BACTERII Metode de sterilizare utilizate n microbiologie

Sterilizarea este operaia de distrugere a microorganismelor prezente ntr-un mediu sau pe instrumentarul de laborator. Cunoaterea metodelor de sterilizare este necesar pentru desfurarea corect i reuita oricrei lucrri de microbiologie. Exist numeroase metode. Alegerea metodei potrivite depinde de natura materialului care va fi sterilizat (sticlrie, cauciuc, metal). Clasificarea metodelor de sterilizare se face n funcie de natura operaiilor efectuate: Metode care utilizeaz ageni fizici: cldura ( uscat, umed), radiaii UV, filtrarea, ultrasunetele. Metode care utilizeaz ageni chimici: substane antiseptice, substane dezinfectante. Metode care utilizeaz cldura uscat: incinerarea, nclzirea la rou, flambarea, sterilizarea cu ajutorul aerului cald. Metode care utilizeaz cldura umed: fierberea, pasteurizarea, tindalizarea, autoclavarea

Principul metodelor care se bazeaz pe cldur- n cursul operaiei are loc degradarea proteinelor microbiene pn la calcinarea materialului biologic. Cldura realizeaz distrugerea formelor vegetative la temperatura de 50- 60o C cam n 30 de minute. Dac se crete temperatura la 70o C formele vegetative sunt distruse n 10 minute. La 20o C cu cldur umed i la 100o C cu cldur uscat sunt distrui sporii. Incinerarea const n arderea materialului biologic n cuptoare speciale sau crematorii. Prin aceast metod sunt distruse cadavrele animalelor scoase din exploatare ca i vata i tifoanele infectate. nclzirea la rou este folosit pentru ansele bacteriologice care sunt meninute n flacra becului de gaz pn la rou, mai nti la baza flcrii, apoi la vrf. Ansa se sterilizeaz obligatoriu nainte i dup utilizare. Flambarea const n trecerea prin flacra becului de gaz de cteva ori a obiectului care se sterilizeaz- lame de sticl, pipete gradate, pipete Pasteur, nainte de sterilizare, idem mnerul ansei i gtul eprubetelor i baloanelor nainte i dup utilizare. Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficient msur de sterilizare cu cldur uscat. Carbonizarea materiei vii se face n etuve la 180o C timp de o or. Este o metod de sterilizare complet: se sterilizeaz sticlria de laborator, instrumentarul chirurgical. Nu se pot steriliza seringile cu armtur metalic i obiectele de cauciuc. Obiectele se pregtesc pentru sterilizare astfel: sticlria s fie bine splat i perfect uscat. Se mpacheteaz n hrtie de ambalaj fiecare obiect n parte. Toate eprubetele i baloanele se astup cu dopuri de vat nvelite n tifon, se leag cu sfoar i li se aplic un capion de hrtie. Pipetele se ambaleaz individual, sau n cilindrii metalici. Vata, compresele, pansamentele se sterilizeaz n casonete speciale (cutii de tabl cu perei dubli) peretele intern prezint orificii i peste el se afl o centur metalic ce astup orificiile dup ncetarea sterilizrii. Controlul sterilizrii la etuv se face amplasnd pe lng materialele de sterilizat, tubuoare de sticl care conin zaharoz al crei punct de topire este de 170o C Dac zaharoza este caramelizat nseamn c s-a atins temperatura necesar. Temperatura nu trebuie depit pentru c vata i hrtia ard producnd substane inhibitoare pentru microorganisme. Cldura umed are o putere de penetrare mai mare- distruge microorganismele hidratate n timp mai scurt i la o temperatur mai sczut dect cldura uscat. Fierberea const n fierberea instrumentelor chirurgicale, seringilor la 100o C timp de 20- 30 minute. Fierberea nu este o metod complet, sporii nu sunt distrui. Se face n fierbtoare electrice sau cu gaze i se recomand s se foloseasc ap distilat pentru a evita depunerea srurilor. Se recomand adugarea a 4- 5% carbonat de sodiu sau borax care ridic cu cteva grade punctul de fierbere i mpiedec ruginirea. Teoretic obiectele sterilizate pot fi utilizate 24 de ore. Se recomand folosirea lor imediat. Pasteurizarea este sterilizare incomplet, sunt distruse numai formele vegetative, nu i sporii. Este folosit la stilizarea laptelui i a berii. Se face prin nclzirea produsului la 56- 90o C timp de 30 minute. nclzirea se face pe baie de ap. Produsele astfel sterilizate se pstreaz ambalate ermetic la 4o C pn la momentul folosirii pentru a mpiedeca germinarea sporilor.

