul Yersinia.
127
morfologie
Bacterie Gram negativ, de 0,8-6/0,8 microni, pleomorf mai frecvent
cocobacilar cu tendin de coloraie bipolar.
Necapsulogen, nesporogen, prezint fageli peritrichi, cnd este
cultivat la 28-30C.
Condiii de cultivare i caractere culturale
Crete bine pe medii de cultur uzuale n aerobioz. Pentru izolarea
din materiale patologice cu for bacterian mixt se utilizeaz mediul lui
morris, n compoziia cruia intr substane care i confer selectivitatea,
cum ar f eritromicina, novobiocina, teluritul de potasiu.
Pe agar dezvolt la 37C n 24 de ore colonii de 1-1,5 milimetri,
care n 48 de ore ating 2-3 milimetri. Acestea sunt rotunde, uor granulate,
translucide i cu centrul opac, avnd un aspect striat la periferia coloniei.
Proprieti biochimice
fermenteaz glucoza fr producia de gaz, nu produc hidrogen
sulfurat, nu fermenteaz lactoza. la 37C este imobil (mediul mIlf se
tulbur numai dup meninerea 24 de ore la temperatura camerei).
Nu produce indol, lizindecarboxilaz i fenilalanin-deaminaz.
Nu cresc pe mediul cu citrat (Simmons), nu scindeaz malonatul,
produce ureaz i beta galactozidaz.
Tabelul 3.2.
diferenierea biochimic a speciilor de Yersinia
(dup fanner, 1995)
Yersinia spp.
m
o
b
i
l
i
t
a
t
e
a

l
a

3
7

C
a
O
r
n
i
t
i
n
-

d
e
c
a
r
b
o
x
i
l
a
z

U
r
e
a
z

I
n
d
o
l
Z
a
h
a
r
o
z

r
a
m
n
o
z

C
e
l
o
b
i
o
z

S
o
r
b
i
t
o
l
S
a
l
i
c
i
n

Yer. pestis 0 0 5 0 0 1 0 50 70
Yer. pseudotuberculosis 0 0 95 0 0 70 0 0 25
Yer. enterocolitica 2 95 75 50 95 1 75 99 20
Yer. frederiksenii 5 95 70 100 100 99 100 100 92
Yer. ruckeri 0 100 0 0 0 0 5 50 0
128
Yersinia spp.
m
o
b
i
l
i
t
a
t
e
a

l
a

3
7

C
a
O
r
n
i
t
i
n
-

d
e
c
a
r
b
o
x
i
l
a
z

U
r
e
a
z

I
n
d
o
l
Z
a
h
a
r
o
z

r
a
m
n
o
z

C
e
l
o
b
i
o
z

S
o
r
b
i
t
o
l
S
a
l
i
c
i
n

Yer. kristensenii 5 92 77 30 0 0 100 100 15

Yer. mollaretii 0 80 20 0 100 0 100 100 20
Yer. bercovierii 0 80 60 0 100 0 100 100 20
Yer. rohdei 0 25 62 0 100 0 25 100 0
Yer. aldovae 0 40 60 0 20 0 0 60 0
Yer. intermedia 5 100 80 100 100 100 96 100 100
a)
Cu excepia Yer. pestis, toate speciile sunt mobile la 25C
Proprieti antigenice
Posed antigene somatice o i antigene fagelare h, pe baza
crora specia este divizat n 8 serogrupuri majore, dintre care unele sunt
subdivizate n subgrupe, fecare cu mai multe serotipuri.
Subspecia pseudotuberculosis prezint antigene comune cu subspecia
pestis, salmonelele din grupele B, d i Escherichia coli. Nu exist
nrudiri antigenice ntre Yer. pseudotuberculosis i Yer. enterocolitica.
Identifcarea antigenic prin aglutinare cu ser anti Yer. pseudotuberculosis
tip 1 (serovarurile dominante n ara noastr) confrm apartenena de gen
i specie.
Comportarea fa de factorii de mediu
Yer. pseudotuberculosis este o bacterie sensibil la aciunea factorilor de
mediu fzici i chimici i a dezinfectantelor obinuite n concentraii uzuale.
Cele mai active antibiotice sunt streptomicina, neomicina, tetraciclina.
Ecologie
Rezervorul natural al acestei bacterii l constituie roztoarele i psrile
slbatice, de unde ajunge n sol i n apele de suprafa, unde supravieuiete
chiar i la temperaturi joase. la om, ajunge pe cale alimentar, find cauza
unor enterite subacute, nsoite de adenopatie mezenteric ce poate mima
apendicita.
129
Patogenitate
Ajunse n tubul digestiv, yersiniile se multiplic n mucoasa intestinal,
producnd focare infamatorii n lamina propria i nodurile limfatice aferente,
sub form de microabcese determinnd atroferea vilozitilor intestinale.
Ca rezultat se produce malabsorbie, maldigestie i uneori diaree.
Virulena bacteriilor depinde de antigenele V i W, care determin
dependena de calciu, cnd sunt cultivate la 37C.
Tulpinile patogene sunt rezistente la complementul seric, ptrund n
celulele epiteliale umane (celulele he la), sunt letale pentru oarecii de
laborator i prezint citotoxicitate.
factorii de virulen sunt codifcai de plasmida de 70 Kdal. Acetia
sunt reprezentai de o protein-kinaz i de o protein din membrana extern
(YoP = yersinia outer membrane protein), care inhib fagocitoza.
Bacteria ptrunde n celulele eucariote folosind o protein de suprafa
(invaziv), codifcat de o gen cromozomal.
multe tulpini produc o toxin termostabil similar cu cea generat de
Escherichia coli. Aceasta prezint importan (cnd este eliberat la 22C)
n producerea diareei.
Germenul mai produce i o endotoxin, lPS, cu proprieti biologice
similare ce cele provenite de la alte bacterii Gram negative.
Infecia natural. mbrac forme anatomoclinice variate, care
prezint urmtoarele trsturi comune:
calea digestiv de contaminare; 5
caracterul sezonier; 5
incidena mare n anotimpurile reci i umede; 5
afectarea constant a ganglionilor mezenterici; 5
prezena unor noduli pseudotuberculoi asemntori cu cei 5
din tuberculoz, cu centrul necrotic cazeos, cu sau fr tendin de
ncapsulare;
evoluia latent a infeciei evideniabil numai prin examen 5
serologic.
Infecia natural poart denumirea de yersinioz (pseudotuberculoz
sau rodenioz), find mai frecvent la roztoare, dar afecteaz i multe specii
de animale i omul. Se caracterizeaz prin slbire progresiv, adenopatie i
formare de noduli cazeoi n diverse organe i pe seroase.
la iepure i cobai, yersinioza se manifest prin apariia de leziuni
nodulare n ganglionii limfatici, fcat, splin, rinichi, plmni, cu tendin
de transformare n abcese.
130
Infecia are un caracter contagios i o evoluie enzootic. obolanul i
oarecele reprezint un important rezervor natural, find purttori.
mai sunt receptive: pisica, vulpea argintie, maimua, caprinele,
bovinele, iar ovinele se infecteaz sporadic. omul se contamineaz rar, cu
tendin de diseminare septicemic, care este urmat de cele mai multe ori
de sechele renale.
Infecia experimental. Animalele de laborator sensibile sunt cobaiul
i iepurele, indiferent de calea de inoculare, tabloul anatomoclinic find
foarte asemntor cu cel din infecia natural.
3.3.2. Yersinia enterocolitica
Yer. enterocolitica a fost izolat pentru prima dat de mc Iver i Pike, n
1943, iar n 1964 frederiksen a propus actuala denumire a acestei bacterii.
n cadrul speciei au fost recunoscute dou subspecii, enterocolitica i
palearctica i cinci chimiotipuri (biotipuri), care cuprind aproximativ 27 de
serotipuri. unele chimiotipuri produc indol i dau testul VP pozitiv.
Yer. enterocolitica posed factori de virulen i toxicitate ca
enterotoxinele termostabile (ST), asemntoare cu cele de la Escherichia
coli i factori de adeziune.
Yer. enterocolitica nu produce un siderofor pentru transportul ferului,
necesar n cretere i multiplicare, dezvoltndu-se mai bine n prezena altor
bacterii, care posed aceast capacitate.
Endotoxinele sunt responsabile, ca i n cazul colibacililor de
producerea exorbiei i, n ultim instan, a diareei.
Acestea sunt elaborate att in vitro ct i n alimentele pstrate
la temperatura mediului ambiant sau la frigider, conducnd la apariia
toxiinfeciilor alimentare.
Pe baza antigenelor somatice i fagelare au fost identifcate 50 de
serotipuri, dintre care unele (0:9) posed antigene comune cu brucelele
i reacioneaz ncruciat cu Brucella spp. la RAl i RfC (reacii fals
pozitive).
Germenul este foarte rezistent n alimentele de origine animal, la
temperatura de refrigerare i la ph acid. Este sensibil la aciunea substanelor
dezinfectante n concentraii uzuale, la antibiotice i chimioterapice cu
spectru larg, printre care: gentamicina, cloramfenicolul, clotrimazolul,
acidul nalidixic.
Infeciile cu Yer. enterocolitica se ntlnesc la bovine, ovine, cabaline,
caprine, porcine, cmile, cini. dintre animalele domestice afecteaz, mai
ales, tineretul ovin sub un an, porcii, cini, pisicile.
131
la om infecia cu Yer. enterocolitica se produce cel mai adesea
cu tipurile 0:3, 0:5, 0:8, 0:9, de origine porcin, care se manifest prin
enterocolite, mai rar prin septicemie.
Ca rezultat al numrului mare de specii care constituie rezervorul
natural de Yer. enterocolitica, n natur i a incidenei ridicate a purttorilor,
sursele de infecie secundare contaminate cu fecale, cum sunt punile, apele
de suprafa, furajele, apa de but, alimentele, ocup veriga intermediar
n circuitul epidemiologic al yersiniilor n natur i animalul receptiv sau
omul.
3.4. Specii zoonotice din genul Yersinia
3.4.1. Yersinia enterocolitica cu serotipurile 03, 05, 27, 08, 09
i Yersinia pseudotuberculosis
Sunt cei doi ageni zoonotici ai yersiniozei umane.
Prin studiile de hibridare dNA s-a demonstrat c ntre Yer.
pseudotuberculosis i Yer. pestis exist o strns nrudire, astfel nct, bacilul
pestei a fost redenumit Y. pseudotuberculosis subsp. pestis.
n ceea ce privete ns epidemiologia i rezervoarele de infecie cele
dou infecii sunt diferite la om.
Infecia uman cu Yer. enterocolitica a fost descris pentru prima dat
n 1939 de ctre Schleifstein i Coleman.
n 1963, daniels o denumete Pasteurella x, iar n 1964 frederiksen
o adaug genului Yersinia.
n 1975, s-au raportat aproximativ 6000 de cazuri n toat lumea. Cele
mai multe au fost descrise n Scandinavia, Europa, Canada i SuA.
Gazdele principale de Yer. enterocolitica sunt reprezentate de ctre
porci, roztoare, iepuri, oi, capre, bovine, cai, cini i pisici, bacteria gsindu-
se n orofaringele i lumenul tractului gastrointestinal al acestor animale. n
cazul lui Yer. pseudotuberculosis gazdele sunt reprezentate de roztoare,
cprioare, animale domestice, psri. n general animalele infectate sunt
purttoare asimptomatice, nepre-zentnd manifestri clinice.
oamenii reprezint gazde ntmpltoare nefind implicai nici n
meninerea microorganismului n natur i nici n transmiterea lui la ali
oameni.
manifestrile clinice includ febra, diareea, durerile abdominale, care
mimeaz apendicita i artrita cronic. Apar de asemenea leziuni tipice de
enterit i limfadenit mezenteric.
mai receptivi la infecie sunt copii dect adulii. Transmiterea se
132
realizeaz prin ingestia de alimente sau ap i mai rar prin contact direct cu
animalele infectate sau pacienii umani.
Transmiterea infeciei n rile nord europene de la animale la om, se
realizeaz probabil prin cinii de companie i prin consumul de carne de
porc insufcient pregtit.
Germenul se poate gsi n lacuri, izvoare, ap potabil, ns rareori,
s-au produs infecii pe aceast cale.
Supravieuiete la frigider, ceea ce arat c produsele refrigerate pot
f contaminate.
Epidemiile de boal n SuA prin consum de alimente s-au semnalat
prin ciocolat contaminat, lapte pasteurizat, intestine crude de porc.
Infecia cu Yer. pseudotuberculosis, este extrem de rar, find
semnalat mai ales n Europa, transmiterea realizndu-se prin ingestie, dup
contactul cu un animal infectat sau prin contaminare intrafamilial prin ap
i alimente.
majoritatea mbolnvirilor depind de: vrst (copiii ntre 5-15 ani);
sex (masculin); anotimp (iarna).
Transmiterea bolii de la un animal la altul se realizeaz pe cale fecal-
oral, prin ingestia furajului sau a apei contaminate.
Yer. enterocolitica este sensibil in vitro la aminoglicozide,
cloramfenicol, tetracicline, trimetoprim, sulfametoxazol, piperaciclin i
cefalosporine de generaia a III-a.
Yer. pseudotuberculosis prezint sensibilitate la urmtoarele antibiotice:
ampicilin, tetraciclin, cloramfenicol, cefalosporine i aminoglicozide.
Combaterea trebuie concentrat asupra rezervoarelor animale din
toate zonele.
Pregtirea complet a crnii i pasteurizarea laptelui ar trebui s fe
principalele mijloace de protecie.
Christiansen (1987) a propus evitarea refrigerrii crnii pentru perioade
mai mari de timp datorit capacitii bacteriei de a se nmuli la 4C.
Pentru a mpiedica transmiterea bolii prin transfuziile de snge este
necesar testarea donatorilor pentru episoadele recente de diaree sau febr.
3.4.2. Yersinia pestis
Pesta a produs dezastre nc din Evul mediu, cnd a ucis un sfert din
populaia Europei.
n prima jumtate a secolului trecut, India a fost grav afectat de o
epidemie de pest n care au murit mai mult de 10 milioane de oameni.
ntre anii 1960 i 1970 n Vietnam, pesta a fcut peste 10.000 de
133
victime pe an.
o dat cu descoperirea streptomicinei a sczut drastic mortalitatea la
om. mai mult de 10 milioane de oameni au fost vaccinai n timpul rzboiului
din Vietnam cu tulpina atenuat EV76.
Cele mai importante rezervoare ale acestui bacil sunt reprezentate de
obolanii urbani i domestici.
n SuA, n focarele silvatice, rezervoarele sunt reprezentate de ctre
veveria de stnc i cinele de preerie. mai rar, iepurii, pisicile i alte
carnivore.
Yer. pestis rezist n interiorul fagocitelor mononucleare multiplicn-
du-se intracelular, prin producerea antigenelor de membran.
Cel mai efcient vector este puricele obolanului asiatic.
Transmiterea ntre animale se face prin muctura puricelui sau prin
ingerarea de esuturi animale moarte.
Boala, la animale se poate prezenta de la forma bacteriemiei subclinice
pn la afeciuni cu limfadenopatii i abcese n multiple organe sau moarte
subit prin septicemie.
Cea mai comun manifestare, la om este pesta bubonic. Boala se
manifest prin febr, frisoane, cefalee, iar n cteva ore apar buboanele
(adenofegmoane), n special n zona inghinal, axilar i cervical.
o caracteristic special a pestei o reprezint capacitatea bolii de a
nvinge rezistena organismului prin proliferarea intens a bacteriilor n
fuxul sanguin.
una din complicaiile de temut ale pestei la om este reprezentat de
pneumonia secundar.
diagnosticul bacteriologic const n efectuarea de culturi din biopsii
ganglionare. Picturile din aspiratul biopsic trebuie puse pe lame de
microscop i uscate la aer i apoi colorate Gram sau Wayson.
n coloraia Wayson, aspiratul este aplicat pe o lam, fxat 2 minute n
metanol concentrat i colorat 10-20 secunde n amestecul colorant, splat cu
ap i uscat (Thomas Butler).
Yersiniile apar sub forma unor bacili azurii cu o extremitate albastru
nchis, iar mediul apare colorat n roz.
Pesta netratat prezint o rat a mortalitii de 50%. Streptomicina
reduce mortalitatea la mai puin de 5%. Se administreaz intramuscular n
doze de 30 de mg/kg/zi, timp de 10 zile.
majoritatea infeciilor apar n mai-octombrie, cnd oamenii ies n
natur i vin n contact cu roztoarele.
ntre 1980-1989 s-au raportat de omS, 8554 de cazuri de pest n
17 ri. rile cu mai mult de 100 de cazuri sunt: Tanzania, Vietnam, zair,
134
Brazilia, madagascar, Peru, uganda, Burma, Bolivia, SuA, Botswana
(Thomas Butler, 2005).
omul nu are nici un rol n meninerea infeciei n natur find gazd
accidental. Infecia se transmite prin muctura puricilor infectai. Trans-
miterea infeciei de la om la om se realizeaz extrem de rar (n epidemiile
de pest pneumonic).
dei purecii, sunt parazii specifci ai fecrei specii schimbndu-i
rar gazdele, au fost identifcai la cinii i pisicile de companie implicai n
transmiterea pestei la om n SuA.
Pacienii suspeci de pest trebuiesc raportai la departamentul
Sntii Publice i la omS.
n laboratoarele n care se lucreaz cu acest germen, este absolut
necesar existena unor tehnici bacteriologice standard, care s evite
contactul culturilor cu pielea sau formarea de aerosoli.
la persoanele care cltoresc n zonele epidemice, la cele care vin
n contact cu roztoarele i la tehnicienii care manipuleaz Yer. pestis se
folosete Plaque Vaccine uSP (vaccin cu bacterii inactivate cu aldehid
formic) (Thomas Butler).
datorit potenialului exploziv al acestei infecii, o dat identifcat o
epidemie, sunt necesare msuri de urgen din partea autoritilor.
Se va folosi tratamentul cu pulberi insecticide, deoarece puricii
infectai reprezint cea mai mare ameninare pentru oameni.
Cea de-a doua msur prioritar const n omorrea obolanilor (dup
administrarea tratamentului cu insecticide, deoarece puricii infectai pot
trece la oameni, cnd animalele sunt otrvite).
135
harta focarelor de unde Yersinia pestis f1991016, E1979001, B42003004,
K1973002 a fost izolat. dup zhou et al., 2004
Acest bacil Gram negativ,
produce la oameni, psri,
animale domestice i
animale de companie
infecii gastrointestinale
caracterizate prin
scaune apoase uneori
sangvinolente, febr i
dureri abdominale. uneori
poate mima durerea
provocat de apendicita.
Yersinia enterocolitica.
microscopie electronic
de transmisie. Coloraie
negativ pentru
mbuntirea contrastului.
Wadsworth Center, New
York State department of
health
136
Yer. enterocolitica. mediul xld (xylose lysine Sodium deoxycholate)
Yersinia enterocolitica. Coloraia Gram.
137
Bibliografe selectiv
1. Aleksic, S., and J. Bockemuhl. 1984. Proposed revision of the Wauters et al.
antigenic scheme for serotyping of Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 20:99-102.
2. Aleksic, S., A. Steigerwalt, J. Bockemuhl, G. huntley-Carter, and d.J. Brenner.
1987. Yersinia rohdei sp. nov. isolated from human and dog feces and surface water. Int. J.
Syst. Bacteriol. 37:327-332.
3. Archer, J R, R f Schell, d R Pennell and P d Wick. 1987. Identifcation of
Yersinia spp. with the API 20E system. J Clin microbiol. 25(12): 2398-2399.
4. Aulisio, C.C.G., I.J. mehlman, and A.C. Sanders. 1980. Alkali method for rapid
recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl.
Environ. microbiol. 39:135-140.
5. Aulisio, C.C.G., J.m. lanier, and m.A. Chappel. 1982. Yersinia enterocolitica
o:13 associated with outbreaks in three southern states. J. food Prot. 45:1263.
6. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfeld, S.d. Weagant, and W.E. hill. 1983. Yersiniosis
associated with tofu consumption: serological, biochemical and pathogenicity studies of
Yersinia enterocolitica isolates. J. food Prot. 46:226-230.
7. Aulisio, C.C.G., J.T. Stanfeld, W.E. hill, and J.A. morris. 1983. Pathogenicity
of Yersinia enterocolitica demonstrated in the suckling mouse. J. food Prot. 46:856-860.
8. Aulisio, C.C.G., W.E. hill, J.T. Stanfeld, and R.l. Sellers, Jr. 1983. Evaluation
of virulence factor testing and characteristics of pathogenicity in Yersinia enterocolitica.
Infect. Immun. 40:330-335.
9. Bercovier, h., d.J. Brenner, J. ursing, A.G. Steigerwalt, G.R. fanning, J.m.
Alonso, G.P. Carter, and h.h. mollaret. 1980. Characterization of Yersinia enterocolitica
sensu stricto. Curr. microbiol. 4:201-206.
10. Bercovier, h., A.G. Steigerwalt, A. Guiyoule, G. huntley-Carter, and d.J.
Brenner. 1984. Yersinia aldovae (formerly Yersinia enterocolitica-like group x2): a new
species of enterobacteriaceae isolated from aquatic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol.
34:166-172.
11. Bhaduri, S., C. Turner-Jones, and R.V. lachica. 1991. Convenient agarose
medium for simultaneous determination of the low-calcium response and congo red binding
by virulent strains of Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 29:2341-2344.
12. Boyce, J.m., E.J. Evans, Jr., d.G. Evans, and h.l. duPont. 1979. Production
of heat-stable methanol-soluble enterotoxin by Yersinia enterocolitica. Infect. Immun.
25:532-537.
13. Buchrieser, C., S. d. Weagant and C. W. Kaspar, 1994. molecular characterization
of Yersinia enterocolitica by pulsed-feld gel electrophoresis and hybridization of dNA
fragments to ail andpYV probes. Appl. and Environ. microbiol. 60:4371-4379.
14. Carter, P.B., and f.m. Collins. 1974. Experimental Yersinia enterocolitica
138
infection in mice: kinetics of growth. Infect. Immun. 9:851-857.
15. doyle, m.P., m.B. hugdahl, and S.l. Taylor. 1981. Isolation of virulent Yersinia
enterocolitica from porcine tongues. Appl. Environ. microbiol. 42:661-666.
16. feng, P. 1992. Identifcation of invasive Yersinia species using oligonucleotide
probes. mol. Cell. Probes 6:291-297.
17. fukushima, h., K. Saito, m. Tsubokura, and K. otsuki. 1984. Yersinia spp. in
surface water in matsue, Japan. zentralbl. Bakteriol. Abt. 1 orig. B. hyg. Kranhenhaushyg.
Betreibshyg. Praev. med. 179:235-247.
18. fukushima, h., m. Gomyoda, S. Ishikua, T. Nishio, S. moriki, J. Endo, S.
Kaneko, and m. Tsubokura. 1989. Cat-contaminated environmental substances lead to
Yersinia pseudotuberculosis infections in children. J. Clin. microbiol. 27:2706-2709.
19. Gemski, P., J.R. lazere, and T. Casey. 1980. Plasmid associated with
pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 27:682-
685.
20. Gemski, P., J.R. lazere, T. Casey, and J.A. Wohlhieter. 1980. Presence of
a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis. Infect. Immun. 28:1044-
1047.
21. heesemann, J., B. Algermissen, and R. laufs. 1984. Genetically manipulated
virulence of Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 46:105-110.
22. hill, W.E., W.l. Payne, and C.C.G. Aulisio. 1983. detection and enumeration
of virulent Yersinia enterocolitica in food by dNA colony hybridization. Appl. Environ.
microbiol. 46:636-641.
23. Isberg, R., A. Swain, and S. falkow. 1988. Analysis of expression and
thermoregulation of the Yersinia pseudotuberculosis inv gene with hybrid protein. Infect.
Immun. 56:2133-2138.
24. Isberg, R., d.l. Voorhis, and S. falkow. 1987. Identifcation of invasin: a
protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50:769-
778.
25. Isberg, R., and S. falkow. 1985. A single genetic locus encoded by Yersinia
pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.
Nature 317:262-264.
26. Isberg, R., and J.m. leong. 1988. Cultured mammalian cells attach to the
invasin protein of Yersinia pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 85:6682-6686.
27. Isberg, R. 1989. determinants for thermoinducible cell binding and plasmid-
encoded cellular penetration detected in the absence of Yersinia pseudotuberculosis invasin
protein. Infect. Immun. 57:1998-2005.
28. Kandolo, K., and G. Wauters. 1985. Pyrazinamidase activity in Yersinia
enterocolitica and related organisms. J. Clin. microbiol. 21:980-982.
29. Kay, B.A., K. Wachsmuth, and P. Gemski. 1982. New virulence-associated
plasmid in Yersinia enterocolitica. J. Clin. microbiol. 15:1161-1163.
139
30. laird, W.J., and d.C. Cavanaugh. 1980. Correlation of autoagglutination and
virulence of Yersinia. J. Clin. microbiol. 11:430-432.
31. lee, W.h., P.P. mcGrath, P.h. Carter, and E.l. Eide. 1977. The ability of some
Yersinia enterocolitica strains to invade hela cells. Can. J. microbiol. 23:1714-1722.
32. linde,h.-J. h. Neubauer, h. meyer, S. Aleksic, and N. lehn. 1999. Identifcation
of Yersinia Species by the Vitek GNI Card. J. Clin. microbiol.. 37:211-214.
33. miliotis, m.d. 1991. Acridine orange stain for determining intracellular
enteropathogens in hela cells. J. Clin. microbiol. 29:830-832.
34. miliotis, m.d., and P. feng. 1992. In vitro staining technique for determining
invasiveness in foodborne pathogens. fdA laboratory Information Bulletin, march,
9(3):3754.
35. miliotis, m.d., J.E. Galen, J.B. Kaper, and J.G. morris. 1989. development and
testing of a synthetic oligonucleotide probe for the detection of pathogenic Yersinia strains.
J. Clin. microbiol. 27:1667-1670.
36. miller, V.A., and S. falkow. 1988. Evidence of two genetic loci in Yersinia
enterocolitica that can promote invasion of epithelial cells. Infect. Immun. 56:1242-1248.
37. miller, V., J.J. farmer III, W.E. hill, and S. falkow. 1989. The ail locus is found
uniquely in Yersinia enterocolitica serotypes commonly associated with disease. Infect.
Immun. 57:121-131.
38. minnich, S. A., m. J. Smith, S. d. Weagant and P. feng. 2001. Yersinia, Chapter
19, pp. 471-514. In foodborne disease handbook, 2nd Ed., Vol. 1. Y. h. hui, m. d. Pierson,
J. R. Gorham (Eds.) marcel dekker, Inc. New York.
39. Pai, C.h., and l. deStephano. 1982. Serum resistance associated with virulence
in Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 35:605-611.
40. Pierson, d.E., and S. falkow. 1990. Nonpathogenic isolates of Yersinia
enterocolitica do not contain functional inv-homologous sequences. Infect. Immun.
58:1059-1064.
41. Portnoy, d.A., S.l. moseley, and S. falkow. 1981. Characterization of plasmids
and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocoliticapathogenesis. Infect. Immun.
31:775-782.
42. Portnoy, d.A., and R.J. martinez. 1985. Role of plasmids in the pathogenicity
of Yersinia species. Curr. Top. microbiol. Immunol. 118:29-
43. Prpic, J.K., R.m. Robins-Brown, and R.B. davey. 1985. In vitro assessment of
virulence in Yersinia enterocolitica and related species. J. Clin. microbiol. 22:105-110.
44. Ramamurthy T, Yoshino K, huang x, Balakrish Nair G, CRNAiel E, maruyama
T, fukushima h, Takeda T. 1997. The novel heat-stable enterotoxin subtype gene (ystB)
of Yersinia enterocolitica: nucleotide sequence and distribution of the yst genes. microbial
Pathogenesis. 23: 189-200.
45. Robins-Brown, R., and K. Prpic. 1985. Effects of iron and desferrioxamine on
infections with Yersinia enterocolitica. Infect. Immun. 47:774-779.
140
46. Robins-Brown, R., m.d. miliotis, S. Cianciosi, V.l. miller, S. falkow, and J.G.
morris. 1989. Evaluation of dNA colony hybridization and other techniques for detection
of virulence in Yersinia species. J. Clin. microbiol. 27:644-650.
47. Schiemann, d.A. 1982. development of a two-step enrichment procedure for
recovery of Yersinia enterocolitica from food. Appl. Environ. microbiol. 43:14-27.
48. Schiemann, d.A. 1989. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis,
pp. 601-672. In: foodborne Bacterial Pathogens. m. doyle (ed). marcel dekker, New York
and Basel
49. Sereny, B. 1955. Experimental Shigella keratoconjunctivitis. Acta microbiol.
Acad. Sci. hung. 2:293-296.
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 460
pagini), ISBN: 973-40-0568-5
50. Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
51. Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-5-6;
ISBN (13) 978-973-86571-5-1
52. Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
53. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
54. Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
55. Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-
973-736-090-8
56. Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi,
ISBN: 978-973-736-089-2
57. Tsubokura, m., K. otsuki, K. Sato, m. Tanaka, T. hongo, h. fukushima,
T. maruyama, and m. Inoue. 1989. Special features of distribution of Yersinia
pseudotuberculosis in Japan. J. Clin. microbiol. 27:790-791.
58. Wauters, G. 1981. Antigens of Yersinia enterocolitica, pp. 41-53. In: Yersinia
enterocolitica. E.J. Bottone (ed). CRC Press, Boca Raton, fl.
59. Wauters, G., m. Janssens, A.G. Steigerwalt, and d.J. Brenner. 1988. Yersinia
molleretii sp. nov. and Yersinia bercovieri sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica
biogroups 3A and 3B. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:424-429.
60. Weagant, S.d. 1983. medium for the presumptive identifcation of Yersinia
enterocolitica. fdA laboratory. Appl Environ microbiol. 45(2):472-3.
61. Weagant, S. d. and P. feng. 2001. Yersinia, Chapter 41, pp. 421-428. In
Compendium of methods for the microbiological Examination of foods. 4th Ed., f. Pouch
downes and Keith Ito (Eds.) American Public health Assoc. Washington, d. C.
141
62. Weissfeld, A.S., and A.C. Sonnenwirth. 1982. Rapid isolation of Yersinia spp.
from feces. J. Clin. microbiol. 15:508-510.
63. zink, d.l., J.C. feeley, J.G. Wells, C. Vanderzant, J.C. Vickery, W.d. Roof, and
G.A. odonovan. 1980. Plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica.
Nature 283:224-226.
142
CAPITOLUL 4
ImPLICAIILE BACTErIILOr dIn gEnUL VIBrIO n
PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE
4.1. Caractere generale
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae (cu 8 genuri).
Cuprinde 76 de specii. Genul reunete bacili Gram negativi cu aspect
caracteristic de virgul (rar n S), necapsulogeni, nesporogeni i extrem
de mobili. n mediile lichide prezint fageli polari (mono sau lofotrichi), iar
pe mediile solide formeaz fageli laterali.
V. parahaemolyticus reprezint principala cauz a gastroenteritelor
epidemice, mai ales n zonele unde se consum pete crud (Japonia). Exist
dovezi c nc alte 4 specii halofle de Vibrio sunt patogene pentru om:
V. alginolyticus, V. fuvialis, V. metschnikovii i V. vulnifcus. Toate aceste
specii halofle se difereniaz printr-unul sau mai multe teste biochimice.
Tabelul 4.1.
Teste biochimice de difereniere ntre V. parahaemolyticus i alte specii de Vibrio
Specia V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. vulnifcus
flageli laterali pe mediul solid + + -
Bacili d d C
Reacia Voges-Proskauer - + -
Creterea n mediu cu 10% NaCl - + -
dezvoltarea n NaCl 6% + + +
fenomenul de roire - + -
Producia de acetoin/ diacetil - + -
Sucroz - + -
Celobioz - - +
utilizarea putresceinei + % -
Agar TCBS v g v
Legend: d = drept; C = curb; v = verde; g = galben; % = 11-90% din tulpinile pozitive
143
Alimentele frecvent implicate n epidemiile cu V. parahaemolyticus
sunt reprezentate de: pete, stridii, crevei, crabi, homari, scoici. Toxiinfeciile
alimentare sunt probabil provocate de refrigerarea necorespunztoare, de
ferberea insufcient, de contaminarea ncruciat sau de recontaminare.
Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea
hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa.
Tulpinile Kanagawa pozitive produc o hemolizin direct termostabil,
iar tulpinile Kanagawa negative produc o hemolizin termolabil. Exist
tulpini care produc ambele hemolizine. hemolizina termolabil nrudit
reprezint un factor important de virulen pentru unele tulpini de V.
parahaemolyticus. Acesta este un organism halofl ce poate f detectat
n apele oceanice i costiere la temperaturi n jur de 19-20C. un studiu
efectuat n golful Chasapeake (pe coasta de est a SuA) arat c bacteriile
supravieuiesc n sedimentul marin pe timpul iernii, iar apoi sunt eliberate n
coloana de ap prin zooplancton din aprilie pn la sfritul lui iunie. Aceste
microorganisme nu se gsesc de obicei n adncimile oceanelor deoarece nu
pot tolera presiunea hidrostatic. V. parahaemolyticus se dezvolt optim la
un ph de 7,2-7,3 i 3% NaCl sau la un ph 7,6 i 7% NaCl.
Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, frecvent ncurbai sau n
virgul, nesporogeni, mobili n medii lichide, prin fageli polari, mono sau
lofotrihi, iar pe medii solide prin fageli laterali cu lungime de und mai
mic dect fagelul polar, catalaz i oxidaz pozitivi. Excepie face numai
V. metschnikovii, care este oxidaz negativ.
Sunt germeni nepretenioi nutritiv, facultativ anaerobi i fermenteaz
zaharurile fr producere de gaz. Cele mai multe specii sunt sensibile la
agentul vibriostatic o/129 (2,4-diamino-6,7-di-izopropilpteridin) n
concentraii de 10 i/sau 150 g.
Produc variate enzime extracelulare, care includ toxine citotoxice i
citolitice, neuraminidaz, chitinaz, proteaze, lipaze etc.
Sunt organisme acvatice adaptate la variate saliniti (clorura de
sodiu stimuleaz creterea unor specii i este obligatorie pentru altele).
Abund n apele marine i estuariene n simbioz cu vertebratele i
nevertebratele acestor ecosisteme.
4.2. Taxonomie
familia Vibrionaceae, cuprinde genurile: Vibrio, Allomonas,
Catenococcus, Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium,
Salinivibrio
n genul Vibrio sunt ncadrate mai multe specii, patogene i nepatogene.
144
hibridrile RNA-dNA indic o nrudire, de aproape 60%, cu genurile
Aeromonas i Plesiomonas, ceea ce justifc separarea acestor taxoni. Sunt
cunoscute pn n prezent aproximativ 49 specii de Vibrio, patogene att
pentru om (aproximativ 12) ct i pentru animale (24).
dintre speciile nou ncadrate i descrise de ctre Bergeys manual of
determinative Bacteriology, 9th ed., 2000, amintim:
Vibrio albensis 5 , a fost descris de ctre lehmann i Neumann n
1896 i inclus taxonomic de Skerman, n 1980.
Vibrio alginolyticus, 5 subspecia iophagus a fost descris de ctre
Welton i Woods, n 1973 i ncadrat taxonomic de ctre moore i Cato
(1985);
V. anguillarum 5 , descris de ctre Bergeman, n 1909 i ncadrat
taxonomic de ctre Skerman n 1980, rencadrat de mac donell i Colwell,
n 1986, sub denumirea de Listonella anguillarum.
V. fscherii 5 , a fost studiat i ncadrat taxonomic de lehmann i
Neumann sub aceast denumire, nc din 1980, ns a fost recunoscut i
ncadrat ca specie Vibrio n 1994.
V. campbelli 5 a fost denumit i studiat de Baumann n 1981;
V. diabolicus 5 a fost descoperit la un anelid polichet, descoperit
n curenii marini hidrotermali de adncime, find descris i ncadrat n
1997.
V. ichthyoenteri 5 a fost descris n 1996 de Ishimaru i col.;
V. gazogenes 5 a fost denumit i ncadrat taxonomic de ctre
harwood i col., n 1980, find recunoscut ca specie n 1994.
Cinetica asocierii dNA-RNA indic o anumit heterogenitate
flogenetic a genului n care se pot contura urmtoarele grupuri de
vibrioni:
vibrioni O:1 V. cholerae; 5
vibrioni non O:1 V. metschnikovii 5
vibrioni halofli V. furnissi. 5
4.3. Istoric
holera a fost descris pe toate continentele n decursul a ase pandemii.
Prima a aprut n 1817, n India, Pakistan, Birmania, de unde a difuzat n
China i Europa n decursul a patru ani. Cea de-a doua s-a declanat n
Europa (1829) i a difuzat n America de Nord.
n Romnia a fost semnalat n 1913, n cursul celei de-a asea
pandemii. nc din 1855, Snow a artat c holera este transmis la om de un
microb din ap, fecale sau alimente contaminate.
145
n anul 1833, Robert Koch, izoleaz agentul cauzal i demonstreaz
reproducerea bolii la cobaii inoculai intraduodenal i intragastric.
n trecut, holera gastric era denumit i holer asiatic, datorit
izbucnirii mai frecvent a pandemiilor n zona Indiei i Asiei.
ncadrat n categoria vibrionilor non-holerici, Vibrio parahaemolyticus
determin gastroenterite la consumatorii de produse acvatice contaminate.
fujino i col. au izolat pentru prima dat bacteria n anul 1951 din
scaunele bolnavilor care au consumat o specialitate de pescrie denumit
shirasu, de unde au dat i numele toxiinfeciei alimentare.
Takikawa i fujisawa izoleaz bacteria din fecalele unor bolnavi cu
gastroenterit, ncadrnd-o n genul Pseudomonas.
miyamoto i col. (1961) decid ncadrarea acestei bacterii n familia
Enterobacteriaceae.
ulterior, datorit diferenelor metabolice clare fa de aceast familie,
a fost ncadrat n genul Vibrio.
Sakazaki i col. mpart tulpinile izolate n trei grupe, i anume:
grupa 1 , ce ncadreaz tulpinile ce se dezvolt n ap peptonat,
cu adaos de 3-7% clorur de sodiu, nu produc acetil-metil-carbinol, nu
fermenteaz zaharoza;
grupa 2 , cuprinde tulpinile care se dezvolt n ap peptonat, cu
adaos de 3,7-10% NaCl, fermenteaz zaharoza, produc acetil-metil-carbinol,
se izoleaz, de obicei, din apele marine i din animalele acvatice, implicat,
mai rar n etiologia gastroenteritelor umane;
grupa 3 , cuprinde tulpini care se dezvolt pe medii cu 3% NaCl, nu
fermenteaz zaharoza i nu produc acetil-metil-carbinol, care se izoleaz de
la animalele acvatice.
Brzoi i lzrescu (1972) au izolat mai multe tulpini de vibrioni non-
holerici din petele marin, n Romnia.
4.4. morfologie
Genul Vibrio reunete bacili Gram negativi, cu diametrul de 0,5-2/0,3-
0,4 microni, frecvent ncurbai ntr-un singur plan, cu aspect caracteristic de
cornioare sau de virgul, necapsulogeni, nesporogeni i extrem de mobili.
n mediile lichide, mobilitatea le este asigurat de fageli polari, mono
sau lofotrihi, iar pe mediile solide, prin fageli laterali, cu lungime de und
mai mic dect a fagelului polar.
la examenul ntre lam i lamel, pe fond ntunecat din culturi n
medii lichide, V. cholerae prezint o micare vie de rostogolire, caracteristic
organismelor monofagelare, care se traduc plastic prin traversarea
146
cmpului microscopic ca bancurile de pete, ca sgeile sau cu micri
dezordonate, de unde i numele de Vibrio (vibraii).
n culturile tinere predomin formele ncurbate n virgul i ocazional
sub forma literei S. o dat cu mbtrnirea culturii, formele drepte devin
tot mai numeroase, iar diferenierea de ali bacili enterici devine tot mai
difcil.
Cultivai pe medii cu concentraii suboptimale de clorur de sodiu,
vibrionii apar polimorf. Polimorfsmul este accentuat, mai ales la speciile
halofle, n frotiurile din prelevate patologice de la formele fne, bacilare, cu
ncurbare minim, pn la forme cocobacilare.
dup subcultivarea acestor specii, pe medii cu concentraie salin
favorabil, revin la morfologia normal.
4.5. Condiii de cultivare i caractere culturale
Sunt germeni aerobi (dezvoltndu-se foarte bine n prezena oxigenului
la suprafaa mediilor) i tolereaz ph-ul alcalin 8,6-9,6.
Nu sunt pretenioi din punct de vedere nutritiv, dezvoltndu-se pe
medii simple (ap peptonat, glucoz simpl) sau ap peptonat alcalin la
37C.
n bulion produc o turbiditate intens, iar uneori formeaz la suprafaa
mediului o pelicul. dezvoltarea culturii bacteriene apare mai abundent la
suprafaa mediului, find mai intens n medii alcaline.
Pe agar simplu formeaz colonii cu diametrul de 2-5 mm, turtite
sau uor convexe, netede, umede, lucioase. Exist variante de colonii
transparente sau opace. Variantele rugoase formeaz colonii zbrcite, greu
emulsionabile.
Pe agar cu 5% snge de berbec, iepure sau cal, V. fuvialis, V.
metschnikovii, tulpinile non o:1 de V. cholerae produc beta hemoliz dup
24 de ore de incubare la 37 C.
V. alginoliticus V. parahaemolyticus sau V. vulnifcus sunt nehemolitice
sau produc numai o nverzire a mediului, circumscris coloniilor, echivalent
alfa hemolizei.
Activitatea hemolitic a lui V. parahaemolyticus este cunoscut
sub denumirea de fenomenul Kanagawa. Acest fenomen reprezint beta
hemoliza pe care o produce V. parahaemolyticus n condiii speciale de
cultivare, i anume pe agarul Wagatsuma (agar cu d-manitol, cu 7% NaCl
i snge uman grupa o sau snge de iepure).
Tulpinile Kanagawa negative se izoleaz mai rar din cazuri de
toxiinfecii alimentare i nu reproduc boala prin administrri la voluntari.
147
hemolizina Kanagawa a fost identifcat ca o toxin letal cu efect
cardiotoxic. Pe medii fr concentraie optim de sare, majoritatea speciilor
halofle nu se pot dezvolta.
unele tulpini de V. alginoliticus i V. parahaemolyticus prezint o
cretere invaziv. la V. parahaemolyticus acest tip de cretere este declanat
de condiiile feriprive i de limitarea rotaiei fagelare la replicarea n bulion
pe mediu agarizat (dezvoltarea fagelilor laterali).
Pe agarul mac Conkey se dezvolt numai unele specii (V. cholerae),
care formeaz colonii lactoz-negative.
Izolarea vibrionilor (din materii fecale) impune utilizarea mediilor
selective. Selectivitatea se bazeaz pe capacitatea vibrionilor de a crete
la ph 8,6, care este defavorabil dezvoltrii multor specii bacteriene. de
asemenea, au capacitatea de a tolera concentraiile toxice ale unor compui
organici (bil, sruri biliare) sau anorganici (iodur de potasiu, telurit de
potasiu).
Cel mai indicat este s se foloseasc un mediu cu selectivitate medie,
cum ar f mediul B.S.A. (bile salts agar) i cu selectivitate nalt, ca de
exemplu mediul T.C.B.S. (thiosulphate-citrate-bile-salts-sucroze).
Tabelul 4.2.
Aspectul culturii de 18-24 ore pe mediul T.C.B.S. a speciilor de Vibrio,
comparativ cu alte specii posibil asociate (dup Buiuc d., 1999)
Specia
diam.
coloniei (mm)
fermentarea
zaharozei
(% tulpini)
Culoarea
coloniilor
Cretere
V. cholerae 2-3 100 galben bun
V. alginolyticus 2-5 99 galben bun
V. fuvialis 2-3 100 galben bun
V. furnissi 2-3 100 galben bun
V. metschnikovii 2-4 100 galben
poate f
slab
V. parahaemolyticus 2-5 1 verde bun
Aeromonas hydrophila 0-3 > 90 galben variabil
Plesiomonas shighelloides 1 0 verde variabil
Proteus vulgaris 2-3 97 galben bun
Alte enterobacteriacee 0,1 variabil transparente variabil
Pseudomonas spp. variabil 0 verde variabil
148
Se mai folosete, ca mediu de izolare, agarul cu 5% snge de berbec.
Izolarea germenului din plgi contaminate cu ap de mare, muctur
de rechin etc., se poate face pe un mediu selectiv.
4.6. Proprieti biochimice
fermenteaz zaharurile fr producere de gaz (glucoz, galactoz,
sucroz, manoz). Produc oxidaz i catalaz.
lichefaz gelatina, hidrolizeaz cazeina, reduc nitraii n nitrii. Nu
produc ureaz i nici hidrogen sulfurat.
V. cholerae i V. parahaemolyticus produc lecitinaz i indol la 22C i
la 37C, fermenteaz manita, hidrolizeaz amidonul, decarboxileaz lizina
i ornitina, cresc la 5C.
Tabel 4.3.
Caractere biochimice difereniale ale speciilor din genul Vibrio
(dup Janda, 1998, mclaughlin, 1995)
Testul
V.
cholerae
V. parahae-
molyticus
V. algino-
lyticus
V.
fuvialis
V.
furnissi
V.
metschnikovii
oxidaz 100 100 100 100 100 0
0/129 zon
de inhibiie la
discul cu 150 g
99 20 19 31 0 90
Crete n
bulion cu 0%
NaCl
100 0 0 0 0 0
1% NaCl 100 100 99 99 99 100
6% NaCl 53 99 100 96 100 78
8% NaCl 1 80 94 71 78 44
10% NaCl 0 2 69 4 0 4
12% NaCl 0 1 16 0 0 0
Indol 99 98 85 13 11 20
decarboxilaze,
Moeller
Arginin
0 0 0 93 100 60
lizin 99 100 99 0 0 35
ornitin 99 95 50 0 0 0
oNPG 94 5 0 40 35 50
Voges-
Proskauer
75 0 95 0 0 96
149
Acid din:
l-arabinoz
0 80 1 93 100 0
m-inozitol 0 0 0 0 0 40
lactoz 7 1 0 3 0 50
zaharoz 100 1 99 100 100 100
ureaz 0 15 0 0 0 0
4.7. Ecologie
Vibrionii sunt microorganisme acvatice. Speciile halofle sunt limitate
la apele marine, estuariene, costiere i lagunare.
Speciile non-halofle se gsesc i n apele dulci: ruri, lacuri. Prezena
vibrionilor n apele dulci este tranzitorie.
n apele marine se gsesc sub mai multe forme:
forma liber triete n aceste ape atta timp ct apa le ofer
transporturi i concentraii de nutrieni optime pentru cretere;
forma epibiotic reprezint o asociaie intim a vibrionilor cu
matricea chitinoas a zooplanctonului, a scoicilor sau copepodelor. Vibrionii
epibioni rezist mai mult n mediul marin dect vibrionii liberi i traverseaz
mai uor bariera gastric acid;
forma dormant este reprezentat de microvibrioni, care
sunt celule necultivabile, prezena lor find demonstrat prin coloraii
imunofuorescente a probelor provenite din mediul marin.
4.8. factorii de patogenitate
Vibrionii sunt rspunztori de producerea enzimelor extracelulare, care
sunt foarte variate i includ toxine citotoxice i citolitice, neuraminidaz,
chitinaz, proteaze, lipaze etc.
4.9. Specii mai importante de vibrioni
Vibrio cholerae
(Pacini, 1854), sinonim Vibrio comma.
V. cholerae a fost izolat i descris de ctre Roberth Koch n 1884,
ca find agentul holerei la om. holera se caracterizeaz prin gastroenterit,
manifestat clinic prin diaree profuz (pn la 100 de scaune pe zi, cu
aspect caracteristic de ap de orez) i deshidratare rapid. letalitatea este
150
n medie de 50%, prezentnd un interes major pentru sntatea public prin
morbiditate i mortalitate.
Este determinat de serogrupele o:1 i o:139. Principalul factor
de patogenitate al vibrionilor holerigeni este reprezentat de enterotoxina
termolabil de natur proteic, numit i factor de permeabilizare. Toxina se
leag ireversibil de celulele mucoasei intestinului subire, find responsabil
de fuga de ap i de ioni, din esuturi.
Neuraminidaza (sialidaza) reprezint factorul de fuidifcare a
mucusului.
lecitinaza eliberat de vibrionul holeric este nc insufcient studiat.
Sursele de infecie sunt determinate de apa i alimentele infectate, vectorul
viu find musca.
holera are o evoluie epidemic sau pandemic, iar n prezent se
limiteaz la Extremul orient i la Africa occidental, cu o recrudescen
din patru n patru ani.
Vibrionul holeric se transmite, cel mai frecvent, prin consumul de ap
potabil contaminat i, mai rar, prin intermediul unor alimente (n principal
acvatice). Rezervorul de infecie principal l reprezint omul bolnav,
purttorii convalesceni i purttorii sntoi. n ultimii ani s-a evideniat
c exist purttori umani cronici, ce pot elimina prin fecale, timp de cteva
luni, cantiti enorme de vibrioni.
Rezervoarele naturale de vibrioni holerici sunt reprezentate de
crustacee, molute (crabi, midii, stridii) i unele specii de pete.
Vibrionii holerici sunt considerai ca specie endemic pentru apele
litorale, estuare, delte i chiar bli. Studiile fcute n apele de coast ale SuA
i Australiei au demonstrat existena unor rezervoare de Vibrio cholerae (att
tulpini o1 ct i non-o1) n crustacee i molutele cu cochilie. de aceea, n
aceste state, sursa principal de infecie o constituie consumul de stridii.
Vibrio parahaemolyticus
(fujino i col., 1931)
Este o bacterie halofl, cu sediul n mediul marin (ap i alimente
derivate din fauna marin, mai ales pete oceanic) care determin la om
enterite acute grave, mai ales n zonele geografce unde se consum mult
pete de mare.
Toxiinfeciile alimentare sunt mai frecvente n sezonul cald, cnd
temperatura apei depete 15C.
Tulpinile izolate de la bolnavi sunt de regul hemolitice, iar activitatea
hemolitic a acestei bacterii poart denumirea de fenomenul Kanagawa.
151
hemolizina Kanagawa a fost identifcat ca o toxin letal cu efect
cardiotoxic.
n mod obinuit aceast specie produce hemoliz de tip beta pentru
sngele de om. factorul care d reacia Kanagawa pozitiv const ntr-o
hemolizin termolabil i o lizin termostabil.
n 1971, investigaiile fcute de Sakazaki i colaboratorii, pe 2720 de
tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la bolnavii cu diaree, au demonstrat
c 98% dintre acestea erau Kanagawa pozitive, n timp ce din 650 de
tulpini de V. parahaemolyticus izolate de la vieuitoare acvatice doar 1%
erau Kanagawa pozitive. Aceast corelaie ntre fenomenul Kanagawa i
proveniena tulpinilor, i-a determinat pe cercettori s foloseasc acest test
pentru identifcarea tulpinilor virulente.
Testarea acestei teorii pe animalele de laborator a demonstrat c
tulpinile de V. parahaemolyticus, Kanagawa pozitive produc dilatarea
ansei ileale ligaturate de iepure, n timp ce tulpinile Kanagawa negative
nu produc aceast dilatare.
hemolizina Kanagawa este o molecul proteic sensibil la tripsin i
termostabil, cu o greutate molecular de 44.000 daltoni, compus din dou
uniti monomerice identice cu greutatea molecular de 22.000 daltoni.
V. parahaemolyticus mai produce i alte toxine (adezine i mucinaze)
ce asigur aderarea i ptrunderea bacteriei n enterocit, unde se iniiaz
producerea de hemolizine.
Rezervorul principal pentru V. parahaemolyticus este reprezentat
de apele estuarelor, apele litorale, sedimentul blilor, zooplancton, pete,
meduze, crustacee, sepii i calmari (oliver i colab., 1997).
Toxiinfeciile alimentare au un caracter sezonier, majoritatea cazurilor
find semnalate n lunile iunie-octombrie.
Numai tulpinile Kanagawa pozitive sunt capabile s declaneze
toxiinfecii alimentare (oliver i colab., 1997). Studiile efectuate pe probe
de alimente, ap i sedimente marine, arat c doar 1% dintre tulpinile
izolate sunt Kanagawa pozitive.
Cel mai frecvent implicate n producerea unor toxiinfecii alimentare
sunt crustaceele i lamelibranhiatele consumate crude sau insufcient
preparate termic.
Beuchat (1982) a constatat c din 42 de cazuri de toxiinfecii alimentare
determinate de V. parahaemolyticus, 33 au fost produse prin consum de
crevei, consumai sub form crud sau tratai termic prin abur nclzit.
Cel mai mare episod de toxiinfecii alimentare cu V. parahaemolyticus
a avut loc n SuA, producnd 320 de mbolnviri prin consumul de crevei
feri insufcient i pstrai n condiii improprii. Tot n SuA, majoritatea
152
cazurilor de mbolnviri au fost provocate de consumul de midii i stridii
crude, recoltate din apele Pacifcului.
Vibrio vulnifcus
Produce mai multe toxine. Cea mai important este o hemolizin-
citolizin, o toxin extracelular cu proprieti antigenice, termolabil i
citolitic pentru eritrocitele de mamifere. Aceast toxin are o greutate
molecular de 56.000 daltoni i acioneaz mpreun cu ali factori
de virulen. Aceast hemolizin acioneaz, n special, n infeciile
extradigestive, determinnd edem, necroz local sau distrucii locale de
esut (Kreger i lockwood, 1981).
Studiile clinice efectuate de oliver i colab. (1989) au dus la concluzia
c exist o legtur ntre septicemiile cu V. vulnifcus i o serie de disfuncii
hepatice, cum sunt cele produse de etilism, hepatite cronice, hepatoze,
care determin o suprancrcare a capacitii de legare a ferului de ctre
transferina seric. Simpson i olivier au demonstrat c tulpinile virulente de
V. vulnifcus nu au produs infecia, cnd transferina era incomplet saturat
n fer, dar aceasta s-a instituit rapid, atunci cnd transferina era complet
saturat.
Simpson i colab. au artat c exist o corelaie strns ntre virulen
i aspectul morfologic al coloniilor. Ei au observat c tulpinile virulente
formau colonii opace i translucide, iar cele avirulente formau numai colonii
translucide. Au corelat opacitatea coloniilor cu capacitatea tulpinilor de a
folosi ferul, legat de transferin i cu virulena (prezena capsulei).
V. vulnifcus a fost izolat n toat lumea, rezervor principal find
considerate stridiile. A fost izolat i din crabi, raci, peti i crevei (Tamplin
i colab., 1982).
Vibrio alginolyticus
(miyamoto i col., 1961).
Este o specie asemntoare cu V. parahaemolyticus. Prezint cili
laterali, fenomenul de roire pe suprafaa mediilor solide, capacitatea de
multiplicare la 40C, metabolizarea zaharozei, valeratului, l-leucinei i l-
tirozinei.
farmer i colab. (1985) constat c n urma unui studiu pe 74 de
izolate, 5,4% au origine fecal sau intestinal.
n Japonia, V. alginolyticus a fost izolat n procent de 0,5% din populaia
sntoas, neasociat cu simptome specifce bolilor aparatului digestiv.
153
Vibrio alginolyticus a fost izolat din toate tipurile de alimente cu
origine acvatic: peti, crevei, homari, crabi, scoici, midii, stridii.
Vibrio anguillarum
(Bergeman, 1909)
Este o specie patogen pentru peti, la care produce o boal septicemic
(septicemia hemoragic) caracterizat prin leziuni de miozit necrotic i
hemoragii subcutanate. Produce pierderi n cresctorii.
declanarea infeciei este corelat cu temperatura apei, care trebuie s
aib minimum 15C.
7. Vibrio metschnikovii, Gamabia, 1888 (V. cholerae biovar proteus,
Shewar i Veron, 1974).
Produce gastroenterit la psri i o form benign de holer la om,
descris sub numele de cholera nostras.
Aceast specie se ntlnete sporadic n apa potabil i apa marin
din forduri, golfuri sau mri nchise. A fost semnalat la gtele i raele
domestice, hrnite cu fin de pete sau care sunt crescute n sistem extensiv-
gospodresc.
Vibrio mimicus
A fost izolat din scoici i probe de ap i din scaunele diareice i probele
de secreie otic de la pacienii cu gastroenterite sau cu otite externe.
Se transmite prin produse marine crude.
4.10. metode de izolare i identifcare
a speciilor din genul Vibrio din alimente
Pentru identifcarea corect a vibrionilor trebuie respectate dou
aspecte:
cultivarea vibrionilor halofli s se realizeze pe medii de purifcare
a culturii i de identifcare cu concentraie optim de clorur de sodiu. de
exemplu, V. parahaemolyticus izolat pe mediul TCBS i subcultivat pe medii
nesuplimentate cu clorur de sodiu prezint caractere biochimice aberante;
urgena identifcrii lui V. cholerae; este favorizat de caracterul
nonhalofl al speciei.
154
Tabelul 4.4.
Caractere difereniale ale biovarurilor de V. cholerae 0:1
(dup Buiuc d., 1999)
Testul
a
Clasic Biovarul El-Tor
hemoliza
b
- d
hemaglutinarea
c
- +
Sensibilitatea la:
Polimixina B (50 uI)
+ -
fagul clasic IV + -
fagul El Tor - +
a
Simboluri: + = > 90% din tulpini pozitive; d = 11-89% din tulpini pozitive; - = >
90% din tulpini negative.
b
hematii de berbec.
c
hematii de pui de gin.
Pentru identifcare se trimit la laborator materiale patologice
reprezentate de probe de ap, coninut intestinal, alimente pete i fructe de
mare.
Examenul bacterioscopic const n efectuarea de nsmnri din
probe proaspete sau conservate n medii de transport (Cary-Blair).
folosirea ca mediu de cultur a apei peptonate alcaline cu efectuarea
de pasaje la ase ore de la suprafaa mediului, permite izolarea rapid a
germenului n cultur pur.
Se examineaz aspectul cultural i mobilitatea accentuat a
germenilor.
Pentru identifcarea preliminar a genului se mai pot folosi urmtoarele
teste: oxidaz, sensibilitatea la agentul vibriostatic o/129, tolerana la
6-6,5% NaCl i testul uviei de dNA.
Testul oxidazei difereniaz speciile de Vibrio, Aeromonas i
Plesiomonas shigelloides, oxidaz pozitive, de enterobacteriacee, care
eventual cresc pe mediile selective (de exemplu: Proteus vulgaris), oxidaz-
negative. Excepie face V. metschnikovii, lipsit de citocromul C, care este
oxidaz negativ.
Principiu: Citocrom oxidaza este o hemoprotein din lanul respirator
de transport al electronilor, cuplat cu fosforilarea oxidativ. Sub aciunea
citocrom oxidazei tetrametil-p-fenilendiamina este oxidat ntr-un compus
de culoare purpurie.
Procedura: Se plaseaz un dreptunghi din hrtie de fltru ntr-o plac
Petri i se umecteaz cu reactivul pentru oxidaz. Se prelev o poriune de
155
colonie cu o ans de platin ori cu vrful unei pipete Pasteur cudat n tromp
de musc i se etaleaz uor n spot pe suprafaa hrtiei impregnate.
Testul pozitiv: Se traduce prin virajul spotului la purpuriu n interval
de 10 secunde. un viraj mai tardiv, ntre 10 i 60 de secunde, nu este
caracteristic: poate f datorat testrii unei culturi btrne sau de pe un mediu
cu carbohidrai fermentabili.
Testul negativ: Se traduce prin absena culorii purpurii.
Testul vibriostatic cu o/129 (2,4-dinamic-6,7-diizopropilpteridina).
Se prepar o suspensie a tulpinii de identifcat cu turbiditatea echivalent
etanolului 0,5 mac farland i se nsmneaz ca pentru antibiograma
difuzimetric o plac cu agar tripticaz soia.
Se plaseaz pe aria nsmnat cte un disc cu 10 g i respectiv 150
g o/129.
orice zon de inhibiie aprut n fundul discurilor dup ncurbare
peste noapte semnifc un test pozitiv. Efciena testului a devenit relativ
odat cu apariia tulpinilor de V. cholerae rezistente la o/129. de exemplu,
peste 90% din tulpinile de V. cholerae o:1 izolate n India sunt rezistente la
ambele concentraii. deci, rezistena la o/129 nu exclude n mod necesar
aceast specie.
Tolerana la 6-6,5% naCl.
Acest test difereniaz corect genul Vibrio, tolerant, de Aeromonas i
Plesiomonas, care nu cresc la aceast concentraie salin.
Testul uviei de dnA.
Se suspensioneaz o colonie suspect de Vibrio, ntr-o pictur din
soluia 0,5% dezoxicolat de sodiu depus pe o lam de microscop.
Prin liza vibrionilor este eliberat dNA, care poate f tras cu ansa ca o
uvi. Testul difereniaz rapid V. cholerae de Aeromonas spp., care sunt
oxidaz pozitive i pot forma colonii asemntoare pe mediile de izolare.
Alternativ, izolatele suspecte pot f triate pe mediul TSI:
Vibrionii cu interes medical :
fermenteaz fr producere de gaz glucoza;
fermenteaz sau nu zaharoza;
uzual, speciile diareigene nu fermenteaz lactoza;
nu produc h
2
S.
Aeromonadele diareigene , uzual produc gaz din glucoz.
orict de fdel ar f, un singur test nu individualizeaz corect genul
Vibrio.
156
Pentru ca diferenierea s fe corect avem nevoie de o baterie minimal
de teste, care include: oxidaze, creterea pe agar nutritiv cu 0% i 6% NaCl,
fermentarea glucozei cu/fr gaz, testul uviei de dNA, sensibilitatea la
10 i 150 g o/129, la 10 g ampicilin.
Teste defnitive.
Se procedeaz la testele biochimice de confrmare a V. cholerae sau
de identifcare a celorlalte specii de Vibrio pornind de la cultura pur a
izolatelor suspecte.
Se utilizeaz pentru testri, medii cu concentraia de NaCl crescut
pn la 1%, cu excepia testelor de cretere n absena sau la alte concentraii
de sare. Se incubeaz la 30-37C i se urmresc rezultatele, pn la o
sptmn cu citire zilnic, pentru c, frecvent se pozitiveaz i n primele
dou zile.
Tabel 4.5.
Caractere biochimice difereniale ale speciilor
de Vibrio cu interes medical (dup Janda, 1998; mclaughlin, 1995)
Testul
a
V
.

