Sunteți pe pagina 1din 18

Curs xv.

Genus Staphylococcus

1. Minidefinitie
II. Incadrare taxonomica
III. Habitat
IV. Implicare in patologia umana
V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si
diagnosticul microbiologie
VI. Factori de patogenitate
VII. Patogenie
VIII. Raspunsul imun
IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale
X. Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: coci gram pozitivi, dispoziţie În ciorchine, halofili, catalază


pozitivi, fermentează glucoza fără producere de gaz;
S. aureus: coagulază pozitiv, proteină A pozitiv, DNA-ză termostabilă pozitiv,
leziuni purulente, toxinoze, toxiinfecţii;
Stafilococi coagulază negativi (SCN): kit-uri (galerii multitest), infecţii de corp
străin, infecţii urinare
Infecţii nosocomiale, rezistenţa la meticilină (oxacilină)

1. Minidefinitie

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi condiţionat patogeni, cu dispoziţie


caracteristică "în ciorchine", care pot fi implicaţi în infecţii invazive purulente şi/sau de
tip toxinoze/toxiinfecţii, uşoare sau de gravitate medie până la severă, ameninţătoare de
viaţă

II. Încadrare taxonomică şi clasificare

Manual Bergey 2004:


Domeniu: Bacteria
Phylum: B XIII, Firmicutes
Clasa: III, Bacilli
Ordin: Bacillales
Familie: VIII Staphylococacceae
Genul Staphylococcus - este compus până în prezent din 40 de specii, dintre care 20 au
putut fi izolate de la om.

Stafilococii sunt apropiaţi filogenetic de streptococi, enterococi, lactobacili ŞI Genul


Bacillus.
III. Habitat

Stafilococii fac parte dintre bacteriile ubiquitare (prezente peste tot În mediul
Înconjurător).
Colonizează vestibulul nazal şi mucoasele organelor cavitare cu comunicare la
exterior (colon, vagin) şi contaminează frecvent tegumentul, preferând zonele cu
umiditate ridicată (axile, perineu, plici interdigitale etc.)

IV. Implicare în patologia umană:

Staphylococcus aureus poate fi implicat în infecţii invazive cu caracter purulent,


În toxinoze (afecţiuni cauzate de toxine bacteriene) şi toxiinfecţii (afecţiuni mixte de tip
invaziv şi toxic).
Infecţii invazive:
• Infecţii superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor (inclusiv
anexele pielii - foliculită, furuncul, carbuncul, panariţiu,
hidrosadenită etc.)
Abcese profunde
• Osteomielite
• Infecţii ale organelor interne
Infecţii generalizate, sistemice etc.
Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:
• Toxinoze şi/sau toxiinfecţii alimentare
• Necroliza toxică epidermică
• Sindromul de şoc toxic
• Enterocolita postantibiotice

Stafilococii coagulază negativi (SCN) fac parte din microflora tegumentară


normală, exercitând în condiţii normale un rol protector (vezi curs VII).
Nu dispun de factori de patogenitate suficienţi pentru a putea depaşi bariera
cutanată intactă, dar pot pătrunde în organism ca urmare a unor intervenţii invazive
constând în introducerea de catetere, implante, proteze vasculare etc. De obicei,
colonizează mai întâi cateterele sau dispozitivele protetice, de unde ulterior pot disemina
şi cauza infecţii generalizate şi/sau determinări infecţioase la nivelul endocardului,
seroaselor etc. Speciile de stafilococi coagulază-negativi cel mai frecvent implicate În
astfel de infecţii sunt: S. epidermidis, S. capitis, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S.
warneri etc.
O categorie aparte de infecţii cauzate de stafilococii coagulază-negativi sunt
infecţiile urinare cu S. saprophyticus

2
-----------------------------------------------------------------------------------------~--------------~

Fig. 1 - Principalele localizări ale manifestărilor infecţioase şi/sau toxice


determinate de stafilococi

,_+ ~sinusltis
bons, carbun.:::Ies---"""\.

fur uneI es ------,~, ,.,--

""iI_---+---hlcmatogilnolis spread

endocar d! ti s

emilsjs-----+----+1r---=-~" ""'* 1mpetlgo

~H--+--- diarr hea

toxicshock syndrome

s catded ski FI syndrom

ost eomyet itls --------'-~


_---t----uticystitl s

Aspecte clinice particulare în infecţiile, toxinozele şi/sau toxiinfecţiile cauzate de


stafilococi şi toxinele stafilococice

Afecţiuni cauzate de Staphylococcus aureus

Infecţii purulente localizate sau generalizate:


