tefan Popescu-Plosca

TUBERCULOZA
la animale i om
(epidemiologie,diagnostic,profilaxie i
combatere)

Bucureti
2012
 Am scris aceasta pentru Voi i nu doresc mai mult dect s fie o pild de aducere
aminte
c am existat i eu printre Voi , c V-am oferit i V ofer toat cinstea, consideraia i
onoarea mea pn n clipa cnd voi pleca pe un drum care se Sfrete ntr-o lume a
tcerii fr durere , ntristare i suspin.
De acolo m voi bucura de mplinirile fiecruia dintre Voi i de toate cele cte
V sunt de folos .
Cu Mult respect,
Dr. Stefan Popescu Plosca
 CAPITOLUL I

CONSIDERAII GENERALE ASUPRA TUBERCULOZEI

1.1. Definiie.

Tuberculoza este o boal infectocontagioas cu evoluie, n mod obinuit,

cronic, cu caracter enzootic, comun omului, tuturor mamiferelor domestice i
slbatice i unui numr mare de specii de psri.
Are simptomatologie nespecific i din punct de vedere anatomo-patologic
se caracterizeaz prin leziuni specifice de tip productiv sub form de noduli
tuberculoi (tuberculi) cu coninut cazeos, cazeocalcificat sau calci-ficat, n diverse
organe i esuturi .

1.2. Istoric.

Se presupune c tuberculoza a existat la animale cu mult timp naintea

apariiei omulului pe pmnt. Faptul c tuberculoza ar avea origine nc din cele
geologice ndeprtate, a fost demonstrat prin descoperirea unor vertebre de dinozaur
care n timpul vieii a suferit de osteomielit, probabil de natur tuberculoas. Alte
informaii de specialitate presupun c tuberculoza ar fi putut s afecteze unele specii
de primate. Mai trziu, leziuni atribuite tuberculozei osoase au fost descoperite
printre mumiile egiptene, dar primul document care face referire la tuberculoz este
Codexul lui Hammurabi a crui existen dateaz din anul 250 i.e.n.
Mycobacterium tuberculosis a fost prezent n populaia uman nc din
antichitate; fragmente din coloana vetrebal a mumiilor egiptene datnd din anul
2400 i.e.n. prezentau semne patologice definite de formaiuni tuberculoase.
Termenul de ftizie pentru tuberculoz apare pentru prima dat n
literatura greac. n jurul anului 460 e.n., Hipocrate identific ftizia ca cea mai
raspndit boal a timpului i noteaz c aceasta a fost ntodeauna fatal. Datorit
pericolului de transmitere de la un pacient la altul, Hipocrate avertizeaz c
doctorii nu trebuie s viziteze lung timp cazurile cu evoluie a bolii n ultimul stadiu,
pentru c riscul s se infecteze este foarte mare i oricum aceti bolnavi vor muri
inevitabil.
Primele descriei anatomoclinice i patologice ale bolii au fost fcute n
secolul al XVII lea . n opera Medica din 1679, S y l v i u s a identificat prima dat
tuberculii ca modificri consistente caracterisitice n pulmoni i n alte organe ale
pacienilor cu tuberculoz. S y l v i u s a descris de asemenea evoluia tuberculilor
spre abcese i formaiuni cavitare.
In 1702, M a n g e t descrie aspectele patologice n tuberculoza miliar.
Primele referine asupra naturii infecioase a tuberculozei apar n secolul al XVII
lea n literatura medical. O reglementare publicat n R e p u b l i c a l ui L u c a
n 1699 stabilete c: de acum n colo, omul sntos nu trebuie s fie lung timp n
contact cu obiectele care au rmas dup moartea unui bolnav de tuberculoz.
Numele celor decedai trebuie s fie raportat la autoriti i s fie luate msuri de
desinfecie.
1
 In 1720 fizicianul B e n j a m i n M a r t e n s a fost primul care, n
lucrarea sa O nou teorie a infeciei arta c tuberculoza ar putea fi cauzat
de creaturi vii ntmpltoare care ndat ce ptrund n corp pot genera leziuni i
simptome asemntoare tuberculozei.
Autorul stipuleaz n plus c: Poate fi probabil ca un om sntos care,
dup un habitat ndelungat n acelai pat cu un pacient tuberculos, care mannc
i bea impreun cu acel bolnav ori dup frecvente conversaii aa n ct bolnavul
elimin din pulmoni particule infectante, se poate imbolnvi de la acea persoan.
Eu mi imaginez c o conversaie scurt cu pacieni tuberculoi este rareori sau
niciodat suficient pentru a te imbolnvi... spunea Benjamin Martens.
Postulatele lui Martens asupra contagiozitii tuberculozei aveau sa fie
confirmate de V i l l e m a n s , in 1865, care a reuit transmniterea experimental a
bolii la iepuri cu produse patologice recoltate de la oameni cu tuberculoz.
In ciuda faptului c agentul etiologic nu fusese nc identificat ,
experimentele lui Villeman au sugerat totui c tuberculoza ar putea afecta n mod
natural i populaiile de animale domestice i salbatice i boala ar putea s se
transmit pe diverse ci de la animale la om.
Descoperirea agentului etiologic al tuberculozei de ctre R o b e r t K o c h,
n 1882, a nsemnat un pas important, n primul rnd, n iniierea i perfecionarea
metodelor de depistare i, n al doilea rnd, n dezvoltarea mijloacelor de lupt
mpotriva tuberculozei, precum: chimioprofilaxia, imunoprofilaxia i mijloacele de
profilaxie general. De atunci , Koch i ulterior Z i e h l si N e e l s e n elaboreaz
metoda specific de colorare denumit Ziehl Neelsen utilizat i n prezent
pentru evidenierea i identificarea micobacteriilor.
Eforturi semnificative au fost fcute i n domeniul dezvoltrii mijloacelor
de depistare a cazurilor afectate de tuberculoz. Astfel, descoperirea Razelor x, n
1895, de catre W i l h e m K o n r a d v o n R n t g e n a constituit mijlocul de
baz n identificarea i monitorizarea pacienilor cu tuberculoz avansat.
Odat cu descoperirea agentului etiologic al tuberculozei, n 1882 i
perfecionarea mijloacelor de cretere si intreinere ale acestuia n afara orga-
nismului viu, precum i cercetrile laborioase asupra proprietilor culturale,
fizico-chimice i biologice ale bacilului Koch a nsemnat nceputul unei noi etape n
lupta mpotriva tuberculozei. Toate cercetrile erau axate pe descoperirea unor
produse biologice pentru protecia organismului fa de infecia cu bacilul Koch.
Astfel, s-a ajuns la descoperirea epocal a lui R o b e r t K o c h care, la cel
de al 10-lea Congres Internaional de Medicin de la Berlin din 1890, anunta c:
deinea o substan capabil s opreasc creterea bacilului tuberculozei, activ
n lupta mpotriva tuberculozei cobailor infectai i care ar putea fi util n
tratamentul ftiziei umane, n special n stadiile sale iniiale, comunicare reluat
cateva luni mai trziu ntr-o publicaie de specialitate.
tirea descoperirii leacului mpotriva ftiziei a fcut rapid nconjurul lumii
dar tot att de repede s-a produs o decepie general cnd s-a constatat c de fapt
produsul lui Koch declana reacii severe i c, departe de a fi un tratament magic,
la numeroi pacieni, boala se agrava n loc s se amelioreze. Aa s-a ajuns c o
descoperire cu adevrat epocal a fost considerat una din cele mai mari erori din
istoria cercetrii medicale.
Insui Koch i-a pierdut orice speran cnd, n 1915, dup ncercri de a
obine creterea eficacitii terapeutice cu variante ale produsului iniial, rezultatele
au fost descurajatoare.
Nimeni nu i imagina la acea vreme c, de fapt, Robert Koch obinuse un
produs brut cu proprieti revelatoare care dac era injectat bolnavilor de
tuberculoz producea o reacie alergic local specific infeciei tuberculoase.
2
 In cele din urm, Robert Koch public faptul c produsul su era un filtrat
de cultur de bacili tuberculoi n bulion glicerinat.
Acest produs a fost denumit de P o h l P i n c u s nc din anul 1884
tuberculin, termen adoptat i de B u j w i d i acceptat de R. Koch. Mai trziu
acest produs a primit denumirea tuberculina brut a lui Koch.
Cunoscut fiind similitudinea tehnologiei de obinere a tuberculinei i
capacitatea ei revelatoare cu cea a maleinei obinut de H e l m a n n 1890 prin
extracie la cald din bacili ai morvei, se recunoate pe deplin valoarea de diagnostic
a tuberculinei pe care insui Koch o intuise, preciznd: De azi nainte se va putea
depista tuberculoza nc de la nceput, n momentul cnd nici examenul clinic,
nici prezena bacililor nu pot furniza indicii asupra bolii .
De abia n anul 1905, R. Koch a fost rspltit cu Premiul Nobel pentru
fiziologie i medicin fiindu-i recunoscute astfel toate meritele tiintifice .
Recunoscut fiind importana descoperii lui Koch pentru diagnosticul
tuberculozei, ncepe o nou etap n istoria tuberculinelor care pe bun dreptate ar
putea fi considerat concurenial . S-au fcut numeroase ncercri de cretere a
inocuitii i capacitii revelatoare ale tuberculinelor.
In perioada 1892 1897, un numr important de lucrri publicau rezultatele
asupra compoziiei chimice, specificitii i mecanismelor intime de aciune a
tuberculinelor asupra organismului tuberculos. De exemplu, cercetrile lui B u c h n
e r si G a r t n e r i R n e r, 1891 relev legatura strns dintre efectul specific
al tuberculinelor sugernd n acelai timp c proteinele bacililor inactivai produc
efecte similare cu cele ale tuberculinei servind ca nlocuitori ai acestor produse
nocive.
Pe de alt parte, ali cercettori nu renunaser la ideea efectului terapeutic
al tuberculinei, motiv pentru care preocuprile lor s-au orientat spre imbunat-
irea calitii tuberculinelor n acest scop. Astfel, s-a obinut tuberculina fr
albumine (AF) din culturile micobacteriene n mediu lipsit de carne i pepton.
Pn n anul 1930 au aprut peste 100 tipuri de tuberculine preparate dup
diverse procedee . De exemplu, C. S p e n g l e r, pornind de la precizarea eronat
a lui Koch c bacilul tuberuclozei bovine este slab patogen pentru om, este
promotorul tuberculinei (PTO) preparat din bacili izolai de la o bovin cu
tuberculoz perlat.
Prima tuberculin comercializat pentru diagnosticul tuberculozei la bovine a
fost bovotuberculol D produs de firma Merk din bacili de tip bovin dup
metoda Landman (1898).
Folosirea, ncepnd din anul 1934, de ctre L o n g i S i e b e r t a mediilor:
Long, Dorset-Hanley sau a mediului BAI a fcut posibil purificarea tuberculinelor.
Perioada 19311932 a fost dedicat studiilor potenialului bilogic al
tuberculinelor. S i e b e r t considera c factorul care poteneaz activitatea
antigenic nedorit a tuberculinelor l reprezint rezidurile de sruri minerale i
sruri de hidrai de carbon din compoziia mediului sintetic.
Aprea necesitatea modificrii procedurii de producere a tuberculinelor prin
ultrafiltrarea componentelor reziduale, precipitarea cu acid triclor acetic (TCA) i
apoi nlturarea TCA concomitent cu uscarea cu eter n vid. Astfel s-a obinut
primul derivat proteic purificat (PPD) uscat.
Dezvoltarea tehnologiilor de biologie molecular a ncurajat cercetrile
privind componentele proteice, potenialul revelator i antigenitatea derivatelor
proteice purificate (PPD) extrase din M. tuberculosis.

3
 S-au fcut primele dozri de azot proteic i studiile asupra greutilor
moleculare ale fraciunilor proteice au demonstrat c fraciunea cu greutatea
molecular de 40.000 Da. a dovedit potenialul revelator cel mai ridicat. Aseme-
nea studii au stat la baza standardizrii tuberculinelor att de necesar pentru
eliminarea variabilitii calitative considerabile a diverselor tipuri de tuberculine
preparate prin metode similare.
Romnia nu a fost ocolit de febra cercetrilor n domeniul tuberculozei.
Trecuser doar 2 ani de la comunicarea epocal a lui R. Koch i D. S t a m a t e s- c
u susinea teza de doctorat, la coala Superioar de Medicin Veterinar, cu titlul:
ntrebuinarea injeciilor cu tuberculin n diagnosticul tuberculozei bovine.
Iniial, cercetrile au fost fcute cu o tuberculin primit de la Roux din Paris,
pentru ca n 1893 Stamatescu s prepare prima tuberculin romneasc din tulpini
de Mycobacterium obinute de V. Babe de la Prof. Nocard.
n acelai an, Prof. I. S t. F u r t u n propune introducerea oficial a
tuberculinei n practica veterinar pentru diagnosticul tuberculozei i 6 ani mai
trziu, un colectiv format din: V. B a b e s, P a u l R i e g l er i I e r e m i a
P o p e s c u comunica rezultatele cercetrilor asupra ntrebuinrii tuberculinei n
teren pentru detectarea tuberculozei la bovine.
Cantitile de tuberculin erau foarte mici la nceput i aceasta se producea
numai n Laboratoarele de Microbiologie ale colii Superioare de Medicin
Veterinar conduse de P. Riegler.
Eforturile lui Stamatescu i cele ale Prof. P. Rigler, pn n ultimele clipe
ale vieii sale, au fost continuate de cercettori, precum : G e o r g e s c u , S t o en e
s c u , L. P a s c u i T a c u, Gr. C i o r t e a, C. I o n i c , P o p e s c u- B a
r a n . a. ale cror studii asupra tuberculinelor au adus importante i
incontestabile mbuntiri diagnosticului tuberculozei n teren. Trebuie menionat
meritul cercettorilor romni pentru contribuia lor la mbuntirea specificitii
testului tuberculinic la bovine. n acest context, sunt relevante lucrrile lui C i o r t
e a i a l . 1982 privind obinerea pentru prima dat n Romnia a unei
tuberculine bovine (PPD bovin ) de 50.000 UTI/ml. fiind astfel indeplinite
cerinele C.E.E. pentru a se folosi n diagnosticul tuberculozei numai tuberculine
standardizate. Pe de alt parte, C i o r t e a i c o l a b. 1982 au meritul de a fi pus
la punct tehnologia de preparare n cantiti comerciale a tuberculinelor utiliznd
incubatoare circulare verticale de mare capacitate dar mai ales de mbuntire a
metodelor de extracie i purificare. De acum nainte, Romnia nu mai era
dependent de tuberculine din import pentru diagnosticul tuberculozei bovinelor.
A fost pe deplin justificat nlocuirea tuebrculinei mamifere cu cea bovin, aceasta
din urm dovedind specificitate i sensitivitatate superioare n testarea
bovinelor.
In paralel, cercetrile asupra imunologiei i imunopatologiei tuberculozei s-
au intensificat. Scopul acestor cercetri era s se gseasc metode serologice
accesibile pentru diagnosticul tuberculozei.
Iniial, s-au fcut numeroase ncercri de a utiliza testul fixrii
complementului (FCT) sau a testului de imunodifuzie n gel de agar (AGID) dar
rezultatele i valoarea ne-satisfctoare pentru diagnosticul tuberculozei au
determinat abandonarea lor.
Mai trziu, au fost dezvoltate testele imunoenzimatice (ELISA) care utiliza antigene
micobacteriene complexe sau purificate pentru detecia anticorpilor specifici
antimico-bacterieni. Cu toate avantajele demonstrate fa de intradermo-
tuberculinare (IDR), testul ELISA are totui aplicabilitate restrns pentru
diagnosticul tuberculozei la copii fiind dovedit faptul c anticorpii serici pot fi
detectai prin ELISA numai n faza terminal a bolii. (15).
4
 Dezvoltarea tehnologiilor de genetic i biologie molecular, a sistemelor
moderne de separare, fracionare i amplificare a fraciunilor proteice,
descoperirea anticorpilor poli i monoclonali au deschis calea cercetrilor
fundamentale n domeniul imunitii mediate celular (IMC) i imunopatologiei n
tuberculoz.
A fost nceputul erei moderne n cunoaterea i urmrirea proceselor
patologice n cursul evoluiei bolii, a rspunsurilor imune, dinamica i factorii de
influen asupra acestor mecanisme, dar i cunoterea componentelor care confer
rezisten micobacteriilor n organismul gazd i n afara acestuia precum i
elemente de chimioterapie, imunoprofilaxie i profilaxie general.
Astfel, au fost iniiate i utilizate metode cu valoare de diagnostic
superioar intradermotuberculinrii (IDR) n controlul tuberculozei . Un numr
apreciabil de ri, precum: Marea Britanie, Italia, Frana, Spania, Irlanda,
Portugalia, Canada i S.U.A. s-au alturat Australiei i N. Zeelande pentru
oficializarea metodelor de cercetare in vitro a imunitii mediate celular (IMC) n
infecia tuberculoas. De exemplu, oficialitile veterinare din Canada au decis
nlocuirea intradermo-tuberculinrii cu un test imuno-enzimatic pentru detecia
gamma interferonului (EIAs IFN), descoperit i aplicat n infecia tuberculoas
la bovine de P. Ro t h e l ; P. R. W o o d, S. L. J o h n e s , e t a l. (25) cu cteva
decenii n urm. Civa ani mai trziu, cercettorii australieni au meritul de a fi
descoperit kitul QUANTIFERON (QFT), utilizat pentru diagnosticul
tuberculozei la primate i la om.
n S.U.A., H a r r i n g t o n N. P. , e t a l., 2008 (11) sunt autorii unui test
rapid efectuat n ferm , bazat pe analiza sngelui recoltat de la cervideele suspecte
de tuberculoz. Recent, n Marea Britanie, cercettorii de la Compania Immunotec
Oxford (31) au brevetat metoda T-SPOT TB bazat pe analiza activitii in vitro a
celulelor T sensibilizate specific cu antigene tuberculoase. Intensitatea activitii
celulelor este masurata imunoenzimatic i exprimat n numr de spoturi formate
n urma cuplrii receptorilor de pe suprafaa celulelor T cu anticorpii monoclonali
specifici fixai pe un suport solid. Datorit sensi-tivitii i specificitii ridicate
precum i capacitii crescute de a detecta cazurile cu tuberculoz latent
(subclinic), metoda a fost aplicat cu succes n numeroase laboratoare pentru
diagnosticul tuberculozei umane n locul testului intradermic (I.D.R.).
Dup aproape 115 ani de utilizare testul intradermotuberculinic (I.D.R.)
risc s fie abandonat. De altfel, n Manualul de metode standard i produse
biologice de diagnostic al O.I.E./2004 sunt recomandate testele in vitro bazate pe
analiza imunitii mediate celular (IMC) n diagnosticul tuberculozei la
rumegtoarele domestice i slba-tice ca metode complementare.
De aceea, n Romnia, s-a introdus testul imunoenzi-matic de detecie a
gmma interferonului (EIAs-IFN) n Programul strategic anual al aciunilor
sanitare veterinare pentru controlul tuberculozei la bovine nlocuind testul
intradermotuberculinic comparat simultan (IDRTCS) n efectivele libere de
tubercu-loz i pentru controlul animalelor negative la IDRTCS n efectivele
infectate, supuse asanrii prin extracie .
Progrese importante s-au nregistrat n domeniul microbiologiei, n special
n studiul caracteristicilor morfologice, culturale precum i proprietile fizico-
chimice i biologice ale reprezentanilor genului Mycobacterium.
De la sistemele clasice de cultur bacteriologic pe medii cu cartof sau cu
glbenu de ou (Lwenstein Jensen) s-a trecut la utilizarea pe scar larg a
mediilor sintetice solide i lichide cu randament net superior n izolarea i
identificarea micobacteriilor.
5
 Pentru mbuntirea performanelor, au fost preparate i comercializate o
multitudine de medii de cultur, care vor fi prezentate la capitolul destinat culturii
micobacteriilor.
Cu toate acestea, era imperios necesar s se gseasc alte mijloace de izolare
i identificare a micobacteriilor n cultur bacteriologic n scopul reducerii
perioadei de ateptare pn la finalizarea diagnosticului.
Astfel, au fost concepute sistemele BACTEC al cror avantaj este
incontestabil i se bazeaz pe reducerea substanial a perioadei de ateptare pna
la obinerea rezul-tatului final.
Cercetrile ulterioare au fost orientate spre optimizarea acestor sisteme.
Iniial, a fost omologat sistemul BACTEC radiometric i ulterior s-a generalizat
metoda BACTEC colorimetric. Metoda BACTEC colorimetric a ctigat tot mai
mult teren n practica laboratoarelor de sntate public i laboratoarelor
veterinare de diagnostic.
n ciuda progreselor nregistrate n domeniul tuberculozei au rmas nc
neclarificate unele aspecte privind biologia micobacteriilor, epidemiologia i
patogeneza tuberculozei precum i aspecte legate de imunoprofilaxia bolii. La toate
acestea s-a adugat recesiunea economic i declanarea celui de al 2lea rzboi
mondial ca factori impor-tani n creterea fr precedent a incidenei i
recrudescenei tuberculozei. Sracia i lipsurile care au lovit omenirea s-au nfrit
cu bacilul tuebrculozei omornd milioane de oameni i animale. Vicisitudinile
rzboiului au facilitat mbolnavirea i moartea a zeci de mii de militari din cauza
tuberculozei. De aceea, s-au fcut eforturi serioase pentru dezvoltarea i
perfecionarea mijloacelor moderne de diagnostic i profilaxie.
Sfritul secolului al IX-lea a nsemnat punctul de plecare pentru studiul
aplica-tiv al geneticii i biologiei moleculare n tuberculoza. Astfel, au fost elaborate
metodele de recunoatere a acizilor nucleici prin reacia lanului polimerazei (PCR)
pentru detecia reprezentanilor complexului Mycobacterium tuberculosis
utiliznd probe clinice (n special sputa) de la oameni suspeci de infecie. Mai
recent, PCR a fost utilizat pentru diagnosticul tuberculozei la animale din probe de
esuturi fixate n formalin sau incluse n parafin. n acest scop au aprut
numeroase laboratoare specializate i s-a dezvoltat o adevarat industrie de
producere i comercializare a kiturilor i primerilor pentru PCR. De exemplu, s-au
utilizat primerii care amplific secvenele 16S 23S rRNA, inseria secvenelor IS
6110 i IS1081 precum i genele care codific proteinele specifice complexului M.
tuberculosis MPB70 i antigenul b38 kDa.
PCR a fost utilizat nu numai pentru izolarea bacilului tuberculozei din
materiale patologice dar i identificarea iniial a acestuia.
De asemenea, tehnicile DNA pot fi considerate o realizare important pentru
rapiditatea i acurateea lor dar i valoarea ridicat n izolarea i identifi-carea
Mycobacterium bovis i altor reprezentani ai complexului M. tuberculosis.
Mutaia la poziia nucleotidic 285 din gena 0xyR s-a gsit specific pentru
M. bovis.
Acum au fost ndeplinite toate condiiile pentru aplicarea unor noi strategii
de supraveghere i diagnostic al tuberculozei n practica veterinar.
n toate rile n care aceste strategii, bazate pe mijloace moderne de inves-
tigare, au fost aplicate, s-au nregistrat succese remarcabile n lupta mpotriva
tuberculozei.
6
 Tehnologiile de genetic i biologie molecur au fost utilizate i n domeniul
cercetrii imunoprofilaxiei antituberculoase. Genetica i biologia molecular a
micobacteriilor au deschis obinerea unor produse biologice cum sunt : anticorpii
monoclonali, vaccinurile cu rRNA i cu markeri specifici att de necesare n
campaniile de vaccinare a oamenilor.
Multitudinea stuidiilor i publicaiilor de specilaitate, aprute de-a lungul
anilor au dovedit pe deplin valoarea lor imunogen i de aceea utilizarea acestor
vaccinuri, n locul btrnului BCG, n campaniile de eradicare a tuberculozei
umane a intrat n practica medical curent.

1.3. Distribuia geografic global a tuberculozei la animalele

domestice i slbatice.

Practic, tuberculoza taurinelor i a altor animale domestice i slbatice este

rspndit pe toate continentele globului (Fig. 1)

Prezent
Absent
Fr date

Fig.1 - Distribuia geografic global a tuberculozei bovinelor i a altor animale

domestice i slbatice. (29)
Potrivit datelor oficiale furnizate de Revue Sante Animale Mondiale,
publicat de Oficiul Internaional de Epizootii, populaia mondial de animale
domestice, cu excepia psrilor, depete 3 miliarde de capete. Aceeai surs
preciza c peste 1 miliard din totalul animalelor domestice erau bovine i 1/3
dintre acestea se gseau n ri unde tuberculoza este sub control, 1/3 n regiuni
unde incidena bolii este necunoscut i 1/3 n regiuni unde prevalena bolii este
crescut.
n Europa, exist ri ca: Danemarca, Finlanda, Norvegia, Suedia, libere de
tuberculoz. n alte ri precum; Frana, Germania, Austria sunt recununos-cute
numai pri din teritoriile lor ca fiind libere de tuberculoz, n timp ce n Marea
Britanie, Italia, Portugalia erau raportate oficial n 1997 peste 1000 de focare de
tuberculoz la bovine. Exist unele particulariti n distribuia tuberculozei pe
teritoriul fiecrei ri determinate de rezervoarele de animale slbatice infectate cu
M. bovis care sunt responsabile de transmiterea tuberculozei la bovine. De
exemplu, n Marea Britanie incidena cea mai crescut a tuberuclozei la bovine a
fost nregistrat n sud-vestul teritoriului datorit densitii ridicate a populaiei de
bursuci, la care infecia cu M. bovis a fost confirmat la numorase cazuri, fiind
astfel demonstrat faptul c bursucii sunt principala surs de contaminare a
punilor i de transmitere a tuberulozei la bovine (9).

7
 De asemenea, n America, statul Michigan, cervideele reprezint
principala surs de transmitere a tuberculozei la bovinele domestice (29). n Africa,
Australia, Asia i America de Sud transmiterea infeciei tuberculoase la animalele
domestice se realizeaz prin intermediul rumegtoarelor, carnasierelor i felinelor
slbatice (2, 27).
Date mai recente, arat o scdere semnificativ a prevalenei tuberculozei
la animalele domestice n rile cu economie dezvoltat. Totui, incidena
tuberculozei la animalele domestice i slbatice se menine i n prezent la cote
ridicate n numeroase
zone de pe toate continentele. De exemplu, datele statistice arat c tuberculoza
bovinelor era prezent n 4 state membre ale UE, cu inciden cuprins ntre 3,4
10,8 %.
Pe de alt parte, P a v l i k e t a l , 1999 (21) , ntr-un studiu efectuat n 7 ri
central europene, ajunge la concluzia, c unele inconsecvene intervenite n
controlul tuberculozei explic prelungirea semnificativ a perioadei de eradicare a
bolii chiar dac n unele ri ca: Bosnia Heregovina , Slovenia, Cehia, Slovacia
boala evolua sporadic .
Studiile ntreprinse de C o s i v i O. e t a l., (4) n Africa au artat c din
55 de state ale continentului, n 25 tuberculoza la bovine evolua sporadic sau
cazuri rare , n 6 ri tuberculoza avea caracter enzootic i n 2 state prevalena
bolii era extrem de ridicat. Numai n 4 ri tuberculoza la bovine nu a fost
constatat.
De asemenea, n ri unde tuberculoza este notificabil, numai 15 % din
populaia de bovine este supus, msuril0r de control prin testarea alergic a
animalelor i tierea celor cu rezultate pozitive. Se poate meniona c 85% din
populaia bovinelor i 82% din populaia uman din Africa se afl n zone unde
tuberculoza este numai parial controlat sau aceasta nu este supus controlului
oficial (4).
Aceiai autori (4), prezint distribuia tuberculozei bovine n Asia, rile
Americii Latine i Caraibe.
Astfel, din 36 de ri asiatice n 16 tuberculoza este sporadic, n Bahrain
boala evolueaz enzootic i n 10 state boala nu a fost diagnosticat n timp ce alte 9
ri nu fac raportri asupra tuberuclozei la bovine.
Pe de alt parte, se menioneaz c msurile de control prin testarea
alergic a animalelor i tierea celor infectate cu M. bovis sunt aplicate numai n 7
state i tuberculoza bovin este considerat boal notificabil . n alte 29 de state
controlul este parial sau populaia de bovine din aceste state nu este supus
controlului pentru tuberculoz.
Din totalul bovinelor i bubalinelor, numai 6,0 % dintre bovine i,
respectiv mai puin de 1,0 % dintre bubaline se afl n ri unde tuberucloza
bovinelor este notificabil i controlat oficial prin testare alergic i tierea
animaleor cu rezultate pozitive dar 94,0 % din populaia bovinelor i peste 99,0 %
din bubalinele din Asia sunt controlate parial sau nu sunt supuse controlului
pentru tuberculoz. n aceste zone triete 94,0 % din populaia uman.
n rile Americii Latine i Caraibe, din 34 de state 12 au raportat evoluie
sporadic sau prezen foarte rar a tuberuclozei la bovine, n 7 ri se nregistreaz
evoluie enzootic i situaie special se nregistreaz n Republica Domini-can
unde prevalena i incidena tuberculozei la bovine sunt foarte crescute.
Tuberculoza este supus parial msurilor de control i eradicare n 22 de
state din aceste zone . n 67,0 % din efectivele de bovine, prevalena regional a
tuberculozei este estimat la 1,0 % i la 0,1 0,9 % n numai 7,0 % din efectivele
totale n timp ce 26,0 % sunt libere de tuberculoz.
8
 1.4. Distribuia tuberculozei bovinelor n Romnia.

Analizele epidemiologice efectuate de Serviciul de Sntate a Animalelor

din IDSA arat c, n anul 2004, tuberculoza bovinelor n Romnia a fost
diagnosticat i declarat oficial n 60,0 % dintre judeele rii, nsumnd 415
focare noi din care 147 (35,0 %) declarate n cursul anului 2004 i 55 de focare
inactive din care s-au elimimnat animalele dar n care nu au fost finalizate lucrrile
de decontaminare.
n anul 2005, tuberculoza la bovine a fost declarat oficial n 24,o % dintre
judee dar n 64, 0% caracterul staionar al bolii s-a datorat persistenei focarelor
active declarate n anii anteriori i n care msurile de eradicare s-au aplicat numai
parial.

Comparativ cu situaia apidemiologic din anul 2004 numrul focarelor noi

declarate n cursul anului 2005 a sczut substanial; de la 147 n 2004 la 76 n anul
2005. (23). n anul 2004, aproape 50,0 % din populaia de bovine existent n
Romnia era localizat n judeele n care tuberculoza a fost declarat oficial.
Procentul bovinelor n judeele unde boala a fost confirmat n anul 2005 a crescut
la 58,5 %. (23).

1.5. Distribuia geografic a infeciei Mycobacterium bovis la

oameni.
0-24
25-40
50-99
100- 290
300

Fig. 2 - Distribuia
geografic a incidenei
tuberculozei (cazuri
noi) n anul 2009

Ca i la animale, tuberculoza oamenilor este rspndit pe toate

continentele globului. Aproximativ 8, 0 milioane de oameni se mbolnvesc de
tuberculoz i peste 2,5 milioane mor. n fiecare an, 1,0 % din populaia globului se
infecteaz cu M. tuberculosis i ntre 5,0 10,0 % dintre cei infectai se
mbolnvesc sau pot transmite boala.Proporia populaiei infectat cu micobacterii
din complexul M. tuberculosis este diferit de la un continent la altul sau de la o
zon geografic la alta (Fig.3)
Asemenea diferene sunt determinate n primul rnd de creterea
demografic i intensificarea emigraiei i relaiilor interumane i n al doilea rnd,
creterea ngrijortoare, n ultimul secol, a gradului de srcie i persistena
condiiilor sociale precare la o parte nsemnat a populaiei globului.
Cercetrile epidemiologice, au artat c prevalena crescut a tuberculozei
n populaia uman din rile n curs de dezvoltare este n strns relaie cu
prezena

9
infeciei cu M. bovis la animalele domestice i transmiterea bolii de la animale la
oameni este favorizat de aplicarea incorect a programelor de supraveghere prin
depistarea animalelor bolnave i abatorizarea acestora dar i msuri neadecvate
de control al trasabilitii laptelui.(18).

4,5
35,0
2,9

7,1

30,0
21,0

Fig.3 - Proporia (%) populaiei globale infectat cu micobacterii din complexul M. tuberculosis
(28).

n aceste ri, unde tuberculoza bovin nu este controlat, cele mai multe
cazuri de tuberculoz se nregistreaz n rndul persoanelor tinere la care s-a
observat limfadenit cervical, enterit tuberculoas, tuberculoz cutanat
(Lupus vulgaris) i alte forme extrapulmonare (3).
Prezena tuberculozei la oameni produs de Mycobacterium bovis a fost
confirmat n numeroase ri Africane. Cercetrile efectuate n 3 etape n dou
Centre de Sntate din Egipt au artat c proporia de pacieni cu sputa pozitiv la
examenul direct care s-au dovedit a fi infectai cu M. bovis a fost de 0,4 %, 6,4 % i
5,4 % (8). Un studiu similar n Egipt a demonstrat c 9 din 20 pacieni selectai
ntmpltor avnd peritonit tuberculoas au fost infectai cu M. bovis i restul cu
M. Tuberculosis (19).
n Nigeria , din 102 izolate din complexul M. tuberculosis, 4 probe (3,9 %)
s-au dovedit a fi M. bovis (12). Ali autori (13.), analiznd culturile de micobacterii
din sput, au constat c una din 10 micobacterii izolate era M. bovis.
Mai recent, n Tanzania, cercetrile bacteriologice a 19 biopsii limfo-
nodale de la suspeci cu tuberculoz extrapulmonar au demonstrat c 7 au fost
infectate cu M. tuberculosis i 4 cu M. bovis. Din restul probelor nu s-au izolat
micobacterii (6).
Tabelul :1.

Izolatele de la pacienii suspeci de tuberculoz extrapulonar n Tanzania n 1994 (6) .

Ocupaia Nr.robe M.tuberculosis M.bovis Negative

ngrijitori 4 0 2 2
de vite
Fermieri 6 2 1 3
Copii 3 2 1 0
Necunoscut 6 3 0 3
Total 19 7 4 8

Dei numrul de probe a fost mic, totui procentul crescut (36,0 %) de

izolate Mycobacterium bovis reprezint o problem serioas.

10

Cu toate c n literatura de specialitate exist puine dateprovenind din

zona Asiatic, cu privire la transmiterea Mycobacterium bovis de la animale la
oameni prin consumul de lapte i produse lactate proaspete, sutdiul efectuat n
Nepal de I h a V. C, e t a l., 2 0 0 7 (14) arat c din 36 de tulpini micobacteriene
izolate din lapte i din fecale, 39,0 % au provenit de la bubaline i 34,0 % de la
taurine. Din cele 36 de tulpini micobacteriene 13 au fost Mycobacterium bovis
izolate de la 17,0% dintre bubaline i 16,0 % de la turine.
n America Latin, se estimeaz c la 2,0 % dintre pacienii cu tuberculoz
pulmonar i la 8,0 % dintre cei cu tuberculoz extrapulmonar Mycobacterium
bovis este responsabil de producerea bolii. Anual se nregistreaz 7000 de cazuri
noi de tuberculoz cauzat de Mycobacterium bovis cu o rat de 2 cazuri la
100.000 de locui-tori (4).
n Argentina, din 7672 culturi micobacteriene analizate ntre 1982 1984,
36 (0,47 %) au fost Mycobacterium bovis. Un alt studiu, efectuat ntre 1984 1989
n provincia Sanate Fe, unde sunt concentrate cele mai multe efective de vaci de
lapte, M. bovis fost incriminat n producerea a 0,7 6,2% cazuri de tuberculoz n
rndul populaiei din provincia respectiv (4).
Exist destul de puine date cu privire la prezena infeciei cu
Mycobacterium bovis n populaia uman din Asia. Cercetari relativ recente
confirm faptul c n India nu au fost detectate cazuri cu tuberculoz la oameni
produs de M. bovis. Totui, n Pakistan, H a m i d J. et al., (10), arat c din 73
probe ( lapte, scurgeri nazale, fecale) provenite de la vacile delapte i bivoliele
pozitive la testul intradermotuberculinic (IDR) , bacilii acidorezisteni au fost
prezeni n 20 probe de lapte (27,4 %) , n 9 probe secreii nazale (12,3%) i de la 2
animale, bacilii acidorezisteni (BAR) au fost izolai att din lapte ct i din secreii
nazale. n concluzie, autorul studiului atrage atenia asupra riscului transmiterii
infeciei tuberculoase de la animale la om pe calea laptelui dar i pe cale aerogen,
n special n rndul ngrijitorilor de animale i personalului din fermele de animale.
Dealtfel, Annual Report on Tuberculosis in SW England,/2000, confirm
c ntre 10 12 % din probele de lapte nepasteurizat, analizate prin metoda PCR, i
aproximativ 3,0 % din probele de lapte incorect pasteurizat au dat rezultate
pozitive.
Pe de alt parte, n ciuda faptului c n numeroase ri industrializate
tubercuoza bovinelor a fost eradicat sau pe cale de a fi eradicat, totui n unele
zone se mai constat aproximativ 1,0 % cazuri cu tuberculoz cauzat de M.bovis la
care procesul patologic s-a reactivat dup o perioad lung de laten.
Studiile efectuate n SUA i Scandinavia arat c aproape jumtate dintre
aceste cazuri sunt pulmonare i un sfert reprezint tuberculoza aparatului genito
urinar foarte greu diagnosticat n faza primar a bolii.
Tot odat, distribuia infeciei cu Mycobacterium bovis n rndul
populaiei umane din rndul populaiei umane din rile industrializate este
variabil.
Studii relativ recente , au estimat c proporia de cazuri de tuberculoz la
oameni cauzat de M. bovis s-a situat la 3,1 % ; ponderea formelor pulmonare a
fost de 2,1 % n timp ce tuberculoza extrapulmonar s-a ridicat la 9,4 % (24).
n tabelul alturat (tabelul 2 ) este prezentat distribuia infeciei cu M.
bovis n rndul populaiei umane din 8 ri industrializate.