Tindalizarea este o pasteurizare repetat de 3 ori la intervale de 24 de ore. Se face la sterilizarea mediilor de cultur care conin diferite substane organice: glucide, gelatin, ser sanguin care se degradeaz la temperaturi mai mari.. n intervalul dintre sterilizri se pstreaz la temperatura camerei pentru ca sporii rmai nedistrui s evolueze la forme vegetative care vor fi distruse la viitoarea nclzire. Tindalizarea este o sterilizare complet. Autoclavarea este sterilizarea cu vapori de ap sub presiune. Este cea mai folosit n practica microbiologic,. este o sterilizare complet i sigur. Cu vapori de ap sub presiune se obin temperaturi peste 100o C. La 0,5 atmosfere temperatura este de 115o C La 1 atmosfer temperatura este de 121o C La 2 atmosfere temperatura este de 134o C nclzirea se face timp de 20 de minute. Materialele sterilizate sunt materialele infectate, culturile microbiene vechi, casonete cu instrumentarul medical, medii de cultur, obiecte din cauciuc. Sterilizarea se face n autoclav care este un cazan de tabl cu pereii dubli cei interni prezentnd orificii prin care trec vaporii. Antisepticele substane care mpiedec multiplicarea microorganismelor. Aceste substane au n general, aciune microbiostatic, acioneaz n concentraii mici i pentru timp scurt pot fi aplicate pe esuturi vii. Exemplu. Alcoolul etilic de 70o ,KMnO4 0,1%, tinctura de iod, acidul boric , H2O2 ,detergenii cationici de tip bromocet 0,1%. Dezinfectanii sunt substane care au n general, aciune microbicid, care distrug microbii de pe diferite obiecte neanimate. Exemple: formol, fenol, cloramina. Alcoolul absolut de 96o este un dezinfectant foarte slab, el acioneaz prin coagularea proteinelor.

Tipuri morfologice de baz la bacterii Forma bacteriilor este controlat genetic, ele ncadrndu-se ntr-un anumit tip morfologic i anumite dimensiuni. Forma poate fi influenat i de condiiile de mediu, totui polimorfismul este limitat- domin forma tipic pentru specia dat. Convenional forma bacteriilor se apreciaz pe bacterii din culturi tinere, aflate n cretere activ, cultivate pe medii corespunztoare i n condiii optime de temperatur, PH i presiune de oxigen adecvat. Dup form deosebim 5 tipuri: Bacterii sferice- coci, aproape izodiametrice, uor ovalare, poliedrice, reniforme. Dup modul de grupare la sfritul diviziunii -coci izolai -grupate cte dou Diplococcus pneumonie -tetrada - sarcina -streptococ Micrococcus tetragenes (4 celule) Sarcina lutea (8 celule) Streptococcus pyogene (celule n lan)

- stafilococi

Staphylococcus aureus (ciorchine)

Bacterii cilindrice ( bacili )- celule alungite- bastona, dar sunt i forme de tranziie, ntre coci i bastonae- cocobacili. Capetele bacililor pot fi: - rotunjite Pot fi: -izolai grupai cte-doi diplococi tiate drept ascuite picot

- n palisad

Corynebacterium diphteriae

-streptobacili

Lactobacillus sp.

- n rozet

Agrobacterium stellatum

-grupri neregulate

3.Bacterii spiralate (elicoidale) Dup numrul spirelor i dup aspect sunt mai multe subtipuri: -vibrion Vibrio cholerae

- spirili cu ture de spir rigide -spirochetele cu ture de spir flexibile: -strnse - relaxate

Spirillum volutans Treponema pallidum Leptospira sp.

5. Bacterii ptrate. Descoperite n 1980 n Sinai de Walsby. Aparin genului Qadra, grupul Arhebacteriilor. n afara tipurilor de baz sunt i forme rare de bacterii: bacterii pedunculate, bacterii care nmuguresc, bacterii cu apendici acelulari rezultai din produi de excreie, bacterii care formeaz trichoame (lanuri de bacterii reunite de o teac polizaharidic comun, dar pot tri i izolat). Minicelulele- sunt corpusculi mici, sferici care nu cresc, ei se formeaz printr-o septare neobinuit a celulelor bacteriene. Se formeaz la extremitatea unor bacterii- Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella i Vibrio. Aceste minicelule nu au material nuclear, nu cresc i nu se divid, au totui metabolism propriu (cu enzime) sunt rezistente la radiaii ionizante. Sunt importante pentru cercetare, vor fi folosite ca vaccinuri vii.

