Sunteți pe pagina 1din 45

Ro dic a Sirb u, Ticula Neg rean u-Pirj ol,

Iulinna Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupa

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CITIMIC{


FARMACEUTICI

PARTEA A V-A - mp
start
- in:
METODA CROMATOGRAFICA DE ANALIZL A steri

SUBSTANTELOR FARMACEUTICE Schema


eompune di
In partea a Y-a sunt prezentate metodele cromatografice de analize a care se adi
farmaceutice. Capitolul 12 cuprinde clasificarea gi descrierea metodelor c debitului, d
prezentarca m[rimlori gi a ecualiilor caracteristice unei coloane. Sunt de detector.
cromatografia de gazn CG qi cromatografia de lichide de inalti performanli IIPLC.
fiecare tehnicd cromatografici sunt descrigi detectorii specifici qi metodele de Prin
calitativi gi cantitativ[. intrcducere
Coloana c
moleculelot
CAPITOLTJL12 eluentului,
cele doul fi
CROMATOGRAFIA
SCOPUL STUDIULUI

Dobandirea cunogtin{e1or minime necesare pentru abordarea


cromatografice de analizd pentru ttiltzarea lor in studiile fizico-chimice realizate in
medicamentului.

CONSIDERATII TEORETICE

Separarea diferitelor substanJe dintr-un amestec constituie una dintre cele


importante probleme ale chimiei analitice. Cromatografra sebazeazdpe rcpetarea echili
Col
de repartilie a componentelor unui amestec intre o fazE" mobild, gi una stafionari. DatorilI
sunt introdt
diferenlelor in repartilie are loc deplasarea, cu vitezd diferitS, a componentelor purtate de fan
component
mobil5 de- a lungul fazei stalionare. Funclie de natura fazeTor se disting urm6toarele tipuri &
eluent. Im
cromatografte prezentate ?n Tabelul 12.1
cromatogra
Tabelul 12.1 Clasificarea tipurilor de cromatografie Tir
Fazamoblld Faza stalionard Denumirea tipului se numeqt
de
cromatografie respectiv. I
Lichid Lichid LichidJichid (LL) cantitatea <
Lichid Solid Lichid-solid (LS) component
Gaz Solid Gaz-solid (GS) Astfel pute
Gaz Lichid Gaz-lichid (GL) ecualii: v
reprezintd
in general, metodele de sepalare cromatografice concentrafi
se impart in doud categorii:
294

I
Rodica Sirbu, Ticula Negreanu_ptrjol,
Iuliana Stoicesc u, -Co}*
B ogdan $tefan Negreinu_pirj ol,
Elena Lupu
"r,
METODE $I TEHNICI DE ANALIZI FIZICO-CHIMIC,,{
A COM OR FAR]UTACEUTICI

- in prima intrd cele care se bazeazd.pe interacliunea


diferitr a componen{ilor cLr faza
stalionard (repartifie, adsorbfie, schimb ionic
aiafinitrte;, iu,
- in a doua, cele care se bazeazd pe mdrimea diferita a
componenlilor (exclu ziunea
stericd).

schema de principiu a unui cromatograf (LL


sau LS) este reprezentatd mai jos. El se
compune din: sursd de eluent, dispozitiv de introduc"r"
uiprobei,^coloani gi un jetector la
care se adaugd unnitoarele anexe: sursa. de eluent,
dispozitiv de m6surare gi reglare a
debitului, dispozitiv de introducere a probei, instrument
de ?nregis trare asemnalului furnizat
de detector.

Principiul cromatografiei este urmitorul: eluentul trece


introducere a probei, preia proba de analizat gi
prin dispozitiwl de
o introduce in
coloana cromatograficd. este sediul procesului de separare. "olouru cromatograficd.
moleculelor cu faza stafionari, componentele din
Din cavza interacliunii
amestecul de analizat rim6n in urma
de diferenlele care existi intre constantele echiiibrului
de ..p*iri" dintre
lllJl'J,1}!,?Jcfie

Fig'12.r.cromatografie de richide gi picul cromatografic

componentele amestecului separat vor ieqi din


coloand la timpuri diferite, dup6 care
sunt introduse de eluent in detector. Acesta transforrni
diferenla unei proprieteli fizice intre
component 5i eluent. intr-un semnal electric., proporiional
cu concentralia componentului din
eluent' inregistrarea graficd. a semnalului detlctorului ?n funclie de timp se nume$te
cromatogramI.

Timpul fo la care apare maximul unui pic, mdsurat din


momentul introducerii probei
* retenfie. qi esre o caracreristicd catitativd a componentului
::.:::::t:-:1T*:-1:^1,T"1:n sau aria iui, A, sunr
Illi_."i1'; componentutui din probd. se noteazd caracteri;;i;;;;;;i",i;;,;pd;nale cu
cantitatea i:i::::-1::]f cu t_ (rimp *;;;;'i**;'i"t;;i"";,;entul
si
inreraclione azd ct faza sralionarS parcurg distanla
:#r:.:::* :T ll p6na la derector.

Ut* unde L este lungim"u'.ltour"i.-;;;"Xdi;";;,;*"i:


:5l I =raportul
teptezintd
L/t*,
.. concentratia
., dintre
molard (cr) a substanle i in faza stalionard qi
concentra{ia substanlei in fazamobill (cr): K : c./c*
295
Rodica Sirbu, Ticala Negrean u-Piri ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefun Negreanu-Ptriol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMIC{


A COMPUSILOR FARMACEATICI

unde L este
Fracliunea din timpul de refinere in care o moleculd se gdsegte in faza mobil5 sc
componenti s
noteazi.cu R qi reprezinti probabilitatea ca molecula s[ se gdseasc6 infaza mobill, respectiv
fracliunea din totalul moleculelor care se afld in faza mobil[. I - R reprezinti resd se lege mirir
moleculelor care se gdsesc infaza stalionarS. La echilibru reiese c5: precum gi m
no{iune cupri
R \i il
gi selectiviut
c,\t,_R=\* +K\i=-l=-l-.R=urn=t{,ot}"
l-R-c,v* l+K! l+k I+K-3
!- Anali
1t IJ ee include m
YH 'u (12.1)
din prob6. in
unde Vr V, reprezintd volumul fazei mobile, respectiv stalionare iar k : KV./VM
gi mrmlrmare (
poarti denuu
raportul dintre cantitatea totali de substan![ aflatd" in fazi stalionard qi cantitatea total6
substanld aflatd ?n fazamoblld gi se numeqte factor de capacitate.
fua mobild -
h coloana en
Pentru o specie oarecare A afTati in amestec, factorul de capacitate knva fi: Faza
interstifiile G
_ k, _ K, _ tu_1u3 - f*
Ko\r. to eelorn co T
, -t* ^. e introdue
---a ll-M ti kA I{.u turo, - t* (t2.2) ifiroducere a
h incepunrl ,

Factorul de capacitate k este o funclie de parametri de solubilitate, in mloani cu r


cromatografiei de separalie lichid-lichid. Practic, in vederea oblinerii unei rezolulii maxr mleculele p
pe unitatea de timp, trebuie cavaloarea lui k s[ fie cuprinsd intre2 qi 5. Factorul de
ra$onard). E
c pentru o anumitd coloanl de separare este un parametru fiilizat pentru descn noleculele r
diferenlelor ce apat intre vitezele de migrare a componenlilor si se definegte ca fiind r &re posibilA
dintre factorii de capacitate ko $i kr, ai componentului B (care trece mai greu prin coloand) hgnrpurile r
A (componentul care se elueazi mai repede) aflali in amestec. Instm
componenli r
Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic Acest analizt
eficienla sau num6ru1 de talere teoretice. Cu cAt o coloand va avea mai multe talere
unitatea de lungime ctt atdt efrcacitatea ei de separare va fi mai bund. Numirui de talere
tecerea fiec
poate fi definit din cromato grama unui singur pic astfel:
iregistreazi
N : ltnio,l' : 1 6[tR/w]2 : 5,54[twNv tn)z (r2.3al &tectorului i

unde: f timpul de retenlie, o este dispersia aceleiaqi benzi in unit6,ti de timp,


este
valoarea segmentului pe abscisi rczultat din interseclia celor doui tangente prin punctele
(
inflexiune ale picului. N este un numdr adimensional. Aceeaqi valoarealuiNpoas Exist
oblinuti din volumul de retenlie Vz x t* qi dispersia o exprimatd in unititi de volum. pimd rad 1

de talere N este o misur6 a eficienlei intregului supotl al coloanei. O alt5 masura a e * lichide t(
coloanei, folositd curent in cromatografie este datd de inillimea unui taler H (i csE un gaz:
echivalenti a unui taler teoretic): tEe terya
:7tto12; H : LA{: ti matografi
N: [Vniov12 o'lL;H: tWzna ; (12.3bt
ftc5reia dir
R:2tp61-2tqa;/Wa +Ws in cadrul

296
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-Pirj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Hrjol, Carmen Elena Lupu

. METODE $I TEHNICI DE ANALIZI{ FIZICO-CHIMICI


A COMPU$LO R FARMACEUTICI

unde L este lungimea coloanei cu umpluturd. Pentru caracterizarea separabilitafii a doi


componenli s-a introdus noliunea de rezolulie, notati Rr. in expresia rezoluliei s-a cdutat si
se lege m[rimile ce caracteizeazd" propiet5lile termodinamice ale fazelor gi componen]ilor
precum gi mirimile cate caracteizeazi" dinamica proceselor din coloanS. Rezolulia este o
noliune atpnnzdtoare, conlindnd gi mirimile care caracteizeazd efrcacitatea coloanei precum
;i selectivitatea ei.
Analiza chimicd cromatografici este un domeniu mai recent al analizei instrumentale
ce include mai multe metode de separare gi totodatl de analizd a componengilor amestecului
din probi. in toate variantele, separarea precede analiza gi se realizeazi,pin'repetarea, de un
numlr mare de ori, a echilibrului de distribufie intre doui faze.IJna dintre faze este imobila gi
poartl denumirea de fazd stalionard (aflatd de regulE intr-un tub numit coloanl) iar cealaltd, -
-raza mobild - aflatd. in migcare, se deplaseazdprrn golurile primei faze. Separarea se petrece
in coloana cromatograficd, piesa cheie a intregii metode.
Faza mobild, denumit[ Si eluent - deplas6ndu-se continuu (cu vitezl constanti) prin
intrstiliile fazei stalionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a
z componenli ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separ6rii
i.'elor
- introduce sub form[ de solu]ie la inceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de
introducere a probei (de exemplu o microseringa), ;i se afl[ inilial fixat intr-o zond ingustd de
Ia inceputul coloanei. Spdlali de eluent, o parte din componen[li probei migreazd apoi prin
"-oloan[ cu viteze diferite. Acest lucru se datoreazd interacliunilor fizice specifice, dintre
nnoleculele probei Si faza stalionari (desigur, nu orice molecul5 poate migra pe oice fazd"
xationard). Efectul, este numit retenfie gi aceasta provoacl o aga-numiti migrare diferenliatd,
moleculele migrdnd in grupuri, in fiecare grup existAnd doar molecule de acelagi fel. Aceasta
frce posibil[ sesizarea componenlilor, pe rdnd,la pdrisirea coloanei, de citre un instrument,
in grupurile respective - denumite uneori zone.
Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai mulli dintre
r-omponenli ce ies din coloani qi care este plasat in eluent, imediat dup[ iegirea din coloanS.
Acest analizor, denumit detector este capabil si dea un semnal proporlional cu masa sau cu
concentralia soluliei de component in faza mobild. in consecin!6, dispozitir,ul, "marcheazd"
Eecerea fieclreia din substanlele ce farmeazd inilial proba, similar cu o fotocelul5 care
fuegistreaz6 trecerea concurenlilor la sosire in atletism. Reprezentarea grafrcd a semnalului
lui in funclie de timp poartd,numele de cromatogramd.

CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE


Exist5 numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele in
imul rAnd prin natura fazei mobile dar qi a celei stafionare. Astfel se distinge cromatografia
z lichide (CQ cnnd faza mobild, este un lichid, cromatografia de gaze (CG) cirnd aceasta
un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice \a care faza moblld este un lichid aflat
te temperatura criticd, In cadrul cromatografiei de lichide se mai face distinctie intre
romatografia pe coloand deschisd gi cea pe coloand tnchisd. Pe de altd, parte, in cadzul
fecdreia dintre acestea, distingem mai multe variante.
in cadrul CL, se disting, funclie de mecanismele de separare:

297
Rodica Sirbu, Ticula Negreanu-Ptriol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Piriol, Carmen Elena Lupa

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ,{ FIZICO-CHIMICi


ACOM OR FARMACEATICI

Cromatografia de adsorbyie, :utilizati pentru separarea substanlelor orgafiice Toate ar,


molecule de dimensiuni mici gi medii pe adsorbenli, ca silicagel gi alumini, folosi
pin perfora
se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solvenli organici.
sticard {HFI
Cromatografia ionicd (de schimb ionic), care se petrece pe o fazd stalionard soiidl
in rn.
poroas5, formati din materiale specifice - schimbdtorii de ioni - substanle cu o
4rrrrnitfi prre
solide afrnatd, de natur6 organici sau anofganicd, pe care se g6sesc grefara-
t Cro;.
procesul de oblinere, centrele de schimb ionic. Cele mai rispAndite sunt u!1 5L

schimbdtoare de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul orgauic -


rilITgi_I

polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacfie ionici (numitl reaclie de sfi coafe
ionic) inke substanla din solulie (electrolit sau neelectrolit) qi funcliunea t Cr'R
chimic de suportul solid,. 5i ],a
Crontatografia de excluziune stericd, se desfiqoardpe faze stalionare poroase dn xh-:
Frza qs,.
porozitatea seleclionatd astfel incAt sI corespundi dimensiunilor moleculelor
separdrii. O parte dintre molecule intrd prin pori, reugind si interacliofleze cil fril:*
solid, prin for{e de adsorb{ie foarte slabe, iar altele sunt excluse ryE',@
practice nerelinute odatd cu faza moblld. Se obline astfel un gen de siti h Etcis
molecular, sepalarea moleculelor fbcAndu-se funclie de dimensiune. Tehnica &ln
intAlneqte qi sub denumirea defiltrare prin geluri salr permealie prin geluri
natura apoasd sau organicd afazei mobile.
Cromatografia lichid-lichid (LLC), in care faza stalionari este a fazit
nemiscibilS cu cea mobili qi imobilizatd pe un supolt solid, intr-o colod- l,;
suportul solid este, cel pulin principial, inert fa!6 de componentele din prob6- s:fl
rpq*
simpla impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea spdlarea acestuia
I
s-a recurs lalegarcape cale chimicl a acestora de suport, oblin6ndu-se ni,ae
totul specifice - faze stalionare legate chirnic. Molecule organice de di ri
sunt, prin sirfiezd,legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prir s
cdtre faza mobild, fiind practic anulat. Aceasta tehnicd este cea mai ailI
devenind aproape sinonimi cu cromatografia de lichide.
Cromatografia pe coloand deschisd sa:u cromatografia planara (PC), SE
grup de tehnici inrudite cu cele din LC, care au toate in comun faptul cd fa.z
m
circuld printr-un material poros dispus intr-un plan 9i formAnd un strai relatir
thr
dar de compozilie asemindtoare cu cele men{ionate la cromatografia pe rr
disting:
crornatogafia pe h6rtie, tehnica in care faza stalionar6 este o hartie
celulozd (ini1ial o hartie de frltm) care este i,rjgata- de solvent prin forle
tehnicd, azi, cu valenle istorice.
Cromatografia pe strat subyire (TLC), in care faza sta\ionari pulvemlenri c
de suportul plan (sticli, aluminiu, material plastic) cu un liant, formi:xi
sublire (0.1- 0.5mm) irigat prin capilaritate.
Cromatografia pe strat sublire de inaltd performanld (HPTLC), in care fa-r:
are granulalie foarte finb cu rezttltate in eficientizarea separdriior der ;
viteza acestora.

298
Rodica Sirbu, Ticula Negrean u-Ptri ol'
Iuliona Sloicescu, Bogdan $tefan Negreanu'Pir.iol, Carmen Elena Lupu

METODE SI TEHNICI DE ANALIZA FTZICO-CHIMIC{


ACOM. ORFARMACEUTICI

Toate acestea se caracteizeazd prin simplitate, accesibilitate ;i prel de cost scdzut dar 9i
prin perfonn ante ceva mai slabe decAt cromatografia de lichide pe coloani Ia presiune
ridicatd (HPLC), varianta modernd a l,C.
in mod analog, in cazul croruatografiei ele gaze (sau cromatogafia in fazd gazoasd),
denurnitd prescuriat CG se disting urmitoarele teh:dci:
* Cronrctografia gaz-lichid in care faza stalionard este un lichid nevolatil imobilizat pe
un supofi solid. Aici supofful poate fi granular. poros, situat intr.o coloand in aqa-
numita cromatografie de gaze convenfional5 sall chiar pe pere{ii coloanei,
confeclionati de dimensiuni capilare,in cromatografia pe coloand capilard.
c Cromatografia gaz-solid este analog[ cu cele discutate Ia cromatogra{ta de adsorblie
qi la cea de excluziune steric6 cu deosebirea ci schimbarea gaz:ului nu modificd
selectivitatea.
Faza sta{ionar6 o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv "sitele moleculare"
nigie silicali naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem
1e imporlanti pentru separarea gazelor permanente (CO, COz, Oz, Nz, gaze nobile etc.)
Evolulia cromatografiei a cunoscut o suitd de progrese, care au adus-o din situalia
-il1ia15 de metod6 de separare qi purificare de laborator la o tehnic[ de separare qi anaiizd
:himrci cu o arie de aplicare aproape universali. Cromatografia de lichide pe coloan6 a fost
':trodusi in 1903. Metoda a fost uitatd ins6 multa weme qi abia dup[ 1930, anul descoperirii
:romatografiei in strat sublire pe alumin6, s-a perfeclionat, datoritd nevoii de separare 9i
:urificare a compuqilor organicfnaturali sau sintJtici irnpliea{i in biochimie. in 1941 englezii
l,Iarlin qi Synge descoperS cromatografia de repartilie pe h6rtie, reugind si separe cu ajutorul
;rui arnestec de solvenli aproape toli aminoacizii, descoperire extrem de importanti pentru
::zvoltarea ulteriorl a biochimiei. Doar in 1952, aceiagi A. J. P. Martin and R. L. M' Synge
.r inlocuit faza mobild lichidd cu un gaz, realizdnd pentru prima oari cromatografia de
:partilie gaz-lichid. in aceastd variantd, deteclia a fost realizatd fizico-chimic, in efluentul
::zos, dupi ieqirea din col,:and, reugind astfel sd imbunitifeasc[ marcant separirile. Acest
:oment a insemnat demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi unele din
:incipalele mijloace de analizd in chimia organicd qi biochimie, dar qi ?n criminalisticd,
_:ien5, controlul alimentelor, controlul cafitelii medicamentelor
.