11

Tabelul: 2
 Distribuia tuberculozei cu Mycobacterium bovis n populaia uman din in 8 ri industrializate

Perioada de Nr. cu M. bovis

ara studiu TB % din total Pulmonar
TB % din total M.bovis
Australia 1970 - 1994 240 0,43-3,1 71,6a
Anglia 1977 -1990 232 1,2 40,0
Irlada (rural) 1986 - 1990 17 6,4 70,6
Irlanda (urban) 1982-1985 9 0,9 88,8
N.Zeeland 1983-1990 22 7,2 31,8
Spania 1986-1990 10 0,9 50,0
Suedia 1983-1992 96 2,0 -
Elveia 1994 18 2,6 -
SUA 1954-1968 6 0,3 33,3
SUA 1980-1991 73 3,0 52b (12,0c)
A: Procentul include 80,0 % brbai i 51,2 % femei; b: Aduli, c: Copii

ncercnd s stabileasc distribuia tuberculozei cauzat de M. bovis n

rndul populaiei umane n funcie de profesie i cetenie, R o b e r t J, e t a l.,
(24) ajung la concluzia c lucrtorii din agricultur reprezentai de ngrijitori de
animale, fermieri i membrii familiilor acestora, veterinari, lucrtori n abatoare
dein 19,0 % din totalul categoriilor socio profesionale luate n studiu (Fig. 4).

Fig.4 - Procentul de pacieni infectai cu Mycobacterium bovis n funcie de de origine i profesie.

n Romnia, potrivit datelor publicate de D i d i l e s c u C. i M a r i c a C.

n 1998 (7), tuberculoza era rspndit n populaia uman din toate judeele rii.
Dup autorii citai , n anul 1995, incidena tuberculozei s-a situat ntre 43,6% 000 n
jud. Harghita i 138,4 %000 n jud. Giurgiu fa de media pe ar de 102,6 % 000.
n perioada 1985-2009 ,numrul de cazuri cu tuberculoz (cazuri noi i
recderi) a crescut de la 12677 (cazuri noi+recderi) n 1985, la 30984 (26567
cazuri noi i 4417 recidive) n anul 2002 dar n anul 2o10 se nregistreaz scderea
cazurilor noi i recidivelor (16).
Autorii studiului constat c incidena global a tuberculozei a sczut
constant de la an la an, n ultimii 7 ani , de la 142,2 % 000 de oameni n anul 2002,
cnd s-a nregistart cel mai mare numr de cazuri din ultimii 25 de ani, la 90,5
%000 oameni n anul 2010.
Dup incidena global, conform datelor OMS, Romnia ocup locul 52 din
212 ri i locul 4 n reg. Europei dup Kazahstan, Kirgiztan i Republica Moldova.
Pe categorii de vrst, frecvena ce mai mare a tuberculozei s-a registart la
tineri ntre 25-29 de ani i la aduli ntre 40-69 de ani. Aceiai autori consider c
prevalena infeciei tuberculoase i mortalitatea din cauza tuberculozei sunt mai
crescute n judeele din estul i sud-vestul rii, cu densitatea demografic ridicat
i acolo unde nivelul de trai i condiiile de via sunt sub limita subzistenei. (7,16).
De asemenea, sunt citate publicaii de specialitate n care se arat c
formele grave de tuberculoz au fost nregistrate n procent covritor la copiii
infectai cu HIV i Mycobacterium tuberculosis.
12

Astfel, M i h i l e s c u P. (17) preciza c decesele n rndul copiilor

infectai HIV i M. tuberculosis s-au situat ntre 20,0 50,0 % ntr-un grup de copii
bolnavi provenind din judeele Constana, Giurgiu i Mun. Bucureti. Studii
similare, au relevat c din 189 cazuri de tuberculoz asociat infeciei HIV/SIDA,
59,0 % erau copii n vrst de 0-4 ani (1).
Pe de alt parte, analiza riscului de mbolnvire efectuat pe baza testrilor
tuberculinice prevaccinale n anul 1994 a fost estimat la 3,9 % n mediul urban i
5,0 % n mediul rural.
Asupra infeciei cu Mycobacterium bovis la oameni, n Romnia exist
extrem de puine referine, n prezent fiind considerat raritate nu a prezentat
interes deosebit pentru patologia uman. Cu toate acestea, Didilescu C i Marica
C.,1998 (7), pe baza unor studii anterioare efectuate n vestul rii de P o p A l. e t a
l. n vestul rii arat c 9,06 % dintre izolatele micobacteriene obinute de la
pacienii cu diverse forme de tuberculoz extrapulmonar (limfonadal, osteo-
articular, meningite) i 6,21% dintre izolate de la pacienii cu tuberculoz
pulmonar erau Mycobacterium tuberculosis.
Mai recent, P o p e s c u t. (22), atrage atenia asupra riscului crescut de
infecie cu M.bovis i M. paratuberculosis la persoanele care consum frecvent
lapte proaspt nepasteurizat i/sau derivate lactate preparate dup tehnologii
tradiionale, provenind de la vaci, oi i capre potenial infectate cu M.bovis sau
M.paratuberculosis sau care nu au fost supuse controalelor sistematice pentru
tuberculoz i paratuberculoz prevzute n programele naionale de supraveghere
ale acestor boli.

1.6. Importana economic i sanitar.

Importana economic a tuberculozei rezid din nsi perderile econo-

mice care sunt direct proprionale cu incidena, prevalena i gradul de extindere
ale bolii.
Studiile efectuate n perioada 1998 2009 n Marea Britanie arat c
cheltuielile pentru controlul , diagnosticul i profilaxia tubrculozei la bovine i la
animalele slbatice au crescut de la 24,8 mil.lire sterline n 1998 la 87,0 mil. lire
sterline n 2009(Fig. 5) (5).

Milioane

Fig.5 Costurile suportate n Marea Britanie pentru controlul, diagnoaticul i profilaxia

tuberculozei la bovine i animalele slbatice n perioada 1998 -2009 (milioane lire) (5)

13

Pierderile economice datorate tuberculozei sunt reprezentate de:

 a. Reducerea perioadei productive a animalelor. Date nepublicate precizez
c n general la vacile de lapte bolnave de tuberculoz perioada vieii productive se
reduce la peste 50,0 % :
b. Scderi semnificative ale produciei de lapte n fermele afectate de
tuberculoz ca urmare a comercializrii restricionale a laptelui i produselor
lactate care pot s duc, n cele mai multe cazuri, la ncetarea activitii sau
falimentul fermelor ;
c. Scderea randamentului la tiere ca urmare a slbirii progresive a
animalelor bolnave i creterea cantitativ a confiscatelor de abator ;
d. Tulburri de reproducie manifestate prin clduri false, monte repetate,
an-oestrus prelungit etc. determinnd sterilitate pasager sau definitiv dar i
ntreruperea total a procesului de reproducie n fermele contaminate supus
programelor de eradicare a tuberculozei prin depopulare total;
e. Mortalitate embrionar, avorturi, debilitate conenital cu scderea
evident a viabilitii produilor obinui de la mame cu tuebrculoz;
f. Creterea semnificativ a cheltuielilor pentru aplicarea msurilor de
prevenire a difuzrii i pentru eradicarea bolii;
g. Pericolul iminent de transmitere a tuberculozei de la animale la om pe
cale aerogen i prin consumul de lapte i produse lactate provenite de la animale
cu tuber-culoz, motiv pentru care tuberuloza continu s fie ncadrat n grupul
zoonozelor;
h. Cheltuieli ridicate pentru spitalizarea i tratamentul bolnavilor de
tuberculoz precum i pierderi importante pentru incapacitate temporar sau
definitiv de munc

14

Bibliografie la cap. I.
1. Arghir Oana-Cristina: Patologia determinat de specii ale genului Mycobacterium la infeceti cu HIV-SIDA (interrelatii
pe plan individual i epidemiologic). Ref. I. in cadrul doctoratului UNIV.Carol Davilla BUC., 1995.
2. Brook R.K., McLachlan S.M.: factors influencing farmers concerns regarding bovine tuberculosis in wildlife and livestock
around Riding Mountain national Park. J. Environ manage. 2006, 80(20): 156-166.
3. Catalangi A., Romano Maria Isabel: Tuberculosis caused by other members of M.tuberculosis complex. In. Tuberculosis
2007,Palamino, Leoao Ritacco Eds. , BourcillierKamps.com.,Argentina, cap.8, pg. 283.
4. Cosivi O., Grange J. M. , daborn C.J., et al.: Zoonotic Tuberculosis due Mycobacterium bovis in developing countries.
Emerging Inf.Dis.1998, 4(1)
5. DEFRA: Breakdown of bovine TB expenditure for GB in 2009/2010.
6. Daborn G.J., Grange J,M., Kazwalar R.: The bovine tuberculosis cycle an African perspective. J.Appl.Bacteriol.,
(symp.Supl.),1997; 8127s-8132s.
7. Didilescu C., Marica C.: Tuberculosis in Romania. Publ.House, Curtea Veche 1998.
8. Eslabban Ms., Lofty O., Awad W.M., et al.: Bovine tuberculosis its extend of spread as a source of infection to man and
animals in Arab Republic Egypt. In: Proceeding of the International Union Against Tuberculosis and Lung
Diseases Conference 0n Aanimal Tuberculosis in Africa and the Middle east., 1992; Ape., 28-30, Cairo, Egipt,
Paris.
9. Green D.M., Kiss I.Z., Michell A.P., Kao R.R.: Estimates for local and movement-based transmission of bovine
tuberculosis in British cattle. Proc.biol.Sci., 2008, 275(1638): 1001-1005.
10.Hamid J., et al., : Bovine tuberculosis Dairy Animals at Lahore. Threat to Public Health. IAI-ASMA, Ian.2003,1-10.
11. Harrington N.P., Surjbnostic.alli O.P., Prescott J.F., Duncan J.R. Waters W.R., Lyashchenko K., Greenwald R.:
antibody responses of Cervids (Cervus elaphus) following experimental Mycobacterium bovis Infection and the
Implication for Immunodiagnostic. Clin. Vacc., 2008, 15(11): 165-1658..
12. Idigbe E.O., Anyiwo C.E., Onwujekwe D.I.: Human pulmonary infection with bovine and atypical mycobacteria in
Lagos, Nigeria, J,Trop.Med.Hyg., 1996; 89: 143-148.
13. Idrisu A., Schnurenberger P.: Public health significance of bovine tuberculosis in four Northen States of Nigeria: a
mycobacteriologic study. Nig.Med.J., 1997, 7: 384-387.
14. Iha V.C., Morita Y., Dhakal M. et al.: Isolation of Mycobacterium spp. From milking buffaloes and and cattle in Nepal.
J.Vet.Med..Sci., 2007; 69(8): 819-825.
15. Lodha R., Kabra S.K.: Newer diagnostic modalities for tuberculosis , Indian.J.Pedriat., 2004;71: 221-227.
16. Marica C., Didilescu C, Murgoci Fl., Tnsescu M.: Compendiul de tuberculoz.Ed..,Curtea Veche, 2011, 13.07.
17. Mihilescu P.: A X-a Conf.Nat.Pneumoftiziol., 10-11 Oct.1991.
18. Mler B., Hilty M., Berg S., et al.,: African 1, an epidemiologically important clonal complex of Mycobacterium bovis
dominant in Mali, Nigerisa, Cameroon and Chad. J.Bacteriol., 2009,191: 1951- 1960
19. Nafeh M.A., Meddat A., Abdul-Hammeed A-G., Ahmad Y.A., Rashwan N.M., Strickland G.T.: Tuberculosis peritonitis
in Egypt: the value of laparoscopy in diagnosis. Am.J. Trop.Med.Hyg., 1992; 47: 470--477
20. O.I.E. Rev.Sante.Anim.Mond. 1997
21. Pavlik I., Ayele Y.W., Parmova I., et al.: Incidence of boine tuberculosis in seven Central European Countries during the
years 1990-1999. Vet.Med.Chech, 2002, 47(2-3): 45-51.
22. Popescu St.: Some risk food factors involves in the transmission of the Mycobacterium bovis and Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis from animals to man and measures for elimination.. Microbiologia Balkanica,
Bucharest, Romania, No.23-26, 2005.
23. Popescu St.: Raport IDSA asupra situatiei epidemiologice a tuberculozei la animale in anii 2004 si 2005. Ed.,IDSA ,
Buc., 2006.
24. Robert J., et al.: A national survey of human Mycobacterium bovis infection in France. Int.Tub.Lung.Dis., 1999; 3(8):
711-714.
25. Rothel J.S., Jones S.L., Wood P.R.: A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-gamma and its use for
detection of tuberculosis in cattle. Aust.Vet.J., 1997, 67: 134-137.
26. Tschopp R., Schelling E., Hattendorf J., et al: Risk of bovine tuberculosis in cattle in rural livestock production systems
of Ethiopia . Prev.Vet.Med., 2009, 89(3-4): 205-211.
27. Tschopp R., Berg S., Agraw K., etal. : Bovine tuberculosis in Ethiopian wildlife. J.Wild. Dis., 2010, 46(3): 753- 763.
28. WHO , nov.2010, fact sheet, nr.104.
29. Witmer G., Fine A.E., Gionfriddo J., et al.: Epizootlogic survey of Mycobacterium bovis in wildlife and farm
enviroments in northen Michigan .J.Wildl.Dis., 2010, 46(2): 368-378.
31. www.oxfordimmunotec.com

15
 CAPITOLUL II

ETIOLOGIA TUBERCULOZEI

Tuberculoza, cunoscut sub diverse forme de exprimare clinic i localizare,

este produs de microorganisme denumite generic micobacterii.
Prefixul latin myco aparine att fungilorct i substanelor ceroase
prezente n structura peretelui celular al acestor microorganisme.

2.1. Taxonomie i clasificarea micobacteriilor.

n determinatorul Bergey , micobacteriile sunt ncadrate taxonomic n:

. Increngtura: Bacteria;
. Clasa: Actinobacteria;
. Subclasa: Actinobacteridae;
. Ordinul: Actinomycetales;
. Subordinul: Corinebacteriaceae;
. Familia: Mycobacteriaceae.
n cadrul familiei Mycobacteriaceae sunt incluse dou genuri:
Mycobacterium (L e m a n i N e u m a n n ,1896) i Nocardia care se
difereniaz ntre ele prin lungimea lanului de acizi grai din peretele celular,
denumii acizi micolici care au urmtoarea structur :

R1 - CH - CH - COOH

OH R2
Poriunile R1 i R2 au lungimi variabile n funcie de gen. S-a dovedit c la
genul Mycobacterium fragmentul de acizi micolici se gsete ntre C 60 i C90 , adic
este format dintr-un numr de 30 atomi de carbon n timp ce la genul Nocardia
lungimea fragmentului acizilior micolici este cuprins ntre C40 i C56 adic 16
atomi de carbon (70). n cadrul genului Mycobacterium au fost descrise numeroase
specii, subspecii i variante de micobacterii care produc mbolnviri la mamifere,
psri i la om i ale cror manifestri clinice sunt extrem de complexe.
n lucrarea sa, S a n d u I., 2001 (90) semnala existena a peste 85 specii de
micobacterii dar mai recent, s-a comunicat identificarea a 125 specii . Numrul
impresionant de specii aprinnd genului Mycobacterium a generat n timp o
diversitate de clasificri bazate ,n general, pe patogenitatea lor pentru una sau
mai multe gazde receptive, afinitatea pentru anumite esuturi, organe i sisteme din
organismul afectat precum i proprietilor fizico-chimice care difereniaz un grup
de micobacterii de altul.
Iniial, s-a realizat o clasificare general care se bazeaz pe caracteris-ticile de
patogenitate pentru gazda receptiv , conform schemei al schemei alturate (Fig.6):

16
 Familia
Mycobacteri
aceae
Mycobacterium Genul
Nocardia

Complexul
M.tuberculosis Complexul M. avium(MAC)

Micobacterii Gr. M. leprae

atipice
(nontuberculoase)

Gr. M. intracelulare-
Micobacterii Scrofulaceum
nepatogene (MISC)

Fig . 6- Clasificarea micobacteriilor n funcie de gazdele receptive i patogenitatea lor

Pe baza elementelor menionate, s-au fcut numeroase ncercri de clasificare

a micobacteriilor n cadrul genului Mycobacterium, astfel:
a). Specii patogene pentru om i animale :
- Mycobacterium tuberculosis (bacilul lui Koch), este agentul etiologic al
tuberculozei umane;
- Mycobacterium bovis, agentul etiologic al tuberculozei la bovine i la alte
rumegtoare domestice i slbatice. S-a dovedit c n anumite condiii
Mycobacterium bovis poate produce mbolnviri i la alte animale domestice i
slbatice (porcine i carnasiere) (29,36) precum i la om (22);
- Mycobacteirum muris este agentul etiologic al tuberculozei oarecelui de
cmp (Mycrostis agrostis).
Aceste specii au fost ncadrate n complexul Mycobacterium tuberculosis n
care, ulterior au fost incluse M. africanum i M. microtii (14,18, 19,70).
- Complexul Mycobacterium avium (MAC) care cuprinde: M. avium subsp.
avium (agentul etiologic al tuberculozei psrilor)(27), M. avium subsp.
intracelulare,M. avium subsp. paratuberculosisbacilul lui Johne(agentul etiologic
al paratuberculozei la rumegtoare i al bolii lui Crohn la om) (3,17,39,43) M. avium
subsp. silvaticum, M. avium subsp. hominissuis) (113).
b). Specii patogene pentru animale cu snge rece:
- Mycobacterium piscium;
- Mycobacteirum chelonei, izolat de la broasca estoas;
- Mycobacterium thamnopheos, izolat de la erpi;
- Mycobacterium ranae, izolat de la broasc.
c). Specii patogene pentru animale i om care produc etiti infecioase
distincte de tuberculoz :
- Mycobacterium leprae, agentul etiologic al leprei umane;
- Mycobacterium leprae murium, agentul etiologic al leprei la oareci.

d). Specii cu patogeitate relativ intermediar pentru animale i om:

- Mycobacteirum fortuitum, izolat din infecii piogene de la animale i

om,Mycobacteirum ulcerans, izolat din leziuni ulcerate de la om Mycobacteirum
marium, izolat de la peti i om.
17
Specii nepatogene: - Mycobacteirum smegmatis, Mycobacteirum phlei .a.
Din acest grup mai fac parte i alte specii dintre care Mycobacteirum lacticola,
considerat mult vreme agentul cauzal a dermatitei nodulare a bovinelor, entitate
infecioas care determin rspuns paraalergic la tuberculina bovin (PPD bovin).
Totodat, aceast grup cuprinde numeroase specii de micobacterii nepatogene
pentru animale i om dar care provoac numeroase reacii imune ncruciate cu
micobacterii patogene i dificulti serioase n diagnostic.
Grupa micobacteriilor nontuberculoase, denumite anterior atipice,
cuprinde mai multe specii care pot s produc o diversitate de exprimri clinice i
localizri n diferite sisteme i organe. D a v i d N. Mc. M u r r a y, 1 9 9 6 (70) , este
de prere c reprezentanii complexului M. avium ar putea fi ncadrai n grupa
micobacteriilor atipice (nontuberculoase) cunoscut fiind faptul c manifestrile
clinice respiratorii i leziunile provocate n alte organe i esuturi sunt distincte de
cele provocate de micobacteriile complexului M. tuberculosis.
Boala provocat de micobacteriile atipice (nontuberculoase ) evolueaz
dramatic n form diseminat la pacienii cu HIV/SIDA i la cei imunocompromii.
Limfadenitele cervicale cauzate de M. scrofulaceum au fost observate n
special la copiii n vrst de sub 5 ani.
Deobicei, leziunile granulomatoase ale pielii i esuturilor moi s-a izolat M.
mari-num care produce mici granuloame.
n egal msur, Complexul M. avium (MAC) este responsabil de
mbolnviri la peste 90,0 % dintre pacienii infectai cu HIV/SIDA (70).n tabelul 3,
este prezentat clasificarea micobacteriilor n funcie de pigmentogenez i
localizarea leziunilor, ncadrate n 4 grupe denumite grupele Runyon (Tabelul.3).
Tabelul :3

Clasificarea micobaceriilor netuberculoase (atipice) n funciede pigementogenez i localizarea

leziunilor.

Specia Gr. Pigment Apartenena Locazizare

Runyon la grup leziuni
M.kansasii I Foto- - Plumoni,
cromoge cutanat
n Gastrointest
inal
M. marinum I - Cutanat
M. simiae I - -
M. II Scoto - Cutanat ,
scrofulaceum Cromo limfatic
gen
M. szlugai II - -
M.gordonae II - -
M. avium III Necrom MAC Pulmoni,
avium ogen nod
limfatic,
diseminat
M.av. III
intracelularea
e
M.av.paratube III Gastrointest
culosis nal (Boala
Crohn),
limfatic
M. ulcerans III Ulceraii
cutanate
M. fortuitum IV Cretere - Cutanat,
rapid ocular
M. cheloneae IV - Cutanat.
MAC: Complexul Mycobacterium avium.

18

Grupele Runyon sunt alctuite n funie de producia de pigment , astfel:

speciile de micobacterii din grupa I-a se pigmenteaz numai atunci cnd sunt
expuse la lumin n timp ce micobacteriile din grupa II-a produc pigment numai la
ntuneric.
Micobacteriile din grupa III-a rareori sunt pigmentogene dar reprezentanii
grupei a IV-a nu produc pigment. (micobacterii noncromogene).
Utiliznd alte criterii care se bazeaz pe similitudini biochimice, ali autori
consider potrivit includerea M. scrofulaceum i M. avium intracelulareae n
grupul speciilor M. avium i constituirea Complexului Mycobacterium avium
intracelulareae scrofulaceum
(MAIS) n cadrul cruia, ulterior s-au descoperit variante care difer ntre
ele n funie de zahrul rezidual, lipopoligozaharidele sau peptidoglicolipidele din
structura peretelui celular.

2.2. Morfologia i structura micobacteriilor.

Micobacteriile sunt bacili fini, uor curbai, cu dimensiuni variind de la 1,5

4,0 n lungime i 0,2 0,6 n grosime dar prezint o un polimorfism accentuat
(10) (Fig.7).

Fig. 7- Imagine electrono microscopic a peretelui M. tuberculosis (10)

Unii autori au semnalat prezena n materialele patologice a formelor

cocobacilare sau cocoide, fr perete celular sau perete celular incomplet,
denumite forme (3, 7, 98).
Din punct de vedere tinctorial, unii microbiologi susin c bacilii
tuberculozei sunt Gram-pozitivi (113) .
P r e s c o t t e t a l, 1996 (84), arat c micobacteriile nu se ncadreaz nici
n grupa bacteriilor Gram-pozitive i nici n cea bacteriilor Gram-negative i c
structura peretelui celular al acestor microorganisme determin rezistena la
colorare cu cristal violet dar afinitate pentru coloranii anilinici aa cum este
fuxina. De aceea, pentru colorarea micobacteriilor, evidenierea i diferenierea lor
fa de alte microorganisme, se folosete metoda Ziehl-Neelsen, varianta de
colorare la cald (90).

19
n cadrul structurii micobacteriilor , peretele celular (anvelopa) este
componenta principal datorit rolului complex al acestuia n biologia i rezistena
micobacteriilor n mediul exterior, n celulele gazde infectate dar i rezistena fa
de medicamente i chimiotrepaia antimicobacterian. De asemenea, peretele
celular are n structura sa componente antigenice care permit diferenierea
diverselor specii de micobacterii. Cercetrile chimice, moleculare i de microscopie
electronic au adus contribuii importante n cunoaterea structurii peretului
celular al micobacteriilor (10,26,54).
S-a demonstart c toate speciile din genul Mycobacterium au un perete
celular caracteristic mai gros dect la alte bacterii cu proprieti hidrofobe datorit
coninutului ridicat n substane cerate complexe, acizi micolici i glicolipide.
Reprezentat schematic ( Fig. 8), nveliul extern al micobacteriilor este
alctuit din: membran citoplasmatic , peretele celular propriuzis i la unele
specii o capsul protectoare care se formeaz n anumite condiii de temperatur i
biologice n cursul creterii micobacteriilor n medii lichide.

Cero- Porine Pepto- Micolai LAM Arabino- Lipide dublu

lipide glicani galactan strat

Fig.8 - Reprezentare schematic a peretelui celular al micobacteriilor

a. Membrana citoplasmatic, se pare c nu este caracteristic

micobacteriilor, excepie fcnd numai cteva polizaharide din compoziia acesteia
care n general au fost ientificate la toi reprezentanii ordinului Actinomycetales
(65)
Membrana citoplasmatic conine proteine cu diverse funcii. De exemplu,
din membrana citoplasmatic au fost separate proteine cu rol n translatarea
semnalelor la componentele genetice din citoplasma, au fost extrase enzime
implicate procesele metabolice i generatori de energie precum i purttori care
mediaz selectiv transformarea nutrienilor n ioni (5). Enzimele intervin n
peretele celular i n sinteza membranei prin formarea de septumuri n timpul
diviziunii celulare.
De asemenea ele sunt implicate n asamblarea i secreia proteinelor extra-
plasmatice i replicarea acidului dezoxiribonucleic (ADN).
b. Peretele celular propriuzis, nconjoar membrana celular i este
constituit dintr-un strat intern de peptoglican (PG) care se pare c este responsabil
de morfologia i integritatea structural a bacteriei.
Structura peretelui celular difer nesemnificativ de cea a bacteriilor comune
dei celula micobacterian prezint unele elemente chimice reziduale particulare i
un numr mai mare de legturi ncruciate.

20
 S-a constatat c proporia acestor legturi ncruciate ale peptoglicanului
(PG) n peretele celulei M. tuberculosis este ntre 70,0 80,0 % n timp ce la
celula E. coli aceste legturi se gsesc n proproie de numai 20,0 30,0 % .
Poriunea covalent a peptoglicanului (PG) este o polizaharid cuplat cu
arabinogalactanul a crui extremitate terminal este esterificat cu acizi grai
denumii acizi micolici.
c. Acizii micolici. Aceste componente, sunt dispuse n peretele celular sub
form de lanuri branate ntre atomii de carbon C 60 C90 cu lungimi variabile de la
o specie de micobacterie la alta i greuti moleculare variind ntre 1.108 1.307
Da.
Genurile Dietzia, Rodococus, Nocardia, Gordona i Mycobacteirum conin
acizi micolici al cror numr de atomi de carbon este crescut.
Dispunerea acizilor micolici este specific speciei, propietate care permite
identificarea mai multor specii de micobacterii utiliznd metoda cromatografiei n
strat subire (5). De exemplu, n componena pereteluli celulei M. tuberculosis au
fost identificai : -acid micolic, keto-acid micolic i metoximicolatul care au ntre
76 82, 84 89 i respectiv 83 90 atomi de carbon.
Acizii micolici joac un rol important n mecanismele imuno-patogenetice n
cursul infeciei cu micobacterii. n cursul procesului de liz a celulei micobacteriene
prin fagocitoz se produce eliberarea acizilor micolici. Moleculele de acizi micolici
se leag la receptorii de pe suprafaa macrofagelor i determin eliberarea
citokinelor, n special a factorului - de necroz tumoral (TNF- ) mpreun cu
eliberarea de componente lisosomale toxice din macrofagele care ncearc s ucid
micobacteriile (6, 89).
d. Alte componente ale peretelui celulei micobacteriene. Peretele
celular al micobacteriilor mai conine lipide libere cum ar fi: fitocerol-dimico-
serozai (PDIM), glicolipide fenolice (GLF), diglicolattrehaloza (factorul cord)
i sulfolipide.
Prezena acestor lipide complexe n stratul exterior al peretelui celulelor
micobacteriene determin caracteristicile coloniilor pe medii de cretere solide. n
mod obinuit, la M. canetti care dezvolt pe medii de cultur solide colonii netede
(smouth) s-a identificat un glicolipid fenolic unic (101).
M. bovis i M. bovis-BCG produc un glicolipid fenolic (GLF) n cantiti i
dimensiuni apreciabile care a fost denumit micosid B. Majoritatea tulpinilor de M.
tuberculosis nu sintetizeaz acest produs.
Alte cercetri (64), au confirmat dispunerea selectiv a claselor de lipide
existente la suprafaa peretelui micobacteriilor.
Autorii citai, susin c n timp ce fosfatidil-etanol-amina i fosfatidil-
inositol-manosidul au fost gsite la toate speciile de micobacterii studiate (M.
tuberculosis, M. avium, M.kansasii, M. gastri, M. smegmatis i M. aurum) n
plus, la M. aurum s-a identificat dimicolil trehaloza (factorul cord).
Pe de alt parte, monomicolil - trehaloza i triacil - gliceridele au fost
identificate la suprafaa peretelui M. avium i M. smegmatis dar nu i la celelalte
micobacterii. Speciile i tipul de lipide specpfice-speciei, cum sunt : glicolipide
fenolice, dimicocerosate, fitoceroli i lipooligozaharide au fost identificate la
suprafaa celulelor aparinnd: M. tuberculosis (canetti) M. kansasii, i M. gastri n
timp ce glicopeptidolipidele s-au identificat numai n
componentele lipidice ale M. avium i M. smegmatis, sugernd c aceste
caracteristici pot explica diferenele n organizarea structural a peretelui
micobacteriilor.
Cercetri mai recente au constatat c peptoglicolipidele sunt reprezentate
de ceara D care se gsete n cantiti variabile n peretele celulei M. tuberculosis.
21
 De pild, n tulpinile virulente cum ar fi: M. tuberculosis H37 Rv ,
concentraia de cear D este ntre 6,0 8,0 % fa de numai 2,0 % ct s-a gsit n
tulpinile avirulente de M. tuberculosis - H37Ra .
Completnd structura peretelui (anvelopei) celulei micobacteriene, literatura
de specialitate descrie alte componente constituite din molecule glicolipidice dis-
puse n filamente care traverseaz peretele celular de la suprafa i pn la
membrana citoplasmatic de care se leag prin puni fosforice.
Aceti compui au fost denumii: fosfatidil-monoinositol-miosid, lipomanan (LM),
lipoarabinomanan (LAM). Lipoarabino-mananul (LAM) este specific - speciei
micobacteriene.
e. Porinele micobacteriene, sunt molecule de lipoproteine organizate
n canalicule, dispersate n peretele celulei micobacteriene i a cror extremitate
liber se deschide la exteriorul peretelui celular sub form de micropor. Unii autori
sunt de prere c porinele micobacteriene sunt diferite de cele ale bacteriilor Gram-
negative (9). Cercetrile n domeniu au artat c peretele celular al M.tuberculosis
conine cel puin dou tipuri de porine:
- un canal selector cationic termosensibil de 0,7 nanosiemens (ns) ,
constituit din subuniti cu greutate molecular de 15 kDa;
- un canal de 3,0 (ns) constituit din subuniti cu greutate molecular mai
mic de 60 kDa. (9).

Pe de alt parte, S o r u s h S h a r b a t i T e h r a n i , e t a l., 2005 (94),

studiind mecanismul sintezei i funciile porinelor din peretele celular al unei
mutante de M. smegmatis deletate la gena pentru porine mspA i o alt mutant
cu blocaj la gena mspA comparate cu o gen omoloag mspc au ajuns la concluzia
c gena responsabil de sinteza i funciile porinei este prezent la tulpina
slbatic de M. smegmatis i de aceea, persistena n interiorul celulei gazd nu
este afectat comparativ cu tulpinile de M. smegmatis deletate la gena mspA.
f. Componentele antigenice din structura peretelui celular al
micobacteriilor.
Dup cum s-a demonstrat anterior, peretele celular al micobacteriilor
conine un numr variabil de antigene (glicolipide i proteine) care pot fi utilizate n
diagnosticul serologic preliminar al infeciilor cu micobacterii (10).
Lipoarabinomananul (LAM) este un antigen lipopolizaharidic specific M.
tuberculosis n timp ce glicolipidele fenolice (PGL) cu prpieti antigenice au fost
extrase din pertele celular al M. leprae i M. bovis.
De asemenea, din glicopetidolipidele cu akilat trehaloze care se gsesc
n peretele M. kansasii, M. szulgai i M. malmoense, au fost extrase antigene
specifice.
Pe de alt parte, s-a constatat c stratul de peptidoglican (PG) este o surs
important pentru antigene proteice (55).
Micobacterii fr perete celular sau cu perete celular incomplet:
forme L.
Sunt corpusculi sferoizi sau cocoizi, localizai n celulele gazd, n special
macrofagele infectate sau n afara acestora, care au rezultat n urma pierderii totale
sau pariale de ctre bacterii a peretelui celular n cursul procesului infecios ca
urmare a aciunii unor factori intriseci i extrinseseci.
Micobacteriile deficiente n peretele celular au fost descoperite prima dat n
1883 de M a l a s s e z i V i n a l.
K l i e n e b e r g e r n 1935, a folosit pentru prima dat termenul de forme
L pentru micobacteriile deficiente n perete celular studiate n Institutul Lister
din Lodra.
22
 Termenul forme deficiente n peretele celular a nceput s fie utilizat mai
recent n literatur, relevnd o imagine real a acestor formaiuni (23).
Bazai pe rezultatele unor studii i cercetri complexe i pe un bogat material
documentar (7), relev importana deosebit pentru patologia medical, pentru
nelegerea mecanismelor imunologice i imunopatogenetice dar mai ales pentru
industria farmaceutic i chimioprofilaxia infeciilor cu micobacterii patogene
pentru om i animale. Cunoaterea acestor forme de supravieuire a
micobacteriilor n interiorul macrofagului i esuturilor afectate , nelegerea
mecanismelor de formare a acestora, funciile i implica-rea micobacteriilor cu
deficit de perete celular n evoluia infeciilor micobacteriene reprezint cheia
scuccesului n profilaxia i eradicarea tuberculozei, paratuberculozei (boala lui
Johne i boala Crohn) i a altor boli cu etiologie micobacterian la animale i om.
Este evident c prezena micobacteriilor cu deficit de perete celular (FDPC) n
materialele patologice provenite de la oameni i animale bolnave de tuberculoz
sau paratuberculoz (boala lui Johne) ori alte boli cu etiologie micobacterian, sunt
destul de dificil de detectat i identificat numai prin examen bacterioscopic direct i
n consecin, n nenumrate cazuri un diagnostic eronat este inevitabil, cunoscut
fiind faptul c numeroase alte specii de bacterii cum ar fi: Yersinia (46),
Staphylococcus coagulaso-negativ (35), Listeria monocytogenes (67) sau
Helicobacter pylori(109), pot s sufere transformri similare n interiorul orga-
nismelor gazd i unele specii ca: Bartonella sau Proteus sunt implicate n activarea
bolii HIV/SIDA. De aceea, am considerat necesar o prezentare mai larg a acestor
forme de celule micobacteriene.

a. Importana formelor micobacteriene lipsite de perete celular sau cu

perete celular incomplet. Recent, formele deficitare n perete celular (FDPC) al
micobacteriilor a focalizat atenia cercetrii medicale asupra asocierii acestora cu
infeciile cronice i persistente. n prezent, formele deficitare n perete celular
(FDPC) sunt considerate ca produse ale interaciunii ntre un agent infecios i
sistemul de aprare al gazdei (69). Ele pot supravieui pentru o lung perioad de
timp ntr-un stadiu de hibernare n interiorul organismului gazd dar pot
induce manifestri ale bolii dup ce devin active, suferind fenomenul de reversie
sub influiena diferiilor factori de stress asupra organismului gazd. (23).
b. Clasificarea micobacteriilor far perete celular sau cu perete celuar
incomplet (FDPC).
Conform capacitii lor de a reveni la celula iniial, cu perete clasic,
fenomen denumit reversia formelor L, micobacteriile deficitare n perete
celular se clasific astfel:
- stabile ( nereversibile) i;
- instabile ( reversibile spontan) .
Dup gradul de participare a componentelor peretelui celular, formele L
ale micobacteriilor au fost ncadrate de K a p r a l e k F. , 2000 (51) i M a t t m a
n , 2001 (69) n dou grupe:
- proptoplati:
- sferoplati.
Protoplatii, formaiuni lipsite complet de peretele celular, sunt acoperite
numai de o memebran care le separ de mediul exterior.
Protoplatii pot fi confundai foarte uor cu micoplasmele care de asemenea
sunt lipsite de perete celular. Principala caracteristic a protoplatilor este legat
de absena complet a peretelui celular, motiv pentru care ei nu pot suferi
fenomenul de reversie regene-rnd celule cu perete normal, deci nu se pot divide
(69).
23
 Sferoplatii. Deobicei, sferoplatii sunt structuri care i pstreaz parial
peretele celular i de aceea suprafaa lor permite ptrunderea cu uurin a
substanelor din exterior n interiorul celulei comaprativ cu suprafaa peretelui
normal al celulei care reprezint o veritabil barier de protecie mpotriva
enzimelor lisosomale, a altor produse de metabolizare elaborate de celula gazd
precum i aciunii chimioterapicelor.
Morfologia micobacterilor lipsite de perete celular sau perete incomplet.
Microscopia electronic cu transmisie-scanare a permis s se aprecieze c
formele L ale micobacteriilor au o morfologie divers, cel mai frecvent fiind cele
sferice.
Dimensiunile destul de reduse coner formelor-L aspect de corpusculi care
pot traversa filtrele bacteriologice standard cu mrimea porilor de 220 nm.
Formele rotunde virulente ale M. tuberculosis denumite mycocus nu se
coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen dar au dovedit proprieti tinctoriale Gram-
pozitive. De asemenea, forme celulare gigante asemntoare cu Amoeba au fost
evideniate n culturile nvechite de M. phlei.
Asemenea forme sferice gigante denumite muguriri similare drojdiilor
sunt dispuse n grupuri caracteristice.
De asemnea, s-a observat, n probele examinate, att corpusculi elementari
solitari dar i structuri filamentoase care au fost asociate cu micobacteriile cu
deficit deperete celular.
Experimentele efectuate de M i h a i l o v a e t a l., (2005) au artat c
formele granulare atipice ale M. tuberculosis sunt rezistente la streptomicin i
isoniazid (73).
Prezena micobacteriilor cu deficit al peretelui celular (forme L) n
materialele biologice infectate au fost asociate mult vreme cu sarcoidoza.
Astfel, n esuturile provenind de la pacieni cu sarcoidoz au fost observate
aa numitele cromogene pleiomorfe: structuri similare drojdiilor, elemente divers
pigmentate, forme vacuolizate
(stadiu de sferoplati i corpusculi rotunjii detectabili n granuloame (1). Prezena
acestor forme diverse ale M. tuberculosis au fost confirmate, de asemenea n
cursul infeciei exeperimentale a macro-fagelor de oarece n care s-au observat
celule bacteriene lipsite de perete (33).
Mecanismul transformrii micobacteriilor in vivo n forme cu deficit n
perete celular. Mecanismul transformrii micobacteriilor in vivo n forme-L cu
deficit n perete celular nu este cunoscut n detaliu i adesea controversat.
Totui, asemenea forme pot fi produse ca urmare a interaciunii dintre
microorganismele infecioase i sitestemul imun al gazdei, astfel nct celulele
micobacteriene nu sunt complet distruse i intr n stadiul de somonolen
(hibernare) (Fig. 9).
Aceste forme hibernante ale micobacteriilor sunt capabile s persiste
perioade ndelungate de timp n organism i s reziste la rspunsul imun (85).
Sub influena factorilor intrinseci, cum ar fi: deficitul sau blocarea
substanelor lisosomale de digestie a micobacteriilor, scderea capacitii de
aprare a celulei gazd sau a sistemului imun al organismului gazd i factori
extrinseci din mediul nconjurtor cu aciune nociv asupra organismului, se poate
produce reversia formelor-L n bacili acido rezisteni (BAAR) cu perete celular
complet care determin reactivarea bolii.