c
h
o
l
e
r
a
e
V
.

m
i
m
i
c
u
s
V
.

p
a
r
a
h
a
e
m
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

v
u
l
n
i
f
c
u
s
V
.

a
l
g
i
n
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

f
u
v
i
a
l
i
s
V
.

f
u
r
n
i
s
s
i
V
.

h
o
l
l
i
s
a
e
V
.

d
a
m
s
e
l
l
a
V
.

m
e
t
s
c
h
n
i
k
o
v
i
i
V
.

c
i
n
c
i
n
n
a
t
i
e
n
s
i
s
V
.

c
a
r
c
h
a
r
i
a
e
oxidaz 100 100 100 100 100 100 100 100 95 0 100 100
o/129 zon de inhibiie
la discul cu 150 g
99 95 20 98 19 31 0 40 90 90 25 100
Creterea n bulion cu:
0% NaCl 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1% NaCl 100 100 100 99 99 99 99 99 100 100 100 100
6% NaCl 53 49 99 65 100 96 100 83 95 78 100 100
8% NaCl 1 0 80 0 94 71 78 0 0 44 62 0
10% NaCl 0 0 2 0 69 4 0 0 0 4 0 0
12% NaCl 0 0 1 0 17 0 0 0 0 0 0 0
Indol 99 98 98 97 85 13 11 97 0 20 8 100
Decarboxilaze Moeller
Arginin 0 0 0 0 0 93 100 0 95 60 0 0
lizin 99 100 100 99 99 0 0 0 50 35 57 100
ornitin 99 99 95 55 50 0 0 0 0 0 0 0
oNPG 94 90 5 75 0 40 35 0 0 50 86 0
157
Testul
a
V
.

c
h
o
l
e
r
a
e
V
.

m
i
m
i
c
u
s
V
.

p
a
r
a
h
a
e
m
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

v
u
l
n
i
f
c
u
s
V
.

a
l
g
i
n
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

f
u
v
i
a
l
i
s
V
.

f
u
r
n
i
s
s
i
V
.

h
o
l
l
i
s
a
e
V
.

d
a
m
s
e
l
l
a
V
.

m
e
t
s
c
h
n
i
k
o
v
i
i
V
.

c
i
n
c
i
n
n
a
t
i
e
n
s
i
s
V
.

c
a
r
c
h
a
r
i
a
e
Voges-Proskauer 75 9 0 0 95 0 0 0 95 96 0 50
Acid din:
l-arabinoz 0 1 80 0 1 93 100 97 0 0 100 0
m-inozitol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 100 0
Salicin 1 0 1 95 4 0 0 0 0 9 100 0
lactoz 7 21 1 85 0 3 0 0 0 50 0 0
zaharoz 100 0 1 15 99 100 100 0 5 100 100 50
ureaz 0 1 15 1 0 0 0 0 0 0 0 0
a
Rezultate pozitive exprimate procentual.
Biotipia
Vibrio cholerae o:1 se difereniaz n biovarurile, clasic i El Tor.
Vibrio cholerae o:139 este o mutant o a biovarului El Tor.
Serotipia
Vibrio cholerae o:1 are, indiferent de biovar, trei serovaruri defnite
prin factorii antigenici a, b i c: ogawa (a, b), Inaba (a, c) i hikojima (a, b,
c), primele dou curent izolate i cu rspndire epidemic, al treilea, foarte
rar i nerecunoscut de ctre unii specialiti.
Identifcarea combinat biovar-serovar ofer un marker epidemiologic
orientativ.
Lizotipia
Sistemul de lizotipare a biovarului El Tor a fost mult ameliorat prin
completarea setului Basu-mukerjee, cu cinci fagi litici (I-V), cu ali cinci
noi fagi i redefnirea diluiei test de la liza confuent la liza aproape
confuent.
n acest mod au fost defnite 146 de lizovaruri care acoper tiparea a
circa 99% din tulpini.
Capacitatea discriminatorie a acestor lizovaruri este excelent, mai
puin lizovarului 115, cu o prevalen de 12%.
metode ale biologiei moleculare
n prezent, mai greu accesibile, ofer markeri epidemiologici fdeli
pentru biovarul El Tor.
158
Tehnica de lucru
Prepararea probei
a) probe de pete: se recolteaz esuturi de suprafa, intestine,
branhii;
b) crustacee cu cochilie: se recolteaz ntregul coninut interior; se
adun 10-12 crustacee, din care se recolteaz 50 g pentru o prob test.
c) crustacee fr cochilie: se prepar n ntregime sau se recolteaz
poriunea central inclusiv branhii i intestine.
Ziua I:
Se amestec 450 ml de bulion cu NaCl 3% i polimixin B, ntr-un
blender steril pentru 1 minut, cu 8.000 rpm. Aceasta reprezint diluia 1:10.
n continuare se fac diluii seriate (1:100, 1:1.000, 1:10.000 etc.). din fecare
diluie seriat se trec cte 10 ml n cte 3 tuburi per diluie cu bulion GST
(glucose salt Teepol).
mbogirea: Se incubeaz bulioanele respective la 35C, 18-24 de
ore. dac diluarea i incubarea nu se pot realiza n aceeai zi, probele se
pstreaz pe ziua urmtoare la o temperatur cuprins ntre 0 i 5C. n
cazul produselor congelate se recomand s se efectueze o a doua izolare
dup 18 ore de incubare.
ziua a II-a:
Izolarea i identifcarea: dup incubare se nsmneaz din fecare tub
o ans de cultur pe suprafaa mediului de izolare TCBS (agar cu sucroz-
sare-bil-citrat-tiosulfat) (m65) n plci Petri (cte 3 per diluie) astfel nct
s se obin colonii izolate. Se incubeaz plcile la 35C, timp de 18-24 de
ore.
ziua a III-a:
Testul diferenial I: Se recolteaz cu acul de nsmnare dou sau
mai multe colonii tipice (netede, verzi, zaharoz negative, cu diametrul de
2-3 milimetri), de pe suprafaa plcilor cu agar TCBS i se transfer pe
urmtoarele medii:
a) Agar TSI salin: V. parahaemolyticus i V. vulnifcus realizeaz o
pant alcalin (roie = lactoz i zaharoz negative); baza mediului este
acid (galben = glucoz pozitiv), fr producere de gaze i nu prezint
nnegrire (hidrogen sulfurat negativ). Aceasta este o reacie tipic shigeloid
(Shigella-like). V. alginolyticus, V. fuvialis i V. metschnikovii dau o pant
acid i o baz fr gaz.
b) Mediul TSA (3% NaCl) i TSB (3% NaCl): Se nsmneaz mediile
TSA i TSB cu bacteria de cercetat i se nsmneaz 18-24 de ore la 35C.
Aceste culturi se folosesc ca surse de inoculare pentru alte teste, pentru
159
coloraia Gram i examinri microscopice. Vibrionii sunt bacterii Gram
negative, pleomorfe, cu aspect de bastonae, curbe sau drepte, prevzute cu
fageli polari.
c) Mediul pentru testarea mobilitii: Se inoculeaz un tub cu mediu
pentru testarea mobilitii prin neparea centrului coloanei de mediu n
profunzime. Se incubeaz 18-24 de ore la 35C. o cretere circular difuz
de la linia de nepare constituie un test pozitiv. V. parahaemolyticus i
vibrionii nrudii sunt mobili.
ziua a IV-a:
Testul diferenial II:
a) Bulion cu glucoz Hugh-Leifson (Hugh-Leifson glucose broth): Se
inoculeaz dou tuburi de mediu hlGB cu un ac de nsmnare de pe
mediul TSA. Se acoper suprafaa mediului cu ulei mineral steril ntr-un
strat de aproximativ 3 cm i se incubeaz 2-3 zile la 35C. dac culoarea
mediului se modifc din purpuriu n galben nseamn c microorganismul
fermenteaz hidraii de carbon. V. parahaemolyticus i vibrionii nrudii
fermenteaz glucoza fr producie de gaz.
b) Testul de citocrom oxidaz: Se nsmneaz bacteria de cercetat
pe mediul TSA i se incubeaz 24 de ore la 35C. Se adaug 2-3 picturi de
reagent pentru testul oxidazei peste coloniile bacteriene crescute pe pant
sau peste coloniile din plci Petri. dac n aproximativ 2 minute mediul se
va colora n albastru nchis testul este pozitiv. V. metschnikovii este negativ,
iar toi ceilali vibrioni halofli sunt pozitivi.
c) Testul pentru dihidrolaza argininei, lizinei i ornitindecarboxilazei:
mediile au culoare galben, ca rezultat al producerii de acid din glucoz.
Apariia unei culori violete i tulburarea mediului la sfritul perioadei de
incubare este considerat reacie pozitiv. Rezultatul acestor teste i a altor
teste difereniale sunt prezentate n tabelul de mai jos:
Tabelul 4.6.
Teste de difereniere a lui V. parahaemolyticus de bacteriile nrudite
Test V
.

p
a
r
a
h
a
e
m
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

a
l
g
i
n
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

a
n
g
u
i
l
l
a
r
u
m
V
.

v
u
l
n
i
f
c
u
s
V
.

f
u
v
i
a
l
i
s
V
.

m
e
t
s
c
h
n
i
k
o
v
i
i
A
e
r
o
m
o
n
a
s

h
y
d
r
o
p
h
i
l
a
P
l
e
s
i
o
m
o
n
a
s

s
h
i
g
e
l
l
o
i
d
e
s
TCBS (colonii verzi) + - - + - - - +
Creterea la 42C + + - nd var var - -
160
Test V
.

p
a
r
a
h
a
e
m
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

a
l
g
i
n
o
l
y
t
i
c
u
s
V
.

a
n
g
u
i
l
l
a
r
u
m
V
.

v
u
l
n
i
f
c
u
s
V
.

f
u
v
i
a
l
i
s
V
.

