Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
(VII.1)
Acid galic
186
EGCG a manifestat proprieti inhibitorii mai puternice n formarea 8-hydroxy-2doexyguanosine, care este un produs al interaciunii speciilor active de azot (ONOO-)
cu ADN, dect vitamina C i glutationul [442]. Mecanismul exact al activitii inhibitorii nu este cunoscut, dar se pare c cteva structuri sunt importante n conferirea
acestei activiti. Toate catehinele au grupa dihidroxilic (o-3,4-OH) n inelul B care
particip n delocalizarea electronului i la stabilizarea formei radicalice [443]. Galocatehinele (EGC i EGCG) au grupa trihidroxilic n inelul B (3,4,5-OH), n timp ce
catehingalaii (EGC i EGCG) au componenta galat esterificat n poziia 3 a inelului C
i 3 grupri hidroxile. Componenta galat mpreun cu 3 grupri hidroxile (3,4,5-OH)
este asociat cu creterea activitii antioxidante [436]. Studiile efectuate n domeniul
oxidrii produselor cu radicalul peroxil (HO2) n prezena galocatehinelor au constatat
c gruparea 3,4,5-OH din inelul B este principala poziie n proprietatea antioxidant
a EGC i EGCG [444,445].
Radicalii liberi n diferite sisteme se pot forma n rezultatul descompunerii peroxidului de hidrogen n prezena diferitelor metale: Fe2+, Cu2+, Cr3+ .a. n rezultatul reducerii H2O2 prin reacia Fenton n prezena Cr3+ (care este toxic i cauzeaz genotoxicitate), se formeaz radicalul OH:
Cr(III) + H2O2 Cr(IV) + OH + OH(VII.2)
Radicalul hidroxil format in vivo iniiaz paguba oxidativ a ADN cu formarea
8-OH-dG, care este un biomarcher n acest proces [441]. n rezultatul studiului, Silvia
Lopez-Burillo i al. [441] au constatat c antioxidanii inhib procesele oxidative ale
ADN. Dintre polifenolii studiai n [441] cel mai nalt efect inhibitor l posed (-)-epigalocatehin-3-galatul (EGCG) n concentraie de 1 M i mai mare, care reduce formarea 8-OH-dG. Catehinele ceaiului pot forma compleci stabili cu Cu(II) i Cr(III)
i, n rezultat, are loc generarea radicalilor OH [442]. Dar, s-a constatat c n cazul
EGCG radicalii OH sunt scindai de gruparea galat existent n complex i astfel nu se
manifest efectul prooxidant al acestui compus [443].
Ceaiul verde i cel negru poate inhiba oxidarea lipoproteinelor indus de Cu2+
[442]; astfel, contribuie la prevenirea arterosclerozei i a altor boli cardiovasculare.
Inhibiia acestui proces este determinat de faptul c polifenolii pot chela metalele i
micora astfel concentraia formelor active ale oxigenului, care, la rndul su, particip
la oxidarea proteinelor.
Antocianidinele i catehinele au fost testate pentru activitate inhibitorie in vitro
asupra enzimelor ciclooxigenaze (COX), care activeaz creterea celulelor cancerigene
i influeneaz proliferarea celulelor de cancer uman [434]. S-a constatat c cel mai
puternic efect inhibitor al enzimelor COX posed cianidina, care are n inelul B grupele
3',4'-dihidroxilice. Activitatea inhibitoare a descrescut pentru delfinidin i pelargonidin, care au grupri 3',4',5'-trihidroxilice i 4'-hidroxilic n inelul B, respectiv. Din
punctul de vedere al legturii dintre structur i activitate, numrul i poziia gruprilor
hidroxilice n inelul B al antocianidinelor influeneaz activitatea inhibitoare a acestor
compui. Pentru catehine cis-, trans-izomeria i epimerizarea nu au influenat semnificativ activitatea inhibitoare asupra enzimelor COX, dar prezena grupelor galoil n
189
structura catehinelor a influenat mai mult activitatea lor inhibitoare asupra enzimelor
COX. Din rezulatele obinute n inhibiia proliferrii celulelor de cancer sub aciunea
antocianidinelor i catehinelor, s-a constatat c gradul de inhibiie este mai nalt pentru
derivaii galoil ai catehinelor [434] (galocatehina 95%, epigalocatehina 100% i
galocatehingalat 97%), iar pentru antocianidine n jur de 75%.
S-a constatat c unii colorani naturali pot fi antioxidani nutriionali importani i
prezena lor n alimente la fel poate reduce riscul bolilor cardiovasculare, al cancerului
[448-450]. Mai multe cercetri s-au axat pe studierea a astfel de colorani naturali cum
sunt carotenoidele, antocianidinele i curcuminoizii, care au manifestat proprieti antioxidante, antiinflamatorii, antibacteriene (antivirale), anticancerigene i efecte antitumorale [451,452]. Colorani naturali importani sunt betalainele care se conin n sfecla roie.