24
 BK

Membrana
Macrofagului

Citoplasma
Imunodepresie Factori
inactivitate inhibitori ai
lisosom activitii
lisosomale

Multiplicare
masiv cu LISOSOMI
distrugerea
lisosomului

Forme L Activitate intens absent

n stadiul a lisosomului de tuberculoza
de laten distrugere a BK clinic
(hibernare)

TUBERCULOZ
ACTIV REVERSIA TUBERCULOZ
formelor-L LATENT
CRONIC

Fig. 9 - Mecanismul transformrii micobacteriilor n forme L .

Efectul incomplet al antibioticelor, enzimelor i a altor subtane eliberate de

celula gazd pentru digestia micobacteriilor reprezint probabil factorii favorizani
pentru declanarea mecanismului de transformare a micobacteriilor n forme-L.
Reversia formelor-L la celula iniial acidorezistent este posibil datorit
meninerii capacitii formelor-L de a sintetiza peptoglicanul (PG) i alte
componente macromoleculare ale peretelui celular (78).
U d o u e t a l ., 1982 (98), au studiat reversia sferoplatilor de micobacterii la
forme bacilare i au constatat c acest mecanism se deruleaz n dou stadii:
- n primul stadiu se produce o mugurire a tulpinilor sferoplatilor ;
- n al doilea stadiu se formeaz celule fiice din ramurile mugurite. Stadiul
al doilea ar putea fi explicat prin dou ipoteze :
- formele bacilare au originea din corpusculii elementari, formai n
citoplasma ramurilor i sferoplatilor ;
- formele bacilare sunt originare din corpusculii iniali ca un rezultat al
divizrii tulpinilor i sferoplatilor.
Factorii extrinseci care influeneaz reversia formelor-L nu sunt nc bine
cunoscui. Unele experimente au artat c frecvena regenerrii sferoplatilor ar
putea fi afectat de concentraiile n ioni de Mg2+ i Ca2+ n mediul de cultur(99).
Pentru cercetarea micobacteriilor cu deficit de perete celuar (forme-L) au
fost utilizate la nceput metodele clasice (microscopie optic i microscopia cu
lumin fluoerscent, imunofluorescena , microscopia electronic, cultura bacte-
riologic clasic i cu sitem automat i mai recent biologia molecular . Aceste
mijloace de investigare vor fi prezentate n detaliu n capitolele urmtoare.
Semnificaia clinic a micobacteriilor cu deficit de perete celular este
relevat pe larg n literatura de specialitate (38).
De exemplu, C h i o d i n i e t a l . , 1984 (17) , au izolat de la 4 pacieni cu
boala lui Crohn o micobacterie care prezenta caracteristicile unei biovariante a
M.av.paratuberculosis sau o specie nou de Mycobacterium; aceste izolate erau
lipsite de perete celular.
 25
Mai trziu , G r a h a m et a l.,1987 (38), au stabilit c aceste
microorganisme erau forme L ale M.av. patratuberculosis demonstrnd totodat
c frecvena reversiei n esuturi provenind de la pacienii cu boala Crohn s-a
ridicat la 33,3 % din cazuri.
Studii similare au fost ntreprinse de S c h w a r t z e t a l., 2000 (91) care
au publicat izolarea presferoplatilor M.av.paratuberculosis din esuturile
pacienilor cu boala lui Crohn fr ns a preciza numrul izolatelor.
Utiliznd hibridizarea in situ pentru detecia formelor-L ale M.av.para-
tuberculosis, H u l t e n e t a l., 2001 (43), au constatat diferene procentuale
notabile ntre pacienii cu boala lui Crohn, cei cu colit ulcerativ i oamenii
sntoi n timp ce S e c h i a e t a l ., 2001 (92), au nregistrat o rat de detecie
a formelor-L la peste 70,0 % dintre pacieni.
Dup G r e e v s t e i n R. J. ,2003 (39) se pare c sensibilitatea ridicat a
pacienilor la enterita granulomatoas (boala lui Crohn) i substanial redus la
enterita ulcerativ este determinat de gena defectiv NOD 2 responsabil de
rspunsul imun fa de infecia bacterian.
n aceeai msur s-au realizat studii i cercetri ample privind impactul
clinic al formelor-L ale M. tuberculosis n cursul evoluiei bolii.
De exemplu, D o r o z h k o v a I.R, e t a l ., 1990 (25), raporteaz izolarea
formelor-L ale M.tuberculosis, cu frecven sczut, de la 28,0 % pacieni aduli,
dar semnificativ crescut (67,7 %) la copii, sugernd rolul important al formelor-L
n reactivarea procesului infecios.
De asemenea, G u r e n k o E.G., e t a l., 1990 (40), a detectat formele-L ale
M. tuberculosis la 66,3 % dintre pacienii cu pneumoconioz asociat cu
tuberculoza. Acelai autor a gsit 57,8 % forme-L ale Mycobacterium tuberculosis
la pacienii cu tuberculoz liberi de pneumoconioz.
Alte cercetri, semnaleaz creterea procentului de pacieni la care s-au
detectat formele-L ale M. tuberculosis dup ce acetia au fost supui timp de 6
luni chimioterapiei specifice, ceeace conduce la susinerea ipotezei potrivit creia
reversia formelor-L persistente ale M. tuberculosis determin reactivarea tuber-
culozei care constituie un aspect clinic foarte important (62).
Cercetnd rolul formelor - L ale M. tuberculosis n epidemiologia
tuberculozei K o m e n k o i M u r a t o v, 1993 (53), au determinat pericolul
prezentat de purttorii i eliminatorii de forme-L pentru mediul nconjurtor.
Autorii au stabilit c formele-L evident instabile au fost capabile s se transforme
n celule bacteriene cu perete complet i n consecin s infecteze ali indivizi la
care s-a observat infiltraie pulmonar atipic i leziuni isolate distructive precum
i proces inflamator persistent. Ulterior, studiile au fost completate de Z h u e t a
l ., 2000 (108) care a detectat formele-L ale M. tuberculoais n 15,0 % din probele de
sput ale pacienilor examinai i respectiv 26,0 % din probele de snge.
In medicina veterinar exist extrem de puine referine privind existena
formelor-L la animalele infectate cu micobacterii. Majoritatea cercetrilor au
utilizat modele experimentale cu animale de laborator. n acest context, sunt
menionate experimentele lui Li G.L., 1990 (61) care, cercetnd formele-L ale M.
tuberculosis prin examinarea n microscopie electronic a organelor cobailor
infectai cu tulpina H37 Rv, a ajuns la concluzia c formele-L apar dup 3
sptmni de la infecia intraperitoneal i nregistreaz vrful maxim la 8
sptmni dup infecie.
Alte exeprimente pe cobai au demonstrat lipsa patogenitii formelor- L ale
M. tuberculosis nainte de reversia acestora la formele bacilare (87).
 26
Pe de alt parte, s-a dovedit c infecia cobailor cu forme-L i forme ultra
fine ale M. tuberculosis au indus rspuns imun mediat celular i intensitatea
acestui rspuns s-a corelat cu extinderea modificrilor macroscopice aprute dup
infecie. Autorii citai, susin ptogenitatea pentru cobai a formelor L izolate de la
pacieni cu tuberculoz (87).
n rezumat, micobacteriile cu deficit de perete celular, denumite ulterior
forme-L, au un rol esenial n patogeneza i epidemiologia infeciilor micobacte-
riene.
Morfologia formelor-L face extrem de dificil diagnosticul tuberculozei i a
altor boli cu etiologie micobacterian prin mijloacele clasice cunoscute. Prezena
formelor-L n celula gazd n stadiul de hibernare este consecina interveniei
factorilor intrinseci cu referire la mecanismele de aprare ale gazdei i a factori-
lor extrinseci din mediul nconjurtor.
Mecanismul de reversie descris, reprezint o etap important n evoluia
bolii; revenirea formelor-L la celula micobacterian complet determin reactiva-
rea bolii.
Pe de alt parte, mecanismul de reveresie constituie un element epidemio-
logic deosebit de important, cunoscut fiind procentul ridicat de cazuri infectate cu
forme-L eliminate de bolnavi n sput, urin, fecale. Importana epidemiologic a
formelor-L este amplificat n cazul infeciilor cu micobacterii din complexul M.
avium n special M. a. paratuberculosis i M.a. intracelulare .
De aceea, tehnologiile moderne de biologie molecur i a altor mijloace cu
valoare diagnostic ridicat trebuie s fie indispinsebile n practica medical i
medicin veterinar pentru a elimina erorile i ntrzierile n diagnostic i a sin-
gura succesul n lupta impotriva infeciilor micobacteriene.

2.3.Rezistena bacililor tuberculozei la factorii fizico-chimici.

Dup cum s-a artat, reprezentanii complexului Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium avium i alte micobacterii responsabile de infecii
tuberculoase la animale i oameni , au peretele celular alctuit din lipide care
reprezint ntre 30,0 60,0 % din greutatea bacilului i substane cerate , aa cum
este ceara D care acoper suprafaa peretelui M. tuberculosis. Lipidele i
substanele cerate din compoziia peretelui micobacteriilor asigur acestora
protecie sporit mpotriva factorilor fizico-chimici din mediul exterior, gradul de
rezisten fiind diferit de la o specie la alta i variabil n funcie de condiiile de
mediu (temperatur, umiditate, pH, etc.).
Cunoaterea rezistenei bacililor tuberculozei fa de agenii fizico-chimici
are importan deosebit pentru activiti de diagnostic dar mai ales pentru
prevenirea rspndirii tuberculozei i pentru combatere i eradicare. n acest
context, este important de subliniat c bacilii tuberculozei, ncorporai n secreii i
materii biologice infectate, sunt mai rezisteni dect cei liberi n mediul ambiental
sau cei din culturi (45).
Cercetrile ntreprinse de I o n i c C., e t a l , 1974 (45), au demonstrat c
bacilul tuberculozei bovinelor rezist n pmnt i pe puni pn la un an n
condiii optime de temperatur, umiditate i pH neutru. n fecalele i urina ani-
malelor precum i n rezidiile furajere supuse procesului de biosterilizare, bacilii
tuberculozei sunt distrui dup 6 luni. Aceeiai autori arat c n fecalele uscate
bacilii pot rezista mai muli ani.
Studii recente au demonstrat persistena n apele reziduale i n ruri a M.
tuberculosis, M. bovis, M. marinum timp de peste 12 luni de observaii.
27
 n apa potabil germenii responsabili de producerea infeciilor tuberculoase
au rezistat mai mult de 140 de zile .
Dup autorii citai, reprezentanii complexului M. avium sunt mult mai
rezisteni dect M. tuberculosis i M. bovis chiar i n condiii de temperaturi
negative n mediul exterior, umiditate ridicat n sol i pH acid. Rezistena crescut
a micobacteriilor din complexul M. avium la agenii fizico-chimici din mediul
exterior a fost explicat prin grosimea stratului exterior de substane cero-lipidice
ale peretelui acestor microorganisme, mult mai crescut dect la M. tuberculosis,
M. bovis i ali reprezentani ai complexului M. tuberculosis.
Experimentele proprii efectuate ntr-o exploataie de ovine infectate cu M.
av. subsp. paratuberculosis au condus la concluzia c probele prelevate din padoc
de la suprafaa solului supus aciunii directe i prelungit a razelor solare au fost
negative n timp ce n probele prelevate din adpost i din locuri ferite de aciunea
direct a razelor solare au fost evideniai bacilii acido-rezisteni (BAR) n peste
90,0 % din eantioane. (P o p e s c u S t., date nepublicate). Rezultatele
experimentelor, sugereaz c, razele ultraviolete distrug bacilii tuberculozei n 5
ore n mediul uscat timpul fiind prelungit ns mai mult n condiii cnd germenii
sunt protejai de materiale organice, discontinuitate n expunere,etc. (8) .
n pulmonii, n nodurile limfatice i in alte organe cu leziuni tuberculoase,
precum i n alte produse patologice ngropate, bacilii, tuberculozei rezist pn la
180 de zile i n sputa infectat 3-4 luni dac nu este expus la lumina solar
direct, 7 zile la lumina difuz i numai 10-15 ore cnd este expus la aciunea
luminii directe(104). n carnea srat i afumat bacilii tuberculozei nu sunt
distrui . De asemenea sucul gastric nu are aciune bactericid asupra agenilor
tuberculozei. De exemplu, sucul gastric al cinilor nu distruge bacilii nici dup 6
ore de aciune.
Cldura umed distruge bacilii tuberculozei n 4 ore la 55 o C., n 25 de
minute la 65o C., n 10 minute la 70o C. i n 30 de secunde la 100 oC. S-a dovedit c
rezistena bacililor este mai crescut la cldura uscat.
De asemenea, temperaturile sczute acioneaz diferit asupra viabilitii
agenilor etiologici ai tuberculozei n funcie de specie, timpul de expunere i
scara temperaturilor (oC). Dup B e r c e a I. e t a l., 1981 (8) reprezentanii
complexului M. tuberculosis rmn viabili timp de 3 ani la temperatura de +4 oC. -
+8oC dar M. avium rezist la temperaturi de - 192o C. i i pstreaz viabilitatea i
virulena chiar dup 200 de cogelri i decongelri succesive.
n lapte, bacilii sunt distrui la 75o C. n 20 de minute, la 80o C. n 5 minute ,
la 90 C. n 2 minute i la 95 o C. ntr-un minut . n laptele acru rezist 15 zile i n
o

unt 30 de zile . n brnzeturi fermentate bacilii tuberculozei dispar dup 4-5 luni
.Studiul ntreprins n Marea Britanie i publicat n anul 2000 n A n n. R e p. o n
T B i n S. W. E n g l a n d, arat c M. bovis a fost detectat prin PCR n 12,0
%din probele
de lapte provenind de la vaci cu tuberculoz i nepasteurizat i n 3,0 % din
laptele pasteurizat necorespunztor.
Cerecetri similare au fost efectuate i de O f u k w u e t a l., 2 0 0 8 (79)
i D o m e n e c h - d e l a R u a (22 ) care au demonstrat c din 73 probe de lapte
crud provenind de la vacile i bivoliele pozitive la intradermo-tuberculinare (IDR),
n 27,4 % s-au identificat bacilii acidorezisteni responsabili de tuberculoza la copii.
Bacilii tuberculozei au rezisten deosebit la aciunea acizilor i alcaliilor
chiar i atunci cnd acestea sunt utilizate n concentraii apreciabile. De exemplu,
acidul sulfuric i hidratul de sodiu ntre 5,0 - 10,0 % , acidul lactic 15,0 %, etc. nu au
aciune asupra agentului tuberculozei bovine. De asemenea, rezistena este
apreciabil la aciunea substanelor chimice i anti septice.
 28
Formolul 0,01 % i sublimatul 1 %o distruge bacilii tuberculozei din culturile
bacteriologice n 24 de ore i fenolul 5,0 % n 2 minute, n timp ce pentru
inactivarea bacililor din materialele patologice sunt necesare 6 ore.
Dup G e o r g e s c u V. , e t a l. (citat de 8), formolul 3,0 % omoar bacilii
tuberculozei n 30 de minute iar soluia de var cloros 4,2 % clor activ inactiveaz
suspensiile de bacili i materiale organice contaminate att cu M. bovis ct i cu M.
avium n 30 de minute.
Pulverizarea soluiei alcaline de formol inactiveaz germenii existeni pe
pardoseala, pe pereii i pe tavanul adpostului contaminat cu M. bovis i M. avium
n 24 de ore. Unii autori au obinut eficien maxim atunci cnd au utilizat soluia
alcalin de formol nclzit la 25 30o C.
Soluia de bromocet 1,0 % omoar bacilul tuberuclozei n 12 24 de ore n
timp ce soluiile nclzite i concetrate de detergeni anionici n 24 48 de ore (30).
Testarea unor produse pentru decontaminarea incintelor spitaliceti i a labora-
toarelor pentru micobacterioze au demonstrat c peroxid hidrogenul mpreun cu
acidul peroxiacetic 0,06 %, glutaraldehida acid 2,0 % i alcalin 2,0 % fenolul i
cloramina (aproximativ 1000 ppm.) au fost eficiente n timp ce compui cuaternari
amoniacali i 0,13 %, glutaraldehida 0,44 % i fenolul 0,08% s-au dovedit
ineficiente (11).
Rezistena micobacteriilor la medicamente. n biologie prin rezistena
microorganismelor la unul sau mai multe medicamente se nelege capacitatea
agenilor etiologici ai bolilor infecioase de a rezista la o larg varietate de medica-
mente sau produse chimice distincte din punct de vedere structural i funcional.
Microorganismele sunt capabile s supravieuiasc ani n ir prin
capacitatea lor extrem de a se adapta la aciunea distructiv a agenilor
antimicrobieni, inclusiv medicamentele.
Microorganismele patogene, se adapteaz i supravieuiesc prin dou
mijloace: mutaia spontan i transferul DNA.
Biologia definete mutaiile ca fiind schimbri la secvena baz-pereche a
materialului genetic din celula microorganisului. Mutaiile pot fi cauzate de erori de
copiere a materialului genetic n cursul diviziunii celulare prin expunere la
ultraviolete sau la radiaii ionizante, mutageni chimici sau virusuri. Mutaiile pot s
apar i deliberat sub control celular n cursul unor procese cum ar fi hipermutaia.
n general mutaiile subdivizate care pot fi transmise la descendeni se
produc la organisme unicelulare, n timp ce mutaiile somatice se produc la
organismele din regnul animal i nu pot fi transmise descendenilor.
Transferul DNA reprezint o alterare a funciilor biologice celulare care
rezult din preluarea i exprimarea materialului genetic strin (DNA). Alterarea
genetic are loc dup inserarea n DNA prin conjuncie a unei plasmide codate.
Cercetrile complexe asupra multirezistenei micobacteriilor la medicamente i
chimioterapice respect perceptele biologice menionate dar exist unele
particulariti.
Micobacteriile i manifest rezistena, n primul rnd prin proprietile
hidrofobe ale peretelui celular care nu permite ptrunderea moleculelor
medicamentelor i a altor produse chimice hidrosolubile i n al doilea rnd,
rezistena micobacteriilor la medicamente este controlata genetic ( 48,49,70,114).
D a v i d M c M u r r a y (70) susine c mutaiile genelor catG i InhA sunt
asociate cu rezistena M. tuberculosis la inosidazid n timp ce gena rpoB,
responsabil pentru RNA-polimeraz, este alterat la multe izolate rezistente la
rimfamicin.
 29
Asemenea mutaii n rpoB au fost gsitre n 87,8% dintre izolatele rezistente
la rimfamicin sugernd c o detecie rapid a rezistenei la rimfamicin ar putea
fi fcut prin testarea izolatelor pentru mutaia rpoB (114).
Pe de alt parte, J u l i e S. P h i l a l a y et al., 2004 (48) sunt de prere c
multirezistena Mycobacterium tuberculosis este determinat de prezena unei
poliketid sintaze responsabil de sinteza dimicrocerosil-fitoceroulului, un lipid
major din peretele celulei micobacteriene.
n acelai timp, autorii susin c distrugerea genei pks 12 a M. tuberculosis
a dus la apariia de mutante moderat sensibile la claritromicin dar fr ca
sensibilitatea la ciclofoxacin i penicilin s fie modificat . n cazul complexului M.
avium (MAC) acest aspect pare a fi diferit. Gena pks12 mpreun cu Maa2520
joac un rol semnificativ pentru rezistena la medicamente al complexului M.
avium.
C a r o l i n e L a v e n d e r e t a l .,2005 (59), susin c mutaiile survenite
n regiunea katG, n special substituirea S315T, este responsabil de rezistena la
isoniazid (INH) ntr-o poporie semnificativ de cazuri cu tuberculoz .
Cercetri recente ntreprinse de J u n c h i r o S e k i g u c h i et al.,
2007 (49), au relevat mai pregnant rolul mecanismelor genetice n aparia
mutantelor de micobacterii rezistente la medicamente i chimioterapice. Utiliznd
o metod rapid de secveniere bazat pe detectarea mutaiilor din genomul
Mycobacterium tuberculosis rezistent la medicamente, autorii citai au gsit 8
regiuni de restricie genomice, fiecare dintre aceste regiuni responsabil de
rezistena la unul sau la mai multe medicamente, cum ar fi: rpoB pentru rifampin
(RIF), katG i mabA (fabG1)-inhA promotor pentru isoniasid (INH), embB pentru
etambutol (EMB). pncA pentru pirazidamid (PZA) rps i rrs pentru
streptomicin(STR) i gyrA pentru levofloxacin. n acelai an, autorii au raportat c
sensitivitate i specifitatea testului de hibridizare n linie pentru detectarea
mutaiilor n regiunea pncA a genomului M. tuberculosis a fost 100 % dovedind
superioritate net fa de metoda convenional de testarea a susceptibilitii la
pirazidamid (PZA) prin simplitate i rapiditate.
Interesul pentru studiul rezistenei M. bovis la medicamente i chimio-
terapice uzuale a fost mai redus datorit faptului c tratamentul la bovine i alte
animale domestice este costisitoare i tratamentul este lipsit de eficien. De aceea,
n literatura de specialitate exist puine raportri asupra rezistenei M. bovis la
medicamente i acestea se refer numai la comportamentul dezvoltrii tulpinilor de
M. Bovis pe medii de cultur n prezena unor medicamente antituberculoase.
Totui, s-a demonstart rezistena mult mai crescut a M. bovis comparativ cu M.
tuberculosis la inosiasid (INH), pirazidamin (PZA), etambutol (EMB).
Avnd n vedere c rezistena la medicamente i chimioterapice este un
criteriu frecvent utilizat n laboratoare pentru identificarea i diferenierea bacilului
tuberculozei bovine de alte micobacterii subiectul va fi tratat pe larg n capitolul
rezervat diagnosticului bacteriologic.

2.4. Particulariti epidemiologice.

a. Specii receptive. Tuberculoza afecteaz omul i numeroase specii de

animale i psri domestice i slbatice fiind dependent de specie i individ.
Dac pn n anul 1975 se cunoteau 50 de specii de animale i 25 de specii de
psri domestice i slabatice afectate (104), n 1981 boala era semnalat i la
animale cu

30
snge rece ( peti, reptile, batracieni) de la care s-au izolat tipurile: M. piscium, M.
chelonei, M. thamnopheos, M. ranae (8) i n prezent , numrul speciilor receptive
la tuberculoz este impresionant.
Dintre animalele domestice, cele mai receptive sunt: taurinele, bubalinele,
caprinele i ovinele care se infecteaz cu Mycobacterium bovis i mai rar cu Myco-
bacterium tuberculosis.
De exemplu, la taurinele i bubalinele infectate cu M. tuberculosis i/sau M.
avium cu excepia M. a. paratuberculosis nu se instaleaz leziuni vizibile dar este
activat sistemul imun mediat celular (IMC) care evideniaz , n majoritatea
cazurilor, reactivitate ncruciat cu PPD - bovin n testul intradermotuberculinic
(IDRT). Pe de alt parte, literatura de specialitate citeaz izolarea de la capre a
Mycobacterium caprae care a fost ncadrat recent n Complexul M. avium. (44).
Porcii domestici se infecteaz cu M. bovis n urma hrnirii acestora cu lapte
crud provenit de la vaci bolnave de tuberculoz sau cu produse secundare cum ar fi
zerul (105). Paradoxal, ntr-un studiu complex cu durata de 9 ani, P a v l i k I. e t a
l., 2003 (81), au monitorizat 45.258,5 miloane porci tiai n abatoarele din
Republica Ceh i au gsit leziuni de tuberculoz, confirmate prin examen
bacteriologic i PCR , la 134.088 (0,32 %) din care numai la 0,07 % s-a identificat
M. bovis n timp ce complexul M. avium s-a gsit la 55,7 % din care. M. av.
hominissuis la 39,2 % din cazuri. De asemenea, n probele examinate s-au
identificat n proporie de 5,1 % micobacterii condiionat patogene cum sunt:
M.cheloneae-abscessus, M.terrae, M.fortuitum, M.phlei.
Totui,autorii menioneaz c M. bovis a fost izolat de la porcii cerscui
ntr-o ferm de vaci cu tuberculoz.
La carnasierele domestice (cini i pisici), tuberculoza nregistreaz
inciden progresiv, infecia fiind produs cel mai frecvent de M. bovis i M.
tuberculosis i destul de rar de M. avium dar exist referine asupra infectrii
pisicilor cu M. microti (10,0 % din cazurile investigate) precum i cu unele
micobacterii oportuniste : M. cheloneae-abscens, M. xenopi, M. smegmatis, M.
fortuitum, M. terrae .a., care sunt responsabile de producerea unor infecii
tuberculoase la pisici (29, 66, 76). Frecvena cea mai crescut a fost observat la cinii
i pisicile cu habitat n fermele de vaci de lapte, n incinta abatoarelor,
carmangeriilor i unitilor de prelucrare a laptelui (75).
n ultimul timp, s-a semnalat inciden crescut de cazuri cu lepr felin
produs de M. leprae murium n Australia, Noua Zeeland, Marea Britanie,
Olanda, vestul Canadei i n California i Oregon din SUA (66).
Cazuri excepionale de tuberculoz au fost descrise la cal, catr i mgar, la
care infecia cu M. bovis a fost mult mai frecvent dect cea produs de M.
tuberculosis i M. avium. Studii epidemiologice asupra mecanismelor de realizare
a infeciei cu M. bovis au ajuns la concluzia c aceasta se produce exclusiv pe cale
aerogen i leziunile caracteristice, cantonate prodeminant n aparatul respirator,
au fost observate numai la caii care au coabitat n acelai adpost cu bovinele
bolnave de tuberculoz.
Psrile domestice de curte: ginile, curcile, bibilicile, porumbeii i
palmipedele dar i fazanii i punii sunt sensibile la infecia cu M. avium ns
unele psri de colivie precum papagalul i canarul se infecteaz uor cu M.
tuberculosis. n egal msur au fost semnalate cazuri de tuberculoz aviar la
numeroase specii de psri slbatice : vrabie, potrniche, prepeli, stru, coofan,
mierl, vultur, corb i n ultimul timp boala a fost diagnosticat la egret (27).
31
 S-a dovedit c o varietate larg de specii de animale slbatice care triesc
libere n mediul silvatic, n semicaptivitate n rezervaii naturale sau n captivitate
n grdini i parcuri zoologice: de la primate (31, 32 ,60, 112) i pn la
roztoare(iepuri, obolani, popndi, oareci de cmp) prezint receptivitate
considerabil la infecia cu diverse tipuri de micobacterii. Receptivitatea este totui
diferit n funcie de specia afectat de factorii de mediu i ali factori extrinseci i
intriseci (14, 19, 34) .
Tuberculoza afecteaz animalele din rezervaiile naturale sau din cresctorii
organizate, cum ar fi: bubalinele slbatice ( bivolul african), diferite specii de
antilope, impala, lama, gazela, girafa .a. (16, 18), urmate de carnasierele slabtice
libere i cele din rezervaii i parcuri zoologice, precum: leul, tigrul, pantera,
jaguarul, linxul, acalul, hiena, coiotul , lupul, vulpea, etc. de la care s-a izolat
frecvent M. bovis dar i alte specii de micobacterii patogene din Complexul M.
tuberculosis, Complexul M. avium i altele din grupa micobacteriilor atipice
(15,58,82).
n proporie mai redus, tuberculoza a fost descoperit la porcii slbatici
(mistrei i fagoceri) (36, 68, 103). Exist numeroase referine cu privire la rolul i
importana bursucilor n Marea Britanie i possumilor n Australia i Noua
Zeeland pentru epidemiologia i circuitul biologic al micobacteriilor n mediul
nconjurtor dar mai ales pentru relaiile i legturile ntre biosisteme care asigur
meninerea rezervoarelor active i continutitatea ciclului contagios i infecios al
tuberculozei (24, 88). (Fig.10)
BIOSISTEM DOMESTIC

AER

TAURINE OM TAURINE
BUBALINE BUBALINE

LACTATE
CARNE

CAPRINE
OVINE
CARNASIERE
SOL DOMESTICE SOL
PSRI

APA

CERVIDEE I ALTE CERVIDEE I

IERBIVORE CARNASIERE I ALTE IERBIVORE
SLBATICE FELINE SLBATICE SLBATICE
LIBERE iclusiv bursuci CAPTIVE

BIOSISTEM SILVATIC

Fig.10 - Interconexiunile dintre biosisteme n cadrul epidemiologiei tuberculozei la

animale, om i psri (concept original).
 32

Se poate observa c o particularitate important a epidemiologiei tuberculozei

este existena a dou biositeme principale: biosistemul domestic constituit din
mamiferele si psrile domestice receptive la infeciile tuberculoase i omul i bio-
sistemul silvatic constituit din ierbivorele i psrile slbatice dar n care
carnasierele i felinele slbatice ocup poziie central, ele fiind cele care realizeaz
multiple conexiuni att n interiorul biosistemului silvatic dar i ntre cele dou
biosisteme.
Realizarea ciclului biologic i circulaiei micobacteriilor ntre biositeme nu
poate fi posibil n absena aerului, apei i solului care reprezint element
principale ale interconexiunilor intra i extra sisteme.
Pe lng ali factori de influien asupra caracteristicilor epidemiologice ale
tuberculozei apa, aerul i solul, ca elemente comnstitutive ale biosferei, realizeaz
complexitatea conexiunilor care asigur existena rezer-voarelor de micobacte-rii
n mediu n condiii de dezechilibre majore ntre biosisteme.
Pentru a demonstra valabilitatea conceptului enunat s-a recurs la cteva
evenimente epidemiologice considerate etalon. Primul se refer la relaia ntre
reizbucnirea enzootiei de tuberculoz la bovinele din Marea Britanie i Irlanda i
nmulirea exagerat pe puni a populaiilor de bursuci (Meles meles) la care s-a
dovedit c incidena bolii era considerabil.
Cercetrile minuioase efectuate asupra populaiilor de bursuci, au
demonstrat c acetia reprezint prinicipalul rezervor natural pentru transmiterea
tuberculozei la bovine prin intermediul punilor.
Datorit sistemului de via caracteristic, n galerii subterane i n grupuri
numeroase, infectarea membrilor familiilor de bursuci pe cale aerogen se
realizeaz destul de uor i creterea numrului de purttori i eliminatori, conduce
la ntreinerea permanent a rezervei de bacili ai tuebruclozei pe puni, n sol i n
ap (72).
Un alt exemplu, se refer la populaiile de cervidee slbatice din Minesota i
Michigan la care tuberculoza a fost confirmat i al cror areal de via interfereaz
cu cel al efectivelor de bovine i cervidee domestice. Din acest motiv, n aceste state
nu s-a reuit eradicarea tuberculozei n toate fermele de bovine i de aceea s-au
elaborat programe speciale de monitorizare i control pentru tuberculoz a tuturor
populaiilor de cervidee slbatice.
b). Factori implicai n apariia i evoluia tuberculozei. Factorii de care
depinde receptivitatea fa de infecia cu bacilii tuberculozei n cadrul aceleiai
specii se grupeaz n:
- Factori intrinseci, care se refer la ras, vrst, sex i individ.
n general , rasele locale sunt mai rezistente dect cele importate, neadaptate
la noile condiii de ntreinere , exploatare i climatice.
S-a dovedit c tineretul din cadrul aceleiai rase este mult mai predispus la
mbolnvire i evoluia tuberculozei este mult mai grav dect la animalele
adulte.Dei unele lucrri de specialitate susin c nu exist legturi semnificative
ntre vrsta animalelor i prevalena bolii, totui C a r o n A. et al., 2003 (13),
constat o prevalen mai crescut n cadrul poulaiei de bivoli africani din Kruger
Park, la categoria de vrst 3 - 8 ani, dar reitereaz ideea evoluiei dramatice a
tuberculozei la tineretul bubalin cu mortalitate ridicat n special al animalele cu
stare de ntreinere proast i infecie parazitar masiv cu: Trichostrongylidae,
Trichuris, Fasciola hepatica .a.
 33

