Efectuarea preparatelor microscopice

Tehnica efectuarii frotiului

1 ) Etalarea

din cultura bacterian n mediu lichid

se prelev cu ansa o pictur i se
etaleaz n centrul lamei, n strat ct
mai

subire,

prin

micri

circulare

excentrice pe suprafat de 1-2 cm2 fr

a atinge marginile lamei;

din cultur pe mediu solid se prelev

o cantitate numai prin atingerea unei
colonii ( doar varful coloniei ! ) cu
ansa i se depune n centru lamei lnga
o pictur de ap distilat steril. Se
1

omogenizeaz

progresiv

cultura

pictura de ap i se etaleaz;

prelevatele patologice fluide se

etaleaz procednd ca pentru cultura n
mediu lichid.

pentru produsele patologice

fibrinoase se evit micrile de du-te
vino ale ansei pe aceeai suprafa. Se
depune n centrul lamei un mic flocon
fibrino- purulent care se ntinde n strat
ct mai subire prin micri radiare i
excentrice;

2) Uscarea
frotiurile se usuc la temp.camerei
3) Fixarea
fixarea se face prin cldur: se trece
lama cu frotiul n sus, cteva secunde
2

prin flacra unui bec de gaz. Dosul

minii trebuie s suporte atingerea
lamei astfel nclzite. O nclzire mai
puternic poate carboniza frotiul.

1. Place one needle of solid bacterial growth or two loops

of liquid bacterial growth in the center of a clean slide.

2. If working from a solid medium, add one drop (and only one
drop)
of water to your specimen with a water bottle. If using a broth
medium, do not add the water.

3. Now, with your inoculating loop, mix the specimen with the water
completely and spread the mixture out to cover about half of the

total slide area

4. Place the slide on a slide warmer and wait for it to dry. The
smear is now ready for the staining procedure.

Colorarea frotiurilor
1) Coloratia Gram
se pune lama cu frotiul n sus pe stativul
de colorare;

STAINING

se coloreaz frotiul 30 sec 1 min cu

soluie de violet de gentiana ( colorare)

se vars colorantul, se spala lama cu

apa de robinet

se acoper lama cu soluie Lugol

( fixare) proaspt i se menine 30 sec1 min;
6

se scurge soluia Lugol i se acoper

lama cu soluia de decolorare (alcoolaceton) imprimndu- i micri
alternative de nclinare pn cnd
preparatul nu mai elibereaz colorant:
cca 5- 10 sec pentru frotiurile subiri, cca
10 sec pentru cele mai groase. Se
stopeaz decolorarea prin splare
ngrijit cu ap.

se recoloreaz cu soluie de fucsin

bazic timp de 30 sec. Pentru hemofili
se prelungete la 1- 2 min.

2 ) Coloratia cu Albastru de metilen

Se acopera frotiul cu albastru de metilen,
timp de 1 min, se spala.
Frotiurile colorate se pun in pozitie verticala,
in stativ si se lasa la uscat, apoi se
examineaza

la

microscop,

initial

cu

obiectivul de 40, apoi cu imersie .

Examinarea cu imersie se pun 1-2 picaturi

de ulei de cedru si se examineaza la
microscop.
Datorita

structurii

peretelui

abcterian,

bacteriile Gram poztive se coloreaza in

violet,

iar

cele

Gram

negative

pierd

colorantul si se recoloreaza cu fuxina, in

rosu
Ce se vede la microscop ?

Forma bacteriilor

1) forma sferic (coci)

- Diametre egale: stafilococ, streptococ
- Reniformi: neiserii
- Lanceolai: pneumococi
- Ovalari: enterococi
dispoziie
- Ciorchine: stafilococi
- Diplococi: neiserii, pneumococi
- Tetrade: Micrococcus tetragenus
- Cte opt: Sarcina
9

- Izolai
- Lanuri: streptococci
2) forma cilindric (bacili)
- drepi cu capete drepte: Bacillus
- drepi cu capete rotunjite: entrobacterii
- drepi cu capete ascuite
- ncurbai: bacil difteric
- deformai de spor: clostridia
dispoziie
- neregulat: entrobacterii
- diplobacili
- n lanuri (streptobacili): Bacillus
- sub aspect de litere, bee de chibrituri:
bacili difterici
forma spiralat (ncurbat)
- vibrioni
- spirili spire rigide
- spirochete spire flexibile
Dimensiunile bacteriilor
Coci: 0,5 2 m
Bacili: lungime 0,5 10 m / lime 0,3 2
m
10

Vibrioni: lungime 1,5 3 m / grosime 0,5

m
Spirochete: lungime 6 20 m / grosime
0,15 0,5 m

11

12

In

cazul

frotiului

din

cultura-

cocobacili, coci, bacili Gram pozitivi

(colorati in violet), Gram negativi
(colorati in rosu), albastru (coloratia
cu albastru de metilen)

In cazul frotiului din produs patologicbacterii ( coci, bacili, cocobacili),

Gram

pozitivi,

Gram

negativi-

coloratia Gram si albastru coloratia

albastru

de

metilen;

celule

inflamatorii care predomina fata de

celulele epiteliale, raportul bacterii

13

/celule

inflamatorii

(intra,

perileucocitar, extraleucocitar)
Importanta

examenului

microscopic

direct (frotiu din produs patologic)