Studiul mediilor de cultur utilizate n bacteriologie Mediul de cultur este un produs nutritiv preparat artificial n laborator n vederea cultivrii microorganismelor. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: Compoziia chimic s fie corespunztoare pentru dezvoltarea microorganismelor S asigure sursa de C, N ,srurile minerale i vitaminele PH-ul ntre 7- 7,5 pentru bacterii i 5,5- 6 pentru drojdii Mediul s fie steril Umiditatea mediului s fie corespunztoare S se asigure protecia fa de lumin S se asigure cerinele pentru oxigen n funcie de tipurile de microorganisme: aerobe, microaerofile, anaerobe Asigurarea temperaturii de dezvoltare de 25- 28oC pentru germenii saprofii i 37oC pentru germenii patogeni. Cele mai utilizate medii de cultur sunt mediile uzuale sau simple. Mediile uzuale pot fi lichideexemplu bulionul simplu de carne, sau solide- exemplu geloza nutritiv. Etapele preparrii unui mediu de cultur: Stabilirea compoziiei chimice a mediului n funcie de tipul de microorganisme Cntrirea substanelor n ordine din reet i dizolvarea lor n ordine n din cantitatea de ap, se adaug restul de ap, se corecteaz PH-ul fie cu HCl 10% fie cu NaOH . Dac este cazul se filtreaz Sterilizarea mediului printr-o metod adecvat- filtrare, tindalizare, autoclavare Reete pentru mediul de cultur: -mediu lichid Extract de carne- 3g Pepton- 5g NaCl 5g Ap distilat pn la 1000 ml -mediu solid Extract de carne 3g Pepton 5g NaCl -5g Agar 20g Ap distilat pn la 1000 ml

Tehnici de nsmnare utilizate n microbiologie nsmnarea este trecerea unei culturi microbiene sub form de inocul care conine microorganisme, pe un mediu de cultur favorabil dezvoltrii speciei microbiene. Condiia esenial de lucru este asepsia. Sunt mai multe tehnici n funcie de consistena mediului i de tipul de cultur pe care vrem s o nsmnm. nsmnarea n medii lichide 1. nsmnarea unui mediu lichid cu o cultur microbian dezvoltat n mediu lichid- se realizeaz cu pipeta gradat (pentru un volum fix) i pipeta Pasteur (pentru un volum oarecare) 2. nsmnarea unui mediu lichid cu o cultur microbian dezvoltat pe mediu solid cu ajutorul ansei bacteriene. Tehnica de lucru. Se recolteaz aseptic o poriune de cultur microbian n bucla ansei. Se introduce ansa n mod aseptic n eprubeta cu mediu lichid, se depune materialul pe peretele eprubetei, la nivelul interfeei cu mediul lichid, apoi se spal peretele eprubetei cu cteva picturi din mediul de cultur. Se omogenizeaz inoculul cu mediul de cultur prin rsucirea eprubetei ntre palme .Pe gtul eprubetei se noteaz numele culturii i data incubrii. Se termostateaz la temperatura optim de incubaie de 28- 37oC .

Dop

Sarcina lutea

15.08.2001

Geloz

Temperatura optim timp de 24 de ore

Mediu lichid

Dup inoculare se observ tulburarea mediului de cultur datorit multiplicrii celulelor bacteriene. Se obine o cultur bacterian n mediu lichid. nsmnarea mediilor solide. Sunt dou variante: nsmnarea mediilor solide nclinate cu o cultur microbian dezvoltat n mediu lichid. nsmnarea se face cu pipeta. nsmnarea mediilor solide nclinate, cu o cultur microbian dezvoltat pe mediu solid se face cu ansa bacteriologic

Tehnica de lucru. Se recolteaz aseptic n bucla ansei o poriune de cultur (inocul) . Se introduce ansa n mod aseptic n eprubeta cu mediu nclinat steril, pn la fundul eprubetei unde este o pictur de ap de condensare. Se omogenizeaz inoculul n aceast pictur, apoi se traseaz pe suprafaa gelozei striuri n zigzag de la fundul spre gura eprubetei.

inocul

pictur de lichid de condensare

striuri n zig-zag

Se incubeaz la temperatura de dezvoltare a germenului 24-48 ore

cultur bacterian

nsmnarea mediilor solide repartizate n plci (pe geloz plci) Tehnica de lucru din cultura care trebuie nsmnat se face o suspensie foarte dens n ap fiziologic steril, indiferent dac nsmnm cu un produs solid sau lichid. Sunt dou variante n funcie de obiectul utilizat