• .Impetigo: infecţie superficială la nivelul feţei şi membrelor, care afectează mai
ales copilul mic. Se manifestă prin apariţia de macule, vezicule, pustule, cruste pe
fond eritematos. În 20% din cazuri este posibilă asocierea S.aureus cu
streptococul de grup A.
• Foliculită: infecţie piogenă la nivelul foliculului pilos
• Orgelet - infecţie piogenă afectând un folicul pilos la nivelul pleoapelor
(denumire populară ulcior sau urcior)
• Furuncul: extinderea infecţiei foliculului pilos la glandele sebacee, colecţie
apreciabilă de puroi, Însoţită de ţesuturi necrozate, durere
Carbuncul (Fig. 2): rezultat al extinderii infecţiei la mai multe glande
pilosebacee şi la nivelul ţesuturilor subcutanate profunde, cu necroză la
nivelul tegumentelor şi ţesurilor subiacente. Denumirea de "carbuncul" sau
"furuncul antracoid" provine de la culoarea neagră a ţesuturilor necrozate, care se
aseamană cu cea a leziunilor produse de Bacillus anthracis la nivel cutanat,
antraxul cutanat, cunoscut sub denumirea populară de "cărbune", .xlalac" sau
"bubă neagră". În cazul S. aureus, necroăa cutanată se datorează producerii de
leucocidină Panton Valentine sau "toxina dermonecrotică". Pacienţii cu infecţii

3
cauzate de tulpini producătoare de toxină dermonecrotică prezintă risc de infecţii
pulmonare necrotizante, mai ales în cazul în care dezvoltă în paralel infecţii virale
respiratorii (mai ales cu virus gripal).

Fig. 2 - Carbuncul

• Hidrosadenita: infecţie a glandelor sudoripare cu localizare la nivel axilar,


perineal, sau În zonele genitale
Celulita: infecţie a hipodermului, cu tendiţă la extindere prin contiguitate
(din aproape În aproape, ca o pată de ulei), care apare în special la pacienţi cu
deficienţe imunitare sau la care se asociază un factor traumatic local.
Celulita care evoluează la nivelul feţei (Fig. 3), mai ales cu localizare deasupra
buzei superioare, constituie o urgenţă medicală, ca urmare a faptului ca se poate
extinde la nivelul sinusurilor cavemoase. Se evită orice traumatism local şi se
instituie rapid tratamentul cu antibiotice de elecţie (oxacilina, cu efectuarea recoltării
şi antibiogramei înainte de începerea tratamentului, pentru a depista eventualele
tulpini rezistente la meticilină şi a schimba antibioticul În caz de rezistenţă la
meticilină).

Fig. 3 - Celulita cu localizare la nivelul feţei

• Mastita: infecţie a glandei mamare; apare la 1-3% din femeile care alăptează şi
se manifestă ca un nodul eritematos, cu formarea unui abces canalicular

4
Infecţii ale plăgilor: pot apare post traumatic sau post chirurgical; se manifestă
prin edem şi eritem local, durere şi acumulare de puroi
• Bacteriemia şi endocardita: sunt dobândite în proporţie de cel puţin 50% în
mediul spitalicesc, după proceduri chirurgicale, utilizare de catetere intravenoase
care devin contaminate etc.; se asociază frecvent cu diseminare septică secundară,
de obicei la nivelul endocardului şi apariţia endocarditelor acute, infecţii severe,
cu o mortalitate de aproximativ 50%.
• Pneumonia şi empiemul pulmonar sunt întâlnite mai ales la vârstele extreme
• Osteomielita şi artrita septică: rezultat al diseminării septice secundare unor
infecţii stafilococice cu alte localizări, sau postraumatic; localizarea este diferită
la copii, unde afectează mai ales metafizele oaselor lungi şi la adulţi, unde
localizarea este mai frecventă la nivel vertebral
• Artrite septice după infiltraţii intra -articulare

Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:

