INSTITUTUL DE CERCETARE DEZVOLTARE

PENTRU POMICULTUR
PITETI - MRCINENI

ADER 2.2.7
TEHNICI DE PRODUCERE I MENINERE A MATERIALULUI SDITOR
POMICOL DIN CATEGORIILE BIOLOGICE CANDIDAT, PREBAZ I BAZ

Director proiect: Dr. ing. Valentina ISAC

OBIECTIVUL GENERAL
Perfecionarea tehnicilor i metodologiilor de producere, meninere i
control sanitar al materialului din categorii biologice superioare n
vederea creterii calitii i reabilitri sectorului de producere a
materialului sditor pomicol, conform normelor n vigoare.

NECESITATEA
Obinerea materialului sditor pomicol liber de virusuri, conservarea si utilizarea
lui n producerea pe scar larg a pomilor certificai. Prin programul de
certificare sunt garantate statutul sanitar al materialului sditor pomicol ct i
autenticitatea acestuia.

RELEVANA
Proiectul este relevant pentru domeniul tiinific i pentru cel economic al
producerii materialului sditor pomicol, deoarece produsele obinute prin
activitatea de CD (ramuri altoi i portaltoi libere de virusuri) sunt promovate
i valorificate direct n sectorul economic prin producerea pe scar larg de
material sditor pomicol certificat.

Reglementrile noi, promulgate ndeosebi prin Legea 266/2002 ordinele 382/2002, 1295/2005
i 82/2010 iau n considerare att legislaia UE (Directivele Europene 77/93/CCE, 92/103/CEE
si 92/34/CEE) ct i recomandrile OEPP privind starea fitosanitar

Ord. 1295

4filieredecertificareamaterialuluidenmulire

2005
1.PB,B,C liberdevirus(vf)
2.PB,B,C testatdevirus(vt)
3.CAC
4.PB,B,C autenticitate lacerereaRO

Ord. 82

3filieredecertificareamaterialuluidenmulire

2010
Oct.2012

1.PB,B,C liberdevirus(vf)
2.PB,B,C testatdevirus(vt)
3.CAC
4.PB,B,C autenticitate lacerereaRO

SCHEMADEPRODUCERESICERTIFICARE(ord.82/2010)

FURNIZOR

MATERIALCANDIDAT

PARCELADEVERIFICARE
AUTENTICITATE

TESTAREVIROTICASIORGANISME
DAUNATOARE

MENTINERE
INVITRO

PREBAZA

PREBAZA

VIRUSFREE

VIRUSTESTED

PARCELACONTROL

BAZA

BAZA

AUTENTICITATE

VIRUSFREE

VIRUSTESTED

PARCELACONTROL

CERTIFICAT

CERTIFICAT

AUTENTICITATE

VIRUSFREE

VIRUSTESTED

MATERIALDE
PLANTAREFRUCTIFER
CertificatVf.

MATERIALDE
PLANTARE
FRUCTIFER
CertificatVt.

PARCELACONTROL
AUTENTICITATE

C.A.C.

MATERIALDEINMULTIRE

SELECTIEIDENTIFICARE

PARTENERI I BUGET
Buget iniial

Bugetrealizat

ICDPPiteti Mrcineni

657.250

627.900

95,5

SCDPBistria

124.125

118.226

95,2

SCDPConstana

41.125

39.688

96,5

TOTAL

822.500

785.814

95,5

OBIECTIVELE SPECIFICE
Crearea condiiilor pentru meninerea plantelor din categorii biologice superioare
(spaii insect proof).
Evaluarea i implementarea unor metodelor rapide de testare (ELISA, PCR) pentru
determinarea strii de sntate viral.
Dezvoltarea procedeelor pentru eliminarea virusurilor i meninerea materialului
biologic liber.
Managementul producerii materialului sditor pomicol conform schemelor de
certificare din legislaia actual, prin folosirea unor elemente biotehnologice n
nmulirea plantelor sntoase.
Realizarea unor verigi tehnologice privind obinerea materialului biologic din
categorii biologice superioare.

REZULTATEMSURABILE

Cuantificarea gradului de infectare cu virusuri;

Baz material format din 10 spaii izolate care s
asigure condiii pentru evitarea reinfectrii;
1-2 protocoale de lucru optimizate pentru testare i
diagnosticare viral;
35 - 45 clone selecionate conforme privind
caracteristicile de autenticitate i stare fitosanitar i
testate de virusuri;
Verigi tehnologice privind eliberarea de virusuri la
1 - 3 specii pomicole;
Biotehnologii de
nmulire
pentru
obinerea
materialului prebaz la 1-2 specii pomicole;
Plante prebaz i baz din soiurile a 10 - 12 specii
pomicole.