Din anul 1968, s-a pus la punct CL folosind un solvent sub presiune in calitate de fazd
:,:bili gi deteclie fizico-chimici in efluentul lichid, aceasta fiind inceputul dezvoltdrii
.:cmatografiei de lichide sub presiune inalti (200 atm). Din anul 1980, s-a reugit qi oblinerea
-:ior separdri analitice performante bazate pe schimb ionic - prin introducerea eluen{ilor
-..ua1i gi a supresoruiui ionic, tehnicd care de atunci a primit denumirea
de croruatografie
.,ic'd'(IC).Azi se luqeazd nu numai crr cromatografe de laborator, analitice, ci qi cu
::.rmatografe de proces, dedicate analizelar automate ale proceselor industriale sau
.:lmatografe preparative, destinate oblinerii de substanie pure in industria fatmaceuticd sau
-- biotehnologii.
in oriie tip de cromatografie detectorul di urr selnnal proporlional, uneori cu
.:rcentrafia, alteori cu masa componentului aflat in celula de misurd, semnal ce poate fi
:egistrat funclie de timp. Diagrama semnal, funclie de timp sau de voiurnul de eiuent se
-
-rne$te cromatograntd.Pe cromatogram[ distingem o serie de maxime,
numite picuri {peak
'.. englezd), care se produc deasupra liniei de bazd sau a porliunii orizontale a curbei.

299
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-Piri ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Piriol, Catmen Elena Lupu

METODE SI TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICA-CHIMICA


A COMP FARMACEUTICI

paraleld cu axa timpului. Aceasta apare ori de c6te ori ?n detector nu apare nici un . Yol
in afara eluentului evident. (lee
I
x(D
c 'E" ' Tim
timt
HA dife
E*r

i l*
#t* ' Cor
:i..,:":'
.' ',f i, ,,".: .:1
voh
Pr0l
tubr
Titu$
fVnh*u tl* retenfic)
F ig.ll. 2. Elementele unei cromatograme

Oicare pic are, in caztl ideal, forma distribuliei normale Gauss. Sd considerfu CR
mai simplS cromatogramd posibilS: cazul introducerii unui singur component, intr-un gaz,
ce conline urme de aer - aerul {iind un component inert. Aspectul acestei cromatograme Asp
cel prezerrtat in Fig.12.2. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de reprezentar
scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a coordonaE
semnalul detectorului - in unitSliarbitrare. Distingem urmdtoarele elemente debazd:
. Picurile cromatografice.lncaztilprezentat in Fig.12. 1, cele doud semnale sau y{:
sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile in analiza calitatiti
cantitativd in toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde undep-or
'' component inert (aerul de exemplu in CG) - care nu este relinut de ioc - iar cel eorespundt
doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic in caztl de falir) al care reprez
considerate gi este datorat moleculelor care se distribuie pe parcwsul migrarii elulie. Vak
coloani intre faza mobil5 Ei cea stalionari 9i care, in consecin!6, ies mai tAran
coloani.
. Timpul mort, ty1- este timpul in care un component, complet nerelinut de citre
stalionar6, parcurge coloana qi tuburile de legitur[ pindla detector. Acesta nu poa&
zerc. in cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retenlie al aerul
tM : tR (R: Retenlie). Deci, cu alte cuvinte, reprezintd timpul scurs de la inj
(introducerea) probei in coloand gi aparilia maximului de concentralie ?n
pentru componentul nerefinut.
. Timpul de retenlie, tR - o mdrime caracteristicd pentru fiecare componeflt
amestecului separat de coloand - reprezintd timpul scurs de la injectarea prohi
apanlia maximului de concentralie in detector. De exemplq in cazul
anterior, in Fig.l2.Z, acesta este distanla de 7a axa ordonatelor (
cromatogramei) p6na la vetticala prin vArful picului C. Acest timp, pentnr
F
component gi o coloand, date (plus condilii experimentale) este constant, indi
dr
daci componentul respectiv este singur sau in amestec.

300
Ro di c a Str b u, Tic uya Neg reanu _ pirj ot,
luliana Stoicescu, Bogdan
$tefan Negrei""_it irt, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{


FIZICO-CHIMIC{
A COMP a$rlo4 FARMACE aTrcr

' Yolumul de retenlie, vR este volumul


de eluent corespunzator timpului
de retenfie
(legat de timpui 1r prin intennediut
a*Uitutri
"i_;;r;i; f;j,
Vp: rp.F6
$2.aa)
' Timpul de retenrie ajustur, tR'- introdu^s
in cromatografie penku a se putea compara
pe eoloane diferite, in ,ur.,i ur*iu;;;i "."-ponent
lffi**uturali - este dat de
tB':tq-ttv{ (12.4b)
'
i:;:::;ff::,?;:Y...:i.:: :?: !: ytenli1ajyst\t, vR' : vn - vu unde vy esre
;?':#:,:i;:,':T:l#'1T,T:i-,--t'::;ffi.";;.;;i;lit"il;il,iJ"ffiJf JJ;:',I
j:ryllta,of umul golurilor dt; :ff;a"ill] ij;r#
lilff-1.]'r"Iil;
tuburilor :ii ::,
de legdturd de la coloana
^u: k Jeteci r..

CROMATOGRAnIE T$EALE gI ${EALE


Aspecful unui pic dintr_o craneatogr*ned
*::..zentarea ideald este aceiaqi cu curba obfinutd
graftcd. a funcliei de ctistribrilie prin
a erarilor {GaLrss), a cdtei expresie,
,:jonate carteziene x,y este: serisi ?n

3'{x.pq*}:-+-**ry-ts-}r}t }
o,\E; -'u't--lIr,i: y-(x.0.11 o x2.
: -5-expq-::-1
Y_ rr t12.5)
i;
-: u - o constantd - simbolizea zd media dishibuliei;
in cazulcrornatografiei aceasta
-"punde chiar
timpului de retenlie, iar o - abaterea
': -iprezintd distanla standarJ a Jlstriuuliei - tot o constantd
pe axaabsciselor cle la maxlm iu prr.iJ
-,
-'/aloarea J. irrR.^iune ai curbei de
o rei'reeti chiar r[rgirea picurui ra trecerea
u.".toiu prin coroan6.

Fig.12.3. Picuri reale a c.dror aparifie


se datoregte izotermelor de adsorblie;
depSgirea domeni,rui liniar ar roroun"i ut*gdupr sine apari;iaasimetriilor

301
Rodica Sirbu, Ticula Negreanu-Ptrjol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ/T FIZICO.CHIMICi


A C OMP U$ILO R FARMACE U TICI

Picurile reale nu respecte intotdeauna forma gauss-iand din mai multe motive. Pe c.:-
patte, coeficientul de distribulie K nu este constant la orice concentratie iar pe altd p",--
existd qi diferenle intre viteza eluentului transversal prin coloand (in vecindtatea per-: *
aceasta este practic zerc pe cAnd la mijloc este rnaximd).

naAnrul $r ECUATTT CARACTERTSTTCE UNEr COLOANE


CROMATOGRAFICE
Factorul de retentie, Rp , reprezintd raportul, subunitar, dintre vitezele de dep-,;-l
prin coloani ale unui component gi ale eluentului. Cum vitezele amintite se pot calcu-" *:
raportul spatiului parcurs in unitatea de timp, lungimea coloanei fiind notatd Lcor. . .:
conform definiliei:
Loo:
tF' -t:r-\"X
nr- _-
L:o: ta \-i
; (12r,

Coeficientul de distribulie,K (sau Kp) este o mdrime identicd celei din extractie (re:. , -riir.

intre faze) definit intotdeauna prin rapoftul dintre concentraliiie componentului in ch=,--:urr
din fazele stalionard, Cs, respectiv mobil6, C,vr. Conform definiliei (dupa Nernst): F i ---
',il

K: Cs/Cv (1t -
In cazul cromatografiei de adsorbtie, acesta a fost denumit coeficient de adsc,.'' :,
cazul cromatografiei de schimb ionic (denumitd ulterior cromatografie ionicd), coefici.
distribulie ionicii iar in cadml cromatografiei de excluziune stericd coeJicient tle clifit:.:. .

Factorttl de cctpacitale, k (notat in tratate mai vechi k') se definegte ca raporlul dintre :.----nu
de moli distribuiti intre fazele: stalionard, respectiv mobild. Numdrul de moli : - *;;
sta{ionard pot fi exprimali prin produsul Cs'Vs iar din cea mobild Ctr'Vv unde cu C s-.- - ,;uur

concentratiile molare gi cu V5respectiv V1a s-au notat volumele fazelor stalionari :::t": "''
mobila - din coloand, volumul ultimei fiind egal numeric cu volumul morl ai : --*l
Ecualia de definilie pentru k este aqadar:
,il- -. r'

k: Cs Vs / Cur Vr,l (l: ri""


lllP _-'.._. t-
llilirrliif -:
in ultimul timp a primit gi denumire a de .factor tle separore. Acest factor e Sri : --. Ml

timpul de reten{ie, respectiv de ce1mofi, printr-o ecuatie simpii: ,.* :"

tB: txa(1+k) ( ,1
i_*-
!

Deci, cu c6t factor-ul de capacitate este mai mare coloana reline mai Fr!.:- luiltfi

component iar timpul de retentie cre$te. Pe de altd parte, din ecualia anterioar::: r,ullmtr
obsen a cd, dacd k : 0 atunci tn: tr,r.
ffinF,h"4

302
jlodica S{rbw, Tieu{a Negrean a_ptrjol,
'Ixliana stoicescu, Eogda* $t.fitn Negrei*u-Ftryot, carmen Erena Lupu

M E TO I}E $i TEETNICT frE,ANALTZA FIZICO, CHIMICA


{g uP_yg$q 4 {48 y49.9!2!gL

, ::r'u ;ieterminarea praetici a valorii k se exprirnd


aceastd mirirne dirr ecu-alia r1e mai sus ryi
.:<i cont de ceie amir:tite *nterior, anllrne: tp'= ts* t14, se
obgine retralia cle calcul:

k: tp-'/t1a 11? 10\


':itti{t !"eidti',,it, a., a rnai f,ost rtrenumit5
gifactoru! cie separilre decarece, cu cit valcatea
.:i:iiir esi:: mai mare cu at6t poz_iliapicurilor pe aceia5i eromatogrami
.. :epararea pe coloana respectivd este rna-i neti. S_a ccnstatat cd este mai Cistaalati
_

-:rifientale este 0u mult i::ai rerjusd irrfluenla variabileior


dac6 se t$-ilizeaz:a pentrr: expriararea retrentiei aceastd
.riie leiati.rd.
Pentru caicului acesteia trebuie efectuatr mrsurarea, a-t6t pentzu compo*entetre probei
'i; pentru * substanl6 consideratd eratrcn {sau standari; a trmpulu; (sau volumului)
de
:'rfie, in condilii absolut identice. De rnulte ori substanga etalcn
este pane a prcbei gi nu
: addugat6 intenlionat. Retenlia relativr se poate expdma astfer:

o2lr - tRi r (tnl).,a - K.21Kr (12.1 1i

-- -: K2 $i K1 sil1ri coeficienlii de distribulie


{vezi expresia K de r:rai sus) ai substantelor 2
:: ':ectiv i
1" ii:r cu s-a notat substania etalon
istandard). Substanleie ,";**;;;;;
i'J eaiitate
:': :ibstanie standard in GC, in vederea caicularii reteniiei relative, sunt
n - aicanii.

.-:sia i;aractenzeazd performania coloanei qi se poafe


caicula din raporfui:

H: L"orA.tr (r2.12)
:= cu L".1 s-a notat lungimea coloanei iar cu N numlrul
de talere teoretice. Cu cat valoarea
:sle mai mare separarea este mai bund. Numdrul n se poate
calcula pebazacro*utogru*"i
:::irte experimental din lilimea picului
rrr r.Lrrrr(rd pruurur Ld
rabazd, *0, care dupa
oaza) wb, dupi cum se vede
vede dinFig.LZ.2,
dinFig.Ly.2
: de 4 ori valoarea dispersiei curbei gaussiene eare"ur" modele azd matematic picul, ceea ce
:eite scrierea ecuafiei:
Rodica Sirb u, Ticula Negreanu-Pirj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefdn Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMICI


A COMPASILOR FARMACE UTICI

N: tx.2ls2 (12.14)
Acest raport reprezintd p[tratul numSrului de picuri ce ar inc6pea pe o cromatogrami fu
intervalul corespunzltor timpului tp, picurile fiind separate toate doar parlial (de exemplu
cele cu rezolulia Rs: 0.75.
Deci, cu c0t numdrul de talere este mai mare cu atAt vor "inc[pea" mai multe picuri pe aceeagi
cromatogram[. intruc0t se pot separa mai multe componente, separarea picurilor, dou[ cite
dou[, va fi mai net[, considerdndu-se astfel coloana mai eficientd.
Rezolulia, simbolizatd Rs, este mdrimea ce exprimd gradul de separare a dou[ componente
date de pe o cromatogram[. Pentru componentele oarecare A qi B aceasta se exprimi prin
raportul:

R.s:
&te. -- &t*
t{*s +*n} A (12.1s)
Prin iniocu
unde Atp este diferenla dintre timpii de retenfie ai componentelor B gi A adic6 Atn: tn,e - tx.a,
iar w y2reprezintd ldlimea medie a picurilor la bazd, w yz: (wa + we)/2.

ECAATIA LUI VAN DEEMTER


Pen
Aceasti ecualie exprimd contribulia diferililor factori lamdnrea zonei unui anumit experimenl
component, in timp ce acesta migreazd prin coloani cu o wtezdmedie v. Inilial crea6 ca frcfindu-se
model matematic pentru CG, ecualia poate fi generalizatdpentru oricare tip de cromatografie, eluentului.
dupi cum s-a constatat ulterior. Aceasta, conline expresia analiticd a valorii in[Uimii umpluturii,
echivalente a talerului teoretic - H - funclie de vitpza liniari medie, v, a eluentului de-a lungul longitudinr
coloanei. Cea mai simplE qi cunoscutd expresie este cea descoperitd inilial de Van Deemter constant ir
pentru cromatografra de gaze'. cinetica pr
fazei stafio
H:A+B'v+C/v (t2.16) ME
a scurta an
a pictrrilor,
unde A, B qi C sunt, pentru o coloani dat6, constante. Dar acestea au tn realitate frecare, mai depart
dependenle funclionale ce lin de natura fizicd a fazelor stalionard gi mobild, de diametrul qi de cauza celat
natura umpluturii, dar qi de condiliile de operare: temperatur[, presiuni etc. in,
Graficul acestei ecualii este o curbi cu un minim (vezi Fig.12. 4), adicd, o ramurd a mai pulin r

unei hiperbole ce trece printr-un minim. Se observd cd inillimea talerului, H, are un optim gazelor, dt
pentru o vitezd care se poate calcula. Anume, prin derivarea ecualiei lui Van Deemter gi Deemter et
egalarca ca zer o a r eniltatului derivdrii, se obline : in
coloanei e
{.- de retenlie
Y r{
E (r2.17)

344
llstlic * S?ritu, Tir:utc h egreenu-?trj ol,
l:,!i;;tl: Srititr:;cu, Be.qd.:t,; ,ffeji;ti 7ci;ri.$iln-?it".iol, {ar:ncn Eieta Lulttt

:ui E 7' E Lt E 5.{'i E ii.: t- ! t {


il E I N. 4 l- I Z A i: i Z I {: C - { fi I ni I t: i
-

. * __ - - _ _ - - *-_4S
s!_!l !;_trL 9 8-{A R M A C: E t r r C r t

$t

-* E:-' -*

-i..t'"'

Fig.12.4. Ecuatia lui Van C.*n tJ,

Piin i:ilocuirea valorii v cu vopt ?n ecualia iniliala se obtiile optirnul pentr"u H (adici minimul)

H*;-:Atir,6f (12.1 B)

Pentru v oirt se reailzeaze cleci eficienle maxim[ a co]oanei. Valorile;\, B gi C se oblin