• Toxinozele şi/sau toxiinfecţiile alimentare cu S. aureus apar după consumul de


alimente contaminate cu stafilococi producători de enterotoxine stafilococice
(carne de porc În saramură, şuncă, salate de cartofi, Îngheţate) sau/şi numai după
ingerarea unui aliment prelucrat termic, în care au rămas numai enterotoxinele
stafilococice, care sunt termorezistente; acest tip de toxinoze/toxiinfecţii apar mai
frecvent în sezonul cald (iulie-august), ca rezultat al contaminării produsului
alimentar de către purtători şi/sau indivizi cu infecţii purulente. Alimentul
contaminat nu are aspectul sau gustul alterat. Incubaţia este de 1-8 ore, debutul
este brusc, evoluţia rapidă, 12-24 de ore, caracterizată prin: diaree apoasă, greţuri,
vărsături, dureri abdominale, cefalee. Este un toxinoză/toxiinfecţie spontan
autolimitată, care dispare odată cu eliminarea toxinei. Cazurile sunt de obicei
uşoare sau cel mult de gravitate mediu, dar pot apărea şi cazuri grave, la pacienţi
aflaţi la vârste extreme (sugari, persoane de vârsta a treia), care prezintă
instabilitate hemodinamică şi hidroelectrolitică
• Dermatita exfoliativă (sindromul pielii opărite stafilococice, maladia Ritter sau
impetigo bulos stafilococic) - este o toxiinfecţie care apare de obicei la nou-
născut şi se manifestă cu eritem perioral, care în decurs de 2 zile cuprinde întreg
corpul. Se formează vezicule cu lichid clar, fără microorganisme şi leucocite, ca
urmare a clivajului straturi lor intraepidermice. Are loc descuamarea epiteliului,
iar refacere epiteliului are loc în 7-10 zile, când apar anticorpii protectori
• Sindromul de şoc toxic stafilococic a fost descris ca urmare a unor evenimente
care au avut loc în 1978 şi a fost atribuit eliberării unei toxine care a primit
denumirea de Toxina Sindromului de Şoc Toxic - 1 (TSST-l). Se manifestă prin
febră, hipotensiune, eritem scarlatiniform. Evoluţia poate fi fatală sau se termină
cu descuamarea epitelului şi vindecare. TSST-l stimulează macrofagele, care vor
elibera cantităţi mari de mediatori chimiei, cauză a sindromului şocului toxic.
Este superantigen, adica determină activarea limfocitară policlonală (nu
monoc1onaIă, aăa cum fac antigenel obişnuite)
Episodul din 1978 a apărut la femei tinere, care au utilizat tampoane
intravaginale. Toxina se absoarbe şi stimulează macrofagele care secretă

5
interleukină-I, prostaglandine şi TNF-a (vezi cursuri imunologie). Aceste citokine
sunt reponsabile de manifestările clinice.
• În cazul infecţiilor nosocomiale (apărute în unităţi de îngrijire), dar mai recent şi
în cazul infecţiilor care evoluează În afara unităţilor de Îngrijire (infecţii
comunitare), sunt de temut infecţiile cu S.aureus rezistent la meticilină
(SAMRJengl. MRSA). Transmiterea se face mai ales prin contact direct, prin
intermediul purtătorilor sănătoşi de germeni (portaj nazal, prin mâini contaminate,
etc). Localizările pot fi: cutanată, respiratorie, renală, digestivă, osoasă, articulară,
generalizată etc.

Stafilococii coagulaza-negativi (SCN)

Endocardita - se poate instala pe valvele cardiace lezate prin malformaţii


cardiace, reumatism articular acut etc., dar mai ales pe valve artificiale.
Stafilococul coagulază negativ este introdus în organism în timpul tehnicilor de
chirurgie cardiovasculară. Debutul este lent, la aproximativ 1 an de la
intervenţia chirurgicală, la nivelul suturii valvei de ţesutul cardiac; se
însoţeşte de formarea de abcese cardiace şi separarea valvelor la nivelul liniilor de
sutură, cu tulburări de dinamică cardiacă. Prognosticul este rezervat.
Infecţii ale materialelor de implant: în funcţie de unitatea de îngrijire, o cincime
până la peste 50% din infecţiile secundare implanturilor de dispozitive, catetere,
şunturi, tuburi de dren sunt cauzate de SCN, mai frecvent S. schleiferi şi
S.lugdunensis). Capsula polizaharidică a SCN asigură ataşarea la nivelul
dispozitivelor protetice, protejându-i astfel de acţiunea antibioticelor şi a celulelor
fagocitare
Infecţii ale tractului urinar sunt mai frecvent diagnosticate la femeile de vârstă
fertilă. Infecţia urinară cu S. saprophyticus se poate instala ca urmare a colonizării
pe cale ascendentă, de la nivelul intestinului sau al tractului genital, putând
recunoaşte deci şi un mecanism de transmitere pe cale sexuală.
Alte infecţii: abcese cerebrale, meningite, infecţii vasculare, peritonite, septicemii
etc. Majoritatea au caracter nosocomial şi pot fi produse de speciile de SCN mai
sus menţionate.