Datele statistice arat c incidena tuberculozei este mai crescut la femele

dect la masculi. Aceast particularitate epidemiologic ar putea fi explicat prin
faptul c masculii sunt de regul abatorizai, n cadrul speciei taurine, la vrsta de
cel mult 12 luni.
- Factori extrinseci, n general sunt cei implicai n favorizarea instalrii i
evoluiei infeciei tuberculoase i includ: alimentaia deficitar calitativ i cantitativ,
epuizarea fizic consecutiv ftrilor repetate , lactaia prelungit i regim de
cretere i exploatare iraional.
De asemenea, s-a dovedit c apariia i creterea progresiv a cazurilor de
tuberculoz se nregistreaz n acele ferme n care nu s-au asigurat condiii
corespunztoare de zooigien i n care se practic sistemul de cretere i exploatare
n stabulaie permanent.
Factori similari sunt incriminai n apariia i evoluia, tuberculozei umane
uneori, n forme deosebit de grave. Rapoartele Organizaiei Mondiale a Sntii
(OMS) arat c principalii factori favorizani n apariia tuberculozei la oameni
sunt: srcia i condiiile mizere de via. De aceea, extensivitatea, incidena i
prevalena tuberculozei sunt semnificativ crescute i boala continu s reprezinte o
cauz important a morbiditii i mortalitii ridicate n rndul populaiei umane
din rile srace i cele n curs de dezvoltare.
Numeroase alte studii au relevat rolul asocierii tuberculozei cu HIV unde s-
a dovedit c n toate cazurile evoluia bolii este dramatic i sfritul ntotdeauna
fatal (12, 96, 97, 111).
Totodat, alte cercetri au demonstrat c apariia de cazuri explozive de
tuberculoz cu M. bovis la copii a fost cauzat de lipsa echipamentelor pentru
pasteurizarea i prelucrarea corespunztoare a laptelui n unele ri din Africa.
c). Frecvena sezonier, a tuberculozei dup unii autori este slab exprimat;
boala poate s apar n orice anotimp. Totui, B e r c e a I., e t a l., 1981 (8), n
urma observaiilor extinse pe o perioad de mai muli ani, sunt de prere c infecia
i exprimarea clinic a bolii se produc n peroada de stabulaie, ca boal tipic de
grajd avnd n vedere c n aceast perioad , animalele sunt concentrate n
spaiu restrns i transmiterea bolii pe cale aerogen, prin intermediul aerosolilor i
microparticulelor de praf se realializeaz cu destul uurin n condiiile n care
numrul eliminatorilor de bacili pe unitatea de suprafa este substanial crescut.
C a r o n, A., e t a l ., 2003 (13) susin c n anotimpul secetos s-a
nregistrat incidena maxim a cazurilor cu tuberculoz la bivolii africani din
Kruger Park datorit faptului c n acest peroad rezervele de hran au sczut
sub-stanial i n consecin starea de ntreienere i rezistena organismului au fost
grav afectate.
Studii personale, efectuate n ferme de vaci de lapte controlate trimes-
trial pentru tuberculoz i eliminarea sistematic a tuturor animalelor supecte de
tuberculoz au artat scderea semnificativ a incidenei cazurilor n perioada de
observaie punat stabulaie, spre deosebire de fermele de vaci de lapte, cu
statut epidemiologic similar dar n care nu s-a aplicat acelai program de asanare a
bolii, numrul purttorilor i eliminatorilor a crescut substanial n perioada de
stabulaie i la pune astfel nct, la reluarea ciclului de stabulaie, proporia
cazurilor noi cu tuberculoz a cresut progresiv de la an la an. Aceast
particularitate, a fost denumit spirala evoluiei tuberculozei al crui capt se
termin ntotdeauna prin lichidarea efectivului i ncetarea activitii fermei.
 34

2.5. Surse i ci de infecie.

Sursele de infecie n tuberculoz sunt numeroase i variate. Acestea sunt

grupate astfel:
a). Surse primare, reprezentate de animalele bolnave care pot s elimine
bacilii prin diverse secreii (bronhice, fecale, urin, lapte, scurgeri genitale).
Prezena bacililor tuberculozei n fecale este explicat prin actul de deglutire
a secreiilor bronhice de ctre animalul adult bolnav ale crui leziuni sunt localizate
n sfera aparatului respirator. Asmenea mecanism a fost observat i n cazul
tuberculozei la oameni. De asemenea, bacilii prezeni n fecale pot proveni i din
leziunile ficatului, pancreasului sau chiar cele localizate n tubul digestiv. La
tineretul bovin sub vrsta de 6 luni, eliminarea bacililor tuberculoi n fecale este
urmarea consumului de lapte infectat de la vacile mame cu mamite tuberculoase.
Eliminarea bacililor tuberculozei prin urin a fost ntlnit la animalele cu
tuberculoz renal n timp ce la oameni frecvena eliminatorilor de bacili
tuberculoi n urin a fost mai mare n rndul bolnavilor cu cistit tuberculoas
(50, 95).
O surs important, cu risc ridicat de transmitere a infeciei cu bacili ai
tuberculozei de la mam la nou nscut dar i de la animalela om, este reprezentat
de lapte i produsele lactate proaspete neprelucrate sau prelucrate i
comercializate necorespunztor, provenind de la animalele cu mamite tuberculoase
subclinice.
n acest context, se remarc studiile efectuate n Anglia (22) i n unele ri
din Africa (79). De exemplu, n Ann. Rep.0n TB in South West of England, 2000, se
menioneaz c din numrul de probe de lapte nepasteurizat, provenind de la vaci
pozitive la intradermotuberculinare, 10,0 - 12,0 % au fost pozitive pentru M. bovis
prin metoda PCR, n timp ce n probele supuse unei pasteurizri necorespuntoare
s-au gsit 3,0% pozitive pentru M. bovis. Acelai studiu arat c din totalul
cazurilor cu tuberculoz la copii, cel puin 0,5% erau cauzate de M. bovis i
exprimate prin adenopatii cervicale i tuberculoza tubului digestiv i n rare cazuri
tuberculoz pulmonar. Potrivit anchetelor epidemiologice copiii proveneau din
familii cu activiti n fermele de vaci i consumaser lapte crud, smntn i alte
preparate lactate proaspete provenite de la animale cu tuberculoz (15). Mai recent,
D o m e n e c h d e l a R u a, R. 2006 (22) arat c in perioada 1990-2003 au fost
confirmate intre 17 si 50 de cazuri noi cu tuberculoz la oameni produs de
Mycobacterium bovis, reprezentnd intre 0,5 - 1,5 % din totalul cazurilor de
tuberculoz confirmat n culturi bacteriologice. Cercetri similare au fost
ntreprinse de J a l i l H. et a l., (2003) (47) care gsesc c din 73 de vaci i bivolie
pozitive la testul intradermotuberculinic (IDR), 20 erau eliminatoare de bacili M.
bovis prin lapte. In mod similar, M u m t a z N. e t a l. (2008) (77) ., stabilesc c
ntre 9 i 11 % dintre probele de lapte de bivoli, analizate prin PCR i 9,6 % din
probele de lapte provenite de la vacile suspecte de infecie tuberculoas prin testul
intradermotuberculinic unic, au fost pozitive pentru complexul Mycobacterium
tuberculosis
Cercetrile lui P o p A l., e t a l., 1964 ( citat de 21 ) , scot n eviden faptul
c infecia cu M. bovis provoac tuberculoz extra pulmonar la cel puin 9,06 %
dintre pacieni i localizare pulmonar la 6,21 % dintre cazurile cu tuberculoz.
Bazat pe aceste constatri, P o p e s c u t, 2005 (83) este de prere c n
condiiile actuale din ara noastr, unde creterea i exploatarea vacilor de lapte
este
 35

concentrat n proporie de peste 70,0 % n gospodriile individuale, n condiiile

aplicrii necorespunztoare a msurilor de profilaxie i a reglementrilor n vigoare
cu privire la aprarea sntii animalelor mpotriva tuberculozei i cnd
comercilaizarea laptelui i a produselor lactate proaspete (smntn, ca dulce,
brnz nematurat, etc) se face n procent de aproximativ 80,0 % din cantitatea
total la pia , riscul infectrii consumatorilor cu M. bovis este maxim (Fig.11. )

GOSP.INDIVIDUAL cu max. 5 FERMA ORGANIZAT (> 100

vaci Interferen pe vaci: 5% = + IDR)
(1 = + IDR) puni

80% COMER c.c.a. 10% 90 %

LA PIAT CONSUM
FAMILIAL 10 %

FABRICA
LACTATE
10 12 % RISC
MAXIM

Fig.11 - Trasabilitatea laptelui si riscul transmiterii infeciei cu M. bovis prin consum de lapte i
produse lactate proaspete. (concept original)

Transmiterea infeciei tuberculoase prin mont natural sau nsmn-

area artificial a femelelor cu sperm infectat este posibil dar n literatura de
specialitate sunt citate extrem de puine cazuri de transmitere a tuberculozei pe
aceast cale. Tot odat nu exist referine c tuberculoza s-ar transmite de la mam
la ft pe cale transuterin.

b). Sursele secundare, sunt multiple i includ: obiectele de inventar

contaminate cu bacili prezeni n cadavre, sau secreii i excreii de la animalele
bolnave. De asemnea, un rol important n transmiterea tuberculozei l au: solul,
apa, furajele aternutul, dejeciile, ustensilele i echipamnetul de lucru din ex-
ploataie. n aceeai msur vectorii animai n care sunt incluse animalele i
psrile domestice inclusiv omul dar i cele din mediul silvatic pot constitui ade-
vrate rezervoare naturale pentru micobacterii i transmiterea infeciei.
 36
Bibliografie la Capitolul II.

1. Alavi H.A., Moscovic E.A.: Immunilocalization of cell-wall-defficient forms of Mycobacterium tuberculosis complex in
Sarcoidosis and Sinushstiocytosisof lymphonodes draining carcinoma. Histology and Hostopatology, 1996;
11:683-694.
2. Alecsy M., Anuchin M. Mulyukin A.L., Suzina E.N., Duda I.V., Galina I. , El-Registau and Kaprelyants A.S.: Dormant
forms of Mycobacteirum smegmatis with disrinct morphology . Microbiol.,2009; 155: 1071-1079.
3. Anukin A.M., Mulykin A.I., Suzina N.E., Duda V.I., El- Registan I.G., Kapreiants A.S. : Dormant forms Mycobacterium
smegmatis with distinct morphology. Microbiol., 20o9; 155:1071-1079.
4. Ayele W.Y., Svastova P, Roubal P., bartos M., Pavlik I.: Mycobacterium avium subsp paratuberculosis cultured from
locally and comersialiiy pasteurised cow`s milk in the Czech Repub. Appl.. Env. Microbiol.,2005; 71: 1210-1214.
5. Barera L.: The basis of clinical Bacteriology.In: Tuberculosis 2007. Palmino,, Leao Rotacco(Eds) Bourcilier Kampus,
2007; cap.3, pp 97-101.
6. Bechman E.M., et al.: Recognision of lipid antigen by CD1 restricted T cells. Nature, 1994;372(6507):691-694.
7. Beran V., Havelkova M., Kaustova J., Dvorska L., Pavlik I.: Cell-wall defficient forms of Mycobacterium tuberculosis : a
review. Vet.Med 2006; 51(7): 365-389
8. Bercea I., Mardari A., Manzat MR, Pop M., Popoviciu A. Boli infectioase ale animalelor domestice. Ed.Did.Ped.,Buc.1981
9. Betina K, et al.: Porins in cell wall M. uberculosis . J.Bacteriol.,1999;181(2):6543-6546
10.Brennan P.J., Drapes P.: Ultrastructure of Mycobacterium tuberculosis In. Bloom BR (ed).Tuberculosis,pathogenesis,
Protection and control. Am.Soc.Microbiol., Washington DC, 1994; pp271-284.
11. Bungetzianu C., Olga Molgovan: Investigatia bacteriologic in tuberculoz si micobacterioze Ed. Acad.,RSR, Buc. 1987.
12.Burman WJ: Issue in the management HIV related tuberculosis. Clin.Chest.med,2005;26(2):283-294.
13. Caron A., Cross P.C., du Toit J.T.: Ecological infection of bovine tuberculosis in buffalo. Herds. Ecolog.Appl., 2003
13(5):1338-1345
14.Cavanagh R, Begon M., Benetti M., Ergon T., Graham M.J., de Haas WEP, hart AC, CoedamM., Kremer K, Lambin X,
Rohal P, van Soolingen D.: Mycobacterium microti infection (vole tuberculosis) in wild Rodent Population.
J.Clin.Microbiol., 2002; 40(9): 3281-3285
15.C.B.S.G.-Conservation Counsil: Lion (Pantera leo). Bovine tuberculosis Disease Risk Assessement. Workshop.Rep.,
160-20 March,2009,pp2-53 ( www. ewt. org. za)
16.Chakraborty A., Chaudury B.: Mortality in different species of captive Wild Herbivores of Assam state Zoo Assam. Ind.
Zoo. Year Book 1996: 1: 12-17
17.Chiodini R.J., van Krainingen H.J. Thayer W.R., Coutu J.A., Merkal R.S: Characteristic of an unclasified Mycobacterium
species isolated from patients with Crohn`s disease. J.Clin. Microbiol.,1984; 20: 966-971
18.Clifton Hadley RS, Wilesmith J.W.: Tuberculosis in deer: a review. Cattle Practice, 2005 ; 13: 369-379
19,Cooke MM., Jacson R, Coleman J.D.:Tuberculosis free-living brown hare (Lepus europaeus occidentalis) N.Z.J. 1993;
41(3): 144-146
20.DEFRA : Ann.Rep.on TB in South West of England, 2000
21.Didilescu C., Marica C.: Tuberculoza in Romania , Bucuresti 1997 ?
22.Domenech- de la Rua R.:Human Mycobacterium bovis infection in the United Kingdown : incidence,risk,control
measures and review of the zoonotic aspects of bovine tuberculosis ?
23.Dominguez G.J. Woody H.B. Bacterial persistence and expression of disese. Clin Microbiol.Rev.1997;10:320-344
24.Donelly C.A., Woodroffe R, Cox D.R., Bamne F.J., Cheeseman C.L., Wei G., Gettinby G. Gilks P., Jenkins H., Johnston
W.T., Le Fevre A.M., McInerney J.P., Morriso V.I.: Positive and negative effects of widespread badger culling on
cattle tuberculosis. ELSEVIER, Tuberculosis, 2006; 86: 77-109
25.Dorozhkova I.R., Zmeskova Z.S., Krudu V.N., Kochetkova E.Ia . : Endogenous reactiveof tuberculosis as a result of
reversion of persistent Mycobacterial L-forms (in Russian) .Problemy.Tuberculezai Bolezni., Legkikh ,1995; 3: 43-
46
26.Draper P., Daffe M.: The cell anvelope of Mycobacterium tuberculosis with special reference to the capsule and othe
permeabillity bariers. In: Tuberculosis and tubercle bacillus. ASM Press, Washington DC, 2005; pp.261-273.
27.Dvorska L., Matlova L., Ayele WI, Fisher OA, Amemori T, Weston RT, Alvarez J., Beran V, Morakova M, Pavlik I.: Avian
tuberculosis in captive water birds of the Ardeidae and Threskionitidae families studied by serotiping IS901 RFLP
typing and virulence for pultry. Vet.Microbiol,2007; 1992- 4: 366-374.
28.Ernst J.D.: Receptor of macrophages for Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immun 1998; 66(4): 1277-1281
29.Erwin P.C., Bemis D.A., Mawby D.I., McCombs S.B., Sheeler L.L., et al.: Mycobacteirum tuberculosis transmision from
Human to Canine. Emerg.Inf.Dis., 2004; 10(12): 2558-2559
30.Eugenia Duca, et. al : Microbiologie medical. Ed.Did.Ped.Buc. 1979; pp520-540
31.Freitas J.A., Ueki S.Y.M., Curcio M., Tury E.: dentification of Mycobacterium tuberculosis in a outbreak of tuberculosis
infection of a Cebus appela monkey`s colony. Rev. Cienci.Agr., 2004;42:165-168
32.Garcia M.A., Bonley D.M., Larson M.J., Lifland B., Moorhead R., Simikinis M.D., Borie D.C., Tolwani R., Otto G.:
Outbreak of Mycobacterium bovis in a conditioned colony of Rhesus( Macaca nulatta and Cynomologus macaca
fascicularis) macaques. Comp. Med. (Mephis), 2004; 54(5): 578-584
33.Gerasimov V.N., Biketov S.F. Golov E.A., Potapov V.D., Bakhteeva I.V. Nicolaeva O.G: Specific features of minute
structure of mycobacteria cultured in murine macrophages.(in russian). Problemi Tuberculeza i Bolezni, Legkikh,
2003; 7: 52-58
34.Gill J.W., Jacson R.: tuberculosis in the rabit: a case revisited. N.Z.J.,1993; 41(3): 147.

35.Goksu N., Ataoglu H., Kemaloglu Y.K., Ataoglu O., Ozokmen D, Akyildiz N.: Experimental otitis media iduced by
coagullase negative Staphylococcus and its L-forms. Int.J.Pediatric. otohinolaringo.,1996;37: 201-216
36.Gortazar C., Vicente J., Gavier-Widen D.: Pathology of bovine tuberculosis in the European wild boar (Sus scrofa).
Vet.Rec.,2003;152:779-780
37.Gortazar C., Torres M.J., Vicente J., Acevedo P., Reglero M., de la Fuente J., Negro J.J., Martin J-A.: Bovine
tuberculosis in Donana Bisfere Reserve: the role of wild Ungulates as Diseases Reservoir in the Last Iberian Lynx.
PL oS ONE, 2008; 3(7): e2776
38.Graham D.Y., Markesich D.C., Yoshimura H.H.: Mycobacteria and inflamatory bowel disease. Gastroenterol.,1987 92:
436-442

37
39.Greevstein R.J.: Is Crohn`s disease caused by a Mycobacterium? Comparison with leprosy, uberculosis and Johnes
disease. Lancet,2003; 3: 507-514
40.Gurenko E.G., Noreiko S.B., Prilutskaia N.V., Chistilina L.V., Oleferovskaia R.P., Lepshina S.M., Kaniula S.B.,
Matvienko E.V., Makarova R.I., Taushan M.D., Serdechnyi V.I., Goroshko M.E., Soshenko I.I.: Bacteriological
aspects of diagnosis of tuberculosis associated with pneumoconiosis (in Russain). Gigiena Truda i Prof.
Zabolev.,1990; 8:46-48
41.Hiens M.E., Styer E.L. Preliminary characteriztion of chemically generated Mycobacterium avium supsp
paratuberculosis cell wall defficient forms (spheroplasts). Vet.Microbiol;2003; 95: 247-258
42.Huber T.W.: Growth of cell wall defficient variants of Enterobacter cloacae facilitates beta-lactamase depressed
mutants. Int. J.Antimicrob.Agents,2002; 19:397-404
43.Hulton K, El-Zimaity H.M.T., Kartumen T.J. Almashrawi A., Schwartz M.R., Graham DY., El-Zaatari F.A.K. : Detection
of Mycobacteirum avium subsp. Paratubercu-losis in Crohn`s diseased tissues by in situ hybridization. Am.J.
Gastroenterol., 2001; 96: 1529-1535
44.Iconomopoulos J, Aranaza A., Balaskas C., SechiI., Gazouli M.: Outbreak of acute tuberculosis in a goat herd ; first
report of Mycobacterium caprae izolation in Grecee. J. Vet.Res., 2006;10(2): 108-115
45.Ionic C., Ciortea Gr., Miclea E.I.: Tuberculoza animalelor domestice Ed,Ceres, Buc. 1974.
46.Isachkova L.M., Zhavoronkova AA, Shubin FN,.: Yersinia L-transformation in experimental pseudotuberculosis. Zh.,
Microbiol.Epidemiol.Immunobiol., 1993;1: 11-16
47.Jalil H, Das P., Suieman A: Bovine tuberculosis in dairy animals at Lahore, threat to the public health. Metrop.Corp.
Lahore Pakistan. http//www.priory.com/vet/bovinetb.htm
48.Julie S. Philalay, Chrisitine O. Palermo, Kristensen A.Hauge, Ruislad TR, Cangelassi GA: gene required for intrisic
multidrug resictance in Mycobacterium avium- Antimicrob.Agents and Chemotherapy,2004,49(9): 3412-3418.
49.Juni-chiro Sekiguchi, et al.: Detection Multidrug resistance in Mycoibacterium tuberculosis . J.
Clin.Microbiol,2007,45(1): 179-192.
50.Kafwabulula M., Ahmed K., Nagatake T, Gotoh J, Mitarai S., Oziumi K, Zumula A.: Evaluation of PCR based method
for diagnostic of tuberculosis by mycobacterial DNA in urine samples. Int.J. Tuberc. Lung.Dis.,2002;6(8): 732-737
51,Kapralek F.: Principles of Bacteriology(In Czech). Publ.Prague,2000; p.242
52,King D.: Bovine tuberculosis in cattle and badgers. Report, 2007, July 30.
53.Komenko A.K., Muratov V.V.,: Epidemiological risk of tuberculosis infections foci in patients dischariging L-forms of
Mycobacterium tuberculosis (in Russian). Problemi.Tuberc. i Bolezni Legkikh, 1993; 2: 2-5.
54.Kremer L., Besra G.A.: A waxy tole, by Mycobacterium tuberculosis .In: Tuberculosis and tubercle bacillus . ASM Press,
Washington DC ,2005; pp 287-305
55.Krick D.C., Mahpatra S, Brennan P.J.: Biosynthesis of the arabinogalactan-peptidoglican complex of Mycobacterium
tuberculosis. Glycobiology,2001;11(9): 107R-118R
56.Lacase C., Terio K., KinselM.J., Farina I.L. Travis DA Greemwald R., Lyashchenko K.P., Miller M., Gamble K.C.: Two
case of atypical mycobacterioses caused by Mycobac-terium szulgai associated with mortality in captive African
Elephants (Laxodonta africana). J.Zoo,Wild.Med., 2007; 38: 101-107
57.Lai J-F., Zindl C.L., Dulfy L.R., Atkinson T.P., Jung Y.W., van Rooijen N., Waites K.B., Lantos A., Niemann S., Mezosi L.,
Sos E., Erdely K., David S., Parsons M.L., kubica T., Gerdes-Rush S., Somoskovi A.: Pulmonary Tuberculosis due to
Mycobacterium bovis in captive Siberian Tiger. Emerg.Infect.Dis. 2003; 9 (11); 1462-1464
58.Lantos A., Nieman S, Mezsi , Sos E, Erdely K, David S, Parsons MI, Kubika T, Gerdes-Rush S., Somoskovi A:
Pulmonary Tuberculosis due to Mycobacterium bovis in a captive Siberian Tiger. Emerg.Infect. Dis., 2003; 9(11):
1462-1464
59.Lavender C., Globan M., Savers A, Jacobs-Billau H., Fyfe A: Anti-Microb Aagents and Chemotherapie, 2005,49(10):
4068-4070.
60.Lerche N.S.V., Jo Ann L.Y., Saverio V.O., Jo Anne L, Flynn . : New approaches to Tuberculosis surveillance in non
human primates. L.L.A.R. J.,2008 42(2): 170-178
61.Li G.L.: Induction of the L-forms of M.tuberculosis in vivo guineea pigs. Zhongua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 1990; 13:
351-354
62.Litvinov V.I., Mikailova I.V., Kapina M.A.,Boenski A.V., Demianenko N.V.: Dinamics in bacterial izolation and
antigenemia in patients with infiltrative pulmonary tuberculosis (in Russian) Problemy.Tuberc. i Bolezni Legkikh,
1994; 4: 23-25
63.Lyashchenko K.P., GreewLD d.r., Esfandiari J., Olsen J.H., Ball B.R., Dumonceaux G., Dunker F., Buckley C., Richard
M., Murray S., et al.: tuberculosis in Elephants: antibody responses to defined antigen Mycobacterium tuberculosis
paternal for early diagnosis, and monitoring treatment. Clin.vacc.Immunol.,2006;13(7):722-732.
64.Magne-Ortalo A., et al., Identification of the surface expand lipids on the cell-envelopes of M. Tuberculosis and orhe
my cobacterial species. J. Bacteriol.,1996; 178(2): 456-461
65.Mahpatra S., Basu J., Brennan PJ, Crick D.: Structure, biosynthesis and genetics of the mycolic acid-Arabinogalactan-
Peptidoglican complex. In: Tuberculosis and tubercle bacillus . ASM. Press Washington DC,2005; pp275-285
66.Malik R., Huges M.S., Martin P., Wignei D.: feline leprosu syndromes. In: Infectious Disease of the Dog and Cats, 3-rd
ed., Greene C.E. (ed)W.B. Saunders Co., Philadelphia P.A., 2006;pp.477-480.
67.Marcova N., Michailova L., Vesselinova A., Kussovski V., Radoncheva T., Nikolova S., Paskaleva I.: cell Wall defficient
forms (L-forms) of Listeria monocytogenes in experimentally infected rats. Zentralbat fur Bacteriologie.
Int.J.,Med. Microbiol.viral, parasitolog.Inf.Dis. 199; 286:44-45.
68.Martin-Hernando M.P.,Hfle U., Vicente J., Ruiz- D., et al. : Lesions associated with Mycobacterium complex infection
in the European wild boar. Tuberculosis, 2007; pp.360-367.
69. Mattam L.H.: Cell wall Defficient Forms . Stealth Pathogens,3rd ed. CRC.Press, Boca Raton 2001;p416.
70. Mc Murray D.N.: Mycobacteria and Nocardia. In: Barab S, et al., (eds). Baran`s Medical Microbiology (4-th ed.)
Univ.Texas Med.Branch,1996.
71. Meck C., Levi J.K., Crowford P.C., et al. : Chronic disseminated Mycobacterium xenopi inact with idiopathic CD4+T-
lymphopenia.J.V.I.M,2008.
72. Michel L.A., de Klerk L.M., van Pittus N.C.G., Waren R.M.., van Helden P.D.: Bovine tuberculosis in African
buffaloes:observation regarding in to watter and exposure to enviromental mycobacterium in BMC Vet.Res., 2007;
3:1-7
73.Mihailova L., Kussovski V., Radoucheva I., Iordanova M, Berger W, Rinder H. Marcva N.: Morphological variability and
cell-wall defficiency in Mycobacterium tuberculosis heterorestant strains. Int.J.Tuberc.Lung.Dis.,2005;9: 907-914
74,Mikota S.K., : Tuberculosis in elephants. In: Fowler ME, Miller RE(Eds). Zoo and Wild Animal Medicine, current
therapy, 6-th edition.Saunders?Elsevier, St, Louis,2008; pp.355-364
38
75.Monies B., Johans K, de la Rue R,: Bovine tuberculosis in cats. Vet.Rec.,2006;158:245-256.
76.Moore G.D., Dean R., Shaw S.: Mycobacterial infections in cats and dogs. J.Brit, Vet. Ass., 2010; 32(44): 444-452
77.Mumtaz N. Chandhru Z.I., Mahmood N., Shakoori AR: reability detection of bovine tuberculosis in Pakistan. Pak, J.Zool.,
2008;40(5):347-351
78.Murty M.V.V.S., Subramanian V.T.A.: Evidence for synthesis of petidoglican by spheroplasts of Mycobacterium
smegmatis-ATTC14468. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 1984;134B:359-365
79.Ofukwu RA., Goeglubm SI, Akwouhu CA: Zoonotic Mycobacterium species in fresh cow milk and fresh skimmed,
unpasteurised milk (nono) in Makurdi, Nigeria: implication for public health. J.Anim.Plant. Sci.,2008; 1(1): 21-25
80.Pavlik I., Ayele Y.W., Parmova I., Melicharek I., Hanzeikova M, Kormendy B., Nagy G., Cventic Z., Fejic N., Lipiec M.:
incidence of bovine tuberculosis in cattle in seven Central European Countries durin the years 1990-1993. Vet.
Med.Chech.,2002; 47(2-3): 45-51.
81.Pavlik I., Ayele WY, Parmova I., Hanzlikova M. Svejnochva M, Komerdy B.: Mycobacterium tuberculosis in animal and
human population in six Centreal european countries in durin 1990-1993. vet.Med., 2003; 48 : 83-89
82.Perez J, Galzada J., Vicario-L.L., Cubero M.J., Velarde J., Mozos E.: tuberculosis in an Iberian lynx (Lynx pardina). Vet.
Rec.,2001;148: 414-415.
83.Popescu St.: Balanika Microbiol Symp.Bucharest, 2005
84.Prescott L.M., Harley J,P, Klein D.A..: Microbilogy. Third Ed. Wm. cBrown Dubuque IA. pp. 4072
85.Rastogi N. Hellio R.: Evidence that the capsule around mycobacteria grown in axenic media contains mycobacterial
antigens: Implication at teh level of cell anvelope architecture. FEMS Microbiol.Lett.1990;70: : 166-166.
86.Rastogi N.: Structure and functions of the cell envelope in relation to mycobacterial virulence, pathogenity and multiple
drug resistance. Res Microbiol.1991; 142:419-481
87.Ratnam S., Chandra Sekhar S. The pathogenity of Spheroplast of Mycobacterium tuberculosis. Am. Resp. Dis. 1976; 114:
549-554
88.Robert M.G.: The dynamics and control of bovine tuberculosis in possum. Math. Med.Biol.,1992;9(1): 19-28
89.Ryll R., et al. Immunological properties of trehalose dimycolat (cord factor) and other mycolic acid containing
glycolipids:a review. Microbiol immunol. 54(12):801-811
90.Sandu I.: Investigaii privind optimizarea diagnosticului inclusiv prin procedee biotehnologice n micobacterioze la
animale. Teza de doctorat. ASA-FMV, Buc.2000.
91.Schwartz D., Shafran I., Romero C., Piromalli C., Biggerstaff J., naser N., Chamberlin W., Naser S.A.: Use of short-term
culture for identification of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosisin tissue from crohn`s disease patients.
Clin. Microbiol. Inf.Dis.,2000; 6: 303-307.
92.Sechia A., Mura M., Tanda F., lissia A., Salinas A., Fadda G., Zanetti S.: Identification of Mycobacterium avium subsp.
Paratuberculosis in biopsy specimens from patients with Crohn`s disease identified by in situ hybridation. J. Clin.
Microbiol., 2001;39: 4514-4517.
93.Sinitinskaia O.S., Sibirnaia R.I., Beliakova O.I.: The significance of L-forms mycobacteria development of pulmonari
tuberculosis (in Russian). Vrachebnoe Delo., 1990; 3:38-40.
94.Soroush S -T., Joachim S., Gudrun H., Bernd A., Michael N., Levin A: Porins limit the intracellulare persistance of
Mycobacterium smegmatis. Microbiol.,2005; 151: 2403-2410
95.Torrea G., van Perre Ph., Ouedrago M., Zougba A, Sawadogo A., Dingtoumda B., Diallo B, deffer MC, Sombite I, Zanetti S,
Sechi AL.: PCR-based of Mycobacterium tuberculosis complex in urine in HIV-infected and noninfected patients in
Burkina Faso J.Med.Microbiol., 2005; 1: 39-44
96.Stenbrook R: Tuberculosis and HIV in India. N,Engl.J.Med.,2007;356:1198-1190.
97.Swaminathan S., Narendran G: HIV and tuberculosis in India, J,Biosci.,2008;33:527-537.
98.Udou T., Ogawa M., Mizuguchi Y.: Spheroplast formation Mycobacterium smeg-matis and morphopathological species of
their revision to bacillary form. J. Bacteriol., 1982; 151(2): 1035-1039
99.Udou T, Ogawa M., Mizuguchi Y.: An improved method for the preparation of Mycobacterial spheroplast and the
mechanism involved in the reversion to bacillary form: Electron microscopic and physiological study. Can. J.
Microbiol,1983;29:60-68.
110.Urlich T., Kaufmann S.H.E.: Mycobacterial persistence and immunity. Frontiers in Bioscience, 2002;7: 458-469.
101.van Soolingen D., Hoogenboezem T., de Haas P.E.,, et al.: A novel pathogenetic taxon of the Mycobacterium complex
canetti : charaterization of exceptional isolate from Africa. Int.Syst.Bacteriol., 1997;47:1236-1245
102.van Cruningen H.J., Ruiz B., Grumprecht L.,: Experimental disease in young chickens induced by Mycobacterium
paratuberculosis from patients with Crohn`s disease. Can.J.Vet.Res.1991;55:199-202.
103.Vicente J., Hfle U., Garrida J.M., fernandez-de-Mea I.G., Juste R., et al.: Wild boar and reed deer display high
prevalence of tuberculosis-like lesions in Spain. Vet.Res.2006;37:107-119
104.Volintir V.: Bolile infectioase ale animalelor domestice Ed.Did,Ped.Buc.1975; pp189-212
105.Zamfiroiu I., Rob I, Maritoiu T, Imosanu P. : Depistare si diagnostic in tuberculoza porcinelor . Al VI-lea Congres
Nat.Med. vet., 1994; p.67
106.Zhang I.: Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Frontiers Bioscience, 2004; 1: 1136-1153

107.Zhang I., Yen W.W.: Mechanism of drug resistence in Mycobacterium tuberculosis. Int.J. Tuberc. Lung Dis.,2009
13(11):1320-1330.

108.Zhu M., Xia P, Zhang I.: detecting Mycobacteria and their L-forms in peripheral blood from pulmonary tuberculosis
patients by cultivation with hemolysed centrifugated blood in liquid medium. (in Chinese) Zhonghua. Jie.
He.He.Hu.Xi Za Zhi, 200023:556-558.
109.Wang K.X., Li C.P., Cui Y.B., Yang Q.G.: L- forms of H. pilori. Gastroenterol., 2003 9: 525-529.
110.Wayne L.G.: Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease . Eur. J. Clin.Micobriol.Infect Dis., 1994
13: 908-914 .
111.Williams BG, Granich R, Chauhan LS, Darmashaktu NS, Dye C: The impact of HIVAIDS on the control of tuberculosis in India.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2005102:9161-9624
112.Willis J., Weeb J., Bruce E., Le Roy F., Quinn D.: An overview of tuberculosis in Macaques. Vet.
Clin.Path.Clerkship.Progr.2007. www.vet.uga.edu/VPP/clerk/....index php.
39
114. Yuang Shuang Liaw, et al : Characterization of a 411 bp fragment of the rpoB gene in clinical izolates of Mycobacterium
tuberculosis in a University hospital in northen Taiwan. J.Formos Med. Assoc,2005,104(11): 792-797.

40
 CAPITOLUL III

MECANISME IMUNOLOGICE I IMUNOPATOGENETICE N

INFECIA TUBERCULOAS.

n termeni generali, imunitatea reprezint starea specific organis-mului

fa de una sau mai multe substane strine organismului (non-self) cu proprieti
antigenice , n particular celula ntreag, fraciuni sau chiar molecule din aceasta,
care se caracterizeaz prin dezvoltarea unui rspuns imun la ptrunderea acestora
n organism. Ca i n celelalte infecii bacteriene, micotice, parazitare, virale i n
micobacterioze au fost descrise mai multe tipuri de imunitate precum: imunitatea
natural, tolerana imunologic, imunitatea dobndit (natural sau artificial),
imunitatea de protecie , hipersensibilitatea .a.
Pentru ca s se realizeze starea de rezisten a organismului fa de diveri
ageni animai i neanimai externi trebuie s fie ndeplinite cteva condiii esen-
iale:
- sistemul de aprare celular trebuie s fie imunocompetent (SICC):
- sistemul de aprare trebuie s fie reglat genetic;
- substana recunoscut de organismul gazd ca non-self s posede
caracteris-tici imunogene.
n baza acestor considerente i n funcie de caracteristicile mecanismelor
imune precum i de tipul de efector imunolofgic n cadrul infecciilor micobac-
teriene au fost descrise dou grupe de procese imunologice:
- immunitate mediat celular i
- imunitate mediat prin anticorpi .
ntre cele dou grupe de procese imunologice exist relaii de cooperare
direct intercelulare (limfocite T- cooperante i limfocite B pentru producie de
anticorpi) i indirecte prin intertermediul mediatorilor chimici sau substanelor
hormonale .