.riperimental drn graiicul crynsiruit in coordonate simil*re celei ciin Fig.12. 5 sau prin calcul
:IcAndu-se mai multe detennin6ri de indilime a talerului teoretic l{ la diyerse viteze rnedii ale
:lr.rentului. 'I'ermenul A, constant, legat de difuzia rurbulent6 qi implicit de geometria
rmpluturii, este pra-ctic constailt ?n1r-o coloanE. Termenui B este legat puternic de difuzia
,-rngitudiriala. deci mai ales de coeficientul de difuzie ir gazul pufietor - determinant, dar
-onstant intr-un moniaj insii-umerrtai dat - iar lemenul C de transferul de mas6, a$adar de
-iueiica procesrtiui de fixare a Lrompont:ntului pe faza stalionarS. deci iegat direct ele natura
'1,:ei siationaie , respcctir. de sDecia rtoiecular[ care migrea zd, prin coloand.
${iilitrd viteza elitentui'.ti, in iritentia de a grabi ie;irea din coloand a componentului gi
-.ctuIa analiza, Ce cele rnai multe ori perlurbim separarea in ansamblu prin ldrgirea,excesil.i
,, p'ictirilor, deoarece eehiiibr-ul dintre Cp15i Csnu se realizeazd,,iar picul este spiilut.de eluent
'rai departe prin coloan[. Din coni;:ii, micqorAnd vitez.a prea mult, upu.* o largiie excesiva
din
-:uza celor doud difuzii, mai ales a celei in fazd gazoasd, care de asemenea strici separarea.
in cromatografia de lichiCe porliunile liniare crescdtoare, de dupd minim, au pantele
:rai pulin abruptedatoriti diftiziei infazd, iichida cu mult mai lentd in lichide decat in cazul
:azelor, de circa 1000 de ori. Astfel, contribuiia prirnilor doi termeni din ecuatia lui Van
leemter este mult diminuatd gi in generai llrgirea zonei in LC are valori mai mici.
irr cazul cromatografiei de gaze cu coloanl capilari s-a demons1at cd eficienla
-.rloanei exprimatl prin indltimea taleruiui, H^ este influenlatd de factorul de capacitate (sau
--' retenfie) k precum gi de raza coloanei capilare, r:

+tr 1k:
Hru :r'
(t2.19)
Rodica Sirbu, Ticaga Negreanu-Pirjol,
Ialiana Stoicesca, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZI FIZICO-CHIMICI


A COMPUSILOR FARMA CE UTICI

Se poate remarca cd" valoarca H este ct atat mai micd cu cdt taza, r, scade.
Op
Coloana 4,
CROMATOGRAFIA DE GAZ[, (CG) dispozitiv p
c:rre mai es
Aceastd tehnic[ cromatografic5 este printre cele mai rdspAndite gi totodatd este prirna ermostatart
dintre metodele de analizl cromatograficl, aplicatd"pe scard largdin analizele chimice. in"
Compugii amestecului supus separirii nu trebuie sd fie neapdrat gaze, ci pot sd fie qi lichidc coloan6 de
sau chiar solide volatile. Substanlele de analizat se introduc in coloana de separare, la o hmperatua
temperatur[ potrivitd, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a probei. Singrrn mmPorede
restricfie este temperatura de vapoizare care uneori poate fi mai mare decAt temperatura & Golecteazi s
descompunere a substanlelor de analizat. in aceste cazui se poate recurge la alte tehnici rgmfl
cromatografice care au ca eluent un lichid sau fluid supracritic. De asemenea, se mai pot Aaea
rcaliza, inainte de introducerea probei in cromatograf, nigte derivali (compuqi noi), volatili, citindri de
ilJ:ilizdnd anumite reac,tli chimice specifice, procedeu denumit deivahzarc. Uqurinla cu care laborator. G
se pune la punct o analizd. noud, sensibilitatea sa, posibilitatea de artomatizare precum gi plejudicia fi
largile posibilit5li de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile reducerea or
in care CG qi-a cucerit un loc de prim rang sunt: industria farmaceuticd,, proteclia mediului pot utiliza Ei
igiena qi criminalistica. Spre
importanf5 r
CROMATOGRAFUL DN GAZE componentel
gazele gi se
Instrumentul care realizeazd, separdile gi totodatd analiza in CG poartd numele de regleazl cu i
cromatograf de gaze. Functionarea acestuia se poate inlelege urm6rind schema din Fig.12. 5
cu aga-mrmi
domeniul 0.
pistonul, se i
din dispoziti
0.5m1, fie nrt

DisW
a plovoca l'(
coloan[. Act
F i9.12.5 a G az Cromatograf KoniK HRGC 40008 Fig.12.5b Schema de principiu a unui coloanele cu
cronratograf de gaze dispozitive cr
incdlzit6., int
In aceastl schemd sunt prezentate doar componentele principale. Astfel gazttlpurtdtor de ridicatE p
(eiuentul), de exemplu hidrogenul sau heliul, pdriseqte cilindrul sub presiune, l, in care sus al dispoz
acesta se gdsegte inilial gi pdtrunde in coloand, la o presiune de intrare, de 1- 3atm, prin pastild din ca
intermediul unui reductor 2. Gazul se ramifici, apoi (op{ional) prin doud conducte. al.dispbzifivt
306 unei garriituri

t^
Rodic a Strb u, Ti c uta N e g re an u-ptrj o l,
Iuliana stoicescu, Bogdan $tefin Negreanu-ptrjol, carmen
Elena Lupu

LIETODE SI TEHNICI DE ANALIZ,,T FIZICO.CHTMTC,,i


A COMPU$ILOR FARMACE LTTICI

o parte intrr in coloan6, in mod conlinuu iar cealalt[ ramura, direct in detector.
loloana 4, se afld' intr-o etuvd - termostat, 3, izolatd
termic ai prevdzut[ in exterior eu un
-ispozitiv pentru introducerea probei (care de regulr include gi o microseringd),
notat,s, etuvi
' are mai este dotatd in interior cu un ventilatoi v qi
cu un disporitiv electric de incdlzire -
,:rmostatare, R.
in coloana cromatograficd se produce separarea probei. Aceasta se introduce
- rloani doar dupd ce instrumentul este in regim de funclionare in
-:mperatura continui qi a fost adus la
de lucru' Dypa c-e_prrlsegte co,loina 4, gazulpurt[tor
intrd, antrenAnd pe r6nd
':mponentele separate, in celula de misurd din dete-ctor de uncle iese in
rrorf".a"iuf .J
-iecteazd separat. Faza rnobild in aceastd tehnicd este un guz "t
::QOIIUl.
hiarog.rrl h;ii;i, azotut sau
Aceasta poaie fi eliberati, prin intermediul unor ventile gi regulatoare de presiune,
din
' lindri de gaze presurizate, fie oblinute.din generatoare-(caztl
Nz sau Hz) - direct in
''5orator' Gazul nu'trebuie sr conlin6 urme de1pE, oxigen sau tlioxid de caibon care pot
::ejudicia fazele stafionare. De aceea se mai intercileazdirltr"
.u auutu rot- u*u.", i"*p".tiu.,
' Jucerea oxigenului, dispozitive situate imediat dupi sursa ,Je gaz.
rn cantiexceplionale se
- i utiliza gi alli eluenli cum ar fi COz, Ne etc.
Spre deosebire de cromatografia cu lichizi, in CG, natura gazului
:'portan{d minord asuAra selectivitrlii separErii-eluenli are o
deoarece gazul,practic, nu inteiaclio meazd. c,t
' ' rtponentele probei sau cll suporlul. Desigur cd viteza
Jptima nu este aceeagi pentru toate
-'zele 5i se stabile$te p.e baza ecualiei Van Deemter. Prlsiunea de la caprtul
'= tleazd coloanei se
cu ajutorul unui regulatol de presiune rgi r.entil u". lrrt
oou."r", p.ob.i se redizeazd
- - e$a-numiteb seringi microrne)trice (Fig.tz..a1,
in cazul probelor care au volumele in
-"meniul 0'1-10p1' Cu acestea, ayni umplerea cu volumul de probd necesar,
aprs6nd
: stonul, se injecteazr conlinutul pria cauciucul siliconic sau garnituia
inelard
:r dispoziti'ul de introducere a probei. penrru gaze sefoloseJc ""i;;;;;;
i;;;;;;;^;""J,iri*"ri,
!r',1, fie nrr$te dispozitive speciale nurnite ventile pentru a"
in8oducerea probei.

Fig.12.6. Aspectul unei seringi micrometrice folosite in


GC

Dispozitivele penftu inieclie au rolul de a permite introducerea


seringii qi totodatd, de'
I rrcvocil volatilizarea probei in curentul de gaz purt6tor cat mai aproape'de intrarea in
- "oan6' Aceste dispozitive sunt diferite in funclie de coloanel e utilrzati. De
exemplu in
- "oanele cu umpluturd
9i cele capilare, cu ciiametre de 530pm - wide bore, se folosesc
- 'pozitive cuvolatilizare direct6. Aceste dispozitive (Fig.12.7j au toate o insertie
din sticl6,
: -ilzitd, introdusd intr-un rub prin care rrece gazul purtdt or,
uiu, tu-r;;il;ffi;; Iufficient
:. ndicatd Plntru a permite
1-olatihzarca prsbei simultan cu injectareu u"ir*iu.-Lapet,l de
al dispozitiwlui din Fig.12. 5, situat in afaracromatografului,
"-'
: -'ti15 din cauciuc siliconic care permite pdtrunder"u
conlin un rip,ru*. adica o
"
u"ului asculit al seringii. celdlalt capdt
* Jispozitivului este legat la coloana cromatograficd prin intermediul unuiiacord
filetat gi a
--:i garnituri. Astfel, imediat dupd injectarea piobei, aceasta pdtrunde ?n capul coloanei.
3A7
t

Rodica Strbu, Ticuya Negreana-Piri ol,


Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreana-Ptrjol, Carmen Elena Lupa

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ,i FIZICO-CHIMICI


A C OMPUSILOR FARMACEATICI

Domeniul dir
concentra{ia (

Septum Acest
care apar at
experimental
-Sertn&fl de componenr
Existi
*ac mai ridicat dr
purffit*r Iflsrtl{
practica eur
ccnductibilita
f,otoionizare (
detectori aco
cromatografel

Ta
Fig.l2.7. Dispozitiv de injeclie simplu folosit adesea in GC
-C*loan*
Pentru coloane capilare, care au debitele mult mai mici iar volumele introduse in
tr"t*t*
coloane deosebit de mici, introducerea cu o seringd a probelor, direct, ar compromite coloane I FID-cu ic
IECD-cr
definitiv. De aceea se folosesc nigte dispozitive speciale cu ajutorul cdrora doar o mici 1,.
I elcfforu
fracliune din probd, cunoscut5, intr5 in coloan6 iar restul este evacuati in atmosfer6.
Dispozitivele se numesc split/splitless iar fracliunea de probd introdusl efectiv ?n coloan6
mD-*,
reptezintd UZA pdnd,Ia 1/500 din volumul injectat cu seringa. l.ilNPn - c
ronica
Incinta termostatati in care se afld coloana, numit6 etuvd-termostat, are temperatura
FPD - fla
reglabil5 intr-un domeniu larg (4A-45A'C) frind foarte precis stabllizatil (+0.1'C) qi totodati
ventilati, pentru o stabilizare rapidi a temperaturii. La anumite cromatografe, se pot efectn PID
gi anumite incdlzin controlate ale coloanei, ?n timp, pe parcursul efsctuirii analizei. Are lc fotoioniu
in acest fel o volatilizare treptati" a compugilor - la inceput ies cei volatili care migreazd raprt
qi la urm6, cei mai pulin volatili care migreazd foarle lent mdrind mult durata analizei. Coasfia
componentr:lui
D E TE C TORII GAZ CRO MATO GRA F ICI detectorului pe
Reactivitatea i
Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz- cromatografe, avdnd rchl aceasta prin de
de a sesiza in mod continuu; rapid qi cu o mare sensibilitate, componentele din proba supus6
Efectul asupcl
analizei. in corpul detectorului zonele cromatografrce carc ies separate din coloanh, conlinind fi izolat6. De e
de preferinli moleculele unei singure substanfe, se transform[ in semnale electrice (picuri).
Pentru a se putea compara, ca performanfe, fiecare detector este caracteizat de rnfi DETEl
mirimi ftzice: specificitate, sensibilitate, zgamot de fond, drift, limit5 de detecfie, constan6 Este r:n
de timp, reactivitate, efect asupra probei qi altele, comune multor metode analitice. De compuqii cu c
asemenea, unii detectori distrug proba iar allii o lasd nealteratd, permildnd sepatarea ftziedt substanlele oq
acesteia. Despre sensibilitate gi limita de deteclie am amintit in cursurile introductive cAtevz cromatografia ,

gazelor ih prez
lucruri esenliale valabile qi aici. in orice gaz uomatograf trebuie sd existe cel pulin un
detector universal care sd permit6 inregistrarea sigurd a tuturor componenfilor. In afard & gi temperatura
acesta mai pot exista gi alli detectori specifici, care rndresc siguranla analizei componenlilr momentul cAnr
de interes practic, deoarece rSspund doar la anumite tipuri de molecule. acestora in ctn

308

t-
rutianar,",,,,,f#;;i;iti:;tr!;,r;:_;;ff
:;!,^enEteaaLupa

*r,

?"XT#,1*,f?:#i;,i:lT,"ilj:l::::lllreprezinti
oncentrqtia,f
.-
domeniur in careare semnalul
semnarur \vaiazdriniar cu
d" . o*pon"nr) vu
:: i:Xy,*?^rt,ul T,ur"j
Acesta se misoard de ra rimita
d";";;;;i;"'vu'L,'|
ce trece
rr.,Utr prin
pnn oete*or.
detector.
,ar abateri de la liniar it*,, ao ,"",p411 Ia nivelul. superior de concentratie
:[:#:ili;:;.j;.fl
construi'"u
,[x,x1,,lx':,
j:*:*"::";;;;;;';ilffi
^---^
#i;;.;";";;;"ilj::,lilX1: H;:xTlltrffil:
Ia

;:'-:ffi:#lprin "u,r,,i;; Jffi,::,:::9lfi*


Existd diferen{e intre metodele de
.,ai ndicat decat multe dintre *"'ro"r" deteclie (Tabelul 12.2} dartoare au domeniul liniar
:ractica curent; detectorii cu ,n jo**;u a" analizd.' opti".. c"i--ui tttitizalidetectori
sunt in
'cnductibilitate remica (TCD), a.r*.to*r
liri"; l;g;'uru*r, detectorur bazat pe
ionirur*?n }acara GID), detectorur
'bioionizare (PID) qi cel cu aapiarlral "u cu
:etectori acoperd ?mpreund un "i""tr*i (ECD)'";;;;;1ii
larg Jon
d"
s" oir"*a de asemenea cd cei patru
' ro;aatcgrafele comerciale au in "nio motiv pentru care gaz
dc,tarJ cer pulin doi din ace*i alt..tori.
Tabelul 1z'z' Limtte rJe creteclie gi domerii,r dinamic penrru
principarii
detectori utilizati
urulzau fta G(j
-.-
Detector
m GC

ffi P
Limita

10-'"
cie detecrie(n_- Domeniul
10',
dint;icliniar

elctroni !U

ffi
NFD - imiile Ern* ru
iil' IU
ionicl "u i0'
ffi
\1u - U.dzail
10-"
To*
pe 10-''
flotoionizare 10'
%_

constanta de timp reprezinta vitezade


raspuns a instrumentului din
: in detector' Mai riguros, acesta reprezinti
:nponentului momentul intrarii
-=:ectorului penhu a atinge gog+ din v?ioarea timpur necesar rdspunsurui
limita ijnaiS.
: :activitatea include 9i posibilita*u r"ii""i a"
.::asta prin degradare, prin adsorblie .*nf*ente are prcbei sau provenite din
sau prin reaclii
- -:rtul asupra probei poate fi dishuctiv sau "il;l;;*
nedistrurtio. i, uitl*rl caz proba separat' poate
:zolata' De exempru. FiD este
u, a"t"rio. distructiv r" *"J icD este
nedistructiv.
DETECTORUL BAZAT pE roNrzAne
irv rtttcAru{ @rD)
Este unul dia cei mai folosiii
detectori, io rp""ia .rui#ta ,"nriuilitalii
: ::rpu;;ii cu carbon, practic..neripsili din sale ridicate la
orice iip ;"-;;;_.rornatograf
'-''stanlele organice' Deqi distrug"'prJu, dedicat analizei
a fost detecTorur care a consacrat definitiv
'-'natografia de gaze' Funclionareu ,u u." la
bazd *"d;fi;;;u conductibilitifii
*.e1or in prezenla unor particule electrice a
inc[rcate (de reguld;;r;;;r; ionizate).
;emperatura Dacdlapresiunea
' ambiantd tn gaz aflat intre doi clnducto.i-..* un izorator
:-mentul c6nd intrerc:],j:l,"1""rozi roarte bun, in
apar particule incarcate erectric,
i*;stora in campul electric creat,
apare un curent electric. Ionizarea
in urma deplasdrii
moleculelor probei este
309
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-Ptrj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreana-Pirjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZI FIZICO-CHIMICI


A COMPAS I LOR FARMAC E UTICI

voili (Fig.12
intensificati de prezenla unei flEc6ri de hidrogen, care arde in aer intr-o incintd, flacdrd e ln iipsa oricr
atinge temperaturi ridicate (20A0-2200"C). rnolecr:lelor
Gazul purtitor in cromatografia de gaze este Nz, He sau Ar, condilii in care detectord M, care cont
di un semnal debaz1 minim, foarte stabil. Schila simplificatd este prezentatl in Fig.12. 8 *trasta va ct
curentuiui dt

Electrod colector Nz ---

Cadere de Garnltnre M*'


tensiune
Ieslre
Sep
de circa
100 v
analiza chirr
termici. Act
recombina ci
Curi
parte diaffe
deteclia cou

DET
Gaz putfltor:
Azot din Dete
N2, Ar, He coloana pentru hidro
Fig. 1 2. 8. Principiul de funclionare alF ig.lZ. 9. Schila de principiu a detectonrlui 10) se baze
detectorului cu ionizare ?n flacnri GID) cu capturi de electroni (ECD) coloana o t}
prcdqi suu
in momentul apariliei ?n flac[rd a unor molecule organice, de exemplu hidrocarffi forelinerea
sau derivafi, iorizarea duce la un semnal (curent) specific fiecdreia dintre acestea. Curentul * ur detector
transformi in tensiune pe rezistenla cu valoare ridicatd R. $i aici debitele gazelor trebuie 15 futre 5.6 gi
fie riguros constante. Sensibilitatea FID la fluctualiile debitului^gi ale temperaturii sunt ec melecuiele t
mai mici decdtla detectorul bazatpe conductibilitatea termicd.In gazul purtitor provenit dL
coloan6, se dilueazl cu hidrogenul qi aerul necesare qi eventual cu un alt gazinert (Nz, Ar).
Detbctorul cu ionizare ?n flacdri FID (Fig.12. 8) este confeclionat adeseori din old
inoxidabil iar intre corpul metalic qi placa cilindrici pozitivd, de deasupra sa, se aplici r
potenlial de polaizare de 100-300V, continuu. Rispunsul detectorului, depinde ds nrrrnirl
de molecule ionizate ce apfi tn flacir5.
Cele mai stabile rentltate se oblin pentru alcani. Pentru alte substanle semnalul i
general scade cu cre$terea numErului de heteroatomi din moleculi. De aceea, aici este ner,rft
de un factor de corecgie specific pentru fiecare compus analizat De regu16 se folosesc
de coreclie relativi, adicd raportul dinke arie gi unitatea de mas[ a unui compus de referin6if
rispunsul, pentru unitatea de masd a speciei chimice anahzate.