v. Microbiologie - principalele caractere cu implicaţii În patogeneza şi


diagnosticul microbiologic

Stafilococii se definesc prin caracterelele lor morfotinctoriale, de cultivabil itate,


metabolice şi enzimatice, rezistenţa la agenţii fizici, chimiei şi biologici.

Caractere morfotinctoriale:
Forma: coci rotunzi, dimensiuni: 0,5 - I urn
• Tinctorialitate: gram pozitivi
• Dispozitie: caracteristica, grupaţi în grămezi de forma ciorchinelui de strugure
(staphile, gr. = strugure); în prelevate pot exista extra, dar şi intracelular

6
Sunt nesporulaţi, pot prezenta capsulă, mai ales În cazul tulpinilor foarte virulente,
recent izolate din Iezi uni purulente şi/sau infecţii sistemice

Caractere de cultivabilitate: sunt nepretentioşi nutritiv, cresc pe medii nutritive


simple.
Adaosul de sânge În mediile nutritive simple se realizează mai mult În scop
diferenţial, pentru a facilita diagnosticul de specie, ştiut fiind că tulpinile de S. aureus
sunt mai frecvent producătoare de hemolizine.
Pot supravieţui şi se pot multiplica În medii cu concentraţii ridicate de NaCI,
proprietate denumită halotoleranţă. Această proprietate este utilizată pentru prepararea
mediilor selective cu ajutorul cărora se realizează separarea stafilococilor din amestecuri
cu alte bacterii nehalotolerante (ex. majoritatea bacteriilor enterice din materiile fecale,
alte prelevate contaminate etc.)

Tip metabolic: stafilococii au un metabolism HETEROTROF, putând creşte numai În


prezenţa substanţelor organice), facultativ anaerob. Fermentează glucoza fără producere
de gaz. S. aureus fermentează manita şi în anaerobioză, spre deosebire de SCN, dintre
care unele specii nu utilizează manita, ira altele o utilizează doar în aerobioză.
Sunt catalază pozitivi, oxidază negativi

Rezistenta la agenti fizici, chimiei si biologiei

Stafilococii sunt relativ rezistenţi la agenţi fizici, cum sunt frigul, uscăciunea,
variaţii de pH.
Sunt sensibili la dezinfectante din grupa derivaţilor halogenaţi (ex. povidon-
iodine, cloramină) şi la derivaţi de amoniu cuaternar.
Natural sensibili la majoritatea antibioticelor, cu excepţia polimixinelor (colistin)
quinolonelor de generaţia Întâi (acid nalidixic), la care prezintă rezistenţă naturală. În
ultimele decenii, mai ales În spitale s-au selectat clone rezistente la meticilină, atât de S.
aureus, cît şi de SCN. În România, tulpini le de S. aureus rezistente la Meticilină sunt
frecvent rezistente şi la alte antibiotice (polirezistenţă la antibiotice).
Unele tulpini sunt sensibile la bacteriofagi, ceea ce permite tipizarea
bacteriofagică (lizotipia), de mai mică valoare În cazul tulpinilor rezistente, care sunt
frecvent netipabile prin lizotipie sau sunt sensibile la majoritatea bacteriofagilor din setul
internaţional, ceea ce nu permite Încadrarea lor În grupe fagice distincte, pentru
d iferenţi ere. .