m
e
t
s
c
h
n
i
k
o
v
i
i
A
e
r
o
m
o
n
a
s

h
y
d
r
o
p
h
i
l
a
P
l
e
s
i
o
m
o
n
a
s

s
h
i
g
e
l
l
o
i
d
e
s
Creterea n medii cu:
NaCl 0%
NaCl 6%
NaCl 8%
NaCl 10%
-
+
+
-
-
+
+
+
-
+
var
-
-
var
-
-
-
+
var
-
-
+
var
-
+
-
-
-
+
-
-
-
lizindecarboxilaz + + - + - var - +
Arginindihidrolaz - - var - + + var +
ornitindecarboxilaz + var - var - - var var
fermentarea sucrozei - + + - + + var -
fermentarea lactozei - - - + - var var var
fermentarea manitolului + + + var + + + -
fermentarea arabinozei + - - - + - var -
Voges-Proskauer - + var - - + var -
d) Mediul TSB (salt tripticase broth), haloflismul: Se nsmneaz
4 tuburi cu mediu TSB ce conin 0, 6, 8 i 10% NaCl, din cultura de TSB
cu 3% NaCl. Se incubeaz 24 de ore la 35C. Speciile halofle de Vibrio
care cresc i n absena srii se dezvolt bine n mediul cu 6% NaCl. V.
parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. fuvialis i, ocazional, tulpinile de V.
metschnikovii se dezvolt n 8% NaCl. Numai V. alginolyticus crete bine n
mediile cu 10% NaCl.
e) Creterea la 42C: Se inoculeaz un tub cu bulion TSB cu NaCl
2% cu o ans de cultur bacterian de 24 de ore de pe mediul TSB cu
NaCl 3% i se incubeaz n baie marin la 42C, timp de 24 de ore. dac
creterea are loc n profunzimea mediului reacia este considerat pozitiv.
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i ocazional tulpinile de V. fuvialis i
V. metschnikovii sunt pozitive la acest test.
f) Bulionul MP-VP (testul Voges-Proskauer) (m56): se nsmneaz
un mediu mP-VP cu o ans dintr-o cultur de pe mediul TSA i se incubeaz
2 zile la 35C. Se efectueaz testul Voges-Proskauer. V. parahaemolyticus,
V. vulnifcus i V. fuvialis sunt VP negative, n timp ce V. alginolyticus i V.
metschnikovii sunt pozitive.
g) Reaciile de fermentare n bulion cu bromcrezol purpuriu: Se
inoculeaz cte un tub cu bulion cu sucroz, lactoz, manitol i arabinoz
cu o cultur bacterian de pe mediul TSA i se incubeaz la 35C pentru 4,
161
5 zile. Reacia acid se traduce prin virarea culorii bulionului din purpuriu
n galben. Rezultatele acestor teste de fermentaie sunt incluse n tabelul de
mai sus.
h) Fenomenul Kanagawa (agar Wagatsuma) (m71): Reacia
Kanagawa reprezint un test pentru determinarea prezenei hemolizinei
termostabile directe specifce pe agarul Wagatsuma. S-a constatat c
reacia pozitiv se coreleaz strns cu patogenitatea rezultatelor de V.
parahaemolyticus. Izolatele care produc boala la om, sunt de obicei Kanagawa
pozitive, n timp ce izolatele recuperate din hrana marin sunt Kanagawa
negative, aproape ntotdeauna. Pentru efectuarea testului Kanagawa se
introduce o pictur dintr-o cultur de 18 ore n TSB cu NaCl 3% cu o
scobitoare steril pe o plac cu agar snge Wagatsuma, bine uscat. Se pot
face mai multe nepturi de tip circular pe o singur plac. Se nsmneaz
ntotdeauna culturi pozitive i negative pe fecare plac. Se incubeaz la
35C i se urmresc rezultatele nregistrndu-se la 24 de ore.
Testul pozitiv const n beta-hemoliz, adic n clarifcarea mediului
n jurul coloniei datorit unui proces de hemodigestie. zona are o singur
margine, clar delimitat, fr inele concentrice multiple. hemoliza este pe
deplin clar, fr s aib loc nverzirea mediului. zonele de hemoliz se
observ de la marginea coloniei pn la marginea extern a zonei. Izolatele
care produc zone clare de hemoliz, mai mici de 3 mm pot f slab patogene
prin testul ansei ileale de la iepure. Este important de reinut c n acest test
nu e valabil nici o observaie dup 24 de ore.
i) Conservarea culturilor bacteriene: Se inoculeaz un mediu de
conservare semisolid pe termen lung prin nepare n profunzime. Se
las capacul lax, pn la apariia unei creteri vizibile n cursul incubrii
la 35C, timp de 24 de ore. Se nchide etan capacul pentru a mpiedica
deshidratarea i se pstreaz la temperatura camerei. Pentru conservarea
lui V. parahaemolyticus i a lui V. vulnifcus pentru cteva luni la -70C
se plaseaz 1 ml dintr-o cultur de 6-12 ore de TSB NaCl 3% i 0,09 ml
de dimetil-sulfoxid (dmSo) n criotuburi sterile; se congeleaz imediat la
-70C.
f) Confrmarea serologic a lui V. parahaemolyticus: Antigenele K,
care cuprind diferite grupe somatice sunt prezente n tabelul de mai jos:
Tabelul 4.7.
O grup Tipul K
1 1, 25, 26, 32, 38, 41, 56, 58, 64
2 3, 28
3 4, 5, 6, 7, 29, 30, 31, 33, 37, 43, 45, 48, 54, 57, 58, 59
4 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 42, 49, 53, 55, 63
162
O grup Tipul K
5 15, 17, 30, 47, 60, 61
6 18, 46
7 19
8 20, 21, 22, 39, 62
9 23, 44
10 19, 24, 52
11 36, 40, 50, 51
TOTAL 60 de tipuri K/63 de serotipuri
Se procedeaz astfel: se spal o pant cu 2 ml dintr-o soluie de NaCl 3%
(o suspensie mai mare este optim pentru acest test de aglutinare pe lam).
Suspensia de celule se mparte n dou volume egale n tuburi separate. Se
autoclaveaz tubul o or la 121C. Aceast suspensie autoclavat reprezint
antigenul o. Suspensia netratat reprezint antigenul K. Pentru
efectuarea reaciei de aglutinare o se mparte lama n 12 compartimente
egale, folosind un creion de cear. Se introduce o pictur n fecare
compartiment i se adaug cte o pictur din cele 11 antiseruri de grup
o. n compartimentul al 12-lea care conine martorul de aglutinare se
adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz uor lama timp de 1 minut
pentru amestecarea componentelor. Aglutinarea pozitiv se citete imediat.
Aceasta determin ce antigene de tip K trebuiesc testate. n acest
sens se marcheaz pe lam numrul de compartimente pozitive. Se plaseaz
o pictur mic de suspensie neautoclavat n fecare compartiment i se
adaug cte o pictur de antiser K adecvat n fecare compartiment. n
compartimentul de control se adaug o pictur de NaCl 3%. Se balanseaz
uor lama nainte i napoi pentru amestecarea componentelor, timp de un
minut. Se citete imediat.
4.11. Izolarea i identifcarea vibrionilor din produsele acvatice
n perioada 2007-2009 au fost recoltate i prelucrate prin examen
bacteriologic complex 25 de tulpini bacteriene din genul Vibrio, dintre
care 10 tulpini de Vibrio parahaemolyticus din scaun diareic, 5 tulpini de
Vibrio vulnifcus izolate din scoici, molute i stridii, 3 tulpini de Vibrio
alginolyticus izolate din probe de zooplancton, pete i ap, 2 tulpini de
Vibrio metschnikovii izolate din pete congelat i fin de pete i 2 tulpini
de Vibrio furnissi izolate din fin de pete.
Studiul s-a efectuat n cadrul facultii de medicin Veterinar,
163
Bucureti i a INCdmI Cantacuzino, Bucureti.
Caracteristicile celor 25 de tulpini analizate conform metodei propuse
de organizaia Internaional de Standardizare (SR/ISo-8914/1992) sunt
prezentate pe larg n tabelele 4.8 i 4.9.
Tabelul 4.8
Teste preliminare
nr.
crt.
Specia bacterian
nr.
de tul-
pini
Oxi-
daz
Colora-
ia
Gram
Mo-
bili-
tate
Glu-
coz
gaz
gluco-
z
Lac-
toz
Zaha-
roz
1 V. parahaemolyticus 10 + - + + - - -
2 V. vulnifcus 5 + - + + - + -
3 V. alginolyticus 5 + - + + - - +
4 V. metschnikovii 3 - - + + - + +
5 V. furnissi 2 + - + + - + -
Tabelul 4.9
Teste biochimice de confrmare
nr.
crt.
Specia bacterian
nr. de
tulpini
Adh LdC ONPG OdC Indol H
2
S
1 V. parahaemolyticus 10 - + - + + -
2 V. vulnifcus 5 - + + - + -
3 V. alginolyticus 5 - + - - + -
4 V. metschnikovii 3 - - + - - -
5 V. furnissi 2 + - + - - -
Legend:
Adh = arginin-dehidrolaz;
ldC = lizin-decarboxilaz;
oNPG = hidroliza ortonitrofenil--d-galactopiranozidei;
odC = ornitin-decarboxilaz;
h
2
S = producere de hidrogen sulfurat.
rezultatele antibiogramei
Analiznd comparativ rezultatele obinute n urma efecturii
antibiogramelor, constatm c, speciile de Vibrio non-holerice sunt sensibile
la aciunea tetraciclinei, a penicilinei, ampicilinei, cefalosporinelor,
cloramfenicolului, aminoglicozidelor i fuorochinolonelor. Vibrio
parahaemolyticus i Vibrio alginolyticus sunt rezistente la aciunea
penicilinei i a ampicilinei.
A fost constatat antibiorezistena unor tulpini la ampicilin (V.
alginolyticus i V. parahaemolyticus), la gentamicin (V. metschnikovii), la
164
eritromicin (V. parahaemolyticus, V. vulnifcus, V. alginolyticus).
Sensibilitatea maxim a fost constatat la tetraciclin, cefalosporine
i quinolone.
Rezultatele statistice ale interpretrii antibiogramelor sunt prezentate
n tabelul 4.10.
tulpini rezistente , cele care au zona de inhibiie 0-1 mm;
tulpini cu sensibilitate medie , cele care au zona de inhibiie 10-14
mm;
tulpini cu sensibilitate maxim , cele care au zona de inhibiie
14-16 mm;
Tabelul 4.10
Testarea sensibilitii tulpinilor Vibrio non-holerice fa de antibiotice
Specia bacterian
media zonei de inhibiie (mm)
T P A Cf Cfc C G E Ef Cft
V. parahaemolyticus 14,90 0,85 0,90 15,08 14,28 8,00 4,50 1 10,25 15,92
V. vulnifcus 16,00 5,00 4,38 14,35 14,25 3,28 6,25 1 10,50 16,00
V. alginolyticus 15,00 0,52 1,00 15,92 15,18 4,00 5,11 0,63 11,20 15,34
V. metschnikovii 15,52 6,28 2,00 16,00 15,92 8,25 0,73 3,28 13,40 14,28
V. furnissi 14,35 4,02 3,15 14,53 14,38 5,18 2,73 4,56 15,92 14,72
Legend: T = tetraciclin; P = penicilin; A = ampicilin; Cf = ciprofoxacin; Cfc
= cefaclor; C = cloramfenicol; G = gentamicin; E = eritromicin; Ef = enrofoxacin; Cft
= cefotaxim.
Tabelul 4.11
Interpretarea statistic a rezultatelor obinute din citirea antibiogramelor
Antibioticul
testat
media zonei
de inhibiie
Tulpini
rezistente (%)
Tulpini cu
sensibilitate
medie (%)
Tulpini cu
sensibilitate
maxim
Tetraciclin 15,15 0 0 100
Penicilin 3,33 40 60 0
Ampicilin 2,28 40 60 0
Ciprofoxacin 15,17 0 0 100
Cefaclor 14,80 0 0 100
Cloramfenicol 5,74 0 100 0
Gentamicin 3,86 20 80 0
Eritromicin 2,09 40 60 0
Enrofoxacin 12,25 0 0 100
Cefotaxim 15,25 0 0 100
din studiile efectuate s-au desprins urmtoarele concluzii:
Speciile de Vibrio au fost izolate i identifcate din diferite probe 1.
biologice prin metoda ISo-8914/1992.
165
n ceea ce privete fermentarea lactozei, au fost negative tulpinile 2.
de V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i pozitive cele de V. vulnifcus, V.
metschnikovii i V. furnissi.
Prin coloraia Gram s-a dovedit c toate tulpinile de vibrioni au 3.
fost Gram negative.
Testul oxidaz a fost pozitiv pentru toate speciile, n afar de 4. Vibrio
metschnikovii, care a rspuns negativ la aceste teste.
Testul mobilitii i fermentarea glucozei au fost pozitive, n toate 5.
cazurile, n timp ce nici una dintre tulpini nu a produs gaz din glucoz.
Testele preliminare au fost reprezentate de: testul oxidazei, 6.
coloraia Gram, mobilitate, glucoz, gaz-glucoz, lactoz, zaharoz.
Rezultatele testelor biochimice de confrmare au fost 7.
urmtoarele:
cele 5 tulpini de V. alginolyticus au rspuns pozitiv la urmtoarele
teste: ldC, indol i negativ la Adh, oNPG, odC, h
2
S;
V. vulnifcus, toate cele 5 tulpini au rspuns negativ la Adh,
odC, h
2
S i pozitiv la ldC, oNPG, indol;
V. furnissi , cu 2 tulpini pozitive la Adh i oNPG i negative la
ldC, odC, indol, h
2
S;
V. parahaemolyticus , toate cele 10 tulpini au rspuns negativ la
Adh, oNPG, h
2
S i pozitiv la ldC, odC, indol.
V. metschnikovii , cu 3 tulpini izolate a rspuns pozitiv la oNPG
i negativ la toate celelalte teste de confrmare;
cele 25 de tulpini non-holerice de Vibrio s-au dovedit a f sensibile
fa de urmtoarele antibiotice: tetraciclin, penicilin, aminoglicozide,
fuorochinolone.
am remarcat faptul c vibrionii sunt bacterii halofle, ce se
dezvolt optim n mediile cu concentraii n clorur de sodiu situate n
intervalul 1-6%;
tulpinile de V. parahaemolyticus i V. alginolyticus au fost
rezistente la aciunea penicilinei i a ampicilinei;
sensibilitatea maxim (de 100%) a fost constat la tetraciclin,
ciprofoxacin, cefaclor, enrofoxacin, cefotaxim;
tulpinile de Vibrio testate de noi s-au dovedit a f rezistente fa
de aciunea penicilinei (40%), ampicilin (40%), gentamicinei (40%) i
eritromicinei (20%).
n produsele alimentare solide, la temperaturi de refrigerare i
congelare vibrionii se distrug rapid, iar la temperaturi mai mari de 80C
rezist cteva minute.
166
Izolarea i identificarea lui V. parahaemolyticus
-schema de lucru-
1. diluarea
probei alimentare
2. Efectuarea
diluiilor seriate
3. mbogirea
Incubarea la 35C,
18-24 de ore
4. Obinerea
coloniilor izolate
5. Teste biochimice i serologice de confirmare
diluii seriate
n 90 ml
tampon fosfat
450 ml de diluant (ap cu 3% NaCl)
50 g aliment; se amestec la 8.000
rpmpt 1 min.
1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
0,1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
0,01 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
Agar TCBS
Izolarea i identificarea lui V. parahaemolyticus
-schema de lucru-
1. diluarea
probei alimentare
2. Efectuarea
diluiilor seriate
3. mbogirea
Incubarea la 35C,
18-24 de ore
4. Obinerea
coloniilor izolate
5. Teste biochimice i serologice de confirmare
diluii seriate
n 90 ml
tampon fosfat
450 ml de diluant (ap cu 3% NaCl)
50 g aliment; se amestec la 8.000
rpmpt 1 min.
1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
0,1 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
0,01 g de inocul
n fiecare tub
GSTB
Agar TCBS
167
mediu selectiv Agar TCBS (tiosulfat-citrat-bil-sucroz) propus de NAKANIShI
(1962), modifcat de KoBAYAShI et al. (1963). Se utilizeaz la izolarea i cultivarea
selectiv a Vibrio cholere i ali vibrioni enteropatogeni (V. parahaemolyticus, NAG
vibrios).
Vibrio parahaemolyticus: Colonii grii, de dimensiuni
medii, nehemolitice
168
Bacili Gram-negativi, curbai. frotiu din cultur de Vibrio cholera
Vibrio parahaemolyticus : Bacili drepti sau curbai.
microscopie n contrast de faz
169
BIBLIOgrAfIE
Adams mR & moss mo., 2000, Bacterial Agents of foodborne Illness., food 1.
microbiology 2nd Edition, The Royal Society of Chemistry; P.184-271.
Chai TJ & Pace Jl., 2001. Vibrio parahaemolyticus, hui Yh, Pierson md & 2.
Gorham JR, editors. foodborne disease handbook Volume 1: Bacterial Pathogens,
2nd Edition. New York: marcel dekker, Inc.; P.407-437.
dalsgaard et al., 2001. Vibrio vulnifcus., foodborne disease handbook Volume 3.
1: Bacterial Pathogens, 2nd Edition. New York: marcel dekker, Inc.; P.439-470
fAo/Who. Joint fAo/Who Activities on Risk Assessment of microbiological 4.
hazards in foods. Preliminary document. hazard Identifcation, Exposure
Assessment and hazard Characterization of Vibrio spp. in Seafood. disponibil la:
ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/vibrio.pdf
Gram l & huss hh. fresh and Processed fish and Shellfsh, 2000, The 5.
microbiological Safety and Quality of food. Volume I. maryland: Aspen
Publishers, Inc; P.472-506.
heymann dl., 2004, Cholerae and other Vibrioses., Control of Communicable 6.
diseases manual, 18th Edition. Washington dC: American Public health
Association;. P.103-117 united States food and drug Administration Centre for
food Safety and Applied Nutrition. Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup
o1. disponibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap7.html
International Commission on microbiological Specifcations for foods., 1996, 7.
Vibrio cholerae, microorganisms in foods Characteristics of microbial Pathogens.
london: Blackie Academic & Professional; P.414-425.
International Commission on microbiological Specifcations for foods, 1996, 8.
Vibrio parahaemolyticus, microorganisms in foods 5. Characteristics of microbial
Pathogens, Blackie Academic & Professional; P. 426-435.
International Commission on microbiological Specifcations for foods, 1996. 9.
Vibrio vulnifcus, microorganisms in foods 5. Characteristics of microbial
Pathogens., Blackie Academic & Professional P.436-439.
International Commission on microbiological Specifcations for foods., 1998. 10.
fish and fish Products., microorganisms in foods 6. microbial Ecology of food
Commodities, Blackie Academic & Professional; P. 130-189.
Kaysner CA., Vibrio species, 2000. The microbiological Safety and Quality of 11.
food. maryland: Aspen Publishers, Inc.; P.1336-1362.
170
Nutrition. Vibrio vulnifcus. disonibil la: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/ 12.
chap10.html
oliver Jd & Japer JB., 1997, Vibrio species., doyle mP, Beuchat lR & montville 13.
TJ. food microbiology fundamentals and frontiers. Washington dC: ASm
Press; P.228 264.
Raport Comisia Europeana. opinion of the Scientifc Committee on Veterinary 14.
measures, Public health on Vibrio vulnifcus and Vibrio parahaemolyticus (in
raw and undercooked seafood) (adoptat la data de 19-20 sept. 2001).
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 15.
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 16.
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere n 17.
micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-86571-
5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor 18.
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor 19.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor 20.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973- 21.
736-090-8
Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, 22.
ISBN: 978-973-736-089-2
Sutherland J. & VRNAam A., 2000, Enterotoxin-producing Staphylococcus, 23.
Shigella, Yersinia, Vibrio, Aeromonas and Plesiomonas., Blackburn CW &
mcClure PJ., editors. foodborne Pathogens. hazards, Risk Analysis and Control.
Cambridge: Woodhead Publishing limited;. P. 358-415.
united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied 24.
Nutrition, Bad Bug Book: Vibrio cholerae Serogroup Non-o1. disponibil la:
http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap8.html
united States food and drug Administration Centre for food Safety and Applied 25.
Nutrition, Vibrio parahaemolyticus: http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap9.html
171
united States food and drug Administration Centre for food Safety and 26.
Applied
xu h et al., 1998, occurrence and distribution of Vibrios in fishes and Shellfshes 27.
in Coastal Waters of hong Kong, Acta oceanologica Sinica, 17: 545-553.
Yam WC et al., 1999. Abundance of Clinical Enteric Bacterial Pathogens in 28.
Coastal Waters and Shellfsh. Water Research; 34: 51-56.
172
CAPITOLUL 5
Implicaiile campylobacteriilor n toxiinfeciile alimentare
5.1. Caractere generale
Genul Campylobacter conine 25 de specii, iar dintre acestea cea mai
important specie izolat din alimente este Cam. jejuni subsp. jejuni. Spre
deosebire de Cam. jejuni subsp. doylei este rezistent la cefalotin, crete
la 42C i reduce nitraii n nitrii. diferenierea de Cam. coli const n
capacitatea de a hidroliza hipuratul. Genul Campylobacter este strns
nrudit cu genul Arcobacter. Campilobacteriile au fost clasifcate n trecut
ca specii Vibrio.
din punct de vedere morfologic Cam. jejuni este un bacil subire
n form de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi,
multispiralate, ct i scurte, cocoide. Este monofagelat, iar fagelul poate
f dispus la unul sau la ambii poli ai celulei bacteriene. Produce oxidaz
i catalaz i nu se dezvolt la 25C, n prezen de NaCl 3,5%. Este
microaerofl, necesitnd pentru cretere cantiti mici de oxigen (3-6%).
Temperaturile minime, optime i maxime de cretere pe mediile solide sunt
de 30C, 40C i respectiv 45C. Se dezvolt bine la un ph ntre 5,5-8,0 i
n prezen de NaCl 1,75%. Creterea este inhibat de oxigen 21%. dioxidul
de carbon 10% este necesar pentru creterea bacterian. metabolismul este
respirator.
datorit dimensiunilor lor mici, campilobacteriile pot f separate de
alte bacterii Gram negative folosind fltre de 0,65 microni.
Campilobacteriile cresc mai lent pe mediile de cultur dect
enterobacteriaceele.
de obicei, nu sunt asociate cu mediul nconjurtor ci cu animalele
homeoterme. S-a dovedit c majoritatea animalelor de carne conin aceste
microorganisme n fecale, n special psrile de cas.
Cel puin cteva tulpini de Cam. jejuni produc o enterotoxin
termolabil asemntoare cu enterotoxinele produse de Vibrio cholerae i
Escherichia coli. Producia maxim de toxin ntr-un mediu special are loc
la 42C, n 24 de ore i sporete prin adugarea de polimixin.
Simptomele toxiinfeciilor provocate de aceste microorganisme includ
173
durere sau crampe abdominale, diaree, disconfort, cefalee, febr. Perioada
de incubaie este de obicei de 48-82 de ore, dar poate ajunge i la 7-10
zile, organismul putnd f detectat chiar i dup dou luni de la ncetarea
simptomelor.
Enteritele campilobacteriene sunt de origine alimentar n proporie de
90%. Cam. jejuni, ca i Vibrio parahaemolyticus i Yersinia enterocolytica
sunt bacterii ce se distrug uor la temperatura de pasteurizare a laptelui.
Campilobacteriozele pot f prevenite prin prepararea termic a
alimentelor de origine animal, n special a laptelui i a crnii de pui.
5.2. Taxonomie
Genul Campylobacter face parte din familia Campylobacteriaceae
(Vandamme i de ley, 1991) i cuprinde urmtoarele specii: Cam. fetus cu
subspeciile: fetus i veneralis; Cam. jejuni cu subspeciile: jejuni i chloylei;
Cam. hyointestinalis cu subspeciile hyointestinalis i lawsonii; Cam.
sputorum cu subspeciile: sputorum i bubulus; Cam. mucosalis; Cam. coli;
Cam. helveticus; Cam. upsaliensis.
Tot din aceast familie, mai fac parte:
Genul 5 Lawsonia, cu specia Lw. intracellularis.
Genul 5 Helicobacter, cu specia tip Hlb. pylori.
Genul 5 Arcobacter, cu specia tip Aob. nitrofragilis.
5.3. Specii ale genului Campylobacter implicate n producerea
toxiinfeciilor alimentare
5.3.1. Campylobacter jejuni
Cam. jejuni se caracterizeaz morfologic prin forme caracteristice
de virgul sau litera S. Se pot ntlni i forme mai lungi, multispiralate,
ct i scurte, cocoide. n condiii neprielnice adopt forma cocoidal, care
pstreaz intacte peretele celular i fagelii.
Aceste forme pot trece ntr-o faz latent, n care tolerana la oxigen
este crescut. Pot rmne viabile mai multe luni, n apa rece, find capabile
s infecteze gazdele susceptibile, dar nu sunt cultivabile prin metode uzuale.
Este mobil, nesporogen, necapsulogen, Gram negativ.
Cam. jejuni i Cam. coli necesit o temperatur optim de cretere
mai mare (42-43C), fa de cea necesar altor campilobacterii, ele find
considerate specii termofle.
174
Se dezvolt pe medii obinuite, mbogite cu adaos de snge defbrinat
i unii acizi aminai.
Ca substane inhibitorii pentru restul forei bacteriene se nglobeaz
bacitracin (25 u/ml), polimixina B, sulfat (20 u/ml) sau novobiocin
(0,025 mg/ml).
la Cam. jejuni exist dou categorii moleculare de lipopolizaharide
(lPS) parietale. Prima cuprinde lPS de greutate molecular mare, cuprins
ntre 4,5 i 5 Kdal. Aceste lPS au o structur asemntoare cu cea a tulpinilor
de tip R de enterobacteriaceae.
A doua categorie de lPS parietale este reprezentat de componeni cu
greutate molecular mare, a cror structur este asemntoare cu lPS de la
tulpinile de tip S de la enterobacteriaceae.
n cadrul acestor dou categorii de lPS, exist o mare diversitate
structural i antigenic. dup Euzeby, la Campylobacter s-au identifcat
63 de serovarieti (dup schema propus de lior). dintre acestea
biotipul I este implicat n leziuni intestinale (enterita campylobacterian)
iar biotipul II responsabil de aa numita hepatit vibrionic (hepatit
campylobacterian). Componentele polizaharidice sunt antigenic distincte,
find antigene o termostabile, care formeaz baza schemei (larg utilizat)
de serotipare Penner.
Schema lior este construit pe baza proteinelor fagelare i de
suprafa, care sunt antigene termolabile.
n schema Penner au fost defnite 66 de antigene o, iar n schema lior
peste 160 de antigene termolabile.
Serotipizarea reprezint cea mai uzual metod de diagnostic,
ns utilizarea ei este posibil doar n laboratoarele specializate. n cele
nespecializate pot f utilizate seturi comerciale care combin biotipizarea i
testele de rezistotipizare.
Recent au fost descrise metode de tipizare molecular, majoritatea
find bazate pe anumite forme de analiz a dNA-ului.
Cam. jejuni este sensibil la aciunea unui spectru larg de ageni
antimicrobieni (tetraciclin, streptomicin) i chimioterapice, dar nu i la
aciunea polimixinei, bacitracinei i novobiocinei.
Cam. jejuni este o bacterie sensibil la aciunea agenilor fzici i chimici.
Este distrus de pasteurizare, clorinare, precum i prin iradiere cu raze gamma.
Supravieuirea crete la rece, dar procesele de congelare i decongelare
determin reducerea de 10 ori a numrului de microorganisme.
n condiii naturale sunt receptive galinaceele, n special ginile tinere
de 3-4 luni. Infeciile campylobacteriene au mai fost identifcate la curc,
bibilic, potrniche, dropie, ra, cioar, stru american Nandu.
175
Cam. jejuni mai produce gastroenterit i diaree mucoid-sangvino-
lent la taurine, ovine i om.
5.4. Epidemiologie
n 2006, au fost raportate 180.009 cazuri (179.510 confrmate) de ctre
24 state membre ale uE, Islanda i Norvegia (Grecia, Portugalia, Romnia
i liechtenstein nu au raportat). Numrul cazurilor de campylobacterioz
raportate n 23 de state cu date disponibile, att pentru 2005, ct i pentru
2006 a fost n mic msur diferit, constatndu-se doar o uoar scdere
(12%) a cazuisticii din 2006 fa de cea din 2005. Rata total a notifcrilor
a fost de 39,5 la 100.000 locuitori, cu cea mai mare rat a notifcrilor n
Republica Ceh (220,2 la 100.000). Numai lituania a raportat 0 cazuri.
Tabelul 5.1.
numrul i rata notifcrilor camylobacteriozelor raportate n UE i EEA/EfTA n
2006
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Austria C
5020 5020 60,7
Belgia C
5771 5771 54,9
Bulgaria A
75 75 1,0
Cipru C
2 2 0,26
Republica Ceh C
22713 22571 220,2
Danemarca C
3239 3239 59,7
Estonia C
124 124 9,2
Finlanda C
3439 3439 65,4
Frana C
2675 2675 4,2
Germania C
52035 52035 63,1
Grecia U
- - -
Ungaria C
6829 6807 67,6
Irlanda C
1815 1812 43,1
Italia C
801 801 1,4
Latvia C
0 0 0,0
Lituania A
624 624 18,3
Luxembourg C
285 285 60,8
Malta C
54 54 13,3
176
ara
Tipul de rapor-
tare
Total cazuri
Cazuri confr-
mate
Nr. cazuri per
populaii de
100.000 de
oameni
Olanda C
3401 3186 19,5
Polonia C
157 156 0,4
Portugalia U
- - -
Romnia U
- - -
Slovacia C
2797 2728 50,6
Slovenia C
944 897 47,1
Spania C
5883 5883 13,4
Suedia C
6078 6078 67,2
Marea Britanie C
52543 52543 87,0
Total UE
177304 176805 39,3
Islanda C
117 117 39,0
Liechtenstein N
- - -
Norvegia C
2588 2588 55,8
Total
180009 179510 39,5
Sursa: Raportri naionale. A = Raportri de date agregate; C = Raportri bazate
pe cazuri; - = fr raportare; u = nespecifcat
Figura 5.1.
distribuia pe grupe de vrst a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (177.469
cazuri)(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
/
1
0
0
.
0
0
0
5.4.1. distribuia campylobacteriozelor la om dup vrst i sex
177
date referitoare la distribuia pe grupe de vrst a infeciilor
campylobacteriene umane au fost furnizate n 2006 de 23 state europene
(177.479 cazuri). Cel mai mare numr de cazuri raportate a fost la grupa de
vrst 25-44 ani cu 51.155 cazuri (28,8%). Totui, n zece state cel mai mare
numr de cazuri a fost raportat la copii sub 5 ani. Acest grup de vrst a avut
i cea mai mare rat a notifcrilor (107,1 la 100.000).
Informaii privind sexul persoanelor bolnave au furnizat 23 de state
europene raportul brbai/femei find de 1,1:1, cu o rat a notifcrilor de
43,6 la 100.00 la brbai i 36,8 la 100.000 la femei.
5.4.2. Sezonalitatea
date referitoare la luna n care a a vut loc fecare caz de campylobac-
terioz au furnizat 23 de state europene, numai lituania a raportat 0 cazuri.
Cele mai multe cazuri au fost raportate n lunile de var, ntre iunie i sep-
tembrie.
5.4.3. Cazurile importate
date referitoare la statutul de boal importat sunt furnizate de 19
state membre ale uE, Islanda i Norvegia. Aproape 10% din cazurile de
campylobacterioz sunt raportate ca importate. n Cipru, republica Ceh,
ungaria, lituania, malta, Polonia, Slovacia i Spania 99% din cazurile
raportate sunt domestice, n timp ce n Suedia i finlanda, 63% i respectiv
59% din cazurile raportate sunt importate.
Figura 5.2.
distribuia sezonier a cazurilor de campylobacterioz n 2006 (178.838 cazuri)
(Centrul European Pentru Prevenirea i Controlul Bolilor, 2008)
C
a
z
u
r
i
Ian Feb Mar Apr Mai Iun Iul Aug Sep Oct Nov Dec
178
5.4.4. rezistena Campylobacter sp. la antibiotice
datele furnizate de Enter-net arat c C. jejuni i C. coli reprezint
43,0% i respective 2,3% din totalul infeciilor campylobacteriene declarate
de 25 state membre ale uE n anul 2006. o proporie mare (53,6%) a cazurilor
confrmate nu furnizeaz informaii referitoare la specia dat. ntre 2.200 i
4.801 izolate C. jejuni i ntre 430 i 630 izolate C. coli au benefciat de
antibiogram. Proporia tulpinilor rezistente la ciprofoxacin, acid nalidixic
i tetraciclin a fost mai mare la C. coli (57,6%, 51,0% i 45,9%) dect la
C. jejuni. Aproape toate tulpinile C. jejuni i C. coli testate au fost sensibile
la amoxicilina+acid clavulanic (99,9% i 100%) i gentamicin (98,8% i
98,2%).
n 2006, la fel ca i n 2005, Campylobacter a fost cea mai frecvent
raportat cauz a bolilor gastro-intestinale n uE, stnd la baza mai multor
focare naionale i internaionale de boal. Existena unei variabiliti mari
ntre sistemele de raportare a evenimentelor de la un stat la altul, alturi de
numrul destul de mare al cazurilor de boal neraportate face extrem de
difcil compararea datelor comunicate de diferite state. Sursele alternative
de informare, cum ar f utilizarea turitilor rentori n ar ca oameni
santinel, sugereaz un nivel foarte ridicat al cazuisticii neraportate n unele
state europene.
datele furnizate de Raportul privind zoonozele al uniunii Europene
pe anul 2006 arat c o surs important de expunere uman la campylo-
bacteriile transmisibile prin alimente este carnea de broiler. majoritatea sta-
telor au raportat nivele mari sau foarte mari ale prezenei acestei bacterii n
carnea proaspt de broiler. o serie de state au raportat o proporie ridicat
de izolate Campylobacter rezistente la antibiotice uzuale, i un interes par-
ticular l reprezint apariia tulpinilor rezistente al ciprofoxacin, un produs
folosit frecvent n afeciunile gastrointestinale severe la om.
5.5. Specii zoonotice din genul Campylobacter
dintre bacteriile care produc campylobacterioz la om i animale,
numai Cam. jejuni i Cam. coli prezint interes pentru sntatea public.
Aceti germeni se af la nivelul tractului intestinal al psrilor slbatice i
n cel al animalelor domestice. Carnea de pasre vndut n magazine este
mai des contaminat dect carnea roie i subprodusele de carne.
n rile industrializate determin pierderi economice ce se ridic la
mai multe milioane de lire sterline, find cea mai frecvent form de diaree
179
infecioas identifcat (inciden de 1% pe an).
omul se contamineaz prin consum de carne i lapte crude, carne
semipreparat sau prin apa contaminat.
Prevenirea infeciei se face att prin respectarea normelor igenico-
sanitare n ferme (mai ales de psri), abatoare (la sacrifcare i prelucrare),
magazine i gospodriile populaiilor (prin manipularea corect a materiilor
prime n timpul prelucrrii alimentelor).
n anul 1886, Theodor Escherich descrie campylobacteriile n
amprentele obinute din mucoasa colonului la autopsia copiilor mori de
cholera infantum.
n anul 1906, mcfadyean i Stockman izoleaz pentru prima dat
bacteria n timpul unor investigaii asupra avortului epizootic la oi i vaci,
iniiat de ministerul Britanic al Agriculturii.
n anul 1919, Smith i Taylor izoleaz germenul denumindu-l Vibrio
fetus.
Cercetrile efectuate la Institutul Pasteur, n anul 1963, au demonstrat
c aceste bacterii sunt diferite de vibrioni, iar pentru clasifcarea lor a fost
creat genul Campylobacter.
ntr-un penitenciar din SuA, n anul 1938, s-a descris primul caz la
om datorit consumului de lapte infectat, manifestat prin gastroenterit.
Butzler, n Belgia (1948), a reuit s izoleze bacteria din fecale. El a
demonstrat c n fecalele a 5% dintre copiii cu diaree pot f gsite campy-
lobacterii.
Prin tehnologia dNA modern s-a demonstrat c genul Campylobacter
alturi de Arcobacter, Helicobacter i Wolinella formeaz un grup distinct
de familii, cunoscut ca Superfamilia VI RNAr. Acest grup de bacterii se
caracterizeaz printr-o morfologie spiralat i o mobilitate mare care le
permite s se deplaseze liber prin mucus.
Cam. jejuni (90%) i Cam. coli (10%) produc majoritatea enteritelor
campylobacteriene n rile industrializate i n cele n curs de dezvoltare.
Cam. jejuni subspecia doylei se ntlnete la copii care triesc n
condiii sociale precare.
Cam. upsaliensis, Cam. lari, Cam. hyointestinalis i Arcobacter
butzlerii determin infecii rare la copii din rile subdezvoltate cu
semnifcaie incert.
Campylobacter fetus specia tip a genului, se ntlnete n infecii
sistemice la pacienii cu imunodefcien sau boal preexistent.
Helicobacter cineadi, izolat frecvent de la hamsteri i Hlb. fennelliae
produc n majoritatea cazurilor proctocolita homosexualilor (mishu i col.,
1995).
180
Hlb. heimannii, care nc nu a putut f cultivat se pare c este identic
cu cel izolat de la cini i pisici.
Hlb. pylori este monopatogen pentru om, jucnd un rol important n
producerea ulcerului peptic i a cancerului gastric.
5.6. metode de izolare i identifcare a genului Campylobacter
din alimente
5.6.1. Prepararea probelor
1. Buci de carne, molute, picioare de broasc. Se amestec 25 g
de prob alimentar cu 100 ml de bulion de mbogire cu soluia numrul
1 de antibiotice, ntr-un sac cu fltru Stomacher, timp de 3 minute. Proba se
recolteaz cu ajutorul unei pense sterilizate prin alcool fambare sau unui
clete steril.
dac proba este reprezentat de o carcas ntreag sau dac este
sngernd sau foarte gras se cltete 3 minute cu pepton 0,1% la un
raport prob/bulion de 1/6. Se ndeprteaz grsimea prin fltrare, printr-un
tifon steril. Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4C. Se ndeprteaz
supernatantul i se resuspend depozitul n 5 ml de pepton 0,1%. Se obine
diluia 1/10 dintr-un ml de sediment i 9 ml de pepton 0,1%. Se striaz
n plci Petri cu agar de izolare. Se incubeaz 24-48 de ore la 42C, ntr-o
atmosfer microaerofl.
2. Produse lactate.
a) lapte i crem de ngheat. Se determin i la nevoie se regleaz
ph-ul probei la 7,6. Pentru probele de lapte nefert se elimin etapa de
prembogire. n cazul probelor lactate procesate se utilizeaz o etap de
prembogire, care dureaz 4 ore. Se cntresc 2 porii de cte 25 ml i
se centrifugheaz la 16.000xg n condiii de refrigerare, 40 de minute. Se
ndeprteaz supernatantul, se recolteaz o ans de sediment i se amestec
cu 1 ml de pepton 0,1%. Se pipeteaz 0,1 ml de suspensie de cultur
emulsifat ntr-un tub steril i se adaug 0,1 ml de tampon pepton 0,1%.
Se amestec uor i se striaz pe medii de izolare. Plcile se incubeaz 24-
48 de ore la 42C, n condiii microaerofle.
b) Brnz i unt. Se amestec 2 probe de cte 25 g fecare cu 100 ml
de pepton 0,1%, la 10.000-12.000 rpm, 30 de secunde. Se fltreaz probele
printr-un tifon steril i se centrifugheaz n condiii de refrigerare la 16.000xg,
timp de 40 de minute. Se ndeprteaz supernatantul i din sediment se fac
nsmnri pe un agar de izolare. Se resuspend un sediment n 100 ml
de bulion de mbogire ce conine suplimentul de antibiotic nr. 1 i un
181
alt sediment se resuspend n 100 ml de bulion de mbogire ce conine
suplimentul antibiotic nr. 3. Se regleaz ph-ul bulioanelor inoculate la 7,5.
3. Carne tocat sau organe. Se centrifugheaz 25 g de prob cu
100 ml de pepton 0,1% la 10.000-12.000 rpm, 15 secunde, dup care se
centrifugheaz n condiii de refrigerare la 2.000 x g timp de 2 minute.
Se transfer supernatantul ntr-o alt cup de centrifug steril i se
centrifugheaz la 5.000 x g pentru 30 minute. Se ndeprteaz supernatantul.
Se resuspend sedimentul n 2 ml de pepton 0,1% i se prepar o diluie
de 1/10 folosind 0,1 ml suspensie i 0,9 ml pepton 0,1%. Se striaz n
plci Petri pe agarul de izolare. Se incubeaz la 42C, 24-48 de ore, ntr-o
atmosfer microaerob. Sedimentul rmas se introduce n 100 ml bulion.
Pentru a crea o atmosfer microaerofl pentru creterea optim a
campilobacteriilor se utilizeaz una dintre urmtoarele metode de producere
de gaze:
sistemul de gaz cu bule fuent:
o se poate folosi o baie marin cu agitator care poate f reglat la 3
temperaturi (pentru procedura de prembogire de 5 ore) sau la 2 temperaturi
(pentru procedura de 4 ore); incubarea cu agitator este preferabil deoarece
stimuleaz o rat de cretere mult mai rapid; se regleaz baia la 30C i
se plaseaz sacii Stomacher; se conecteaz pipete la liniile de barbotare i
se ncepe producia de gaze; viteza agitatorului se regleaz la 50 rpm; se
incubeaz 3 ore; se regleaz temperatura la 37C i se incubeaz 2 ore; n
fnal se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz 19 ore;
o dac se folosesc prembogiri timp de 5 ore, n baie de ap static,
probele mbogite se incubeaz ntr-o prim etap la 30C pentru 3 ore,
fr barbotare deoarece bulionul devine anaerob i va f stimulat creterea
clostridiilor; probele mbogite se transfer ntr-o baie de ap la 37C i se
conecteaz pipetele din saci la liniile de barbotare; ncepe formarea gazelor;
dup 2 ore se regleaz la 42C;
o dac se utilizeaz o prembogire de 4 ore, sacii se plaseaz ntr-
un agitator sau ntr-o baie marin static la 37C; se conecteaz liniile de
barbotare i ncepe producerea gazului; dup 4 ore instalaia se regleaz la
42C i se incubeaz nc 20 de ore;
sistemul de agitare (incubator cu aer):
o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, se ncepe
incubarea la 37C, dup care se regleaz temperatura la 42C i se incubeaz
20 de ore;
o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore, se plaseaz
sticlele gazate ntr-un incubator cu agitator la 30C i se ncepe agitarea
la 200 rpm; dup 3 ore se ajusteaz temperatura la 37C; dup 2 ore se
182
regleaz la 42C i se incubeaz 19 ore;
sistemul de vase gazate:
o dac se folosete procedura de prembogire de 5 ore vasele se
introduc ntr-un incubator la 30C, pentru 3 ore, iar apoi se transfer la
37C, timp de 2 ore, i n cele din urm la 42C, timp de 19 ore;
o dac se folosete procedura de prembogire de 4 ore, vasele se
incubeaz la 37C, 4 ore i apoi la 42C, 20 de ore.
5.6.2. Izolarea speciilor de Campylobacter
Se striaz mediul de izolare dintr-o plac Petri cu o ans de cultur
bacterian din mediul de mbogire. Probele de lapte (aproximativ 3 ml)
se trec prin fltre de 0,65 microni. Este sufcient un fltrat de 0,25-0,5 ml. Se
nsmneaz att culturile fltrate ct i cele nefltrate. Plcile se plaseaz
n vasele de gazare i se incubeaz la 42C, timp de 24 de ore. dac dup
4 ore de incubare cultura bacterian nu se dezvolt, aceasta se reincubeaz
48 de ore la 37C.
5.6.3. Identifcarea speciilor de Campylobacter
Coloniile tipice de Campylobacter sunt rotunde sau de form
neregulat, de culoare alb pn la incolor cu marginile netede.
Se aleg cel puin 2 colonii per plac i se emulsifaz pe o lam de sticl
ntr-o pictur de ser fziologic. Se acoper cu o lamel i se examineaz la
un microscop cu cmp ntunecat sau cu ulei la un microscop cu contrast
de faz. Celulele de Campylobacter sunt curbe cu lungimea de 1,5-5
microni, se execut micri n zig-zag dac preparatul este fcut din medii
solide sau micri n tirbuon n cazul celulelor din bulion. Aproximativ
20% din izolatele de Cam. jejuni nu sunt mobile. Celulele btrne sau
stresate pot prezenta o mobilitate diminuat i o form cocoid. dac este
necesar resuscitarea plcilor, acestea se pstreaz la 4C, ntr-o atmosfer
microaerofl, ferit de lumin.
5.6.4. Confrmarea campilobacteriilor
Se recolteaz aproximativ 5 colonii caracteristice.
Se transfer 2 colonii bacteriene n sticle cu bulion de confrmare.
Se incubeaz la 42C, ntr-o atmosfer microaerofl 24 de ore, pn cnd
bulionul devine tulbure. Pentru inocularea substanelor biochimice se
folosesc culturi n bulion simplu, iar dac cultura respectiv nu se dezvolt
183
bine n acest mediu, se folosesc bulioane, cu ser bovin fetal. Se studiaz
urmtoarele proprieti:
producia de catalaz: se recolteaz o colonie pozitiv i se testeaz;
prezena bulelor arat c testul este pozitiv;
sensibilitatea la antibiotice: se inoculeaz uniform cu un tampon
steril imersionat n cultura n bulion, suprafaa unei plci Petri cu agar
infuzie de inim, cu 5% snge integral (sau lizat) i fBP 0,25%; se aplic
un disc de cefalotin i unul de acid nalidixic; se incubeaz la 37C, timp de
24-48 de ore, ntr-o atmosfer microaerofl; se msoar zonele de inhibiie
din jurul fecrui disc; majoritatea tulpinilor de Cam. jejuni sunt sensibile la
acid nalidixic i rezistente la cefalotin;
coloraia Gram: se folosete carbol-fuxin pentru coloraia de
contrast; speciile de Campylobacter sunt Gram negative;
hidroliza hipuratului: se nsmneaz ntr-o eprubet cu soluie de
hipurat o colonie mare de pe placa cu agar infuzie de inim (folosit la testul
de sensibilitate la antibiotice); se incubeaz 2 ore la 37C ntr-o baie marin;
se adaug 0,5 ml de reactiv minhidrin, se agit i se incubeaz 10 minute;
tuburile se citesc rapid, o culoare violet nchis indic o reacie pozitiv;
Cam. jejuni este pozitiv pentru acest test;
agar TSI: se inoculeaz mediul TSI i se incubeaz la 35-37C timp
de 5 zile, n atmosfer microaerob; Cam. jejuni produce o pant i o baz
alcalin, fr producie de hidrogen sulfurat;
utilizarea glucozei: se nsmneaz de 3 ori cu cultura de testat, 2
tuburi cu mediu fermentativ oxidativ; un tub conine glucoz, iar cellalt
numai baz; se incubeaz la 35-37C, timp de 4 zile, ntr-o atmosfer
microaerofl; speciile de Campylobacter nu utilizeaz glucoza sau alte
zaharuri;
testele de catalaz i oxidaz: se inoculeaz din culturi n bulion
o pant de agar cu infuzie de inim i se incubeaz la 35-37C, 48 de ore
ntr-o atmosfer microaerofl; se recolteaz o ans de cultur de pe pant i
se plaseaz ntr-o pictur de peroxid de hidrogen 3%; se adaug o pictur
de oxidaz; dac reactivul devine purpuriu, cultura este considerat oxidaz
pozitiv; Cam. jejuni este catalaz i oxidaz pozitiv;
tolerana la temperatura de cretere: se dilueaz 2 ml din cultura n
bulion cu pepton 0,1%, pn la turbiditatea standard mc farland nr. 1; se
striaz o linie n fecare dintre cele 3 plci cu agar-snge i infuzie de inim
fBP cu o ans de cultur diluat; n fecare plac se pot inocula 4 culturi; se
incubeaz o plac la 25C, una la 35-37C i a treia la 42C, pentru 3 zile
ntr-o atmosfer microaerofl; dac se produce o turbiditate accentuat n
mediul de cultur, nseamn c testul este pozitiv; Cam. jejuni nu crete la
184
25C, dar se dezvolt la 35-37C i la 42C;
creterea pe agar Mac Conkey: se nsmneaz o ans din cultura
n bulion pe agarul mac Conkey; pot f testate pe aceeai plac, pn la 4
culturi diferite; se incubeaz la 35-37C, 3 zile, n condiii microaerofle;
Cam. jejuni se dezvolt pe agarul mac Conkey;
teste biochimice pe medii semisolide: mediul semisolid conine bulion
Brucella, cu agar 0,18%; se aplic 0,1 ml de cultur diluat pe suprafaa
mediului i se incubeaz 5 zile;
o creterea n glicin 1%: Cam. jejuni este pozitiv;
o creterea n NaCl 3,5%: Cam jejuni este negativ;
o producerea de h
2
S din cistein: se inoculeaz mediul cu bacteria
de cercetat i se introduce pe lng dopul eprubetei o band de hrtie de
fltru mbibat cu acetat de plumb la aproximativ 1-2 cm distan de mediu:
nnegrirea benzii reprezint reacia pozitiv; Cam jejuni nnegrete banda n
poriunea de deasupra mediului;
o reducerea nitratului: nroirea coloniilor dup adugarea reactivilor
de nitrit este considerat reacie pozitiv; Cam. jejuni reduce nitraii n
nitrii.
185
T
a
b
e
l
u
l

