Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Biotech
Biotech
1
Aminoacizi
Acid L-Glutamic Corynebacterium glutamicum 3108
L-Lysin Brevibacterium flavum 3107
L-Fenilalanin Corynebacterium glutamicum 2106
L-Arginin Brevibacterium flavum 2106
Ali aminoacizi Corynebacterium spp. 1106
Transformri microbiene
Steroizi Rhizopus arrhizus
D-Sorbitol la L-sorboz Acetobacter suboxydans 4107
(n producia de vitamina C)
Polizaharide extracelulare
Xanthan Xanthonomas campestris 5106
Dextran Leuconostoc mesenteroides
Nucleotide
5- Guanosin monofosfat Brevibacterium ammoniagenes 1105
Enzime
Proteaze Bacillus spp. 6105
-Amilaze Bacillus amyloliquefaciens 4105
Glucoamilaze Aspergillus niger 4105
Glucozizomeraz Bacillus coagulans 1105
Pectinaze Aspergillus niger 1104
Renina Mucor miehei sau drojdii recombinanta 1104
Vitamine
B12 Propionibacterium shermanii 1104
Ribovlavina Eremothecium ashbyii
Alcaloide Ergot Claviceps paspali 5103
Pigmenti
-Carotene Blakeslea trispora 60
Vaccinuri mpotriva:
-difteriei Corynebacterium diphtheriae <50
-tetanosului Clostridium tetani
-pertussisului (tusea convulsiv) Bordetella pertussis
-virusului poliomielitei Virusuri active atenuate cultivate in vitro
-rubeolei, etc
Proteine terapeutice
Insulina; Hormonul uman de cretere <20
Bacterii, drojdii sau cellule mamaliene
Eritropoietina; Factorul VIII-C;
recombinate
Interferonul-2, etc
Insecticide
Spori bacterieni Bacillus thuringienis
2
Spori de fungi Hirsutella Thompsonii
Antibiotice
Peniciline Penicillinum chrysogenum 3-4107
Cefalosporine Cephalosporium acremonium 1107
Tetracicline Streptomyces aureofaciens 1107
Antibiotice macrolide Streptomyces erythreus
Antibiotice polipeptide Bacillus brevis 2106
Antibiotice aminoglicoside Streptomyces griseus
Antibiotice aromatice Penicillium griseofulvum 1106
Anticorpi monoclonali Celule de tip Hybridoma <20
3
mai multe informaii referitoare la necesarul de oxigen al microorganismului sau la
caracteristicile de spumare ale mediului sau ali parametrii. De asemenea pot fi
identificate limitrile impuse de tipul bioreactorului.De exemplu, dac acesta nu poate
asigura necesarul de oxigen, celulele sunt nfometate. n mod similar, dac agitarea
mediului de cultur nu este adecvat, aceasta poate conduce la spargerea celulelor i
devierea procesului de cultivare. In bioreactor se stabilesc condiiile pentru o anumit
activitate a celulelor. In aceast faz se calculeaz diferii parametrii cum ar
fi:coeficienii de transfer de mas, timpul de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului,
puterea de agitare i muli alii. Aici se decide dac cultura de celule poate fi operat
cel mai bine n sistem "batch", semi-continuu sau continuu. De asemenea pot fi
ncercate diferite tipuri de bioreactor. Se realizeaz de asemenea un calcul economic
de fezabilitate.
2. Urmtoarea treapt de ridicare la scar este aceea de bioreactor pilot. n aceast faz
se implic specialistii instruii n ingineria bioproceselor i n ridicarea la scar
industrial a acestora. In prezent se construiesc vase de 100-1000 l dup specificaiile
prototipului de laborator. Scopul fazei pilot este acela de a examina raspunsul
celulelor cultivate la o scar mai mare. n aceast treapt de operare, rezultatele pot fi
mai bune sau mai sczute fa de cele obinute n bioreactorul laborator. n funcie de
aceste rezultate se hotrte dac se trece la producia industrial sau nu. Aceast parte
a procesului tehnologic aparine n ntregime ingineriei bioproceselor: se proiecteaz
att bioreactorul industrial ct i facilitile auxiliare: echipamente de sterilizare aer i
mediu, generator de abur, utilaje necesare preparrii mediilor de cultur, sistem de apa
de racire, aparatura de automatizare i control. O importan deosebita se acorda
faptului ca instalaia trebuie s asigure conditii aseptice pe ntreg fluxul de productie.