3.1. Rspunsul imun mediat celular (RIMC) .

Rspunsul imun mediat celular (RIMC) reprezint unul din mecanismele

imune efectorii de important major, fiind implicat n eliminarea celulelor infec-
tate cu ageni patogeni, precum: bacterii cu habitat intracelular (Mycobacterium
spp., Legionella, Brucella spp, Listeria, Chlamydia), parazii (Haemosporidiae,
Babesia, Coccidia, Toxoplasma .a) i majoritatea virusurilo.
n general, rspunsulimun mediat celular se bazeaz pe participarea a trei
categorii de celule : limfocitele Tc, celulele NK i celulele K ale cror diferene
funcionale sunt eseniale. De exemplu, recunoaterea antigenului de ctre
limfocitele T depinde de complexul major de histocompatoibilitate (MHC) n timp
ce celulele NK i K au capacitatea de a recunoate antigenul fr prezena MHC (13).
Dup natura receptorului implicat n recunoaterea antigenului pe suprafaa
celulei int s-au stabilit dou grupe de celule:
- limfocitele Tc citotoxice specifice pentru complexul major de histocompa-
tibilitate (MHC - specifice);
- celule citotoxice nespecifice (MHC-nespecifice).
Limfocitele Tc reprezint principala clas implicat n rspunsul imun
mediat datorit funciilor complexe realizate prin intermediul multitudinii
receptorilor de membran specializai, cum ar fi: receptorii pentru recunoaterea

41
antigenului reprezentai de complexul TCR-CD3 i CD8 i parial de TCR-CD1 i
TCR-CD2;
- receptorii pentru activarea limfocitelor Tc, reprezentai prin: TCR-CD 2, TCR-
CD28 i TCR-CD45:
- receptorii de aderen intracelular, reprezentai de TCR-CD 2 care, mpre-
un cu antigenul asociat funciei limfocitare (LFA-3) reallizeaz un cuplu pe baz
de complementaritate.
Studiile de fenotipaj cu ajutorul anticorpilor monoclonali (Moab) anti CD 8 i
respectiv anti CD4, au demostrat c limfocitele Tc-CD 8+, implicate n rspunsul
imun celular, se gsesc n proporie de 90,0 %, avnd ca funcie principal
citotoxicitatea extracelular, n timp ce limfocitele Tc- CD 4 + sunt n proporie de
10,0 %.
D o h e r t y M,L., e t a l., 1995, (69) pe baza studiilor imunocitochimice
privind efectul tratamentului cu dexametazon asupra rspunsului imun celular la
vaci, constat c la animalele infectate natural cu Mycobacterium bovis i tratate
cu dexametazon, activarea limfocitelor Tc-BoCD4+ a fost inhibat i recrutarea
acestora la locul de inoculare a tuberculinei nu s-a mai produs. Pe de alt parte,
autorii au obnservat c reducerea drastic a procentului de limfocite Tc- BoCD 4+ ,
responsabile de producerea reaciei tuberculinice, s-a corelat cu reducerea
semnificativ a produciei de gamma-interferon (IFN) in vitro.
TCCD8+
(a) Pf-Gz (f)

MHC-I TCCD8+

Celula (a)
int
TCCD8

(f)
MC
TCCD4 (e) IL2

` (b)
(c)
(e)
IFN

MHC-II Th
MF

CPA (d)

TC-CD4+

Fig.12 - Schema de cooperare celular n cadrul RIMC ( dup, Br, C. , 1996).

Sintetiznd rezultatele cercetrilor fundamentale B r C., 1996, (13)

susine ideea c pentru realizarea unui rspuns imun mediat-celular (RIMC)
eficient este necesar o cooperare celular cu participarea celuleor prezentatoare de
antigen (APC), reprezentate n special de macrofage (Mf) i mastocite, celulele Th 1,
Tc-CD4+ i Tc-CD8+ (Fig.12).
Dup cum se poate observa, mecanismul cooperrii celulare se realizeaz n
ase etape :
42
a).Prezentarea antigenelor pe suprafaa celulelor int i selecia clonal a
limfocitelor Tc-CD8+ ;
 b).Preluarea antigenelor de ctre macrofage (M) cace au funcie de celule
prezentatoare de antigen (APC);
c).Prezentarea antigenelor la limfocitele Th-CD4+ i Th-CD8+;
d).Cooperarea ntre Th-CD4+ i Th CD8+ i stimularea Tc-CD4+;
e).Eliberarea de ctre Th-CD4+ a interleukinei-2 (IL-2) care activeaz
limfocitele Tc-CD8+ i sinteza gamma-interferonului (IFN) i modific funcia
macrofagului (M);
f).Eliberarea de mediatori citotoxici (MC) de ctre macrofage dar n special
de ctre limfocitele Tc-CD8+ sub form de porfirine (Pf) i granzime (Gz) care
conduc n final la citoliza celulei int.
Aadar, mecanismul de aprare mpotriva infeciei cu bacilii tuberculozei se
bazeaz pe cteva componente importante care au rol crucial n echilibrul balanei
imunologice.

3.1.1. Componenta antigenic.

Este reprezentat de celula bacterian ntreag , fragmente din peretele

celular, produse de secreie, etc. eliberate n mediul de cultur n timpul dezvotrii
bacteriei, capabile s iniieze i s dezvolte un rspuns imun din partea
organismului gazd .
Numeroase studii i cercetri au demonstart, fr echivoc, mai nti
complexitatea antigenic a micobacteriilor i apoi, prin metode genetice i de
biologie molecular , s-a clarificat existena unei similitudini i multiple
interconexiuni antigenice la majoritatea speciilor de micobacterii. De exemplu, sunt
bine cunoscute nrudirile antigenice foarte strnse ntre complexul M.tuberculosis
i complexul M. avium (80), dar importante legturi antigenice au fost constatate i
intre reprezentanii complexului M. tuberculosis i M. avium i majoritatea
micobacteriilor atipice i micobacterii nepatogene din mediul nconjurtor. Aceste
caracteristici antigenice nu sunt att de importante pentru iniierea rspunsului
imun din partea organismului gazd dar prejudiciaz serios valoarea de diagnostic
al unor teste clasice aa cum sunt: intradermotuberculinarea (IDR), ELISA pentru
masurarea anticorpilor anti bacilul tuberculozei i alte mijloace de masurare a
raspunsului imun mediat celular (RIMC) specific infeciei tuberculoase. De aceea,
s-au fcut ncercri de utilizare a extractelor purificate , cum ar fi ESAT-6, CFP10 i
numeroase alte fraciuni proteice cu greuti moleculare cuprinse ntre 12 85
kDa
F i f i s , T. et al, 1994 (80 ) au constatat c proteinele purificate (12; 19; 22a,b;
24; 25;30; 32; 39; 65 i 70 kDa) incluse n majoritatea antigenelor Mycobacterium
bovis au un grad ridicat de nrudire cu Mycobacterium tuberculosis i aceste
antigene par a fi imunodominante dar profilul lor imunodominant se modific n
cursul evoluiei oprogresive a bolii.
Pe de alt parte, S a m a n i c h, K. M., e t a l ., 2000 (253), utiliznd 3
antigene proteice 88 kDa, 85c i MPT 32, extrase din filtratul culturii de
Mycobacterium tuberculosis au ajuns la concluzia c aceste antigene au dovedit
sensitivitate ridicat pentru detecia anticorpilor serici la pacienii cu tuberculoz.
Antigenul 38kDa a dovedit o specificitate foarte ridicat (> 98 %) dar la bolnavii
infectai cu HIV acesta a fost slab recunoscut de anticorpii serici.
Alte studii susin complexitatea antigenelor micobacteriene din puctul de
vedere al potenialului lor n serodiagnosticul tuberculozei.

43
De exemplu, W e l d i n g, K., et al., 2005 (304),au identificat prin selecie n
dou etape 4 seroantigene noi (TB9,7, TB15,3, TB16,3 i Tb51) care au fost testate
cu seruri provenind de la pacieni din zone cu tuberculoz endemic i din zone
unde boala evolua sporadic. Autorii studiului, au stabilit c antigenul cu cel mai
ridicat potenial pentru diagnosticul tuberculozei a fost TB16,3 care a avut o
sensitivitate de 48 - 55% la pacienii rezideni n Danemarca i de 88 98% la
pacieni din Africa. De asemenea, antigenele TB16,3 i TB 9,7 au fost recunoscute n
proporie de 85% de serurile pacienilor suferind de tuberculoz i infecie cu
virusul HIV. Cercetri recente au artat c secreia antigenelor ESAT-6 i CFP10
este controlat de genele Rv3871 i Rv3979c situate n regiunea RD 1 a
genomului majoritii tulpinilor virulente de Mycobacterium bovis i Myco-
bacterium tuberculosis dar nu se gsesc n genomul M. bovis-BCG, unele tulpini ale
M. avium i n genomul tuturor micobacteriilor nepatogene din mediul
nconjurtor, sugernd c cele dou gene sunt implicate nemijlocit n patogeneza
tuberculozei (244) .
De asemenea, s-a dovedit c proteinele ESAT-6 i CFP10 sunt antigene cu
potenial ridicat pentru celulele T, recunoscute la aproximativ 70 % dintre pacienii
cu tuberculoz fapt ce a condus la utilizarea lor ca reageni pentru diagnostic att la
oameni ct i la animale . Astfel, W a t e r s , W.R., e t a l., 2005 (301) au
demonstrat c proteinele ESAT-6 i CFP10 ca i MPB59, MPB70 i MPB83 au fost
recunoscute de anticorpii din serurile renilor infectai cu M. bovis dar nivelurile
anticoropilor specifici au variat n funcie de stadiul evolutiv al bolii .
Din punct de vedere strucutral, analizele sptroscopice speciale au artat c
ESAT-6 are o conformaie helicoidal n jur de 70% la temperaturi de 20 oC. care se
reduce la aproximativ 56% la 25oC i sub 30% la temperatura de 40oC. La polul opus
se situeaz proteina CFP10 care, n general este nestructurat i numai ntmplator
apar polipetide cu structur helicoidal n condiii similare cu proteinele CFP10
sintetizate natural in vivo.Un alt factor important care intervine n variaia
rspunsurilor imune fa de infecia tuberculoas l reprezint virulena
micobacteriilor.
V a n P i t t i u s N. C.. G e t a l , 2006 (294) sunt de prere c nelegerea
acestor factori de virulen ar conduce la elaborarea a noi strategii pentru controlul
tuberculozei la bovine incluznd descoperirea de vaccinuri noi cu eficien
corespunztoare n activitatea de eradicare a bolii. Autorii studiului arat c
secvenierea genomului M. bovis a relevat faptul c ADN extras din M. bovis este
similar n proporie de 70% cu cel al M. tuberculosis i dispunerea genelor n lanul
ADN este identic la ambele specii, diferene nesemnificative apar la un numr mai
mic de 100 de gene.
Diferenele care apar ntre mutantele celor dou specii de micobacterii sunt
mai de grab legate de prezena sau absena genelor virulente n ADN-ul
micobacterian, de potenialul virulent al acestora dar i de particularitile de
rspuns, diferite de la o gazd la alta. Din multitudinea antigenelor descrise n
literatura de specialitate, Derivatele Proteice Purificate (PPD) au cea mai larg
utilitate ca reageni pentru diagnosticul n teren al tuberculozei. Aceste antigene vor
fi descrise n detaliu la seciunea Hipersensibilitatea de tip ntrziat
Intradermoreacia (IDR).

3.1.2. Componenta celular.

Componenta celular, reprezentat de celulele albe sau leucocite, este partea

cea mai important i indispensabil a sistemului imun care apr organismul
44
gazd att mpotriva agenilor patogeni dar i mpotriva altor produse strine
intolerabile pentru gazd. Cele mai multe tipuri de leucocite exist i sunt produse
de celulele multipotente din mduva osoas, denumite celule stem, hemopoetice.
Termenul leucocite are origine n limba greac: leucos= alb i kitos = celul .
Acestea se gsesc n tot organismul, inclusiv n snge i sitemul limfatic. Numrul
de leucocite din snge indic starea de sntate sau de boal i n condiii normale
acesta difer de la o specie la alta. De exemplu, la om exist ntre 4x10 9 i 11x 109
celule albe ntr-un litru de snge reprezentnd aproximativ 1,0 % din sngele unui
adult n timp ce la cal, vac, oaie, capr i porc valorile formulei leucocitare sunt
uor diferite, cu variaii ale limfocitelor n medie de la 34,0 % la cal la 57,0 % la vac
i 54,0 % la oaie i capr.
Proprietile fizice ale leucocitelor, cum ar fi: volumul, conductivitatea i
granulaia se pot schimba ca urmare a activitii celulelor. De aceea, n diferite
situaii patologice,cum este leucemia, se constat prezena leucocitelor imature sau
leucocite maligne.
Uneori plasma sanguin are o nuan verde datorit numrului execesiv de
neutrofile n snge care produc hemoenzima mieloperoxidaza n cantiti
semnificative. Leucocitele au fost divizate n dou grupe, n funcie de prezena
granulaiilor intracitoplasmatice n: granulocite i agranulocite.
Granulocitele sau leucocitele polimorfonucelare , se caracterizeaz prin
prezena de granule intracitoplasmatice divers colorate, care pot fi vizualizate la
microscopul optic. Aceste granule sunt enzime legate de membrana celular care
ajut la digestia i endocitoza particulelor microbiene. S-au descris trei tipuri de
granulocite: neutrofile, bazofile i eozinofile.
Agranulocitele (leucocitele mononucleare), se caracterizeaz prin absena
aparent a granulaiilor intracitoplasmatice, dei adesea pot fi observate granulaii
azurofilice care constituie lisosomii. n acest grup au fost incluse: limfocitele,
monocitele i macrofagele.

3.1.2.1. Neutrofilele.

Au fost mprite n: neutrofile cu funcii de aprare mpotriva infeciilor

bacteriene sau fungice i neutrofile foarte mici care inervin n procese inflamatorii,
fiind primele care rspund la infecia microbian. Activitatea lor deosebit de
intens i moartea lor n numr semnificativ determin formarea de puroi la locul
infeciei. Ele sunt cunoscute n literatura de specialitate sub denumirea de
leucocite polimorfonucleare-microfage i se implic activ n fagocitoz (266).
Dei U r b a n C . F . e t a l , 2006 (288) au demonstrat c neutrofilele sunt
implicate n mecanismele bactericide dependente de oxigen totui rolul lor n
infeciile micobacteriene rmne controversat.
P e d r o s a J., e t a l., 2000 (231) i F u l t o n S.A. e t a l. , 2002 (93 ) au
detectat neutrofilele la locul infeciei n faz incipient susinnd c acestea se
menin pe tot parcursul evoluiei procesului patologic.
n ciuda prerilor controversate, n prezent este unanim recunoscut faptul c
neutrofilele au capacitatea de a distruge bacilii tuberculozei i n acelai timp
contribuie la controlul infeciei prin producia de chemokine (245), inducerea
formrii granulomului i transferul propriilor molecule micobactericide la
macrofage (273 ) . Faptul c neutrofilele intervin mai mult n procesul patologic dect
n aprarea gazdei mpotriva invaziei microbilor s-ar datora expresiei difereniate a
moleculelor chemotactante, pe suprafaa celulelor (145).

45
 3.1.2.2. Celulele mastocite (eozinofilele i bazofilele).

Eozinofilele, ca celule predominant inflamatorii, sunt legate n special de

infeciile parazitare dar prezena lor a fost dovedit n cazul acceselor astmatice,
febrei de fn i alergiei de stupin n timp ce bazofililele sunt recunoscute
ntradevr cu rol crucial n rspunsul alergic prin eliberare de histamine care
cauzeaz inflamaia.(97, 307)
Nucleul lor este bilobat sau trilobat i citoplasma ncrcat cu granulaii mari
albastre.
M e t c a l f e D.D., e t a l.. 1997 (194) i G a l l i S J , 1999 (97) au
demonstrat c celulele mastocite au rol important n dezvoltarea rspunsului imun
al celulelor T-helper2 (Th2) i aceste celule au fost gsite n mucoasa respiratorie,
gastrointestinal i urinar i deasemenea n endoteliul vaselor de snge i
limfatice.
Cercetri recente, folosind tehnologii genetice i biologie molecular au
descoperit prezena pe suprafaa mastocitelor a unor rceptori cu afinitate nalt
pentru IgE ( FcRI). Prin cuplarea antigenului la situsurile active (FcRI legat cu
IgE), mastocitele eliberaz numeroase molecule grupate n : mediatori performani
i mediatori sintetizai de novo (287, 189).
Mediatorii performani, care se gsesc n granulele celulelor mastocite, includ:
histamine, triptaze, chinaze, carboxipeptidaze i heparin n timp ce mediatorii
sintetizai de novo sunt reprezentai de leucotriena C4, Prostaglandina D2,
factorul de activare al plachetelor (PAF), factorul de necroz tumoral (TNF-),
factorul de transformare a creterii (TGF-), factorul de cretere fibroblastic-2
(FGF-2), facorul de cretere endotelial vascular (VEGF), interleukina-4 (IL-4) i
interleukina-5 (IL-5).
Experimentele pe oareci au demonstrat c antigenele microbiene stimuleaz
mastocitele prin intermediul receporilor TRL2 i TLR4 (tool-like receptor ) (272, 252,
192).
n mod obinuit mastocitele se gsesc la poarta de intrare a microbilor i
exist suficiente date care atest c aceste celulele sunt exceleni mediatori ai
rspunsului inflamator (189)(194), cel puin n infeciile produse de Klebsiella
pneumoniae i Escherichia coli..

3.1.2.3. Macrofagele.

Macrofagele joac rolul esenial n eliminarea particulelor strine care

ptrund n organism, n special pe cale aerogen. Mult timp, macrofagele au
fost considerate , alturi de neutrofile, populaia primar de celule care
interacioneaz cu agenii patogeni. Rolul lor primordial a fost demonstrat n
infeciile naturale i experimentale cu micobacterii folosind modele murine i
umane (188, 158) .
S-a dovedit c originea macrofagelor este circuitul sanguin. Aici se gsesc
monocitele care, prsind fluxul sanguin, se localizeaz n diverse esuturi invadate
de bacilii tuberculozei, n special n alveolele pulmonare i nodurile limfatice unde
se difereniaz n macrofage efectoare.
Mecanismul de atracie a monocitelor n esuturile invadate de bacilii tuber-
culozei i apoi de difereniere a acestora n macrofage efectoare este de natur
chimic i se realizeaz prin chemotaxis i un grup de stimuli reprezentai de celule
modificate, ageni patogeni, histamine eliberate de mastocite i bazofile precum i
citokinele eliberate de macrofagele santinel deja prezente n zona de esut
afectate. Exist abateri de la acest regul n sensul c n unele esuturi, cum ar fi
cel testicular, s-a demonstrat c macrofagele populeaz organul prin proliferare .
46
 Spre deosebire de neutrofile a cror via este scurt, durata vieii
macrofagelor se msoar n luni i chiar n ani. De aceea, se justific denumirea
celule cu via lung
Interaciunea ntre micobacterii i macrofage este un mecanism complex,
specific care implic participarea numeroaselor componente ale micobacteriei i
componentelor macrofagului. Aceste mecanisme sunt diferite de cele ntlnite n
cazul agenilor patogeni extracelulari, aa cum este Neiseria spp. care dezvolt
mecanisme specifice pentru a evita ptrunderea n macrofage., n timp ce
micobacteriile, n special cele cu virulen crescut, dezvolt mecanisme de
cooperare pentru a finaliza ptrunderea n celula gazd.
Interaciunea macrofag celul micobacterian se desfoar n trei etape:

a).Recunoaterea micobacteriilor, rolul receptorilor tool-like (TLR).

Recunoaterea bacililor tuberculozei sau produselor rezultate din acetia, este

o etap deosebit de important n realizarea unui rspuns imun eficient din partea
gazdei.
Recunoaterea imun a componentelor majore ale peretelui celulei
micobacteriene, aa cum sunt: lipoarabinomananul (LAM), lipopolizaharidele
(LPS) sau peptoglicanul (PG), pare a fi similar cu cea observat n cazul bacteriilor
Gram-negative unde acest mecanism se realizeaz numai prin intermediul
lipopolizaharidelor (LPS) (293).
n procesul de recunoatere a micobacteriilor de ctre macrofage sunt
implicai o multitudine de factori circulani i receptori, ca: lipopolizaharidele
plasmatice (LPS) care leag proteinele bacteriene astfel nct se amplific
rspunsurile macrofagelor fa de LPS i LAM prin transferul acestor produse
micobacteriene la receptorii de suprafa CD14.
n mod similar, CD14 solubil confer responsabiliti att LAM ct i LPS n
celulele negative CD14.(137).
Rolul major al CD14 i al proteinelor serice care leag LPS n infecia
tuberculoas a fost demonstrat de J u f f e r m a n s N. P . e t a l . , 1998 (137) care
au constatat c la pacienii cu tuberculoz acut concentraia n CD14 i proteinele
serice care leag LPS au fost crescute.
Receptorii tool-like (TLRs) sunt, din punct de vedere filogenetic, mediatori
conservani a imunitii nscute, implicai n recunoaterea micobacteriilor de
ctre celulele macrofage i dendritice (297). Membrii familiei TLR sunt proteine
transmembranale care conin n domeniul extracelular, mai multe segmente
repetate, bogate n leucin similar cu alte modele proteice de recunoatere ale
sistemului imun nscut ( 293).
Domeniul citoplasmatic al TLR este omolog cu domeniul de semnal al
receptorului pentru IL-1 i pentru legturile de asociere al IL -1R cu kinaza formnd
complexul interleukina-receptor kinaz (IRAK ), o serinkinaz care activeaz
trascripia factorilor de semnal NF-KB pentru producia de citokine (212). Pn n
prezent au fost identificai cel puin 10 receptori t0ol-like (TLR) din care Y o s h i-
m u r a A. e t a l . , 1999, studiind receptorii toll-like 2 (TLR2), tool-like-4
(TLR4) i TLR9, au stabilit c acetia sunt responsabili pentru rspunsurile celulare
la peptoglicanii (PG) i lipopeptidele (LP) bacteriene, la endotoxinele bacteriilor
Gram- negative i DNA bacterian (316) (259) (114).
Datorit receptorilor TLR, lizatul de Mycobacterium tuberculosis sau
lipoproteinele solubile induc producerea de interleukinei-2 (IL-2), o citokin
puternic proinflamatorie (33).

47
 Proteina 88 de difereniere mieloid, un component de semnal care
realizeaz legturile ntre TLRs i IRAK este esenial pentru inducerea activrii
macrofagelor fa de M. tuberculosis (286) ca i dinucleotidele din ADN bacterian
(114 , 34)
Aadar, este unanim recunoscut c receptorii tool-like (TLRs) sunt
principalii responsabili de activarea rspunsului imun i fagocitoza nu poate avea
loc n absena acestora.
U n d e r h i l l D. M. e t a l., 1999 (286) au constatat c TLR-2 este activat n
timpul fagocitozei dar mutante ale acestui receptor au afectat semnificativ
producia de citokine. Pe de alt parte, experimentele in vitro au dovedit c
expresia CD14 i receptorilor tool-like nu altereaz activitatea macrofagelor n
capturarea micobacteriilor.
Mai mult, studii recente au demonstrat c activarea TLR-2 determin in
vitro distrugerea direct a M. tuberculosis localizat n macrofagele alveolare (276).
Se poate afirma c polimorfismul genetic sau probabil structura genelor TLR
precum i reducerea sau chiar dispariia semnalelor proteice afecteaz rspunsul
imun nscut al gazdei fa de micobacterii.

b). Fixarea micobacteriilor pe membrana macrofagului i fagocitarea lor

(Fig 13).

Membrana
citoplasmatic

PG
PERETELE
Mtb. micobacteriei
DNA AG

AM
LAM
Ac. micolici liberi
lipide de suprafa
RG RC
CD14 TLR4 TLR2 RM
TLR9

MACROFAG
Membrana
Citoplasmatic
Recunoaterea TLRs
imun a mico- Captura
bacteriei IRAK MyD88 micobacteriei

Prduse mico- Fagosom

bacteriene
NFkB

ACTIVARE IMUN

Nucleu macrofag

Fig.13 - Recunoaterea i fixarea M ycobacterium tuberculosis pe suprafaa macrofagului. TLR2,4,9:

Receptori celulari de recunoatere(tool-like) a micobacteriei ; RC: Receptor complemet ; RM:Receptor manoz; RG :
Receptori pentru captur rezidii micobacteriene (receptori gunoieri).; LAM:Lipo arabinomanan; AG: Arabinogalactan; AM:
Acizi micolici; PG: Peptoglican ; IRAK: Receptor Interleuchinkinaz (serin-kinaz de trascpriie a factoruilor de semnal
NFKB pentru producie de citokine).

48
 Condiia esenial pentru ca macrofagele s devin efectoare este ca ele s fie
activate mpotriva micobacteriilor.
Dei modelele de activare a macrofagelor in vitro nu au dat rezultate
satisfctoare totui este recunoscut faptul c unele produse secretate de limfocite,
n special interferonul-gamma (IFN) i citokinele proinflamatorii din care face
parte factorul de necroz tumoral- (TNF-) sunt principalii factorii implicai n
procesul de activare.
De asemenea, s-a dovedit c metabolitul vitaminei D, 1,25-dihidroxi vitamina
D, ajut macrofagele n supresarea creterii intracelulare a Mycobacterium
tuberculosis . De exemplu, s-a constatat c la populaiile cu alimaentaie
predominant vegetarian deficiena n vitamina D constituie un factor de risc
pentru tuberculoz i susceptibilitatea la infecie crete n toate cazurile n care la
unele populaii exist asocieri ntre deficiena n vitamina D i polimorfism genetic
al receptorilor pentru vitamina D (306). Ali autori (19), studiind variante ale
receptorilor pentru vitamina D (genotip tt) au constatat c numai 6,0 % dintre
pacienii cu tuberculoz erau homozigoi fa de 12,0 % la subiecii de control,
sugernd c polimorfismul genetic confer protecie mpotriva tuberculozei active.
Aderarea micobacteriilor pe suprafaa macrofagului se realizeaz prin
intermediul a 3 receptori: receptorul pentru complement (RC) , receptorul pentru
manoz (RM) i receptorii pentru rezidii rezultate dup moartea celulelor infectate,
micobacteriilor sau produselele reziduale ale acestora cunoscui n literatura de
specialitate sub denumirea de receptori gunoieri (RG).
Capturarea propiuzis a micobacteriilor se produce fie direct, cnd
macrofagele emit pseudopode, nglobeaz microbul pe care apoi l transport la
fagosomi pentru procesare, fie prin intermediul receptorilor complement care
recunosc micobacteriile opsonizate.
Opsonizarea (Fig.14), reprezint mecanismul prin care anumite molecule din
organismul gazd ader i acoper suprafaa particulelor strine ndeplinind
funcia de liganzi pentru receptorii de pe suprafaa fagocitelor . Asemenea molecule
au fost denumite opsonine.
n literatura de specialitate sunt descrise 4 tipuri de opsonine:
- fibronectina, globulin solubil la cldur;
- anticorpii IgG specifici antimicobacterieni;
- un fragment activ din componenta 3-a a complementului C3b;
- un fragment activ din componenta 3-a a complentului C3bi.

A Membrana B C
ext. a Mf.
`

Receptor
Complement
Opsonine Fagosom
Mtb. Edosom

Fig. 14 - Fixarea micobacteriei opsonizate pe suprafaa macrofagului , fagocitarea (A)

formarea fagosomului (B) i procesarea acesteia n endosom (C)

49
 Aceste molecule i fragmente de complement Faciliteaz aderena specific la
membrana extern a leucocitelor .
Dup cum s-a demonstrat anterior, receptorii prezeni pe suprafaa
macrofagelor sunt indispensabili n funcionarea sistemului imun nscut mpotriva
infeciilor micobacteriene.(78).
Receptorii pentru complement (RC), sunt prezeni pe suprafaa
macrofagelor n 2 forme distincte:
a).Receporii pentru complement tip 1 (RC1)i tip 2 (RC2), sunt proteine
monomer transmembranare care leag C3b i C4b i nu leag C3bi (2).
RC1 are funcie de reglare a complementului sau de activare celular i poate
s medieze limitat fagocitoza particulelor microbiene. Capacitatea de activare
celular i de transducie de semnal nu au fost pe deplin lmurite.
b).Receptorii pentru complement tip 3 i tip 4 (RC3 i RC4) , sunt proteine
heterodimerice din grupa integrinelor, care conin subuniti identice (CD18 sau
integrina 2 i subuniti distincte (CD11B sau M i CD11C sau X).
RC3 i RC4 se leag de RC3bi i de asemnea RC3 conine un glican de
legtura a situsului.(279, 228)
S-a observat c n cursul diferenierii monocitelor din snge n macrofage
alveolare, descrete expresia RC3 dar crete expresia RC4 (120). Mycobacterium
tuberculosis, asemenea multor specii de bacterii i fungi, poate s urmeze calea
alternativ a activrii complementului realizndu-se opsonizarea cu C3b i C3bi
(259).
Rezultatele cercetrilor asupra receptorilor pentru complement au
demonstrat c atunci cnd M. tuberculosis este conjugat cu un strat consistent de
liganzi derivai serici, legturile la RC1, RC3 i RC4 sunt suficient de solide i
intensitatea semnalelor deosebit de puternic pentru a se realiza fagocitoza
complet i n consecin, se produce legarea membranei celulare la fagosomi
(120,259,260).
Spre deosebire de ali ageni patogeni cum ar fi: Streptococus aureus, Listeria
monocytogenes sau chiar bacterii patogene intracelular ca Leishmania mexicana,
micobacteriile patogene reprezentate de Mycobacterium tuberculosis , pot dezvolta
un mecanism ajuttor pentru dobndirea peptidelor opsonice C3.
Pe de alt parte, s-a demonstrat c micobacteriile patogene sunt singurele
care pot recruta fragmentele de complement C2a pentru a forma C3-convertaza
utilizat n producerea complementului C3b activ n situaia n care calea
alternativ sau cea clasic sunt ineficiente n activarea componentelor
complementului.
Alte cercetri au ajuns la concluzia c opsoninele predominante care au fost
declanate de C2a i C3b1, implicai n absorbia metaboliilor i rezidiilor
micobacteriene (receptori gunoieri) i nu de C3bi , se leag mai precis de
fragmentul CR1 dect de CR3 i CR4. Asemenea constatri i concluzii sugereaz
multitudinea posibilitilor prin care Mycobacterium tuberculosis se poate lega la
receptorii pentru complement ai macrofagului. Astfel, n afar de cele dou meca-
nisme distincte amintite anterior prin care pot fi dobndite peptide C3 opsonice,
M.tuberculosis se poate lega la receptorul C3 (RC3) prin intermediul a dou situsuri
distincte prezente pe receptor n domeniul de legtur C3bi. M. tuberculosis
neopsonizat utilizeaz polizaharidele endogene capsulare pentru a interaciona cu
situsul -glucan de legtur n apropiere de C terminal al CD11b (57).
Experimente cu monocite umane i macrogfage murine au artat c acestea
sunt implicate direct mai mult dect interaciunea ntre M. tuberculosis i RC3 (56)
cu toate c ali autori susin c pot s existe interaciuni nonopsonice n absena
sintezei endogene a C3 pentru macrofage (260)
50
 Observaiile de mai sus sunt susinute de cercetrile lui C y w e s C. N., e t a
l. 1996 (56) ntreprinse pe celule ovariene de hamsterie chinezeti (COHC)
transfectate ale cror rezultate exclud alte preri potrivit crora legturile ntre
CD18 i CD11b i M. tuberculosis tulpina H37Rv-CC sunt amplificate de serul
proaspt uman sau
bovin. Autorii citai au demonstrat c un complex H37RvCC anticorp monoclonal
care blocheaz situsul de legtur C3bi n domeniul I al CD11b nu afecteaz legarea
tulpinii H37Rv de celulele ovariene n timp ce un anticorp fixat pe un situs
alternativ din domeniul I i un anticorp legat la domeniul C-terminal blocheaz
legtura la RC3 exprimat pe celulele COHC. n acelai timp, alte cercetri au
relevat c tulpini distincte ale M. tuberculosis intercaioneaz diferit cu RC3. De
exemplu, tulpinile de M. tuberculosis H37Rv, Erdman i 4 din 5 izolate din teren
realizeaz legturi numai prin mecanismul C3bi-independent n timp ce subtulpini
ale H37Rv, H37Rv-HH i una din cele 5 izolate din teren au evideniat legturi la
RC3 numai dup opsonizarrea C3bi ( 57).
S-a dovedit c legturile M. tuberculosis neopsonizat la RC3 pot fi blocate n
prezena laminarinei, un -glucan extras din iarba de mare, prin N-acetil-D-
glucosamin n prezena glucanului capsular extras n stare pur din M.
tuberculosis sau n prezena arabinomananului capsular. De asemenea, s-a
observat c extracia mecanic incomplet a polizaharidelor capsulare sau
tratamentul cu amiloglucosidaz au afectat legturile nonopsonice sugernd faptul
c liganzii bacterieni pentru domeniul RC3 sunt localizai preferenial n rezidiile
carbohidrailor. Aceste studii demonstreaz clar c tulpinile de M. tuberculosis se
pot diferenia ntre ele prin modalitile de interaciune cu RC3 i fiecare
interacioneaz cu domenii distincte ale receptorului prin polizaharidele specifice
din componena situsurilor de legtur ale -glucanului-CR3 (297). Dac asemenea
diferenieri au putut fi observate n cadrul tulpinilor de M. tuberculosis este foarte
probabil ca acestea s existe mult mai pregant la restul speciilor din cadrul
complexului Mycobacterium tuberculosis sau cele ncadrate n complexul
Mycobacterium avium.(21, 59)
Aadar, M. tuberculosis poate s utilizeze receptorii pentru complement
pentru a se fixa i ptrunde n interiorul macrofagului prin multiple mecanisme.
Aceste mecanisme i consecinele lor in vivo pot fi determinate de
caracteristicile tulpinilor bacteriene (complement-dependente sau independente),
de viabilitatea proteinelor complement precum i de stadiul de difereniere sau de
activare al macrofagelor.
Receptorii pentru manoz, sunt proteine monomerice de membran cu o
poriune extracelular care conine 8 domenii cu carbohidrai de recunoatere
caracteristice tipului C ( calciu-dependent lectine).
Receptorii pentru man0z sunt exprimai pe macrofagele mature i abseni pe
monocite.
Exprimarea receptorilor pentru manoz este reglat de gamma-interferon
(262, 246). De aceea, rolul lor n imunitate poate fi mult mai important dect atunci
cnd granulomul tuberculos este deja format i stabilizat.
Mai mult, receptorii pentru manoz pot s medieze distribuia lipoarabino-
mananului (LAM) n compartimentele endosomale care conin CD1b i s faciliteze
transportul i prezentarea acidului micolic i antigenele lipoglicani la celulele T-
CD4- i T-CD8- sau T-CD8+ (23) cu ajutorul monosyltransferazei elaborat de
micobacterii i implicat n biosinteza fosfatidil- inozitol-manozidelor i
lipoarabinogalactanului (4).