5
.
2
.


d
i
f
e
r
e
n

i
e
r
e
a

s
p
e
c
i
i
l
o
r

d
e

C
a
m
p
y
l
o
b
a
c
t
e
r
C
a
r
a
c
t
e
r
e

b
i
o
c
h
i
m
i
c
e
C
a
m
.

j
e
j
u
n
i
C
a
m
.

c
o
l
i
C
a
m
.

l
a
r
i
C
a
m
.

f
e
t
u
s
s
u
b
s
p
.

f
e
t
u
s
C
a
m
.

c
i
n
a
e
d
i
C
a
m
.

f
e
n
n
e
l
l
i
a
e
C
a
m
.


c
r
y
a
e
r
o
p
h
i
l
u
s
C
a
m

h
y
o
i
n
t
e
s
t
i
n
a
l
i
s
C
a
m
.

u
p
s
a
l
i
e
n
s
i
s
C
r
e

t
e
r
e
a

l
a
:
2
5

C
3
5
-
3
7

C
4
2

C
-
+ +
-
+ +
-
+ +
+ + +
-
+ +
-
+ +
+ +
-
+ + +
-
+ +
R
e
d
u
c
e
r
e
a

n
i
t
r
a
t
u
l
u
i
:
+
+
+
+
+
-
+
+
+
N
a
C
l

3
,
5

%
-
-
-
-
-
-
-
-
-
h
2
S
,

T
S
I
-
+
-
-
-
-
-
+
-
C
a
t
a
l
a
z

+
+
+
+
+
+
+
+
-
o
x
i
d
a
z

+
+
+
+
+
+
+
+
+
m
a
c

C
o
n
k
e
y
+
+
+
+
-
-
-
+
-
m
o
b
i
l
i
t
a
t
e
+
+
+
+
+
+
+
+
+
C
r
e

t
e
r
e
a

n

1
%

g
l
i
c
i
n

+
+
+
+
+
+
-
+
+
u
t
i
l
i
z
a
r
e
a

g
l
u
c
o
z
e
i
-
-
-
-
-
-
-
-
-
h
i
d
r
o
l
i
z
a

h
i
p
u
r
a
t
u
l
u
i
+
-
-
-
-
-
-
-
-
R
e
z
i
s
t
e
n

a

l
a

a
c
i
d

n
a
l
i
d
i
x
i
c
S
S
R
R
S
S
S
R
S
R
e
z
i
s
t
e
n

a

l
a

c
e
f
a
l
o
t
i
n
R
R
R
S
S
S
S
S
S
186
Tabelul 5.3.
medii selective pentru Campylobacter
Mediul
Componenta bazal
(nutritiv)
Componenta
selectiv
Aspectul coloniilor
Skirow
Agar Columbia
snge de cal
Vancomicin
Trimetoprim
Polimixin
- 1-2 mm
- semitransparente
- rotunde, bombate
- suprafa umed
- tendin de a se ntinde pe striuri
Butzler
Agar Columbia
snge defbrinat de
cal
Novobiocin
- 1-2 mm
- semitransparente, gri-metalic,
strlu- citoare
- rotunde
- nehemolitice
Blaser-
Wang
Agar Columbia
snge de berbec ori
snge de cal
Vancomicin
Trimetoprim
Cephalothin
Amfotericin
B
Polimixin B
- 1-2 mm
- semitransparente, gri, umede
- rotunde, de mrimi diferite
- nehemolitice
Campy-ic
Agar nutritiv Cam-
pylobacter snge de
berbec 7-10%
Vancomicin
Rifampicin
Cefalotin
Trimetoprim
Colistin
- 1-2 mm
- rotunde, bombate
- de culoare gri-castaniu
- cu tendina de a se ntinde pe
striu
Campylosel
(bio-
mrieux)
Agar Columbia
snge de berbec 5%
Cefoprazon
Colistin
Vancomicin
Amfotericin
B
- 1-2 mm
- translucide
- plate, cu margini neregulate
- cu tendin de ntindere pe striu
- nehemolitice
Preston
Agar de baz Cam-
pylobacter snge
de cal
Polimixin B
Rifampicin
Trimetoprim
Cicloheximid
- 1 mm
- semitransparente
- preponderent rotunde
Karmali
Agar Columbia
crbune activat
hemin
Piruvat de Na
Cefoperazon
Vancomicin
Cicloheximid
- 3-5 mm
- semitransparente
- mucoase
- de form neregulat cu tendin
de a se ntinde pe striu
CCdA
Agar nutritiv crbune
activat
hidrolizat de cazein
Sulfat feros
Piruvat de Na
Cefoperazon
Amfotericin
B
- 2-3 mm
- semitransparente
- polimorfe, rotunde
- deseori mucoide
187
Campylobacter sp. Agar cu snge
Campy
Campylobacter fetus. hemocultur. Coloraia
Gram. Se remarc prezena bacteriilor poli-
forme cu predominan a formelor ncurbate,
n form de S sau spiralate
Campylobacter jejuni. frotiu din cultur de pe mediu solid. Bacili n form de virgul
sau litera S, dar i forme mai lungi, ct i scurte cocoide
Campylobacter fetus. subsp. intestinalis.
Agar cu snge
Campylobacter jejuni. microscopie
electronic flageli bipolari
188
Campylobacter jejuni
Campylobacter fetus. Agar tioglicolat
Campylobacter lari - rezistent; Campylobacter jejuni subsp. jejuni - sensibil. Scopul aces-
tui test este acela de a determina sensibilitatea unui microorganism la acid nalidixic. Este
de obicei folosit pentru identifcarea lui Cam. lari. discul cu acid nalidixic se plaseaz
n centrul plcii Petri i se incubeaz, dup nsmnare n condiii microaerofle. dac
apare o zon de inhibiie mai mare de 5-7 mm (msurat de la marginea coloniilor) cul-
tura respectiv este considerat pozitiv.
Campylobacter sp. Agar Campy.
189
Bibliografe selectiv
Achtman, m., K. zurth, G. morelli, G. Torrea, A. Guiyoule, and E. CRNAiel. 1.
1999. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia
pseudotuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 96:14043-14048.
Adak, G. K., J. m. Cowden, S. Nicholas, and h. S. Evans. 1995. The Public 2.
health laboratory Service national case-control study of primary indigenous
sporadic cases of campylobacter infection. Epidemiol. Infect. 115:15-22.
Altekruse, S. f., N. J. Stern, P. I. fields, and d. l. Swerdlow. 1999. Campylobacter 3.
jejuni-an emerging foodborne pathogen. Emerg. Infect. dis. 5:28-35.
Bolton, f. J., S. B. Surman, K. martin, d. R. A. Wareing, and T. J. humphrey. 4.
1999. Presence of Campylobacter and Salmonellae in sand from bathing beaches.
Epidemiol. Infect. 122:7-13.
Bolton, f. J., d. R. A. Wareing, m. B. Skirrow, and d. N. hutchinson. 1992. 5.
Identifcation and biotyping of campylobacters, p. 151-161. InR. G. Board, d.
Jones, and f. A. Skinner (ed.), Identifcation methods in applied and environmental
microbiology. Blackwell Scientifc Publications ltd., london, united Kingdom.
Bygraves, J. A., R. urwin, A. J. fox, S. J. Gray, J. E. Russell, I. m. feavers, 6.
and m. C. J. maiden. 1999. Population genetic and evolutionary approaches to
the analysis of Neisseria meningitidis isolates belonging to the ET-5 complex. J.
Bacteriol. 181:5551-5556.
Embley, T. m. 1991. The linear PCR reaction: a simple and robust method for 7.
sequencing amplifed rRNA genes. lett. Appl. microbiol. 13:171-174.
Enright, m., and B. G. Spratt. 1998. A multilocus sequence typing scheme for 8.
Streptococcus pneumoniae: identifcation of clones associated with serious
invasive disease. microbiology 144:3049-3060.
feavers, I. m., S. J. Gray, R. urwin, J. E. Russell, J. A. Bygraves, E. B. 9.
Kaczmarski, and m. C. J. maiden. 1999. multilocus sequence typing and antigen
gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J.
Clin. microbiol. 37:3883-3887.
harrington, C. S., f. m. Thomson Carter, and P. E. Carter. 1997. Evidence for 10.
recombination in the fagellin locus of Campylobacter jejuni: implications for the
fagellin gene typing scheme. J. Clin. microbiol. 35:2386-2392.
heuvelink, A. E., J. J. h. C. Tilburg, N. Voogt, W. van Pelt, W. J. van leeuwen, 11.
J. m. J. Sturm, and A. W. van de Giesen. 1999. Surveilance of zoonotic bacteria
among farm animals (dutch). RIVm-report 285859-009. RIVm, Bilthoven, The
Netherlands.
holmes, E. C., R. urwin, and m. C. J. maiden. 1999. The infuence of 12.
recombination on the population structure and evolution of the human pathogen
190
Neisseria meningitidis. mol. Biol. Evol. 16:741-749.
hudson, J. A., C. Nicol, J. Wright, R. Whyte, and S. K. hasell. 1999. Seasonal 13.
variation of Campylobacter types from human cases, veterinary cases, raw
chicken, milk and water. J. Appl. microbiol. 87:115-124.
huson, d. h. 1998. SplitsTree: a program for analysing and visualising 14.
evolutionary data. Bioinformatics 14:68-73.
Jackson, C. J., A. J. fox, d. m. Jones, d. R. Wareing, and d. N. hutchinson. 1998. 15.
Associations between heat-stable (o) and heat-labile (hl) serogroup antigens of
Campylobacter jejuni: evidence for interstrain relationships within three o/hl
serovars. J. Clin. microbiol. 36:2223-2228.
Jolley, K. A., J. Kalmusova, E. J. feil, S. Gupta, m. musilek, P. Kriz, and m. 16.
C. J. maiden. 2000. Carried meningococci in the Czech Republic: a diverse
recombining population. J. Clin. microbiol. 38:4492-4498.
Ketley, J. m. 1997. Pathogenesis of enteric infection by Campylobacter. 17.
microbiology 143:5-21.
Konkel, m. E., S. A. Gray, B. J. Kim, S. G. Garvis, and J. Yoon. 1999. Identifcation 18.
of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on
the cadf virulence gene and its product. J. Clin. microbiol. 37:510-517.
Kumar, S., K. Tamura, and m. Nei. 1994. mEGA: molecular evolutionary genetics 19.
analysis software for microcomputers. Comput. Appl. Biosci. 10:189-191.
maiden, m. C. J. 2000. high-throughput sequencing in the population analysis of 20.
bacterial pathogens of humans. Int. J. med. microbiol. 290:183-190.
maiden, m. C. J., J. A. Bygraves, E. feil, G. morelli, J. E. Russell, R. urwin, 21.
Q. zhang, J. zhou, K. zurth, d. A. Caugant, I. m. feavers, m. Achtman, and
B. G. Spratt. 1998. multilocus sequence typing: a portable approach to the
identifcation of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc.
Natl. Acad. Sci. uSA 95:3140-3145.
maynard Smith, J. 1991. The population genetics of bacteria. Proc. R. Soc. 22.
london B 245:37-41.
maynard Smith, J., C. G. dowson, and B. G. Spratt. 1991. localized sex in 23.
bacteria. Nature 349:29-31.
maynard Smith, J., N. h. Smith, m. oRourke, and B. G. Spratt. 1993. how 24.
clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 90:4384-4388.
Nachamkin, I., B. m. Allos, and T. ho. 1998. Campylobacter species and Guillain- 25.
Barre syndrome. Clin. microbiol. Rev. 11:555-567.
Nachamkin, I., h. ung, and C. m. Patton. 1996. Analysis of hl and o serotypes 26.
of Campylobacter strains by the fagellin gene typing system. J. Clin. microbiol.
191
34:277-281.
Parkhill, J., B. W. Wren, K. mungall, J. m. Ketley, C. Churcher, d. Basham, T. 27.
Chillingworth, R. m. davies, T. feltwell, S. holroyd, K. Jagels, A. V. Karlyshev,
S. moule, m. J. Pallen, C. W. Penn, m. A. Quail, m. A. Rajandream, K. m.
Rutherford, A. h. van Vliet, S. Whitehead, and B. G. Barrell. 2000. The genome
sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable
sequences. Nature 403:665-668.
Peabody, R., m. J. Ryan, and P. G. Wall. 1997. outbreaks of Campylobacter 28.
infection: rare events for a common pathogen. Communicable dis. Rep. 7:R33-
R37.
Penner, J. l., J. N. hennessy, and R. V. Congi. 1983. Serotyping of Campylobacter 29.
jejuni and Campylobacter coli on the basis of thermostable antigens. Eur. J. Clin.
microbiol. 2:378-383.
Selander, R. K., d. A. Caugant, h. ochman, J. m. musser, m. N. Gilmour, and 30.
T. S. Whittam. 1986. methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial
population genetics and systematics. Appl. Environ. microbiol. 51:837-884.
Skirrow, m. B. 1994. diseases due to Campylobacter, helicobacter and related 31.
bacteria. J. Comp. Pathol. 111:113-149.
Simona Ivana, 2002 Bacteriologie veterinar special (Ed. Ceres, Bucureti; 1.
460 pagini), ISBN: 973-40-0568-5
Simona Ivana, 2005 Bacteriologie general (Ed. tiinelor medicale, Bucureti; 2.
250 pagini), ISBN: 973-86485-7-2
Simona Ivana, 2006 Tratat de bacteriologie medical-veterinar i introducere 3.
n micologie (Ed. tiinelor medicale, Bucureti;768 pagini), ISBN (10) 973-
86571-5-6; ISBN (13) 978-973-86571-5-1
Simona Ivana, 2007 manual de microbiologia alimentelor (Ed. tiinelor 4.
medicale, Bucureti; 160 pagini), ISBN: 978-973-86571-3-7
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. I (Ed. tiinelor 5.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-01-6
Simona Ivana, 2007 microbiologie medical veterinar, Vol. II (Ed. tiinelor 6.
medicale, Bucureti) ISBN: 978-973-1847-00-9; 978-973-1847-02-3
Simona Ivana, 2008, microbiologia alimentelor, Ed. orizonturi, ISBN: 978-973- 7.
736-090-8
Simona Ivana, 2008, Practical guide of microbiogical diagnosis, Ed. orizonturi, 8.
ISBN: 978-973-736-089-2
192
Slater, E., and R. J. owen. 1998. Subtyping of Campylobacter jejuni Penner 9.
heat-stable (hS) serotype 11 isolates from human infections. J. med. microbiol.
47:353-357.
Staden, R. 1996. The Staden sequence analysis package. mol. Biotechnol. 5:233- 10.
241.
uerbaum, S., J. maynard Smith, K. Bapumia, G. morelli, N. h. Smith, E. 11.
Kunstmann, I. dyrek, and m. Achtman. 1998. free recombination within
helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. uSA 95:12619-12624.
Walker, R. I., m. B. Caldwee, E. lee, P. Guerry, T. J. Trust, and G. m. Ruiz- 32.
Palacios. 1986. Pathophysiology of Campylobacter enteritis. microbiol. Rev.
50:81-94.
Wareing, d. 1999. The signifcance of strain diversity in the epidemiology of 33.
Campylobacter jejuni gastrointestinal infections. Ph.d. thesis. university of
Central lancashire, Preston, united Kingdom.
Wassenaar, T. m., and d. G. Newell. 2000. Genotyping of Campylobacter species. 34.
Appl. Environ. microbiol. 66:1-9.
193
CAPITOLUL 6
TOxIInfECII ALImEnTArE dE OrIgInE
BACTErIAn CU InCIdEn rEdUS
6.1. genul Aeromonas
6.1.1. Taxonomie
Interesul tiinifc fa de bacteriile din genul Aeromonas a crescut
foarte mult ncepnd cu anul 1980, cnd s-a demonstrat patogenitatea lor
pentru om i animale, i mai ales asocierea unora dintre specii cu bolile
gastrointestinale la oameni, cu alur de toxiinfecii alimentare.
S-au izolat, de la muli copii cu diaree, specii de Aeromonas
productoare de enterotoxine.
din momentul demonstrrii semnifcaiei lor patogene s-au ntreprins
numeroase cercetri referitoare la taxonomia complicat a genului i la
factorii de virulen implicai n infeciile umane i animale.
dei continu s existe ideea c toxiinfecia alimentar ar f provocat
numai de A. hydrophila specia tip a genului n realitate aceast mbolnvire
poate f cauzat i de alte specii, n primul rnd de A. sobria.
Genul Aeromonas cuprinde 14 specii. Speciile clasice ale grupului
psichrofl (A. salmonicida, cu subspeciile sale) i ale grupului mezofl (A.
hydrophila, A. caviae, A. sobria) sunt de fapt fenospecii, n care analizele
prin hibridare dNA-RNA au delimitat 12 grupe de hibridare (hG) care, dat
find homologia de 70-100% n cadrul unei grupe de hibridare, au cptat
rang de genospecii:
A. hydrophila = hG
1
;
A. salmonicida = hG
3
;
A. caviae = hG
4
;
A. media = hG
5
;
A. eucremephila = hG
6
;
A. sobria = hG
7
;
A. veronii biovar sobria = hG
8
;
A. jandaei = hG
9
;
194
A veronii biovar veronii = hG
10
;
A. schubertii = hG
12
.
Au rmas nenumite hG
2
i hG
11
.
la acestea se adaug noi specii, care au fost defnite pe criteriul
secvenierii RNA
r
16S:
A. allosaccharophila ;
A. trota.
Analiza secvenial a RNA-ului subunitii ribozomale justifc pentru
aeromonade rangul de familie.
6.1.2. morfologie
Aeromonadele sunt bacili Gram negativi, uneori cu aspect cocoid, de
0,3-1 micron grosime/1-3,5 microni lungime, drepi, indistinci de bacilii
coliformi.
Sunt monotrichi, cu un mic fagel polar, n mediile lichide i pot deveni
peritrichi n culturile tinere pe mediile agarizate.
Toate subspeciile de A. salmonicida sunt atriche (imobile).
Sunt necapsulogeni i nesporogeni.
6.1.3. Condiii de cultivare i caractere culturale
Germeni facultativ anaerobi, nepretenioi nutritiv, tolerani pn la
4% NaCl, ph 5-9 sau sruri biliare.
Pot f mbogii n ap peptonat alcalin i cresc bine pe medii
selective uzuale pentru izolarea enterobacteriaceelor i a vibrionilor.
Speciile mezofle se cultiv optim la 35-37C i formeaz n 24 de
ore colonii cu diametrul de 3-5 mm, cenuii, uor rugoase. Coloniile de A.
caviae sunt nehemolitice.
multe tulpini ale altor specii sunt beta hemolitice pe agar cu snge de
berbec, iar la o examinare superfcial pot f confundate cu Pseudomonas
aeruginosa, fr a avea ns luciu metalic sau arome caracteristice bacilului
piocianic.
Exist tulpini care produc hemoliz dubl, format dintr-o zon extern
de hemoliz incomplet i una intern, complet de beta hemoliz.
A. salmonicida este specia tip a genului, este psichrofl, patogen
pentru peti i se cultiv optim la 22-25C, formnd pe medii cu 1 tirozin
un pigment brun, hidrosolubil.
Pentru izolare se folosesc medii speciale, cum ar f mediul difco-
furunculosis-agar.
195
Tabel 6.1.
Criteriile de difereniere ale subspeciilor din specia A. salmonicida
(dup Quinn i col., 1994)
A. salmonicida
(subspeciile)
Pigment
brun
gaz din
glucoz
Catalaz Importana patogen
Subsp. salmonicida + + + furunculoz (tulpini tinere)
Subsp. nova - - - Eritrodermatit la crap
Subsp. achromogenes - - +
Se izoleaz de la salmonide i
sunt considerate tulpini atipice
Subsp. masoucida - + +
dei aeromonadele sunt bacterii fr cerine nutritive speciale, putnd
crete uor pe medii simple, izolarea lor din alimente i materiale patologice
este posibil numai prin folosirea mediilor selective, pe suprafaa crora se
striaz materialul de cercetat i pe care se dezvolt colonii caracteristice,
dup o incubare de 24-48 de ore la 35C.
menionm cteva dintre aceste medii selective:
agarul nutritiv cu snge de oaie i ampicilin (SB-A);
agarul cu amidon i ampicilin;
agarul de difereniere pentru Aeromonas (AdA);
agarul selectiv Pseudomonas-Aeromonas (GSP-agar).
de pe suprafaa mediilor selective inoculate i incubate se aleg cte
5 colonii caracteristice, care se nsmneaz fecare n cte o eprubet cu
bulion nutritiv i alta cu agar nutritiv nclinat, care constituie cultura ce se
supune testelor de diagnostic menionate mai sus.
6.1.4. Ecologie
Aeromonadele se izoleaz curent din apele dulci (ruri, lacuri, fntni,
rezervoare de ap), din coninutul gastrointestinal al petilor, batracienilor,
reptilelor i a unor vertebrate superioare, de unde contamineaz uor solul i
produsele agricole. Prezena lor n biotipurile marine este ocazional.
la om produc gastroenterite. Acioneaz toxic prin elaborarea a dou
enterotoxine, dintre care una este aerolizina (citolizin bet-hemolitic), iar
alta o citotoxin.
Exist mai multe aerolizine distincte imunologic i genetic, dar cu
mecanism de aciune unic. Aerolizinele produse de A. hydrophila i A.
veronii prezint cele mai strnse nrudiri imunologice.
Infeciile extradigestive sunt reprezentate de infecii ale plgilor,
bacteriurii, iar la gazdele imunocompromise (anemie aplastic, leucemie,
196
sarcoame, ciroz hepatic), infecii sistemice.
A. salmonicida produce furunculoz la somn, iar A. hydrophila este
patogen pentru broate, la care produce infecia numit red leg.
la peti produce infecii locale sau septicemie. Elaboreaz o endotoxin
i o hemolizin, care acioneaz cooperant.
6.1.5. diagnostic
Tipurile de Aeromonas pot f confundate cu Escherichia, Enterobacter,
Providencia, ns spre deosebire de enterobacteriacee sunt oxidaz pozitive
(tabelul 6.2).
Tabel 6.2
Teste minimale pentru diferenierea ntre genurile:
Vibrio, Aeromonas i Plesiomonas (dup Buiuc d., 1999)
Testul
a
Vibrio
Aeromonas Plesiomonas
Non-
halofl
halofl
Oxidaza + +
b
+ +
Creterea pe agar cu:
0% NaCl
6% NaCl
+
+
-
+
+
-
+
-
Glucoz:
fermentarea
Producere de gaz
+
-
+
-
c
+
v
+
-
Testul uviei DNA + +
d
- -
Rezistena la:
o/129 (10 g)
o/129 (150 g)
Ampicilin (10 g)
-
c
-
e
-
v
v
v
+
+
+
-
-
-
a
Simboluri: + = reacie pozitiv (pentru testele de rezisten: rezistent); - = reacie
negativ (pentru testele de rezisten: sensibil); v = diferit la diferite specii.
b
Cu excepia V. metschnikovii.
c
Cu excepia V. furnissi i rare tulpini de V. damsella.
d
Cu excepia unor tulpini de V. parahaemolyticus.
e
Cu excepia A. trota.
Teste defnitive. Identifcarea speciilor de Aeromonas poate f fcut
prin bateria de teste recomandate n tabelul 1.7.
197
Testele adiionale sunt necesare pentru diferenieri corecte ntre
grupele A. hydrophila, hG
2
A. salmonicida (utilizarea dl-lactatului i
acidului urocanic, fermentarea d-rhamnozei).
A. caviae A. media (utilizarea dl-lactatului, fermentarea manozei,
producerea de pirazinamidaz i beta-hemoliz), dar rmn de competena
laboratoarelor de referin.
de altfel, erorile pentru izolatele cu semnifcaie clinic sunt semnifca-
tive, dat find diferena de patogenitate ntre A. hydrophila i A. caviae, pe
de o parte i speciile cu care pot f confundate, pe de alt parte.
A. allosaccharophila nu poate f identifcat corect n laboratorul clinic
date find multiplele asemnri fenotipice cu alte specii.
Ca markeri epidemiologici, accesibili numai laboratoarelor de
referin, sunt de reinut grupele serologice o i ribotiparea.
Tabel 6.3.
Caractere biochimice ale speciilor din genul Aeromonas
(dup Euzeby, 1993)
Caracterul 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ldC + - + - - + + + - + + +
odC V - - - - - - - - - - +
Adh V + + + + + + + + + + -
Indol + + + + + + + - + + + +
VP - - - - + - + + + - + +
hemoliz V v + - + + + + + v + +
Esculin V + - + + - - - - - - +
Glucoz** + - + + + + + - + + + +
Arabinoz** V + - + + - - - - - - -
Celobioz* + + + - + - - v + v +
manitol* + + + + + - + + + +
zaharoz* + + - + + - - - + - + +
Salicin - + - + + - - - - - - +
Legend:
* Are loc acidiferea.
** Produce gaz din glucoz.
1 = A. allosaccharophila;
2 = A. caviae;
3 = A. enteropelogenes;
4 = A. eucrenophila;
5 = A. hydrophila;
6 = A. ichthiosmia;
7 = A. jandae;
8 = A. schubertii;
9 = A. sobria;
10 = A. trota;
11 = A. veronii (sobria);
12 = A. veronii (veronii)
198
6.2. genul Plesiomonas
Conine specia P. shighelloides, care este un bacil Gram negativ,
cilogen. Are form de bastona drept, cu capetele rotunjite (0,8-1-3 microni),
grupat izolat, n perechi sau n lanuri scurte, asporogene, acapsulogene.
Este o bacterie nepretenioas nutritiv, facultativ anaerob, catalaz i
oxidaz pozitiv. metabolismul este fe respirator, fe fermentativ.
fermenteaz hidraii de carbon cu producere de acid, dar nu i de
gaze.
Cele mai multe tulpini se dezvolt pe medii minerale, care conin o sare
de amoniu, ca unic surs de azot i glucoza, ca singur surs de carbon.
Nu elaboreaz exofermeni ca fosfataz, lipaz, deoxiribonucleaz
i proteinaze. decarboxileaz lizina, ornitina i arginina. Reduc nitraii n
nitrii, produc indol i nu produc acetilmetilcarbinol, hidrogen sulfurat,
fenildezaminaz, gelatinaz. Nu hidrolizeaz malonatul i nu pot folosi
citratul ca unic surs de carbon. dau reacia KCN negativ.
un caracter biochimic important al bacteriilor din genul Plesiomonas
este fermentarea inozitolului, caracter care lipsete la toate genurile cu care
se aseamn.
Se cultiv pe medii uzuale ntre 8 i 45C, la ph 4,5-8,5.
Nu necesit suplimentarea cu sare a mediilor de cultur. Pe agar snge,
dup 24 de ore de incubare la 37C formeaz colonii rotunde, cu diametrul
de 1-2 mm, convexe, cenuii, nehemolitice.
majoritatea tulpinilor sunt sensibile la vibriostaticul 0-129 (2-4
diamino-6,7 diizopropil-pteridin).
n acest gen este ncadrat o singur specie P. shighelloides care
mai nainte a fost repartizat de diferii cercettori ntr-unul din genurile sau
familiile apropiate: Aeromonas, Vibrio, Pseudomonas, Enterobacteriaceae,
de care se deosebete printr-o serie de caractere proprii, menionate mai
sus.
S-a constatat c aceast specie bacterian are un antigen o comun
cu Shigella sonnei (de unde i numele), iar Sakazaki i colaboratorii, pe
baza studiului serologic la 57 de tulpini, le-au mprit n 16 grupe o. P.
shighelloides se izoleaz frecvent din apele dulci i estuariene, cu poluare
fecal. Concentraiile realizate sunt dependente de temperatura ambiant,
mari vara i mici iarna.
Bacteria a fost izolat din sedimente estuariene de la ipari, peti,
batracieni, crabi, scoici, precum i din fecale de om i maimu, ganglioni
limfatici de cine, embrioni de pui mori.
199
Poate determina ocazional diaree acut. Autorii japonezi au descris un
episod de gastroenterit infecioas, la om, produs de aceast bacterie.
6.3. genul Photobacterium
Bacteriile ncadrate n genul Photobacterium au form cocobacilar,
mai rar bacilar, mici (1-2,5/0,4-1 microni), dispuse izolat i, rar, n perechi,
asporogene, acapsulogene, de obicei mobile, Gram negative, facultativ
anaerobe.
Au un metabolism respirator sau fermentativ, oxidaz pozitive.
fermenteaz hidraii de carbon, cu producere de gaze. n general,
fermenteaz hexozele, dar nu i pentozele i hidraii de carbon mai compleci.
Produc amoniac din pepton, nitrii din nitrai, decarboxileaz lizina, dar nu
i ornitina.
Reacia Voges-Proskauer i pepton sunt pozitive. diger chitina
rar, lichefaz gelatina slab, nu hidrolizeaz amidonul. Sunt sensibile la
cloramfenicol, streptomicin, polimixina d i vibriostaticul o/129.
Se dezvolt pe medii nutritive obinuite, la un ph 6-9. unele tulpini
sunt halofle, neputndu-se dezvolta n bulionul nutritiv, dac nu conine
2-3% clorur de sodiu.
Concentraia optim de sare din mediile nutritive pentru aceste bacterii
este de 3%, majoritatea tulpinilor dezvoltndu-se la concentraii de 0,5-5%.
Temperatura optim de dezvoltare este de 20-30C.
n condiii convenabile acestei bacterii produc luminescen de unde i
numele dat genului. Aceast proprietate se pierde n urma trecerilor repetate
pe mediile artifciale.
habitatul obinuit al acestor bacterii l formeaz apa marin, suprafaa
corporal a unor specii de peti marini, precum i organele unor peti i
cefalopode.
Pot contamina petele i produsele din pete, i n condiii convenabile
de multiplicare concur la alterarea lor.
Speciile ncadrate n acest gen, sunt: P. phosphoreum; P. angustum; P.
leiognathi.
6.4. genul Brucella
Genul Brucella face parte din familia Brucellaceae.
Cuprinde ase specii: Bru. abortus, Bru. melitensis, Bru. suis, Bru.
canis, Bru. neotomae, Bru. ovis.
n cadrul primelor trei specii au fost identifcate mai multe biovaruri.
200
Speciile se difereniaz prin susceptibilitatea lor la fagi. Bru. melitensis,
Bru. abortus, Bru. ovis sunt subdivizate n 3,7 i respectiv 5 biovaruri, pe
baza urmtoarelor teste suplimentare:
necesitatea prezenei de dioxid de carbon; 5
producia de hidrogen sulfurat; 5
creterea n prezena coloranilor pe baz de tiamin i fucsin 5
bazic i aglutinarea serurilor monospecifce anti A i anti m.
Istoric. marston, n anul 1861, semnaleaz pentru prima dat la om o
infecie pe care o denumete febra de malta.
n 1887, david Bruce a izolat primul reprezentant al genului, din
splinele soldailor britanici mori, pe care l-a denumit iniial Micrococcus
melitensis, dup numele dat de localnici insulei lor (melita).
n 1897, Bang i Stribold, n danemarca, au izolat o bacterie
asemntoare, de la vaci, care au avortat.
Pe 21 iunie 1905, horrocks a izolat Bru. melitensis din laptele unei
capre, infectate natural. Investigaiile ulterioare au artat c peste 40%
din caprele de malta erau serologic pozitive, iar multe dintre ele aparent
sntoase excretau Bru. melitensis n lapte.
n 1918, Alice Ewans, n SuA, propune constituirea genului Brucella
(n cinstea lui Bruce), n care ncadreaz dou specii: Bru. melitensis i
Bru. abortus, find prima care a fcut legtura ntre micrococul lui Bruce i
bacilul lui Bang.
meyer i Shaw (1920) au confrmat cercetrile ntreprinse de Alice
Evans i au propus crearea genului Brucella, cu dou specii: Bru. melitensis
i Bru. abortus.
n 1929, huddleson a izolat Bru. suis, care fusese mult timp consi-
derat o varietate suin a bacilului lui Bang.
Bruceloza este considerat de ctre omS ca find cea mai rspndit
zoonoz.
n ara noastr, bruceloza a fost identifcat pentru prima dat n 1923,
de ctre flcoianu i mihilescu la bovine, n 1934 de Pop Al. la porcine,
iar n 1958 la iepuri i berbeci.
la om a fost semnalat de ctre Combiescu n 1939.
morfologie. Brucelele sunt cocobacili fni de 0,5-0,7 microni n
diametru i 0,6-1,5 microni n lungime, dispui izolat i mai rar, n perechi,
lanuri scurte sau mici aglomerri, Gram negativi. n general, se coloreaz
palid i de aceea, este indicat prelungirea la 1-3 minute a recolorrii cu
safronin sau fuxin.
Sunt nesporogeni, necapsulogeni i imobili. Prezint un grad redus de
acidorezisten, care st la baza coloraiilor speciale: Kster, Kozlowsky,
201
Stamp i, mai ales metoda Kster modifcat, recomandat de ctre omS.
Condiii de cultivare i caractere culturale. Brucelele sunt organisme
exigente care pot f cultivate pe medii de calitate, suplimentate cu glucoz,
ser sangvin sau snge. Infuzia de fcat, frecvent utilizat n trecut, este n
prezent nlocuit cu bulionul i agarul cu triptoz de soia. Agarul triptoz cu
5% ser bovin a devenit mediul standard pentru izolarea brucelelor, pentru
c satisface exigenele nutritive ale pretenioaselor tulpini de Bru. ovis i
Bru. abortus, biogrup 2, ca i a altor tulpini de Bru. abortus grup 3 i 4.
hemoculturile trebuie fcute n medii difazice (R. m. mnzat).
Izolarea brucelelor din prelevatele contaminate, impune suplimentarea
mediilor cu amestecuri selective compuse din bacitracin (25 uI/ml),
polimixin B (50 uI/ml), ciclohexamin (100 mg/ml) i nistatin (100 uI/
ml).
din punct de vedere respirator, brucelele sunt aerobe i carboxifle.
Necesit la cultivare anumii aminoacizi i vitamine i nu cresc pe agarul
mac Conkey. Pentru cretere sunt necesare tiamina, nicotinamida i biotina.
Creterea poate f stimulat prin adaos de ser normal, n proporie de 5-10%.
Creterea este inhibat pe medii care conin sruri biliare, telurit sau selenit.
Tulpinile de Bru. abortus biovar 2 sunt cele mai sensibile la inhibitori.
Temperatura optim pentru toate speciile de brucele este de 36-38C;
ph-ul corespunztor este n jur de 7.
Aciditatea excesiv (de ex: fermentaia unor brnzeturi) omoar rapid
celulele de Brucella.
la izolare creterea brucelelor este lent i de aceea culturile incubate
aerob n atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon trebuiesc urmrite pn la 10
zile, iar hemoculturile pn la 3 sptmni.
Cultivate n medii lichide, dup cteva zile de incubare produc o
turbiditate moderat cu depozit cenuiu i uneori inel la suprafa, producnd
i alcalinizarea mediului (ph 8). Creterea este slab dac nu se asigur o
aerare corespunztoare.
Creterea n medii lichide statice favorizeaz disocierea coloniilor din
netede n lucioase.
Pe agar cu 1% glucoz i 5% ser sangvin ori pe medii similare, dup
48 de ore la 37 de grade Celsius apar coloniile de Brucella care sunt rotunde,
convexe, de 0,1-1 milimetru n diametru i cresc n urmtoarele 4-5 zile
pn la 2-7 milimetri. Pe agar-snge sunt nehemolitice.
Pe cartoful glicerinat formeaz colonii lucioase de culoare glbuie,
care se pigmenteaz prin nvechire n brun ocolatiu.
n cazul mediilor semisolide, Bru. abortus Co
2
dependent produce
un disc de civa milimetri, sub suprafaa de cretere, n timp ce tulpinile Co
2