3. O parte important a unui proces biotehnologic o constituie faza de recuperare a
produsului din mediul de producie i anume izolarea si purificarea acestuia pna la
produsul finit. Aceast faz este adesea foarte dificil pentru produsele rezultate prin
tehnologia ADN recombinant, astfel nct costurile reprezint 80-90% din costul total
al bioprocesului. Procedeul aplicat pentru izolare i purificare depinde de natura
produsului i cuprinde metode fizice, chimice, biologice. Multe metode ncercate n
laborator i care au dat rezultate bune, nu pot fi aplicate la scara industrial. n aceast
faz, biochimitii, inginerii chimiti, tehnologii au o contribuie important n
recuperarea i purificarea substanei active. Procedeele elaborate includ: filtrri
,centrifugri pentru separarea celulelor de lichid, metode mecanice de distrugere a
membranei celulare, dac produsul este intracelular, extracii cu solventi, metode
cromatografice, separri prin membrane, cristalizri i uscri.Toate aceste procedee
sunt testate mai nti la scara mic i apoi la scar pilot i industrial.
Dupa ce produsul a fost purificat pn la standardele cerute de normele internaionale,
acesta poate fi ambalat i vndut. In cazul produselor farmaceutice noi este necesar i testarea
eficacitii acestora, mai nti pe animale i apoi pe oameni. Pentru produsele uz alimentar sunt
cerute alte teste specifice.
4
Pentru toate produsele obinute pe cale biotehnologic se cer avize oficiale conforme cu
standardele existente pentru fiecare tip de produs. Din acest exemplu se poate vedea c ntr-un
bioproces sunt implicate multe discipline diferite att tehnice ct i discipline fundamentale.
Specialitii din domeniul biotehnologiei se confrunt n mod constant cu probleme aparinnd
domeniilor: biologie, chimie, fizic, inginerie i uneori medicin.
Sfera domeniilor de aplicabilitate a biotehnologiilor este foarte mare, dat fiind varietatea
proceselor biotehnologice.
Principalele direcii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate n primul
rnd de descoperirile recente din domeniul biologiei moleculare dar i de cerinele societii fa
de anumite aspecte cu care se confrunt n prezent: criza energetic, epuizarea rezervelor de
hran de pe planet, probleme ecologice i de bioremediere.
ncercnd o clasificare a diferitelor tipuri de biotehnologii, n funcie de domeniul n
care se aplic sau tipul de celule utilizate, observm c este greu s realizm o delimitare. Orice
manipulare a viului n folosul societii, nseamn biotehnologie. Indiferent dac aceasta se
realizeaz la nivel laborator avnd un caracter de cercetare fundamental sau se realizeaz la
nivel industrial avnd un caracter aplicativ, scopul final i n general tehnicile sunt asemntoare
i incluse n aceeai sfer larg a biotehnologiei.
1. n funcie de tipul de celule cu care se lucreaz, deosebim: biotehnologii : microbiene,
vegetale i animale.
2. n funcie de domeniul n care i gsesc aplicaii produsele obinute pe cale
biotehnologic deosebim:
Biotehnologii industriale (acestea cuprinznd biotehnologii farmaceutice,
alimentare i biotehnologii de depoluare).
Biotehnologii agricole (care cuprind dou mari domenii: biotehnologii
vegetale i biotehnologii n zootehnie)
Biotehnologii medical-veterinare
Biotehnologiile industriale cuprind procedee de obtinere a unor produse de larg interes,la
nivel industrial,utiliznd microorganisme sau enzime.n categoria biotehnologiilor farmaceutice
intr:
producerea de biomas proteic
biosinteza antibioticelor
producia de acizi organici
producia de aminoacizi, enzime, obinerea de probiotice, hormoni, vitamine,
polizaharide.
n funcie de gradul de puritate, produsele obinute pot fi utilizate att pentru consumul
uman ct i animal.