51
 Proteine surfactante (Sp-A) i receptori pentru proteine surfac-
tante (RPs-A). n momentul cnd cile aeriene superioare i alveolele pulmonare
devin locurile de staionare i multiplicare ale micobacteriilor patogene din
complexul M. tuberculosis, rolul important revine proteinelor surfactante, aa cum
este proteina surfactanta A (Sp-A) i receptorilor pentru aceste proteine (RPs-A).
S-a dovedit c proteina surfactant A (Ps-A) mediaz aderarea Mycobac-
terium tuberculosis la macrofagele alveolare murine (229).
Dei prezena receptorilor pentru Ps-A pe suprafaa macrofagelor a fost
demonstrat, totui numrul i identitatea acestora rmn incomplet cunoscute.
De semenea nu exist date de specialitate asupra existenei acestor proteine i
receptorii afereni n cursul invaziunii altor esuturi i organe de ctre micobacterii
ca de pild esuturile limfonodale, ficatul .a.
Proteina a surfactant (Ps-A) este un reprezentant al familiei protein-
colectine, care include o protein seric pentru legarea manozei (PSM) i o
component a complementului C1q.
Proteina surfactant (Ps-A) posed un domeniu cu structur asemntoare cu
ce a colagenului care include hydroxiprolina i un domeniu asemntor cu cel al
lectinelor tip C prezente n proteina seric pentru legarea manozei.
Domeniul similar colagenului mediaz interaciunea ntre PS-A i receptorii
celulari de suprafa dar i domeniul corespunztor componentei C1q i PSM pot s
realizeze legturi la aceeai receptori (78).
Pn n prezent s-au identificat cel puin 3 receptori Ps-A . Unul dintre acetia
a fost definit ca o protein de 16 kDa prezent pe suprafaa monocitelor,
macrofagelor, neutrofilelor i celulele endoteliale. S-a demonstrat c anticorpii
monoclonali care recunosc aceast protein blocheaz interaciunile cu Ps-A . PSM,
i C1q.(78). De asemenea, n secvena DNA a receptorului RpC1q exist o prtein de
membran tip I cu potenial de recunoatere a domeniului carbohidrat, denumit
factor de cretere epidermal (205).
nsfrit, o alt protein de 210 kDa a fost descoperit pe suprafaa
macrofagelor i pneumocitelor de tip II. Aceast protein a fost denumit SRP21o.
Ea se leag direct numai de Ps-A din componena micobacteriilor i nu posed situs
de legtur pentru C1q (44).
Mecanismele prin care Ps-A intensific activitatea de legare a M. tuberculosis
pe suprafaa macrofagelor nu sunt pe deplin elucidate
S-a dovedit totui c Ps-A extras n stare purificat din tulpina H37Ra de
M. tuberculosis se leag la receptorii pe macrofage i aceast legtur este
dependent de calciu i de glicolizarea Ps-A. (229).
Experimentele realizate de P a s u l a R., e t a l . 1997 (229) pe macrofage
pulmonare de oarece au demonstrat c n timp ce colagenul tip V blocheaz
legturile M. tuberculosis, legtura ntre Ps-A la M. tuberculosis nu este afectat.
Aceste constatri conduc la concluzia c Ps-A poate aciona ca o opsonin,
legturile Ps-A la macrofage realizndu-se prin intermediul zaharidelor N-lincate la
domeniul similar colagenului.
S-a constatat de asemenea, c tripsinizarea M. tuberculosis altereaz
capacitatea Ps-A de a se lega la stusurile receptorilor pentru Ps-A .
Pe de alt parte, W e i k e r t, L . F ., e t a l., 1997 (303) susin c legarea i
fagocitarea M. bovis-BCG de ctre macrofagele pulmonare de obolan i monocitele
umane sunt intensificate n prezena Ps-A. Legturile directe ale M. bovis BCG la
mcrofage au fost blocate de anticorpii monoclonali pentru receptorii RSP21o-SpA.
O alt caracteristic important a proteinelor surfactante (Ps-A) este capacitatea lor
de

52
a reaciona cu receptorii pentru complement, cu FcR i probabil cu receptorii
pemntru manoz intensificnd astfel fagocitarea micobacteriilor. Aceste mecanisme
nu au fost complet elucidate pentru receptori cu structuri diverse (102). n concluzie,
proteinele surfactante (Ps-A) sunt indispensabile ntr-o anumit etap a fagocitozei
asigurnd legtura ntre celulele fagocite i micobacterii prin intermediul
receptorilor omologi RPs-A.
Ali receptori. Multitudinea receptorilor prezeni pe suprafaa fagocitelor
permit micobacteriilor s adere cu uurin la membrana extern a celulelor gazde
i fagocitarea lor s se realizeze far inconveniente. Majoritate cercettorilor admit
c spre deosebire de alte microorganisme, micobacteriile, n special cele patogene,
i intensific eforturile i apeleaz la toate cile posibile directe i alternative
pentru a ptrunde n interiorul celulelor gazde.
n afar de receptorii prezentai anterior, literatura de specialitate descrie o
grup separat din care cei mai importani sunt:
Receptorul CD14 , un fosfatidilinositol glican din componena membranei
celulare externe , este cunoscut i descris ca receptorul cu nalt afinitate pentru
lipopolizaharidele bacteriilor Gram-negative.
Totui, s-a descoperit c CD14 poate lega lipoarabinomananul (LAM)
M.tuberculosis (H37Ra) i aceast legtur activeaz macrofagele pentru a secreta
interleukina-8 (IL-8) (238) .
Transducia semnalului iniiat de LAM care se leag de CD14 nu este bine
explicat dar se cunoate c aceast cale necesit una sau mai multe componente
restricionate pe celulele hematopoetice. Aceast cale este potenial distinct de
aceea iniial prin legarea lipopolizaharidelor la CD14.
Celulele microgliale derivate din monocite au funcii similare macrofagelor
inclusiv funcia fagocitar i utilizeaz receptorul CD14 pentru a recunoate M.
tuberculosis, tulpina H37Rv. (233)
Receptorii pentru rezidii (receptorii gunoieri)(RG), leag mole-
culele polianionice i particule polizaharidice aparinnd, n general bacteriilor
Gram-negative i acidul lipoteicoic din compoziia bacteriilor Gram-pozitive . (73).
S-a constatat c receptorii gunoieri clasa A utilizai ca inhibitori competitivi
pentru M. tuberculosis-tuplina Erdman, asupra macrofagelor umane derivate din
monocite nu altereaz supravieuirea i creterea micobacteriei n aceste celule. (312)
Mai mult, receptorii gunoieri clasa A purificai se leag de M.tuberculosis i
de sulfatidele din compoziia acestuia n competiie cu ali liganzi pentru receptorii
gunoieri clasa A cu excepia LAM, dar nu se cunoate modalitatea prin care
gunoierii pot s activeze citoscheletonul pentru a facilita ptrunderea bacteriei n
celula gazd.
Receptorii Fc. S-a constatat c unii bolnavi de tuberculoz au n circulaie
anticorpi anti M. tuberculosis (156 ).
Imunoglobulina G (IgG) cuplat cu micobacterii este fagocitat de macrofage
n vezicule care fuzioneaz uor cu lisosomii legai de feritin, n timp ce
micobacteriile neopsonizate rmn n fagosomi care nu pot capta feritina din liso-
somi. n ciuda fusiunii cu lisosomii, micobacteria opsonizat cu IgG supravieuiete
intracelular la o rat egala cu cea a bacililor neopsonizai. Aceast constatare
sugereaz faptul c legarea la receptorii Fc nu afecteaz creterea intracelular a
bacteriei i de aceea transferul pasiv al serului imun nu are efecte benefice n
tuberculoza experimental.

53
 Receptori mediatori ai cilor de ptrundere a micobacteriilor n
celula gazd. Cercetrile ntreprinse pn n prezent, au ajuns la concluzia c
pentru a supravieui n interiorul celulei gazd, mai precis n fagosom,
micobacteriile patogene , apeleaz la o cale mediat prin receptorii neimplicai n
mecanismele bactericide ale celulei, cum sunt: producia de oxigen reactiv i
intermediari ai azotului.
Utilizarea anticorpilor monoclonali i liganzilor competitivi pentru a bloca
receptorii CR1, CR3/4, receptorii pentru manoz i receptorii gunoieri clasa A nu
s-au observat diferene vizibile n extinderea supravieuirii sau a ratei de cretere a
M. tuberculosis-tulpina virulent Erdman (312). Analiza rezultatelor acestor studii
conduc la concluzia c M. tuberculosis utilizeaz selectiv receptori specifici pentru
supravieuire intracelular dei s-a putut dovedi c de exemplu, reeptorii pentru
manoz pot transporta LAM n compartimentul endocitic care conine CD1b i
particip la fixarea LAM sau a acidului micolic pe CD1b n vederea prezentrii
antigenului la limfocitele T (237).
Rolul receptorilor cu funcii distincte n determinarea calitativ i dinamica
interaciunilor fagosomilor cu endosomii nu au fost nc cercetate.
Este posibil ca rute distincte de ptrundere a M. tuberculosis s controleze
activarea macrofagelor pentru producia unor citokine Aceste rspunsuri sunt
importante in vivo dar nu au putut fi evideniate cu ajutorul modelelor de analiz
a supravieuirii micobacteriilor in vitro.
Complexele majore de histocompatibilitate (MHC). Sunt molecule
glicoproteice exprimate pe suprafaa tuturor celulelor nucleate (macrofage,
neutrofile, celule dendritice, etc.) din circuitul sanguin (cu excepia eritocitelor),
implicate n sitemul imun de aprare al celor mai multe vertebrate. Au primit
aceast denumire pentru c sunt responsabile de compatibilitatea, sau mai precis,
necesitatea prezenei acestor molecule n esuturi diferite genetic individual. Ele
controleaz rspunsul imun prin recunoaterea self ului i nonself- ului i n
consecin servesc ca inte n rejecia grefei de transplant
Exist dou categorii de molecule de histocompatibilitate (MHC): molecule
de histocompatibilitate clasa I-a (MHC-clasa I-a) care se gsesc n toate tipurile
de celule menionate mai sus i molecule de histocompatibilitate clasa II-a (MHC-
clasa II-a) care se gsesc n celulele prezentatoare de antigen (CPA) . Moleculele
MHC-Cl.I i Cl.II aparin unui grup denumit Familia Supergenelor Imuno-
globulinice care includ imunoglobuluinele, receptorii celulelor T, CD4 , CD8 i alii.
Complexele majore de histocompatibilitate sunt codificate de diferite gene ,
localizate la om pe cromozomul 6. (Fig.15).
Regiunea D A B C

MHC Cl. II MHC Cl. III MHC - Cl. I

Fig.15 - Domeniile de reprezentare ale MHC- cl.I i MHC Cl.II pe cromozomul 6 uman.

Moleculele MHC- Cl.I sunt codificate de regiunea ABC n timp ce MHC Cl.
II sunt codificate de regiunea D. Dup cum se poate observa n schema de
reprezentare a cromozomului 6 uman exist o regiune intermediar care codific
moleculele de histocompatibilitate clasa III (MHC- Cl.III) inclusiv unele
componente ale complementului.
a). Moleculele de histocompatibilitate clasa I-a (MHC clasaI-a ) , sunt alctuite din
dou lanuri polipeptidice (Fig.16) : un lan codificat de regiunea BCA, glicolizat
n
 54
lungimea cruia se gsesc 346 aminoacizi a cror greutate molecular total este de
45 kDa, denumit i lan greu i un lan scurt (lanul ) format din 99 de
aminoacizi.
Lanul cuprinde 4 regiuni:
- prima regiune citoplasmatic , conine situsuri pentru fosforilare care se
leag de elementele citoscheletice;
- a 2-a regiune , transmembranal conine aminoacizi hidrofili de care se
leag moleculele din constituia membranei celulare;
- regiunea a 3-a, denumit i 3-imunoglobulin, conine domeniul de
legtur cu CD8 prezent pe suprfaa celulelor T;
- a 4-a regiune , este o peptid cu un polimorfism foarte accentuat care se
interpune ntre domeniile 1 i 2 i interaconeaz noncovalent cu lanul uor
(lanul ) .
NH2

Situs de legtur
peptide antigenice NH2
2
S-S 2
CHO
COOH

3
Clivaj papain

Membrana

citoplasmatic
OH Citoplasma
P

Fig. 16 - Reprezentarea schematic a domeniilor complexelor de histocompatibilitate clasa I-a

(MHC-cl. I).

Lanul uor denumit i 2 microglobulin, acest domeniu se asociaz cu

lanul i mpreun definesc conformaia specific fiecrei molecule.
Datorit faptului c lanul uor are rolul de a prezenta peptidele celulelor T a
fost denumit antigenul epitop .
Studiul segmentelor moleculelor MHC-Cl. I a artat c domeniul 1 i 2 care
cuprinde regiunea de legtur a peptidelor micobacteriene prezint o
variabilitate extrem de pronunat. Analiza tridimensional prin cristalografie cu
raze-X, arat c aceast regiune are form de canelur constituit din segmentele
spiralate ale lanului care formeaz cte un perete pe fiecare latur i 8 benzi
aplatizate care formeaz pardoseala canelurii. Peptidele se leag de rezidiile care
cptuesc canelura. Aceste rezidii se carcterizeaz pintr-un polimorfism foarte
ridicat. De regul canelura nu se poate cupla dect cu peptide cu lungime de
aproximativ 8 10 aminoacizi . Legtura unui alt peptid cu structur particular
este posibil n funcie de aminoacizii care cptuesc canelura.
55
 Datorit faptului c moleculele MHC-Cl.I sunt polimorfe, fiecare molecul Cl.I
se va cupla numai cu o anumit peptid microbian pe baza unui set de criterii
care trebuie s fie ndeplinite de acea petid pentru a se cupla la canelur. De
exemplu, o anumit molecul MHC-Cl.I care are un aminoacid cu carboxil terminal
se va cupla cu peptide n structura crora se gsete leucina (L) sau sau
fenilalanin (F) dac al 4-lea aminoacid final are un carboxil terminal. In mod
similar, orice molecula MHC-Cl.I se va cupla cu orice petid care are n structur
tirozina (Y) ca aminoacid secundar terminal i valina (V) , izoleucina (I) sau leucina
(L) la carboxilul terminal din aminoacidul final.
Aadar, pentru fiecare molecul Cl.I , exist diferii aminoacizi care trebuie s
reprezinte un locus special n structura peptidei nainte ca acesta s se lege la
molecula MHC. Cl.I.
Aceste situsuri din structura peptidelor sunt cunoscute sub denumirea de
situsuri de ancorare.
n cadrul complexelor majore de histocompatibilitate (MHC), la om exist 6
gene care codific moleculele MHC Cl.I : HLA-A; HLA B; HLA-C ; HLA-E; HLA-
F; i HLA-G.
Dintre acestea, primele 3 (HLA-A; HLA-B; HLA-C) sunt cele mai importante
i prezint un polimorfism extrem de pronunat . De exemplu, HLA-A are un numr
de 218 alele (alotipuri) , HLA-B : 439 alele i n structura genei HLA-C au fost
detectate 96 alele.
b).Moleculele de histocompatibilitate calasa II-a (MHC cl. II), sunt alctuite
din dou lanuri polipeptidice, ambele codate de regiunea D a cromozomului 6
uman. Aceste lanuri polipeptidice i , coninnd aproximativ 230 i respectiv
240 aminoacizi, sunt glicolizate i au o greutate molecular total de 33 kDa i
respetiv 28 kDa. Polipeptidele, compenente ale celor dou lanuri, sunt pliate n
cte dou domenii separate notate cu 1 i 2 pentru peptidele i 1 i 2 pentru
peptidele . Aceste domenii interacioneaz ntre ele prin legturi peptidice. ntre
cele dou lanuri se afl o canelur a crui platou este format din 8 fascicole pliate
i 2 perei din polipeptide dispuse helicoidal.
Ca i n cazul MHC-cl.I, variabilitatea accentuat a polimorfismului
aminoacizilor este cea care configureaz aceast canelur cu rol esenial n
prezentarea moleculelor de antigen la celulele T. (Fig.17).
NH2 NH2

CHO 1 1 CHO

2 2

Membrana citoplasmatic

COOH COOH

Citoplasma

Fig. 17 - Structura moleculei de histocompatibilitate clasa II-a (MHC-cl.II).

Situsul de ancorare pentru unul sau mai muli aminoacizi a fost observat n
canelura MHC - cl.II n poziii extrem de diverse comparativ cu situsul pentru
aminoacizi prezent pe MHC-cl I.
56
 Regiunea similar imunoglobulinelor, format din 2 i 2, este pliat n
interiorul domeniului similar Ig. Pliurile sunt extrem de polimorfe. Corelaia
expresiei CD4 pe celulele T-helper (Th) cu un receptor TCR specific pentru MHC-
cl.II este dat de legtura moleculelor domeniului CD 4 la pliul asemntor Ig.
polimorf din domeniul 2.
Regiunea transmembranal are funcii similare cu segmentul omolog al MHC-
cl.I i de asemenea i regiunea citoplasmatic este similar cu zona
corespunztoare a MHC-cl.I.
Analiza structurii tridimensionale prin cristalografie cu raze X a
demonstrat variabilitatea extrem de pronunat a domeniilor 1 i 1 care cuprind
regiunea peptidelor de legtur (canelura). Structura canelurii de legtur este
similar cu cea descris la moleculele Cl.I i este compus din dou lanuri
peptidice - spiralate care formeaz 2 perei laterali i 8 benzi - aplatizate care
alctuiesc pardoseala canelurii (Fig.18) .
Att lanul ct i lanul contribuie la cuplarea peptidelor microbiene in
canelur prin aminoacizii reziduali care intr n contact cu aceste peptide.
Aminoaciizii reziduali din canelur se caracterizeaz prin polimorfism foarte
ridicat .
1 3 4 5
2
Molecule peptidice
1
1 7

6 8

Fig. 18 - Structura tridimensional a regiunii canelurii moleculelor MHC-Cl.II i legarea peptidelor

n canelur

Canelura moleculei MHC-Cl.II este deschis la captul terminal astfel nct

aceasta poate s se adapteze cuplrii peptidelor care au o lungime de aproximativ
13 25 aminoacizi, unii dintre aminoacizi fiind localizai n afara canelurii.
Legarea petiptelor la molecula MHC- Cl.II depinde de aminocizii existeni n
componena canelurii i de poziia acestora.
Aceast caracteristic confer moleculelor MHC-Cl.II polimorfism accentuat
i n consecin anumite molecule MHC-Cl.II vor lega diferite peptide. Fiecare
molecul MHC.Cl.II va impune unei anumite petide un set de criteii care trebuie
ndeplinite pentru ca aceasta s se cupleze la canelura moleculei Cl.II.
Totodat, polimorfismul moleculelor MHC-Cl.II este determinat de existena
pe cromozomul uman a 5 locusuri care codific aceste molecule.
Fiecare din aceste locusuri conine cte o gen pentru lanul i cel puin o
gen pentru un lan . n literatura de specialitate , cele 5 locusuri au fost
identificate astfel: HLA-DP; HLA-DQ;HLA-DR ; HLA-DM i HLA-DO. Dintre
acestea primele 3 prezint importan imunologic semnificativ i posed un
polimorfism foarte accentuat. De plid, HLA- DRB 1 conine 269 alele i HLA-DRB
conine 88.
Cercetrile recente asupra complexelor majore de histocompatibilitate
(MHC) au scos n eviden urmtoarele aspecte:
1. Dei exist un grad ridicat de polimorfism pentru o specie, un idivid din
acea specie nu poate s posede mai mult de 6 populaii diferite de molecule
MHC.Cl.I i extrem de puine populaii de molecule MHC.Cl.II, fiind considerate
numai locusurile majore;
57
2. Fiecare molecul MHC posed numai un singur situs de legtur. Dei
este posibil ca la un singur situs al moleculei MHC s se lege mai multe peptide
aceast legtur nu se realizeaz niciodat simultan ci la intervale diferite. Aceast
caracteristic a meloculelor MHC , de a lega mai multe peptide diferite are efect
negativ asupra situsului de legtur care degenereaz progresiv;
3. Polimorfismul moleculelor MHC este determinat de specia microbian.
Nu exist mecanisme recombinative care genereaz diversitate.
Moleculele MHC sunt liganzi de membran; recunoaterea lor de ctre
celulele T necesit realizarea contactelor intercelulare;
4. Alele pentru genele MHC sunt co-dominante. Fiecare gen MHC este este
exprimat pe suprafaa unei celule nucleate individuale;
5. Un peptid ar trebui s se asocieze individual cu o anumit molecul MHC,
n caz contrar nu poate s apar rspuns imun. Aceasta constituie o modalitate de
control al rspunsului imun;
6. Celulele T mature trebuie s posede un receptor celular T care recunoate
peptidul asociat cu MHC . Aceasta este a doua modalitate de control al
rspunsului imun;
7. Citokinele (n special interferonul-) crete gradul de exprimare a
moleculelor MHC;
8. Peptidele din citosoli asociate cu moleculele MHC Cl.I sunt recunoscute
de celulele Tc (T- citotoxice) n timp ce peptidele din interiorul veziculelelor
citoplasmatice legate la moleculele MHC-Cl.II sunt recunoscute de celulele Th (T-
ajuttoare);
9. Polimorfismul moleculelor MHC este important pentru supravieuirea
speciilor .
Organizarea i funcionarea moleculelor complexe majore de histo-
compatibilitate (MHC) au fost studiate pe larg la oameni i la animale de laborator
utilizndu-se n special modele murine.
S i n g h N. e t a l, 1997 (265) au evideniat rolul major al asocierii
mecanismelor rspusurilor imune fa de unele boli infecioase cu MHC/ HLA
(Tabelul:4).
Autorii citai, sunt de prere c transmiterea infeciei cu virusul HIV-1 de la
mamele gravide la fetui i rspndirea infeciei n unele populaii umane sunt
influenate de alelele DRB1- fetale ale MHC cl.I. Astfel, cel puin 13 alele DR,
incluznd DRB1*1301, 1302 i 1303 au fost descoperite la 15,2% dintre copiii
infectai cu HIV -1 i la 31,7 % dintre copii seroreversibili cu variaii importante n
funie de populaia studiat; de exemplu, la copiii caucazieni prezena alelei DRb1 *
03011 a fost asociat cu infecia HIV.
n acelai context, L e w i n H. A. i R u s s e l l G. C. ,1999 (167) referindu-se
la organizarea genetic, polimorfismul i funcia genelor care controleaz
activitatea moleculelor MHC cl. II la bovine, au artat c regiunea BoLA (Bovine
Leucocyte Antigen) este diferit de cea a moleculelor MHC umane (HLA) i cele
murine n care autorii studiului au observat o reversie imoportant a mai multor
gene cl.II , inclusiv n gruparea TAP (transporteur antigen proteine) care se nchide
la centromerul cromozomului 23.
Aceeai autori, susin polimorfismul extrem de pronuat la bovine al genelor
moleculelor MHC-cl.II care influeneaz semnificativ att magnitudinea
rspunsului imun ct i specificitatea epitopului de pe suprafaa celulelor T pentru
peptidele virusului febrei aftoase perzentate de macrofage celulelor T prin
intermediul MHC.
58

Tabelul:4
 Asocierea ntre antigenele leucocitare umane (HLA) i unele boli infecioase
(Singh, N. et al., 1997).
Bolile Asocierea cu HLA
(alele)
1. Bacteriene
Spondilita anchilozant B27
Boala Reiter B27
Uveita acut anterioar B7
2. Micobacterioze
Tuberculoza i lepra DR2
(forme multibacilare) DRB1*1501,1502)
Lepra : forma leromatoas DR2 i DQ1
forma tuberculoid paucibacilar DR3
3. Virale
Virusul-1 al imunodeficienei umane (HIV-1) DR13 (DRB1*1301, 1302,
1303)
DR2(DRB1*1501,
DRB1*03011)
Virusul hepatitei B DR13
Virusul Hepatitei C A2, DR5
Virusul Epstein-Barr B35.01, A11, B7
Virusul febrei Denga DR15
4. Parazitare
Malaria B53
Scabia A11
Leishmanioza cutanat difuz A11, B5, B7
Leishmanioza cutanat localizat A28, Bw22, DQw8, DR11,
Qw7, Dqw3
Leishmanioza visceral A26
Schistosomiaza B5, DR3

Pe de alt parte, s-a demonstrat c alelele BoLA sunt implicate n evoluia

subclinic a infeciei cu virusul leucozei bovine (BLV) i aceast asociere se
coreleaz pregnant cu prezena aminoacizilor specifici n domeniul DRB3 de legare
a antigenului.
Semnificaia practic a acestor constatri const n faptul c asocierea ntre
BoLA i BLV reprezint un model unic pentru studiul rezistenei gazdei la infecia
cu retrovirusuri i , de ce nu, ofer posibilitatea real ca n viitorul apropriat, s se
descopere vaccinuri recombinante cu eficacitate maxim mpotriva infeciilor cu
retrovisuri.
Acesta a fost probabil motivul principal pentru care alte cercetri s-au focalizat
asupra studiului moleculelor majore complexe de histocompatibilitate (MHC) i
implicaiilor lor n infecii precum: infecia cu Brucella abortus (89), infecia cu
Toxoplasma gondii (95), infecii cu germeni din genul Chlamidia spp. .(201) dar
numeroase cercetri au fost intreprinse n infeciile cu Mycobacterium sp. la om , animale
i psri (87, 300, 141,94,280).
n experimente pe linii de celule B murine i umane s-a putut demonstra c
moleculele complexe major de histocompatibilitate cl.II (MHC-cl.II) interacioneaz cu
lipopolizaharidele (LPS) provenite din procesarea germenilor Brucella abortus i
trsansportul acestora la celulele B declannd producia de anticorpi specifici anti LPS- B.
abortus .
Asocierea MHC cl.II numai cu LPS- B. abortus se realizeaz ntr-o manier
halotip-independent, sugernd c antigenul lipopolizaharidic de B. abortus poate
s joace un rol important i n activarea celulelor T (89).

59
 Rolul protector al MHC - cl. II a fost evideniat anterior de M o r r i s o
n P.R. et a l., 1995 (201) care, utiliznd oareci lipsii de genele care controleaz 2-
microglobulina (2-/-), MHC cl.I (cl.I -/-), MHC cl.II (cl.II-/-) sau CD 4 (CD4-/-) ,
monitorizai pentru capacitatea lor de a reaciona la infecia tractusului genital cu
Chlamydia trachomatis , au ajuns la concluzia c MHC-cl.II au un rol esenial n
activarea celulelor T pentru dezvoltarea rspunsului imun protector fa de infecia
tractusului genital cu Chlamydia i c prezena anticorpilor locali (IgA) la nivelul
mucoasei vaginale a determinat regresia infeciei i reducerea semnificativ a
numrului de germeni eliminai.
O particularitate deosebit de important a moleculelor complexe majore de
histocompatibilitate (MHC) este capacitatea acestora de a procesa selectiv
antigenele i de a conferi rezisten diferit fiecrui organism n parte impotriva
agresiunii microorganismelor patogene.
De exemplu, studiile ntreprinse pe oareci congenetici C57BL/KsJ i
DBA2/J care posed MHC-halotip d au fost mult mai rezisteni dect variantele
paternale C57BL/6 i DBA1/J la infecia cu Toxoplasma gondii tulpina ME-49 i nu
au dovedit aceeai rezisten atunci cnd au fost infectai cu Toxoplasama gondii
tulpina P-Br.(95)
Rezultate similare au fost obinute i n infeciile cu Criptococcus neoformans
unde cercetrile pe oareci congenetici MHC au artat diferene semnificative ale
susceptibilitii ntre homozigoi i heterozigoi (191)
Cercetrile asupra particularitilor imunologice n infecia tuberculoas au
adus clarificri importante n acest domeniu. Studii comparative ntre pacienii la
care contactul cu Mycobacterium tuberculosis se soldeaz cu iniierea i
declanarea imunitii de protecie i indivizi la care se dezvolt tuberculoza activ
au sugerat implicarea factorilor genetici prin moleculele complexe majore de
histocompatibilitate (MHC) cu importan crucial pentru rezistena gazdei la
infecia cu M. tuberculosis. De asemenea, s-a observat c locusul MHC
corespunztor joac rolul cheie n controlul susceptibilitii la infecie. Cercetrile
genetice la oameni au dovedit c alelele HLA-DR 2 i HLA-DR3 controleaz
susceptibilitatea la tuberculoza pulmonar i lepr. Experimentele ulterioare,
utiliznd modele murine, au demonstrat c recunoaterea antigenelor M. tuber-
culosis de ctre celulele T depinde de halotipul MHC care transport componentele
antigenice ctre aceste celule n timp ce rezistena la infecie nu este influenat
(141).

3.1.2.4 . Leucocitele Limfocitele B i T.

Limfocitele reprezint grupa cea mai important de celule albe implicate n

sistemul imun al organismului gazd mpotriva agenilor patogeni (bacterii,
virusuri, parazii, micei, etc). Ele sunt cunoscute n imunologie i sub denumirea
de leucocite care circul n snge.
Cu toate c aparent limfocitele mature sunt extrem de asemntoare, n
realitate acestea prezint un grad ridicat de diversitate , dac se consider numai
funciile pe care le ndeplinesc.

Limfocitele B .

Sunt produse n mduva osoas a celor mai multe specii de mamifere i n

bursa lui Fabricius la psri. Corpul uman produce milioane de tipuri de celule B
care circul n snge i limf ndeplinind funcia de supraveghere imunologic.

60
 Cercetri recente au demonstrat c la iepuri celulele B se dezvolt n
formaiunea limfoid denumit apendix-sacculus rotundus.
Dup atingerea stadiului de IgM imatur n mduva osoas, celulele B
migreaz n splin unde sufer transformri devenind celule mature (234).
n dezvoltarea celuleor B au fost descrise mai multe stadii, fiecare stadiu
reprezint o schimbare n structura genomului n locusurile pentru anticorpi.
n orice etap a procesului de maturare a celuleor B pot interveni blocaje care
duc la moartea celulelor, fenomen cunoscut sub denumirea de apoptoz sau
deleie. Celulele B se produc permanent n mduva osoas dar numai un procent
mic supravieuiesc i reuesc s ptrund n circuitul sanguin. Fiecare celul B
recunoate un anumit antigen , adic este capabil s lege o structur molecular
specific. Specificitatea de legare este determinat de receptorii pentru antigen
(RCB).
Receptorii celulari pentru antigen (RCB), sunt proteine integrale prezente
ntr-o mulime de copii identice la suprafaa membranei celulare.
Receptorii celulari pentru antigen (RCB) se formeaz naintea contactului
celulei cu antigenul i sunt codificai de gene asamblate prin recombinarea ADN
(172).
Receptorii pentru antigen (RCB) au un singur situs de legtur care leag
fragmentul antigenului denumit determinant atigenic sau epitop.
Legtura receptor-epitop se realizeaz prin fore noncovalente i se aseamn
cu cea care are loc ntre o enzim i substratul su, fiind dependent de
complementaritatea suprafeei receptorului i suprafaa epitopului.
Studiile ntreprinse asupra receptorilor celulari B (RCB) i receptorii celulari
T (RCT) au scos n eviden unele diferene care se refer la structur, genele care i
codific i tipul de epitop care se leag la aceti receptori ( de exemplu, RCB se
leag la antigene solubile similare cu toxoidul difteric) (61).
Cercetrile privind mecanismul de legare a antigenului la receptorii celulei B
(RCB) au artat c antigenul ajunge n celula B prin endocitoz mediat de
receptor.
Antigenul procesat n fraciuni antigenice se leag la moleculele complexe de
histocompatibilitate cl.II (MHC-cl.II) i sunt transportate la suprafaa membranei
celulare.
Celulele T-helper (Th) se leag la celulele B prin intermediul receptorilor
celulari T (RCT) i elibereaz limfokine care stimuleaz i activeaz celulele B s
dezvolte, prin mitoze reptate i difereniere , o clon de celule numite plasmocite,
recunoscute n imunologie ca celule secretoare de anticorpi.
n mod similar, celulele B se pot diferenia n celule B cu memorie sau s
parcurg un stadiu intermediar denumit centrul germinal de reacie cnd celula B
va suferi hipermutaia regiunii variabile a genenei resposabile pentru imuno
globulin hipermutaie somatic i posibil schimbarea clasei de imunoglobuline
(146,178).
Pe de alt parte, s-a demonstrat c celulele B mezenchimale au proprietate
specific de a produce anticorpi care reacioneaz cu glicolipide, lipoglicani sau
polizaharide derivate din Mycobacterium tuberculos (54, 296).
Ulterior, cercetrile suplimentare asupra proteciei antituberculoase indus
prin vaccinare au emis conceptul n baza cruia celulele T-CD 1d ofer ajutor
celulelor B pentru producia in vivo a anticorpilor specifici (Fig. 19).
Potrivit acestui concept, iniial are loc captura de ctre celula dendritic (DC)
sau macrofag (Mf) a proteinelor, glicolipidelor sau complexelor antigenice care
ulterior sunt prezentate la celuleleT-natural killer (NKT) pe calea receptorului TCD1
sau la celulele T-helper (Th) pe calea moleculeleor complexe de histocompatibilitate
(MHCcl.II).
61
 Celul dendritic (DC)
Macrofag (Mf)
Endosom NKT Plasmocit Secreie
Ag LB Ac.
Proliferare
Difereniere

Rspuns imun secundar

IL-4
Celul B cu memorie
DC
IL-5 IL-6
LT
Procesare antigen

Fig.19 - Mecanismul de cooperare ntre LT , NKT i LB pentru producia de anticorpi anti M. tuberculosis

Dup cum s-a precizat anterior, celulele B pot s capteze antigene solubile
(glicolipide, lipoglicani, polizaharide carbohidrai) i s le prezinte celulelor
natural killer (NKT) sau celulelor T-ajuttoare (Th) pe care le stimuleaz, s
produc limfokine, n special IL-4, mediator important al cooperrii ntre celulele T
i B prin receptorii menionai.
Proliferarea celulelor B in vitro s-a dovedit posibil numai atunci cnd
acestea au fost stimulate cu IL-4 n asociere cu CD40L, cunoscut ca un ligand din
familia receptorilor factorului necroz tumoral (TNF) prezent pe suprafaa
limfocitului T h2 i care se cupleaz cu cu congenerul CD40 prezent pe suprafaa
celulei B determinnd clonarea masiv i producie de anticorpi in vivo(134).

Tipuri de celule B.

- Celulele B naive, sunt acele celule B lipsite de memorie. Att celule B

naive ct i predecesorii lor nu au venit n contact cu un antigen i nu au
recunoascut anterior epitopii acestuia.
Contactul primar cu antigenul specific, cooperarea celular i aciunea
limfokinelor iniiaz activarea i proliferarea acestui tip de celule .
- Celulele B-plasmatice (plasmocitele), reprezint un grup important, derivat
n urma diviziunii mitotice a celulelor B care au recunoscut antigenul realiznd
legturi ntre receptorii celulari B (RCB) i epitopii prezeni pe suptafaa microbilor.
Plasmocitele sunt productoare i secretoare de cantiti importante de
anticorpi care ptrund n circuitul sanguin i limfatic i particip efectiv la
distrugerea microbilor fie prin blocarea epitopilor fie prin opsonizare, trans-
formarea microbilor n inte pentru fagocite i activarea sitemului complement.
Diferenierea celulelor plasmatice pentru a produce o anumit clas de
imuno-globuline este coordonat genetic.
- Celulele B cu memorie includ celulele B activate, specifice pentru antigenul
cu care aceste au venit n contact n cursul rspunsului imun primar.
Aceste celule au o viaa lung i sunt capabile s rspund rapid la urmtorul
contact cu acelai antigen, extracte sau fraciuni din acesta; de aceea ele au fost
recunoscute ca promotoare i iniiatoare ale rspunsului imun secundar (203, 247).
- Celulel B-1, exprim IgM n canti apreciabile pe supraa membranei lor
comparativ cu IgG i receptorii acestor celule prezint polispecificitate , demon-
strnd afinitate slab pentru o multitudine de antigene-self i polizaharide
bacteriene comune.

62
 Celulele B-1 sunt prezente n numr redus n nodurile limfatice i n splin dar
predomin n cavitile peritoneal i pleural (76).
- Celulele B-2 , sunt celule B convenionale .

Recunoaterea antigenului de ctre celulele B.

Diferena notabil ntre celulele B i celulele T const n modul cum aceste

limfocite recunosc antigenul.
Celulele B recunosc antigene solubile care circul libere n snge sau n limf
utiliznd receptorii celulari (RCB) care sunt imunoglobuline (IgM i IgG) ataate la
suprafaa membranei celulare externe (220).
Celulele T, recunosc antigenul ntr-o form procesat. Fraciuni din antigenul
procesat sunt preluate de moleculele complexe de histocompatibilitate (MHC) i
transportate la suprafaa macrofagului (Mf) sau celulei dendritice (CD) care
ndeplinesc funcia de celule prezentatoare de antigen (CPA) la receptorul celulei T
(TCR).

Activarea celulelor B.

Imunoglobulinele M (IgM) i D (IgD) prezente la suprafaa celulelor B , nde-

plinind funcia important de receptor celuar B pentru antigen (BCR), particip la
activarea celulelor B prin dou modaliti:
- prima modalitate este similar cu cea a receptorului pentru antigen al celulei
T (TCR) i se bazeaz pe transmiterea de semnale in interiorul celulei n momentul
cnd aceasta s-a cuplat cu antigenul specific;
- a doua modalitate: complexul receptor-antigen este fixat la situsurile
intracelulare corespunztoare unde este degradat i readus la suprafaa ceulei B ca
peptid legat la moleculele complexe de hizstocompatibilitate clasa II (MHC cl.II).
Complexul MHC cl.II-peptide este recunoscut de celulele Thelper (Th)
specifice antigenic care preiau peptideleantigen prin intermediul receptorilor
corespunztori (TCR), se sensibilizeaz i determin celulele B s prolifereze i
ulterior s se diferenieze n celule secretoare de anticorpi (plasmocite).
Unele antigene microbiene pot s activeze celula B direct, n absena celulei
Th; aceast caracteristic are importan imunologic crucial avnd n vedere c
posibilitatea activrii directe a celulelor B de ctre anumite anitegene furnizeaz un
rspuns imun rapid fa de unele bacterii patogene. Anticorpii indui numai de
antigene microbiene au variabilitate redus i funcii multilaterale slab dezvoltate
comparativ cu anticorpii indui n urma interaciunii celulelor Th cu celulele B.
Pe de alt parte, n imunitatea adaptat lifocitele B naive cu specificitate
pentru un anumit antigen se activeaz destul de dificil numai la stimulul antigenic
respectiv. De aceea, celulele T naive necesit un semnal de co-stimulare de la
celulele prezentatoare de antigen (CPA) . Celulele B naive necesit semnale
suplimentare de la celulele Th care posed mijloacele necesare transmiterii acestor
semnale sau, n unele cazuri, direct de la componentele microbiene (54). Antigenele
care se leag direct i sunt nglobate n celulele B transmit un semnal specific care
recruteaz celulele Th pentru a coopera cu celulele B n iniierea rspunsului
imun umoral. S-a dovedit c aceste antigene sunt incapabile s induc singure
rspunsuri n anticorpi la animale i oameni cu deficiene n limfocite Th i de aceea
aceste antigene au fost denumite tymus-dependente sau antigene TD (Fig.20 ).