202
independente de Bru. melitensis i Bru. suis produc o turbiditate uniform
de la suprafa spre profunzime, pe o adncime de civa milimetri.
Pe mediile solide, coloniile din culturile primare sunt de tip S
(cu excepia lui Br. ovis i Br. canis, care dau colonii de tip R), dar prin
nvechire i treceri repetate apare la brucele, un fenomen de disociere
spontan n toate cele trei tipuri culturale principale (S, R, m). Acestea se
pot diferenia prin examinarea lor n lumin oblic (henry, 1932), ct i
pe baza caracterelor culturale n medii lichide, a stabilitii suspensiilor n
soluie cloruro-sodic i a aglutinabilitii suspensiilor nclzite la 90 de
grade Celsius (testul Burnet) sau tratate cu soluie de tripafavin 1/1000
(testul Panama). Astfel, coloniile de tip S dau o suspensie omogen cu
aceast soluie, iar cele de tip R i m aglutineaz.
Coloniile S examinate n lumin transmis apar galben-deschise,
transparente, cu aspect caracteristic de picturi de miere, iar n lumin
refectat prezint suprafaa neted, strlucitoare, cu transparen cenuiu
albstruie.
Coloniile R, mai puin transparente, au suprafaa mai granular, alb
mat sau alb glbuie i sunt fragile sau vscoase, difcil de detaat complet
de pe suprafaa mediului.
Coloniile netede sunt mai patogene, n timp ce variantele rugoase sunt
mai puin virulente. de aceea examinarea morfologiei coloniilor dintr-o
cultur prezint o importan deosebit n producerea de vaccinuri vii i n
antigene de diagnostic.
longevitatea n culturi este de aproximativ 2 luni.
diferenierea speciilor se poate face pe baza testului de cromobacte-
riostaz, care const n examinarea aciunii inhibante asupra multiplicrii
germenilor a unor substane colorante (tionina, fuxina etc.) adugate n
diferite concentraii la mediul huddleson.
Proprieti biochimice. Brucelele prezint proprieti fermentative
slabe, reduc nitraii n nitrii, nu produc indol, utilizeaz citratul de amoniu
ca unic surs de carbon, lichefaz gelatina, iar testul Voges-Proskauer i
testul roului metil sunt pozitive.
Caracterele biochimice permit diferenierea speciilor prin activitatea
ureazic i prin producerea de hidrogen sulfurat.
Proprieti antigenice i imunogene. la speciile clasice de brucele
(abortus, melitensis, suis) s-au evideniat n faza S dou componente de
nveli solubile, de natur polizaharidic, i anume:
factorul antigenic m (de la melitensis);
factorul antigenic A (de la abortus).
203
Cei doi factori antigenici difer cantitativ de la o specie la alta.
Alte dou antigene majore (R i z) au fost identifcate ulterior la
celelalte specii. Ca urmare, identifcarea serologic a speciilor este posibil
numai pentru seruri aglutinante (adsorbite), antimelitensis (anti m) i
antiabortus (anti A), inndu-se seama de titrurile reaciilor obinute n
raport cu titrurile celor dou seruri imune de referin.
Specii de brucele implicate n infeciile zoonotice
Speciile de brucele care transmit bruceloza la om sunt Brucella
melitensis, care afecteaz oile i caprele, Brucella abortus, care afecteaz
bovinele i Brucella suis, patogen pentru porcine.
Infecia se transmite prin contact direct sau indirect cu animalul infectat.
Are loc o infecie primar a sistemului reticuloendotelial cu bacteriemie i
febr ondulant. Infecia produce leziuni de tip granulomatos care pot afecta
diferite esuturi i organe. n urma bolii pot aprea sechele osteoarticulare,
cardiace i neurologice.
n urma administrrii antibioterapiei adecvate se produce vindecarea
n aproximativ 6 luni.
la animale brucelele se localizeaz la nivelul placentei (producndu-
se avort sau ftarea de produi infectai) sau a ugerului. Contaminarea
mediului se face prin excreie genital.
Transmiterea bolii la om se poate realiza i prin consum de lapte
nepasteurizat, brnz i alte produse din lapte.
Bruceloza nc este considerat endemic n Africa, orientul mijlociu,
Asia Central i de Sud-Est, America de Sud i unele ri mediteraneene.
Bruceloza este i o boal profesional n sensul c atac grupuri expuse
ca veterinari, fermieri, muncitori n abatoare, laboratoare, ferme, etc.
Proflaxia bolii se bazeaz pe educaia sanitar i pe supraveghere.
Tipurile predominante depind de sistemul regional de cretere.
Speciile de brucele care dezvolt colonii natural netede (de tip S) cu
localizare la nivelul placentei sau a ugerului, sunt responsabile de zoonoze
grave la om, n timp ce coloniile natural rugoase (de tip R) produc infecii
relativ benigne, fr transmitere la om.
n Romnia nu s-a semnalat niciodat infecia cu Brucella melitensis
la ovine, iar ultimul caz de bruceloz bovin a fost lichidat n 1969.
204
6.5. genul Enterobacter
Genul Enterobacter face parte din familia Enterobacteriaceae, find
o specie condiionat patogen. Specia implicat n toxiinfeciile alimentare
este Enterobacter sakazakii. Aceast bacterie a fost descoperit n anul 1961
i a fost iniial denumit Enterobacter cloaceae. Este o bacterie pigmentat
n galben ce cauzeaz enterocolite necrotice neonatale (NEC), meningite
neonatale i septicemii.
Vehiculul alimentar a fost reprezentat de ctre laptele praf. Este
considerat germen oportunist, de ctre unii autori. Cteva tulpini produc
enterotoxine, iar infecia experimental se reproduce pe oarecele sugar.
6.6. genul Bacteroides
Taxonomie. Genul Bacteroides face parte din familia Bacteroidaceae
i cuprinde 10 specii dintre care amintim: B. acidifaciens, B. gracilis,
fragilis, B. oris, B. ovatus, B. putredinis, etc.
Speciile din genul Bacteroides prezint urmtoarele caracteristici:
sunt Gram negative, obligatoriu anaerobe, saharolitice, conin enzime ale
ciclului fosfat-pentoz-monofosfat-hexoz. Are o compoziie n baze dNA,
guanin+citozin, 40-48 mol%, membrana conine sfngolipide, acizi grai
cu lanuri lungi, sintetizeaz menaquinonele mK 10 i mK 11 ca produi
majori, conin n stratul de peptidoglican, acid mezo-diamino-pimelic.
6.6.1. Bacteroides fragilis
Este un potenial patogen alimentar, deoarece a fost implicat n
producere diareei la om, alturi de A. hydrophila, i P. shigelloides.
Prezena enterotoxinei a fost demonstrat n 1984, iar tulpinile
enterotoxice de B. fragilis au fost pentru prima dat asociate cu sindromul
diareic uman, n 1987.
B. fragilis face parte din microbiota intestinal uman, n proporie de
2%.
6.7. genul Klebsiella
Primul reprezentant al genului Klebsiella a fost descris de ctre
friedlnder n anul 1883. Numele genului a fost dat n cinstea bacteriologului
Edwin Klebs (1834-1913).
Genul Klebsiella cuprinde bacterii imobile, capsulogene, care
205
fermenteaz glucoza cu producere de mari cantiti de gaz (excepie face
K. rhinoscleromatis). Pe mediile gelozate simple sau slab selective crete
repede, formnd de obicei colonii mucoide. fermenteaz majoritatea
zaharurilor (cu excepia dulcitolului) i produc acetoin din glucoz (reacia
Voges-Proskauer pozitiv).
Taxonomie. Genul Klebsiella include 12 specii (K. pneumoniae,
cu trei subspecii: pneumoniae, ozaenae, rhinoscleromatis; K. oxytoca, K.
(Raoultella) terrigena; K. (Raoultella) planticola; K.(Raoultella) orniti-
nolytica).
Pentru bacteriologia veterinar, de interes majoritar este K. pneumo-
niae, ca agent etiologic al unei game largi de infecii i K. oxytoca, care poate
f ocazional patogen. K. terrigena este saproft, nepatogen, prezent n sol
sau n ap, iar K. planticola se izoleaz de la plante i din mediul acvatic.
Principalul caracter diferenial al ultimelor trei specii fa de K.
pneumoniae este capacitatea lor de multiplicare la 10 grade Celsius.
6.7.1. Klebsiella pneumoniae
morfologie. Bacil polimorf, mare (0,6-6/0,3-1,5 microni), Gram
negativ, imobil, capsulogen i nesporogen. Tulpinile izolate din infecii au
capsule mari, bine vizibile prin coloraii obinuite. Se dispun izolai sau
n perechi, cap la cap, formnd diplobacili i uneori lanuri scurte (R. m.
mnzat).
Capsula este moale sintetizat in vivo i in vitro, cu caracter pronunat
mucos, de natur polizaharidic (fg. 5.2).
multe tulpini de K. pneumoniae i K. ozaenae posed pili (au fost
descrise diferite tipuri morfologice i hemaglutinante).
Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ
anaerob, ce se dezvolt pe medii uzuale la temperatura optim de 37 grade
Celsius n 18-24 de ore. n bulion produce turbiditate intens i un inel gros,
mucos la suprafa. Prin nvechire, gradul de vscozitate crete datorit
secreiei n exces de substan mucoas capsular, iar mediul capt un
aspect flant.
Pe agarul nutritiv formeaz colonii neuniforme mari, 4-5 milimetri
diametru, nepigmentate, rotunde, bombate, umede, cu aspect mucoid. Acest
aspect se accentueaz dup 48 de ore, cnd diametrul coloniilor atinge 4-5
milimetri, aprnd o evident tendin de confuare.
Pe mediile slab selective, coloniile lactoz-pozitive i pstreaz
206
caracterul mucoid.
Proprieti biochimice. fermenteaz glucoza cu producie de
gaz, produce ureaz, lizindecarboxilaz, utilizeaz citraii ca unic surs
de carbon, reacia Voges-Proskauer este pozitiv. Nu produce indol,
ornitindecarboxilaz, hidrogen sulfurat, gelatinoliz.
Proprieti antigenice. Klebsielele conin antigene somatice o
(lipopoliglucide, care dau frecvent reacii ncruciate cu polizaharizii o
Escherichia) i capsulare K (poliglucide acide capsulare ce dau reacii
ncruciate cu polizaharizii capsulari de S. pneumoniae, Escherichia, S.
paratyphi B).
deoarece, polizaharizii capsulari sunt termostabili, antigenele o
situate mai profund sunt greu de pus n eviden. n practic, se face numai
diferenierea serotipurilor K.
Tipizarea serologic se practic dup schema Kauffman i orscov.
ncadrarea ntr-un serovar K se poate realiza prin aglutinare, coagulare,
latex aglutinare. Prin oricare din aceste metode ncadrarea este laborioas i
pretenioas, datorit numrului mare de serovaruri i a nrudirilor antigenice
frecvente dintre acestea.
Ecologie. Principalul habitat al klebsielelor este tubul digestiv. n urma
contaminrii mediilor naturale cu fecale, K. pneumoniae se poate adapta i
multiplica ntr-o mare diversitate de biotipuri, cum ar f suprafaa arborilor,
plante, ceea ce implic acestora un caracter mucos-vscos.
Patogenitate. K. pneumoniae este o bacterie virulent (prin capsula
polizaharidic antifagocitar, prezena pililor cu aderen specifc,
bacteriocinele factori de autoselectare), posed o endotoxin, condiionat
patogen. Afecteaz, n special organismele cu aprare antiinfecioas
defcitar. odat ajuns n esuturi se nmulete rapid, este piogen, uneori
bacteriemic.
Klebsielele produc complicaii supurative bronhopneumonice post-
virale (mai ales n viroze tratate cu antibiotice i chimioterapice), n
tuberculoz; complic leziunile n pasteureloza iepurilor; produce infecii
secundare n tusea de canis, mai ales dup intervenia agenilor virali,
izolndu-se frecvent de la cinii bolnavi; mamite la vaci; infecii pulmo-
nare primare sau asociate cu ali germeni la viei i cobai); metrite la iap,
etc.
la om, subspecia ozaenae determin ozena, care se manifest printr-o
secreie nazal, purulent i fetid, cu leziuni granulomatoase i evoluie
cronic, iar subspecia rhinoscleromatis (frisch, 1882) produce rinoscleroma,
care se manifest printr-o rinit cronic cu leziuni granulomatoase.
Aceast bacterie a fost izolat dintr-un episod de toxiinfecie alimentar
207
cu Escherichia coli din probe de hamburgeri i din sngele unui pacient.
Tulpina de K. pneumoniae a fost lT pozitiv.
Infecia experimental. Animalul cel mai sensibil este oarecele alb
inoculat intraperitoneal, care face o infecie septicemic, iar n frotiurile
efectuate din organe se evideniaz numeroi germeni capsulai.
Sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice. Speciile de Klebsiella
sunt natural sensibile la majoritatea antibioticelor i chimiote-rapicelor cu
spectru larg, n special la polimixine i la concentraii mari de penicilin
G, dar tot mai multe tipuri sunt multirezistente datorit transferului de
fR-plasmidic. datorit procentului foarte mare de tulpini rezistente la
antibioticoterapie, Stp. aureus, Ps. aeruginosa, Proteus formeaz mpreun
grupul bacteriilor problem a terapeuticii medicale umane i veterinare.
6.8. genul Streptococcus
familia Streptococcaceae face parte din ordinul Lactobacillales.
Acesta cuprinde n afar de familia Streptococcaceae, nc ase familii,
dup cum urmeaz: Lactobaci-llaceae (cu 3 genuri), Aerococcaceae,
CRNAobacteriaceae, Enterococca-ceae (cu 5 genuri, streptococi enterici),
Leuconostoccaceae (streptococii din produsele lactate), Incertae sedis.
Istoric. Studiul streptococilor a preocupat n decursul timpului pe
muli cercettori: lister, Rivolta, Billroth, Pasteur, Koch, Rosenbach,
lancefeld.
n 1873, Rivolta pune n eviden agentul etiologic al gurmei, boal
infecioas specifc solipedelor. ulterior, s-au realizat studii ample de ctre
numeroi cercettori, n ara noastr evideniindu-se cele efectuate de Jivoin
i mitroi.
Stc. suis a fost identifcat prima dat ca specie n 1959, de ctre moor,
care l-a izolat din leziuni septicemice de la porci.
Taxonomie. familia Streptococcaceae a suferit numeroase remanieri
pe baza criteriilor de taxonomie molecular: hibridarea acizilor nucleici,
analiza secvenelor RNAr 16S, procentajul coninutului n G+C al dNA-
ului, compoziia n lipide, analiza electroforetic a diverselor enzime,
utilizarea anticorpilor monoclonali.
Cuprinde n prezent 2 genuri (dup J.P. Euzby, 2006): Streptococcus
(cu 83 de specii) i Lactococcus (cu 5 specii).
208
Tabelul 6.4
diferenierea grupelor de streptococi n funcie de unele caractere de baz
(dup Rpuntean Gh., Boldizsar E., 2001)
Streptococi de
grup
hemoliz
Sensibilitatea la
bacitracin
CAMP 6,5% naCl
Bil
esculin
A + - - -
B - + + -
C - - - -
d + - - + +
E nehemolitic - - - +
Viridans - - - -
Pneumococi - - -
Clasifcarea streptococilor se poate realiza pe baza urmtoarelor
caractere:
aspectul hemolizei determinat pe agar snge; 5
structura antigenic (clasifcarea lancefeld); 5
criterii ecologice i metabolice (clasifcarea Sherman). 5
Pe baza activitii hemolitice streptococii se clasifc n urmtoarele
tipuri:
streptococii 5 beta-hemolitici, care produc hemoliz complet (clar)
n jurul coloniilor, cu diametrul variabil, n funcie de grupul antigenic.
streptococii 5 alfa-hemolitici, care produc hemoliz incomplet,
coloniile find nconjurate de o zon galben-verzuie, datorit transform-
rii hemoglobinei n methemoglobin sub aciunea peroxidului de hidrogen,
hematiile find numai parial lizate.
streptococii 5 alfa prim () hemolitici, ce produc n jurul coloniilor
o zon asemntoare alfa hemolizei, dar bordat de o zon ngust de beta
hemoliz.
streptococii 5 nehemolitici, care formeaz n mediul de cultur
colonii, fr modifcarea acestuia.
Clasifcarea antigenic Lancefeld a fost realizat pe baza antigenului
specifc de grup, poliglucidul (poliozidul) C din peretele celular, cu excepia
grupului d, care este constituit din acid glicerol-teichoic. n 1928, Rebecca
lancefeld a mprit genul Streptococcus n 18 grupe serologice, notate de
la A la T. Grupele A, B, f, h i I sunt echivalente cu cte o specie, iar mai
mult de 90% din infeciile streptococice sunt produse de grupa antigenic
209
A, respectiv de Stc. pyogenes.
n prezent, clasifcarea antigenic a fost readaptat n:
streptococi grupabili, grupele A-W (cu excepia literelor I i J); V
streptococi negrupabili, care nu conin antigenul de grup. V
Specii de streptococi de interes zoonotic
Speciile de streptococi de interes zoonotic sunt reprezentate de Stc.
suis i Stc. equi subsp. zooepidemicus.
n cazul lui Stc. suis, sursa de infecie pentru om este reprezentat de
porcii sau carnea de porc infectat, iar n cazul Stc.equi zooepidemicus de
laptele nepasteurizat.
Toi streptococii zoonotici produc exotoxine (hemolizine, hialuroni-
daze i proteinaze) care distrug esuturile.
Stc. equi zooepidemicus poate produce leziuni septice la numeroase
specii de mamifere, de la bovine i cabaline, pn la cobai i iepuri.
Produce infecii ale tractului respirator la cabaline, manifestate prin
catar.
la vaci poate f implicat n producerea mastitelor, care reprezint
principala cale de transmitere la om.
la om determin faringite acute, datorit faptului c este localizat la
nivelul tractului respirator. Infecia se poate complica prin diseminare pe
cale pulmonar sau sangvin.
Infeciile cele mai severe de la om au fost asociate cu consumul de
lapte nepasteurizat de la vaci cu mastit.
n Romnia, 85 de persoane s-au mbolnvit de glomerulonefrit acut
prin consum de lapte nepasteurizat. un episod asemntor a avut loc ntr-o
familie de fermieri din Yorkshire (R.T. mayon-White, 2005).
Prevenirea acestui tip de infecii se poate realiza prin pasteurizarea
laptelui. n tratament se folosete penicilina.
Stc. suis. Exist dou tipuri, 1 i 2.
Tipul 1 a fost semnalat la purceii nou-nscui i nu transmite boala la
om, iar tipul 2 la purceii nrcai, rspunztor de infecia zoonotic cu Stc.
suis face parte din grupul R (tipul 2), find implicat n producerea meningitei
la om i la porc.
Se pare c omul contracteaz infecia de la porc prin intermediul
picturilor inhalate n timpul prelucrrii crnii.
Germenul a fost identifcat n 1959 de ctre moor, care l-a izolat din
leziuni septicemice de la porc.
210
Pe baza antigenelor polizaharidice de grup speciile au fost divizate n
grupul R (tipul 2) i grupul S (tipul 1).
Boala a fost semnalat la om pentru prima dat ntre 1960-1966 n
danemarca. S-a rspndit apoi n olanda, frana, marea Britanie. n hong-
Kong (1978-1980) boala a fost considerat ca find cea mai frecvent cauz
de meningit la om (R.T. mayon-White, 2005).
Calea de contaminare nu este nc clar. Se pare c infectarea se
produce de la esuturile de porc (carne, esut limfoid inclusiv tonsile) prin
pielea lezat sau prin inhalarea streptococilor care colonizeaz subclinic
faringele.
Nu exist o metod satisfctoare de prevenire a infeciei deoarece
majoritatea cazurilor umane au fost nregistrate printre persoanele care
nu au intrat n contact direct cu purceii tineri sau bolnavi. Antibioticul de
elecie este penicilina.
Streptococcus iniae a fost pentru prima dat izolat n 1972 dintr-o
infecie a delfnilor din Amazon, n Israel, n 1986, din infecii la tilapia i
pstrv, iar mai trziu din Taiwan i SuA.
Primul caz uman de intoxicaie alimentar a fost semnalat n 1991,
n Texas i n 1994, n otawa. Patru cazuri de intoxicaii alimentare au
fost semnalate n ontario, Canada 1995-1996, att din probele de pete
consumat, ct i de la pacieni. Petele a fost tilapia, importat din SuA.
S. iniae este beta-hemolitic pe globulele roii de oaie. la om produce
infecii fulminante ale esuturilor moi.
6.9. genul Erysipelothrix
Taxonomie. Genul Erysipelothrix face parte din familia
Erysipelothrichaceae. (Bergeys manual of Systematic Bacteriology, 2
nd
,
2004.
Genul cuprinde trei specii: Ers. rhusiopathiae i Ers. tonsillarum, Ers.
inopinata (Verbarg et al., 2004)
6.9.1. Erysipelothrix rhusiopatiae
(migula, 1900; Buchanan, 1918)
Istoric. Robert Koch n 1876, a izolat pentru prima dat dintr-o
infecie septicemic, o bacterie fn, Gram pozitiv, pe care o denumit-o
Ers. murisepticus.
Pasteur i Thuillier (1883) descriu un germen asemntor dintr-un caz
de rujet la porc.
211
friedrich lffer este primul care realizeaz un studiu concludent,
iar Rosenbach (1909) descrie pentru prima dat infecia la om, pe care o
denumete cu termenul de erizipeloid. ulterior, leclainche i lorenz au
preparat serul antirujetic pe cal i, respectiv, pe porc.
Trevistan (1885) propune denumirea de Ers. insidiosa, iar Migula
(1900) cea de Bacterium rhusiopathiae.
Buchanan (1918) combin cele dou apelative, crend numele de Ers.
rhusiopathiae, acceptat pn n prezent.
morfologie. Bacterie Gram pozitiv, cu dimensiuni de 0,5-2,5/0,2-0,4
microni. Este nesporogen, necapsulogen i imobil.
Bacilul rujetului este considerat cel mai fn bacil din grupa bacteriilor
clasice i apare n frotiuri drept sau uor ncurbat.
Variantele S apar dispuse izolat, n perechi unghiulare (V, Y, N, etc.),
grmezi sau lanuri scurte.
Variantele R se caracterizeaz prin apariia formelor flamentoase,
foarte lungi de circa 50-60 microni, care devin predominante.
Ambele forme se decoloreaz uor i pot aprea Gram negative cu
poriuni Gram pozitive, ceea ce d flamentelor un aspect moniliform,
putnd f considerat Gram labil.
n frotiurile efectuate din fcat, n infecii experimentale, se ntlnesc
numeroi bacili fagocitai n citoplasma celulelor Kuppfer, care iau aspectul
unor pernie cu ace.
Condiii de cultivare i caractere culturale. Germen facultativ
anaerob sau microaerofl, care se dezvolt bine pe medii uzuale. Pentru
stimularea creterii se recomand incubarea germenului la 37
o
C n bulion
glucozat i atmosfer cu 5-10% dioxid de carbon.
Pe agar infuzie de cord cu 5% snge de berbec sau iepure, n 24-48 de
ore de incubare la 37 de grade Celsius n atmosfer mbogit cu dioxid de
carbon, formeaz att colonii S ct i R.
Variantele S sunt foarte fne (circa 0,5 milimetri), cu aspect de
geam aburit caracteristic, rotunde, convexe, strlucitoare, transparente i
cu centrul din ce n ce mai opac.
Variantele R sunt mai mari, mai turtite, cu suprafaa ondulat i
margini neregulat fmbriate.
formele S (dar nu i cele R) sunt nconjurate de o zon ngust de
alfa hemoliz de culoare verzuie.
Cultivat n profunzimea mediilor semisolide, bacilul rujetului se
dezvolt uniform de-a lungul liniei de nsmnare, cultura bacterian avnd
212
aspectul unei periue de splat eprubete.
n bulion produce o turbiditate discret, care la agitare, n cazul
culturilor tinere formeaz valuri cu aspect de fum de igar. n culturile
vechi formeaz un depozit lenticular, care dup agitare se ridic n mediu
sub forma unui flament rsucit (tirbuon).
Pentru izolarea germenului din materiale patologice, se folosesc medii
de mbogire selectiv cum ar f: mediul Packer, pe baz de azid de sodiu
i cristal violet; mediul Bhm, din bulion de carne de porc, pepton Whitte,
fosfat de sodiu, glucoz, cristal violet i azid de sodiu.
n cazul preparrii vaccinurilor se folosete un mediu lichid recomandat
de feist, care conine: fosfat acid de sodiu, glucoz, pepton, extract de
drojdie de bere, l-arginin i Tween80.
Proprieti biochimice. fermenteaz fr producie de gaz: glucoza,
lactoza, fructoza i galactoza.
Nu produce catalaz, oxidaz n schimb produce hidrogen sulfurat pe
mediul TSI (triple sugar iron).
Proprieti antigenice. Bacilul rujetului posed antigene poligluci-
dice i polipeptidice cu caracter de haptene. Prin reacia de seroprecipitare
n gel de agar au fost identifcate iniial trei serogrupuri, notate cu A, B i N.
ulterior, au fost identifcate peste 23 de serovaruri, dintre care serovarurile
notate cu 1 i 2, corespund celor notate anterior cu serogrupurile A i B.
de remarcat c n primele dou serotipuri s-au ncadrat 75-80% din
tulpinile examinate.
Tipul 1 (fost tip A) are dou subtipuri 1a i 1b. Se izoleaz din infeciile
acute i este virulent, iar tipul 2 (fost tip B) se izoleaz din infeciile cronice i
posed n plus un antigen hemaglutinant i o substan solubil imunizant.
de aceea, pentru prepararea vaccinurilor antirujetice se utilizeaz tulpinile
de tip B.
Prin testele de aglutinare ncruciat s-a dovedit c toate tulpinile de
Ers. insidiosa, posed cel puin un antigen comun.
Sensibilitatea fa de factorii de mediu. Bacilul rujetului prezint o
rezisten destul de crescut la aciunea factorilor de mediu.
la temperatura de 70
o
C rezist 5-10 minute i este rezistent la
uscciune.
n snge i carne rezist luni de zile, chiar dac acestea au intrat n
putrefacie. n dejecii sau reziduuri de pete rezist pn la 6 luni, dac
temperatura este sub 12
o
C.
213
Prezint o rezisten foarte mare n mediile de cultur. de exemplu, n
culturile din medii lichide, supuse variaiilor de temperatur, germenii i-au
conservat nu numai viabilitatea, dar i patogenitatea, ntre 6 luni i 2 ani.
Bacilul rujetului este sensibil la aciunea substanelor dezinfectante,
cum ar f: hidroxid de sodiu 5%, formol 2% i clorur de var 1%.
Este sensibil la antibiotice ca: penicilina i tetraciclina, find rezistent
la polimixin, neomicin, kanamicin.
Ecologie. Ers. rhusiopathiae este o bacterie cu rspndire cosmopolit,
find natural gzduit la vertebrate (porci, ovine, cobai, bovine, psri, peti
i nurca domestic) i nevertebrate (crustacee).
Sediul de predilecie l constituie rinofarinxul i amigdalele. Prezena
bacteriei n coninutul intestinal, dejecii, mucusul petilor i rezistena n
mediul extern explic rolul solului, apelor de suprafa, apelor reziduale
de la ferme i abatoare, a nmolului, n transmiterea bacteriei pe cale oral
ntre animale.
Produsele de carne i pete, chiar afumate ori saramurate, vehiculeaz
efcient aceast bacterie.
frecvena mbolnvirilor este mai mare n sezonul clduros i mai
mic n sezonul rece iar n efectivele n care a aprut infecia, mbrac un
caracter staionar sau trenant.
Patogenitate. Nu este nc pe deplin neleas. Bacilul rujetului
acioneaz prin virulen i toxigenez. Tulpinile virulente aparin seroti-
pului A i produc de regul, hialuronidaz.
Alte tulpini produc neuraminidaz, endotoxine productoare de eritem,
evideniate de ctre leimbeck, n 1979, pe embrioni de gin. Activarea
neuraminidazei poate f asociat cu mai multe aspecte ale patogenezei
bolii, cum ar f: creterea permeabilitii pereilor vasculari, formarea n
exces a fbrinei din fbrinogen i stimularea aglutinrii eritrocitare, ducnd
la hemoliz.
Neuraminidaza cliveaz legturile alfa glicozidice ale acidului
neuraminic, un mucopolizaharid reactiv, care se gsete pe suprafeele
celulare.
modifcrile cronice din artrita erizipelic sunt asociate cu procese
imunologice. Bacteriile nu dispar complet din articulaiile afectate cronic
i leziunea poate progresa ca rspuns la expunerea continu la aceste
componente antigenice.
Infecia natural. Se numete rujet (rash), iar popular, brnc i
214
afecteaz, de regul, suinele, dar este ntlnit i la alte specii de animale i
psri inclusiv la om, cu caracter endemic.
Se manifest clinic prin evoluie septicemic, febril, cu tulburri
generale i leziuni cutanate congestive i urticariforme, sau prin evoluie
cronic, cu localizri cardiace, auriculare i cutanate.
Porcul este specia cea mai receptiv, iar datorit frecvenei i pierderilor
mari, pe care le producea n trecut, a fost considerat boala numrul doi a
porcinelor, dup pest. Infecia are de obicei, o evoluie enzootic producnd
mari pierderi economice (cu dermatite, artrite, endocardite).
n ordinea receptivitii, dup porcine urmeaz ovinele n special mieii
cu vrsta de 2-3 luni i psrile, n special curcile i fazanii (Stilles, 1946).
Au mai aprut infecii la gte, gini outoare, puni, potrnichi.
omul, este de asemenea, receptiv, fcnd n special infecii localizate
sub forma unei dermatite acute, numit i erizipeloidul lui Baker-Rosenbach,
boal profesional, ce apare mai ales la mcelari, mezelari, care intr n
contact direct i repetat cu carnea contaminat.
Infecia poate mbrca aspectul unei dermite cu posibiliti de
generalizare septicemic i localizri secundare (artrite, endocardite).
unul dintre primele studii ale incidenei acestui microorganism n
alimente a fost efectuat de ctre Ternstrom i molin, n 1982, n Suedia. Ei
au examinat 135 de probe de carne de pui, de vit i de porc i au gsit E.
rhusiopatiae n 36%, respectiv 13%, dintre probele de porc i pui.
n probele din carnea de vit nu au gsit acest germen.
215
Aeromonas hydrophila susp. hydrophila: Colonii netede, de
dimensiuni medii sau mari, de culoare alb. Coloniile au mar-
ginile regulate
Acelai mediu de agar cu snge examinat n fundal luminous.
Coloniile sunt nconjurare de o zon de hemoliz
216
Bacteroides fragilis: flamente bacilare n frotiu din cultur.
Bacteroides fragilis: cultur agar cu snge, colonii de
dimensiuni mici, netede, de culoare alb.
217
Enterobacter aerogenes: mediu Eosin-methylene Blue. Colonii mari mu-
coide, brune cu central ntunecat, ce indic fermentarea lactozei i producia
de acid (Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers university, Canada)
mediu Eosin-methylene Blue inoculat simultan cu (A) Escherichia coli, (B)
Pseudomonas aeruginosa, (C) Klebsiella pneumoinae i (d) Enterobacter
aerogenes. Toate cele patru bacterii gram-negative exprim morfologie
diferit. Coloniile de Escherischia coli prezint morfologie tipic lactozo-
fermentativ cu producie excesiv de acid i precipitarea de pigment verde
metalizat (colonii verzi cu luciu metalic). Coloniile de Pseudomonas aerug-
inosa expun o morfologie nefermentativ (colonii roz), ambele colonii de
Klebsiella pneumoniae i Enterobacter aerogenes au morfologie lactozo-
fermentativ i productoare de acid (colonii brune cu centrul ntunecat).
(Naowarat Cheeptham i Carolynne fardy, Thompson Rivers university,
Canada)
218
Brucella suis: cultur n agar cu snge ( foto: CdC/dr. W.A.
Clark, Public health Image library)
Brucella spp.: Cocobacili mici gram-negativi (0,5-0,7 x x0,6-
1,5 ) (are gram-negative in their staining morphology (CdC,
Public health Image library)
219
Klebsiella pneumoniae subsp. pneumonia: colonii gri,
de dimensiuni medii, nehemolitice
Klebsiella pneumonia: microscopie in contrast de faz. Bacili
scuri cu marginile paralele i capetele rotunjite, imobil
220
Mediu Plesiomonas shigelloides CCm 5860, 37C, 24h
Plesiomonas shigelloides CCm 5860 , mediu de cultur, 37C, 24h
221
Erysipelothrix rhusiopathiae: mediu agar cu snge. la 48 de
ore coloniile sunt punctiforme, nepigmentate i transparente,
nehemolitice
Erysipelothrix rhusiopathiae: bacilli drepi sau ncurbai
222
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Agar cu snge ,
colonii mucoide, semitransparente, punctiforme i mici
Streptococcus zooepidemicus: coloratie Gram. lanuri de coci
gram pozitivi
223
Bibliografe selectiv
1. Amagliani, G.; omiccioli, E.; Andreoni, f.; Boiani, R.; Bianconi, I.; zaccone, R.;
mancuso, m.; magnani, m. development of a multiplex PCR assay for Photobacterium
damselae subsp. piscicida identifcation in fsh samples.; Blackwell Publishing, oxford,
uK, Journal of fish diseases, 2009, 32, 8, pp 645-653, 28 ref.
2. Benno, Y.; mitsuoka, T. Incidence and isolation of three new Bacteroides spp.
from abscesses in pigs.; Japanese Journal of Veterinary Science, 1984, 46, 5, pp 749-752,
9 ref.
3. Bergagna S, zoppi S, ferroglio E, et al. Epidemiologic survey for Brucella suis
biovar 2 in a wild boar (Sus scrofa) population in northwest Italy. [Journal Article, Re-
search Support, Non-u.S. Govt] J Wildl dis 2009 oct; 45(4):1178-81.
4. Chacko, K. l.; Vineeth Rajagopal; Jaibi, K.; latha, C.; Nanu, E. fish borne bacte-
rial zoonoses. ; Intas Pharmaceuticals ltd, Ahmedabad, India, Intas Polivet, 2006, 7, 2, pp
207-211, 5 ref.
5. falkenhorst G, Bagdonaite J, lisby m, et al. outbreak of group A streptococcal
throat infection: dont forget to ask about food. [JouRNAl ARTIClE] Epidemiol Infect
2007 Nov 16.:1-7.
6. Gonzlez-Rey, C.; Svenson, S. B.; Bravo, l.; Siitonen, A.; Pasquale, V.; dumon-
tet, S.; Ciznar, I.; Krovacek, K. Serotypes and anti-microbial susceptibility of Plesiomonas
shigelloides isolates from humans, animals and aquatic environments in different coun-
tries. ; Pergamon Press, oxford, uK, Comparative Immunology, microbiology & Infec-
tious diseases, 2004, 27, 2, pp 129-139, 40 ref.
7. hassan, N. B. A.; Abdalla, m. o. m.; Nour, A. A. A. m. microbiological quality
of heat-treated milk during storage.; ANSInet, Asian Network for Scientifc Information,
faisalabad, Pakistan, Pakistan Journal of Nutrition, 2009, 8, 12, pp 1845-1848, 24 ref.
8. Jaradat, z. W.; Ababneh, Q. o.; Saadoun, I. m.; Samara, N. A.; Rashdan, A. m.
Isolation of Cronobacter spp. (formerly Enterobacter sakazakii) from infant food, herbs
and environmental samples and the subsequent identifcation and confrmation of the iso-
lates using biochemical, chromogenic assays, PCR and 16S rRNA sequencing. ; Biomed
Central ltd, london, uK, BmC microbiology, 2009, 9, 225, pp (27 october 2009), 51
ref.
9. Jin ShengQuan; Yin BinCheng; Ye BangCe multiplexed bead-based mesofuidic
system for detection of food-borne pathogenic bacteria.; American Society for microbiol-
ogy (ASm), Washington, uSA, Applied and Environmental microbiology, 2009, 75, 21,
pp 6647-6654, 44 ref.
10. linhart Y, Amitai z, lewis m, et al. A food-borne outbreak of streptococcal phar-
yngitis. [Journal Article] Isr med Assoc J 2008 Aug-Sep; 10(8-9):617-20.
11. manzat, R. m.; Vintil, C.; Isolation and cultivation of fusiformis (Bacteroides)
nodosus. lucrri Stiintifce, Institutul Agronomic Timisoara, Seria medicin Veterinar,
1980, 17, pp 159-162, 12 ref.
12. munn, C. B. microbial diseases of fsh. ; Garland Science, Taylor and francis
Group, llC, New York, uSA, marine microbiology: ecology and applications, 2004, pp
223-242, 39 ref.
224
13. musgrove, m. T.; Jones, d. R.; Shaw, J. d.; Sheppard, m.; harrison, m. A. Enter-
obacteriaceae and related organisms isolated from nest run cart shelves in commercial shell
egg processing facilities. ; Poultry Science Association, Savoy, uSA, Poultry Science,
2009, 88, 10, pp 2113-2117, 25 ref.
14. Nagano, I.; Inoue, S.; Kawai, K. Repeatable immersion infection with Photobac-
terium damselae subsp. piscicida reproducing clinical signs and moderate mortality.; os-
hima, S.; Springer-Japan, Tokyo, Japan, fisheries Science, 2009, 75, 3, pp 707-714
15. Nakazawa h, hayashidani h, higashi J, et al. occurrence of Erysipelothrix spp.
in chicken meat parts from a processing plant. [Journal Article] J food Prot 1998 Sep;
61(9):1207-9.
16. Neta AV, mol JP, xavier mN, et al. Pathogenesis of bovine brucellosis. [JouR-
NAl ARTIClE] Vet J 2009 Sep 2.
17. Newaj-fyzul, A.; mutani, A.; Ramsubhag, A.; Adesiyun, A. Prevalence of bacte-
rial pathogens and their anti-microbial resistance in tilapia and their pond water in Trini-
dad.; Blackwell Publishing, Berlin, Germany, zoonoses and Public health, 2008, 55, 4, pp
206-213, 44 ref.
18. Pereira, C. S.; Amorim, S. d.; Santos, A. f. das m.; Siciliano, S.; moreno, I. B.;
ott, P. h.; Rodrigues, d. dos P. Plesiomonas shigelloides and Aeromonadaceae family
pathogens isolated from marine mammals of southern and southeastern Brazilian coast.;
Sociedade Brasileira de microbiologia, So Paulo, Brazil, Brazilian Journal of microbiol-
ogy, 2008, 39, 4, pp 749-755, 30 ref.
19. Roop Rm, Gaines Jm, Anderson ES, et al. Survival of the fttest: how Brucella
strains adapt to their intracellular niche in the host. [JouRNAl ARTIClE] med microbiol
Immunol 2009 Sep 22.
20. Salerno, A.; deltoile, A.; lefevre, m.; Ciznar, I.; Krovacek, K.; Grimont, P.;
Brisse, S. Recombining population structure of Plesiomonas shigelloides (Enterobacte-
naceae) revealed by multilocus sequence typing. ; American Society for microbiology
(ASm), Washington, uSA, Journal of Bacteriology, 2007, 189, 21, pp 7808-7818, 57 ref.
21. Scheff, G. J. Comparison of fusobacterium sp. versus Bacterioides sp. in the
monoxenic cultivation of E. histolytica.; zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde
und Infektionskrankheiten, Abteilung 1, originale A, 1978, 242, 3, pp 419-421
22. Suzuki J, Sakaguchi K [Properties of metabolic substance produced by group A
Streptococcus from two food-borne epidemic] [English Abstract, Journal Article] Kansen-
shogaku zasshi 2009 Jul; 83(4):380-5.
23. Takayama Y, hikawa S, okada J, et al. A foodborne outbreak of a group A strep-
tococcal infection in a Japanese university hospital. [JouRNAl ARTIClE] Eur J Clin
microbiol Infect dis 2008 Aug 21.
24. Yez, m. A.; Cataln, V.; Apriz, d.; figueras, m. J.; martnez-murcia, A. J.
Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequenc-
es.; Society for General microbiology, Reading, uK, International Journal of Systematic
and Evolutionary microbiology, 2003, 53, 3, pp 875-883, many ref.
25. Ye YingWang; Wu QingPing; Yao lin; dong xiaohui; Wu Kui; zhang Jumei;
mary Ann liebert A comparison of polymerase chain reaction and international organiza-
tion for standardization methods for determination of Enterobacter sakazakii contamina-
tion of infant formulas from Chinese mainland markets. Inc., New Rochelle, uSA, food-
borne Pathogens and disease, 2009, 6, 10, pp 1229-1234, 31 ref.
225
CAPITOLUL 7
PrInCIPALELE mICOTOxInE ImPLICATE n
PrOdUCErEA TOxIInfECIILOr ALImEnTArE
Caractere generale
micotoxinele sunt metabolii toxici produi de micei n substraturile
alimentare i furaje. Termenul de micotoxin deriv de la grecescul
mykes, mucos = ciuperc (fung) i latinescul toxicum = otrav.
Se pare c fungii (mucegaiurile) reprezint grupul cel mai mare de
microorganisme din sistemul biologic (~300 000 specii), fapt care a dus
la concluzia c nu trim ntr-o lume cu fungi, ci mai degrab ntr-o lume a
fungilor (Bulmer, 1969).
un numr foarte mare de ciuperci produc micotoxine. unele sunt
mutagene i carcinogene, altele prezint o toxicitate cu specifcitate pentru
anumite organe.
Toxicitatea acestora pentru om nu a fost nc demonstrat. Se cunosc
ca substane carcinogene 14 micotoxine, dintre care afatoxinele sunt cele
mai importante.
n general este acceptat faptul c 93% dintre compuii mutageni sunt
carcinogeni.
micotoxinele sunt metabolii secundari. Ei se formeaz la sfritul
fazei exponeniale, nefind implicai n cretere sau metabolism. n general
se formeaz cnd se acumuleaz cantiti mari de precursori primari de
metabolism (aminoacizi, acetat, piruvat). din fericire speciile patogene
sunt n numr de cteva zeci.
n patologie, fungii sunt implicai n trei categorii de afeciuni:
micoze, micotoxicoze i alergiile fungice.
micozele sunt boli determinate de fungi a cror prezen este obligatorie
n organismul afectat (de exemplu: candidoza, tricofia, etc).
micotoxicozele sunt entiti determinate de micotoxine care ptrund
n organism o dat cu furajele n care au fost elaborate de ctre fungii toxici.
Astfel, micotoxicozele nu implic prezena agentului biotic (fungului)
n organismul animal i uneori nici chiar n substratul n care a fost elaborat
micotoxina.
Alergia fungic este un sindrom determinat cel mai frecvent de sporii
226
de mucegai.
Tabelul 7.1.
Toxicitatea i efectele biologice ale unor micotoxine majore din alimente
micotoxina
Alimentele
implicate
Specii productoare
Activitatea
biologic
Ld
50
(mg/
kg)
Afatoxine
porumb, alune,
smochine, lapte
i produse din
lapte
Aspergillus favus
Aspergillus parasiticus
hepatotoxic,
carcinogen
0,5 (cine),
9,0
(oarece)
Acid
ciclopiazonic
brnz, porumb,
alune, mei
Aspergillus favus
Penicillium
aurantiogriseum
convulsii
36
(obolan)
deoxiniva-
lenol
cereale
Fusarium graminearum
Fusarium culmorum
vom, refuzarea
hranei
70
(oarece)
Toxina T-2 cereale
Fusarium
sporotrichioides
leucopenie to-
xic de origine
alimentar
4 (obolan)
Ergotamina secar Claviceps purpurea neurotoxin -
fumonizin porumb Fusarium moniliforme
encefaloma- 5
lacia ecvin
edem pulmo- 5
nar - la ecvine
carcinom 5
esofagian - la
suine
?
ochratoxina
porumb, cereale,
boabe de cafea
Penicillium verrucosum
Aspergillus ochraceus
nefrotoxic
2030
(obolan)
Patulina
suc de mere,
produse din mere
Penicillium expansum
edem, hemo-
ragii, posibil
carcinogen
35
(oarece)
Penitrem A nuc
Penicillium
aurantiogriseum
efect tremorgen 1,05
(oarece)
Sterigmato-
cistina
cereale, boabe de
cafea, brnz
Aspergillus versicolor
hepatotoxic,
carcinogen
166
(obolan)
Acid
tenuazonic
past de tomate Alternaria tenuis
Convulsii, he-
moragii
81
(oarece
) 186
(oarece
)
Zearalenona
porumb, orz,
fin
Fusarium graminearum Efect estrogen
nu prezint
toxicitate
acut
Tabelul 7.2.
227
Limitele admise pentru micotoxine
micotoxine limite admise (g/kg) Nr. de ri
Afatoxine n alimente 0 48
Afatoxina m
1
n lapte 0-1 17
deoxinivalenol n fin 1000-4000 5
ochratoxina A n alimente 1-300 6
Patulina n sucul de mr 20-50 10
Toxina T
2
100 2
Zearalenona 30-1000 4
7.1. Afatoxinele
Afatoxinele reprezint un grup de metabolii secundari elaborai dup
faza de cretere logaritmic a unor tulpini toxigene de Aspergillus. Sunt de
departe cele mai studiate micotoxine.
Sunt cunoscute, nc din anii 1960, cnd mai mult de 100.000 de
pui de curc au murit n Anglia dup ce au consumat o mncare cu alune,
importat din Africa i America de Sud. din alimentul toxic au fost izolate
Aspergillus favus i o toxina produs de acest microorganism, care a fost
denumit afatoxin (toxina lui A. favus: A-fa-toxin).
Aspergillus favus este un microorganism mezofl care se dezvolt la
temperaturi cuprinse ntre 6C i 46C, cu un interval optim de 36-38C.
umiditatea, substratul, gradul de aerare etc sunt foarte importante
pentru dezvoltarea tulpinilor afatoxigene.
Aspergillus favus se dezvolt i elaboreaz afatoxine cnd umiditatea
relativ a aerului este de 80% i a substratului de 30%.
Temperatura optim de dezvoltare n condiii de laborator este de 25C,
cnd tulpina este cultivat pe arahide, iar elaborarea afatoxinei ncepe din a
7 a pn n a 9 a zi de cultivare (diener i davis, 1966).
hesseltine i col. (1966) au publicat o sintez a cercetrilor privind
producerea afatoxinei pe boabele de cereale ntregi sau mcinate: porumb,
gru, orez. mayne i col. (1966) au artat c producia de afatoxine pe
seminele de bumbac a fost egal cu cea de pe gru i de dou ori mai
mare dect cea de pe arahidele infectate cu Aspergillus favus. Cantiti de
ordinul zecilor de g/ml afatoxin au fost obinute prin cultivarea fungului
pe sucuri de mere, caise, grapefruit, struguri, portocale, piersici, ananas,
roii (Wildman citat de diener i davis, 1969) precum i pe alte substraturi
alimentare ca: paste finoase, brnz, lapte praf, alune de pdure, nuci,
semine de mac, miez de nuc de cocos, cartof, bacon afumat, mazre,
228
fasole, prune, mere, pere, smochine (frank, 1966).
n general, datele existente n literatur indic faptul c substraturile
bogate n glucide (gru, orez) favorizeaz producerea unor cantiti mai
mari de afatoxine dect cele bogate n ulei (arahide, bumbac, soia), (diener
i devis, 1969).
Studiile asupra naturii toxine a acestor substane, relev urmtoarele
4 componente.
Aspergillus favus produce AfB
1
i AfB
2
, iar Aspergillus parasiticus
produce toate cele 4 afatoxine majore (B
1
, G
1
, B
2
i G
2
) n funcie de culoarea
fuorescentei lor n lumina uV de 254 i 366 nm (B - blue, G - green) i de
poziia lor pe placa cromatografc.
Aceti compui sunt cumarine, nalt substituite, find cunoscute cel
puin 18 toxine nrudite. Afm
1
, este un produs hidroxilat al lui AfB
1
, i
apare ca produs metabolic n lapte, urin, fecale.
Afl, Aflh
1
, AfQ
1
, i AfP
1
, sunt derivai din AfB
1
, AfB
2
(este forma
2,3-dihidro- a lui AfB
1
).
Toxicitatea celor mai potente afatoxine descrete n ordinea urmtoare:
B
1
-m
1
-G
1
-B
2
-m
2
-G
2
. Privite n lumin ultraviolet prezint urmtoarea
fuorescen: B
1
i B
2
- albastru, G
1
- verde, G
2
-verde-albstrui, m
1
-albastru
violet, m
2
- violet.
Afatoxinele sunt metabolii secundari al cror schelet de carbon vine
de la acetat si malonat.
Calea parial propus pentru sinteza AfB
1
este urmtoarea: acetat-
acid norsolorinic-averantin-averufanin-averufn-acetat verziconal
hemiacetal, versicolorina A, sterigmatocistina, metil-sterigmatocistina
229
o, AfB
1.
Verzicolorina A este prima din lan, care conine legtura dubl
esenial C2-C3.
Proprietile fzico-chimice ale afatoxinelor
Afatoxinele naturale sunt compui foarte stabili n substraturile
alimentare i furaje, find foarte reactivi la extremele de ph (10< ph< 3), n
lumin uV i n prezena oxigenului, reactivitate datorat ciclului furanic
nesaturat i structurii lactonice.
din 25 de probe de A. favus i A. parasiticus pe agar la 2C, 7C,
41C sau 46C n 8 zile, nu a fost produs nici o afatoxin, sub 7,5C sau
peste 40C, chiar i n condiii favorabile.
Pe agarul Sabouraud dezvoltarea minim a lui A. favus i A. parasiticus
a aprut la 33C, la un ph 5 i un a
w
=0,99. la 15C dezvoltarea a aprut
la un a
w
=0,95, n timp ce la 27C i la 33C, la a
w
=0,85 s-a observat o
dezvoltare slab.
ntr-un studiu, creterea maxim a lui A. parasiticus a aprut la 35C,
dar nivelul cel mai nalt de toxin a fost produs Ia 25
e
C.
Coninutul limitant (pn la 50 ng/g) de umezeal pentru AfB
1
i AfB
2