VI. Factori de patogenitate (Fig. 4)

• S. aureus:
Factori structurali (endocelulari):
(1) proteine şi/sau mucopolizaharide de suprafaţă - promovează
colonizarea tesuturilor gazdei (ex. acidul teichoic, care se ataşează la
fibronectină; coagulaza legată care se ataşează la fibrinogen etc.) şi/sau
inhibă fagocitoza şi accesul antibioticelor (capsula)

7
(2) pigmenţi carotenoizi localizaţi la nivelul peretelui cellular-
supravieţuirea în fagocite - S aureus, pigment galben cu moleculă
polinesaturată - reduce radicalii toxici de oxigen

Factori solubili (exocelulari):

(3) producere de catalază - supravieţuire în fagocite prin reducerea


radicalilor toxici de oxigen (ex. apa oxigenată);
(4) producere de coagulază - se îmbracă într-un strat de fibrină care îl
apără la nivel circulator de atacul fagocitelor şi antibioticelor; când ajunge
în ţesuturi, fibrinolizina descompune fibrina şi eliberează stafilococul,
pentru a-şi putea relua multiplicarea
(5) invazine - promovează pătrunderea bacteriilor în ţesuturi: leucocidina
(citolitică), hialuronidaze (promovează invazia bacteriană prin
hidroliza matricei conjunctive tisulare); lipase - tropism spre glanda
sebacee şi pentru ţesuturile grăsoase etc.
(6) toxine cu activitate citolitică (Ieziuni ale membranei celulare eucariote)
- hemolizine ( a - hemoliză clară, J3- hemoliză incompletă de tip cald-
rece, 0, y ), leucotoxine, leucocidine - inclusiv leucocidina Panton
Valentine;
(7) exotoxine care lezeaza tesuturile gazdei sau provoaca simptome de
boala (enterotoxine stafilococice A-G, TSST-l, epidermolizina sau toxina
epidermolitică etc.)
(8) Se consideră, de asemenea că rezistenţa la antibiotioce intrinsecă sau
dobandită constituie un factor de patogenitate suplimentar.

Fig. 4 - Factori de patogenitate la S. aureus

y;.. IgG

ml cro- P,""'~~,
capsute , . ')., .

cellwal~'

InVi!lsi ns:
hya! ur ont das e
staphylysl n
,1eukocl di n
,leukoto:1d n
<coagul ase
staphyl old nase

8
VII. Patogenie

Manifestarea infecţiilor stafilococice invazive şi/sau a toxinozelor/toxiinfecţiilor


( stafilococice presupune derularea mai multor etape:
a. Colonizarea tegumentelor şi mucoaselor, prin acţiunea proteinelor şi
polizaharidelor cu rol de adezine. Bacteriile care posedă capsulă şi/sau alte
structuri mucopolizaharidice de suprafaţă pot contribui la realizarea biofilmelor,
structuri matriceale în interiorul cărora bacteriile se pot integra, evitând şi în acest
fel acţiunea factorilor imunitari celulari şi/sau umorali, precum şi a antibioticelor
b. Invazia şi procesul infecţios - proces în care intervin invazinele (hialuronidaza,
leucocidine, leucotoxine, coagulaza, stafilokinaza, lipazele etc.) este
caracteristică afecţiunilor stafilococice de tip invaziv
c. Acţiunea toxinelor - se manifestă specific pentru fiecare dintre toxinele
enumerate:
- acţiune citotoxică pentru hemolizine, leucocidina Panton Valentine;
- activitate de serin-proteaze în cazul toxinelor exfoliative, cu acţiune asupra
desmozomilor care constituie structurile de legătură la nivel intercelular;
- infiltrat leucocitar la nivelul stomacului şi jejunului şi stimularea mediatorilor
chim ici de la nivelul mastocitelor, cu reacţie inflamatorie şi senzaţie de greaţă în
cazul enterotoxinelor;
- activarea limfocitară policlonală specifică pentru toate toxinele care au
caracterul de "superantigene": enterotoxine, toxina exfoliativă
- stimularea eliberării de citokine, având ca rezultat creşterea permeabilităţii
vasculare sau efect citolitic, la concentraţii înalte, precum şi efecte sistemice mergând
pânaă la şoc toxic, în cazul TSST-l

VIII. Raspunsul imun

• Principalul mecanism: fagocitoza


• Anticorpi neutralizanti antitoxici
Opsonizare anticorp dependenta

Mecanismele de evitare a raspunsului imun:


- Aderenţa de epiteliul mucoasei prin existenţa interrelaţiei receptori - adezine
(acizi teichoici, alte adezine) inpiedică mecanismele de curăţire a mucoaselor
- Capsula, microcapsula, proteina A interferă cu fagocitoza
- Biofilmul de la suprafata materialelor străine introduse în organism jenează
fagocitoza
- Carotenoizii, catalaza constituie mecanismele de rezistenţă intrafagocitară: prin
neutralizarea speciilor reactive de oxigen, care constituie mecanismele primare de
bactericidie intrafagocitara la nivelul fagolizozomului
- Leucocidinele, hemolizinele etc. reduc eficienţa răspunsului antifagocitar