- Tehnica nsmnrii n pnz prin inundare: se aspir cu pipeta 2-3 ml din suspensia bacterian dens, se las s se scurg tot volumul de lichid pe suprafaa gelozei astfel ca s fie acoperit toat suprafaa

inocul exces de inocul mediu suspensie bacteriologic dens n ap fiziologic steril cu inocul, se nclin placa i cu aceeai pipet se extrage excesul de inocul. Se noteaz pe capacul plcii numele culturii i se incubeaz la temperatura optim 24- 48 ore. -nsmnarea cu ajutorul tamponului de vat Se mbib tamponul n suspensia bacterian, se preseaz de pereii interiori ai eprubetei pentru a ndeprta excesul de inocul pe suprafaa plcii cu geloz se traseaz striuri foarte apropiate n zig- zag pe toat suprafaa plcii nti pe o direcie, se rotete placa cu 90o, se traseaz din nou striuri foarte apropiate, apoi un striu marginal. Dup incubare se va observa c ntreaga suprafa a mediului de cultur este acoperit cu un strat uniform de celule- se obine o cultur n pnz. nsmnarea n pnz se face pentru obinerea de mas celular bogat, pentru realizarea tehnicii autobiogramei i n cazul culturii bacteriofagilor.

Tampon de vat

Se noteaz numele culturii nsmnate, data i se incubeaz la temperatura optim de dezvoltare 24- 48 de ore Metode de examinare a microorganismelor la microscop. I. n stare vie, pe preparate proaspete ntre lam i lamel. Examinarea preparatelor proaspete se face pentru evidenierea mobilitii germenilor, se dau puine detalii de structur, dar mobilitatea este un caracter care poate servi la identificarea unei specii de bacterii alturi de alte caracteristici studiate: structura, morfologia, proprieti biochimice, proprieti serologice, de patogenitate ca i reactivitatea germenilor pentru diferii colorani- activitate tinctorial. Se examineaz pe viu: bacili, spirili, leptospire, spirochete. Materiale necesare: Lame cu lamele curate i degresate, culturi microbiene n mediu lichid sau suspensie n ap fiziologic steril, sau mediu natural, pipete Pasteur, vas cu amestec sulfocromic. Mod de lucru: Se recolteaz cu pipeta Pasteur o cantitate mic de cultur, se depune o pictur pe lam, apoi lamela la 45o se aeaz pe marginea picturii i se las s cad uor fr s prind aer. Observarea preparatelor lam- lamel se face la microscopul optic cu obiectiv uscat (40x), dar pot fi observate ui la microscopul cu fond negru i la microscopul cu contrast de faz. Microorganismele efectueaz micri active, datorit prezenei flagelilor, n toate direciile cmpului- naintare, rsucire, rostogolire; micri