n porumb a fost de 17,5% la o temperatur peste 24C. la temperatura de
13C nu a avut loc producia de toxin. Per ansamblu producerea de toxin
(cu valori raportate de 0,71 -0,94) a avut loc la un ph de 0,93-0,98.
ntr-un alt studiu creterea maxim a lui A. parasiticus a avut loc la
35C, dar cel mai nalt nivel de toxin s-a produs la 24C.
Per ansamblu parametrii maximali i minimali ce controleaz
dezvoltarea i producerea de toxin de ctre aceste organisme eucariote,
nu sunt uor de defnit, pe de o parte datorit habitatelor diverse din natur,
iar pe de alt parte datorit statutului lor de eucariote. Este clar c se pot
dezvolta fr s produc toxine.
AfG
1
este produs la temperaturi de cretere mai mici dect AfB
1
. n
timp ce unii cercettori au gsit mai mult AfB
1
dect AfG
1
la 30C, alii au
gsit o producie relativ egal.
A. favus produce numai AfB
1
i AfG
1
. Aerarea favorizeaz producerea
de afatoxin. Aceasta poate f produs n cantiti de 2 mg/g, de ctre
substane naturale ca orezul, porumbul, soia i altele.
n bulion cu cantiti potrivite de zn
2+
pot f produse pn la 200-300
mg/l. Eliberarea de AfB
1
de ctre A. favus implic un sistem de transport
energo-dependent.
230
Toxicitatea, mecanismul de aciune i metabolismul afatoxinelor
Efectele toxice acute ale afatoxinei se datoreaz interferenei ei cu
replicarea, transcripia i transducia dNA-ului, deci inhibiia sintezei proteice
(moule, 1977). Inhibiia este rapid i intens chiar la doze de 1/20 din dl
50

(lafage i frayssinet cit. de moule, 1977). Aceste tulburri biochimice au
drept consecin alterarea infrastructurilor celulare, segregarea nuclear,
deformri polisamice, agregarea granulelor intercromatiniene etc.
Sistemele metabolizante ale mamiferelor sunt eseniale pentru
afatoxina AfB
1
pentru exprimarea mutagenicitii. de asemenea, este
esenial legarea de acizii nucleici, n special de dNA. AfB
1
se leag de
dNA-ul mitocondrial al fcatului, preferenial fa de cel nuclear.
Situsul responsabil pentru mutagenicitate al afatoxinei este dubla
legtur din molecula de dihidrofurofuran C
2
-C
3
. Reducerea sa la forma
2.3 dihidro(AfB
2
) reducemutagenicitatea de 200-500 ori. leziunile
genetice predominante induse de afatoxine sunt mutaiile punctiforme. S-a
demonstrat c mutageneza lui AfB
1
poate f potenat de 2 ori de ctre BhA
(hidroxianisol-butilat) i de BhT (hidroxitoluen-butilat).
dl
50
de AfB
1
pentru obolani pe cale oral este de 1,2 mg/kg i de 1,5-
2,0 mg/kg pentru AfG
1
. Bobocii de ra i puietul de pstrv sunt printre
cele mai sensibile, find urmate de obolani (30-1/713). majoritatea speciilor
de animale susceptibile mor n trei zile dup administrarea toxinelor, apar
grave distrucii ale fcatului, care dup examinare post mortem relev c
afatoxinele sunt hepato-carcinogene.
Toxicitatea este mai mare pentru animalele tinere i pentru masculi,
dect pentru animalele mai n vrst i pentru femele, iar efectele sunt
sporite de dietele srace n proteine.
Evidenele circumstaniale arat c afatoxinele sunt cancerigene
pentru oameni. Se pare c afatoxinele au o infuen destul de mare n
producerea sindromului EfdV n Tailanda, sindromului Reye n Noua
zeeland i a hepatomului acut la un copil din uganda. n ultimul caz s-au
gsit modifcri histologice identice cu cele observate la maimuele tratate
cu afatoxine.
doi cercettori care au lucrat cu afatoxina purifcat au fcut
carcinom de colon. Riscul apariiei cancerului de fcat n urma consumului
de afatoxine este de 30 de ori mai mare pentru indivizii care au fost expui
hepatitei A.
231
Tabelul 7.3.
dL
50
n cazul afatoxinelor pentru diferite specii de animale
Specie Vrst (sau greutate) Sex Cale dL
50
(mg/kg)
boboc de ra
1 zi M per os 0,37
1 zi M per os 0,56
obolan
1 zi m-f per os 1,0
21 zile M per os 5,5
21 zile f per os 7,4
100 g M per os 7,2
100g M intraperitoneal 6,0
150 g f per os 17,9
hamster 30 zile M per os 10,2
porc de guineea adult M intraperitoneal 15,0
iepure nrcat m-f intraperitoneal 9,0
cine
adult m-f intraperitoneal 0,5
adult m-f per os 0,38
pstrv 100 g m-f per os 7,5
dup Wogan G. N.
AfB
1
i AfB
2
se pot distruge din porumb prin folosirea bisulftului.
Smochinele uscate dozate cu 250 ppb de AfB
1
au fost supuse la cteva
tratamente observndu-se urmtoarele aspecte:
1) n cazul folosirii bisulftului de sodiu 1% s-a produs o reducere cu
28,2% n 72 de ore;
2) apa oxigenat 0,2% a produs o reducere de 65,5%;
3) nclzirea la 45-65C pentru o or a produs o reducere de 68,4%;
4) radiaia uV a produs o reducere 45.7%.
Seminele de bumbac contaminat cu afatoxin, tratate cu amoniac i
date vacilor, au coninut niveluri mai mici de AFB
1
n lapte, dect produsele
netratate.
S-a demonstrat c Flavobacterium aurantiacum produce AfB
1
ntr-o
mare varietate de alimente. Aceast bacterie n cantitate de 10
10
cfu/ml, din
fltratele de culturi mai vechi de 72 de ore, au fost mai efciente dect cele
din culturile proaspete (24-48 de ore).
ntr-un alt studiu s-a dovedit c mg
2+
i Ca
2+
sporesc activitatea
distructiv a acestei bacterii. Cu toate c nu degradeaz afatoxinele,
bifdobacteriile i bacteriile acidolactice se leag de AfB
1
i Afm
1
n culturi
i substraturi alimentare. Att celulele vii, ct i cele moarte se leag de
aceste micotoxine.
232
Mixobacterianannocystis exedens care triete n sol, a fost testat
mpotriva exosporilor i hifelor productoare de afatoxine, A. favus i A.
parasiticus, iar rezultatele au artat c ambii fungi au fost inhibai dup
14 zile la 28C. de fapt, mixobacteria a lizat dezvoltarea coloniei dup 24
de ore. Nu este de neconceput c principiul activ pote f extras i folosit n
forma purifcat mpotriva altor fungi i chiar a unor bacterii.
descoperirile din acest studiu sugereaz c unele mixomicete pot f
efciente n distrugerea fungilor micotoxigenici.
Tabelul 7.4
Limitele admise de afatoxine n alimente, n diferite ri
ara Limita (g/kg) Alimente
marea Britanie
2 nuci, smochine uscate
5
aceleai de sus, dar pentru proc-
esate
SuA
20 toate alimentele
0,5
afatoxina m
1
n lapte integral,
lapte degresat, lapte smntnit
Australia
5
toate alimentele cu excepia pro-
duselor pe baz de alune
15 produse pe baz de alune
India 30 toate alimentele
Japonia 10 toate alimentele
China 50
orez, alune, porumb, sorg, fasole,
fin, orz i ovz
Analize chimice pentru evidenierea afatoxinelor
Acestea se mpart n 4 categorii: vizuale, calitative rapide, de confrmare
i cantitative (Romer, 1976).
1) Metoda rapid de vizualizare a afatoxinei n lumin UV permite
identifcarea acesteia n porumb la o concentraie de peste 10 ppb (Shatwell
i col. 1972).
2) Testele de screening calitative rapid sunt cele mai numeroase i mai
des utilizate, att n cercetarea micotoxicologic, ct i n scopuri practice.
metodele ofciale n vigoare n diferite ri indic utilizarea pentru
extracia afatoxinelor a sistemelor: metanol-ap (liem i Belfoars); aceton-
ap (Ponce i col.); cloroform-ap (Velasco. 1970); acetonitril-KCI (Stahr,
233
1977).
Procedeele de purifcare a extractului primar depind de compoziia
chimic iniial a substratului analizat. Cele mai difcile sunt cele care
implic analizele nutreurilor combinate, datorit multiplelor posibiliti
de interferen fzico-chimic. Cel mai indicat procedeu n acest sens este
utilizarea unui precipitat de plumb acid, urmat de trecerea fazei lichide pe o
coloan de absorbie cu gel de aluminiu acid (Ponce i col, 1971).
Separarea, identifcarea i evaluarea afatoxinelor se face prin procedee
cromatografce: cromatografe, n strat subire (CSS), cromatografe n faz
de gaz-lichid (CGt) i cromatografe de lichid de nalt presiune (CtIP).
3. Testele de confrmare se realizeaz de obicei prin reacii de
derivatizare a afatoxinei in situ pe placa cromatografc cu diferii reactivi
chimici.
derivatizarea are drept scop modifcarea culorii fuorescentei
afatoxinei n lumin uV de 366 nm.
4. Pentru evaluarea cantitativ a afatoxinelor din alimente i
substraturife furajere, fuorodensimetria reprezint cea mai practic metod
(Peterson, Stotoff, 1972). o nou metod cantitativ pentru determinarea
afatoxinelor o reprezint cromatografa n lichid de nalt presiune (ClIP)
(Engsticom i col.).
7.2. Toxinele produse de Alternaria
Sunt produse de mai multe specii de Alternaria. Au fost gsite n
mere, roii i alte alimente. Toxinele produse includ alternariolul, eter de
alternariol monometil, alternuen, acid tenuazonic si altertoxina-1.
Pe felii de mere, roii sau afne zdrobite, incubate 21 de zile la 21C, mai
multe specii de Alternaria au produs toxine n cantitate de 137 mg/100g.
ntr-un alt studiu, acidul tenuazonic a fost principala toxin produs
n tomate cu niveluri pn la 13,9 mg/100g. Pe portocale i lmi, A. citri
a produs acid tenuazonic, alternariol i eter de alternariol monometil, n
concentraie de 1,15 - 2,66 mg/100g. fructele au fost incubate la temperatura
camerei pentru 21-28 de zile.
ntr-un studiu pe 150 de probe de foarea soarelui n Argentina,
85% conineau alternariol, 47% alternariol eter monometil i 65% acid
tenuazonic.
n urma fermentrii timp de 28 de zile de ctre A. alternata i separarea
uleiului de aliment, toxinele au fost gsite numai n ulei.
o tulpin de A. alternata a produs stemfltoxina III, care s-a dovedit a
f mutagen prin testul Ames.
234
Specii de Alternaria i leziunile pe care le produc
la om, plante i animale
* Alternaria alternata - cauzeaz infecii respiratorii, la pacienii
hIV pozitivi, astm, rinosinuzite cronice. Cauzeaz tciunele cartoflor i
altor plante.
* Alternaria arborescens - distrugerea celulelor stem la roii
* Alternaria arbusti - pete pe frunzele prului asiatic
* Alternaria blumeae - leziuni la Blumea aurita
* Alternaria brassicae - legume i trandafri
* Alternaria brassicicola - culturi de varz
* Alternaria brunsii - semine de chimen
* Alternaria carotiincultae - frunze de morcov
* Alternaria conjuncta - pstrnac
* Alternaria dauci - morcov
* Alternaria euphorbiicola - culturi de varz
* Alternaria gaisen - leziuni punctiforme la pere
* Alternaria infectoria - fin
* Alternaria japonica - culturi de varz
* Alternaria molesta - leziuni cutanate la marsuini (mamifer
cetaceu)
* Alternaria panax - ginseng
* Alternaria petroselini - frunze de ptrunjel
* Alternaria selini - ptrunjel
* Alternaria solani - cartof i roii
* Alternaria smyrnii - ptrunjel
7.3. Citrinin
Cu toate c ciupercile productoare de citrinin au fost gsite pe boabele
de cafea i cacao, acestea nu au produs micotoxine n aceste substraturi.
Citrinina este o substan cristalin cu greutatea molecular de 250 Kda
i punctul de topire la 170-171
0
C. n stare cristalizat din alcool citrinin
(C
13
h
14
o
5
) formeaz cristale aciforme de culoare galben-citrin care n
lumin uV de 366 nm prezint fuorescen galben strlucitoare.
235
Citrinina este puin solubil n ap, dar solubil n soluii diluate de
Naoh i Na
2
Co
3
, i n majoritatea solvenilor organici.
Citrinina este o micotoxin izolat pentru prima dat din Penicillium
citrinum. Este produs de o mare varietate de fungi, folosii n producerea
unor alimente ca brnzeturi, cereale, sake i pigmeni roii.
Citrinina este o nefrotoxin ce cauzeaz nefropatii n efectivele de
animale i a reprezint unul dintre agenii etiologici ai nefropatiei balcanice
i a febrei galbene de orez.
Citrinina este folosit ca reagent n cercetarea biologic. Induce
permeabilitate mitocondrial, i inhib respiraia prin interferena cu
complexul I al lanului respirator.
Citrinina este produs de ctre Penicillium citrinum, P. viridicatum,
Aspergillus niveus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus
terreus, Monascus ruber, Monascus purpureus, Penicillium citrinum,
Penicillium camemberti. A fost izolat din orez, pine mucegit, unc
preparat n cas, gru i alte produse similare.
Este un cunoscut cancerigen. din 7 tulpini de P. viridicatum toate au
produs citrinin n bulion cu dextroz de cartof, n 14 zile la 20-30C, dar
nu i la 10C.
Citrinin a fost identifcat n Germania din alimentele mucegite i
mpreun cu alte micotoxine a putut f produs ntr-un mediu sintetic.
din culturile de micei toxigeni, citrinina poate f obinut prin extracii
simple la rece cu cloroform.
din furaje i, n special din nutreurile combinate, tehnica de izolare
i identifcare este mai complicat, implicnd i etapele de degresare i
decolorare (Coman i col. 1978).
236
Pentru confrmare se poate folosi sistemul de developare toluen -
acetat de etil-acid formic.
7.4. Ochratoxinele
Ochratoxina A este o substan cristalin, incolor, optic activ n
cloroform i fuorescent n lumina uV de 254 nm i 366 nm. Greutatea
ei moleculara este de 403 kda, iar punctul de topire de 90C, cnd este
cristalizat din benzen i 169C cnd este cristalizat din xilen (Steyn i
holzapfef, 1967).
Ochratoxina B este analogul decolorat al ochratoxinei A care se
observ n lumin uV fuorescent albastr. micotoxina pur se prezint
sub forma unei substane cristaline incolore cu greutate molecular de 369
Kda, find rar ntlnit n condiii naturale de mediu Krogh, 1979).
Ochratoxina C este un ester etilic amorf al ochratoxinei A (Ioan Coman
i ovidiu Popescu, 1985).
ochratoxinele fac parte, mpreun cu citrinina, acidul oxalic i
viridicatumtoxina, din grupul micotoxinelor nefrotoxice, care sunt
implicate n etiopatogenia afeciunilor renale, ntlnite la om i animale.
Ele sunt produse de micei ce aparin taxonomic genurilor Penicillium i
Aspergillus.
ochratoxinele au fost evideniate pentru prima dat n condiii de
laborator, n cursul testrii toxicitii tulpinilor de micei din cereale i
legume (Ioan Coman, ovidiu Popescu, 1985).
Acestea conin un grup de 7 metabolii asemntori structural, din care
ochratoxina A (oA) este cea mai cunoscut i cea mai toxic.
oB este oA declorinat i mpreun cu oC poate aprea n mod natural.
oA este produs de un numr mare de fungi, incluznd A. ochraceus. A.
alliaceus, A. ostianus, A mellus, A. niger i A carbonarius. ultima a fost
237
gsit n Spania ca principal productor de oA din fructele uscate. din 91
de izolate, 97% au fost productori de oA.
dintre speciile de Penicillium productoare de oA menionm: P.
cyclopium, P. variable i altele.
oA este produs la niveluri maxime la temperaturi de 30C i la un a
w

0,95. A. ochraceus produce oA n furajele pentru psri la un a
w
minim de
0,85 i la temperatura de 30C.
la obolani dl
50
este de 20-22 mg/kg, avnd un efect hepatotoxic i
nefrotoxic. Aceste micotoxine au fost gsite n porumb, boabele de cacao,
boabele de soia, ovz, orz, citrice, nuci de Brazilia, tutun mucegit, alune,
boabe de cafea i alte produse similare. A. ochraceus a produs oA i oB n
mncruri de orez i alune.
ntr-un studiu pe 4 inhibitori chimici privind dezvoltarea i producerea
de oA la un ph de 4,5 n ordinea efcienei enumerm: sorbat de potasiu -
propionat de sodiu - paraben metil - bisulft de sodiu; n timp ce la un ph
de 5,5 cele mai efciente au fost paraben metilul i sorbatul de potasiu. Ca
multe alte micotoxine oA este termostabil. ntr-un studiu oA nu a putut
f distrus prin procedurile normale de gtire din boabele de faba (specie de
fasole originar din Africa).
n lumina uV, oA are o culoare verzuie, n timp ce oB emite o culoare
albastr. oB induce o mitoz anormal n celulele renale de maimu.
Biocenoza unui substrat condiioneaz n mare msur producia
de ochratoxine, ntruct ntre elementele unui ecosistem pot exista relaii
de antagonism sau de simbioz (loan Coman, ovidiu Popescu, 1985).
de exemplu A. ochraceus nu se poate dezvolta pe grunele de cereale
contaminate deja cu A. glaucus. fenomenul ar putea explica incidena mai
redus a afeciunilor produse de A. ochraceus (Christensen, 1962).
n condiii experimentale, ochratoxina s-a dovedit a f teratogen i
carcinogen.
odat ptrunse n organism ochratoxinele sunt absorbite foarte lent
n tractul digestiv, ncepnd din stomac i continund pn n intestinul
subire.
Imediat dup absorbie, ochratoxina A poate f ntlnit liber n snge
(Galtia, 1974) sau legat de proteine (Chu. 1971).
ochratoxinele afecteaz echipamentul enzimatic celular, determinnd
astfel tulburri metabolice grave.
ochratoxina A inhib RNA-sintetaza i implicit procesele de sintez
ale proteinelor la nivelul diferitelor celule microbiene, precum i celulele
hepatomului la obolan (Creppy i col., 1979).
Experienele efectuate pe obolan au demonstrat c aceast micotoxin
238
inhib gluconogeneza renal printr-un efect exercitat asupra carboxikinazei
fosfoenolpiruvatului renal, n timp ce enzima hepatic similar a rmas
neafectat (meisner i Selanic, 1979).
ochratoxinele produc la om nefropatia endemic balcanic (nefrita
endemic) descris pentru prima dat n 1950. A fost diagnosticat la
populaia rural din Bulgaria, Iugoslavia, Romnia. Este ncadrat n grupa
nefritelor cronice i se ntlnete mai des la femei ntre 30-50 ani, producnd
o mortalitate ridicat (loan Coman, ovidiu Popescu, 1985).
Cele mai multe metode de identifcare a ochratoxinelor se bazeaz pe
cromatografe. o separare bun a ochratoxinelor A i B prin cromatografe
preparativ a fost realizat de ctre Steyn (1969) pe silicagel impregnat cu
acid oxalic 5% dup developare cu un sistem neutru de solveni.
Aceast faz staionar a fost utilizat n cromatografa pe coloan
pentru separarea ochratoxinei A de compuii acizi nrudii (Scott i col.,
1970).
7.5. Patulina
Patulina este un antibiotic toxic produs de un numr mare de fungi
ce aparin genurilor Penicillium (P. claviforme, P. expansum, P. patulum),
Aspergillus (A. clavatus, A. terreus i alii) i Byssochlamys (B. nivea, B.
fulva). n mai multe ri s-au impus restricii n folosirea patulinei drept
conservant n produsele pe baz de mere. omS (Who) recomand o
concentraie maxim de 50 g/l n sucul de mere. n uE, limita maxim
admis este 50 g/kg att n sucul de mere, ct i n cidru, 25 g/kg n
produsele pe baz de mere, pentru aduli i 10 g/kg n produsele pe baz
de mere pentru copii (1 noiembrie 2003).
Proprietile sale biologice sunt asemntoare cu cele ale acidului
penicilic. unii fungi pot produce patulina i sub 2C
Aceast micotoxin a fost gsit n pinea mucegit, crnai, fructe,
suc de mere, cidru, i alte produse. Au fost gsite n sucul de mere (de pn
la 440 g/l) i n cidru (pn la 45 ppm). A fost identifcat n alimentele
mucegite examinate n Germania.
P. expansum i P. patulum au nevoie petru dezvoltare de un minim de
a
w
de 0,83 i 0,81.
P. patulum i P. roquefortii au produs patulina n 10 zile n bulion cu
dextroz de cartof, prin incubare la 12C. P. roquefortii a produs pn la
1033 ppm. Patulina a fost produs i n sucul de mere la 12C de ctre B.
nivea, cea mai mare concentraie obinndu-se dup 20 de zile la 21C
Aceti cercettori au confrmat c producia de patulin este favorizat
239
de temperaturi sub optimul de cretere. ulterior au fcut cercetri pe P.
expansum i au observat c producia de patulina are loc peste intervalul de
5-20C i n cantiti mici la 30C.
n 5 probe comerciale din Georgia, nivelurile patulinei au fost de 244
pn la 3993 g/l. Atmosfera de Co
2
i N
2
a redus producia da patulin
(comparativ cu aerul). So
2
s-a dovedit mai efcient dect sorbatul de potasiu
sau benzoatul de sodiu n inhibarea produciei de patulina.
dl
50
pentru obolani administrat
pe cale subcutanat este de 15-25 mg/
kg. Iar la unele dintre animale induce
formarea sarcoamelor subcutanate.
Patulina produce aberaii
cromozomale n celulele animale i
vegetale i este carcinogen. Inhib
sinteza RNA-ului n culturi celulare
(Kawasaki, 1972). doza de aciune
cancerigen a patulinei a fost adus
nc din 1961 de ctre dickens i Jones.
Autorii au inoculat subcutanat de 2 ori pe sptmn obolanilor
masculi de 61-64 sptmni cte 0,2 mg de patulin solubilizat n ulei
de arahide. la locul de injectare au aprut formaiuni tumorale la 6 din 6
animale, care au supravieuit la sfritul experienei.
Patulina este dotat cu importante proprieti citostatice i
antibacteriene, dar toxicitatea sa pentru animalele de laborator, aciunea sa
mutagen faa de levuri i puterea ei cancerigen au mpiedicat utilizarea n
terapeutic (Ioan Coman i ovidiu Popescu, 1985).
Evidenierea patulinei n substraturi se face deobicei prin cromatografe
n strat subire sau pe coloan. Ca solvent se folosete deobicei acetatul de
etil. dup extracie purifcarea se face prin cromatografe pe coloan, folosind
ca element de separare alumina, silicagelul sau rinile schimbtoare de
ioni (Norstadt).
Rezidul brut obinut dup evaporarea extractului pe baia de ap (n vid
sau n curent de N
2
), ori fraciile purifcate prin cromatografe pe coloan sunt
etalate pe plci cu silicagel, care se developeaz ntr-un tanc cromatografc.
n care se gsete sistemul toluen-aceton-cloroform.
dup developare plcile se usuc n curent de aer cald i se vizualizeaz
n lumin uV, de 254 nm, condiii n care patulina apare ca un spot ntunecat
(frank. 1976).
240
7.6. Acidul penicilic
Aceast micotoxin posed proprieti biologice similare cu patulina.
Este produs de un numr mare de fungi care includ specii din genul
Penicillium (ca de exemplu, P. puberulum) i membrii ai grupului A.
ochraceus. unul dintre cei mai mari productori de acid penicilic este P.
cyclopium.
A fost gsit n porumb, fasole i alte cereale. A fost cultivat
experimental n brnza elveian.
dl
50
pentru oarece administrat pe cale subcutanat este de 100-300
mg/kg i este cangerigen.
din 346 de izolate cu Penicillium din salam, aproximativ 105 au
produs acid penicilic n mediile lichide, dar n cinci probe de crnai nu s-a
produs toxina nici dup 70 de zile.
din 183 de fungi izolai din brnza elveian la 5C, 87% au fost din
genul Penicillium. Extractele de Penicillium au fost toxice n proporie de
35% pentru embrionii de gin, 5,5% din amestecurile toxice au coninut
acid penicilic, patulin i afatoxine.
Acidul penicilic a fost produs la 5C, n 6 sptmni de 4 din 33 de
tulpini fungice.
7.7. Sterigmatocistina
Sterigmatocistina i derivaii si au fost izolai iniial n condiii de
laborator din culturi de Aspergillus versicolor (Bullocu si col, 1962, Pohland,
1976), P. luteum (dean, 1963), A. nidulans, A. rugulosus (Ballantin i col
1965), Bipolaris sorokiniana drechslera (holzapfel si col. 1966).
Coman i col., 1981 au izolat din nutreuri combinate trei tulpini
toxigene de A. versicolor, capabile s sintetizeze sterigmatocistina.
Sterigmatocistina a fost identifcat pe cromatoplci, pe baza fuorescenei
i a valorii RG-ului.
unele sortimente de brnz care reclam n procesul de preparare i
241
o faz de maturare se pot contamina foarte uor cu micei n spaiile n care
sunt depozitate.
Nortbolt i col, (1980) au izolat din astfel de probe de brnz mucegit
o for micotica variat.
din 39 de probe analizate micotoxicologic, 9 au coninut
sterigmatocistin, n cantiti cuprinse ntre 5 i 600 g/kg.
Aciunea chimic a derivailor furofuranici fa de animalele de
laborator depinde de specie, dar i de structura lor chimic.
Sterigmatocistina a indus carcinogeneza la
obolani prin inoculri subcutanate sau
administrri orale (dickens i Jones).
Intoxicaia oral cronic a maimuelor
s-a caracterizat clinic prin scaune frecvente i
hepatit cronic (Van der Watt).
Sterigmatocistina este o micotoxin
nrudit structural i biochimic cu afatoxinele,
avnd activitate hepatocancerigen la animale.
Sunt cunoscui cel puin 8 derivai.
dl
50
pentru obolanii infectai intraperitoneal este de 60-65 mg/kg. n
lumina uV toxina are o culoare fuorescent, roie-crmizie nchis.
Cu toate c nu se gsete n produsele naturale, a fost izolat din gru,
ovz, brnz danez i boabe de cafea. Sterigmatocistina se nrudete cu
afatoxinele dar nu este la fel de potent ca acestea. Acioneaz prin inhibarea
sintezei de dNA.
o metod semnifcativ de evaluare a sterigmatocistinei din brnz
a fost comunicat de Egmond i col. (1980). metoda const n extracia
micotoxinei cu metanol -clorur de potasiu 4%, purifcarea extractului pe o
coloan de forisil i poliamid i apoi evidenierea sterigmatocistinei prin
cromatografe n strat subire bidimensional.
Testul de confrmare const n etalarea extractului brut pe placa
cromatografc, developarea acesteia n cloroform metanol i urma ei
uniform dup uscare cu acid trifuoracetic benzen.
metoda este sufcient de sensibil pentru a putea permite detectarea
sterigmatocistinei n concentraii de pn la 5g/kg.
7.8. fumonizinele
fumonizinele sunt produse de Fusarium spp. pe porumb i pe alte
cereale, iar mbolnvirile la oameni i animale sunt asociate cu consumul
de cereale sau produse ale acestora, care conin niveluri ridicate de astfel de
242
mucegaiuri.
Speciile care produc fumonizine sunt: F. sacchari, F. subglutinans,
F. thapsinum, F. globosum, F. anthophilum, F. dlamini,F. napiforme, F.
nygami, F. moniliforme, F. proliferatum. ultimele 3 specii produc cantiti
mari de toxin. F. moniliforme (iniial denumit F. verticilliodes; Gibberella
fujikuroi) este cea mai studiat dintre cele 3.
Prevalena lui F. moniliforme este mai mare n porumb n zonele unde
exist o rat ridicat a cancerului esofagian.
Exist cel puin 15 fumonizine, cele mai cunoscute find: fB
1
, FB
2
,
fB
3
, fB
4
, fA
1
, fA
2
, fA
3
.
Cele mai importante sunt fB
1
-fB
3
celelalte find considerate minore.
din 9 tulpini de F. moniliforme, fB
1
, produs n grul autoclavat n cantitate
de 960 - 2350 micrograme/g n timp ce fB
2
a fost produs ntre 120-320
g/g.

