Introducere

Conceptul de bibliotec colecie de clone

ADN dintr-o celul, esut sau organism
3 categorii de biblioteci
1.genomice alctuite din ADN-ul genomic
total al unui organism
2.ADNc colecia de clone obinute pe
baza ADN complementar
3. Cromozomiale specifice fiecrui
cromozom n parte

1.Biblioteci genomice
O bibliotec genomic conine toate
secvenele prezente n genomul unui
organism.
Procedura cuprinde 5 etape:
pregtirea ADN-ului
fragmentarea ADN-ului
pregtirea vectorului
ligaturarea i introducerea n gazd
amplificarea

 bibliotec genomic - util pentru a gsi o

gen de interes prin screening cu sonde
specifice.

Bibliotecile genomice se obin prin 2 tehnici:

1. ADN genomic este digerat complet cu o
enzim de restricie, iar fragmentele
rezultate sunt clonate fie printr-un vector
derivat din bacteriofagul , fie ntr-un
vector cosmidic.

 Cosmidele - vectori hibrizi ce conin ADN

plasmidial i situsul cos din genomul fagului .

Prezentnd secvena din plasmidul EcoRI i gena

de rezistenla ampicilin (Ampr), cosmidele se
pot replica i mentine n celula bacterian n
forma plasmidial i permit selecia
transformanilor pe mediu cu ampicilin

2. O alt cale este digestia parial cu ER, care

recunosc secvene de 4 pb. Prin digestie parial
doar o parte din SR este tiat de ER.

2.Biblioteci de ADNc
Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar
se numete bibliotec ADNc.
Din bibliotecile de ADNc se produc copii ADN din secvene
ARN (ARNm) care apoi se cloneaz

Extrem de utile: nu reprezint doar colectarea de secvene

exprimate, ci i pe acele secvene de dup orice modificare

post-transcripional

Secvenierea parial a unei colecii mari de ADNc ,

depunerea ntr-o baz de date - etape de caracterizare a

genomului unui organism

Fiind sintetizat pe matria moleculelor de ARNm,

ADNc va corespunde numai genelor aflate n
stare de activitate transcripional, reproducnd
doar genele funcionale specifice celulei
respective.
ADNc este clonat n vectori plasmidici sau n
vectori derivai din bacteriofagul .
Spre deosebire de fragmentele obinute prin
digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed
capete adezive, de aceea pentru introducerea
n vector, la moleculele de ADNc se adaug
adaptori care conin capete adezive.

Alegerea vectorului
Niciunul din vectorii derivai din fagul nu este
adecvat pentru toate experimentele de clonare
molecular
Este necesar alegerea vectorului cel mai
adecvat scopului urmrit

Trebuie luai n considerare 3 factori:

enzima (enzimele) de restricie folosite
dimensiunea fragmentului de ADN ce va fi clonat
dac vectorul va fi folosit i pentru exprimarea
ADN n E.coli

3.Biblioteci cromozomiale
Dimensiunea genomului uman este att de
mare, nct sunt necesare mii de clone
pentru a reprezenta ntregul genom.
pentru om sunt necesare 24 de biblioteci
diferite
dac o gen este localizat pe un
cromozom cunoscut cu metode genetice,
cercetarea va fi limitat la biblioteca acelui
cromozom.

izolarea cromozomilor este posibil

datorit dimensiunii i morfologiei diferite
ale cromozomilor, care pot fi separai cu
ajutorul citometriei n flux.
n prezent sunt disponibile biblioteci
preparate din toi cromozomii umani.

Sortarea cromozomilor
gena de interes poate fi cartografiat la un
cromozom particular
separarea cromozomilor PFGE(pulsed field
gel electrophoresis), dar pentru clonare se
utilizeaz aparatul cu fluorescena
cromozomii trebuie s fie n metafaza
sunt izolai, apoi colorai cu EtBr i condui
printr-un cmp electric la un fascicul laser care
duce apoi la fluorescen

 cantitatea de fluorescen se msoar

cu un detector iar filtrul utilizat identific
cromozomii particulari
aplicarea unui cmp electric ntre plcile
de deflecie prin care cromozomii vor
trece, permite devierea i colectarea lor
dup colectarea unei cantiti suficiente,
pot fi deproteinizai i utilizai pentru
prepararea bibliotecilor cromozomiale

Microdisecia
- dac o gen a fost cartografiat la un
cromozom particular, se utilizeaz
microdisectia pentru a obine materialul
corespunztor
- cromozomii colorai sunt examinai la
microscop si sunt mutai cu ajutorul unui
micromanipulator
- materialul este apoi colectat n pipete i
utlizat pentru clonri ulterioare