Elaborarea metodologiei de lucru - Stabilirea materialului biologic i

reabilitarea facilitilor

Selecionarea celor mai bune clone din punct de vedere al autenticitii,

calitilor pomologice i al productivitii - 76 soiuri:

10 soiuri de mr: Jonathan, Idared, Florina, Goldspur, Golden Delicious, Prima,

Generos, Romus, Starkrimson, Mutsu i portaltoii M 106 i M9;
9 soiuri de pr: Williams, Cure, Tudor, Monica, Argessis, Carpica, Williams rou,
Euras, Conference i portaltoiul Gutui A;
9 soiuri de prun: Agent, Ialomia, Gras ameliorat, Centenar, Silvia, Minerva, Diana,
Andreea, Delia i portaltoiul Mirobolan BN 4Kr;
6 soiuri de cire: Ponoare, Daria, Tentant, Superb, Stella, Germrsdorf i portaltoiul
IPC 5.
6 soiuri de viin: Mocneti 16, arina, Rival, Stelar, Ilva, Schattenmorelle;
7 soiuri de cais: Tudor, Goldrich, Traian, Sulmona, Sirena, Harcot, NJA 42;
8 soiuri de piersic: Catherine sel. 1, Cora, Creola, Liana, Delta, Florin, Cardinal,
Redhaven;
6 soiuri de cpun: Premial, Real, Red Gauntlet, Coral, Magic, Benton;
3 soiuri de zmeur: Cayuga, Opal, Ruvi;
4 soiuri de mur: Darrow, Thornfree, Dar 8, Dar 24;
6 soiuri de coacz: Abanos, Deea, Tsema; Jonkheer van Teets, Red Lake,
Houghton Castle;
2 soiuri de agri: Virens, Verda;

Studiu documentar referitor la sursele de material vegetal i caracterizarea

genotipurilor luate n studiu (22 pagini).

Crearea condiiilor impuse de reglementrile n vigoare pentru meninerea

plantelor CANDIDAT i PREBAZ (spaii insect proof)
ICDPPITETI
(toatespeciile)

Izolator de 180 mp, cu plante crescute n containere

i cu fertirigare programat

Reabilitarea a 10 izolatoare (2.200 mp), pentru

meninerea plantelor Iniiale i Prebaz n
conformitate cu normele n vigoare i asigurarea
condiiilor necesare evitrii reinfectrii cu virusuri.

SCDP BISTRIA
(specia prun)

Izolator de 52 mp, cu plante crescute n containere.

Izolator (300 mp), cu plante crescute n ghivece mari de

50 l, cte 6 ghivece pentru fiecare soi i portaltoi de prun.

TESTAREAVIROTICAMATERIALULUISELECTAT,RETESTAREAMATERIALULUIPREBAZ I
BAZ
Indexarea prin metode biologice, teste serologice i moleculare (ELISA, PCR)
pentru 68 boli virale, a artat c:

Plantele candidat selecionate sunt sntoase (-) i pot fi utilizate pentru obinerea
materialului PREBAZ i ulterior BAZ.

Rezultatele testelor ELISA au artat c soiurile de cire Ponoare, Daria i Superb

sunt infectate cu virusuri (ArMV, CLRV, PNRSV) iar soiul de viin Mocneti cu PPV.

Retestarea DASELISA la PREBAZA de prun Bistria, efectuat pentru PPV, PDV,

PNRSV, ACLSV, ApMV i MLRSV a fost negativ.

De asemenea, rezultatele IC-RT-PCR au confirmat absena PPV.