fuzarina A fuzarina B
fuzarina C este produs de ctre F. moniliforme, dar aparent nu este
implicat n activitatea hepatocancerigen. S-a demonstrat prin testul Ames
c are un efect mutagen.
o cantitate mai mare a fost obinut pe mediile de cultur, la ph 6,0,
ntre ziua a 2-a i a 6-a, la o temperatur de 28C.
Structura chimic a lui fB
1
i fB
2
difer prin faptul c fB
1
are o
grupare oh n loc de h pe carbonul 10. Aceste toxine difer de majoritatea
celorlalte pentru c nu posed grupri ciclice sau inelare, find solubile n
ap. Pe de alt parte sunt termostabile ca i alte micotoxine.
ntr-un studiu, materialele de cultur lioflizate care conineau fB
1
au
fost ferte 30 de minute, iar apoi uscate la cuptor la 60C, 24 de ore fr s-i
piard activitatea toxic.
ntr-un alt studiu a fost demonstrat stabilitatea termic a acestor
toxine la un nivel de 5 g/g de fB
1
, n porumbul procesat. la 204C, 30
minute nu s-a nregistrat nici o pierdere important. Reducerea complet s-a
nregistrat la 218C, 15 minute.
o reducere semnifcativ a fost observat la pinea de porumb la
232C, 20 minute.
243
ntr-un studiu privind stabilitatea termic a acestor toxine n conserve,
au fost adugate 5 g/g, dup care acestea au fost reconservate. Nu s-a
observat nici o reducere semnifcativa n porumbul cremat pentru copii i n
mncarea pentru cini, reduceri semnifcative aprnd n porumbul crem.
la animalele de experien, fcatul este inta principal a fB
1
. ntr-un
alt studiu, pe obolani pe o perioad de 26 de luni, toate animalele care au
murit (dup 18 luni) au prezentat: ciroz micro i macronodular, noduli
mari expansivi de colangiofbroz la nivelul hilului hepatic.
Colangiofbroza este considerat un precursor al leziunilor de
colangiocarcinom.
din 15 obolani care au murit ntre 18 i 26 de luni, 66% au prezentat
carcinom hepatic primar. Ctre sfritul studiului au aprut i unele
disfuncii renale. Nu au fost nregistrate leziuni esofagiene sau modifcri
neoplazice.
Activitatea hepatocancerigen a lui fB
1
la oareci a fost demonstrat
prin adugarea de 50.000 g/g n raiile alimentare, ntr-o perioad de 26 de
luni.
ntr-un alt studiu s-a demonstrat c fB
1
este cancerigen prin
capacitatea sa de a mri activitatea -glutamiltranspeptidazei la oareci.
leucoencefalomalacia (lEm) a fost reprodus la un cal prin injectarea
intravenoas a 7 doze de 0,125 mg/g greutate corporal de fB
1
, zilnic pe o
perioad de 10 zile.
la un porc, dup 4 zile de administrare a unei cantiti de 0,4 mg
fB
1
/g s-a produs edem pulmonar.
Prevalenta cancerului esofagian la om, n Transkei, Africa de Sud este
corelat statistic cu nivelurile ridicate de fB
1
si fB
2
din cereale.
7.9. Sambutoxina
Sambutoxina a fost izolat pentru prima dat n 1994, iar structura sa
este prezentat mai jos.
A fost asociat cu cartofi putrezii i
uscai. Este produs de tulpinile de Fusarium
sambucinum i F. oxysporum. din 13 specii
de fusarium, 90% au produs aceast toxin.
din probele de cartof mucegii din Coreea,
9 din 21 au coninut 15,8-78,1 ng/g de
sambutoxin.
Toxina a fost gsit n cartofi din Irak
unde exist o inciden mare a cancerului esofagian.
244
7.10. Zearalenonele
Exista 5 tipuri de zearalenone naturale, produse de Fusarium spp. (n
special F. graminearum i F. tricinctum). zearalenonele se produc dup
acumularea unor cantiti mari de fungi n cereale.
Toxinele produc n lumina uV, cu unde lungi o fuorescen ble-
verzuie, iar n lumina uV cu unde scurte o culoare verzuie. Posed proprieti
estrogene i produc estrus la oareci i hiperestrogenism la suine. Nu sunt
mutagene prin testul Ames i produc un rspuns pozitiv la testul cu Bacillus
subtilis.
metode de izolare i identifcare a levurilor i mucegaiurilor
din alimente
din cauza creterii lor lente i a capacitii relativ reduse de a concura
cu bacteriile, levurile i mucegaiurile se gsesc, cel mai probabil n alimentele
al cror mediu nconjurtor este mai puin favorabil creterii bacteriene:
ph-redus, umiditate crescut, coninut mare de sare sau zahr, temperatur
de depozitare redus, prezena antibioticelor sau expunerea la radiaii.
Analiza probelor.
Se prepar un mediu steril de agar (porii de 250 ml n sticle sau facoane,
autoclavate 15 minute la 121C). Se rcesc la 45C, n baie marin.
Prepararea mediului se face cu mult timp nainte i se las s se
solidifce. mediul nu se retopete, dect o singur dat sau sub presiune. Se
recomand o camer de distilare Arnold. o dat ce mediul a fost rcit, acesta
poate f pstrat 2-3 ore nainte de folosire, cu condiia ca nivelul apei din
baia marin s fe cu 2-3 centimetri deasupra suprafeei agarului. mediul de
elecie este reprezentat de agarul cu dextroz de cartof. Agarul cu dextroz
de cartof i sare este deosebit de util pentru analizarea probelor care conin
mucegaiuri de rspndire (mucor, Rhizopus, etc.) deoarece NaCl inhib
creterea lor permind detectarea altor propagule de levuri i mucegaiuri.
Pentru inhibarea creterii bacteriene, mediul se amendeaz fe cu
antibiotice, fe cu soluie de acid tartaric 10% (dup rcirea agarului i
imediat nainte de turnarea plcilor), dup cum urmeaz:
antibiotice: se recomand clortetraciclin hCl, la un mediu
de agar cu concentraie de 40 ppm; mai pot f folosite i alte antibiotice
(cloramfenicol, streptomicin) n aceeai concentraie cu clortetraciclina
hCl.
245
Se prepar soluia stoc prin dizolvarea a 1 gram de antibiotic n 100
ml de ap distilat steril i prin fltrare, printr-o membran de 0,45 microni.
Soluia stoc se pstreaz la ntuneric, la 4-8C. Perioada de valabilitate nu
trebuie s depeasc o lun.
soluia de acid tartaric: se sterilizeaz soluia prin fltrare printr-o
membran de 0,45 microni; se ajusteaz ph-ul la 3,5, dup adugarea
soluiei n mediu se verifc din nou ph-ul.
Se prepar omologatul alimentar i se efectueaz diluii seriate. Sunt
sufciente diluii pn la 10

-6
.
Se transfer cte 1 ml din fecare diluie n plci Petri i se adaug
imediat 20-25 ml de agar cu dextroz de cartof, rcit cu antibiotic sau acid
tartaric. Se amestec bine coninutul prin rotirea uoar a plcilor n sensul
acelor de ceasornic i n sens contrar, avnd grij s se evite rspndirea pe
capacul vasului. fiecare diluie se toarn n plci Petri n triplicat, utiliznd
pipete cu calibru mare. de la prepararea primei diluii i pn la turnarea
plcii fnale nu trebuie s treac mai mult de 10-20 minute.
Plcile se incubeaz la ntuneric la 22-25C, pentru 5 zile. Nu se aeaz
mai mult de 3 plci una peste alta i nici nu se inverseaz. Plcile nu se vor
mai deplasa pn la numrare, deoarece manipularea lor ar putea avea drept
rezultat o cretere secundar din sporii dislocai invalidnd numrtoarea
dup 5 zile.
Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 de colonii. Se raporteaz
rezultatele n colonii per gram sau n colonii per mililitru, fcnd media
setului n triplicat. dac a treia cifr este 6 sau mai mult se rotunjete pn
la cifra superioar (de exemplu: 456 = 460). dac cifra a treia este 4 sau
mai puin, se rotunjete pn la cifra inferioar (de exemplu 454 =450).
dac a treia cifr este 5, se rotunjete pn la cifra inferioar dac primele
dou cifre sunt un numr par (de exemplu: 445 = 440); se rotunjete la cifra
superioar dac primele dou cifre sunt un numr impar (455 = 460).
determinarea numrului de levuri i mucegaiuri
prin nsmnarea direct n plci Petri (pentru alimente ca
fasole uscat, nuci, condimente ntregi, boabe de cafea i cacao)
Analiza alimentelor nedezinfectate pe suprafaa (nSd). nainte de
nsmnarea n plci Petri, probele se pstreaz la -20C, timp de 72 de
ore, pentru a omor cpuele sau alte insecte care ar putea mpiedica analiza
alimentelor.
Prepararea plcilor de agar. Se utilizeaz agar cu dextroz de cartof
i sare (conine 75 de grame NaCl per litru). Sarea inhib creterea
246
mucegaiurilor de rspndire i germinarea seminelor viabile, care ar putea
ridica capacul plcii Petri.
la agarul rcit se adaug 40 ppm clortetraciclin hCl. Se toarn
aproximativ 30 ml de mediu n plci Petri i se las s se solidifce. Se
prepar 10 plci per prob. Perioada dintre preparare i utilizare a plcilor
nu trebuie s depeasc 24 de ore.
nsmnarea probelor n plcile Petri. din fecare prob se transfer
aproximativ 50 de grame ntr-un pahar steril de 150 mililitri. Se plaseaz 5
poriuni de prob per plac, sub form de rozete (una n centru i celelalte
n fecare cuadrant) cu ajutorul unei pense fambate n etanol. Se utilizeaz
alternativ mai multe pense pentru a se evita supranclzirea. Nu se aplic pe
poriuni vizibil mucegite sau decolorate.
Incubarea probelor. Se aliniaz plcile Petri n stive de cte 10.
Se noteaz numrul probei i dat nsmnrii, pe fecare plac. Stivele
incubate se las nederanjate la ntuneric, la 22-25C, timp de 14-21 de zile.
Citirea plcilor. Apariia mucegaiului se determin n procente.
de exemplu, dac acesta a aprut n toate cele 50 de poriuni de prob,
mucegirea este de 100%, dac mucegaiul a aprut n 32 de probe,
mucegirea se consider c are loc n proporie de 64%.
247
dETErmInArEA nUmrULUI dE drOJdII I mUCEgAIUrI
1. Se amestec ingredi-
entele ntr-un blender
2. Se dilueaz omo-
genatul de prob
alimentar
3. Se pipeteaz 1 ml din
fecare diluie n plci
separate cu PdA
PdA (Potato dextrose Agar) suplimentat cu Clor-
tetraciclin hCl sau acid tartric
4. Se incubeaz la ntuneric, la 22-25C, timp de 5 zile.
5. Se numr plcile ce conin ntre 10 i 150 colonii.
(schem adaptat dup W. Andrews, 1992)
248
Saccharomyces cerevisiae
microscopie electronic
Saccharomyces cerevisiae
microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat
Saccharomyces cerevisiae
microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat (coloraie cu foxin). Reproduc-
ere asexuat prin nmugurire
Saccharomyces cerevisiae
microscopie cu contrast de faz n cmp
ntunecat (coloraie cu foxin). Se observ
n mijlocul fgurii o asc cu 4 ascospori
Saccharomyces cerevisiae
Cultur pe agar cu dextroz de cartof
Saccharomyces cerevisiae
Cultur pe mediul Czapek
249
Bibliografe selectiv
Enomoto, m., and m. Saito. 1972. Carcinogens produced by fungi. 1. Annu. Rev.
Microbiut. 26:279-312.
Eschcr. f.E., P.E. Koehler, and J.C. Ayres. 1973. Production of ochratoxins A and B 2.
on country cured ham. Appl. Microbiol. 26:27-30.
Escobar, A., and o.S. Regueiro. 2002. determination of afatoxin Bi in food and 3.
feedstuffs in Cuba (1990 through 1996) using an immunoenzymatic reagent kit
(Afacen). J. Food Proiect. 65:219-221.
farber, J.m., and G.W. Sanders. 1986. fusarin C production by North American 4.
isolates of Fusarium moniliforme. Appl.Eimron. Microbiol. 51:381-384.
Gclderblom. W.C.A., N.P.J. Kriek, W.f.o. marasas. and P.G. Thiel. 1991. Toxicity 5.
and carcinogenicity of the Fusarium moniliforme metabolite, fumonisin B|, in rats.
Carcinogenesis 12:1247-1251. I. Gelderblom.
W.C.A., K. Jaskiewicz, W.f.o. marasas. P.G. Thiel, R.m. horak, R. Vleggaar, and 6.
N.P.J. Kriek. 1988. fumonisinsnovei mycotoxins with cancer-promoting aclivity
produced by Fusarium moniliforme. Appl. Environ. Microbiol. 54:1806-1811.
Gourama. h., and l.B. Bullerman. 1995. Antimycotic and antiafatoxigenic effect 7.
of lactic acid bacteria: A review. J. Food Proiect. 58:1275-1280.
K 8. Gutema, T., C. munimbazi, and l.B. Bullerman. 2000. occurrence of fumonisins
and moniliformin in corn and corn-based food products of u.S. origin. J. Food
Proiect. 63:1732-1737.
harrison, m.A. 1989. Presence and stability of patulin in apple products: A review./ 9.
FoodSaf 9:147-153. ).
henry. S.h., f.x. Bosch, T.C. Troxell. and P.m. Bolger. 1999. Reducing liver 10.
cancerglobal control of afatoxin. Science 286:2453-2454. ).
hesseltine, C.W. 1967. Afatoxins and other mycotoxins. 11. Health Lab. Sci. 4:222-
228.
I. holmquist. G.u., h.W. Walker. and h.m. Stahr. 1983. Infuence of temperature. 12.
ph, water activity and antifungal agents on growth of Aspergillus favus and A.
parasiticus. J. Food Sci. 48:778-782. .
Jorgenssen, K.V., d.l. Park. S.m. Rua, Jr., and R.l. Price. 1990. 13.
Reduction of mutagenic potcntials in milk: Effects of ammonia treatment
on afatoxin-contaminated cotton-seed. J. Food Protect. 53:777-778, 817.
3.
Karunaratne. A., E. Wezenberg, and l.B. Bullerman. 1990. Inhibition of mold 14.
growth and afatoxin production by Lactobacillus spp. J. Food Protect. 53:230-
236.
Kcdera. C.J.. R.d. Plattner. and A.E. desjardins. 1999. Incidence of 15. Fusarium spp.
250
and levels of fumonisin B| in maizc in western Kenya. Appl. Environ. Microbiol.
65:41-44.
Kim. J.-C., and Y.-W. lee. 1994. Sambutoxin, a new mycotoxin produced by toxic 16.
Fusarium isolates obtained from rotted potato tubers. Appl. Environ. Microbiol.
60:4380-4386.
Kim. J.-C.. Y.-W. lee, and S.-h. Yu. 1995. Sambutoxin-producing isolates of 17.
Fusarium species and occurrence of sambutoxin in rotten potato tubers. Appl.
Environ. Microbiol. 61:3750-3751.
Kurtzman, C.P, B.W. horn, and C.W. hesseltine. 1987. 18. Aspergillus nomutus, a new
afatoxin-producing species related to Aspergillus favus and Aspergillus tamarii.
Antonie van Leeuwenhoek 53:147-158.
labuza. T.P 1983. Regulation of mycotoxins in food. 19. J. Food Protect. 46:260-
265.
lee, Y.J., and W.m. hagler, Jr. 1991. Afatoxin and cyclopiazonic acid production 20.
by Aspergillus favus isolated from contaminated maize. J. Food Sci. 56:871-872.
leistner, l., and C. Eckardt. 1979. Vorkommen toxigener Penicillien bei 21.
fleischerzeugnissen. Fleischwirtsch. 59:1892-1896.
leistner. l.. and f. Tauchmann. 1979. Afatoxinbildung in Rohwurst durch 22.
verschiedene Aspergillus favus-SlUmme und einer Aspergillus parasiticus-Slamm.
Fleischwirtschaft 50:965-966.
lie.J.l-.andE.h. marth. 1967. formation of afatoxin in cheddarcheesebyAsperg/7/ 23.
w.s//avm.s and Aspci gillus pai -a.situ us. J.DairySci. 50:1708-1710.
line, J.E.. R.E. Brackett, and R.E. Wilkinson. 1994. Evidence for degradation of 24.
afatoxin B, by Flavobacterium auran-tiacum. J. Food Protect. 57:788-791.
marasas. W.f.o., K. Jaskiewicz, f.S. Venter, and d.J. van Schalkwyk. 1988. 25.
Fusarium moniliforme contamination of maize in ocsophageal cancer areas in
Transkei. 5. Afr. Med. J. 74:110-114.
marin, S., N. magan, J. Serra, A.J. Ramos, R. Canela, and V. Sanchis. 1999. 26.
fumonisin B, production and growth of Fusarium moniliforma and Fusarium
proliferatum on maize, wheat, and barley grain. J. Food Sci. 64:921-924.
marin, S., V. Sanchis. f. Rull, A.J. Ramos. and N. magan. 1998. Colonization of 27.
maize grain by Fusarium monilifor and Fusarium proliferatum in the presence of
competing fungi and their impact on fumonisin production. J. Food Pron 61:1489-
1496.
marin, S., V. Sanchis. 1. Vines. R. Canela. and N. magan. 1995. Effect of water 28.
activity and temperature on growth ; fumonisin B| and B? production by Fusarium
proliferatum and F. moniliforme on maize grain. Lett. Appl. Microb 21:298-301.
marth, E.h., and B.G. Calanog. 1976. Toxigenic fungi. In 29. Food Microbiology:
Public Health and Spoilage Aspects, m.P. defigueiredo and d.f. Splittstoesser,
210-256. New York: Kluwer Academic Publishers.
251
mphande. f.A., B.A. Siame, and J.E. Taylor. 2004. fungi afatoxins, and 30.
cyclopiazonic acid associated with pea retailing in Botswana. J. Food Protect.
67:96-102.
Nelson. PE., R.d. Plattner, d.d. Shackelford. and A.E. desjardins. 1992. fumonisin 31.
Bi production by Fusarium spec other than F. moniliforme in section Liseola and by
some related species. Appl. Environ. Microbiol. 58:984-989.
Newsome, R. 1999. Issues in internaional trade: looking to the Codex Alimentarius 32.
Commission. Food Technol. 53(6):
Niranjan. B.G., N.K. Bhat, and N.G. Avadhani. 1982. Preferenial attack of 33.
mitochondrial dNA by afatoxin B| dur hepatocarcinogenesis. Science 215:73-75.
Northolt, m.d., C.A.h. Verhulsdonk. P.S.S. Soentoro, and W.E. Paulsch. 1976. 34.
Effect of water activity and temperat on afatoxin production by Aspergillus
parasiticus. J. Milk Food Technol. 39:170-174.
oatlcy, J.T., m.d. Rarick, G.E. Ji, and J.E. linz. 2000. Binding of afatoxin Bi to 35.
bifdobacteria in vitro.y. Food Prot 63:1133-1136.
Pestka, J.J., J.I. Azcona-olivera, R.d. Plattner, f. minervini, m.B. doke, and A. 36.
Visconti. 1994. Comparative assessm of fumonisin in grain-based foods by ElISA,
GC-mS, and hPlC. J. Food Protect. 57:169-172.
Pierides. m.. h. El-Nezami, K. Peltonen. S. Salminen, and J. Ahokas. 2000. Ability 37.
of dairy strains of lactic acid bact( to bind afatoxin mi in a food model. J. Food
Protect. 63:645-650.
Pittet, A., V. Parisod, and m. Schellenberg. 1992. occurrence of fumonisins Bi 38.
and B2 in com-based products from Swiss market. J. Agric. Food Chem. 40:1352-
1354.
Park. K.Y., and l.B. Bullerman. 1983. Effect of cycling temperatures on afatoxin 39.
production by Aspergillus prsii and Aspergillus favus in rice and cheddar cheese.
J. Food Sci. 48:889-896.
Ram, B.P. P hart. R.J. Cole, and J.J. Pestka. 1986. Application of ElISA to retail 40.
survey of afatoxin B| in peanut bui ./ Food Protect. 49:792-795.
Rheeder, J.P. W.f.o. marasas, P.G. Thiel, E.W. Sydenham. and d.J. van Schalkwyk. 41.
1992. Fusarium moniliforme fumonisins in corn in relation to human esophageal
cancer in Transkei. Phytophathology 82:353-357.
Roland, J.o., and l.R. Beuchat. 1984. Biomass and patulin production by 42.
Byssochlamy.s nivea in apple juice as affec by sorbate, benzoate, SO and
temperature. J. Food Sci. 49:402^*06.
Ross, P.f., l.G. Rice, R.d. Plattner, G.d. osweiler, T.m. Wilson, d.l. owens, h.A. 43.
Nelson, and J.l. Richard. 1< Concentration of fumonisin B| in feeds associated
with animal health problems. Mycopathology 114:129-135.
Ross, P.f., P.E. Nelson, J.l. Richard, G.d. osweiler, l.G. Rice, R.d. Plattner. and 44.
T.m. Wilson. 1990. Productioi fumonisins by Fusarium moniliforme and Fusarium
252
proliferatum isolates associated with equine leukoencephalomal; and a pulmonary
edema syndrome in swine. Appl. Environ. Microbiol. 56:3225-3226.
Schillinger, u.. R. Geisen. and W.h. holzapfel. 1996. Potenial of antagonistic 45.
microorganisms and bacteriocins for biological preservation of foods. Trends Food
Sci. Technol. 7:158-164.
Schindler, A.f. 1977. Temperature limits for production of afatoxin by twenty-fve 46.
isolates of Aspergillus favus Aspergillus parasiticus. J. Food. Protect. 40:39-40.
Scrck-hanssen. A. 1970. Afatoxin-induced fatal hepatitis? 47. Arch. Environ. Health
20:729-731.
Shelef, l.A., and B. Chin. 1980. Effect of phenolic antioxidants on the mutagenicity 48.
of afatoxin Bi. Appl. Envi Microbiol. 40:1039-1043.
Shih, C.N., and E.h. marth. 1974. Some cultural conditions that control biosynthesis 49.
of lipid and afatoxin by Aspergi parasiticus. Appl. Microbiol. 27:452^156.
Shim, W.-B.. J.E. flaherty, and C.P. Woloshuk. 2003. Comparison of fumonisin B, 50.
biosynthsis in maize germ degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food
Protect. 66:2116-2122.
Shotwell. o.l.. and C.W. hesseltine. 1983. five-year study of mycotoxins in 51.
Virginia wheat and dent corn. J. Assoc. Anal. Chem. 66:1466-1469.
253
Capitolul 8
SCUrT PrEZEnTArE A PrInCIPLALELOr
VIrUSUrI CE SE TrAnSmIT PrIn ALImEnTE
Caractere generale
Moto
Virusurile sunt entiti potenial patogene care au o faz infecioas,
posed un singur tip de acid nucleic, se multiplic sub form de material
genetic, nu cresc, nu se divid i sunt lipsite de sistem Lippman (Lwoll A,
1957; The concept of a virus; Y. gen. Microbul).
n 1972, Uniunea Internaional de Biochimie (IUB) recomand
folosirea prescurtrilor dnA i rnA pentru acid dezoxiribo i respectiv
ribonucleic indiferent de limba n care este scris textul (diem K i
Lentner).
Virusurile constituie un regim aparte, VIRA, datorit caracterelor de
structur i funcie prin care se deosebesc fundamental de microorganismele
procariote i eucariote.
Pasteur a intuit prezena virusurilor n studiile sale privind agentul
turbrii (1884) ca find un microoganism infnitezimal de mic.
d. I. Ivanovski (1892) demonstreaz c mozaicul tutunului este produs
de un agent att de mic, nct poate trece prin fltrele care rein cele mai
mici bacterii.
loefer i frosch n 1898, n febra aftoas a bovinelor, J. Cord mpreun
cu Watter Reed (1901) n febra galben, Remlinger (1903) n turbare, au pus
n eviden faptul c agenii infecioi respectivi sunt fltrabili.
n urmtoarele decenii, au fost identifcai i ali ageni cu caractere
asemntoare prin inocularea la animalele de laborator de fltrate lipsite de
bacterii obinute din suspensii de organe sau fuide de la gazdele naturale
(animale, plante, bacterii).
Aceti ageni noi au fost denumii iniial virusuri fltrabile
ultramicroscopice apoi virusuri ultrafltrabile, i n cele din urm
254
virusuri.
n 1915, Twort i, independent, n 1917, dherelle au descoperit
bacteriofagul. n 1930, studiile pe modelul fag-bacterie i-au permis lui
Schlesinger (1930) s arate c particula de fag este alctuit din dNA i
protein.
Virusurile sunt sisteme genetice independente dotate cu continuitate i
variabilitate genetic i care posed o istorie evolutiv proprie.
Pentru replicare virusurile utilizeaz mainria de sintez a celulei vii-
gazd dirijnd-o spre sinteza de virioni, particule specializate care conin
genomul viral (acid nucleic) i componentele structurale (proteine, nveli),
care permit transferul acestuia la alte celule gazd.
Clasifcarea virusurilor se bazeaz pe urmtoarele criterii:
1) Tipul de acid nucleic: dNA sau RNA; structura i proprietile
acestora;
2) dimensiuni i morfologie (tipul de simetrie al capsidei, numr de
capsomere, prezena de inveliuri);
3) Comportarea fa de agenii fzici i chimici (fa de eter);
4) Caractere antigenice;
5) modul de transmitere n natur;
6) Gazda, esutul, celula pentru care prezint tropism;
7) leziuni celulare i anatomopatologice.
8) Simptome clinice.
Componentele principale ale unui virus sunt acidul nucleic i
proteina.
metodele de purifcare sunt reprezentate de: a) metode care se
adreseaz fracionrii proteinelor din matricea lipoidal i b) metode fzice,
ca de pild adsorbia i ultracentifugarea, care in seama de diferenele de
dimensiune, densitate i proprieti de suprafa ntre particula de virus i
componentele subcelulare, nevirale, prezente n omogenatul de celule sau
esut infectat folosit ca surs de virus.
Pn n prezent se cunosc mult mai puine date legate de incidena
virusurilor n alimente, dect a bacteriilor i a fungilor.
n primul rnd virusurile find parazii obligatorii nu se dezvolt pe
medii de cultur ca bacteriile sau fungii. Replicarea lor se realizeaz numai
n celulele vii. Pentru replicarea virusurilor animale se pot folosi celule vii
provenind din trei surse: a) animale de laborator, b) embrioni de gin n
dezvoltare (ou embrionate) sau c) culturi celulare.
255
datorit faptului c virusurile nu se pot replica n alimente, numrul
lor n acestea find sczut n comparaie cu cel al bacteriilor, sunt necesare
metode de extracie i concentrare pentru recuperarea lor. Cu toate c au
fost efectuate multe cercetri n acest sens este difcil recuperarea a mai
mult de 50% din particulele virale din carnea de vit tocat.
un alt motiv este reprezentat de faptul c n majoritatea laboratoarelor
de microbiologie alimentar nu se practic tehnicile de virusologie.
deasemenea, nu toate virusurile care prezint interes pentru
microbiologia alimentar, pot f cultivate prin metode obinuite.
un interes deosebit l reprezint reacia de revers transcriptaz-
polimerizare n lan (RT-PCR) care a permis detectarea virusurilor
transmisibile pe cale alimentar din esuturile de stridii i molute.
Efcacitatea tehnicii RT-PCR pentru detectarea virusurilor din alimente
a fost demonstrat de mai muli cercettori.
Au fost comparate 4 metode de concentrare i extracie a astrovirusurilor,
hepatitei A i poliovirusurilor din stridii. Cele mai efciente au fost metodele
care au folosit soluia de glicerina i boratul tamponat. Astfel au fost folosite
mai multe combinaii pentru detectarea celor 3 virusuri din probele de
analizat.
Intr-un alt studiu, detectarea prin hibridizare dot-blot a ampliconilor
prin tehnica RT-PCR a permis detectarea a 8 ufp de hepatit A/g n carnea
de stridii (ufp = uniti formatoare de plaje; pfu = plaque forming units).
datorit faptului c s-a demonstrat c n condiii insalubre orice agent
patogen bacterian poate f gsit n alimente, se poate presupune acelai
lucru i despre virusurile intestinale, cu toate c acestea nu se multiplic n
alimente.
Cliver a demonstrat c orice aliment poate servi ca rezervor de virusuri,
marcnd importana modului de transmitere oral-anal, n special pentru
hepatita viral de origine alimentar.
la fel cum bacteriile non intestinale se pot gsi n alimente, acelai
lucru se poate spune i despre virusuri, dar datorita afnitii lor pentru
esuturi, alimentele vor juca rolul de rezervoare numai pentru virusurile
intestinale i pentru enterovirusuri.
Ca frecven, gastroenterita viral se pare c se situeaz imediat dup
rceal.
256
8.1. Virusurile hepatice enterice
Tabelul 8.1.
Virusul hepatic Caracteristici
Virusul hepatitei A (hAV)
familia Picornaviridae, nenvelite, capsid icosaedral, 27-
32 nm, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice i nu
are statut de purttor, exist vaccinuri, mortalitate sczut
Virusul hepatitei E (hEV)
familia Caliciviridae, nenvelite, 25-35 nm, capsid
icosaedral, RNA monocatenar, nu produce infecii cronice,
nu are statut de purttor, nu exist vaccin, mortalitate mare
la femeile gravide
Virusul hepatitei f (hfV)
Neclasifcat, nenvelit, 27-37 nm, capsid icosaedral, dNA
dublu catenar, nu produce infecii cronice, nu are statut de
purttor, nu exist vaccin, mortalitate sczut
8.1.1. Virusul hepatitei A
Hepatita A Virusul hepatitei A (hAV) este un virus ARN nenvelit, de
27 nm, termo-, acido- i etero-rezistent. Virionul conine patru polipeptide
n capsid, denumite de la VP1 la VP4, care sunt clivate posttranslaional
din produsul poliproteic al unui genom de 7500 de nucleotide. Inactivarea
activitii virale se poate obine prin febere 1 minut, prin contact cu
formaldehida i clorul sau prin iradiere cu raze ultraviolete.
n ciuda variaiei de pn la 20% a secvenei nucleotidice printre
izolatele de hAV, toate varietile acestui virus identifcate pn acum nu se
pot deosebi din punct de vedere imunologic i aparin unui singur serotip.
hepatita A are o perioad de incubaie de aproximativ patru sptmni.
Replicarea este limitat la fcat, dar virusul este prezent n fcat, bil, scaun i
snge spre sfritul perioadei de incubaie i n timpul fazei acute preicterice
a bolii. n ciuda persistenei virusului n fcat, eliminarea viral n fecale,
viremia i infectivitatea diminu rapid o dat ce icterul devine manifest.
hAV este singurul virus hepatic uman care se poate cultiva in vitro.
Anticorpii anti-hAV pot f detectai n cursul bolii acute, atunci cnd
activitatea aminotransferazei serice este crescut i virusul nc se mai
elimin n fecale. Acest rspuns precoce este reprezentat de elaborarea de
anticorpi predominant din clasa Igm i persist mai multe luni, doar arareori
pn la 6-12 luni. n timpul convalescenei anticorpii anti-hAV din clasa
257
IgG devin predominani. Ca urmare, diagnosticul hepatitei A este realizat n
timpul bolii acute prin demonstrarea existenei titrurilor nalte de anticorpi
anti-hAV din clasa Igm. dup perioada de boal acut, anticorpii anti-
hAV din clasa IgG rmn detectabili pentru un timp nedefnit i pacienii
cu anticorpi serici anti-hAV sunt imuni la reinfecie. ntr-adevr, activitatea
neutralizant a anticorpilor crete concomitent cu apariia anticorpilor anti-
hAV, iar protecia mpotriva infeciei hAV este oferit de anticorpii IgG
anti-hAV prezeni n imunoglobuline.
nainte de anii 1990 au fost nregistrate mai multe epidemii de hepatit
A de origine alimentar, dect oricare alt infecie viral. Virusul aparine
familiei Picornaviridae cu RNA monocatenar. din care fac parte:
Enterovirusurile, din care face parte, virusul hepatitei A (hAV),
clasifcat de curnd n genul hepatovirus (nainte g. heparnavirus). Ca
multe alte picornavirusuri, cauzeaz infecii cu simptome terse sau fr
simptome, mai ales la copii. Incidena acestora este strns legat de condiiile
de sanitaie i igien, majoritatea mbolnvirilor avnd loc n copilrie.
Simptomele clinice apar de obicei la aduli, mortalitatea este mai mic
de 1%. Poate cauza epidemii atunci cnd e prezent n ap i alimente.
Calea de transmitere este cea oral-fecal, prin consum de ap i
alimente poluate cu fecale sau prin contact direct cu o persoan infectat.
un pas important l-a constituit vizualizarea hAV prin microscopie
electronic imun.
Ruta oral-fecal reprezint principalul mod de transmitere, iar
rezervoarele principale sunt reprezentate de crustacee crude sau parial
gtite din apele poluate.
n SuA n 1973, 1974 i 1975 au fost 5, 6 i respectiv 3 epidemii cu
425, 282 i 173 de cazuri. Epidemiile din 1975 au fost datorate salatelor,
sandwich-urilor i gogoilor glazurate servite n restaurante. Conform cu
CdCP (Centrul de prevenire i control, Centers for disease control and
prevention) numrul de cazuri de hepatit A a sporit n SuA ntre 1983-
1989 de la 9,2 la 14,5 din 100.000 de oameni.
din numrul cazurilor de hepatit, din anul 1988, n SuA, 7,3% au
fost de origine alimentar. din 88 de elevi i profesori in Georgia, 15 s-au
mbolnvit de hepatit A.
din 641 de rezideni i angajai dintr-un centru pentru oamenii cu
handicap din montana, 13 cazuri s-au mbolnvit de hepatit A. n ambele
cazuri vehiculul a fost reprezentat de prjitura cu cpuni.
Cea mai mare epidemie de hepatit A, nregistrat n SuA a avut
loc n noiembrie 2003 i au fost cca 600 de victime i 3 mori. Alimentul
vehicul a fost reprezentat de ceapa verde servit de un lan de fast-food.
258
ntre 1992-2001, au fost raportate de CdCP aproximativ 230.000
de cazuri de hepatit A. n 2001 ntr-o epidemie cu 46 de cazuri din
massachusetts a fost asociat cu consumul de sandwich-uri contaminate de
procesator.
Tabelul 8.2
Genul Specii (* = specia tip)
Enterovirus
enterovirusul bovin
enterovirusul uman A
enterovirusul uman B
enterovirusul uman C
enterovirusul uman d
poliovirusul*
enterovirusul porcin A
enterovirusul porcin B
enterovirusul simian A
Rhinovirus
rinovirusul uman A
rinovirusul uman B
rinovirusul uman C
hepatovirus (nainte heparnavirus)
virusul hepatitei A (hAV)
virusul encefalomielitei aviare (AEV)
Cardiovirus
virusul encefalomiocarditei (EmCV)
theilovirus
Aphthovirus
virusul febrei aftoase*
virusul rinitei ecvine A (ERAV)
Parechovirus
parechovirusul uman (hPeV)
virusul ljungan
Erbovirus virusul rinitei ecvine B
Kobuvirus
virusul aichi
kobuvirusul bovin
Teschovirus teschovirusul porcin
259
8.1.2. Virusul hepatitei E (hEV)
Existena hEV a fost confrmat la sfritul anilor 1970.
Acest virus a fost descoperit recent si producele hepatitele non-A,
non-B (NANB). Este un calicivirus sferic, nenvelit, de 27-34 nm, i genom
RNA monocatenar.
n forma acut, perioada de incubaie este de 30-40 zile. Nu prezint
form cronic i nici statut de purttor. Predomin la persoanele adulte (15-
40 ani). Pot aprea complicaii la femeile gravide, rata de mortalitate find
la acestea de peste 40%.
Patogenitatea este asemntoare cu cea a hepatitei A, virusul se
replic iniial n intestin, dup care invadeaz fcatul i ajunge n fecale.
Este slab virulent, find necesar o mare cantitate de virus pentru producerea
infeciei.
Se pare c incidena bolii este sczut n rile puternic industrializate.
Epidemii mari au aprut n India, mexic i America de Nord, unde principala
surs de infecie pare a f contaminarea cu fecale a surselor de ap.
Transmiterea interuman nu a fost raportat (se presupune c este
necesar o cantitate mare de virus pentru transmiterea bolii). Virusul nu se
poate cultiva in vitro. Pentru diagnostic se folosesc urmtoarele metode:
identifcarea particulelor de calicivirus n fecale prin microscopie electronic,
teste serologice, PCR.
8.1.3. Virusul hepatitei f (hfV)
hepatita f (non A, non E) a fost raportat recent, n cazuri izolate
n Europa de Vest, SuA i India. hfV a fost izolat din fecalele subiecilor
infectai, unde apare sub form de particule, cu dimensiuni cuprinse ntre
27-37 nm, conine o molecul de dNA dublucatenar de aproximativ 20
Kbytes. Nu a fost nc clasifcat. Acest virus difer substanial de hAV,
hEV ambele find alctuite dintr-o molecul de RNA monocatenar de 7,5
Kbytes. Nu exist teste serologice pentru diagnosticul hepatitei f, dar el
poate f pus n urma examinrii prin microscopie electronic, din scaunul
pacienilor. Sunt suspecte cazurile de hepatit a cror etiologie nu poate f
determinat n urma testrii pentru celelalte virusuri. Infecia experimental
a fost raportat la maimua Rhesus. Se replic i produce efect citopatic n
linia celular hep-2 (human larynx carcinoma).
260
8.2. norovirusurile
Norovirusurile (nainte denumite Norwalk virus - like) sunt virusuri
noi, aparinnd familiei Caliciviridae, cu RNA monocatenar, de 7,5 knt,
conine proteina structural major VP1, de aproximativ 58-60 Kda i o
protein capsidic minor (VP2). la microscopul electronic apar ca structuri
amorfe, cu dimensiuni ntre 27 i 38 nm.