5
Biotehnologiile alimentare cuprind procedee industriale de prelucrare a legumelor i
fructelor, a laptelui i produselor lactate, a crnii, viznd n general aspectele fermentative ce stau
la baza obinerii acestora.
n cadrul biotehnologiilor de depoluare a mediului sunt incluse toate metodele i tehnicile
de epurare biologic a apelor uzate sau poluate, a aerului sau ale solurilor degradate, extracia de
minereuri cu ajutorul microorganismelor sau metodele de bioremediere cu ajutorul plantelor sau
microorganismelor.
Biotehnologiile agricole vizeaz un domeniu larg de aplicare i presupun att utilizarea
aspectelor tradiionale de ameliorare a plantelor i animalelor ct i cele moderne, bazate pe
manipularea genetic controlat a informaiei genetice a celulelor vegetale (biotehnologii
vegetale) sau a celor animale (biotehnologii animale cu aplicaii n zootehnie sau medical
veterinare). Biotehnologiile vegetale vizeaz utilizarea culturilor celulare vegetale precum i a
tehnicilor de inginerie genetic n scopul obinerii de noi soiuri cu rezisten la atacul agenilor
patogeni, tolerante/rezistente la factori de mediu defavorabili, la implementarea de sisteme
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole i obinerea de noi hibrizi
cu proprieti mbuntite etc.
Biotehnologiile din domeniul zootehniei se refer n special la nutriia animal, creterea
rezistenei animalelor la atacul factorilor patogeni, biotehnici de reproducie artificial i de
predeterminare a sexului la animale, conservarea resurselor genetice animale.
Biotehnologiile medical veterinare au ca scop, n principal, crearea unor sisteme de
diagnostic rapid i eficient a maladiilor sau dereglrilor funcionale la animale sau la om,
producerea unor sisteme biologice de combatere a bolilor (anticorpi monoclonali, vaccinuri,
ageni de biocontrol), realizarea de studii n vederea clarificrii mecanismelor implicate n
producerea unor procese patologice sau n rezistena la diverse boli etc.
Saltul tiinific nregistrat n fiecare din domeniile biotehnologiei enunate mai sus nu ar fi
fost posibil far aplicarea tehnicilor noi de biologie molecular, legate de transferul de gene i
clonarea molecular pentru obinerea unor noi tipuri de celule si organisme; astfel este posibil
obinerea de linii celulare noi cu proprieti utile pentru medicin, agricultur, zootehnie,
industria alimentar. Incorporarea unor gene dorite, utile, conduce la obinerea unor produse noi
de interes medical sau industrial.
CAPITOLUL 2
ETAPELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC
6
2.1. Faza de laborator
Cercetrile de obinere a unui produs prin biosintez ncep cu lucrri de laborator care
constau n: izolarea i selecia oragismelor (microorganismelor) de interes; ntreierea tulpinilor
cu proprietile dorite; realizarea culturilor inocul.
Izolarea i selecia unui mare numr de microorganisme cunoscute din literatura de
specialitate ca productori ai compusului ce urmeaz a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate n acest
scop sunt specifice pentru fiecare microorganism, cele mai multe referindu-se la tehnica diluiilor
i tehnica granulelor de sol.
Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide,
astfel nct s fie posibil punerea n eviden a unor caracteristici fiziologice. n prima etap se
urmrete realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei,
diluii succesive), dup care se stabilete o metod de triere (screening) adecvat scopului
urmrit.
De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plci Petri, pe medii solidificate cu agar-
agar. In cazul n care se urmrete selectarea unor microorganisme productoare a unui anumit tip
de enzim se realizeaz teste de identificare care pot fi calitative sau cantitative. n cazul
enzimelor se aplic de obicei metode de identificare calitativ prin includerea substratului
specific n mediul solid pe care se cultiv microorganismele (de ex.amidon n cazul amilazelor,
casein n cazul proteazelor, celuloz n cazul celulazelor). Dup dezvoltarea coloniilor izolate,
enzimele difuzeaz n gelul de agar-agar, atacnd substratul inclus n mediu i astfel zona
respectiv poate fi vizualizat, n cazul n care devine transparent sau cu un reactiv specific. In
cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultiv pe medii
specifice dup care se utileaz fie lichidul de biosintez fie extracte din culturile respective.