Studii recente [453,454] au demonstrat c betalainele din sfecla roie posed efect antiradicalic i activitate antioxidant mai nalt dect carotenoizii. Concentraia inhibitoare
IC50 a betaninei pentru oxidarea proteinelor cu densitate sczut este mai superioar
dect a catehinei, adic betanina are activitate antioxidant mai nalt dect (+)-catehina.
Dei betalainele (betanina, betaxantina, izobetaina, amarantina) nu sunt flavonoizi, ele conin grupa o-difenol-monoglicozidic i gruparea amino-, manifestnd
astfel foarte bune proprieti electrodonoare [454]. Moleculele de betalaine sunt foarte
buni donori de electroni, deoarece conin grupe hidroxile (-OH), aminogrupri (=NH)
i grupe tiolice (-SH). Activitatea antioxidant/antiradicalic pentru diferite betalaine
depinde de structura chimic i crete odat cu creterea numrului grupelor hidroxilice i aminogrupelor din molecul, iar glicozilarea reduce activitatea lor antiradicalic
[455]. Un captator de radicali liberi n sisteme biologice este acidul uric [456].
VII.2. Metode de evaluare a activitii antioxidante/antiradicalice
a inhibitorilor prin testul cu radicalul DPPH
S-a studiat activitatea antioxidant/antiradicalic a diferiilor inhibitori: cvercetina (Cv), rezveratrolul (Rezv), acidul dihidroxifumaric (DFH4), esterul dimetilic al acidului dihidroxifumaric (EDMD) i extracte din semine de
struguri (Eneox extract enotaninic neoxidat, ENOXIL
extract enotaninic oxidat). n acest scop a fost utilizat testul
DPPH, care include determinarea variaiei concentraiei
radicalului DPPH n rezultatul interaciunii lui cu componenii antioxidani. Utilizarea DPPH-radicalului (2,2difenil-1-picrilhidrazil) (Fig.VII.2) permite de a determina
Fig. VII.2. Structura
activitatea antioxidant/antiradicalic a compuior puri i
a extractelor din produse vegetale dup variaia concen- chimic a DPPH -radicalului
traiei de DPPH ce se consum dup urmtorul mecanism: (2,2-difenil-1-picrilhidrazil).
DPPH
Red + DPPH-H
DPPH + RedH2 DPPH-H + RedH
(VII.3)
Abilitatea compuilor de a capta radicali este determinat de proprietatea lor de a ceda
electroni sau hidrogen, adic de mrimea potenialului de reducere al antioxidanilor. Cu
ct mai mic este potenialul de reducere cu att mai activ este antioxidantul (Tab. VII.1).
190
n studille experimentale a fost determinat activitatea antiradicalic a antioxidanilor dup variaia concentraiei DPPH n soluie alcoolic (75%). Descreterea
absorbanei a fost determinat la = 517 nm la 1, 5, 10 minute, timp de dou ore. n
procesul experimental concomitent se obinea curba cinetic nul (fr antioxidant),
care indic variaia concentraiei DPPH n timp. Pentru fiecare antioxidant s-a studiat
variaia concentraiei radicalului DPPH n funcie de concentraia reductorului. Apoi
s-a calculat concentraia rezidual de DPPH (%) n funcie de timp i s-au construit
curbele cinetice. Rezultatele comportamentului cinetic al reductorilor studiai este
prezentat n Figura VII.3.
(a)
(d)
(b)
(c)
(e)
(f)
Fig. VII.3. Curbele cinetice de consum al DPPH la interaciunea cu: (a) Rezv; (b) ENOXIL;
(c) Eneox; (d) DFH4; (e) EDMD; (f) Cv; n soluii alcoolice de 75%; [DPPH] = 510-5M.
Evoluia reaciilor cinetice depinde de natura antioxidanilor testai. n acest context exist trei tipuri de comportament [447]: 1) comportament de cinetic rapid, la care
timpul de reacie t < 1 min.; 2) comportament de cinetic intermediar (5 < t < 30 min.);
3) comportament de cinetic lent, cnd reacia decurge de la 1 h pn la 6 h i mai mult.
Din FiguraVII.3, unde sunt prezentate curbele cinetice ale variaiei concentraiei (%)
de DPPH, constatm c Rezv (a) interacioneaz foarte rapid. Astfel, rezveratrolul
poate fi clasificat ca antioxidant ce particip n reacie cu radicalii DPPH dup un comportament de cinetic rapid. Ceilali inhibitori pot fi clasificai la tipul comportamentului de cinetic intermediar. Conform metodei utilizate n [447], activitatea antiradicalic a fost evaluat din cota-parte de DPPH rmas, la echilibru. Activitatea antiradi 191
calic (AAR) a fost definit ca fiind cantitatea de antioxidant necesar pentru descreterea concentraiei iniiale de DPPH cu 50% i s-a numit concentraie eficient CE50
(mol/L antiox./mol/L DPPH).