DETECTORUL CA CAPTURI DE ELECTRONI

Gazti purtdtor este in acest caz azotul. La pitrunderea in detector, acesta este ioniil
de c6tre o sursd B- radioactiv[ (sunt suficienli cd[iva mCi fumizali de o sursd conlindnd
6hfi[
Gazul, trece apoi printre doi electrozi, intre care se asigurd o cidere de tensiune de o sutE dc
310

L-
I
. Rodica Strbu, Tica{q Negreanu_ptrjol,
Iuliana Stoicescu, Bogdu $tefan Negreinu_ptrjol,
Carmen Eletta Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMTC{


FARMACEATICT

vclii (Fig' 12' 9), de reguld intre un electrod central, pozitiv


In lipsa oricirei molecule oigaaiee ?n gazul ptrrtdtor, existi ;i corpul electrodului - negativ.
un curent de bazdredus datorat
nolec&leiQr de diazot (N*r) - ionizaie negatrv. La aparilia
in rletector a unei rnolecule organice
M, care conline eiemente eiectronegative
ica Cl sau i'; - mare afinitate penhu eiectroni,
aceasta va c1pt{r o palle dinke electronii radialiei ",,
F-. va apdrea, in ccnsecinli, c diminuare a
curentului de recombinare a ionil*r de semne contrare.
Ari loc agadar transformirile:
*
Nz --* 1g. *
*-, .un*rt de fond
M * e- -- ld- ; t-r{ + N2* --, 14 + Nz, diminuarea curenturui de
Se produc deci picuri negative, ceea ce nu deranjeaza
fond {12.2a)
analiza chimicd. Fiecare partiqutd poate genera prin
oi*i. ,"zuttlt rt final -
", 100 qi rooo
B- ciocniri intre
anod inainte de a "rffi"]
tennici' Aceqtia avind o mobilitate ridicatd vor fi coiectati de
se putea
recombina cu ionii pozitivi de az*t. De aici rezultdsensibilitatea
mare a metodei.
Cur5firea detectorului se face prin scoaterea eleckoduiui +, pe
care se depun o mic6
larte dintre r,roleculele organice ionizate. Acest detector este unul
seiectiv, adecvat pentru
Jeteclia compuqilor halogenali (pesticide). avind o liniaritate
a rdspunsului aproximativi.

DETE{TGRUL BAZ.4T pE FOTOTONTLARE


{prD)
Detectorwl bazat pefotoionizare (PID) este un detector deopotriv5
sensibil qi specific
rentni hidrocarburi aromatice gi cu heteroatomi (F gi S) in molecull.
Dispozitilul (Fig.l2.
10) se bazeazd pe capacitatea razelor UV de a'iottiza moleculele
organice, care pdr6sesc
.-olo-ana o data cu gazul purrr]or, Anarog cu metoda precedenti,
;^r;;;;;;;; i-oflare, ionii
:rcduqi sunt c':lectafi pe doi eleclrozi, cel pozitiv fiind sei demontabil
trtrelinerea periodicr). I)eoarece fracfiunea moleculelor ionizate lper,rilarra u*tel
este mici, pID se considera
:n cetector nedistructiv 9i poate fi inseriat cu alli detectori. LImpile
IrV cu energii cuprinse
'ntre 5'6 9i il.7eV pot furniza o seiectivitate suplimentard, peste l0.6eV practic toate
nolecuiele organice ionizAnd.

F ereastri
transparenti Electrozli
in UV limpii UV

Garnituri Secnlill
.<- Y
30* -_+
.R
Evacuare h-.1 la elertrornetrn
gar, I
+
glcanl
I

Ile la
coloanl
Fig.l? 10. Principiul de funclionare ar detectoruiui cu fotoionizare (pID);
radialiile uv sunt fumizate de o iampd situat5 in contact cu camera
de
Tomzate

311
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-Ptri ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negteanu'Piriol, Carmen Eleua Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ/{ FIZICO-CHIMIC{


A COMPUSILOR FARMACEATICI

COLOANE LE G AZ CROMATOGRAFICE intre 0.1-0.3


umpluflrE. (
Coloanele cromatografice sunt partea principald a oricdrui cromatograf de gare f confeciioaea
sediul separ[rii respectiv al corectitudinii rezultatului analizei chimice. Ini,tial au existat dd intr-un polir
tipuri de coloane: (A) cu umpluturd 9i (B) coloane capilare (Fig.12.11). Din anii 1990 a rri coroziune (t
ap6rut un tlp - coloanele 530pm (whide bore) - care degi nu mai sunt coloane capilare' i metaiice av6
adeviratul sens al cuvdntului, pdstreazd geometria qi tipurile de umpluturd ale coloaaeb
capilare.
Ciloanele cu umpluturd -pnmele coloane cunoscute in GC - sunt confeclionate din &H
(olel, sticlS sau alte materiale), avdnd diametre cuprinse intre 2-8 mm - cel mai frecvetr &
1/8 loli (3.18mm) saut/q loli (6.35mm) - qi confin adsorbanfi, site moleculare sau un slpc
inert pe care se giseqte depus sau legat chimic un film sublire dintr-o fazl stafiord.
Raportul diametrelor coloanei qi umpluturii trebuie sI fie cuprins ?ntre 25 qi 20.In ultid
timp au apdrut qi coloane cu umpluturd de 1/16 !oli.
Umplutura coloanei consti dintr-o anumiti fazd sta[ionard - activd care se depure pe
granulele umpluturii inerte qi poroase, in afaru coloanei (dupd dizolvarea acesteia ?ntr
solvent potrivit ales) prin amestecare urmind apoi evaporarea solventului intr-o etuvl Fig.l
Doar apoi umplutura se introduce in coloan5 qi coloana se monteazilin cromatogPf, r
intermediul unor racorduri filetate. Debitul gazului purldtor la aceste coloane este cel d Colq
mare, fiind cuprins intre 10 qi 40ml'min-1. Totoqi, astfel de coloane sunt din ce in ce d capilarei, g
pulin utilizate. chiar lega6
deja comt
B poate atitrgt
hweliq polianidic restor tipn
Sticld de i aescope*g
cuar!

mde termo
fure garu,
Cd
Granul*-suport plus
faza stsfionari ryinse io
w Perete dLr stictE E llazi stationtrS colrcta
DEbiBI pri
Ftg.l2.1 1. Cele doul tipuri de coloane, cu umputurd - A qi capilare - B;
drran perfi
coloanele 530 pm (wide bore) nu diferi ca geometrie de cele capilare
Fe'
Suportul poros (qi totodatd inert) este format dintr-un material solid, ela ryolue &
industrial, de formd pteferatd sferici gi cu o granulalie cdtmai uniformd (de exemplu
sdcs
rt4imfie t
mesh sau 80-100 mesh [109]). in raport cu suportul poros, faza stalionarS constituie doar
rfud o co
25o/o. Cele mai rlspdndite sunt confeclionate din pimdnturi diatomitice dar multe
mf,rul r
fabricate qi din silice. Acestea se modifici chimic prin silanizare pentru a deveni inerte.
Coloanele capilare sunt, la rindul 1or, de cel pulin doui tipuri: cu fazd s
Frel fuE
depuse chiar pe peretele coloanei capilare (WCOT) sau cu faza stalionard depusi pe r
,eilnil
roiid, poror, aderent, format in prealabil pe peretele acesteia (SCOT). Au diametre
csm-F
312
rutia*ar,,,,,,,:';:,;::;:;;:#:{,:r;::;#:i:,;:,,tenEtenaLupa
ME T o D E $ I TE E Nr c I D E,q x,
euzi p tzt c o cnt a t
_
ci
A COMPU$ILqR FARMACE (iTrcl

intre 0'1-0'35mm 9i lungimi intre


5-100m, separarea durind ceva mai
umplufirS' cu cdt coloana este mai murt dec6t la cere cu
lurrga .u atf;t durata anarizei cre$te.
c*rrfeciioneazdin uitimui timp mai coroanere capilare se
aler"Ji, sticld de."ur. ir;terior acestea
intr-un polimer - poriamidi^- p"rrt* sunt imbr,cate
ccroziune (ln acelaqi s-coP se. *ui
u rezista.=r1.uir;"-iulo"u' mecanice respectiv
f.ior"qte-aluminiuty. cotoaneie sunt ia
metaiice avAnd o formi circuiari bobinate pe suporruri
ig.iZ. f Z).

9i9.12.12. Bobin' de coioand capiiira


in forma care se forosegte in gaz-cromatograf

coloanere I{coT con[i\.fu?ustalionari sub form5 de firm sublire in interiorur


capilarei' grosimea acestuia .'u.;i.ra
int o.os-s pm. Fazastarionara poate
chiar legati chimic cle grupele -ou fi depusd fizic sau
-ir1"jiii."i#. ti'I"rr.
"
ate coroane sunt disponibile
deja comercial pentru.majoritatea
aplicaiiiior .ur"rt". pn"u'.lr"r"u unei
poate atinge isOmii tarere teoretice. astfel de coloane
indltimea echivale"ra *ri taler teoretic,
o exrresie deosebin d" ;;;riu " rui vun o""*t H, ?n cazul
::::$:-1irT- ["J]Hfu:le , ei a rost
H: B/v + (Cc + Cr_) . v
(12.21)
uade termenul A lipseqte iar cc
este coeficientul de difuzie al speciei
faza gazoasd" Cr_, fiind acelagi *"nri"rrip" moleculare separate in
ntru fanlichidd.
coloanele 530pm sau wide bore iuntconfeclionate
auprinse inhe 5-50m' Se pot denumi tot din siliee (sio2) av6nd lungimi
"rlooon_r"oricapilaredeoarece pdstreazd,caracteristicile
il,iffiff T*[ *:,1'ffi x1". :l :* :1,.{it6y,,i"oi dimensiunea nre,cr de pdr
f,1ffi l;ffi:T;;;,g ::#[:il:ri;;;i;;;#,';:ffi :"JHri::T:.l'ffi
Fazele sta{ionare sunt gi ele de mai
,X"-H;
multe feluri: polare, de exernplu polietilenglicoli,
;i:t::::#:'i;:':*:*:":'^::'",':^'g"r"dt*1$i.r,.rariii J"r. .u punli de hidrogen
u. cele specifice (de exemplu
cered;ril;;; ;;;;.J;i;;"?#"*##:Lf#t:::[
to compozilie chimici fgartg vaiatd,(peste i"ia" ,i-ro,*ut. din richide nevoratire
Il:,:':j:::,#i""::::r:!::!::!".s-tltiornr.e 100 de tipurf. -;;#,#;",|;ru;H,llf

ffiffiTT"ti::l 1::1T'.lx:i::'i':.r::r$:q":r,^'i
:a rnterni a coloanei. i,"u,a un n,m grerat pe
se pot disins" d"ii;p*;.ff#;lo1t.fli,*t
!." ":.1a*uar6
tiloxanii si polietilenglicotii '-
fiecare int io,r*i"ti" ,i-ir""'itas modificarea
tora. Formulele acestora sunt ilustrate uruu,rLiartsa polaritnlii
polant-',--
""r"
in Fig. 12. 13.
313
Rodica Strbu, Ticala Negreanu-Ptrj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Piirjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMIC{


A COMPU$ILOR FARMACE ATICI

retentie, unul mai mare $i altul mai mic decit substanla respectivd. Pentru seria omoloagi e
alcanilor este respect atd ecualia: Me
Atu
componeal
log(tp'):a'n*b (r2.28)
csmpocenl
detectarulu
unde a gi b sunt niqte constante numerice glsite pe cale experimentald, care sril
aceleagi pentru o coloand qi condilii fizico-chimice date. Se observi cd in formula valorii L celui bazat
termenul b se va reduce qi factorul a se va simplificd. Astfel, indicele Kov6ts, I, va depin& moiecuii.
doar de numdrul aparent de atomi de carbon ai substanlei respective - constant. Pen
Experimental se procedeazd, astfel: dup6 cdteva incerclri preliminare se injecteazi prealabil ct

impreuni cei doi alcani, cu Cn respectiv Cn+r impreund cu substan{a de analizat, X iar &ryi
mdsurarea pe cromatogramd a valorilor tn' pentru toate trei picurile componentrh
amestecului, prin inlocuirea acestora in formula precedenti sau pe cale grafrcd, se oblb
indicele Kovats. uf,d,
etalon (stal
fizicE a fr
tus fL concentra$ir

Ma,
Cils flr-t Der
a afr t4
li fr alta. Pentm
ilfl ri

*i
tl

_i,,'-]l
ti;l
\'-_j ! -
ii
1l
il
j\-
I
analog cu aJ
Acel
constituie p
-J
o tn: [!!,
*{x tr-i fiecare da
e
ffi tlx Il+I n ariile unui p
Fig.l2.l4. Calculul grafic al indicelui Kovdts (l : 100.n ) aitor pernrt
substanla et
funcfie de a
Analiza cantitdtivd
in anumite condilii (pe porliuni liniare ale rdspunsului detectorului, condilii
experimentale identice etc.), suprafala dintre linia de bazd Si curba picului cromatografic -
semnalul analitic - este proporlionald cu cantitatea de component injectatd. Deci, pe
domeniul liniar al detectorului, oricare ar fi acesta, existS relalia: unde Cx-x-es
concentragia
Masa injectatd: K'(Aria picului) (t2.2e) picului subrs
intern din pr
unde, K este o constantd numerici. Aceastd proprietate poate servi pentru construirea d Se ol
curbe de etalonare fiind general valabild. atdt in cazri GC cAt pi in celelalte teffi la-anEltra p
cromatografice. Se poate qi aici aplica metoda adausului standard, mai ales la domenii lirlh concentrafie
largi. Pentru valori tn'mici, c6nd picurile sunt gi asculite gi inguste, se poate ttlliza ?n lord ce intervia t
ariei ?ndllimea sa - cu rezerva unei pierderi din precizia determindrii. Prezentilm in cek c intern - coo$
urmeazl cdteva practici debaz\,legate de analiza cantitative folosind ariile picurilor.
Deta
Dets
3t6 rrai multe pr

ts
Rotlicc S?rhu, Ticulo Negrean u_pirjol,
-C
Iu Iia n a sto lcesc u, B ogdan $rcfan N eg red u-pitj o r,
tt arm en E r e u a L u pu

turEToDE $t TErrNrcr DE ANALIZ{ FtZTCO_CH\MrC.i


-
A CO|4PU$ILGR FARMACEUI{CL

M e to da fac
trs ru iu i d e rdsputr s
Atunci cand se dovedeqte ca detectorul riisptinde la fei de bine pelitru i-recare
cofilpcilent al amesiecuir:i, aria reiatir'5 a picuriior este propo4ionaid
cu cantitatea drverselor
coinponenie' Aceastl condilie este ?ndepiinit[ extrern de rar.
De exempiu, sensibilita_tea
deiectonrlui bazat pe conductibilitatea tennicd a gazelor depince
de natura substantelor iar a
celui i:azat pe ionizarea in flaciLri are rdspunsui rlepen,Jent rie
numarui a. caruon <inr
moiecul:i. "t""riJ-
Pentru aceste caz.urt este necesar ca tati ctmrponenlii a.naliza{i
sq aiba detersttittali in
prealabil crile rfr Joctor de r&spuns, ! . Eastotli {e r[spuns st ob$n.o oy.to*\ tormu\e\:
ue
F : Cx/Cs r'A1;lAg ( 12.30)
m
unde cu Cx gi Cs s-au notat concentratiile componentelor
X respectiv a substantei
etalon (standard), S, iar Ax gi As sunt ariile picurilor coiespunzdtoare
acestora.
fizicl a tbctorului de rhspuns este aceea ca indic'a ae cate ori este mai Semnificatia
mare raportul
concentralie pet serrmal analitic in cazul unur component
al probei fap. de etalonul ales.