Testare cpun pe F. vesca UC 04

Altoire de foliol R. o.Munger - zmeur

Altoire cu ramur detaat - zmeur

Protocoaledelucruoptimizatepentrutestareidiagnosticare
Au fost experimentate i pot fi implementate protocoale ELISA - kit + protocol
Bioreba i kit + protocol Sediag pentru detectarea a 17 virusuri i phytoplasme.
Tehnicile moleculare de diagnostic au un potenial foarte ridicat de detecie viral
i sunt utile n procedura de certificare a materialului sditor.
DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL VIRUSULUI
PLUM POX
IC-RT-PCR foloseste kitul Qiagen One Step RT-PCR
i perechea de amorse polivalente P1/P2 care
amplific un fragment de 243 bp corespunztor
regiunii C-terminus a proteinei capsidale (Wetzel
i colab., 1991). Pentru imunocaptur se
utilizeaza antiser produs de BIOREBA.
Ciclul termic utilizat pentru RT-PCR cuprinde:
Reverstranscriere
30
min
la
50C,
denaturare/inactivarea reverstranscriptazei timp
de 2 min la 94 C urmat de 35 de cicluri:
denaturare ADNc - 30 s la 94 C, hibridarea cu
amorsele - 45 s la 61 C, elongaia ADNc - 60 s
la 72 C.
Dup ultimul ciclu urmeaza elongaia final la 72 C
pe durata a 10 min.
Produii de amplificare se separa prin electroforez,
n gel de agaroz (Sigma) 1,5%.
Vizualizarea produilor de amplificare s-a realizat n
lumin UV, imaginea gelurilor fiind achiziionat
cu o camer video DocPrint.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL FITOPLASMEI

EUROPEAN STONE FRUIT YELLOW (ESFY)
Nested-PCR, se realizeaz n dou etape de
amplificare
Pentru amplificare se utilizeaza ADN-ul total din
floem i nervurile frunzelor de prun, extras cu
ajutorul kit-ului de extracie Dneasy Plant Mini
Kit (Qiagen).
Pentru prima amplificare se recomanda primerii
P1/P7 (Schneider si colab., 1995), iar pentru
cea de-a doua amplificare setul de primeri
R16(X)F1/R16(X)R1 (Lee si colab., 1995).
Ciclul termic utilizat pentru Nested-PCR n ambele
etape
de
amplificare
este
urmtorul:
denaturare - 5 min la 94C, urmat de 35 de
cicluri: denaturare ADNc - 20 s la 92C,
hibridarea cu amorsele - 20 s la 55 C,
elongaia ADNc - 40 s la 72 C.
Dup ultimul ciclu urmeaza elongaia final la 72 C
pe durata a 10 min.
Migrarea si vizualizarea produilor PCR se face
identic cu procedura pentru IC-RT-PCR

nmulirea materialului selecionat

- devirozare

A fost nmulit fondul biologic plante Candidat (iniiale) la speciile pomicole

lemnoase i la cpun i arbutii fructiferi.
n urma lucrrilor de altoire efectuate la ICDP au fost nmulite 13 soiuri la specia
mr (78 plante), cte 10 soiuri pr i prun (50 de plante din fiecare specie), 3 soiuri
la cire (15 plante), iar la viin s-au obinut 25 de plante din 5 soiuri.
La prun, Bistria a nmulit prin altoire n vederea obinerii plantelor Candidat 7 soiuri
(64 plante) testate serologic i molecular i stabilite ca Virus free.
Aplicarea nmulirii prin butai a permis realizat nucleul de plante Candidat la 3
soiuri de coacz negru i 3 soiuri de coacz rou totaliznd un numr de 32 plante la
container meninute n prezent n spaii izolate.
Pentru realizarea nucleelor de Plante iniiale i Prebaz (material in vitro) au fost
folosite i elemente biotehnologice:
- Au fost optimizate protocoale de lucru i randamentele n fiecare faz a
culturii in vitro.
- au fost create nucleele de plante iniiale in vitro la 5 soiuri de cpun, 4
soiuri de zmeur, 3 soiuri de mur i a portaltoilor M9 i M106 (mr), Gutui A (pr), IPC
5 (cire, viin), Mirobolan BN 4Kr (prun). Plantele obinute sunt folosite la
producerea prin micropropagare a nucleelor de plante Prebaz n funcie de
necesitile activitii de producere a materialului sditor pomicol.

n procesul de devirozare au fost introduse un numar de 3 soiuri de cire i un soi de

viin. Metoda aplicat a fost prin culturi de meristeme. A fost stabilit mediul de
cultura LF cu 0,3 mg/l GA3 si 0,01 mg/l IBA ct i protocolul de lucru pentru
speciile respective.

Plantecpun arbutifructifericertificatela
categoriaPrebaz
Specia/soiul

Plantat la aclimatizare

Numr plante
certificate

Lot nr.
3AG6091 3AG01

Premial

5400

2500

Real

1100

500

3AG6101 3AG01

Magic

3000

1500

3AG6111 3AG01

Redgauntlet

1700

800

3AG6121 3AG01

Benton

1250

500

3AG6131 3AG01

Darrow

1500

250

3AG6471 3AG01

Thornfree

750

250

3AG 6481 3AG01

Opal

1560

360

3AG3411 3AG01

Ruvi

440

40

3AG3421 3AG01

Star

200

18

3AG3431 3AG01

Gustar

500

10

3AG3491 3AG01

Cayuga

960

165

3AG7361 3AG01

Vely

500

100

3AG3551 3AG01

Testarea/retestarea i meninerea materialului Prebaz i

Baz existent
CP - A fost constituit un nucleu de plante Prebaz pentru
ramuri altoi la speciile lemnoase pentru care a fost depus
documentaia la ITCSMS Arge n vederea certificrii.