VII.2.1. Studiul activitii antioxidante/antiradicalice
a inhibitorilor naturali prin utilizarea testului
cu radicalul DPPH
Din datele experimentale (Fig. VII.3) constatm c concentraia de DPPH este
stabil pentru majoritatea antioxidanilor la t = 120 min. Astfel, reeind din aceste date,
am construit dependena concentraiei (%) de DPPH la 120 min. n funcie de raportul
molar al antioxidantului i DPPH (Fig. VII.4).
DPPH', %
[DPPH'], %
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0.2
0.4
0.6
0.8
1
[Red]/[DPPH']
ENX
(+)-Ct
Cv
Rezv
DFH4
Eneox
[Red]/[DPPH']
EDMD
(a)
(b)
Datele obinute pentru CE50 sunt prezentate n Tabelul VII.2. Din rezultatele experimentale obinute observm c cea mai mic CE50 a fost pentru Eneox (CE50Eneox = 0,08)
i cea mai mare pentru Rezv (CE50Rezv = 0,5). O alt carecteristic mai ampl a activitii antiradicalice a reductorilor este puterea antiradicalic (PAR), care se determin
ca mrimea invers a CE50 (1/CE50). Conform datelor prezentate n Tabelul VII.2, PAR
pentru antioxidanii studiai variaz ntre 2,012,5. Cea mai sczut PAR s-a determinat pentru Rezv (2,0) i cea mai nalt pentru Eneox (12,5). Extractul ENOXIL are
PAREnx egal cu 6,7.
Valoarea stoechiometric egal cu CE100, determinat prin multiplicarea CE 50
cu doi, alctuiete concentraia eficient necesar pentru reducerea a 100% DPPH.
n acest caz, clasificarea eficienei antiradicalice nu va fi corect pentru compuii ce
au un comportament de cinetic lent, fiindc reacia poate s nu parcurg pn la
capt.
192
n Tabelul VII.2 este prezentat pentru toi reductorii studiai valoarea stoechiometric care variaz n limitele 0,2-1,0. La fel, s-a calculat mrimea invers a CE 100
(1/CE100), ce determin numrul de moli de DPPH care pot fi redui de 1 mol de
reductor.
Tabelul VII.2
Clasificarea eficienei antiradicalice n acord cu comportamentul cinetic
Comportament
cinetic
Compui
Concentraie
eficient CE50
Valoarea
stoechiometric CE50 x2
PAR
(1/CE50)
Nr. de moli
DPPH redus
(1/ CE100)
Comportament
de cinetic
rapid (1 min.)
Rezveratrol
0,5
1,0
2,0
1,0
ENOXIL
0,15
0,30
6,7
3,3
Eneox
0,08
0,16
12,5
6,25
0,10
0,11
0,11
0,15
0,20
0,22
0,22
0,30
10,0
10,0
10,0
6,7
5,0
5,0
5,0
3,3
Comportament
de cinetic
intermediar
(5-30 min.)
Cvercitina
Comportament
(+)-Catehina
de cinetic
DFH4
lent
EDMD
Conform datelor cuprinse n Tabelul VII.2, pentru compuii care au un comportament de cinetic intermediar, 1/CE100 coincide cu numrul de atomii de hidrogen
sau grupe hidroxile, disponibili pentru redare. Pentru cvercetin, (+)-catehin 1/CE100
este n jur de 5, astfel o molecul de (+)-catehin reduce cinci molecule de DPPH,
ceea ce coincide cu numrul grupelor hidroxile ce particip n procesul de reducere
(primele dou etape sunt indicate n ecuaia (VII.4)):
(VII.4)
193
80
Gradul de inhibiie, %
Gradul de inhibiie, %
100
80
60
40
20
60
40
20
0
0
0.1
ENX
0.2
C[Red], g/L
0.3
0.4
-4.7
Eneox
-4.38
-4.06
-3.74
-3.42
lg[Red]
(+)-Catehin
(+)-Catehina
Cvercetin
Cvercitina
DFH44
DFH
EDMD
Rezveratrol
Gradul de inhibiie, %
Cvercetina
195
Prezena grupei
asigur o mare capacitate de donare a hidrogenului i
ulterior stabilizarea radicalului format. Potenialele reductoare ale inhibitorilor sunt
invers proporionale cu puterea de donare a electronilor. Un efect important asupra
proprietilor electrofile l are grupa carboxil.
Concluzii
Prin medota TEAC s-au demonstrat aceleai corelaii. Capacitatea antioxidant
determinat pentru reductonii studiai prin testul ABTS.+ n sisteme peroxidice
indic la proprietile reductoare ale antioxidanilor, care pot fi aranjai n urmtorul ir: taninurile > (+)-catehina > DFH4 > cvercetina > rezveratrolul > acidul
ascorbic > enotaninele.
196