63
 A B
Toxoid tetanic
MHC-TCR
Ag (LPS)

IL-4

Receptor (Ig) MHC LB

pentru cl.II
antigen (Ag)
TCR CD40 CD40L
Semnal Primar
Semnal secundar
Procesare i
prezentare Ag
Fig.20 Activarea celulelor B pe calea MHC-TCR (A) i cu Ag-LPS + Toxoid T. (B)

Dei celulele Th sunt necesare la activarea celulor B n vederea iniierii unui

rspuns imun fa de antigene proteice, exist o multitudine de componenente
microbiene precum polizaharidele bacteriene care pot s induc producia de
anticorpi fr aportul celulelor Th. Aceste antigene au fost denumite tymus-
independente sau antigene TI i ele au fost capabile s induc rspunsuri
umorale la pacienii cu imunodeficien n limfocite T.
Semnalul secundar necesar pantru activarea produciei de anticorpi este
transmis direct dup recunoaterea componentelor bacteriene comune sau prin
legturi complexe ncruciate.
Celulele Th coopereaz numai cu acele celule B ai cror receptori leag acel
antigen care coonine peptidul recunoscut iniial de aceste celule.
Acest tip de interaciune intercelular se numeterecunoatere de legare
(recognition linked) i are importan crucial n reglarea i controlul rspunsului
imun umoral. De exemplu recunoaterea de legareare aplicabilitate practic n
producia de vaccinuri eficiente mpotriva infeciei cu Haempfilus influnzae tip B
agentul etiologic al meningitei infecioase la copii.
S-a dovedit c numai antigenele lipopolizaharidice (LPS) capsulare singure
extrase din corpul bacteriei produc rspunsuri imune slabe la copiii cu sistem imun
imatur dect atunci cnd LPS a fost legat de toxoidul tetanic, o protein strin
cu care copiii au fost vaccinai cu succes, ntruct celulele B care recunosc i leag
LPS Haemofilus, sunt activate de celulele Th sensibilizate fa de toxoidul tetanic
legat la LPS- Haemofilus (133 ).
Alte cercetri au ajuns la concluzia c peptidele-antigen legate la moleculele
self- MHC cl.II atrag celulele Th efectoare s relaizeze legturi de memebran i s
secrete molecule care pot s activeze celulele B. O particularitate important a
celulelor Thefectoare este prezena unei molecule ligand identificat n
imunologie cu simbolul CD40L sau CD154, al crui corespondent pe celula B este
molecula CD 40 un membru al familiei factorului de necroz tumoral- (TNF-)
care include receptori pentru citokine (321).
Legtura ntre receptorul CD40 i CD40L determin celulele B inactive s
intre n ciclul celular de activare , proliferare i difereniere. Acest proces este
esenial pentru rspunsul celulelor B la antigene thymus-dependente (TD).

64
 Experimentele lui K u p f e r H., e t a l., 1 9 9 4 (154) i D a v e y , J. E., et a l. 1
9 9 8 (62 ) au demonstrat c celulele B prolifereaz atunci cnd acestea au fost
stimulate in vitro cu CD40L asociat cu interleukina-4 (IL-4) ambele secretate de
celulele Th2-efectoare iniiate n recunoaterea ligandului specific de pe suprafaa
celulelor B. Aceste interaciuni celulare au fost puse n eviden prin imuno-
fluorescen microscopic
Combinaia receptorului celular B i conexiuni cu IL-4 i alte semnale
transmise prin contactul direct al celulelor T determin proliferarea celulelor B.
Asemenea semnale sunt transmise i de ali membrii ai familiei TNF- dintre care
se evideniaz CD30, stimulatorul pentru limfocite B (BLys) (314).
Dup parcurgerea a mai multe stadii de proliferare , celulele B se difereniaz
n celule plasmatice secretoare de anticorpi. n ultimul stadiu de activare a celulelor
B sunt implicate citokinele IL-5 i Il-6, ambele eliberate de celulele T-h (55). Toate
celulele B exprim IgM i IgD la suprafaa membranei citoplasmatice dar aceste
imunoglobuline se gsesc n procent 10% n plasm, spre deosebire de IgG a cror
concentraie se ridic la valori semnificative. Majoritatea anticorpilor din plasm
sunt produi de celulele B care sufer transmutaii izotipice importante n
regiunea C a lanului greu V.
S-a demonstrat c transmutaia izotipic nu a fost prezent la indivizii
diagnosticai cu disfuncii ale CD40L ntruct la acetia interaciunile ntre celulele
B i Th sunt ineficiente aa nct, n plasm s-au gsit cantiti neglijabile de IgM la
antigene thymus-dependente i concentraii extrem de crescute ale acestei
imunoglobuline la pacienii cu infecii cronice afectai de imunodeficien umoral
sever (90). Totodat, experimentele cu celule B de oarece stimulate in vitro cu
lipopolizaharide bacteriene (LPS) i citokine purificate au dovedit c diferitele
citokine utilizate induc preferenial transmutaii izotipice, unele dintre aceste
citokine fiind aceleai care determin proliferarea celulelor B i iniierea
rspunsului imun celular (RIC).
De exemplu Il-4 induce la oareci transmutaii prefereniale pentru IgG i IgE
n timp ce factorul de transformare a creterii (TGF-) induce transmutaii
pentru IgG2b i IgA. (Tabel: 5 )
Tabelul: 5.

Rolul unor citokine n reglarea expresiei izotipice n clasele de imunoglobuline IgA,IgG i IgM

Citokine Rol n reglarea expresiei izotipului:

IgM IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgE IgA
IL-4 Inhib Induce Inhib Inhib Induce
IL-5 Sporete producia
IFN- Inhib Inhib Induce Induce Inhib
TGF- Inhib Induce Inhib Induce

Fiecare dintre citokinele implicate n transmutaii ale izotipului imuno-

globulinei, probabil induc transcripia a dou gene diferite din regiunea modificat
a lanului C greu, promovnd recombinri specifice a uneia sau alteia dintre cele
dou gene. De asemenea, s-a observat c celulele B suport individual frecvente
transmutaii pe ambii cromozomi ai aceleleiai gene C chiar dac anticorpul cu lan
greu este evident exprimat de unul din cromozomi. Aadar, celulele T-helper (Th)
regleaz att producia de anticorpi de ctre celulele B ct i izotipul de
imunoglobulin care determin funcia efectoare a anticorpilor.

65
 Dup activarea celulelor B prin combinaia cu antigenul i celula T, acestea
migreaz n centrii germinali (CG) unde sufer hipermutaii somatice care se
soldeaz cu reamplasri ale aminoacizilor n regiunile V ale imunoglobulinelor i n
final se decide soarta celulelor B.
Mutaiile care produc receptori celulari B (RCB) cu afinitate slab pentru un
anumit antigen vor bloca activarea ulterioar a celulei i n consecin existena
receptorilor cu situsuri de legturi ncruciate i capacitatea redus de a prezenta
peptide-antigen specifice la celulele T se soldeaz cu moartea natural a celulelor B
prin apoptoz .
Centrii germinali au fost descrii de M a c L e n n a n , I. C. M., 1 9 9 4 i
K e l s o e , G., 1996 ca fiind microformaiuni specializate localizate n foliculii
nodurilor limfatice n care celulele B sufer proliferare, hipermutaie somatic i
selecie pentru legarea antigenului.
Celulele B care prolifereaz rapid n centrii germinali sunt denumite
centroblati. Grupuri compacte de centroblati formeaz aa zis zon
ntunecat. Aceste celule se matureaz i se transform n centrocite care se
deplaseaz la periferia centrului germinal n care se gsete o reea de celule
dendritice (CD) foliculare i celule Th cu care celulele B interacioneaz formnd
foliculul ptimar. n interiorul centrului germinal celulele B se difereniaz n celule
plasmatice, secretoare de anticorpi i celule B cu memorie care prsesc centrul
germinal i migreaz spre medular sau prsesc nodul limfatic i, pe calea vaselor
limfatice aferente, migreaz spre mduva osoas. Celulele B cu memorie migreaz
n esutul limfoid secundar i unele pot s se stabileasc n zona periferc a splinei
(178, 147).
Rolul celulelor B n infecia cu micobacterii . Mult vreme , rolul celulelor B
n infecia cu Mycobacterium tuberculosis a fost neglijat i de aceea implicarea
celulelor B n aprarea gazdei mpotriva infeciei tuberculoase a fost mai puin
studiat. Majoritatea cercetrilor au evideniat rolul celulelr B ca productoare de
anticorpi dar nu s-au ntreprins studii complete asupra gradului de participare i
importana acestor populaii de celule n imunitatea mediat celular (IMC) aa
cum, n multe infecii cu diveri ageni patogeni controlai prin IMC, s-a dovedit c
celulele B ndeplinesc funii i pot juca un rol important att n cursul rspunsului
imun precoce ct i n cel de lung durat.
De exemplu, I a n k o v i c, D., et al., 1 9 9 8 (128) i I a n k o v i ci, D., e t
a l , 1 9 9 9 (129) au demonstrat c n absena celulelor B se produce alterarea
diseminrii Schistosmas mansoni din focarul infeciei, granuloame de dimensiuni
apreciabile, imunitate vaccinal ineficient mpotriva acestui agent patogen.
De asemenea, s-a stabilit c celulele B sunt implicate n imunitatea primar i
secundar a celulelor T ca urmare a infeciei pulmonare cu Chlamydia trachomatis.
oarecii cu deficien n celule B au etalat rspunsuri slabe n IFN specifice
pentru Chlamydia trachomatis i hipersensibilitate de tip ntrziat (DTH)
nesatisfctoare (315 ).
Ca urmare a infeciei cu aerosoli de Bordetella pertusis , oarecii deficieni n
celule B au dezvoltat o infecie persistent i, spre deosebire de oarecii din tipul
slbatic, dispariia agentului patogen din organism a fost numai parial (183).
Perfecionarea procedeelor genetice de obinere a populaiilor de oareci cu
disrupia genelor responsabile de producia unor citokine cu rol major n
imunitatea mediat celular (IMC) precum i blocarea sintezei celulelor B (0areci
BKO) a permis diversificarea studiilor n domeniul infeciilor cu micobacterii.

66
 Astfel, V o r d e r m e i e r, H . M . e t a l. 1 9 9 6 (298) au obsrvat c la
oarecii lipsii de celule B ( BKO) numrul de bacili tuberculoi a fost uor crescut
n organele afectate la 4-6 sptmni dup infecie intravenoas cu o doz crescut
din tulpina virulent de laborator M.tuberculosis- H37Rv.
J o h n s o n, C. M., e t a l . 1 9 9 7 (136) observ diferene notabile privind
ncrctura bacterian, nivelul mARN pentru citokine sau gravitatea proceselor
patologice din organe la oarecii BKO i oarecii tipul slbatic la 45 de zile dup
infecia cu o doz redus de aerosoli cu M.tuberculosis-H37Rv. Cele dou studii
sugereaz c celulele B au o contribuie minor n controlul sau exacerbarea infec-
iilor cu M. tuberculosis la oareci n faza cronic a bolii.
Pentru nelegerea rolului celulelor B n diverse faze de evoluie a
tuberculozei, B o s i o , M . C . , e t a l ., 2000 (28 ) au studiat faza acut a infeciei
utiliznd un izolat clinic de M.tuberculosis (CDC1551) cu o capacitate de
transmitere i virulen deosebit de crescute. n baza rezultatelor obinute, autorii
studiului ajung la concluzia c dezvoltarea leziunilor i generarea imunitii
protectoare sunt evenimente disociate n cursul infeciei cu M. tuberculosis; la
oarecii BKO s-a observat o ntrziere n diseminarea bacililor n splin i ficat i
diseminarea a fost absent pn la evidenierea granuloamelor tipice. Dezvoltarea
granuloamelor de dimensiuni apreciabile nu contribuie la prevenirea diseminrii
bacililor i controleaz riguros multiplicarea bacililor n organisul gazd. De
asemenea, autorii au observat c la oarecii BKO diseminarea bacilior a fost
ntrziat i extinderea n numr i volum a granuloamelor s-au meninut
diminuate pn la 120 de zile dup infecie comparativ cu grupul de oareci tipul
slbatic.
M o g l i o n e, J. P., e t a l. 2 0 0 7 (199 ) au constatat c infecia oarecilor
BKO cu 100 UFC din tulpina Erdman de M. tuberculosis a determinat creterea
produciei de IL-10 n pulmoni, n timp ce IFN-, TNF- i IL-10R au rmas
neschimbate la oarecii din tipul slbatic. De asemenea, la oarecii BKO s-a
nregistrat creterea succeptibilitii la infecie i ncrctur bacilar ridicat n
pulmoni i redus sau absent n splin i ficat chiar atunci cnd oarecii au fost
infectai pe cale aerogen cu 300 UFC de M. tuberculosis. Transferul de celule B la
oarecii BKO a confirmat rolul acestora n modularea rspunsului imun al gazdei i
controlul asupra numrului de bacili din coninutul tuberculilor.
Faptul c celulele B au fost identificate n centrii germinali din pulmonii
oarecilor cu tuberculoz pulmonar explic rolul incontestabil al acestei populaii
de celule n mecanismul de aprare a gazdei mpotriva infeciei cu M. tuberculosis.

Celulele T.

Celulele T aparin unui grup de celule albe ale sngelui fiind cunoscute i sub
denumirea de limfocite T , joac un rol extrem de important n imunitatea mediat
celular (IMC) . 62
Abreviaia T atribuit acestei populaii de celule deriv de la thymus
principalul organ unde se dezvolt celulele T.
Celulele T se difereniaz de alte tipuri de celule , aa cum sunt: celulele B i
celulele natural killer (NK), prin prezena pe suprafaa lor a unui receptor
denumit receptorul celular T (TCR).
Receptorul Celular T (TCR) , este o molecul prezent pe suprafaa celulei T
avnd responsabilitate n recunoaterea antigenelor legate la moleculele complexe
majore de histocompatibilitatea (MHC).

67
 Cercetrile imunochimice au stabilit c receptorul celular T ( TCR) este un
heterodimer alctuit dintr-un lan i un lan la 95 % dintre celulele T n timp ce
o parte dintre acestea, reprezentnd 5 %, posed TCR alctuit dintr-un lan i un
lan .
n urma interaciunii receptorului celular T (TCR) cu complexul MHC
peptid antigen rezult activarea vcelulei T datorit unor procese biochimice
mediate de enzime asociate, co-receptori i accesorii specializate .
Ambele lanuri din structura TCR au funcii similare unei imunoglobuline cu
N-terminal n domeniul variabil V (ig-variabil), motiv pentru care majoritatea
imunologilor au ncadrat acest receptor n superfamilia imunoglobulinelor. De
asemnea, n structura lanului TCR s-au mai evideniat : un domeniu constant C
(Ig-constant), un segment transmembranal i o prelungire n citoplasma celulei cu
C-terminal.
Domeniul variabil al lanului TCR- i al lanului TCR- posed 3 regiuni
hipervariabile denumite regiuni complementare determinante (CDR), dar
regiunea variabil a lanului posed o zon suplimentar de hipersensibilitate
(HV4) care n mod normal nu se leag la antigen i de aceea nu este considerat
determinant.
CDR3 este responsabil de recunopaterea antigenului procesat, dei s-a
dovedit c CDR1 din componena lanului interacioneaz cu poriunea N-
terminal a peptidei antigen, aceeai zon al lanului nu particip la
recunoaterea antigenului dar s-a dovedit c interacioneaz cu componente
antigenice a cror lanuri peptidice au lungimi considerabile.
Domeniul constant al TCR este compus din secvene scurte de conexiune n
care depozitele de cistein formeaz puni disulfidice de legtur ntre cele dou
lanuri.
Mecanismelele de formare a TCR sunt similare cu cele descrise pentru
receptorii celulari B. Formarea TCR este rezultatul recombinrii genelor regionale
V,D,J sub impulsul unei secvene semnal de recombinare (RSS) i un grup de
enzime denumite recombinaze VDJ.
J a n n e w a y , C. A. j r. e t a l . , 2005, (134) definesc recombinarea TCR ca
un mecanism de rearanjare genetic specific vertebratelor care selecteaz aleator
i asambleaz segmentele de gene care codific proteinele specifice cu rol improtant
n sistemul imun.
Lanul -TCR, este format n urma recombinrii poriunii ntre domeinul V
pn la J.
Lannul -TCR, se realizeaz prin recombinarea domeniilor VJ:
Pentru formarea lanului -TCR este necesar recombinarea domeniilor VJ i
domeniilor V(D)J pentru lanul TCR .
Secvenele semnal de recombinare (RSS) sunt compuse din 7 nucleotide
(heptameri) localizate n vecintatea genei care codific o secven de 12-23
nucleotide neconservate urmat de un monomer conservat format din 9 baze
perechi.
Aceste secvene semnal sunt prezente n poriunea a 3-a inferioar a regiunii
V i n poriunea a 5-a superioar a regiunii J. Ele sunt segmenetele care vor fi
implicate n realizarea legturilor.
Recombinazele VDJ, se refer la un grup de enzime din care unele au
specificitate pentru limfocite dar sunt exprimate in multe alte tipuri de celule (176).
Etapele iniiale ale recombinrii V(D)J sunt realizate prin participarea
exclusiv a enzimelor specifice pentru limfocite denumite; gena 1 i gena 2 care
activeaz recombinarea (RAG1 i RAG2 ).

68
 Pentru recunoaterea secvenelor RSS, acestea se asociaz cu alte enzime aa
cum sunt: protein-kinazele, artemis-nucleaza, diverse polimeraze-ADN .a. care
produc clivajul pe unul din filamentele ADN declannd un atac asupra
nucleotidelor componente i formarea unui la n form de agrafcu
participaresa proteinelor RAG (176).

Dezvoltarea celulelor T.

Dup cum s-a precizat anterior, celulele T se dezvolt n timus. Toate

limfocitele T produse de celulele Stemmigreaz din mduva osoas i populeaz
timusul unde se mulesc prin diviziune i formeaz o populaie numeroas de
timocite imature (258).
Iniial, timocitele imature nu exprim pe suprafaa lor nici CD4 i nici CD8,
motiv pentru care ele au fost considerate celule T dublu negative (CD4- ; CD8-) dar
n cursul evoluiei lor, aceste celule dezvolt la suprafa receptori CD i capt
statutul de timocite dublu pozitive (CD4+;CD8+).
n etapa final, cnd devin mature, celuleleT se difereniaz prezentnd la
suprafa una din cele dou tipuri de molecule CD: CD 4+ i CD8- sau CD4- i CD8+ .
Astfel desvrite, celulele T prsesc timusul i se localizeaz n esuturile
periferice. Aproximativ 98% dintre timocite mor n cursul proceselor de dezvoltare
n timus n absena seleciei pozitive sau negative i numai 2% supravieuiesc i
prsesc timusul pentru a deveni celule mature imunocompetente.
a. Seleia pozitiv, se refer la trierea celulelor T care sunt capabile s
interacioneze cu moleculele complexe majore de histocompatibilitate (MHC).
Timocitele dublu pozitive migreaz n profunzimea cortexului unde sunt
prezentate antigenului-self (anigen care aparine celulelor gazdei) asociat cu
moleculele MHC de pe suprafaa celulelor corticale epiteliale.
Vor primi semnalul de supravieuire numai acele timocite care sunt
capabile s lege compelxul antigen/MHC cu afinitate corespunztoare. Acele celule
T incapabile s interacioneze cu MHC i cu complexe peptidice, mor prin
apoptoz(moarte celular programat) i sunt nglobate n macrofage.
O alt particularitate a seleciei pozitive se refer la faptul c celulele T dublu
pozitive selectate iniial, suport o selecie pozitiv difereniat, astfel:
celulele T selectate pe molecule MHC cl.II vor deveni celule TCD 4+ i cele care sunt
selectate pe molecule MHC.cl.I devin celule TCD8+ .
Cu toat rigurozitatea dovedit n cursul seleciei totui, acest proces nu
nltur n totalitate posibilitatea ca unele timocite s reacioneze cu alte celule
proprii organismului gazd cauznd diverse stri de autoimunitate. Organismul
gazd apleaz ns la o nou faz de ndeprtare a acestor celule cu influen
negativ asupra sistemului imun, denumit selecie negativ .
b. Selecia negativ , se bazeaz pe trierea acelor timocite care reacioneaz
mpotriva peptidelor self prezentate de MHC.
Timocitele care au supravieuit seleciei pozitive , migreaz ctre grania
cortexului i n medular unde sunt prezentate din nou complexului antigen-
self/MHC de pe celulele prezentatoare de antigen (APC) cum sunt: macrofagele
(Mf) i celulele dendritice (Cd).
Timocitele care interacioneaz pronunat cu antigenul-self primesc un
semnal apoptic determinnd moartea acestora.
Marea majoritate a timocitelor produse iniial, sunt distruse n cursul seleciei
timice.

69
 Maturarea celulelor T.

Maturarea celulelor T are loc n timus; primul pas este rearanjarea regiunii
variabile de legare i regiunii constante din genele lanului receptorului pentru
antigen al celulelor T (TCR) ntr-o manier similar cu cea observat n sinteza
imunoglobulinelor; de fapt n ambele situaii sunt implicate aceleai enzime.
Producerea unui lan TCR funcional presupune expresia CD4 i CD8 care
induc rearanjri genetice i n final, formarea unui complex funcional TCR cu
participarea efectiv a markerului CD3. n aceast faz unele limfocite sunt blocate
n sinteza CD8 dar produc numai CD4.
n continuare celulele T sunt iniiate s nu atace esuturule self i s rspund
la un antigen strin numai dac acesta este ataat la o molecul complex de
histocompatibilitate (MHC). Procesul de iniiere se realizeaz prin selecie pozitiv
i selecie negativ.

Activarea celulelor T.

Activarea celulelor TCD4+ este rezultatul a dou semnale model i apare ca

urmare a interaciunii ntre complexul TCD28 - peptidele MHC i membrii familiei
B7 de pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen (APC). Ambele semnale sunt
necesare pentru un rspuns imun eficient. S-a observat c numai semnalul transmis
de receptorul CD28, denumit receptor de co-stimulare, sau absena acestuia
determin starea de anergie. De aceea, calea de semnalizare include att receptorul
CD28 ct i receptorul celular TCR .
1. Primul semnal, este furnizat de legtura TCR specific la o peptid cu lan
scurt ataat la complexul major de histocompatibilitate (MHC) sau la alte celule ,
asigurnd c numai acele celule T care posed TCR specific pentru acea peptid va
fi activat. Celula partener este deobicei o celul dendiritic (Cd), specializat n
prezentarea antigenului (APC), specializat n prezentarea antigenului (APC) n
cazul rspunsurilor naive dar i macrofagele (Mf) i celulele B fac parte din
familia celulelor prezentatoare de antigen (APC). Peptidele prezentate la TCD 8+ de
ctre moleculele MHC cl.I au n componen 8-9 aminoacizi n timp ce peptidele
prezentate de moleculele MHC cl.II la celulele TCD 4+ c0nin aproximativ 25 de
aminoacizi aa nct recunoaterea difereniat a complexelor peptide-
antigen/MHC sunt deter-minate de configuraia i mrimea canelurilor poriunilor
terminale ale MHC.
2. Al doilea semnal , este transmis de receptorul de co-stimulare prezent pe
suprafaa celulelor prezentatoare de antigen (APC) care primesc un numr limitat
de stimuli, deobicei produse ale agenilor patogeni, i produse rezultate din
alterarea celular, aa cum sunt corpusculii necrozani sau proteinele de oc
termic.
Al doilea semnal asigur celulele T c pot s rspund numai la un anumit antigen
i n acelai timp transmite informaii acestora n scopul prevenirii rspunsurilor
imune nedorite la antigene-self.
n mod obinuit, peptidele-self nu vor fi prezentate cu co-stimulator
corespunztor.

Tipuri de celule T.

n cadrul populaiei de celule T au fost descrise mai multe subseturi, fiecare

cu funcii distincte.

70
 Celule T-helper (celule efectoare, celule Th sau celule T-ajuttoare). Sunt
cunoscute i sub denumirea de celule T intermediare ale sistemului imun de
adaptare. Acest grup de celule joac un rol important n stabilirea i amplificarea
capacitilor sistemului imun.
Deobicei, ceulele T-helper (Th) nu au activitate citotoxic i nici funcii
fagocitare, motiv pentru care ele nu sunt responsabile de distrugerea altei celule
infectate i nici a agenilor patogeni liberi.
Rolul celulelor T-helper (Th) este esenial n determinarea claselor de
anticorpi produi de celulele B, n activarea celulelor citotoxice i n amplificarea
activitii bactericide a fagocitelor reprezentate de macrofage i celulele dendritice
(Cd).
Celulele T-helper (Th) mature exprim la suprafa proteina CD4. Toate
celulele T-helper (Th) care exprim aceast protein au fost identificate ca celule T-
CD4+ cu rol predefinit pentru celulele T-helper n cadrul sistemului imun, cu toate
c exist rare excepii cnd pe suprafaa unui numr extrem de mic de celule T-
supresoare (Ts), celule T- natural killer (NK) i celulele T- citotoxice (Tc) a fost
observat proteina CD4.
Importana celulelor T-helper (Th) a fost clar evideniat n infecia cu virusul
imunodeficienei umane (HIV), un agent patogen care afecteaz celulele T-CD 4+
inclusiv celulele Th, n ultimul stadiu al bolii, se remarc scderea dramatic a
numrului celulelelor T-CD4+ funcionale determinnd instalarea stadiului
simptomatic cunoscut sub numele de sindromul deficienei imune ctigate
(SIDA).
Activarea celulelor T-naive. Celulele T-helper (Th) care nu au venit n
contact niciodat cu un antigen cunoscut, la care ar putea s rspund, sunt
denumite celule T-helper naive. Similar tuturor celulelor T, ele prsesc timusul
i se rspndesc n toate organele, esuturile adiacente i nodurile limfatice , pre-
zentnd la suprafa complexul de receptori celulari T-CD3. Regiunea variabil a
receptorului celular TCR are rol hotrtor stabilind crui tip de de antigen ar putea
s rspund celula Th.
Celulele T-CD4+ au afinitate pentru moleculele complexe majore de histo-
compatibilitate cl.II (MHC cl.II) care sunt localizate numai pe celulele
prezentatoare de antigen (APC): celule dendritice primare (Cd), macrofage (Mf) i
chiar celule B. Exist cteva excepii cnd unele celule prezentatoare de antigen
(APC) , aa cum sunt celulele dendritice foliculare, pot prezenta antigene
neprocesate pe MHC dar aceste antigene nu interacioneaz cu celule T i nu sunt
implicate n activarea lor. Antigenele care se leag la MHC sunt fr excepie
peptide cu lan scurt format din 8-10 aminoacizi, pentru MHC cl.I i pn la 25 de
aminoacizi pentru peptidele care se leag la MHC.cl.II.
Activarea celulelor Th se realizeaz n dou etape distincte: recunoaterea
(semnalul 1) i controlul (semnalul 2) sau verificarea proteciei fa de existena
posibil a celulelor cu funii autoimune.
a. Recunoaterea (semnalul 1). n cursul rspunsului imun, celulele prezenta-
toare de antigen (APC) endociteaz materialul strin (bacterii, virusuri, etc) care
este supus procesrii i apoi difuzeaz de la locul infeciei n nodurile limfatice. Aici
celulele prezentatoare de antigen (APC) prezint complexele peptide-antigen/MHC
receptorilor TCR specifici anti complexe peptide/MHC care se activeaz. Realizarea
unei legturi solide ntre complexul CD3-TCR i complexul peptid-antigen/MHC
precum i legarea co-receptorului la o secven diferit a moleculei MHC permit
att kinazelor intracelulare prezente pe TCR ct i proteinelor CD3 i CD4 s
activeze fiecare alt cale de fosforilare.

71
 Sub controlul unei fosfataze prezent n poriunea intracelular a CD45,
aceste molecule activeaz cile biochimice majore din citosolul celulei Th definind
semnalul 1 al activrii celulelor T. Acesta este considerat semnalul primar de
co-activarea unei celule Th. Urmtoarele contacte cu antigenul cunoscut determin
reactivarea celulelor T cu memorie pe aceeai cale TCR.
Pe de alt parte, s-a dovedit c n structura moleculei CD45 se gsesc diferii
izoformi care i modifc dimensiunile n funcie de activarea celulelor. De
exemplu, la celulele Th activate, CD45 are lungimea redus semnificativ, comparat
cu lungimea CD45 a celulelor Th neactivate.
Modificarea lungimii CD45 permite s se realizeze uor interaciunile celulare,
activarea celulelor Th i n final transformarea n celule T efectoare.
b. Verificarea (semnalul 2), se bazeaz pe activarea unei ci biochimice in-
dependente i reprezint o msur protectiv care garanteaz c celula T este
capabil s rspund numai la un anumit antigen strin organismului gazd. Lipsa
acestui semnal n cursul contactului iniial ntre celula T i antigen conduce la
apariia celulelor T autoreactive, situaie n care asemenea celule devin anergice,
stare generat de schimbri biochimice neprotejate ale semnalului 1.
Celulele anergice nu vor rspunde n viitor la nici un stimul antigenic, chiar
dac ulterior ambele semnale descrise au acionat pozitiv. Dei aceste celule circul
n tot organismul gazd ele nu au nici o valoare imunologic pn la dispariie prin
apoptoz.
Stadiul de verificare a capacitii de recunoatere i selectarea a antigenului
pentru activarea celulelor T naive a fost mai bine demonstrat n cursul activrii
celulelor T-CD8+ - citotoxice care se bazeaz pe activarea CD28 pentru a recunoate
antigenul strin. Totodat CD28 joac rol esenial n reducerea riscului apariiei
autoimunitii mpotriva antigenelor proprii organismului gazd.
Dac celulele T-naive au fost activate pe cele dou ci menionate mai sus,
schimbrile biochimice induse de semnalul 1 vor fi diminuate fr apariia anergi-
zrii i semnalul secund nu mai este strict necesar aa nct generaiile viitoare de
celule sunt iniiate pentru a rspunde eficient la o nou ntlnire cu acelai antigen.
Rspunsuri imune solide apar dup reinfecie datorit faptului c celulele T cu
memorie (Tm) au ctigat anterior confirmarea i pot produce mult mai rapid
celule efectoare.
Proliferarea. Imediat ce ambele semnale au acionat asupra celuleleor T
helper (Th), acestea ncep s prolifereze. Fenomenul eliberrii unor citokine
celulare pentru a controla propriul comportament este cunoscut sub denumirea de
autoreglare sau stimulare autocrin.
De exemplu, celulele T-NK ncep proliferarea sub aciunea interleukinei-2
(IL-2). Totui, interleukina-2 (IL-2) poate s acioneze i asupra altor tipuri de
celule T realiznd o stimulare paracrin.
Producerea de IL-2 de ctre celulele Th este util pentru proliferarea celulelor
T-CD8+ activate. Absena interaciunilor celulelor Th i lipsa IL-2 mpiedic
proliferarea celulelor T-CD8+ care devin anergice.
Diferenierea celulelor T-helper (Th). Dup maturarea mai multor generaii
de celule Th, descendenii acestora se difereniaz n: celule Th-efectoare, celule Th-
cu memorie (Tm) i celule Th- supresoare (Ts).
- Celulele Th-efectoare, sunt secretoare de citokine, proteine sau peptide care
stimuleaz sau interacioneaz cu alte leucocite, incluznd chiar i celulele Th;
- Celulele Th- cu memorie (Tm), menin afinitatea pentru un anumit antigen
recunoscut de celulele T originale activate, avnd funcie efectoare n cursul rs-
punsului imun secundar, cum ar fi: o reinfecie a organismului gazd n ultimul
stadiu;
72
 - Celulele Th- supresoare (Ts), nu ndeplinesc funii imune dar acioneaz la
diminiuarea rspunsului imun sau bl0carea acestuia. Dei numrul celulelor T-
supresoare (Ts) este redus, acestea joac rol important n limitarea rspunsului
imun-self; de asemenea, celulele T-supresoare (Ts) sunt implicate n prevenirea
apariiei i evoluiei diferitelor boli autoimune.
Pe baza profilului lor imunologic, celulele Th se clasific n: celulele T-helper
-1, celulele T-helper-2 (Th2), celulele T-helper-3 (Th3) i celule T-helper -17 (Th17)
Celulele T-helper-1 (Th1), au ca partener principal macrofagul. Celulele Th1
stimuleaz sistemul imun celular, activitatea microbicid a macrofagelor i proli-
ferarea celulelot T-citotoxice (TCD8+).
De asemenea, celulele Th-1 sunt productoare de gamma-interferon (IFN) i
n acelai timp stimuleaz celulele dendritice (Cd) i macrofagele (Mf) s elibereze
cantiti crescute de interleukina-12 (IL-12) care, prin mecanismul feed-back ,
intervine n iniierea celulelor Th pentru a produce gamma-interferon (INF) i
consolidarea profilului Th1.
Totodat, inhib producia interleukinei-4 (IL-4) care acioneaz pentru
promovarea rspunsului imun propriu de tip 2 (Th2).
Celulele t-helper-2 (Th2), au ca partener celula B. Acest subset de celule sunt
productoare de IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13; au funcii importante n producia de
anticorpi prin stimularea proliferrii celulelor B i inducerea de anticorpi celulari B.
Celulele Th2 promovez un profil propriu de rspuns imun de tip 2 untiliznd
dou citokine diferite.
Alte date din literatura de specialitate sugereaz c n afar de influena
citokinelor asupra profilului de rspuns imun, concentraia antigenului prezentat la
celula T n timpul activrii primare, influeneaz tipul de rspuns imun selectat.
ncercrile de clarificare a modului cum influeneaz citokinele tipul de
rspuns imun au rmas fr rezultate concrete. Totui, s-a observat c citokina IL-
10 de tip uman supreseaz proliferarea i producia de citokine a tuturor celuleolor
T i macrofagelor dar stimuleaz activitatea celulelor plasmatice (plasmocite) i n
final producia de anticorpi.
Celulele T-helper-3 (Th3), sunt cunoscute sub denumirea de celuleT-
reglatoare natural sau celule T de supresie datorit funciei lor supresoare
asupra sitemului imun. Aceste celule produc factorul de transformare a creterii
(TGF) i interleukina-10 (IL-10), ambele citokine avnd rol inhibitor asupra
celulelor Th.
Cercetri recente au demonstrat c TGF- nu este capabil s supreseze
activitatea celulelor Th2 dei activitatea celulelor T naive este diminuat semni-
ficativ prin prezena acestei citokine care nu este considerat tipic pentru celulele
Th2 (96,316).
Celulele T-helper-17 (Th17), iniial au fost descrise de H a r r i g t o n , L. E.,
e t a l ., 2 0 0 5, (113) ca o populaie patogen implicat n autoimunitate dar n
prezent se consider c ele posed efectori proprii distinci i funcii reglatoare .
Celulele T-citotoxice,celulele T-killer sau celulele TCD 8+(Tc), aparin
grupului limfocitelor T i sunt capabile s produc moartea celular a celulelor
somatice i a altor celule infectate cu virusuri sau ali microbi patogeni, sau care au
suferit alte disfuncii. Majoritatea celulelor T-citotoxice (Tc) exprim receptori
celulari TCR care pot s recunoasc un antigen-peptid specific legat la
moleculele complexe de histocompatibilitatea cl.I (MHC cl.I). de asemnea, la
suprafaa celulei T-citotoxic este exprimat glicoproteina CD8 care se leag la
poriunile invariabile ale MHC.cl.I.

73
 Afinitatea ntre CD8 i MHC cl.I caracterizeaz legtura strns care se
realizeaz ntre celula Tc i celula int n cursul activrii specifice antigenic i
transformrii lor n celule TCD8+ cu rol predefinit citotoxic n cadrul sistemului
imun.
Dezvoltarea celulelor T-citotoxice (Tc). n general, dezvoltarea celulelor T-
citotoxice (Tc) urmeaz ci i etape similare cu cele prezentate pentru alte populaii
i subpopulaii de celule T prin: recombinarea segmentelor VDJ ale lanului -
TCR-DNA i formarea unei proteine precursor (TCR-precursor). Dup rearanjarea
lanului -TCR se produce recombinarea lanului -TCR-DNA i constituirea
complexului -TCR, un produs cu nalt variabilitate genetic n cadrul genelor
TCR. Variabilitatea genetic a complexului -TCR genereaz milioane de celule T
cu o multitudine de receptori TCR cu caracteristici distincte permind sitemului
imun s rspund la orice protein strin care invadeaz organismul gazd.
Diferenierea ntre celulele T-citotoxice (Tc) dublu pozitive (TCD 4+ ;TCD8+) se
realizeaz prin selecie pozitiv, n baza creia celulele cu reactivitate slab fa de o
varitate larg de antigene-self prezentate de MHC sufer procesul de apoptoz.
Selecia negativ prin care celulele T dublu pozitive care reacioneaz puternic la
antigene-self au tendina de a se transforma n celule autoreactive i aceste celule
mor prin apoptoz.
Celulele care supravieuiesc seleciei pozitive i negative se difereniaz n
celule T pozitive CD4+ sau celule TCD8+ . Suferind procesul de maturizare, celulele
TCD8+ se transform n celulele T-citotoxice prin activare cu un antigen
restricionat pe MHC cl.I.
Activarea celulelor T-citotoxice (TCD8+), este dependent de diverse inter-
aciuni similare ntre molecule exprimate pe suprafaa membranei celuleleor T i
molecule de pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen (APC) i se realizeaz
prin dou semnale model:
-primul semnal, stabilete legtura ntre receptorul TCR i complexul peptid
antigen/MHC cl.I i interaciunea secundar ntre receptorul CD8 i MHC cl.I.
-al doilea semnal este transmis moleculei CD28 de pe celula T i
proteinelor CD80 i CD86 aparinnd MHC cl.I. Proteinele CD80 i CD86 sunt
cunoscute sub denumirea de co-stimulatori. Al doilea semnal acioneaz sub
impulsul IL-2 eliberat de celulele T-helper (Th) care stimuleaz expresia clonal a
celuleleor T-citotoxice (Tc).
Funciile efectoare ale celulelor T-citotoxice (TCD 8+). Atunci cnd vin n
contact cu celule somatice infectate cu virusuri bacterii sau ali ageni patogeni sau
cu celule manifestnd diverse disfuncii, celulele T-citotoxice (TCD 8+) elibereaz
porfirine i granulisin, molecule citotoxice implicate direct n procesul de
distrugere al celulei int.
Perforinele strpung memebrana extern a celulei int i formeaz pori care
permit granzinelor (serinproteaze) s patrund n celula int i s activeze o serie
de enzime citolitice.
Pe de alt parte, celulele T-citotoxice (Tc) pot s distrug celula int utiliznd
calea interaciunilor de suprafa ntre celula T-citotoxic (Tc) i celula int. O
celul T-citotoxic (Tc) activat exprim la suprafa proteine denumite liganzi
FAS (FASL) care pot fi captai de liganzi omologi prezeni pe celula int . Aceast
interaciune Fas-Fas pare a fi mult mai important pentru activitatea litic a
diferitelor celule Th dect activitatea similar a celulelor Tc efectoare.