M etoda standardului ( etolonului) intern


\rt \lr'u\tt, \\ t'lL\ \uu\mqir neagep\are \n cond\1i1\e
expenmentale de }a o prob[ ]a
alta' Pentru evitarea surprizelor de acest gin (gi
a eroriior aibrente analizeior) se utilizeazla,
analog cu alte metode instrumentale, un slonclc
rd intern,diferit de substanla i"'urut rur..
Acesta este o substan{d purS cunoscutl, introdusi
intenlionat in umestecul care
constihtie proba, 9i totodati aflat6 pe cromatogrami
in vecindtatea componentelor de analizat,
e -liecare datd ln cc:eeasi cantitati.
Motivril irtroducerii.ri. to.*ui acela cd raportui dintre
ariile unui pic oarecare gi standardul intem este constant,
indiferent de debitul gazul'i sau al
aitor perturbafii uEoare aie condi{iilor experirnentale,
tocmai d,atodt5, asemln[rii frzic,e dintre
snbstanla etalon qi proba. Analitic, conCentralia
necunoscuta se calcule azd, inacest caz, in
funclie de standardul intem gi proba cunoscutl:
.1 r
]:s : -- - 'f,-o
. LCI)
t- .
Alr Asr-h-
(12.31)
unde cx,N este concentra{ia substanlei X in proba de
analizat (necunoscut6), Cx,s _
concentralia substanlei X, ce urmea zd a fi analizatd, in proba
etalon (cunoscute), Ax,N - aria
picuiui substanfei X in proba de analizat, Asr,x - aria picului
corespunzdtoare standardului
inteur din proba necunoscutS, Ast,s - aria picului standardului
intern in proba etalon.
Se observi cd raportul Asr,N /Asr,s, apropiat de unu, corecteazdmicile
abateri care apar
ia analiza probei necunoscute in timpul cromatografierii, in raport
cu proba cunoscuti, de
concentrafie Cx's (denumitd probi etaion gi executati pe
o altd cromatogramd, separat). Ariile
ce intervin in raportul amintit se referd la aceeagi .rniitut"
din aceeagi substan!6 - standardul
intern - conlinute atat in proba necunoscutd cdt gi in cea
cunoscutr.

ariei picurilor
D ete nn inare a
Detenninarea ariei picurilor i.e. semnalul analitic al metodei
- se poate realiza p;,n
mai multe procedee, rnulte dintre acestea mai mult de importanld
istoricE:
317
Rodie a Strbu, Ticuya Ne grean u-Pirj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreana-Ptrjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEIINICI DE ANALIZ4 FIZICA-CHIMICi


A C O MP U$IL O R FARMACE UTICI

l. Metoda triangulalieibazaffipe aproximarea picului cu un triunghi gi calcularea ariei prin Exis


inmullirea l[limii picului Ia jum[tate din indllimea sa, w 172, cu inil]imea acestuia, h (picul se retentie, cc
consider6 gaussian). parametri dr
2. Metoda plenimetrdrii, sebazeazipe rnesurarea ariei propriu zise. doud faze.
3. Metada integratorutui - atilizeazd un aparat, numit integrator, ce di un semnal propor,lionl
cu aria de sub pic.

Metade de prelacrare a inforrualiei cromatagrafice


Metoda standardului intern furmzeazd cea mai rnare precizie pentru cromatografr
cantitativ6 deoarece ea elimin[ incertitudinile introduse de simpla injecfie. in aceasti metofi,
o cantitate exact mdsuratd de substanld este ad6ugatd fiecdrui standard sau probe. Standardd
intern trebuie sd fie ales astfel inc0t el si se separe foarte bine de celelalte picuri componetr
ale probei. De asemenea, picul standard trebuie sd fie aproape de picul analitic. Cantitatea & Crou
substanld din picul de standard intern serveqte apoi ca parametru analitic. aproximativ
Metqda normaliz6rii ariilor este o altE aproximare utilizatd pentru eliminarer inclusiv con
incertitudinilo: asociaJe cu simptra injeefie. in aceastd metod6, aria tuturor picurilor compla ridicati (nat
eluate este calculatE, Concentralia analitici este gdsitd ca raport al ariei de pic la una totaE e punct de spr
tuturor pieurilor. egaleazdina
,A.stfel, 9 cromatogr4rni: mobii6, cror
r ilustreazd rispunsul detectorului la un compus de analizat din protd la ieqirea acestuia dir rcalizat pir*
coloanE ca fuxolie de timp sal de volum defazd mobild addugati; aceasti meto
. qqte util6 at6{ pentru deterrnin6rile cantitative c6t gi calitative; constituind u
. fu.r izazd o. serie de picuri, unde aria de sub picuri f*rnizeazd informalia cantitativd derym biochimia 9i
cantitatea de component iar pozilia pieului servg$te pentru identificarea compusului dh

AA&
probi;

Fig.12. 15. Forme {e picuri . (p} Gaussian; (b) deplasat dreapta; (c) deplasat stAnga

Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum piEurile pot avea o cre$ts,re
pro.gesivd ur,rnati de o cidere abrupti datorati supratncdrcdrii coloanei (b) sau o formi qg
coadi carerazu\ti din faptul ci unele ldcage alo coloanei rqltl solutul rnai mult dectt altele Fig.l
(c). Ldrgimeabenni poate fi explicat6 din punct de vedere cantitativ. O particulS individualE
suportd multe transform[ri in timpul migrarii, in consecinld, timpul de stalionare in coloari
este extrem de diferit precum gi migrarea partr'culelor de.a lungul coloanei este neregulat5-
Odate cu cregterea timpului, IdJimea benzii creqte ?n tirnp re se parcurge coloana, timpul de
stalionare ?n coloani va fi mai rnare, iar vtteza de curgere a fazei mobile scade.

318
Rodica Sirbu, Ticula Negreanu_ptrjol,
luliaaa stoicescuu Bogdan $tefan Negreanu-ptrjor, carmefl Erena Lupu

METODE $I TENNICT IIE ANALIZi FIZICO_CHIMrC,,{


A COMF U${LOR FARMACE (rTICr

Existd patru parametri care caracterizeazd in general viteza de migrare:


timpul de
retenlie, coeficientul de partifie, tbctorul de capacitate qi factorul de
separare. Aceqti
parametri descriu echilibrul de distributie care existd qi implicit, transferui
solutiei in cele
doud faze-

CRGMATOGR,{FIA DE LICHIDE ON iNAI,TA


PERFORMANTA (HPLC)

Cromatografia de lichide de inalti performan!5 (HPLC acoperd azi,inproporlie


)
aproximativ 80Yo, analiza substanlelor moleculare: crganice, orguno-*"talice gi
anorganice
inclusiv compugii foarte polari sau labili termic pr.Ju- gi compugii cu masd
molecularl
ridieatS (naturali sau sintetici). De aceea, impreund cu cromato grafia de gaze
constituie un
punct de spnjin important in analizele chirnice moderne. Degi eficacitate-a
coloanelor nu o
egaleazd incd pe cea din GC, prin faptul c[ se poate modifica, pe
iAngi faza stalionard,, Si faza
mobii6, cromatogratia de lichide (LC) face posibile separiri'qi urtir" ur,"o.i
imfosibil de
tealizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masi a transformat,
in ultimul timp;
aceasti metodd in principalul mijloc de analtza a compugilor molecuiari
naturali sau sintetici,
ggnstituind unul din pilonii pe care se sprijind chimia sintetice actaald.qi pe care s-a dezvoltat
biochimia gi biotehnologia modern6.

ffi[,* ,ffi,
lrffifiilF* :liftffi
M
5**M* +lt
lt
H
t#
H
&
&t+Ierrreffi-is*r' rA
;ffiffi

tr$#fid
frprihffirt s*eae**ls
Semfl
mlffid-ffi'ffin tst**S*l#
Fi9.12.16a Prczentarea schematici a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern

319
Rodica Sirb u, Ticula Negreanu-Hirjol,
Iuliqna Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupu

METODE SI TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHTMIC4


OR FARMACEUTICI

Apoi are loc comutareape analizd (Fig.12. l8-B) cAnd prin rotire cu 600, in direcgia acelor &
ceasornic, manual sau automat, bucla este parcurs[ de eluentul de la pomp6 gi conlinutgl Se
acesteia este antrenat in coloan[. Volumul probelor pentru coloane obignuite (25cmx4.6rnm) mult de fa
este de 10-50p1. Evident aceste ventile sunt confeclionate din materiale rezistente la care se ba
coroziune gi la solvenli (o!el inoxidabil, tantal, teflon etc). rnecanism
r +(
r +(
COLOANELE iN CAO*TETOGRAFIA DE LICHIDE r -i{
, +(
Locul tn care se petrece separarea propriu-zis6 gi funclie de calitatea acesteia, sa
mdregte sau micgoreazd ruportul semnaUzgomot, este coloana cromatografici. Degi mul,ti Se disting
autori denumesc coloana "piesa cea mai importantI" dintr-un cromatograf, rezultd, cI fiecare
.Cn
compartiment in parte, contribuie separat la oblinerea rezultatului analitic. Pentru un 'Cn
practician din domeniul LC insd, locul unde acesta intervine efectiv gi unde se concepe logic cal
separarea este intr-adev[r coloana. in primul
Materialul din care se confeclioneazd corpul coloanei ?n LC trebuie sd asigure solvent or1
acesteia rezistenla mecanici adecvat6 presiunilor inalte (20mii kPa) precum gi rezistenga le faza mobi
coroziune fald de faza mobild. in majoritatea cazunlor a fost preferat o1elul inoxidabil 316 faze invet
lucios. Acesta rezistd la majoitatea solventilor, exceplie fbcAnd doar sdrurile halogenilor, h acriloaiail
special insolulie putemic acid5. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticll sa Fig.12.20.
plastic in interior - ofel inoxidabil sau material plastic in exterior.

Fi9.12.19. Aspectul coloanelor din LC: coloand analiticd (st6nga),


semipreparativl (dreapta)

Din punctul de vedere al geometriei (Fig.12.19), aceste coloane sunt cilindrice, itr
dimensiunile depind, in primul rAnd, de dimensiunea granulelor gi porozitatea umpluturii.
Astfel diametrul coloanelor variazd, intre 0.3-5cm iar lungimea poate fi intre 3-25cm. Pentru
scopuri preparative, in cazul unor componente necunoscute, se utilizeazd, chiar diametre mai
mari.
Cu cAt umplutura este mai find, cu atAt coloana este mai scurtd. Pentru a se relirp
eventualele impuritdli sau componenli care nu pot pdrS.si coloana (fiind relinuli practic
ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelaF
diametru gi lungimi de 0.4-icm), pot fi inlocuite mai des, evitdndu-se astfel scoateree
Cn
prematuri din funclie a coloanei principale. Pentru a nu fi antrenatl faza stalionard, in afu
coioanei, aceasta este blocat6 la capete de doud discuri metalice, poroase, av6nd diameuC
foloseqte i
schirnHtc
porilor intre 0.5- 10pm. De asemenea pentru a nu se ldrgi prea mult prin coloand zon
in analizel
cromatograficd (cu diluarea ce ate loc simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri L
pereclti de
coloan6, tubul de aducliune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus h
semn coffi
minim.
ionizabile.

322
Rodica Sirbu, Ticuya Negreonu-pfrjol,
Iuliana Stoiceseu, -Crr*
B ogdan $tefan Negreanu-ptrj ol, Elena Lupu
"o
!|{ETODE $r TEHNTCT DE ANALTZ{ FTZTCO_CHrMrC{
4 C OMPUSTT.O R FARMACE UTrCr

cunosc pani in prezent mai muite mecanisme de separare prin coloane,


. " S""fazele
nrult de
care depind
mobili gi stafionard. Mai exact, depind de natuia fenomenului fizico-chimic pe
care se bazeazd retenfia diferen]iatE gi separarea. Metodele LC (HPLC)
se pot clasifica, dupi
mecanismeie prineipale amintite, astfel.:
r -: cromatografie de adsorblie,
r + crcmatografie de repartilie,
r + crornatografie ionici,
E + cromatografie de excluziune sterici
Se disting douE moduri de realizare a cromdtografiei de repartifie:
r cromatografie de repartilie directd (sau cu faze normale - clasic6);
r Cromatogtafia de repartilie cufaze inversate- metoda preferat[ in zilele noastre - pe
3 _ care se realizeazd cele mai numeroase separiri.
In prirrul caz faza stafionard este formatl dintr-un lichid polar iar faza
mobild dintr-un
solvent organic nepolar iar in al doilea, situalia se inverseazd: lichidut
imobil este nefolar iar
faza mobil5 este un amestec. de solvenli polari. De exemplu, una
dintre cele mai rlsp6ndite
faze inversate este cea stalionari - silicagel, iar r"u - un amest ec apd, metanol,
acrilonitril (sau tetrahidrofuran). o separare bund pe "*uita
o astfel de fazd este prazentatd in
Fi9.12.20.

l. Izapotrxrru 1rr. Simszirl


?. Profarn 15. Bron:,acil
J. Pr*p*zir 16. (:iatazi*
4, Irlbtrtila:ina 17, Atrazin
5. Limu'ari I8. Carbaril
6. Propanil r Coloani: Supeleosil {Sift)
7" Pr"*ureu'ir LC-ABZ, -15x.1.$crn:
8. Fer:*rnifos . G*riulatie:Spar. t =40oCi
9. Fe*itroiiu r Elllsr* 10 p*nn h 90?r
10. fxfriai acetonitril I'r apn S.516:uiul
li. Mekniusu . De?i:ctsr: [I\i la 2]5su
l!. F,eutrar . Debif: lnrl.mi*-l;
20 .ro 60 }l[in B0 15. Met,rxursn

Fig.12. 20. Separarea unor pesticide prin HPLC

Cromatografia ionicd (IC) are mai multe variante. Cea mai frecvent intalniti
astdzi
foloseqte in calitate de fazd' mobili solventi apoqi diluali de electrolili iar ca fazA stafionari
schimbitori de ioni. Metoda va fi descris[ intr-un capitoi separat datoriti
implicaliilor actuale
in analizeie de ape legate de proteclia mediului. o aita variantr denumit5
cioma'ngrafi" pri,
perechi de ioni folosegte faze stafionare capabile sd fixeze anumili
ioni care rxeizeioni de
i:11,::'ttr (perechi de ioni). Acest mecanism se prefer[ in cazul subsranfelor ionice sau
lonlzaDlte.

323
Rodica .Strhu, Ticupa Negreanu_ptrjol,
Irtli*na Stoicescu, Bogdan $tejan Negreanu-pirjol, Cannen Elena Lupu

t,rEToDE $r rErrNrcr DE ANALTZ{ FIZTC0-CHI1|,trci


49 o Mry; rL o ry4 tuA c E u rr c r

m
r.
imr

q1 - S; ,4w."\.la",i'"'.
g; - 5i ,&,;'-"'24\r'\.
L

O- Si "\''\'^'*''""'
f

u
o-si n*',-,\r4-,At
o-si y4a"r''""""r'f-A.
o - si /'\,^",\n
Fig.12. 21.a. Aspectul granulelor de silicagel Fig.12.21.b. Aspectul schematic al unei
Folosite frecvent la umplerea coloanelor granule sferice cufazd stalionar6
Jin HPLC chimic legatd pe suprafafa suportului

Indiferent de form5, granulalia trebuie sd fie uniformd (se eiimind partea


fin6) pentm
;d astfel caracteristicile curgerii eruentului sunt mult imbundtriite.
Oblinerea silicageluhti sferic se face plecdnd de la soluiii confinand silicat
de sodiu
dar 9i alii compugi hidrolizabili ai siliciului (ietraclorura de siliciu,
silicat de etil etc.). De la
t:".1ti1, printr-o reaclie cu apa urmatd de o pulveri zare
si apoi de o sinterizar", pro""r"
r izibile pe Fig. i2.22, se oblin granule cu
aspeci sferic.

OE
ti
r--. \/
I
I I
I
I'-r Jrrr
Si OII I r -.-J
!