Tabelul 8.3.
Serotipurile genului Norovirus
Serotip Tulpin Izolat
desert Shield [u04469] (hu/NlV/dSV395/1990/SR)
lordsdale [x86557] (hu/NlV/ld/1993/uK)
Mexico [u22498] (hu/NlV/mx/1989/mx)
Norwalk [m87661] (hu/NlV/NV/1968/uS)
hawaii [u07611] (hu/NlV/hV/1971/uS)
Snow mountain [l23831] (hu/NlV/SmV/1976/uS)
Southampton [l07418] (hu/NlV/ShV/1991/uK)
Aceste virusuri sunt responsabile de aproximativ 90% dintre epidemiile
de gastroenterite non-bacteriene n lume i de 50% dintre epidemiile de
gastroenterite alimentare din SuA.
Norovirusurile afecteaz persoanele de toate vrstele, se transmit
prin contaminarea apei i a alimentelor cu fecale sau de la persoan la
persoan.
261
Imunitatea este incomplet i temporar. Exist o predispoziie la
infecie a indivizilor cu grupa sanguin o, n timp ce persoanele cu grupele
B i AB sunt mai rezistente.
Epidemiile apar n comuniti nchise sau semi-nchise, cum ar
f spitale, nchisori, dormitoare, vase de croazier, campinguri, n care
infecia se transmite cu repeziciune de la o persoan la alta, prin alimentele
contaminate sau prin persoane infectate care manipuleaz alimentele.
Norovirusurile sunt inactivate rapid de dezinfectante pe baz de
clor, ns datorit anvelopei lipidice, sunt mai puin sensibile la alcool i
detergeni.
Norovirusurile sunt clasifcate genetic n 5 genogrupe (GI-GV), care
se clasifc la rndul lor n mai multe grupuri sau genotipuri.
de exemplu, genogrupul II, cel mai frecvent genogrup uman, conine
18 genotipuri. Genogrupurile I, II i IV sunt patogene pentru om, n timp ce
genogrupul III infecteaz bovinele i genogrupul V, a fost izolat recent, de
la oarece.
Genogrupul II, genotipul 4 (GII.4) este responsabil de producerea
epidemiilor de gastroenterite, n care sunt implicate, n special persoanele
adulte, cu rspndire pandemic.
Exemple recente de astfel de epidemii includ:
tulpina uS95/96-uS - cu rspndire pe tot globul - anii 90;
virusul farmington hills - Europa i SuA - 2002;
virusul hunter - Europa, Japonia, Australia, Asia - 2004.
n 2006, au crescut cazurile de mbolnaviri cu norovirusuri pe tot
globul. n 2007, a izbucnit o epidemie, ntr-un club country din California
de Nord, cu 80-100 de cazuri de mbolnvire.
Istoric. Norovirusurile au fost denumite iniial Norwalk virusuri.
denumirea provine de la localitatea Norwalk, ohio, unde a izbucnit o
epidemie de gatroenterit acut, ce a afectat majoritatea copiilor din coala
Elementar Bronson, noiembrie 1968. Virusul a fost identifcat n 1972,
prin microscopie electronic imun, efectuat din probe de fecale de la
pacieni. n anul 2002, denumirea de Norovirusuri (genul Norovirus) a fost
recunoscut de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral.
Boala poart diferite denumiri cum ar f: winter vomiting disease,
stomach fu gastroenterit viral sau gastroenterit acut non-bacterian.
Virusul a purtat nainte diferite denumiri, cum ar f: virusul Norwalk,
Norwalk-like virus, SRSV (Small Round Structured Viruses) sau virusul
Snow mountain
diagnostic. Testele specifce de diagnostic de laborator sunt PCR,
RT-PCR, care confrm rezultatul n cteva ore, putnd detecta concentraii
262
mai mici de 10 particule virale. Exista kituri ElISA comerciale, ns au
specifcitate i sensibilitate sczut.
Norovirusurile sunt extrem de contagioase, n medie o persoan
infectat transmite infecia altor 14.
Splarea minilor i igienizarea suprafeelor rmn cele mai importante
metod de prevenire a acestei infecii.
n 2007, ligocyte i col., au creat un vaccin, nc n faz
experimental.
Recent, n Nicaragua s-a observat faptul c norovirusurile sunt
responsabile de 11% din cazurile de diaree la copiii sub 5 ani, iar 15% dintre
cazuri necesit rehidratare intravenoas.
Norovirusurile se pot transmite direct de la persoan la persoan sau
indirect prin apa sau alimentele contaminate. ntr-un studiu CdC, n 11
epidemii din statul New York, s-a observat c modul de transmitere la 7
dintre acestea a fost de la persoan la persoan, la 2 prin alimente, 1 prin apa
de but, iar una necunoscut.
Alimentele cele mai des implicate n epidemiile Norwalk, sunt
alimentele pe baz de scoici i diferite salate. Consumul de molute i stridii
crude sau insufcient preparate termic, prezint un risc mare de infeciozitate
cu virusul Norwalk.
8.3. rotavirusurile (duovirusuri)
Rotavirusurile sunt virusuri RNA dublu catenare din familia Reoviridae,
care produc diaree sever la copii i sugari.
Statistic, se poate spune c fecare copil din lume a fost infectat cu
Rotavirus cel puin o dat. Imunitatea se instaleaz treptat, pe parcursul
vieii, persoanele adulte find rar afectate.
Exist 7 specii de virus, notate cu A, B, C, d, E, f i G. Rotavirusul A
este cel mai ntlnit, cauznd peste 90% din infeciile umane. Infecii umane
mai produc i speciile B i C.
Conine dou proteine structurale, glicoproteina VP7, care defnete
tipurile G i VP4 pentru tipurile P.
Genomul este constituit din 11 molecule de RNA, dublu helix, constiuit
n total din 18.555 de perechi de baze nucleotide.
RNA-ul este nvelit de o capsid proteica, icosaedral, tristatifcat.
Particulele virale au aproximativ 76,5 nm i nu sunt nvelite.
Virionul este format din 6 proteine structurale (VP1, VP2, VP3, VP4,
VP6 i VP7) i 6 proteine nestructurale (NSP1-NSP6).
263

stnga:
Rotavirus A,
microscopie
electronic
dreapta:
distribuirea
proteinelor n
virion
Peste 500.000 de copii, sub 5 ani mor anual din cauza infeciilor cu
rotavirusuri, iar peste 2.000.000 prezint forme severe.
Istoric. n 1943, Jacob light i horace hodes au dovedit c agentul
fltrabil, din scaunele diareice ale copiilor este acelai cu cel care produce
diareea infecioas n efectivele de vite.
n 1974, Thomas henry flewett, a propus denumirea de Rotavirus
dup ce a observat prin microscopie electronic aspectul asemntor al
particulelor virale cu al spielor de roat (rota n latin). Numele a fost
recunoscut ofcial de ctre Comitetul internaional de taxonomie viral, n
1978.
n 1980 au fost descrise serotipurile de Rotavirus i n anul urmtor au
fost izolate pe culturi celulare de rinichi de maimu.
n 1998, a aprut primul vaccin comercial, n SuA, care a fost scos de
pe pia un an mai trziu, deoarece exista suspiciunea ca ar produce ocluzie
intestinal la 1/12.000 copii.
n 2006, au aprut dou noi vaccinuri vii atenuate mpotriva infeciilor
cu Rotavirus A (Rotarix - GlaxoSmithKline i RotaTeq - merck), care s-au
dovedit a f sigure i efciente.
Aceste vaccinuri sunt disponibile n Australia, Europa, Canada,
Brazilia, Egipt, India, Israel, Taiwan, Africa de Sud, Panama, Argentina i
SuA.
Programul de vaccinare mpotriva rotavirusului A, reprezint o
colaborare ntre PATh, omS i CPC i este fnanat de GAVI Alliance.
Programul are ca scop reducerea mortalitii i morbiditii prin campanii
de vaccinare, n rile n curs de dezvoltare.
n iunie 2009, Who a recomandat vaccinarea obligatorie n toate
programele de imunizare naionale.
Epidemiologie. Calea de transmitere este cea fecal-oral, prin
contactul cu mini, suprafeele sau obiectele contaminate i posibil pe
cale respiratorie. fecalele unei persoane bolnave conin peste 10 trilioane
de particule infecioase/gram (numai 10-100 dintre acestea pot transmite
264
infecia la alte persoane).
Tabelul 8.4
ara
rat de
mortalitate
Sursa
Viet-
nam
1 din 61 - 1
din 113
Anh dd, Thiem Vd, fischer TK, Canh dG, minh TT, Tho le
h, Van man N, luan le T, Kilgore P, von Seidlein l, Glass RI
(2006). The burden of rotavirus diarrhea in Khanh hoa Prov-
ince, Vietnam: baseline assessment for a rotavirus vaccine trial.
Pediatr. Infect. dis. J. 25 (1): 3740
Ban-
gladesh
1 din 330 -
1 din 660
Tanaka G, faruque AS, luby SP, malek mA, Glass RI, Parashar
ud (2007). deaths from rotavirus disease in Bangladeshi chil-
dren: estimates from hospital-based surveillance. Pediatr. In-
fect. dis. J. 26 (11): 10148
Ven-
ezuela
1 din 1800
Prez-Schael I, Salinas B, Gonzlez R, Salas h, ludert JE, Es-
calona m, Alcal A, Rosas mA, matern m (2007). "Rotavirus
mortality confrmed by etiologic identifcation in Venezuelan
children with diarrhea". Pediatr. Infect. dis. J. 26 (5): 3937.
uE 1 din 20433
Soriano-Gabarr m, mrukowicz J, Vesikari T, Verstraeten T
(2006). Burden of rotavirus disease in European union coun-
tries. Pediatr. Infect. dis. J. 25 (1 Suppl): S7S11.
SuA 1 din 21675
Cook Sm, Glass RI, leBaron CW, ho mS (1990). Global sea-
sonality of rotavirus infections. Bull. World health organ. 68
(2): 1717.
n zonele temperate, infeciile cu rotavirusuri apar n special iarna, iar
n cele tropicale de-a lungul ntregului an.
de-a lungul anului 2005 a fost raportat cea mai mare epidemie, n
Nicaragua.Au aprut mutaii genetice ale Rotavirusului A, care au afectat i
populaia adult.
Rotavirusul B, denumit i rotavirusul diareei la aduli (AdRV),
a cauzat epidemii severe de diaree, ce au afectat mii de oameni de toate
vrstele n China. Aceste epidemii au fost produse prin consumul apei. n
1998, a aprut i n India o epidemie cauzat de Rotavirus B, tulpina CAl,
care este endemic.
Rotavirusul C a fost asociat cu cazuri sporadice de diaree la copii, n
mai multe ri, dintre care Japonia i Anglia.
265
CAPITOLUL 9
PRINCIPALII PRIONI CE SE TRANSMIT PRIN
ALIMENTE
Prionii sunt proteine unice prin faptul c pot converti alte proteine n
unele duntoare fcndu-le s i modifce forma.
Proteina prionic din celula normal (PrP) exist n membrana
celular din creier, avnd unele funcii vitale i find degradat de proteaze.
forma sa patogen apare deformat, find rezistent la proteaze, i astfel se
acumuleaz n esutul creierului i d natere bolilor.
S-a postulat ideea c molecula prionic distorsionat acioneaz ca o
matri, convertind proteinele normale n forme deformate. Proteina normal
(forma -helical) cnd devine patogen ia o form -linear, rezistent la
proteaze.
formele patogene au tendina s se agrege n fbrilele amiloide, unde
cauzeaz degenerarea celulei nervoase, ceea ce conduce la manifestarea
clinic.
Aceste particule au fost pentru prima dat denumite prioni de ctre
Stanley Prusiner n 1982, cruia i-a fost acordat premiul Nobel pentru
munca sa de pionierat n domeniul fziologiei.
Prionii cauzeaz scrapia la oi, capre i hamsteri i kuru la oameni.
Alte infecii cu aceeai origine etiologic sunt: boala Kreutzfeldt Jacob
(CJd), encefalopatia spongiform bovin (BSE) - boal a vacilor i oilor,
denumit i boala vacii nebune, encefalopatia transmisibil a nurcilor,
boala cahectizant a cervideelor.
Toate acestea aparin unei familii de boli denumite encefalopatii
spongiforme transmisibile (TSEs)
9.1. Encefalopatia spongiform bovin (BSE)
BSE (mad cow disease) a fost descoperit pentru prima dat n marea
Britanie n 1984 i diagnosticat specifc la vaci n 1986. Patru ani mai
trziu, n marea Britanie, dintr-o populaie de 10.000.000 de vite au fost
confrmate 14.000 de cazuri. Epidemia a atins un maxim de 1.000 de cazuri
pe sptmn n 1993. Pn n februarie 1998 au fost confrmate 172.324
de cazuri.
266
Perioada de incubaie pentru BSE la om este ntre 1 i 15 ani.
n 8 ri din afara Statelor unite au fost nregistrate 600 de cazuri,
cu 256, numai n Elveia. din 1996-2000, au fost omorte 4.500.000 de
vaci. ntre 1986 i noiembrie 2003, n SuA au fost diagnosticate cu BSE
183.634 de vaci i 4.469, n alte 22 de ri. n 2000 s-au nregistrat n SuA,
n jur de 84 de victime umane. Primul caz confrmat n Japonia a aprut n
septembrie 2001, iar pn n 2003 au fost nregistrate aproximativ 9 cazuri.
n America de Nord, primul caz confrmat a fost anunat n mai 2003, n
Alberta, Canada.
n SuA, primul caz a fost confrmat n decembrie 2003 n mosses
lake, Washington. Vaca avea 6 ani jumtate i consumase nutreuri cu
materii animale (n prezent interzise).
Testele de detectare a proteinelor prionice constau ntr-o metod
imuno-histochimic (considerat metod standard), un CdI (conformation
dependent immunoassay) practicat din 2003; un test screening elaborat de
Bio-Rad Co. (TeseE) i alte 5-6 teste postmortem pentru SNC la vaci.
BSE este o afeciune neurologic ntlnit numai la bovinele adulte,
cu evoluie progresiv, insidioas. Se caracterizeaz clinic prin modifcri
de comportament, tulburri locomotorii, pareze i moarte, iar histopatologic
prin vacuolizarea neuropilului, degenerarea pericarionilor i astroglioz,
datorate interveniei unei proteine patogene (prion). datele epidemiologice
arat c sursa primar de infecie o constituie hrana contaminat cu agentul
cauzal al BSE. n momentul de fa se accept c sursa de infecie este
reprezentat de fina de carne i de oase, provenite de la carcasele de oi i
capre, bolnave de BSE, insufcient prelucrate industrial, ndeosebi termic
permind supravieuirea agentului contaminant. Se consider c SNC,
intestinele, splina, esutul limfoid i ocular, precum i placenta, constituie
sursele de contaminare cele mai active.
n SuA, incidena a fost mai mare la vacile din fermele de lapte,
comparativ cu cele din fermele de carne, deoarece administrarea finii de
carne i oase, la prima categorie a fost fcut din primele luni de via, pe o
perioad lung de timp.
multiplicarea iniial a agentului infecios are loc n esutul
limforeticular, dup care se rspndete n SNC pe cale nervoas.
dup infectarea vieilor pe cale oral, agentul etiologic al BSE poate
f detectat n regiunea distal a ileonului (plcile Payer).
Infectivitatea a fost demonstrat la rdcina ganglionului toracic
dorsal la 32-40 de luni dup infecie i n ganglionul trigemen la 36-38 de
luni (Constantin Vasiu, 2003).
S-a dovedit experimental c prin acidiferea mediului, are loc
267
o modifcare structural a PrP
c
, practic transformarea ntr-o structur
monomeric, cu solubilitate ridicat, -PrP, bogat n structuri . Aceste
experimente arat c legarea mai multor molecule de -PrP poate duce la
apariia unei confguraii ireversibile, probabil baza acumulrii PrP
sc
n
BSE. (Constantin Vasiu, 2003).
n rile indemne de boal se impune respectarea urmtoarelor msuri
de prevenire:
Supraveghere clinic i prin examene de laborator a bovinelor 1.
domestice, bovideelor exotice i cervideelor din mediul silvatic si din
captivitate.
Interzicerea importului de animale i produse ale acestora din rile 2.
unde evolueaz boala.
Eliminarea din hrana rumegtoarelor a oricrui produs posibil 3.
contaminat.
n rile n care boala evolueaz, msurile aplicate urmresc reducerea
sau eliminarea surselor de infecie pentru animale i a riscului de expunere
a oamenilor la mbolnvire prin consum de alimente de origine animal. Se
interzice folosirea, n hrana bovinelor a finii de carne i oase. Animalele
bolnave se sacrifc i se distruc prin incinerare.
Tabelul 9.1
Situaia cazurilor de BSE (infecia bovin) i vCJd (infecia uman) raportate
pn n septembrie 2009 (The National Creutzfeldt-Jakob disease Surveillance unit
(NCJdSu), university of Edinburgh. february 2009)
ar cazuri BSE cazuri vCJd
Austria 5 0
Belgia 133 0
Canada 15 1
Republica Ceh 28 0
danemarca 14 0
Insula falkland 1 0
finlanda 1 0
frana 900 23
Germania 312 0
Grecia 1 0
hong Kong 2 0
Irlanda 1,353 4
Israel 1 0
268
ar cazuri BSE cazuri vCJd
Italia 138 1
Japonia 26 1
liechtenstein 2 0
luxembourg 2 1
olanda 85 3
oman 2 0
Polonia 21 0
Portugalia 875 2
Arabia Saudit 1
Slovacia 15 0
Slovenia 7 0
Spania 412 5
Suedia 1 0
Elveia 453 0
Thailanda nu exist date 2
marea Britanie 183,841 167
SuA 3 3
Total 188,579 214
9.2. Boala Creutzfeldt-Jakob (CJd, vCJd)
n martie 1996, a fost nregistrat o nou variant de CJd (nvCJd,
vCJd) n SuA la un grup mic de oameni majoritatea find mai tineri dect
vrsta semnalat la cazurile precedente. n mod normal CJd apare la
oamenii cu vrsta peste 60 de ani, dar n SuA, vCJd atac indivizii cu
vrste cuprinse ntre 15-40 de ani.
S-a concluzionat c vCJd reprezint de fapt forma uman de BSE.
Prin studii pe oareci s-a demonstrat c BSE i CJd sunt similare.
ntre februarie 1994 i octombrie 1995 au fost depistate n SuA 10
persoane cu nvCJd, dintre care 8 au murit. majoritatea victimelor aveau
sub 30 de ani. ntre anii 1995 i 1998 au fost depistate n SuA 32 de cazuri.
n 2003, n Europa boala a produs 150 de victime. ntre 1991 i 1995 au
fost nregistrate n SuA, 94 de decese, dintre care 9 au avut vrste sub 55
de ani. Peste 85% dintre pacienii cu CJd mor la aproximativ un an de
la declanarea bolii. ntre 1991 i 1995 rata mortalitii anuale n SuA,
datorat CJd a fost de 1,2/1.000.000 de oameni.
269
9.3. Boala cahectizant cronic
(Chronic Wasting disease - CWd)
CWd este o boal prionic detectat pentru prima dat n 1967, n
statul Colorado. A fost diagnosticat la cerbii slbatici i la elani n districtele
Wyoming, Nebraska i n provincia Saskatchewan din Canada.
Boala se pare c se transmite prin saliv i fecale. Se estimeaz c
n zonele endemice sunt infectai ntre 4% i 6% dintre cerbi i 1% dintre
elani. Simptomele primare la elani sunt emacierea musculaturii i salivaie
permanent.
n decembrie 2003, departamentul de agricultur din SuA a pus la
punct un program prin care se interzice deplasarea cerbilor captivi i a
elanilor ntre diferite state. Pentru detectarea agentului etiologic se folosesc
dou teste postmortem din SNC.
270
Vacuole microscopice caracteristice pe o seciune dintr-un esut nervos afectat de prioni, cu
aspect spongiform (www.aphis.usda.gov)
Imagine clasic cu vac bolnav de BSE. Se observ difculti locomotorii datorate
afeciunilor nervoase (www.aphis.usda.gov)
271
distribuia BSE. zonele verde nchis reprezint cazuri confrmate la om, iar cele verde
deschis, zone n care au fost raportate cazuri umane.
Infarcte cerebeloase la un pacient cu vCJd. Seciuni adiacente cerebeloase, colorate imun
pentru markerul neuronal al proteinei din neuroflament (A) i PrP (B) (h. Budka 2000).
272
Se remarc vacuole mici rotunde sau ovale grupate difuz sau focal n neuropil. Spectrul
de intensitate crete de la fg. (A) - fr modifcri, (B) - modifcri moderate la (C) -
modifcri pronunate. Coloraia hE. (h. Budka 2000).
vCJd cu plci forale vizibile (plci amiloide fbrilare nconjurate de vacuole spongiforme).
Coloraia hE. h. Budka 2000
273
Bibliografe selectiv
Bovine Spongiform Encephalopaphy: An overview. Animal and Plant health 1.
Inspection Service, united States department of Agriculture. 2006. http://www.aphis.
usda.gov/publications/animal_health/content/printable_version/BSEbrochure12-
2006.pdf.
Bovine Spongiform Encephalopathy - mad Cow disease. fact Sheets. food 2.
Safety and Inspection Service. 2005. http://www.fsis.usda.gov/fact_Sheets/
Bovine_Spongiform_Encephalopathy_mad_Cow_disease/index.asp.
BSE cases - Italy 2001 - 2006. 2006. http://www.izsto.it/ceafoc_bse.htm. 3.
BSE Cases in North America, by Year and Country of death, 1993-2008. Centers 4.
for disease Control and Prevention, department of health and human Services.
2008. http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/bse/images/bse_cases_namerica_2008.gif.
BSE in Belgium. 2006. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Belgium.htm. 5.
BSE in Greece. http://home.hetnet.nl/~mad.cow/landen/Greece.htm. 6.
BSE Positive findings in the Czech Republic. State Veterinary Administration, 7.
ministry of Agriculture, Czech Republic. 2007. http://www.svscr.cz/fles/bse/en_
mappositivefndingsbse.pdf.
BSE: disease control & eradication - Causes of BSE, department for Environment, 8.
food, and Rural Affairs, 2007.
Commonly Asked Questions About BSE in Products Regulated by fdAs Center for 9.
food Safety and Applied Nutrition (CfSAN). Center for food Safety and Applied
Nutrition, food and drug Administration. 2005. http://vm.cfsan.fda.gov/~comm/
bsefaq.html.
Creutzfeldt-Jakob disease fact Sheet. National Institute of Neurological disorders 10.
and Stroke. 2008. http://www.ninds.nih.gov/disorders/cjd/detail_cjd.htm.
Israel: BSE testing according to source of cattle and age groups, 2002-2008. 2008. 11.
http://agri3.huji.ac.il/~yakobson/bse/bse_test.htm.
mad cow disease: Still a concern. mayoClinic.com. CNN. 2006. http://premium. 12.
edition.cnn.com/hEAlTh/library/Id/00012.html.
mad cow watch goes blind. uSA Today. 2006. http://www.usatoday.com/news/ 13.
opinion/editorials/2006-08-03-our-view_x.htm.
overzicht BSE-gevallen. ministerie van landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit. 14.
2008. http://www.minlnv.nl/portal/page?_pageid=116,1640440&_dad=portal&_
schema=PoRTAl&p_document _i d=110016&p_node_i d=1161644&p_
mode=BRoWSE.
Statistics. Trade library. u.S. meat Export federation. http://www.usmef.org/ 15.
Tradelibrary/Statistics.asp.
The BSE Inquiry, lord Phillips of Worth matravers, 2000. 16.
274
The Current Status of BSE and scrapie in denmark. danish Veterinary and food 17.
Administration. 2007. http://www.uk.foedevarestyrelsen.dk
vybp7ro2oirh77lz4kacv72gwfhuv6gmt4g643hvuhg4t2wgmynpbco2zpem2ucte/ 18.
StatusreportonBSEandscrapieindenmarkmay20071.
Variant Creutzfeld-Jakob disease, Current data, 2009. The National Creutzfeldt- 19.
Jakob disease Surveillance unit (NCJdSu), university of Edinburgh. http://www.
cjd.ed.ac.uk/vcjdworld.htm.
Almer, G., hainfellner, J. A., Brcke, T., Jellinger, K., Kleinert, R., Bayer, G., Windl, 20.
o., Kretzschmar, h. A., hill, A., Sidle, K., Collinge, J., and Budka, h. (1999): fatal
familial insomnia: a new Austrian family. Brain 122, 5-16.
Belichenko, P. V., miklossy, J., Belser, B., Budka, h., and Celio, m. R. (1999): 21.
Early destruction of the extracellular matrix around parvalbumin-immunoreactive
interneurons in Creutzfeldt-Jakob disease. Neurobiol dis 6, 269-279.
Bell, J. E., Gentleman, S. m., Ironside, J. W., mcCardle, l., lantos, P. l., doey, 22.
l., lowe, J., fergusson, J., luthert, P., mcQuaid, S., and Allen, I. V. (1997): Prion
protein immunocytochemistry -- uK fve centre consensus report. Neuropathol
Appl Neurobiol 23, 26-35.
Brown, david, 2001. The recipe for disaster that killed 80 and left a 5bn bill. 23.
The daily Telegraph. http://www.telegraph.co.uk/news/uknews/1371964/The-
recipe-for-disaster-that-killed-80-and-left-a-5bn-bill.html. Retrieved.
Budka, h. (1997a): The human prion diseases: from neuropathology to pathobiology 24.
and molecular genetics. final report of an Eu Concerted Action. Neuropathol Appl
Neurobiol 23, 416-422.
Budka, h. (1997b): Transmissible spongiform encephalopathies (prion diseases), 25.
pp. 449-474. In J. h. Garcia (Ed.): Neuropathology. The diagnostic approach,
mosby, St.louis.
Budka, h. (2000a): histopathology and immunohistochemistry of human 26.
transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Arch Virol.
Budka, h. (2000b): Prions and transfusion medicine. Vox Sang 78 (suppl 2), 231- 27.
238.
Budka, h., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J.-m., Bugiani, o., Gullotta, f., haltia, 28.
m., hauw, J.-J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, h. A., lantos, P. l.,
masullo, C., Schlote, W., Tateishi, J., and Weller, R. o. (1995): Neuropathological
diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJd) and other human spongiform
encephalopathies (prion diseases). Brain Pathol 5, 459-466.
Chesebro, B. (1999): minireview: Prion protein and the transmissible spongiform 29.
encephalopathy diseases. Neuron 24, 503-506.
Colchester AC, Colchester NT 2005. The origin of bovine spongiform 30.
encephalopathy: the human prion disease hypothesis. lancet.
Colchester, A; Colchester, N 2006. origin of bovine spongiform encephalopathy 31.
275
Authors reply. The lancet (Elsevier).
Constantin Vasiu, 2003. Viroze i boli prionice la animale. Ed. Nereamia Napocae. 32.
digesta Artis mulomedicinae, Publius flavius Vegetius Renatus Vol.1 - Executive 33.
Summary of the Report of the Inquiry
dorandeu, A., Wingertsmann, l., Chrtien, f., delisle, m.-B., Vital, C., Parchi, P., 34.
montagna, P., lugaresi, E., Ironside, J. W., Budka, h., Gambetti, P., and Gray, f.
(1998): Neuronal apoptosis in fatal familial insomnia. Brain Pathol 8, 531-537.
Giaccone, G., Canciani, B., Puoti, G., Rossi, G., Goffredo, d., Iussich, S., fociani, 35.
P., Tagliavini, f., and Bugiani, o. (2000): Creutzfeldt-Jakob disease: Carnoys
fxative improves the immunohistochemistry of the proteinase K-resistant prion
protein. Brain Pathol 10, 31-37.
Groschup, m. h., Beekes, m., mcBride, P. A., hardt, m., hainfellner, J. A., and 36.
Budka, h. (1999): deposition of disease-associated prion protein involves the
peripheral nervous system in experimental scrapie. Acta neuropathol 98, 453-457.
Guentchev, m., Groschup, m. h., Kordek, R., liberski, P. P., and Budka, h. (1998): 37.
Severe, early and selective loss of a subpopulation of GABAergic inhibitory neurons
in experimental transmissible spongiform encephalopathies. Brain Pathol 8, 615-
623.
Guentchev, m., hainfellner, J.-A., Trabattoni, G. R., and Budka, h. (1997): 38.
distribution of parvalbumin positive neurons in brain correlates with hippocampal
and temporal cortical pathology in Creutzfeldt-Jakob disease. J Neuropathol Exp
Neurol 56, 1119-1124.
Guentchev, m., Voigtlnder, T., haberler, C., Groschup, m. h., and Budka, h. 39.
(2000): Evidence for oxidative stress in experimental prion disease. Neurobiol dis
(in press) 7.
Guentchev, m., Wanschitz, J., Voigtlaender, T., flicker, h., and Budka, h. (1999): 40.
Selective neuronal vulnerability in human prion diseases. fatal familial insomnia
differs from other types of prion diseases. Am J Pathol 155, 1453-1457.
hainfellner, J. A., and Budka, h. (1996): Immunomorphology of human prion 41.
diseases, pp. 75-80. In l. Court, and B. dodet (Eds): Transmissible Spongiform
Encephalopathies: Prion diseases, Elsevier, Paris.
hainfellner, J. A., and Budka, h. (1999): disease associated prion protein may 42.
deposit in the peripheral nervous system in human transmissible spongiform
encephalopathies. Acta Neuropathol 98, 458-460.
hainfellner, J. A., Brantner-Inthaler, S., Cervenakova, l., Brown, P., Kitamoto, T., 43.
Tateishi, J., diringer, h., liberski, P. P., Regele, h., feucht, m., mayr, N., Wessely,
P., Summer, K., Seitelberger, f., and Budka, h. (1995): The original Gerstmann-
Strussler-Scheinker family of Austria: divergent clinicopathological phenotypes
but constant PrP genotype. Brain Pathol 5, 201-211.
hainfellner, J. A., Jellinger, K., diringer, h., Guentchev, m., Kleinert, R., Pilz, P., 44.
276
maier, h., and Budka, h. (1996): Creutzfeldt-Jakob disease in Austria. J Neurol
Neurosurg Psychiat 61, 139-142.
harden, Blaine 2003. Supplements used in factory farming can spread disease. 45.
The Washington Post. http://archives.seattletimes.nwsource.com/cgi-bin/texis.cgi/
web/vortex/display?slug=madcowdairy28&date=20031228.
hegyi, I., hainfellner, J. A., flicker, h., Ironside, J. W., hauw, J. J., Tateishi, 46.
J., haltia, m., Bugiani, o., Aguzzi, A., and Budka, h. (1997): Prion protein
immunocytochemistry: reliable staining protocol, immunomorphology, and
diagnostic pitfalls. Clin Neuropathol 16, 262-263.
hill, A. f., Butterworth, R. J., Joiner, S., Jackson, G., Rossor, m. N., Thomas, d. 47.
J., frosh, A., Tolley, N., J E Bell, Spencer, m., King, A., Al-Sarraj, S., Ironside, J.
W., lantos, P. l., and Collinge, J. (1999): Investigation of variant Creutzfeldt-Jakob
disease and other human prion diseases with tonsil biopsy samples. lancet 353,
183-189.
Kordek, R., hainfellner, J. A., liberski, P. P., and Budka, h. (1999): deposition 48.
of the prion protein (PrP) during the evolution of experimental Creutzfeldt-Jakob
disease. Acta neuropathol 98, 597-602.
Kretzschmar, h. A., Ironside, J. W., deArmond, S. J., and Tateishi, J. (1996): 49.
diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob-disease. Arch Neurol 53, 913-
920.
macKenzie, debora 2007. New twist in tale of BSEs beginnings. New Scientist 50.
http://www.newscientist.com/article/mg19325954.400-new-twist-in-tale-of-bses-
beginnings.html.
mago, Chandrika; Sinha, Kounteya 2005. India dismisses lancets mad cow. The 51.
Times of India. http://timesofndia.indiatimes.com/articleshow/1218869.cms.
Parchi, P., Giese, A., Capellari, S., Brown, P., Schulz-Schaeffer, W., Windl, o., zerr, I., 52.
Budka, h., Kopp, N., Piccardo, P., Poser, S., Rojiani, A., Streichemberger, N., Julien,
J., Vital, C., Ghetti, B., Gambetti, P., and Kretzschmar, h. (1999): Classifcation of
sporadic Creutzfeldt-Jakob disease based on molecular and phenotypic analysis of
300 subjects. Ann Neurol 46, 224-233.
Pathogens and Contaminants. food Safety Research Information offce. Nov. 2007. 53.
http://fsrio.nal.usda.gov/document_fsheet.php?product_id=169.
Peck, Clint 2004. Reader Questions Poultry litter And downer Bans. organic 54.
Consumers Association. http://www.organicconsumers.org/madcow/cow110504.
cfm.
Phillips, Kyra; meserve, Jeanne 2001. fdA Not doing Enough to Prevent mad 55.
Cow disease?. organic Consumers Association. http://www.organicconsumers.
org/madcow/cnn22602.cfm.
Rampton, Sheldon; Stauber, John 2004. mad Cow uSA (1st ed.). monroe, maine: 56.
Common Courage Press. ISBN 978-1-56751-110-9.
277
Richt JA, hall Sm 2008. BSE case associated with prion protein gene mutation. 57.
PloS Pathogens.
Schulz-Schaeffer, W. J., Tschoke, S., Kranefuss, N., drose, W., hause-Reitner, d., 58.
Giese, A., Groschup, m. h., and Kretzschmar, h. A. (2000): The paraffn-embedded
tissue blot detects PrP(Sc) early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol
156, 51-56.
Seltzer, molly 2008. meat Recalls to Name Retailers. Bloomberg News. 59.
The Washington Post. http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/
article/2008/07/11/AR2008071102818.html.
Thompson, Geoff 2005. New theory traces mad cow disease to animal feed 60.
exported from India. The World Today (ABC). http://www.abc.net.au/worldtoday/
content/2005/s1453543.htm.
Valleron AJ, Boelle PY, Will R, Cesbron JY 2001. Estimation of epidemic size 61.
and incubation time based on age characteristics of vCJd in the united Kingdom.
Science (New York, N.Y.) .
Van Everbroeck, B., Palsa, P., martina, J.-J., and Cras, P. (1999): Antigen retrieval 62.
in prion protein immunohistochemistry. J histochem Cytochem 47, 1465-1470.
Wanschitz, J., Klppel, S., Jarius, C., Birner, P., flicker, h., hainfellner, J. A., 63.
Gambetti, P., Guentchev, m., and Budka, h. (2000): Alteration of the serotonergic
nervous system in fatal familial insomnia. Ann Neurol (in press).
Weiss, Rick 2007. Scientists Announce mad Cow Breakthrough. The Washington 64.
Post. http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2006/12/31/
AR2006123100672.html.
Who (1998): Global surveillance, diagnosis and therapy of human transmissible 65.
spongiform encephalopathies: report of a Who consultation. Geneva, Switzerland,
9-11 february 1998, pp. Who/EmC/zdI/98.9, Who, Geneva.
278