9
r

IX. Elemente de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Stafilococii sunt microorganisme ubiquitare. SCN nu lipsesc de la nivlul


tegumentelor, iar Saureus colonizează cel puţin tranzitoriu zonele tegumentare sau
mucoase umede.
Atât Saureus cât şi SCN pot fi izolaţi din orofaringe, tract gastro-intestinal,
urogenital.
Colonizarea nou-născutului cu Saureus începe la nivelul bontului ombilical,
suprafeţelor tegumentare, ariei perineale.
Din totalul indivizilor, se consideră că 15 - 25% din adulţii sănătoşi sunt purtători
nazofaringieni persistenţi, 50% purtători intermitenţi şi un procent de 15 - 25% nu
vor fi niciodată purtători, în relaţie cu particularităţile receptorilor celulari care
constituie marca proprie a fiecărui individ. Portajul de scurtă durata este frecvent
nazofaringian. La pacienţii îndelung spitalizaţi, personal medical etc., portajul poate
ajunge la 40-70, până la 90%. Portajul este tegumentar sau nazofaringian şi poate fi
responsabil pentru apariţia infecţiilor nosocomiale.
Stafilococii pot fi implicaţi Însă şi în etiologia infecţiilor extraspitaliceşti
(comunitare). Se consideră că tulpinile cu tropism pulmonar şi capacitate
dermonecrotică, producătoare de leucocidină Panton Valentineîţi au oroginea în
comunitate, dar pot fi introduse şi îăn spital, unde se propagă după mecanismele
infecţiilor nosocomiale.
Posibilitati de profilaxie si/sau tratament:
Vaccin experimental bivalent anti S aureus - conferă imunitate de aprox.
40 zile pacienţilor hemodializati - compus din polizaharide capsulare de
S aureus tip 5 si 8
Ser hiperimun - nu se mai utilizează
Incercări de antagonizare a factorilor de colonizare

X. Diagnosticul de laborator

Recoltarea şi transportul probelor

În diagnosticul infecţii lor/toxiinfecţii lor putem fi confruntaţi cu orice tip de probă:


secreţie purulentă, LCR, saâge, exsudat nasofaringian, biopsie din leziuni cutanate, lichid
articular, secreţie conjunctivală, spută etc.
Pentru recoltare se ţine seama de precauţiile generale, dintre care cele mai
importante sunt: recoltarea înaintea începerii terapiei cu antibiotice, respectarea regulilor
de antisepsie, reprezentativitatea probei etc.
Transportul trebuie realizat cât mai rapid sau cu asigurarea mediului de tranport,
în cazurile în care se anticipează prelungirea timpului de transport. Transportul la distanţă
trebuie Tacut cu respectarea regulilor internaţionale, respectiv împacheterea triplă:
recipient primar, recipient secundar din material incasabil şi nedeformabil şi înveliş
terţi ar, din carton, marcat cu simbolul caracteristic pentru "pericol biologic".

10
Examenul direct

Examenul macroscopic ajută la selectarea porţiunilor reprezentative, purulente,


sanguinolente etc. Aspectul caracteristic este acela de secreţie sau lichid purulent, cu
tentă galbenă.
Examenul bacterioscopic se face după colorare cu coloratia adecvată scopului
urmărit: Gram pentru bacterii, albastru metilen sau May-Grunwald-Giemsa pentru
observarea celulelor inflamatorii, a relaţiei lor cu bacterii le, respectiv detaliilor de
tinctorialitate celulară.
Citologia cantitativă (numărătoarea celulelor) şi calitativă furnizează informaţii
privind reacţia inflamatorie şi fagocitară, relaţia bacteriilor cu celulele fagocitare etc

Izolarea

Pentru izolarea stafilococilor din produse normal sterile (sânge, LCR etc.) se
utilizează medii nutritive simple, însămânţate şi incubate timp de 24-48 h, la 36 ± lOC;
adaosul de sânge înlesneşte observarea caracterelor hemolitice.
În cazul prelevatelor cu floră mixtă )materii fecale, alimente contaminte etc.) se
utilizează medii selective, ca de exemplu agarul hiperclorurat tip Chapman