,, [:;; i]
I

I
-
CIH
Si02 calcidal

tompuSi *i Sigtr:):
iso$
l-
o 5it0Et)d,
r sicfu.
i :{a:si03.

t{ J:ig$tl }l
Fig.12.22. Schema procesului de ob$nere a silicagelului cu granule sferice

Silicagelul are o structurd tridimensionald cu o retea debazd,tridimensionali,


formatd
cin leg6turi Si-O-Si iar pe suprafala porilor sau cea exterioard mai prezintd
grupe silanol, =Si-

325
Ra dii:a. Sirb u, Ec u|a, Ne grca na.Pt rj o l;
fillian:s,Stoicescui B'o6daai$lef*n'Negrcaaa,P,ir'jol.Ctrynen:El4noLapu

hfEa@il $r T.Er{,NIr DE ANAL Eti FEI,{ @,e&r*fl/i


AI @ MP USL AR EATMA EU TII

OH- Funli'le de oxigen, apar ihffe, aJonaii de siliciu, cu ooazia pol'irneriz6riir acidu}d, silii:ie, participi 1

s.i{olr)4i reactia:
in ultirnul tir.np, a mai aplrut un tip de fazd staliouard cu perforrraufe ridicate. Esr
vorba de eolo.anele monolil, reatizate din aceieaqi materii prinre, gi pdntr-o. tehnologi
asemin[toare'din punct de vedere chimic cu cele dil Fig.12.19. Coloana este.forrnatE dfued unde cel r
in tubul rigid (metalic), de unde qi nunnole. Aceasta nu, mai are granutre dupS: cum se pmE acoper6 c
sbserva din Fig 12.23'.. Prin noua tehmologie, s-au obfir.rut coloans cu perfomanfe superims mult stabr
fal[ de cele uo.rplute cu granule. mai multo
SU
uniform, r
HI{H inversate"
/', / / radicalulu
dli!
'o' o/ sreandu-sr
lil
ttt
ti:
si 5i 5i Fr
m Fa
Fig.12. 23. Aspectul Ia microscopul etrectronic aI Fig.12. 24.Pincrpalele tipuri de De aceea r

co{oanelor monolit grupAri silanoiice faza mobi


faza sra$c
Existi trei tipuri de grupe silanol supeSciale I- legate, II- reactive qi II1- libt- tnebuie si
(Fi9.12.2a) cu t[ria relafivd I < III < II. Funclie de tehnologia de oblinere diferi f trebuie sd
porozitatea internS, suprafala specific5, rezistenla la compresiune qi polaritatea. SilicageH Ur
este considerat,in general, un material putemic polar. ci
ryune
Grupele funclionale de pe suprafalS au un caracter acid (pIG pentru grupele siM ridicat5- -r
este similar fenolului). Pentru a se reduce cozilo picurilor pe care le dau centrele de adso@ de aceea,
puternice, silicagelui se poate dezactiva, de exemplu prin adaos controlat de apd (3-8% ry+ mobill - 1

Adsorbanli muXt mai pulin utilizali sunt alumina, oxidul de zirconiu, cdrbunele macropq se vorteqt
polimerii poroqi (de ex. spuma poliuretanic[). srafionarn
Fazele stalionare chimic legate au apdrut in urma tncercdrilor mai pulin eficace de utilizare r repartilie
unor faze staiionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru eluent (a il formate-d
preferat kieselgur-ul sau p6mintul diatomitic - in esen!5 tot SiOz dar cu pori mari gi o prinfre fiu
suprafa!5 mult mai rnic5. Pr
Deoarece in toate aceste incercdri faza stalionard era spdlati de pe suport de ci* eluengi cu
eluentul in miqcare qi in felul acesta deranja funclionarea detectorului, s-a recurs la sohf fo care cn
credrii unor faze care sd fie fixate prin legituri chimice - mult mai putemice decAt cele fui*- in cromat
Aspectul unei faze stalionare chimic legate poate fi imaginat ca in Fig.i2.24, adicd. cat* HCl, iar
legate alcituiesc o adevdtatd pddure de molecule care se comportd fizic asem6ndtor unui sEl separali u
subfre, aderent la suporl (imposibil de dizolvat) dar cu o valoare afactorului de capacitw\ o
maifavorabild. folcsirea
Daci grupdrile silanol =Si-OH de pe suprafala silicagelului sunt puse ?n situalia & r consta6 r
reacjiona cu anumili derivali organometalici, se poate realiza sinteza wor faze chimic leg*- confi5" so
Cele mai stabile legituri sunt cele care au la bazd aparilia structurilor legate prin intermefl impartaal
unei punfi: =Si-O-Si=. Oblinerea acestora se reahzeazd prin reaclii de condensare la c- slab prin

326
Ro di c a Stfi u, Tic uta N e g rean u_ptrj ol,
rwlianfl stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-ptrjor, cennen Erena Luptt

LIETODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHILilCA


.LOR
ACOM, FARMACEATICI

participd grupele silanol - superficiale, efectuate in prezenla


unor clorsilani. Un exemplu este
reactia:
=SiOH + ClSi(CH:)zR --" =Si-O-Si(CH:)z-R + HCt (i2.32)
:
';nde cei mai frecvent R CaIIr; sau C1sH37. Prin astfel de reaclii suprafala silicageiului se
acoperi cu un strat monornolecular de dimetil-aichilsiloxan nepolar. pentru
mult stabilitatea s-a recurs 1a solufia legdrii radicalului de hidrocar-burr
," *a.i gi mai
R prin intermediui
rnai multor iegdturi cu suprafala silicagelului.
Stratul de hidrocarburd grefat de_ se compoftd ca un strat foarte subfire,
unifbrm, de lichid nepolar dar mult mai stabil..suport
Aceste faze siau labazacromatografiei cu faze
inversate' Polaritatea acestor faze se poate regia prin legarea
in cadrul unor catene laterale ale
radicalului de hidrocarbrl? R, de exemplu u unoi funcliuni aminopropil,
cianopropi,l,benzll,
;reindu-se astfel o mare diversitate de faze stalionare.

Faza mobil il

Faza mobilS' sau eluentul in LC nu reprezintl un mediu inert


ca gazul purtdtor din GC.
De aceea alegerea fazei mobile se face aici in perfectl concordanli
f*ustalionar6. Astfel
:aza mobild" difer6 destul cle mult in functie de tipui interacliuniloi "o
componentelor u"pu.ut"
:aza stalionard din coloan6. Singurele caracteristici generale sunt "u
urmdtoarele: (1) faza rnobild
:ebuie sd aib6 o viscozitate coborAt[, (2) aceasta kebuie si dizolve bine componentele,
(3) nu
:rebuie sd afecteze funclionarea coloanei gi (4) trebuie sd permit
funclionarea detectorului.
Unii eluenii provoaci migrarea unui anumit component mai repede prin coloand.
Se
;pune cd aceqtia au o tdrie relativd mai-mare sau, altfel spus, au putere
o de elulie mai
:idicatd. Aceast5 denumire provine de la faptul cI faotorul de capacitate,
je aceea componentut k, este mai mare gi
yiyreya mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component - fazd
::robila - fazd stalionar5. p" o stalionari polari, folosind o fazd*otita nepolar6,
{stf:I,
r"orbeqte de cromatografie de
1u.ig
repartitie'hormal[
'e (sau cu faze dftecte). Din contrd, pe o fazd.
:ialionara nepolar6 utilizAndu-se o fazd\mobild polard se vorbegte de de
:epartitie cu faze inverse (sau inversate). iq acest ultim caz at devenit "ro*uiogrufie
tntale fur"r" ,noUii"
--brmat".din amestecuri metanol - apa carj in cromatografia de repartilie sunt considerate
:rintre fazele mobile mai pulin tari.
Pe o fazd sta[ionar[ polar[, amestecul metanol-apd face parte dintre cei
mai tari
:luenli cunosculi. in Tabelul iz.3 se prezintd, cd\ivadintre cei mai intdlnili
solvenli si"rai*l
-n care cregte tlria lor relativS, in cele doul tipuri de cromatografie
de repartilie.
.n cromatografia ionicd (CI) se folosesc solulii diluate de -electrolifi ca:
NaOH, NaHCO:,
SCf iar in cea de excluziune steric[ solven]i simpli - evident compatibili cu polimerii,
.eparali unii de allii dupd dimensiuni.
O altd cale de imbundtilire a separlrilor existentd in LC (cale inexistentd in
GC) este
-closirea gradienlilor de elulie. De exemplu, in GC, prin modificarea eluentului gazos
nu se
:onstatr nici o imbundtifire a calite]ii separdrii, in sensul miririi
selectivitdlii. in"gpLc, ai,
''-rntrd, solventul are o contribulie importanti in procesul de separare, dar nu trebuie neglijati
'nportanla decisivi a cuplului fazd mobild, - fazd, stalionara. degi unii compugi
sunt relinuli
'iab prin coloan6, iegind destul de repede, cei relinuli puternic pot ieEi din coloan5 dupd un
327
Rodica Strb u, Ticu1a Negreana-friri ol,
Iuliana Stoirescu,.B ogdan $tefon Negreanu'Piri ol, Carm en Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMICI


A COMPU$ILOR FARMACEATICI

timp cdteodatd nepractic de lung, lucru care determind diluarea in eluent a componentul fo DET]
uflna parcurgerii coloanei, micgorindu-se astfel calitatea anaTizei.
Tehni
Tabelul 12.3 Cdteva faze mobile (monocomponente) utilizate detectorii in r

in cromatografta de repartilie in ordinea t6riei lor dintr-o colo:


relative in LC de repartilie ct faze normalg detectorii co
Fxee *ce"male Satr*,enti F*r* irtrrs*fe decurge sepa
ikxan Intrucdt colc
deteclie trebu
Er:rzelr.
ordinul micr<
Tri*crrnetan se putea sesir
fi{*r**rii r$s mefr?sn In cal
ter *tilic chimic[ cunc
Aee at d* etitr exemplu, in
Ae.r*seitril difuzia lumir
&{***rr*1 oligomeri dir
Apa reaclie chimi
numegte deri'
9i dupS iegire
De aceea s-a recurs la introducerea treptatd peste primul solvent (eluent), a unui al doilea in special leg
pentru analiz
solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce in limbajul de specialitate se numeste
gradient de elulie (sau de concentrafie). exemplu ami:
La ora actuald, solulia la care s-a recurs in practicd consti, ?n general, dintr-un sistem Carac
de ventile electromagnetice care permite intrarea solvenlilor in aceeaqi pompI, prin gi oarecum si

intermediul unei camere de amestecare aflate la joasd presiune. Este posibil qi un alt montqi
?n care fiecare solvent are pornpa proprie, comandat[ de un dispo zitiv de control al debitulul
Acegti solvenli intri ?n camera de amestec qi de aici in coloan5. DET}
Gradienlii de faz6, mobild pot fi foarte diferiti in practicl dar formele principale sunt cele
Acest
descrise inFig.l2.25.
qi ?n HPLC.I
- adic[ s[ abr
eluentul trebr
Legea
de legea Lan
De aceea lin
AUFS (presc
intreaga scali
AUFS cnzgo
Motir
organiceo anu
organice cu
hidrocarburil
funcfiuni org:
Tiuip
Fig.12. 25. Cdteva din cele mai cunoscute forme de gradienli de fazd mobila
328
Rodica Strbu, Ticuya Negreanu-Plrjol,
Iuliana Soicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carnen Elena Lupa

METODE Sr TEHNTCT DE ANALTZ{ FTZTCO-CHIMTC{


A COMPASILOR FARMACEWICI

DETECTORT

Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dat[ cu perfecfionarea detectorilor. S-a arltat cd


detectorii in cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iegirea eluentului
dintr-o coloand care pot inregisfra continuu substanlele separate de cdtre aceasta. Deci
detectorii constituie acea parte a instrumentaliei ce permite observarea modului in care
decurge separarea prin coloand frrd a se vedea componenlii propriu zigi ci doar semnalul lor.
Iatrucit coloanele de separare performante au capacit5li de incircare mici, sistemul de
deteclie trebuie si fie unul foarte sensibil. TotodatE, pentru c5 in LC volumul de prob[ este de
ordinul microlitrilor (8-10p1), volumul detectorilor trebuie si fie de volum apropiat pentru a
se putea sesiza in mod continuu picul cromatografic.
In calitate de instrumente se poate utiliza, in principiu, oricare dispozitiv de analizd"
chimicd cunoscut, pentru probe lichide, precum gi orice combinalii de instrumente fizice. De
exemplu, in ultimul timp, combinafia dintre un detector refractometric Ai unul bazat pe
difuzia luminii este extrem de eficace in armliza polimerilor in amestec cu monomeri sau
oligomeri dintr-un material. Existd chiar posibilitatea cregterii sensibilitElii detecliei printr-o
reacfle chimicd in urma addug[rii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se
numegte deivatizare gi se poate practica chiar inainte de introducerea probei in coloand, dar
qi dupd ieqirea din coloani a componentelor separate. Metoda a fost utilizafipind in prezent
in special legatil de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimerice qi mai ales
pentru analiza unor amestecuri de compugi numerogi avdnd aceleagi funcliuni reactive (de
exemplu aminoacizi).
Caracteisticile detectorilor sunt asemlnitoare cu ale celorlalte instrumente analitice
gi oarecum similare cu cele descrise la metoda CG.

D E TE C TO RI S PE C TRO FO TOME TRICI

Acest grup de detectori sunt cei mai folosili detectori pdnd in prezent, atiltinLC, cdt
9i in HPLC. Pentru a putea frutrliza{;i, compugii separali cromatografic trebuie sd"fte colorali
- adic[ sE absoarbd lumina pe domeniul de lungimi de undd al detectorului. Pe de altl parte,
eluentul trebuie sd fie practic transparent pentru acelagi domeniu spectral.
Legea frzicd,pebaza cdreia func{ioneazi acegti detectori a fost prezenta6 - este vorba
de legea Lambert-Beer (A: elC). Deci unitdlile vor fi unitlli de absorbanfi, adimensionale.
De aceea limita de detecfie sau zgomotul de fond se prezint[ in cazul acestor detectori in
AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale : unit5li de absorbanli raportate la
intreaga scald, L engl.). Astfel in cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001
AUFS cu zgomotul de fond de lYo.
Motivul principal al popularitdfii acestor detectori este acela ci numeroasele substanle
organice, anume cele care confin legifuri duble (electroni n), respectiv au grefate funcliuni
organice cu electroni neparticipanfi, absorb lumina in UV-VIS. Este vorba de toate
hidrocarburile olefinice qi aromatice precum gi derivalii tuturor hidrocarburilor cu diferite
funcliuni organice (:C:O,:C:S, -N-O, -N:N-, -NH2). intre acestea se includ gi numeroasele

329
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-Pirj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupa

METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMICi


A COMP U$ILO R FARMACE UTICI

combinalii de interes biologic ca efizime, acizi nucleici etc. Un mare ayantaj al acsu
detectori este faptul ce sunt insensibili la micile varialii de debit gi temperaturl.
Celula de deteclie face parte dintr-un spectrofotometru gi are un volum extrem de mt'
de 8-10p1, respectiv un diametru interior de 1mm la o lungime a celulei de 10 rnm-
C onstrucf ia ace stora e ste ilustratd in F ig. 12. 26.
IA
+t
t-- !
{}..tlrirflt l

Ltmur}a

D]
l'or fi pra
Fi9.12.26. Celila unui detectorbazat pe spectrofotometrie de absorblie ?n UY kr care in
momentu
Se pot distinge qi
in cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori. detector -
Detectorii monocromatici au fost primii ntlhzali, fiind mai ieftini deoarece luweazd doar Ia o in
lungime de undd. Modelul cel mai rdspindit se compune dintr-o sursi luminoasl cu deuterl aducerea
sau cu vapori de mercur, un monocromator care separi un domeniu ingust (de ex. linia 251 (10-smol',
nm a mercurului) gi un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezenteti i in crorna'
Fi9.12.26. coloani c
Detectorii policromatici mai frecvent utilizali in cromatografele HPLC moderne permit gi asemenea
selectarea lungimii de undl la carc se lucreazd, dar chiar pot inregistra electronic absorbanF termostati
celulei la mai multe lungimi de undl simultan. Acest mod de lucru dd o mai mare siguranfi
analizei, in sensul cI permite stabilirea purit6lii, adicd, dacd picul constituie un semnal dat de Detectori
o singuri substanld sau de un amestec (ceea ce se cunoa$te sub numele de stabilirea puritnf ioni gi sr
picului). Aceqti detectori conlin celula amfuxitd, montatd intr-un spectrofotometru cu relea de detectori
diode. descris se
unei celui
Sursi-'Monocromator--+Celuli--+inregistrator
Fig.l2. 27. Schema bloc aunui detector HPLC spectrofotometric

Detectorii refractometrici, aLt la bazd legile refracliei luminii. Principiul de


funclionare al acestor detectori arc la bazd legea 1ui Fresnel - de transmitere a luminii prin
medii transparente avAnd un indicele de refraclie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono san
policomponent) trece printr-o celuld cu dou[ compartimente unul conlin6nd doar eluentul pm
iar celSlalt fazamoblld care pirdsegte coloana (Fig.12.28).

Pr
dintre acr
FT-IR , C
deteclie i

330
Rodica Strbu, Ticula Negrean u-pirj
ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan g"1o" Negr";;;:;;j;,
Carmen Etena Lapu
METODE $I TETTNICI DE ANALIZ|
FIZICO.CHIMIA{
A COMP a$rl oR FARMACE aTICr

La cal{}alrE
*,
!