Produsele respective sunt prelucrate n scopul dozrii cantitative prin metode spectrofotometrice,
fluorescen, titrimetrice, polarimetrice. n urma acestor teste se rein numai cteva tulpini care
au dat cele mai bune rezultate n ceea ce privete biosinteza enzimei.
ntreinerea tulpinilor productoare. Dup faza de izolare i selecie, tulpinile
productoare se supun unor teste de caracterizare dup criterii morfologice, biochimice,
fiziologice, imunologice sau toxicologice; tulpina astfel caracterizat se nregistreaz ntr-o
colecie de microorganisme, n vederea protejrii sale i a utilizrii ulterioare.
Tinnd cont c scopul este de a obine un anumit produs la nivel industria este necesar ca
nivelul biosintezei s fie ridicat; de aceea se optimizeaz parametrii de biosintez sau tulpina
microbian de interes este supus unor teste de ameliorare prin metode clasice (mutagenez) sau
moleculare (inginerie genetic).
Conservarea microorganismelor de interes, att tulpinile parentale, ct i tulpinile
modificate genetic (mutante sau recombinate) se face prin metode speciale, aa cum sunt
liofilizarea i conservarea n azot lichid. Tulpinile din colecie utilizate n lucrrile de biosintez
curente se pstreaz sub diferite forme i formeaz aa numita cultur stoc de la care se
pornete procesul de biosintez. Cultura stoc este pstrat la frigider, pe mediu agarizat, n tuburi.
Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator, se pornete de la o astfel de cultur vegetativ.
7
Cultura inocul. Inoculul reprezint o cultur microbian n curs de multiplicare pe un
substrat nutritiv corespunztor i n anumite condiii de dezvoltare (pH, temperatur, agitare,
aerare) specifice. Inoculul constituie materialul de nsmnare al mediului de biosintez propriu
zis, din etapa urmtoare. Transferul culturii inocul n mediul de biosintez se realizeaz n
condiii aseptice, dup o perioad de dezvoltare bine stabilit (vrst, cantitate, aspect
microscopic).
8
o medii sintetice care conin numai compui cu structur chimic
cunoscut care pot fi dozai;
dup tipul respirator al microorganismelor cultivate se deosebesc:
o medii pentru microorganisme aerobe
o medii pentru microorganisme anaerobe;
dup scaopul i frecvena ntrebuinrii deosebim:
o medii de uz curent;
o medii speciale utilizate n general n studiile de izolare a
microorganismelor la nivel de laborator. Acestea pot fi la rndul lor:
elective, selective, de mbogire, de conservare, de identificare;
dup faza de biosintez la care este utilizat mediul de cultur poate fi mediu
laborator, pilot sau mediu de cultur industrial;
dup destinaia final a culturii dezvoltate mediile pot fi:
o medii pentru cultura inocul;
o medii pentru cultura de regim numite i medii de fermentaie sau medii
de biosintez.
n biotehnologie se utilizeaz n mod curent mediile naturale avnd la baz subproduse
agroalimentare, cumr ar fi: rot de floarea soarelui, de soia, fin de porumb, tre de gru,
extractul de porumb. Aceste medii conin n general elemente nutritive necesare dezvoltrii
microorganismelor, la care se adaug de obicei cantiti mici de sruri minerale.
Mediile naturale sunt n general mai ieftine dar prezint dezavantajul variabilitii
compoziiei, ceea ce nu permite o standardizare corespunztoare i n consecin nu permite
reproducerea procesului de biosintez cu un randament constant. Spre deosebire de mediile
naturale, mediile sintetice sunt perfect reproductibile la scar industrial.
Un mediu de cultur utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie s conin
ntodeauna:
sursa de carbon (n general glucide: glucoz,amidon, lactoz, zaharoz, etc.)
sursa de azot care poate fi organic (aminoacizi, proteine,uree), sau anorganic (NH3,
(NH4)2SO4, etc. )
sursa de fosfor (H3PO4, (NH4)3PO4, KH2PO4 , etc)
oligoelemente: K (din KCl sau K2HPO4); Mg ( din MgSO4); Fe (din FeCl3)
factori de cretere: aminoacizi, proteine, vitamine, coenzime.