Identificarea se realizează în scopul managementului cazului clinic individual,


dar şi în scop epidemiologic, pentru confirmarea cazului şi furnizarea de informaţii
microbiologice cu valoare epidemiologică.
Pentru confirmarea cazului este necesară identificare până la nivel de gen şi
specie, prin: aspectul microscopic, caracterele de cultură (vezi descriere anterioară),
caractere biochimice şi enzimatice.
Diagnosticul de gen în cazul cocilor Gram pozitivi facultativ anaerobi constă în
diferenţierea între Staphylococcus şi Streptococcus pe baza capacităţii de producere a
catalazei (Staphylococcus este pozitiv).
Diagnosticul diferenţial de specie constă în :
- diferenţierea Între S. aureus de SCN cu ajutorul testelor pentru: coagulază,
termonuclează, eventual evideţiera prezenţei proteinei A şi/sau a unor polizaharide
capsulare specifice (reactivi de diagnostic rapid)
- diferenţierea speciilor de SCN Între ele - În cazul secţiilor de chirurgie cardio-
vasculară sau În care se fac protezări etc.; sau în infecţii urinare. Se poate face cu ajutorul
kit-urilor sau galeriilor multitest
În scop epidemiologic poate fi necesară evidenţierea unor markeri
microbiologiei care să diferenţieze tulpinile din aceeasţi speeie, pentru a putea
evidenţia sursa şi calea de transmitere.
Diferenţierea intraspecifica: se face prin metode de tipizare cu sunt: tipizara
bacteriofagică (Iizotipie), tipizare moleculară

La examenul microscopic se evidenţiază coci gram pozitivi, cu diametrul de 0,5-


1,5 um , dispuşi în grămezi, imobili, nesporulati, de regulă necapsulaţi. În prelevate,
stafilococii pot fi evidenţiaţi şi izolaţi sau în grupuri de mici dimensiuni, cu defecte de
colorabilitate, mai ales în produse provenite de la pacienţi deja trataţi cu antibiotice.

II
Fig. 5. Frotiu colorat C4 albastru de metilen din cultură pură coci dispuşi în grămezi

,
~@

'1."
,.
'1Si

Fig. 6. Imagine obţinută prin microscopie electronică de baleiaj - coci în ciorchine de


struguri

Caractere de cultivare: se dezvoltă atât în aerobioză, cât ŞI In anaerobioză


(facultativ anaerobi), sunt mezofili (se dezvoltă între 10-42°C, cu dezvoltare optimă la
37°C). Cresc pe medii uzuale (agar nutritiv cu sau fără adaos de sânge) şi/sau pe medii
selective hiperclorurate de tip Chapman. Formează colonii rotunde, convexe, frecvent
pigmentate galben auriu la S. aureus, care produc frecvent o hemoliză completă sau
incompleta pe geloză sânge (Fig. 7, 7 bis). Stafilococii sunt capabili să crească pe medii
suplimentate cu 10% NaCI. Pe acest mediu, S. aureus utilizează manita (virarea culorii
roz a mediului la galben), în timp ce numai unii SCN utilizează manita (Fig. 8).

12
Fig. 7. S. aureus Ca) şi S. epidermidis - aspectul coloniilor pe agar nutritiv simplu cu
adaos de sânge

a. b.

Fig. 7 bis - S. aureus: culturi pe agar nutritiv simplu cu adaos de sânge şi frotiu colorat
Gram

13
--------------------------------------------------------------,

Fig. 8 - Mediu selectiv si diferential hiperclorurat cu manitol- izolare din produse


contaminate cu germeni Gram negativi. S. aureus apare sub forma coloniilor de culoare
galbenă şi îngălbeneşte mediul

Testul catalazei, utilizat pentru diferenţierea stafilococilor de streptococi se


efectuează punând în contact o cultura pe mediu fără sânge cu apă oxigenată 3%. Reacţia
pozitivă constă în apariţia efervescenţei, prin eliberarea oxigenului (Fig. 9).