Criteriu de respingere a probei ( proba
incorect recoltata)
Corelatie frotiu-colonii dezvoltate pe
mediile de cultura

Evolutia sub tratament a infectiei

Microscopia optic pe cmp luminos

se

aeaz

pe

masa

port

obiect

preparatul microscopic i se fixeaz

ntre suporii reglabili;
se rotete capul revolverului pentru a
aduce n axul optic obiectivul selectat. 14

privind

lateral,

micrii

manipuleaz

grosiere

pn

cnd

butonul
lentila

obiectivului ajunge ct mai aproape de

preparat;
se privete prin oculare i se ajusteaz
pentru

propria

distan

interpupilar

pn cnd se obine viziunea binocular

perfect a cmpului microscopic;
se

focalizeaz

preparatul

acionnd

tubul microscopului numai de jos n sus

prin butonul micrii grosiere, apoi dac
se lucreaz cu un obiectiv puternic, prin
butonul micrii fine;
se selecteaz o suprafat din preparat
cu

elemente

bine

etalate.

Pentru

aceasta se acioneaz cu butoanele

15

care controleaz micrile transversal

i longitudinal ale mesei port obiect;
se acioneaz butonul de focalizare a
condensorului pn se obine imaginea
diafragmei de cmp cu cel mai clar
contur. La examinri cu obiectivele 10x
se

reduce

apertura

numeric

condensorului prin deurubarea monturii

cu lentila superioar
se regleaz deschiderea diafragmei de
apertur. Pentru aceasta se scoate
ocularul,

se

privete

prin

tubul

microscopului i se acioneaz prghia

diafragmei

de

apertur

pn

ce

imaginea ei ocup - 1/3 din diametrul

pupilei

de

ieire

obiectivului.

Deschiderea spre maxim a diafragmei

16

de apertur crete puterea de separare,

dar scade contrastul imaginii; invers,
micorarea

ei

scade

puterea

de

separare, dar crete contrastul imaginii;

Odat stabilite aceste reglaje, este
contraindicat reglarea fluxului luminos prin
modificarea

diafragmei

de

cmp

sau

poziiei condensorului. Acum fluxul luminos

mai poate fi crescut prin rabatarea filtrului
mat, sau sczut prin filtrului fumuriu NG 5/2
n lcaul filtrelor. Filtrul verde VG 6/2 ofer
un contrast mai bun imaginii i crete
puterea

separatoare,

dar

altereaz

interpretarea culorilor preparatului;

n final se focalizeaz imaginea prin
ajustarea

dioptriilor:

se

obtureaz

ocularul
17

stng, se privete cu ochiul drept prin

ocularul drept i se focalizeaz imaginea
prin butonul micrii fine. Se obtureaz
ocularul drept, se privete apoi cu ochiul
stng i se focalizeaz imaginea numai prin
rotirea inelului de ajustare a dioptriilor fr a
atinge butoanele micrii grosiere sau fine
a tubului.
ntreinerea microscopului

18

 microscopul se ine la adpost de praf:

sub hus sau n cutie;
ocularele i obiectivele nefolosite se in
n cutia lor;
dup fiecare examinare se cur uleiul
de cedru de pe lentila obiectivului IU cu
o hrtie moale, care nu las scame;
nu se ating cu mna suprafeele optice;

nu se apropie exagerat ochii de oculare;

19

stapylococcus spp.

S.aureus

20

streptococcus spp.

21

Group A, Streptococcus pyogenes

Sputum smear
Staphylococcus & Streptococcus
pneumoniae

22

Neisseria gonorrhoeae

23

streptococcus pneumoniae

Bacillus
24

Salmonella typhi, the agent of typhoid.

Gram stain. (CDC)

25

vibrio cholerae

26

Stained pus from a mixed anaerobic

infection.

At

least

three

different

clostridia are apparent.

27

Clostridium perfringens, Gram Stain. Most

clostridia are renowned for staining "Gramvariable".

corynebacterium diphtheriae

28

Haemophilus influenzae

Pseudomonas aeruginosa

29

Escherichia coli/PMN

Peritoneal fluid Mixed

anaerobic infection

30

Urethral smear,
Neisseria gonorrhoeae

31

Modul de desfasurare a lucrarii practice

-

studentii primesc manuscrisul cu

Efectuarea preparatelor
microscopice, Examinarea la
micoscop

- Lp se desfasoara interactiv
- Fiecare student efectueaza un frotiu
din cultura
- Fiecare student coloreaza frotiul
efectut
- Fiecare student prinde imaginea la
microscop si examineaza frotiul
colorat
- Fiecare student examineaza frotiuri
din produse patologice

32

Bibliografie

Bacteriologie

Medicala,

Olga

Dorobat, editura UTM, 2006

Clinical Microbiology Procedures

Handbook, Henry D. Isenberg,
editata

American

Society

for

Atlas

and

Microbiology, 2004

Koneman's
Textbook

Color
of

Diagnostic

Microbiology , Washington C
Winn, Stephen D. Allen, Gail L.
Woods, William M. Janda, Paul
C. Schreckenberger , editura
Lippincott Williams & Wilkins,
2005
Manual of Clinical Microbiology , Patrick R.
Murray ,
Ellen Jo Baron ,
33

Michael A. Pfaller , Fred C. Tenover ,

Robert H. Yolken, editura ASM, 2007

34