Compoziia mediului nutritiv specific pentru un microorganism se stabilete n laborator,
prin cultivarea acestuia, alegndu-se astfel, n funcie de scopul urmrit, mediul optim de
cultivare. Uneori, pentru creterea randamentului n faza de biosintez, se adaug la mediu
precursori care sunt substane avnd poriuni structurale ale moleculei produsului de biosintez.
n procesele de biosintez, sursa principal de energie o constituie sursa de carbon,
respectiv glucidele. n procesele catabolice, prin oxidarea biochimic a glucozei se elibereaz o
mare cantitate de energie, din care o parte este nmagazinat n compuii macroergici (ATP), iar
restul este preluat de mediul de cultur cu ajutorul sistemelor de termostatare ale bioreactoarelor.
9
Sursa de carbon furnizeaz de asemenea necesarul de oxigen i hidrogen necesar dezvoltrii
microorganismului.
De exemplu, mediile de cultur utilizate n producia de enzime trebuie s conin
elementele eseniale: carbon, azot, sulf, oxigen, fosfor, magneziu, calciu i numeroase alte
elemente n cantiti foarte mici (urme): fier, cupru, cobalt, zinc, mangan, molibden - care sunt
necesare funciilor celulare de baz. De cele mai multe ori este ns nevoie s se utilizeze un
mediu de producere a enzimei ct mai ieftin i posibil de reprodus o perioad ct mai lung de
timp. Aceasta conduce la utilizarea unor substrate ct mai ieftine i mai accesibile n conjunctura
economic respectiv; nlocuirea unui component din compoziia mediului nutritiv conduce la
variaii n randamentul de producere al enzimei, astfel nct studiul aprofundat al influenei
diferitelor componente ale mediului de cultur asupra biosintezei enzimei, constituie un element
important al cercetrilor n domeniul produciei de enzime.
Sursa de carbon utilizat n compoziia mediilor de cultur pentru enzime este suplinit n
mod obinuit de glucide de o anumit puritate sau de un material natural coninnd un amestec de
glucide. Astfel, melasa de sfecl sau de trestie este folosit n multe cazuri drept surs de
zaharoz. Alte surse de carbon utilizate n producia de enzime: siropul de glucoz, amidonul de
porumb sau de cartofi, hidrolizatul de amidon de cereale (gru, orez, porumb) sunt n mod
frecvent folosite ca surse de glucoz, zerul ca surs de lactoz.
Sursa de azot poate fi reprezentat n diferite forme de surse anorganice, cum ar fi:
amoniacul, srurile de amoniu sau amestecuri complexe de tipul extractului de drojdie, a celui de
porumb, pepton, fin de soia sau distilate solubile. Fosforul, sulful i cationii eseniali sunt, n
general, suplinii de srurile anorganice. Uneori se adaug elemente specifice n cantiti mici,
dar de obicei acestea sunt aduse de ap sau de alte componente ale mediului. Dintre factorii de
cretere, tiamina i biotina sunt necesare pentru creterea microorganismelor.
10
concentraiei de substrat n mediul de cultur poate conduce la sporirea numrului de celule
microbiene, dar numai pn la anumite limite, multiplicarea acestora fiind ncetinit, de procese
de inhibiie care au loc la nivelul celulei. Aciunea unui inhibitor asupra celulei microbiene se
poate exercita prin:
modificarea potenialului chimic al substratului, intermediarilor metabolici sau
a produsului finit;
modificarea permeabilitii peretelui celular i reducerea transportului
substanelor nutritive;
modificarea activitii enzimelor implicate in procesul metabolic;
disocierea agregatelor metabolice;
modificarea parametrilor funcionali ai celulei microbiene (capacitatea de
multiplicare, mobilitatea, biosinteza unor metabolii).
Mecanismele prin care se realizeaz inhibiia sunt:
reacie chimic cu una sau mai multe componente celulare;
adsorbia sau complexarea unor enzime sau coenzime;
intervenia n secvene a reaciilor biochimice;
intervenia n disocierea complexelor enzimatice;
modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintez (pH, trie
ionic, constant dielectric, capacitate de solvatare);
intervenia n funciile celulare de control.