Retestarea viral a Prebazelor a identificat numai la prun,

infecie cu PPV: 3 plante din soiul Gras ameliorat i 2 plante
din soiul Ialomia diagnostic confirmat att prin metoda DASELISA ct i prin AGRISTRIP.

Materialul sntos rmas n biodepozitarul ICDP PitetiMrcineni constituie materialul din care se vor nmuli
plantele BAZ, necesare nfiinrii plantaiilor mam ramuri
altoi, de butai i a marcotierelor.

Rezultatele retestrilor efectuate la soiurile de cpun i

arbutii fructiferi au artat c plantele testate sunt sntoase,
starea lor sanitara fiind liber de virusuri.

PlantePREBAZla
containerICDPPiteti

P1 - n urma inspeciei efectuate la SCDP Bistria, ITCSMS Cluj a eliberat documentele oficiale de

certificare la categoria PREBAZA a ase soiuri de prun: Agent, Gras ameliorat, Centenar,
Minerva, Andreea i Delia. Rezultatele analizelor au reconfirmat statusul virus-free al plantelor
BAZA meninute n biodepozitarele de la SCDP Bistria.
P2 - A fost constituit nucleul de material Prebaz format din 24 soiuri de piersic i 23 soiuri la cais.
Toate soiurile retestate au prezentat test negativ fr soiul Cardinal infectat cu PPV.

PREBAZA ICDP 2013

Specia
Mr
Pr
Prun
Cire
Viin
Cais
Piersic
Nectarin
Zmeur
Mur
Coacz negru
Coacz rou
Agri
Afin
Ctin
Cpun

Soiuri
10
9
9
6
6
4
2
1
6
4
3
3
2
2
2
5

Nr.plante
42
24
12
22
12
5
6
1
365
550
3
3
2
2
2
10.000

Specia
Mr
Pr,gutui
Prun

Cire,viin

Piersic
Cais

Portaltoi
Nr.plante
M106
250
M9
2
BN70
2
GutuiA
2
Mirobolandwarf
3
MirobolanC5
2
MirobolanBN4Kr
2
IPC2
2
IPC3
2
IPC4
2
IPC5
2
IPC7
2
Adaptabil
2
Apricor
2

MaterialulbiologiccertificatlacategoriaPrebazn2013
SCDPBistria prun
Soi/portaltoi

Cant
.

Lot nr.

Etichete oficiale
atribuite
Nr. total/serie/de
la...pana la

Agent/Mirobolan29C

3BN0671-3BN01

3/BN/799840-799842

Gras
ameliorat/Mirobolan29
C

3BN0672-3BN01

3/BN/799843-799845

Centenar/Mirobolan29C

3BN0673-3BN01

3/BN/799846-799848

Minerva/Mirobolan29C

3BN0674-3BN01

3/BN/799849-799851

Andreea/Mirobolan29C

3BN0675-3BN01

3/BN/799852-799854

Delia/Mirobolan29C

3BN0676-3BN01

3/BN/799855-799857

Total

18

Aspectedinfazadefortificarelaghiveciaprebazelor
dezmeur(A),cpun(B),mur(C),portaltoi(D)

Diseminare - participare la 8 simpozioane i sesiuni tiinifice, o conferin

naional i o conferin internaional. Au fost publicate 14 lucrri tiinifice att n
reviste cu caracter tiinific dar i tehnic, utile instituiilor de cercetare, universiti
de profil horticol, pepiniere de producie.

Pentru creterea competitivitii sectorului de producere a materialului sditor din Romnia, dar i pentru a
creterea vizibilitatea i credibilitatea rii noastre pe plan internaional n acest domeniu de interes pentru
agricultur este necesar continuarea activitii proiectului prezentat.

Sprijinfinanciar
PERMANENT

Sprijinfinanciar
PARTIAL

investiii
ntreinere
testari virotice

Investiie
specifica

PREBAZA

2013

Pr. sectorial

BAZA

2018

CERTIFICAT

materialdeplantare
fructifer