W
b,
de) "*. Y
Ell*etrt plus
cult+)*lfEzrt
funcfionare al unui detector refractometric

Diferenla dintre indicii de refractie p,enku


soiuliiie aflate in ceie doui compartimente
vor fi practic nule, atata timp cat din
.oiourra iese doai elr*tot pur, dar
in care in eluent mai.apare un component diferitd in momentul
separat - antrenatde catre eluent
momentul ieqirii unui component are din coloand. in
loc o deplasare i pizigiei a."i"orrloi
detector - deplasare cale em-ergent oin
proporlionalS cu concentralia
:ste
rn cazul acestui tip de deiecior sunt posibil" !i sesi zatd, decdtre detectorul
D.
aducerea liniei de bazdli jumdtatea."ut"i $i;i;;;egative, ceea ce face necesard
(1O*mol'L-r)' constituie
rr.* rerariv cobor^td
"^rJ,-i"li"iasensiblitatea
d'".rururtaj. Acest detector
'i deoare"ce, in
in cromatografia cu gradienfi este ririversar, dar nu poate fi utilizat
coloan5 difera de cea de la ieqire gi 1c;st
caz, campozigia eluentului ia intrarea in
se modifi.a .oniinrr,?exist6nd
asemenea fenomenul este foarte o tinie de baz6,. De
sensibil rr r"*p"r*re (*0.000r.c)
termostatare a, a,dLta detectorului
cat qi ; ;oloanei.
fiind necesard

Detectorii conductometrici, se utilizeazd


cu precadere in croma tografta pe schimbdtori
ioni 9i sunt sensibili la ioni urorgurl"i sau de
organici inclusiv acizi organici. Sunt agadar
detectori specifici' Sunt suficient ie sensiuili
tioopg-irii."i.i"cipiul de funclionare este
28. rehnic este vo.ba o" o
ffHffi::ffff#;:-# miniiturizata cu totur
""irra anarogs

F"ari rcohild Faz* rn*hili nlus nrnttS


Fig'12' 29' Principiul de funciionare pentru
celula conductometricd
Pe l6nga detectorii am.intili, in practica
analiticr se mai intalnesc ai alqi detector iar
dintre acegtia o menfiune specialS trebuie
frcutd penhu i"iaurulipe spectromekia
FT-IR care au permis determindri calitative de masd qi
') uneori imposibil de realizatprin alte variante
deteclie in lipsa etaloanelor cunoscute. de

331
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-frrjol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefon Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lapu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMIC{


A COMPUSILOR FARMACEATICI

CROMATOGRAFTA TONICA (CI) H+ din a


similare r

lJtilizarea cromatografiei ionice a apArut datoriti necesitililor de a analira


amestecurile de anioni, cationi sau compu$i polari - lucru dificil sau imposibil de realizm
eficient prin celelalte variante ale cromatografiei de lichide. Aceasti variant6 a cromatografiei
de lichide de inaltd presiune se bazeazd pe utilizarea coloanelor cu schimb5tori de iori
iar aceqti
respectiv a materialelor rezistente la agresivitatea acizilor,bazelor sau s6rurilor - substanle a
c6ror solulii apoase care servesc drept eluenfi.
n
func{iona
Schimbdtorii de ioni sunt materiale solide - derivali ai unor polimeri reticulali (porogi),
sodiu, pn
oblinuli prin legarea de catenele hidrocarbonate, ramificate, ale unor grupe funclionale aqa
de sodiu
cum sunt reprezentate schematizat in figura 12-29.
separartr
. necesare
mai largi
mai uqol
sfericS, e.
Fazele m
necesar, l

molecule
cationi,ti t
se foloser
de carbo:
sehimbda

D,
Fig.12. 30. Cele doud tipuri principale de rl;ini schimb6toare de ioni
k
Granulele de r5gin6 se solvateazd ca apd ttnzdnd spre un volum limitd maxim. Prin mod dire
spa{iile dintre catenele unui cationit pot pdtrunde prin difuziune in fazd lichid6 doar molecule electrolit
neutre sau cationi, anionii fiind exclugi. Pitrunderea in granule a ionilor de semn contrar esk supreso/,
ingreunatd qi de un alt efect, numit efectul Donruan de membrand,, care apare pe suprafap in 1975,i
granulei qi provoacd o selectivitate a acesteia la pdtrunderea ionului, in funclie de cu rolul d
dimensiunile acestuia. Mai exist6 gi un al treilea mecanism util in cazul substanlelor neionicc amintit ar
sau a celor ionice dar cu grqparca ionici identicl dar cu geometria moleculei diferifi - de anioni
difuziaprin granule. Analog stau lucrurile intr-un anionit, cu deosebirea cd de astd dat[ sunt formul[ 1

excluqi cationii. diluat, va


Dac[ pe o coloan6 umplutd cu un cationit (Fig.12.30-stdnga) se introduce un amestec
de doi ioni, de exemplu, format din sodiu gi potasiu, acegtia vor fi fixali pe r6gin5, eliberdnd o
cantitate echivalentd de ioni hidroniu. Fenomenul chimic cate are loc se poate scrie:

pnn care
R-H + Na* .* R-Na * H*
se transfo
R-H + K* *, R-K + H+ (r2.33)

i
i
Pomp6nd un eluent prin coloanS, de exemplu o solulie diluati de acid clorhidric, ionii
i
I
332

L
Rodica Strbq Ticaya Negreaua_Ftrjol,
Iulion a Stoicesaa,B ogdan $tql:an Negre; a-pirjol, lCarruen
Eletia Lupu

METODE $T TEHNICI DE,ANALIZ{ FIZICO.CilIWC{


FARMACEATICI

H.+
fin acid, fiind in concentralie mai mare, vor deplasa
similare spre o porfiune inferioaid:
ionii fixafi, pnln echilibre ionice

R-Na + H" *t R-H + Na*


R-K + H* *..r R-H + K+
(12.34)
iar acegtia se vor puiea fixa din nou, pulin mai jos,
pe alte centre de schimb din coloand.
-Procesul se repetS, ionii migrand. de-sus'in jos
prin coloani. Deoarece grup6rile
funqionale -so:2- au o afinitate cevi mai mare p"rt*
iorili o" potasiu decit fald de cei de
scdiu, primul gtop dg ioni(sau prima zond) careva
iegi din coloana va fi cel format din ionii
de sodiu 9i abia duri va ieqi gr*pul
T
separarea c'elor"doi ioni- tmp
conlinind ionii de potasiu. Asrfel se realizeaz*
Similar stau lucrurile cu amestecuri *ui
necesare coloane mai lpngi. intrucat cu cdt "o*pri"ut.,;#?;;
diarnetrul grunul"lo, este mai mare zonele sunt
mai largi 9i, totodatS, separarea mai de duratd iur
$rr,;1"[ se deforme azd mecanic, in timp
1ai.glor, ulterior rigin3 a fost aplicati'sub formic" p"["ria subflre pe un miez de sticld
sferici, eficacitatea separrrii qi fiatititatea coloanelor crescand foarte niult.
Fazele mobile in IC sunt simple - solulii apoase
necesar, se mai adaugd' o concentralie coboriti
diluate o" *iri sau baze gi doar c6nd este
de metanol pentru a se facilita dizolvarea
moleculelor pulin ionizate ili apE' Pentru separarea
cationilor se uttlizead cafoze sta{ionare
cationili (schimitori de cationi) qi drept eluenli, solufii
se folosesc anionili (schimb5tori de anioni) qi
i acizi, iar pentru separarea bazelor
ca eluenli r"r"iii o" baze, deexemplu, o solufie
de carbonat acid de sodiu. Structura acestora este
de cele mai multe ori diferitr de a

DETECTIA

La pdrrsirea coloanei ionii nu pot fi detectafi suficient


de sensibil, conductometric, in
mod direct, deoarece au concentrafii cobordte gi
sunt in eluentul format dintr-un
electrolit - cu o concentrafie comparabilS sau chiar"or1in,r1i
supresorul ionic- Acesra a fost realizat pentru prima
*ui *u.". De aceea s-a recurs la
datd de un grup de cercetitori american,
in t975, iar inilial a constat dintr-o coloand-supresor,plasati
in continuarea celei de separare,
cu rolul de a transforma- eluentur (un acid sau
o bazd irr"l i" pa. il;;;i;,
amintit anterior - acidul clorhidric - coloana supresor ;.ffi eruentur
este umpluta cu o r5gini schimb[toare
de anioni, avand o capacitate de schimb mare (de
tipul celei din Fig.12. 30- dreapta) cu o
formuli general5: R-oH' Prrrsind coloana a" r"purlr"
conlinend acid clorhidric
diluat, va pltrunde in coloana supresor unde se va petrece "ro*tor,
reacfia:

R-*H+gf +ffi] -* R-Ct+Ir:(} (12.35)


prin care acidul utrlizat drept eluent se. transformE
in ap6 _ un neelectrolit. intre timp, sErurile
se transformi in hidroxizii corespunzitori:

333
Rodic a Sirbu, Ticula Negreanu-Pirjol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Pirjol, Cormen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMTC{


FAXITACEUTICI

F.-OH + ${** + C* -- R-CX + {Fd** + OEr}


R-CIH + {If+ + C* :-* R*Ci + #{+ + ffEf} (12.36)

Apa fiind practic neionizati va pelmite detecfia sensibil[ a hidroxizilor - total i


ce au aplrut din zonele formate inilial din cele doui s5ruri. Schema unui cromatograf i
este reprezentatd in Fig.12.31a iar ?n Fig.12.31b este redat6 distribu{ia
speciilor ionice la iegirea din prima coloan[, in punctul A (Fig.12.31a). Pe aceeagi figur6 est;
prezerfiati conductan,ti gi la iegirea din supresorul ionic, in punctul B.
Semnalul (in pS ) este cel cate ar fi dat de citre un detector conductometic dacd w.
plasat in punctele A respectiv B. Deoarece gi eluentul este format din ioni care co&
curentul, inainte de supresor semnalul va fi mai slab. Deci, cea de a doua cromatogrgili
Ar
(Fig.12.32b) este chiar semnalul detectorului din IC.
Dac[ se urm6reqte separarea a doi anioni, de exemplu Cl- qi Br-, eluentul ar putea fi,
nu un acid ci obazd diluat5", de ex. NaOH, sau NaHCOz. in canil acesta separarea se E
rcaliza pe coloane de anionili qi eluentul ar fi de exemplu NaOH, la ieqirea din coloana &
separare avem in eluentul folosit zonele separate ale sErurilor anionilor supuqi analizei, aM
NaCl qi NaBr. Supresorul utilizat in acest caz ya fi format dintr-o r6qin[ de forma R-H h Bl
exces pe care se va petrece reaclia:

R-H + (Nu* + OH)


:
= R-Na + H2O (12.37)

Inafafi, de detectorul conductometric se mai pot utiliza gi alte tipuri de detectori cum Fig.12.31.
ar fi cei amperometrici sau voltametrici. supresomlu
Supresorul electrochimlc (sau autosupresorul) din cromatografele ionice recente, a inlocuit
mica coloand cu schimbdtori de ioni cu membrane schimbitoare (Fig.12.3i) avind aceeagi Elu
compozilie gi, in plus, schimbul ionic este accelerat prin electro dializd. in acest fel s-a m5rit membrane-
viteza procesului qi s-a micqorat volumul mort. Mai mu1t, a crescut durata de funclionare a componeil[
detectorului. De exemplu in Fig.12.32 se prezinti, schematic principiul de funclionare a unrd cationic[ Q
astfel de supresor electrolitic pentru cazul iegirii din coloand a oriciror anioni, notafi peo&rr doi electro:
simplitate cu X. redat rnai d

la,
E
la,

Fig.

i
i 334

L
Rodica Sirb u, Ticuya Negreanu-ptrj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-pirjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMIC{


ORFARMACEUTICI

tl

rfi
U

ffi
ffi..
ffiiffi.x
ffi.E
ffiE
Mg
ffiffi=
ffiffi{r? TJ
ffiffi
ffi
B *lrnqete@"-.-l
* ,", I .1. ..."
a
Dtlcctor t:.',:.'"' Y
cunrluctornelric
- c$n*l
7 TIMP
a) {bl
Fig.12. 31. Schema de principiu a cromatografiei ionice (IC) -(a) qi a modului de acliune a
supresorului ionic -(b). Aici RH este coloana de separare iar ROH, coloana supresor

Eluentul care a ieqit din coloana de separare trece prin spaliul ingust dintre doud
membrane. Dupi transfornarea eluentului in apd in interiorul supresorului electroliti c, iar a
componenlilor ionici separali ?n acizi, datoritd membranei care, de asti dati este una
cationic[ (RH), solulia intrl in detector iar ulterior alimenteazd, spaliul dintre membrane qi cei
doi electrozi: unul, pozitiv (+), respectiv celIlalt, negativ (-). Fenomenul de electrodializi este
redat mai detaliat in Fig.12.33.

Mcurhrxrfl *endprrxreabilfr
1*r ea::sl
Elue*t -Sr$S $iii8.+,Sie$i- #$#*:EsrS:4ri$ e**ili*S+$$S
la s*natr

Fig.12.32. Amplasamentul supresorului electrochimic la ieqirea din coloanl

335
Ro ilit a Strb u, Ticulo Negrean u'Piiri ol,
Iwliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu-Ptriol, Catmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICCI.CHIMIC,i


A COM ORFARMACEUTICI

L"ts3;1L".
coloani
I
Na'+X Ei N*+ os ruix'l
Canal
f t2o. o,

F ig.LL. 3 3. Principiul supresorului electroli tic bazat pe membrane


schimbdtoare de ioni in IC

In a<

Se poate observa cum membrana schimbdtoare de cationi, R-H, permite transferd fochisi ci 1

catonilor H+ (dinspre polul +) gi Na+ (spre polul -) dar nu permite transferul anionului X formdnd uo
datoriti efectului Donnan. Tot datoritd acestui efect nu traverceazd membrana nici ionul OIL grosimi cuP
i n detector intr5, in cantl separdrii unui amestec de anioni X-, respectiv Y-, doar acid tot parcursu
I{X respectiv HY total disociali in apd.In consecin{d in detectorul conductometric, din caua de eluent. P
lipsei de conductivitate a apei pure, raporlul semnaUzgomot este mult ?mbunitilit. unde faza s
sau, extrem
Celi
Aplicalii pulveruient
Una din cele mai importante aplicalii este analiza cationilor gi anionilor din ape, straturi sub
solulii sau fluide biologice, medicamente dar qi pentru analiza unor poluanli (cum ar fi ionul materiale ir
NHa + din apele naturale). Alte aplicalii imediate srnt analiza lichidelor de naturd apoasi formate pe
conlinAnd sdruri: sucuri de fructe, alimente etc. Metoda permite qi anahza unor specii ob$
organice polare cum ar ft acizlt sau aminele. de la o sr:

anorganic (
pentru aPlir
indicatori d
ce absorb
CROMATOGRAFIA PLANARA (TLC) tntunecate
specializate
Pen
Cromatografraplanard (CP) intAlnitd adesea sub denumirea de cromatografie in strat
aplic[ prot
sublire este cea mai simpll gi ieftind dintre toate metodele cromatografice cunoscute.
specializaa
in literatura de specialitate se utilizeazilmaimulte denumiri (cu prescurtSrile asociate
de probe, r
acestora). Pe lAngi termenul consacrat - cromatografta planard (planar chromatoglaphy - PC
din solulii
se mai intdlnesc denumiri cum ar fi cromatografia in strat sublire de inaltd performanp (high
procesul
performance thin layer chromatography - HPTLC) sau cromatografia de lichide planar
dr

(planar liquid chromatography - PLC).


pot supunr
preselectat

336
Rodica Strbu, Ticula Negrean u-ptrjol,
ruliana stoicesca, Bogdan $tefan Negreanu-ptrjor, carmen Elena
Lupu
METODE $I TEHNICI DE ANALIZi FIZICO-CHIMIC{
A COM OR FARMACET]TICI

Fozilia fiqalfi a
.i:l:,
j
frcntului Xa elutic
:.s

li*;

Frnbe Et*lor
A

F{41}
tinie de stafi

... -c
Fig-12. 34'Placacromatograficd gi poziliile rerative ale
spoturilor
in aceastd vaiantd'.a cromatografi.ei de lichide, separarea nu mai
are loc intr-o coloand
inchisr ci pe o fazd stalionard similai5,. granulari (poioasd)
dispusd ?ntr-un strat subfire,
formand un plan (Fig.12. 34). Acest strat denumit subfre,
se rcalizeazri dintr-un adsorbent cu
grosimi cuprinse inhe 100-250pm gi poate fi simplu
sau legat adeziv de un plan rigid, fiind pe
tot parcursul separirii ?n contact cu o fazd. gazoasd-
mai mult sau mai pulin saturatd cu vapori
de eluent' Primul caz a fost mult utilizat in h'ecut
in cazulaga-numitei pe hartie
unde faza stalionard consta dintr-o bandd de hdrtie "ro*utotufii
de filtru, confeclionata din celulozd purd,
sau, extrem de rat, prin{olosirea unor plEci din materiale
ceramice sinteizatepo.ou.".
Celilalt cazmultmaiutllizat face apel la straturi subliri realizate dintr-un
adsorbant
pulverulent (silicagel, celulozd, alumin5, poliamidd
sau derivate ale acestora) dispuse in
sffatud subflri pe pldci rigide din sticld sau, pe folii flexibile
din aluminiu, potiester sau alte
materiale inerte fald de sistemul pe care u." l,o. separarea.
Se mai poate recurge qi la straturi
ibrmate pe baghete de sticli sau tuburi din sticld.
Oblinerea straturilor subiiri se realiza la inceput in laborator (Fig.12.34),pornindu-se
ce la o suspensie apoasd a adsorbenfului pulverulent (10-40pm)
iripreurri'"u un liant
anorganic (de exemplu ghips, Sioz-coloidal) sau organic (amidon,
carboximet ilcelulozd), iar
oentru aplicare se foloseau nigte dispozitive m_ecanice simple.
Straturile subliri pot include qi
indicatori de fluorescenlE care in lumind lrv fac posibild iizualizareaspoturilor
substanielor
--e absorb in acest domeniu prin stingerea
_fluoiescenlei, adicd prin aparilia unor spoturi
:ntunecate pe fond luminos qi pot fi achizilionate gata pieparate-de la^{irme producdtoare
specializate.
Pentru a se putea demara procesul de elulie, in prealabil pe placa
cu strat subfire se
:plica proba' Acest lucru se rcalizeazla cu seringi ,uu *i"ro-pipete,
dar gi alte dispozitive
speciaTizate, astfel inc6t si se oblind aliniate, p" liniu
de start (rrg.t?.1+1,mai multe spoturi
Je probe, respectiv de amestecuri etalon - s.unust simultan."pure.il.
i",*ff;;;i"'se aplic[
iin solulii diiuate (l-2."/"), in anumili solvenli, pentru a se evita interferlnla
acestora in
:rocesul de elufie, pl5cile se usucd inainte de introducerea in amestecul
de solvenfi. Astfel se
:ot supune separdrii probe care se concentreazd. pe zone inguste (de lungime gi
laiime
:reselectate) asigur6ndu-se o eficienl6 mdritd separArii.