Datorit acestor fenomene concentraiile mari de substrat inhib dezvoltarea
microorganismelor ntr-un anumit grad ajungnd chiar la inhibiie total, motiv pentru care,
pentru un sistem de biosintez se stabilete concentraia optim a substratului att n momentul
iniial ct i pe parcurs. De exemplu, pentru foarte multe bacterii concentraia de 10-15% n surs
de C (glucoz, zaharoz) este inhibitoare, ele dezvoltndu-se bine la valori ale sursei de carbon
sub 10%.
Acesta este motivul pentru care n soluii foarte concentrate de zahr (de exemplu
dulceuri, siropuri) microorganismele n general nu se dezvolt, acestea putnd fi conservate pe o
lung perioad de timp.
Calitatea i cantitatea inoculului joac un rol important pentru obinerea unor metabolii
cu randamente dorite de biosintez. Cel mai adesea se utilizeaz o cantitate mare de inocul pentru
a determina o declanare rapid a dezvoltrii culturii concomitent cu reducerea riscului de
contaminare. In majoritatea cazurilor este necesar ca dimensiunea inoculului s se situeze ntre 3
10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie n parte se stabilete aa numitul
raport optim de inoculare care definete dimensiunile optime ale inoculului.
Pentru asigurarea unei productiviti i msurarea densitii inoculului se extrag probe din
cultura aflat ntr-un anumit stadiu de evoluie optim pentru obinerea unei producii maxime a
11
metabolitului dorit i se determin parametrii specifici (numrul de germeni pe unitatea de
volum, sau coninutul n biomas uscat raportat la unitatea de volum). Efectele determinate de
mrimea i vrsta inoculului sunt specifice pentru diferite microorganisme.
De exemplu, la bacterii, mrimea inoculului la bacterii are influen pronunat asupra
stadiilor ulterioare ale culturii, determinnd diferite stri fiziologice ale celulelor n funcie de
care variaz capacitatea de biosintez a metabolitului dorit. Cnd se utilizeaz o cantitate mare de
inocul, se micoreaz faza de lag datorit formrii i acumulrii unor metabolii intermediari
eseniali care pot difuza n celule i n mediul de cultur mai rapid dect n cazul utilizrii unui
inocul mic. Uneori ns, cantitile mari de inocul determin apariia unui fenomen de
autoinhibiie datorat sensibilitii celulelor bacteriene fa de unii produi metabolici intermediari.
Pe de alt parte, cnd mrimea inoculului este ns prea mic, faza de lag poate fi prelungit la
infinit i aceasta nu poate conduce la o dezvoltare normal a culturii de microorganisme. S-a
observat c n cazul bacteriilor, pentru iniierea dezvoltrii unui inocul este necesar prezena n
mediul de cultur a unei concentraii critice de metale grele. De exemplu pentru un inocul de
Bacillus subtilis este necesar prezena n mediul de cultur a unei concentraii minime de
mangan, n vederea iniierii dezvoltrii. Aceste cercetri subliniaz importana ionilor metalelor
grele pentru faza de lag la bacterii.
n cazul levurilor cantitatea de inocul poate influena de asemenea durata fazei de lag sau
stadiile ulterioare de dezvoltare, similar cu cele descrise n cazul bacteriilor.
n cazul fungilor, importana standardizrii inoculului vegetativ este hotrtoare: pentru
obinerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar s se utilizeze un inocul sub form de
suspensie de spori. De asemenea poate s apar fenomenul de autoinhibiie sau autostimulare a
germinrii sporilor datorit prezenei unor substane produse n timpul germinrii sau n fazele
ulterioare. In cazul fungilor cantitatea de inocul influeneaz mrimea i forma miceliului precum
i randamentul n metabolii. Raportul de inoculare trebuie s fie stabilit astfel nct cantitatea de
miceliu dezvoltat ulterior s nu fie prea mare n detrimentul secreiei metabolitului dorit. O
dezvoltare abundent a masei miceliene conduce n acelai timp la un consum mare de surs de
carbon, cultura fiind astfel ineficient.