pasive- datorate nclinrii platinei- sunt micri ntr-un singur sens. Dup examinare preparatul se pune ntrun cristalizor cu soluie desinfectant- clorur mercuric 2 %. II. Germeni omori prin diferite procedee de fixare i colorare pe preparate fixe numite frotiuri. Examinarea frotiurilor permite studierea morfologiei germenilor, evidenierea unor structuri intra i extraparietale. Frotiul este un preparat microbiologic etalat pe lame microscopice. Pot fi executate din culturi microbiene dezvoltate pe mediu solid cu ajutorul ansei, sau din cultur lichid cu pipeta Pasteur. Materiale necesare : Culturi microbiene, ap fiziologic steril, ans bacteriologic, stative de colorare, creion de scris pe sticl, lame curate i degresate. nainte de efectuarea frotiului lamele se flambeaz pe faa pe care se va efectua frotiul. Timpii de lucru. 1. Etalarea. ntr-o pictur de ap fiziologic steril luat n bucla ansei i pus pe lam se omogenizeaz o cantitate mic de cultur recoltat n bucla ansei. Etalarea se face cu ajutorul ansei prin micri circulare concentrice. Frotiul trebuie s fie subire i uniform pentru a mpiedica suprapunerea germenilor. Suprafaa de etalare se mrete, frotiul nu trebuie s depeasc marginile lamei. 2. Uscarea. Se face la temperatura camerei, nu se recomand agitarea n aer . 3. Fixarea. Se face cu cldur sau ageni chimici. Se trece lama cu faa opus frotiului prin flacra becului de gaz de cteva ori. Fixarea este ncheiat cnd lama frige. Se controleaz temperatura trecnd-o pe dosul palmei stngi. Fixarea cu ageni chimici- metanol, etanol, sau alcool- eter. n cursul operaiei de fixare, germenii sunt omori. Se nltur posibilitatea infectrii, preparatul ader mai bine la lam, se mrete i afinitatea pentru colorani. Pentru efectuarea frotiului din mediu lichid se procedeaz la fel, dar se folosete pipeta Pasteur. 4. Colorarea. Se datoreaz reaciei de combinare ntre anumii colorani i unii constitueni ai celulelor bacteriene. Coloranii utilizai sunt substane organice din grupul anilinei, extrai din gudroanele de huil sau substane chimice de tipul srurilor cu caracter bazic sau acid: fucsina bazic, violet de genian, albastru de metilen, fucsina acid, eozina Metode de colorare utilizate. Simple, cnd se folosete aciunea unui singur colorant. Difereniale, cnd acioneaz 2 sau mai muli colorani Speciale sau selective, se utilizeaz colorani selectivi care evideniaz anumite structuri celulare. Coloraia simpl cu fucsina. Frotiul se fixeaz la flacr. Colorarea cu soluie de fucsina bazic soluie 1% hidroalcoolic fenicat din care se prepar soluia de lucru 1/10. fucsina se menine pe lam un minut. Se spal cu ap de robinet, se usuc la aer, se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie ntr-o pictur de ulei de cedru. Bacteriile sunt colorate uniform, ceea ce constituie un artefact datorat faptului c diferite componente celulare, dei au structuri diferite au afinitate aproape egal pentru coloranii bazici. coloraia simpl se face n scop orientativ. Dac e vorba de o cultur pur se poate observa tipul morfologic al germenilor i confirmarea puritii culturii. Dac frotiul este fcut din preparat natural se poate constata prezena, microorganismelor, tipul i densitatea lor. Coloraia Gram. A fost introdus n practica microbiologic de Gram. Se utilizeaz aciunea a doi colorani: fucsin bazic i violetul de genian, este o coloraie diferenial- difereniaz toate bacteriile n dou grupe: Gram pozitive i Gram negative, care se bazeaz pe diferenele structural biochimice i biologice, dar n special pe structura diferit a peretelui celular. Este o coloraie cu valoare taxonomic, descrierea ncepnd cu caracterul Gram .Descrierea metodei. Frotiul este fixat la flacr. Se coloreaz cu soluie de violet de genian 1% care se menine pe lam 1-2 minute, apoi colorantul se scurge i preparatul se spal cu ap. Toate bacteriile se coloreaz n violet. Mordansarea cu soluie Lugol 1:2:300 iod, iodur de potasiu, ap distilat. Soluia se menine pe lam 2-3 minute. Preparatele nu se spal. n timpul acestei operaii iodul formeaz cu violetul de genian un complex iodat cu greutate molecular mare care la unele bacterii este stabil, la altele este instabil. Decolorarea cu alcool aceton (3-1) se menine 5- 7 secunde pe lam, apoi se face o splare abundent cu ap pentru a opri aciunea decolorantului. Recolorarea cu soluie de fucsin bazic 1%, 1/10. se menine pe lam un minut. Preparatul se spal cu ap, sunt uscate i se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie. Celulele la care complexul este instabil se decoloreaz i vor fi recolorate cu fucsin n rou, celelalte rmn colorate n violet .

Interpretarea observaiilor. Dac preparatul este dintr-un amestec de germeni- unele bacterii vor fi colorate violet- Gram +, altele n rou- Gram . Principiul coloraiei Gram. Coloranii bazici au mare afinitate i reacioneaz cu componentele acide din citoplasma bacteriilor, iar dup tratarea cu soluia Lugol se formeaz un complex iodat stabil. La Gram pozitive i instabil la Gram negative care trebuie colorate apoi cu un colorant de contrast pentru evideniere. Ipoteza acceptat este c un rol esenial n colorare l are peretele celular. Coloraia Gram depinde foarte mult de vrsta culturii bacteriene. Numai culturile tinere permit o coloraie i o interpretare corect. Pe msur ce mbtrnesc i schimb comportamentul- bacteriile Gram pozitiv se coloreaz ca i cele Gram negativ. Bacterii Gram pozitive. Bacilii sporulai- Bacillus subtilis, Bacillus aureus, specii ale genurilor Staphylococcus, Streptococcus, bacteriile lactice- Lactobacillus. Bacterii Gram negative. Escherichia coli, Proteus, Salmonella, gonococul- Neisseria, se comport la fel toate celulele eucariote, cu excepia drojdiilor.