337
Rodica Sfrbu, Ticula Negreanu-Ptrj ol,
Iuliana Stoicesca, Bogdan $tefan Negreanu-Ptrjol, Carmen Elena Lupa

METADE $I TEHNICI DE ANALIZI FIZICO-CHIMIC{


.LOR
FARMACEATICI

Migrarea eluentului, are loc prin coloana deschisd, care aclioneazd ct totul analog celei reactiv, fie
?nchise (vezi LC), are loc sub acfiunea forlelor capllare gi provoac[ migrarea diferenliatd a qi chiar int
componentelor amestecului de separat. Acest lucru se realizeazd in urma simplei scufundiri un aspect i
(manuale) a pldcii cromatografice in eluentul potrivit. Din acest moment, eluentul irigAnd
prin capilaritate straful poros migreaz[ ascendent prin stratul sublire, provocind separarea-
Timpul de separare vaiazd intre 3 gi 60 min.
Nu este totuqi exclusd utilizarea unor dispozitive mai sofisticate de alimentare cu
solvenli (minipompe) - fredndu-se uneori apel chiar la gradienli de concentrafie. Se poate de
asemenea practica migrarea eluentuiui pe orizontald sau descendent.
Se poate elua o plac5 chiar de mai multe ori sau se poate evapora solventul in timpul migrdrii,
in aeest fel mirindu-se eficienla pe seama timpului de separare.
Penku realizarca separdrii (elufiei) se utilizeazi calnere de developare. Cdteva dintre
cele mai utilizate dintre aqestea se prezintS in Fig.12.35. Formele preferate sunt cele
paralolipipedice sau cilindriee (pahare), prevdzute cu un capac qi eventual cu un dispozitiv de
fixare a placii plane (h6rtie sau strat sublire) gi pot fi saturate cu amestecul de solvenli din
tanq, pentru a se miri viteza de elulie. Camerele paralelipipedice se Rumesc camere de tip N
D(
(nor-nrale) iar cele subliri poartd numele de camere de tip S (sandwich). Ultimele prezinti.
generali,
4vant4jul unui volum mai redus al fazei gazoase av6nd a vitezd de saturare mai mare qi o
majoritaEi
duratd a procesului de separare cu ceva mai mic6, (Fig.12.35).
altdvaiu
unor sfrd
fluorescer
spoturi in
substanlel
suficieati
fond intur
o
consti in
caz pldcll
avdnd cul

ffi.Jh.m
Fig.12. 34. Aparatul Linomat: aphcdprobele Fi9.12.35. C6teva dintre cele mai uzuale
in formi de benzi pe straturile subliri camere cromatografice in PC
separate
culoare. l
spotului r

Fr
:

Elulia are loc dupd introducerea plicii in camera cromatograficd", pdnd cAnd amestecul A
de solvenli atinge o ?nillime finald, fixat[ de obicei intre 5 qi 18 cm, sau un anumit timp mai mult
stabilit, in prealabil, prin incercdri preliminare. Solveniii utilizali se aleg in funcfie de repartilie
propriet5lile de elulie a1e substanlelor supuse separlrii (analizei). Natura acestora depinde nu cromatog
numai de substanlele implicate dar gi de mecanismul de separare propus, respectiv de faza deriva6i a
stafionari avutd la dispozilie. II
DupE elu{ie, placa se scoate, se usucd qi dacd spoturile nu se v6d, se trece la vizualizarea cromatog
acestora (operalie numitd uneori revelare). Pentru aceasta, placa fie se scufundi intr-un

338
Rodica Strbu, Ticu(a Negreonu-Pirjol,
luliana Stoicescu, Bogdan $tefau Negreanu-Ptrjol, Cannen Elena Lupu

ITETODE 8I TEHNICI DE,,INALIZ{ FIZICO-CHIMTC{


T
l:
I
A COMPa$rLOR FARMACE(/TICI

::activ, fie se pulverizeazd cu acesta sau se introduce intr-o atmosfera coniindnd gaze reacti\-e
.i chiar intr-o efuvi. 1a cald, c6,nd spoturile devin vizibile ?n urma unor reactii chimice (av0nd
.rn aspect apropiat celor din Fig. 12. 36).

.,r,=..r, :iil]]l;r,r

c**k @ :# iRllrFf
ryryry
@llwiill@,
r.<<vr..4 qsrffi ryr

Fig.12. 36. Aspectul plicilor 9i al spoturilor la vizualizare:


- in luminl UV (stAnga)
- iri lumind vizibild (dreapta)
Doar apoi se poate trece la etapa analizei propriu-zise. Reactivii de culoare pot fi
reirerali, ca de exemplu acidul sulfuric 1a calcl (120'C), care determind carbonizarea
rnajorit-dtii substanteior organice, sau specifici. cind ace$tia reaclioneazi doar anumite. O
alti varianti de a face spoturile vizibile. preferatii tot mai mult in ultirnul timp, este folosirea
unor stt"atilri subtiri fltrorescente (spre exemplu materialul pulverulent conline ZnS -
iiuorescent). Prin exanrinarea cromatogrametror eluate gi uscate in iumind ijV, se vor observa
spcturi inchise la culoare sau colorate, pe Ibnd fluorescent - iuminos. Atunci cAnd chiar
substanfele separate sunt t-luorescente nu mai este nevoie de fondul fluorescent gi este
suficientd o placd obignuitS. observatd ?n lunrind UV, spotunle devenind luminoase pe un
fond intunecat (Fig. i 2. 36).
O variantd q;i mai rnodernd. foafie eficace de vizualizare. tolosind tot lumini Llv.
constl in uiilizarea unor pldci cu straturi subtiri continend antesrecuri de ltnirtofbi'r. in acest
caz p1dc17e au o culoare compusi (de reguld lumina emanand din trei substanle iuminescente
ar,6nd culori diferite). Cum fiecare luminofor emite la o altd lungime de undd, iar substantele
separate absorb diferit lumina, fiecare component de pe placd va avea, in consecintd, o altd
culoare. In acest caz detec\ia este mai sigurl pentru cd nu difera doar pozilia relativa a
spotului respectiv pe placi ci gi culoarea .

Faze mobile qi faze stafionare

Anaiog cu crcmatografia de lichirie, respectiv cu varianta HPLC, in PC sunt posibile


mai multe rnecanisme de separare: (i) cromatografia de adsorblie, (2) cromatograiia de
reparliiie (cu faze directe gi cu lbze inversate), (3) cr:omatografia de schirnb ionic ai (4)
cromatografia de excluziune stericd. Aceleagi fuze stalionare (silicagei, alumin6, celulozl sau
deriva{i^ai acestora) se utilizeazd in granulalii fine (<40pim) dar ftrd pa4ile extra fine (<1pm).
In ultimul timp cAgtigd tot mai muit teren fazeTe chimice legate, perltlu separiri ?n
croraatografia de reparliiie cu faze inr.,ersate (solvenli polari gi ibze sta{ionare nepolare). Ca qi

339
Rodica Strbu, Ticula Negreatta-Pitj ol,
Iulianq Stoicescu, Bogdan $tefan Negreanu'Pirjol, Carmen Elena Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMICA


ACOMP FARMACEATICI

in HPLC, se uttlizeazi tot silicagelul silanizat avAnd grefate gruperi alchilice con{inAnd 8 m Tor
18 atomi de carbon - echivalente cu o peliculS sublire de fazA nepolarl depusi pe graauh bidimensir.
suport. singur) se r

Fazele mobile sunt adesea amestecuri de 2 pdnd la 5 solvenli cit mai diferili ca natd de solvenp
chimici, alegi prin incercdri preliminare. Pentru straturi subliri din silicagel (cele nrai cu 90o gi s
utilizate) prezentim o list6 cu i0 solvenli extraqi din 8 grupe de selectivitate (propus placa se vi
deSnyder, un cercetitor american care a clasificat solvenlii organici in funclie de mai muli cunoscut.
parametri structurali qi fizici), care diferi intre ele prin structura chimic[: eter etilic (grupa If
izopropanol qi etanol (I!, tetrahidrofuran (III), acid acetic (IV), diclormetan (V), acetat de ed
gi dioxan (VI), toluen (VII) li cloroform (VIID. Hexanul este un solvent considerat compk
nepolar gi este recomandat a fi introdus in amestecuri penku aducerea spoturilor in domenid
considerat optim, de Rf : 0.2-0.8 dacd mai este necesar.

ANALIZA CHIMICA PRIN PC

Fiecare compus separat prin PC este caracterizat (calitativ) de parametrul de retenlie


denumit Rf (o prescurtare de la termenul din l. engl.: retardationfactor). Acesta se calculeazi
astfel: Rs : (Distanla parcursd de componentul dat, i)/(Distanla parcursd de fronfl
solventului) sau

R1: x1 / xo (12.38)

unde cu xr, respectiv x0, s-au notat distanlele parcurse de componentul dat, respectiv &
frontul solventului, pAnI la oprirea cromatogramei. Toate m6rimile calculate pentru o colocmi
inchisi au o mlrime corespondentl gi in PC. De exemplu parametrul de retenlie R devine Rr
(f de la front):

a: ts
Ri:
(t2.3e)

unde v reprezintdviteze de migrare, t - timpi de migrare iar k factorul de capacitate. De aici" Fig.l
implicit:
Anal
k: llRr- I (12.40) executarea I

concentralia
Compar0ndu-se valorile Rf ale spoturilor etaloanelor cu cele ale substanlelor densitometn
proba de analizat (lucru rcalizat de cele mai multe ori vizual) se spune ci se face $CanareA. D
calitativd. Aceasta este cea mai uti15 aplicalie a metodei PC. Se pot identifica pesticide posibill gi u
ape, sol dar qi alte substanle pentru scopuri gtiinlifice gi tehnice cu o sensibilitate mult curbe de er
buni decdt in eprubetS. Desigur c[ sensibilitatea atinsS este inferioarl celei drn HPLC. crescitoare I
aeeea, in aplicaliile analitice de performan{[, cu toatS simplitatea gi prelul de cost scdzut netada curb
nu poate inlocui intotdeauna HPLC. liniar al met
principal pe
340
ft- .8arft Ticult tcgreu*pirjol,
IJar ,Sr-er lrt- ${dr ttpr>Dil ,'Cr:sa Dlesc LsS
METODE $I TETINICI DE ANALIZ{ FIZICO.CHIMIC{
A COMPU$ILO R FARMACEUTICI

Tot in scopul realizd/,i analizei calitative se poate practica


bidimensionald'in aceasti-variantd (Fig.12.37), se si cromatografia
atilizeaLdoplacd pdtratd,iar spotul (unul
singur) se aplici intr-unul dintre colluri]de exemplu:
in dreapta-jos. se elueaz[ cu un amestec
de solvenli 1, aYdnd loc o prim6 separare..Apoi,
dup[ oprire se usucd placa. se roteqte placa
cu 90o gi se incepe o nou6 irigare a acesteia ioto.ina,rn
utt u*.*.. de solvenfi, 2. Doar apoi
placa se vizualizeazd gi se compar[ cu o placd
etalon p,g ; avem un amestec similar dar
cunoscut.

Aptic*re Elutia I

Axpect fiunl

@# *:ffi

_ IIII
d#
__ #__ @e: #i#
# #,

Fig'12' 37' Modul de executare a cromatografiei bidimensionale


in strat sublire
Analiza cantitativd poate incepe dupa efectuarea
separdrii qi vizualizdrii sau prin
executarea unei mdsurdtori asupra unui param
etru fizic lraaioactivitate) p;opo4ional cu
concentralia substanlei din spotul de interes analitio.
Metodele practicate pe scard largd sunt
densitometria pin transmisie sau reflexie a spofului (spoturilor), respectivmai recent
scanarea' Densitometria se poate realiza in lumind
sau UV, in ultimul caz fiind,
posibili qi mdsurarea radialiei de fluorescenf5. Semnalul
"izitriia
m[surat servegte la construirea unei
curbe de etalonare din semnalele m6surate pentru
diferitele spoturi, conlin6nd cantitati
crescdtoare de component, aplicate, aldturi de pioba
necunoscutd, pe aceeaqi placd.s";r"f.;;
metoda curbei de etalonarein reflexie (adica prin
misurarea r"Rectanlei) deoarece domeniul
liniar al metodei este destul de ingust gi adesea curba
de etalonare este neliniard. Motivul
principal pentru care rczultatele analizei cantitative pc .rrt
prin inferioare HpLC sunt
341
Rodica Sirbu, Ticala Negreanu-Pirjol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreana-Pirjol, Carmen Elerua Lupa

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ( FIZICO.CHIMICI


A COMPA$ILOR FARMACEUTICI

neuniformitdlile stratului sublire care contribuie in mod hotdrAtor la mdirea raporhrlui indllimii p
semnaVzgomot, notat SA{. Astfel, confo m Fig.12.38, H este ?nIllimea picului (semnalulud semnalul i
analitului iar h, - ldlimea domeniului ?n care vaiazd" zgomotul de fond (intervalul +2o). spot, duce
liniar.
Ur
constituie
aceasta se
realiza ctt
Mr
HPLC. in
aparaturi I

semicantit
Este preze
De
Dar pentr
Fig. 1 2. 3 8. Ilustrarea mdrimilor care afectea zd, raporftlJ semnaUzgomot expertize
H suficient6.
- h"2 :3H
sa+: - h"
u2.4t)
O varianti mai simplS dar mai laborioasi de analizd cantitativ6 constl it spdlaru
zonei corespunzdtoarc analitului de pe suport ?ntr-un pahar, folosind un solvent adecvat gi
apoi determinarea, cu o altd metodd instrumentald, a concenkaliei soluliei reniltate.
Evaluarea cu ajutorul foto-densitometrelor este pdnd in prezent cea mai utllizatd metodd. in
aceste instrumente , placa cromatograficd cu stratul pe ea, se deplaseazd odatd, cu suportul (de
reguld in direclia developdrii), prin faq fantelor sistemului optic de iluminare, respectiv de
misurare a intensitilii luminii reflectate. Schema unui astfel de dispozitiv se poate observa fu
Fis.12.39.

(Xi x*

tr{g

Fig.12.39. Reprezentarca schematicd a unui densitometru

in aceastd figurd se pot rematca posibilitatea de utilizare a unei l5mpi cE


incandescen!5 - cu halogen - (W), pentru determin6ri in domeniul vizibil (400-800nm), a unei
l5mpi cu deuteriu (D) pentru spoturile care absorb in UV (190-a00nm) sau a unei l[mpi IIV
cu intensitate mai ridicati (cu xenon sau cu vapori de mercur), notatd 11g, pentru spoturile
fluorescente. Lumina monocromaticd care pirdseqte monocromatorul MC se reflectd pe
oglinda O, se reflectE pe placa cu sh'at sublire P iar lumina reflectatd este receptatl pe
fotomultiplicatorul .F, Semnalul oblinut este inregistrat de inregistratorul I, care poate fi chiar
un calculator. Dupd inregistrare, densitogramele se evalueazd cantitativ, fie prin mdsurarea
342
Rodica Strbu, Ticula Negreanu-ptrj ol,
Iuliana Stoicescu, Bogdan $tefan Negreana-ptrjol, Carmen Elenu Lupu

METODE $I TEHNICI DE ANALIZ{ FIZICO-CHIMTC{


A COMPUSILOR FARMACE UTICI

indllimii picurilor, fie a suprafelei acestora. Oricare dintre mlrimile misurate poate constitui
semnalul analitic. Trasarea graficului semnal analitic in funclie de cantitatea de substanln
din
spot, duce Ia o curb6 de etilonare. in cazul determindrilor de fluorescenti acest grafic
este
liniar.
Un exemplu de determinare cantitativd din domeniul controlului poluirii mediului il
constituie determinarea seleniului din ape. in acest caz inainte de aplicarea probei pe placd,,
aceasta se supune unei reaclii chimice numitl deivatizarc. Deivatizarea sellniului
se poate
r ealiza cu 2, 3 -diaminonaft alinr (DAN). Compusul rentltat este fl
uore scent.
Metoda PC este simpld gi ieftind dar, ca precizie qi exactitate, este adesea inferioara
HPLC' ln calitate de metodi semicantitativ5, PC este o metodi competitiv[ qi in lipsa unei
aparaturi performante (de exemplu HPLC) rdmAne uneori singura alternativ6. O analizd,
semicantitativd poate rdspunde la ?ntrebarea:
Este prezetttd speciaX intr-o concentralie mai mare decdt o concentralie limitd, C?
De foarte multe ori rlspunsul la aceastd intrebare este suficient in practica curent6.
Dar pentru monitorizarea automatd a conlinutului de poluanli din ape sau sol, pentru
-doar
expertize sau pentru conh"olul alimentelor, medicam"nt"lor, metoda pC nu este
suficient[.

343