Temperatura mediului n care are loc procesul de biosintez este un factor extrem de
important pentru dezvoltarea i activitatea microorganismelor. Temperatura este un factor care
acioneaz n mod direct asupra microorganismelor, diferena ntre temperatura mediului
nconjurtor i cea din interiorul celulei trebuind s fie nul. Pentru un proces de biosintez
industrial, temperatura poate fi considerat unul dintre parametrii fizici cei mai importani care
este implicat profund, prin efectele sale n optimizarea procesului.
Variaiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului n
produsul dorit, asupra cerinelor nutritive ale microorganismului i compoziiei biomasei obinute
precum i asupra vitezei de cretere microbian. n funcie de domeniul de temperatur n care
12
microorganismele, ating viteza maxim de cretere, acestea se clasific n : criofile, mezofile i
termofile. Microorganismele industriale sunt n general mezofile, astfel nct acest domeniu este
plasat n intervalul 25 35C.
Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelor se explic prin faptul c aceasta
afecteaz multe procese metabolice din celul precum i compoziia biomasei n proteine i
lipide, coninutul n ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidic a membranei celulare s se
modifice continuu n funcie de variaiile de temperatur, astfel nct membrana s-i menin
funcia reglatoare.
13
Prin efectul de disociere a acizilor i bazelor, pH-ul acioneaz asupra caracteristicilor
suprafeei celulei, modificnd proprietile ei de aderare la diferite materiale (sticl,
metale) precum i cele de floculare.
14
CAPITOLUL 3
PRELUCRAREA MEDIILOR DE CULTURA IN SCOPUL IZOLARII SI PURIFICARII
PRODUSELOR DE BIOSINTEZA
15
3.1. Filtrarea mediilor de biosintez
Cnd substanele biologic active care intereseaz i care s-au format n cursul procesului
de biosintez sunt intracelulare este necesar distrugerea membranei celulare semipermeabile i a
peretelui protector n vederea recuperrii componentelor respective. Aceast operaie se
realizeaz prin procedee de dezagregare. Dup natura agentului de dezagregare utilizat,
procedeele de dezagregare ale celulelor microbiene se clasific n :
- procedee mecanice
- procedee fizice nemecanice
- procedee chimice
- procedee enzimatice.
Procedeele mecanice cuprind dezagregarea celulelor n mori coloidale sau n mori
vibratoare, meninnd un anumit raport de recirculare, pn la dezagregarea total a celulelor
microbiene; n timpul operaiilor de dezagregare mecanic are loc o cretere a temperaturii
materialului biologic. Evitarea acestui fenomen i meninerea sistemului la o temperatur
acceptabil se efectueaz prin circulaia unui agent de rcire prin mantaua aparatului.
Dezagregarea celulelor de microorganisme prin procedee fizice nemecanice se poate
efectua prin decomprimare rapid, prin ngheare lent (datorit sporirii volumului apei la
trecerea n stare solid) sau prin oc osmotic. Un procedeu deosebit de eficace este aplicarea de
vibraii ultrasonice suspensiei de celule. Vibraiile cu frecvene de cca. 20.000 Hz determin
dezintegrarea celulelor microbiene.
Dezagregarea celulelor microbiene prin procedee chimice cuprinde distrugerea
componentelor lipoproteice ale membranei celulare prin aciunea detergenilor cationici sau
anionici sau a solvenilor organici, determinnd trecerea n faza lichid a unora din componentele
biologic active.
Dezagregarea celulelor microbiene poate fi efectuat i prin tratarea acestora cu diferite
preparate enzimatice. Astfel, liza celulelor bacteriene poate fi indus prin atacul enzimatic
specific al legturilor -1,4 dintre moleculele de N-acetilglucozamin i acidul N-acetilmuramic.
Dezintegrarea biologic enzimatic este una din cele mai vechi metode de obinere a
omogenatelor celulare. Cel mai cunoscut exemplu este cel al descompunerii autolitice a drojdiei
de bere uscat la 30C, timp de 23 zile. Dezintegrarea celulelor de Micrococcus lysodeikticus
poate fi realizat cu suc pancreatic; distrugerea esutului muscular poate fi produs cu enzime
16
proteolitice izolate din Bacillus subtilis, iar dezintegrarea biologic a E.coli poate fi realizat cu
bacteriofagi litici.
17