Fig. 9. Diagnostic diferenţial Staphylococcus # Streptococcus utilizând testul catalazei


(Genul Staphylococcus este catalază pozitiv)

Pentru diferenţierea S. aureus de SCN putem utiliza în concluzie urmatoarele


caractere:

- caracterele culturale
• colonii pigmentate galben-auriu la S. aureus, spre deosebire de S.
epidermidis şi S. saprophyticus care prezintă pigment alb
S. aureus produce pe agar sânge mai frecvent o hemoliză clară sau
o hemoliză incompletă
- producerea de coagulază liberă de către S. aureus - enzimă care are proprietatea de
a coagula plasma oxalatată prin activarea protrombinei (Fig. 10). Restul
stafilococilor sunt denumiţi SCN

14
- S. aureus produce dezoxiribonuclează termostabilă, care rămâne activă pnn
fierberea supernatantului de cultură (Fig. 11 şi 12).
- prezenţa proteinei A în structura peretelui celular - cu ajutorului reactivului rapid
(Fig. 13)

Fig. 10 - Testul coagulazei pozitiv (sus) şi negativ (jos)

Fig. 11 - Testul termonucleazei - metoda cu HCl- clarificarea mediului cu acizi


nucleici în vecinătatea culturii pozitive pentru dezoxiribonuclează prin solubilizarea
acizi lor nucleici depolimerizaţi în acid clorhidric

Medtoda cu H CI

15
Fig. 12. Testul termonucleazei - metoda Lachica, cu albastru de bromtimol (ABT) -
schimbarea culorii complexelor acizi nucleici - ABT, de la albastru la roz, ca
urmare a modificării structurii spaţiale după digestia acizilor nucleici

În Fig. 13 este reprezentată metoda rapidă de identificare a S. aureus prin


aglutinare cu latex sensibil izat cu imunoglobuline (reacţionează cu Proteina A din
peretele S. aureus), fibrinogen (reacţionează cu coagulaza legată din peretele S. aureus)
şi anticorpi monoclonaJi anti antigene capsulare de S. aureus

Fig. 13. Metoda rapidă de identificare aS. aureus

Pentru diferenţierea SCN Între ei, utilizăm kit-uri sau galerii de microteste (ex.
API 20 (Fig. 14) sau API ID 32 STAPH.

16
Fig. 14. Identificarea SCN cu ajutorul galeriei API 20

Dintre metodele de tiprzare, lizotipia poate oferi informaţii utile pentru


diferenţierea în focar (Fig. 15).

Fig. 15. Lizotipia utilizată pentru diferenţierea tulpini lor într-un focar de infecţii
stafilococice

Există metode de tipizare moleculară potrivite pentru diferenţierea în focar, sau


pentru urmărirea evoluţiei tulpini lor la o scară mai largă temporospaţială.
Testarea de rutină a sensibilităţii la antibiotice se face prin metoda disc difuziei.
Principalele mecanisme de rezistenţă la stafilococi sunt:
- elaborarea de beta-Iactamaze - codificate plasmidic, inhibate de inhibitorii de [3-
lactamaze ca: acid c1avulanic (augmentin= amoxicilină cu acid clavulanic), sulbactam,
care pot inactiva aceste beta-Iactamaze
Tulpinile MRSA posedă gena mecA. Cele de provenienţă nosocomială în
Romania sunt de obicei multirezistente.

17
Tulpinile MRSA din comunitate sunt mai sensibile la alte antibiotice.
Rezistenţa prin apariţia unei noi proteine de legare a penicilinei, cu ajinitate joasă
pentru beta-lactamine (tulpini meticilino-rezistente MRSA sau Meti-R),
apariţia unei PBP adiţionale şi se manifestă faţă de toate beta-lactaminele
(peniciline, cefalosporine, carbapeneme). Singurele antibiotice active faţă
de aceste tulpini sunt glicopeptidele (vancomicina). Dar şi faţă de acestea
au apărut tulpini rezistente. Antibiograma este deci obligatorie.
Testarea sensibilitatii la oxacilina - screening difuzimetric cu disc de cefoxitin, însoţit
de al doilea test: evidenţierea PLP2a sau PCR pentru gena mecA
Test D pentru detectarea rezistentei inductibile la MLSb (Macrolide, Lincozamide,
Streptogramine b): discuri Eritromicina si Clindamicina la o distanta de 10 mm:
Eritro R si turtirea zonei de sensibilitate Ia Clindamicina (antagonism) - Fig. 16.

Fig. 16. Testul D pentru rezistenţă inductibilă la macrolide, lincosamide,


streptogramine

18