74
 Celulele T naive, reprezint acel grup de celule T care sunt difereniate n
mduva osoas i care suport cu succes procesele de slecie pozitiv i negativ din
timus.
Celulele T naive exprim la suprafaa lor selectina-L (CD62L) dar lipsesc
martorii de activare CD25, CD44, CD69 i markerii de memorie isoformi CD45.
n stadiul naiv, celula T rmne pasiv, nu se divide i, pentru supravieuire
homeostatic, necesit citokine cu lan gamma comun, cum sunt: IL-7 i IL-15.
Celulele T naive au capacitatea de a rspunde la un agent patogen nou, pe
care sistemul imun nu l-a recunoscut anterior, ca urmare a apariiei de clone ale
celulelor T naive specifice fa de antigenul cunoscut care contribuie la iniierea
rspunsului imun ctigat.
Prin activare fenotipic (CD25, CD44, CD69), celulele T se difereniaz n
celule T cu memorie (Tm).
Celulele T cu memorie (Tm), constituie un subtip specific n cadrul
populaiei de celule T cu funcii deosebit de importante n aprarea organismului
gazd mpotriva agenilor strini. Pe aceste criterii, celulele T cu memorie (Tm)
sunt denumite limfocite, avnd capacitatea de a recunoate agresori cum sunt
virusuri, bacterii .a. cu care organismul gazd a venit n contact n cursul infeciei
primare sau n urma vaccinrilor.
O nou ntlnire a celulelor T cu acelai agresor, generaz un rspuns imun
semnificativ mai crescut dect rspunsul primar.
Celulele T cu memorie (Tm) se grupeaz n 3 subpopulaii:
- Celule centrale T cu memorie (Tcm), reprezentate de celulele Stem cu
memorie, manifest o abilitate evident fa de un antigen self reconstituit
datorit nivelului ridicat al fosforilrii unui factor important de transcripie
cunoscut sub denumirea de STAT5 (1).
Celulele T centrale cu memorie Tcm exprim pe mebrana lor extern L- se-
lectina i receptorul pentru chemokine CCR7 i secret IL-2. Nu secret IFN- i
IL-4 .

3.1.2.5. Interleukinele i chemokinele.

Interleukinele (citokinele) pro i anti inflamatorii sunt mediatori solubili

care joac un rol esenial n reglarea rspusului inflamator i proceselor antiinfla
matorii provocate dup recunoaterea M. tuberculosis de ctre macrofage i celule
dendritice. De obicei aceste substane sunt produse de limfocite i ele stimuleaz
sau inhib cel puin una din funiile altor celule limfoide (limfocite T sau B) sau
nelifoide, aa cum sunt: macrofagele, celulele dendritice .a.
n literatura de specialitate sunt descrise dou grupe de interleukine
(citokine):
a. Interleukinele (citokinele) proinflamatoare, sunt acei mediatori
care activeaz procesul inflamator i din acest grup fac parte:
- Factorul pentru Necroz Tumoral- (TNF-). Stimularea monocitelor,
macrofagelor (16) i celulelor dendritice cu micobacterii sau produse mico-
bacteriene induce producia Factorului pentru Necroz Tumoral (TNF-),
prototipul citokinei proinflamatoare.
TNF- joac rol cheie n formarea granulomului tuberculos prin aceea c in-
duce activarea macrofagelor i are proprieti imuno-reglatoare (65, 264).
Experimentele pe oareci au artat c TNF- este important pentru con-trolul
infeciei latente n granulom (198). Alte lucrri de specialitate au demonstrat
suplimentar c TNF- mpreun cu alte citokine i ali markeri celuleri de
suprafa, intervin n procesele inflamatorii din granulomul tuerculos (290).
75
 La bolnavii cu tuberculoz, producia de TNF- a fost observat la locul
infeciei (11, 35, 163). Perturbaiile sistematice al TNF- pot s produc efecte nedorite
ca febra i alterarea strii generale. S-a constatat c ntreruperea timpurie a
tratamentului specific pentru tuberculoz a fost nsoit de creterea a TNF- n
plasm (18) dar revenirea rapid la tratament a produs scderea concentraiei
acestei citokine n plasm(126). Aceste constatri au fost susinute de rezultatele
experimentelor cu oareci KO prentru gena responsabil de producia de TNF- sau
experimente cu celule lipsite de receptorul TNF-p55 care au dovedit
susceptibilitate crescut la infeciile cu micobacterii (85). Pe de alt parte, s-a
observat c utilizarea anticorpilor monoclonali anti TNF- n boala lui Crohn i
artrita reumatoid a fost nsoit de reactivarea tuberculozei, inclusiv forma miliar
i tuberculoza extra-pulmonar (144).
Studiile privind existena unor eventuale mutaii n cadrul genelor TNF- nu
au consemnat rezultate pozitive i nici nu au fost observate relaii ntre
polimorfismul genetic al TNF- i susceptibilitatea la tuberculoz (24, 106).
- Interleukina -1(IL-1), este a doua citokin proinflamatoare implicat n
rspunsul imun al gazdei mpotriva M.tuberculosis. IL-1 este produs n special de
monocite, macrofage i celulele dendritice (282,163).
La bolnavii cu tuberculoz, IL-1 este eliberat n exces chiar la locul infeciei
(293). n modelele experimentale cu oareci KO a genelor pentru IL-1 i IL-1 i
oareci cu deficien n receptori celulari tip 1 pentru IL-1 (IL-1R) s-a demonstrat c
dezvoltarea micobacteriilor este accentuat i formarea granulomului este
perturbat dup infecia cu M. tuberculosis (51). Halotipurile IL-1 i IL-1R au fost
inegal distribuite la 90 de pacieni hindui din Londra, diagnosticai cu tuberculoz;
creterea ratei produciei IL-1 fa de producia IL-1Ra a fost mult mai frecvent la
pacienii cu tuberculoz pleural dect n alte forme de tuberculoz.
Bazndu-se pe faptul c, n general pleurezia tuebrculoas este forma de boal
care se autorezolv, autorii studiului au emis ipoteza potrivit creia o cretere a
raportului IL-1/IL-1Ra duce la protecia mpotriva unor forme mult mai grave de
tuberculoz (274).
-Interleukina-6 (IL-6), este produs n focarul de infecie cu micobacterii n
stadiul incipient al bolii i are proprieti att proinflamatoare ct i
antiinflamatoare. n anumite situaii IL-6 poate fi duntoare n infeciile
micobacteriene ; ea inhib producia de TNF- i IL-1 i promoveaz in vitro
creterea Mycobacterium avium (311).
Alte lucrri de specialitate evideniaz rolul protector al IL-6, argument
susinut de experimente pe oareci cu deficien n IL-6 a cror susceptibilitate la
infecia cu M.tuberculosis a fost semnificativ crescut (154). Unii cercettori sunt de
prere c deficiena n IL-6 ar fi corelat cu scderea notabil a produciei de IFN-
n infecia incipient (293) .
-Interleukina-12, elementul cheie n mecanismul de aprare mpotriva
infeciei cu M. tuberculosis, este produs de fagocite. Se pare c producia de IL-12
depinde de fagocitarea M. tuberculosis i are rol crucial n producia de INF-
(46,308).
n tuberculoz, IL-12 a fost detectat n infiltratele pulmonare, n pleurezie, n
granuloame i n limfadenite(131). n acelai timp, s-a observat o cretere important
a exprimrii receptorilor pentru IL-12 la locul infeciei (111).
Rolul protector al IL-12 mpotriva infeciilor cu micobacterii a fost demonstrat
n experimente pe oareci cu gene pentru IL-12 distruse (oareci IL-12 -/- ) care au
dovedit susceptibilitate remarcabil la infeciile cu M. tuberculosis comparativ cu
oarecii normali din punct de vedere genetic.

76
 La pacienii care sufereau de infecii micobacteriene intercurente
netuberculoase, au fost detectate mutaii genetice n rndul genelor care codific
IL-12p40 i IL-12R (230, 52). n asemenea cazuri s-a observat capacitatea redus a
celulelor T pentru producie de IFN- (223). n mod similar, defectul genei care
codific receptorul IL-12R (receptorul celular pentru IL-12) s-a constatat n cazul
tuberculozei abdominale la oameni.
Aadar, IL-12 poate fi considerat ca o citokin reglatoare care intervine n
conectarea rspunsului imun nscut i de adaptare al gazdei fa de micobacterii
care exercit efecte protectoare proprii prin inducerea produciei de IFN-
- Interleukina-18(IL-18) i interleukina 15 (IL-15). Cele dou citokine au rol
important n producia de IFN-.
Interleukina-18 (IL-18) are proprieti similare cu IL-1, dei iniial a fost
considerat ca un factor inductor cu aciune sinergic cu IL-12. Totodat, s-a
constatat c IL-18 stimuleaz producia altor citokine proinflamatorii, chemokine i
factori de transcripie (206, 67). oarecii KO-IL-18 au evideniat susceptibilitate
crescut la infecia cu M.tuberculosis, fa de M. bovis-BCG i fa de M.leprae. n
experimente similare, s-a demonstrat c rezistena crescut la infecia cu
micobacterii se coreleaz cu exprimarea n exces al IL-18, cu efect major n
inducerea produciei de IFN- (752,67,250). Asemenea constatri au fost confirmate la
pacienii cu pleurezie tuberculoas unde s-a observat o corelaie strns ntre
concentraiile de IL-18 i cele de IFN-. De asemenea, producia mediat de M.
tuberculosis a IL-18 de ctre celulele mononucleare din sngele periferic a fost
sczut la pacienii cu tuberculoz i aceasta s-a odvedit responsabil de reducerea
produciei de IFN- (317).
- Interleukina-15 (IL-15), are activiti bilogice similare cu cele ale IL-2,
stimulnd proliferarea i activarea celulelor T i celulelor NK .
Se deosebete de IL-2 prin aceea c este sintetizat de monocite i macrofage
(148,10,180).
S-a observat c mARN-ul interleukinei-15 (IL-15) a fost exprimat mult mai
pregnant n cazurile cu rezisten fa de lepra tuberculod dect n forma lepro-
matoas .
Cu privire la rolul IL-15 n tuberculoz exsit extrem de puine date i cele
mai multe sunt incomplete i neclare (10).
- Gamma-interferonul (IFN-). Rolul protector gamma-interferonului (IFN-
) n tuberculoz a fost larg studiat, n primul rnd n contextul celulelor T specifice
antigenic. Producia de gamma-interferon (IFN-) specific pentru antigene
micobacteriene in vitro poate fi utilizat ca un indicator n infecia cu M.
tuberculosis (98,255,281,166,166,30). n special pacienii cu rezultat negativ la testul
intradermotuberculinic (IDR) nu au evideniat producie crescut de IFN- cnd
cultura de celule din sngele periferic a fost stimulat in vitro cu ajutorul
derivatului proteic (PPD) (77,190). Totui, J o h n s o n , B . J. i M c M u r r a y D.
N., 1 9 9 4,(136) au artat c att la pacienii cu testul PPD pozitiv dar i la cei
negativi PPD, monocitele infectate cu M.tuberculosis invitro, coopereaz cu
limfocitele pentru a produce IFN- .
V a n C r e v e l, R. e t a l, 2 0 0 2, (193) au constatat c derivatele proteice
purificate (PPD) din M. tuberculosis induc selectiv producia de IFN- la indivizii
cu IDR pozitiv n timp ce produsele obinute din M. tuberculosis supus sonicrii,
care conin poliglicani i fosolipide induc neselectiv producia de IFN- att la
indivizii cu IDR pozitiv dar i la cei cu IDR negativ n schimb, asemenea produse
stimuleaz monocitele pentru a produce citokine similare cu TNF- i IL-1. (290).
Acestea, ca i IL-12 i Il-18, pot ndeplini funcia de co-stimulatoare pentru
producia nespecific de IFN- independent de antigen (195, 213).
77
 n mecanismul de producie nespecific a IFN sunt implicate cel puin 3
populaii de celule ale sistemului imun. Celulele NK ar putea fi principalii
productori de IFN ca rspuns la IL-12 i IL-18, sau direct prin stimuli eliberai de
oligonucleotidele micobacteriene atunci cnd imunitatea de adaptare iniiat de
celulele T a fost incomplet dezvoltat (100)(130). De asemenea, macrofagele
pulmonare s-au dovedit a fi productoare de IFN la oarecii infectai cu M.
tuberculosis dei constatarea nu a putut fi pe deplin confirmat (299). Totodat, s-a
demonstrat c celulele T care exprim receptori T i celuelele cu restricii n CD1
pot produce IFN n cursul infeciei tuberculoase incipiente. Ccelulele T pot s
recunoasc direct proteinele micobcteriene cu greutate molecular mic i liganzi
neproteici n absena moleculelor complexe de histocompatibilitate (MHC)
prezentatoare de antigen (235). La oareci, un preparat simplu cu M. tuberculosis
crete substanial numrul de celule T spre deosebire de celulele T(TCD4+ i
TCD8+ ) al cror numr a rmas constant n drenajele nodurilor limfatice (193). n
acelai timp, la oarecii infectai cu M. tuberculosis s-a observat acumulare excesiv
a celulelor T la locul infeciei considerate ca fiind necesare n infecia
tuberculoas incipient (42,31.214).
De asemenea, celulele T cu restricii n CD1 nu reacioneaz cu antigene
proteice micobacteriene pe calea MHC cl.I sau MHC cl.II, n schimb aceste celule
reacioneaz cu lipidele micobacteriene, aa cum este lipoarabinomananul (LAM) i
glicolipide (GL) care au legturi prefereniale cu moleculele CD1 de pe suprafaa
celulelor prezentatoare de antigen (APC-CD1). Moleculele CD1 au structuri
asemntoare cu MHC cl.I dar nu prezint polimorfism pronunat.
n infeciile micobacteriene, s-au evideniat mai multe subseturi de celule T,
cum ar fi : celulele T dublu negative (TCD4-; TCD8- ) dar i celuelele T simplu
pozitive TCD4+ sau TCD8+ i celulele T posed capacitatea de a interaciona cu
CD1 manifestnd activitate citotoxic i eliberare de IFN .
b. Interleukine (citokine) antiinflamatoare) . Sistemul imun mediatcelular are
capacitatea i resursele necesare pentru a echilibra rspunsul imun iniiat de mico-
bacterii, utiliznd numeroase mijloace printre care i mecanismele antiinflamatoare.
Aa dup cum s-a menionat anterior, IL-1 este contracarat de IL-1Ra care
joac rol de antagonist specific. De asemenea, receptorii solubili TNF-I i II previn
legturile citokinelor la la receptorii celulari blocnd semnalele suplimentare care ar
deregla funcionarea normal a sitemului imun al gazdei.
Grupa citokinelor antiinflamatoare cuprinde: interleukina-4 (IL-
4),interleukina-10 (IL-10), i factorul de transformare a creterii (TGF-) cu
aciune inhibitoare asupra produciei i efectelor citokinelor proinflamatoare.
-Interleukina-4 (IL-4). Efectele nedorite ale IL-4 n infeciile intracelulare se
evideniaz prin activitatea supresoare asupra produciei de IFN (236,8,66). La
oarecii infectai cu M. tuberculosis , evoluia progresiv i reactivarea infeciei
latente sunt asociate cu creterea produciei de IL-4 (116,118). Alte cercetri au ajuns la
concluzia c producia excesiv a IL-4 duce la intensificarea distrugerii esutului in
infecia experimental cu M. tuberuclosis (1740). Pe de alt parte, s-a constatat c
inhibiia produciei de IL-4 pare s nu susin imunitatea; oarecii cu deficiena
genei IL-4-/- au prezentat modificri n creterea susceptibilitii la micobacterii. Pe
baza acestor observaii s-a emis ipoteza c IL-4 ar putea fi mai degrab consecina
dect cauza dezvoltrii tuberculozei.

78
 Un studiu recent efectuat pe oareci KO-IL-4 a artat totui creteri n numr
i dimensiuni ale granulomului i dezvoltarea excesiv a micobacteriilor dup
infecie pe cale aerogen (269). Comparai cu oarecii de control, producia citokinelor
proinflamatoare a fost crescut la grupul de oareci KO-IL-4 i acest cretere s-a
asociat cu distrugeri tisulare excesive (284, 290, 269, 268). Exist preri care suin c IL-
4 ar fi doar expresia tuberculozei active la oameni i rolul acestei citokine n
susceptibilitatea la tuberculoz nu a fost pe deplin elucidat (159).
Interleukina-10 (IL-10) , este produs de macrofage dup fagocitoza M.
tuberculosis (9, 140, 254).
De asemenea, celulele T reactive pentru M. tuberculosis sunt capabile s
produc IL-10 (29, 104).
La pacienii cu tuberculoz, expresia mRNA-IL10 s-a observat n celulele
mononucleare circulante la locul infeciei n special n lichidul pleural i n lavajul
alveolar (12).
Unii cercettori au detectat in vitro producia de IL-10 n n culturi de celule
din sngele integral sau din lavaje pulmonare provenite de la oameni cu tuberculoz
pulmonar activ (127) dar aceste constatri nu au fost semnalate n alte studii (175).
Interleukina-1o (IL-10) are activitate antagonic pentru rspunsul n citokine
proinflamatoare, materializat n scderea produciei de IFN, TNF- i IL-12
Interleukina-10 (IL-10) rmne esenial n sistemul imun ntruct ea interfer cu
aprarea gazdei mpotriva infeciei cu M. tuberculosis (109).
- Factorul- de transformare a creterii (TGF-) , se pare c interacioneaz
cu imunitatea de protecie n tuberculoz similar cu IL-4. Produsele micobacteriene
induc secreia de TGF- (278).
Cercetrile lui D a h l K.E. e t a l . 1996 ,(58) au condus la concluzia c
lipoarabinomananii din micobacteriile virulente induc selectiv producie de TGF-.
TGF-; ca i IL-10, este produs n exces n cursul evoluiei tuebrculozei i este
exprimat la locul infeciei (49, 278).
TGF- supreseaz imunitatea mediat celular; acioneaz asupra celulelor T
inhibnd proliferarea acestora i n final producia de IFN, precum i asupra
macrofagelor blocnd prezentarea antigenelor, producia altor citokine i activarea
celular (278). Pe de alt parte, TGF- poate fi implicat n degradarea esuturilor i
n producerea fibrozei n cursul evoluiei tuberculozei, ca promotor al colagenazelor
n macrofage i al matricei de colagen (278).
Prezena inhibitorilor naturali ai TGF-elimin efectele supresive ale acestuia
asupra celulelor mononucleare de la pacienii cu tuberculoz i macrofagelor
infectate cu M. tuberculosis (121).
Unii autori sunt de prere c TGF- i IL-10 au aciune sinergic n cadrul
rspunsului antiinflamator; TGF- induce selectiv pro-ducia de IL-10 i ambele
citokine prezint sinergism n supresarea produciei de IFN. De asemenea, TGF-
este capabil s reacioneze cu IL-4 i n mod para-doxal, n prezena axcestei
citokine , celulele T pot fi orientate ctre un profil pro-tector tip Th1 (222).
n sintez, producia receptorilor citokinelor solubile i citokinelor
antiinflamatoare poate interveni n reglarea rspunsului inflamator n cursul
evoluiei tuberculozei.
Un rspuns proinflamator necontrolat se soldeaz cu distrugeri tisulare
majore aa cum s-a constatat la oareci KO-IL-4, n timp ce efectele
antiinflamatoare predominante pot favoriza dezvoltarea M. tuberculosis . Mai mult,
unii indivizi predispui la producie crescut a acestor citokine, se pare c manifest
sus-ceptibilitate nscut la M. tubrculosis, cu toate c, pn n prezent, aceast
predispoziie genetic nu a fost nc dovedit cu claritate la oameni (293).

79
 Chemokinele.

Sunt molecule chimice de natur diferit, care au responsabilitate major n

recrutarea celulelor inflamatoare la locul infeciei. n funcie de natura lor, chemo-
kinele pot manifesta un efect chemotactic pozitiv, aa cum sunt: polizaharidele
bacteriene, factorul chemotactic, diverse molecule din esuturi lezate , componentul
C5a al complementului, anafilatoxina .a. i un efect chemotactic negativ al
toxinelor bacteriene.
Studii recente asupra chemokinelor i rolul acestora n sistemul imun mediat
celular au identificat pn n prezent 40 de chemokine i 16 receptori ai acestora.
(313).
De asemenea, s-a demonstrat participarea unor chemokine n protecia
mpotriva infeciilor cu micobacterii cum sunt: interleukina-8 (IL-8), proteoina-1
monocit- chemotactant (MC-1), RANTES .a.
-Interleukina-8 (IL-8) . Mai multe lucrri de specialitate susin rolul
chemotactant al IL-8 pentru neutrofile, limfocite T i probabil monocite (311,138, 219).
Pn la fagocitarea bacililor tuberculozei s-au stimularea cu LAM,
macrofagele elibereaz IL-8 (138, 311). De asemnea, celulele epiteliale pulmonare, cele
din nodurile limfatice i din plasm produc IL-8 n cursul rspunsului la M.
tuberculosis (305,20,91,138).
Bolnavii care au decedat din cauza tuberculozei au prezentat concentraii
crescute de IL-8 n ser (91). Nivelul IL-8 i n lavajul alveolar a rmas crescut mai
multe luni dup continuarea tratamentului antituberculos (155,91). Autorii studiului
nu au reuit s detecteze factorii care menin secreia prelungit a IL-8 i datorit
faptului c, n mod curent, IL-8 are capacitatea chemotactic pentru neutrofile;
rspunsul neotrofilic nu apare proeminent n tub tuberculoz.
- Proteina-1-Chemotactant pentru monocite (MCP-1) , este produs prin
aciunea monocitelor i macrofagelor. Mycobacterium tuberculosis induce
preferenial producia de MCP-1 de ctre monocite (142). De asemenea, s-a dovedit
c oarecii cu deficien n 2C-c nu rspund la MCP-1 i manifest laten n
formarea granulomului cu evident supresare a celulelor TH1 pentru producia de
citokine (27) i dispariia la scurt timp dup infecia cu M. tuberculosis (232).
n lichidul de splare alveolar, n ser i n lichidul pleural provenind de la
bolnavii de tuberculoz au fost gsite cantiti importante de MCP-1 (138,197).
- RANTES, este a 3-a chemokin produs de o varietate larg de celule care
realizeaz legturi cu multipli receptori pentru chemokine.
Experimentele utiliznd modele murine au demonstrat c exprimarea acestei
citokine s-a asociat cu dezvoltarea granuloamelor pulmonare induse de M. bovis
(43). Ali cercettori, susin c n afar de IL- 8, MCP-1 i RANTES au fost detectate
i alte chemokine implicate n atragerea celulelor sistemului imun la locul infeciei
cu micobacterii (232) .
Inhibiia produciei de chemokine duce la un rspuns tisular local in-
suficient.Totui, datorit inutilitii sistemului chemokinelor, contribuia
individual a fiecrei chemokine este dificil de evaluat, motiv pentru care n unele
lucrri de specialitate se susien ideea c producia chemokinelor , cunoscute pn
n prezent, la pacienii cu infecii micobacteriene urmeaz s fie clarificat (293).

3.1.2.6. Patogeneza n tuberculoz.

Cile de ptrundere ale bacililor tuberculozei n organismele receptive sunt

multiple dar, cel mai frecvent infecia se realizeaz pe cale respiratorie i digestiv

80
prin inhalarea aerosolilor (picturilor Flger) rspndii in tipul tusei, sau cu
microparticule de praf incrcate cu cantiti importante de bacili viruleni.
Picturile Flger au dimensiuni i greuti variabile i de aceea ele acioneaz
diferit n organismul gazd; particulele cu diametrul de 5 10 m sedimenteaz sau
sunt inactivate de mecanismele de aprare ale cilor respiratorii superioare
(activitatea microcililor, reflexul de tuse etc.), n timp ce particulele cu un diametru
de 1-5 m ajung n zona distal a cilot respiratorii i se localizeaz n alveole unde
se declaneaz infecia. Zona preferenial pentru dezvoltarea infeciei tuberculoase
este reprezentat de partea cea mai ventilat a pulmonilor care corespunde cu
regiunea subpleural a lobilor inferiori .
n timp ce infecia pe cale aerogen a fost observat n proporie considerabil
la om i la animalele adulte, infecia pe cale digestiv se ntlnete la naimale n
urma consumului de furaje i ap contaminate; la animalele tinere, la copii i la
persoanele n vrst, infecia se realizeaz n urma consumului de lapte crud
contaminat cu bacilii tuberculozei n unele cresctorii de porci hrnii susinut cu
rezidii de la fabricile de prelucrare a laptelui. Pe de alt parte, calea digestiv s-a
dovedit a fi un veritabil mijloc de rspndire a infeciei tuberculoase n alte organe
i esuturi (ficat, splin,rinichi), sursa primar fiind aparatul respirator de unde
bacilii ajung n tubul digestiv prin deglutirea expectoratului ncrcat cu cantiti
nsemnate de bacili eliberai n cile respiratorii mpreun cu materialul provenit
din leziunile deschise de tuberculoz pulmonar.
La poarta de intrare, mai precis n cile respiratorii, bacilii tuberculozei sunt
ntmpinai i ingerai de macrofage sau alte populaii de celule cu rol n fagocitoz,
aa cum sunt leucocitele neutrofile (226).
Infectarea macrofagelor se produce prin mecanisme n care sunt implicai , n
primul rnd receptorii pentru complement (RC), receptorii pentru manoz,
proteinele surfactante CD14, CD43 .a. prezeni pe suprafaa fagocitelor (241, 261, 115,
295).
Pn n prezent nu se cunoate cu certitudine dac micobacteriile inter-
acioneaz in vivo cu unul sau mai muli dintre receptorii amintii dar
experimentele in vitro au artat c rspunsul macrofagelor depinde de tipul de
receptor cu care interacioneaz mivcobacteriile, aceasta constitutind baza ipotezei
conform creia macrofagul acioneaz cu mijloace complexe pentru distrugerea
bacililor tuberculozei (250). De exemplu, interaciunea cu anumii receptori pentru
complement (RC) amplific producia de intermediari ai oxigeului activ i, n
consecin este facilitat fuziunea lisosomilor cu fagosomii (295).
Dup contactul cu micobacteriile , macrofagele apeleaz la cteva ci de aci-
une pentru distrugerea bacililor. n primul rnd, activitatea macrofagelor se in-
tensific m urma cooperrii cu limfocitele T prin intermediul Factorului de
Necroz Tumoral- (TNF-) i -interferonului (IFN).
Dup R o o k G. V. e t a l. , 2001,(250) aceti mediatori acioneaz, pe de o
parte asupra activrii sintezei oxigenului reactiv (RO) i creterii nivelului
derivailor compuilor azotului, n special oxidul de azot (NO) i pe de alt parte,
prin acidifierea i hidroliza veziculeleor lisosomale ncrcate cu bacili. Mecanismul
aciunii oxidului de azot (NO) nu a putut fi elucidat, dei este cunoscut c acesta
reprezint un important mesager secundar i sursa principal de semnale n
activarea funciilor toxice i bactericide ale celulelor.
Experimentele pe oareci incapabili s sintetiteze NO sau ali
intermediari ai azotului (RNi) au demonstrat absena M. tuberculosis n pulmoni
pn n ultimul stadiu al infeciei dar o cretere pronunat n splin, n tim ce la
oarecii cu deficien pronunat n sinteza compuilor intermediari ai oxigenului
reacit (ROi) s-a observat creterea excesiv a bacililor tuberculoi n pulmoni (250,
1, 101).
 81

Pe de alt parte, unele lucrri de specialitate, susin implicarea unui compus

al vit. D3 (1,25 OH2D3) n reglarea scretiei sintazei oxidului nitric (iNOS) n
monocitele umane care ar explica astfel efectul antibactericid al acestui produs (204,
22, 249).
O alt cale prin care M.tuberculosis poate fi distrus n macrofage se realizeaz
prin cooperarea acestora cu celulele T-citotoxice. Celulele T-citotoxice elibereaz n
spaiul intercelular molecule citolitice antimicrobiene, cum ar fi: perforinele, gran-
zimele i granulizinele (211).
A n d e r s o n , J., et al. 2007 (6), analiznd expresia moleculelor citolitice,
perforina i granzima A i granulizina micobacterian la nivelul celulei din
esuturile pulmonare provenite de la pacienii cu tuberculoz cronic progresiv au
observat prezena masiv a macrofagelor cu receptori CD8+ i aflux masiv de celule
T-CD8+ precum i celule T-CD4+. Celulele T-CD3+, care exprim granulizine au
fost prezente n proproie de 2-3 ori mai mare n leziunile tuberculoase fa de
esuturile neafectate, n timp ce celulele TCD8+ care exprim att perforine ct i
granulizine s-au gasit n numr redus n granuloamele tuberculoase.
Perforinele formeaz pori n membrana celulelor infectate permind
granzimelor A i B s ptrund pn la nucleul celulei int producnd apoptoza
acesteia.
Granulizinele pot declana direct apoptoza i lizeaz membran a celulei
bacteriene din interiorul endosomului macrofagelor infectate. Granulizina produce
liza osmotic a bacililor tuberculoi reducnd creterea acestora ntr-o manier
independent de perforin (215). Aadar , activitatea citolitic coordonat a
perforinei i cea antimicobacterian a granulizinei par a fi indispensabile n
controlul tuberculozei la oameni (6).
Cooperarea fagocitelor cu alte celule imune iniiaz dezvoltarea
granuloamelor tuberculoase , dar s-a dovedit c rspunsul gazdei nu se soldeaz
ntotdeauna cu eliminarea complet a M. tuberculosis i mai de grab stopeaz
infecia n stadiu de laten (hibernare).
Contribuia receptorilor Fas FasL este dependent de capacitatea celulei int
de a distruge bacilii tuberculoi , mediat de aceti receptori (40, 168). S-a dovedit c
n timpul replicrii n macrofage, tulpinile virulente ale M. tuberculosis induc
semnale de tip Bcl-2 conferind macrofagelor rezisten la aciunea FasL. n alte
studii s-a observat c progresia tuberculozei se coreleaz strns cu apoptoza
celulelor activate fa de M. tuberculosis mediate de liganzii celulari Fas/FasL (164).
Cercetrile ulterioare au stabilit c apoptoza macrofagelor, ca mijloc de
distrugere a micobacteriilor s-ar realiza i pe calea receptorilor tool-like (TLR),
dei rolul acestor receptori nu este n totalitate cunoscut. S-a demonstrat implicarea
n apoptoza celular a adenozin trifosfatului (ATP) i hidrogenului peroxid (H2O2).
Procesele imunologice normale, aa cum au fost ele descrise n literatura de
specialitate (70), au permis formularea ipotezei potrivit crei infecia ar putea fi
eliminat numai de sistemul imun de aprare al gazdei fr a fi necesar intervenia
exterioar prin vaccinare.
Cu toate acestea, micobacteriile se bazeaz pe un complex de factori care
interacioneaz cu organismul gazd i intervin pentru blocarea mecanismului
imunologic normal. Aceti factori se grupeaz n funcie de stadiile evolutive ale
bolii, dup cum urmeaz:
Factori proinflamatorii. Studii de specialitate au demonstrat c acizii grai cu
lan lung din structura peretelui micobacteriilor, dintre care acizii micolici, cel mai
mult studiai, stimuleaz puternic rspunsurile inflamatorii ale gazdei conducnd la
 82
formarea granulomului tuberculos (32, 153, 224), dereglarea prezentrii antigenului i,
n consecin, activarea celulelor NK (natural killer) i celulelor T.
Dimycolatul-trehaloz sau factorul cord, de exemplu, induce selectiv
eliberarea unei citokine tip Th1 prin intermediul semnalului direct STAT4 (221). Mai
mult, acizii grai cu lan lung influieneaz semnificativ supravieuirea sau apoptoza
macrofagelor infectate i pot exprima complexul de citokine, ca activitate
suplimentar stimulrii sintezei gamma-interferonului (IFN) (210).
ntruct combinaiile ntre factorii care induc stimularea receptorilor tool-
like (TLR) sunt extrem de multiple nu s-a reuit, pn n prezent, s se stabileasc
o predicie a acestor interaciuni ntre micobacterii i celulele fagocitare i de aceea
rezultatele pot fi neprevzute; att pozitve ct i negative.
Factorii antiinflamatori. T h i n g L. M . e t a l ,1999, (275) susin ideea unui
mediator, component principal al imunitii protectoare mpotriva infeciilor
micobacteriene, care induce un rspuns puternic n gamma-interferon (IFN).
Gamma-interferonul (IFN) produs nu este capabil s distrug n totalitate mico-
bacteriile. Dei mecanismul nu a putut fi elucidat, s-a demonstrat totui c
micobacteriile vii sau extractele din peretele acestora pot inhiba unele efecte ale
gamma-inteferonului (IFN) prin diminuarea semnalului STAT1 care asigur
conexiunea cu transactivatori transcripionali aa nct gamma-intefreronul (IFN)
este profus ns efectele acestuia sunt modulate n avantajul micobacteriei.
De asemenea, producia de gamma-interferon (IFN) variaz semnificativ n
funcie de evoluia bolii. Mai multe lucrri de specialitate susin c intenstitatea
rspunsului n gamma-interferon in vitro este mult diminuat la pacienii cu
tuberculoz avansat n comparaie cu faza inicipient, a bolii (64, 68).
Un rol important n reglarea gamma-interferonului (IFN) n cursul evoluiei
tuberculozei revine interleukinei-10 (IL-10), o citokin imuno-supresiv.
Este cunoscut c lipoarabinomananul (LAM), component major al peretelui
celular al M.tuberculosis, se poate lega la molecula DC-Sing de pe suprafaa
celulelor dendritice. S-a dovedit c molecula DC-Sing este crucial n procesul de
maturare a celulelor dendritice dar acest proces este inhibat n urma conexiunii
care se realizeaz ntre LAM i DC-Sing; n final scade producia de IL-12 n
detrimentul excesului de IL-1o (103).
Studii relativ recente au evideniat expresia pronunat a IL-10 la pacienii cu
tuberculoz activ (64, 218).
Factori care induc citokine tip Th2. date recente din literatura de pecialitate
sugereaz c M. tuberculosis poate interfera cu balana ntre gamma-interferon
(IFN) i IL-4. Pe de alt parte, s-a emis ipoteza conform creia ncursul evoluiei
tuberculozei se modific balana Th1/Th2. S-a constatat c nivelul crescut al IgE
sau expresia CD30 solubil se coreleaz cu producia excesiv de IL-4 la paienii cu
tuberculoz latent comparativ cu grupele de control formate din pacieni provenii
din zone cu tuberculoz endemic (165).
Totui, rspunsurile celulelor T proliferative la antigene M. tuberculosis se
coreleaz strns cu polimorfismul receptorilor pentru IL-4
S-a dovedit c producia crescut a unei variante combinate Il-42 care este
antagonist al activitii IL-4, pare a fi o particularitate a indivizilor cu tuberculoz
n stadiul latent (64,207).
Faptul c IL-4 a fost detectat n mod constant la pacienii cu tuberculoz
latent se explic i prin prezena IL-42 care menine sub control IL-4 dar
intervenia micobacteriilor determin ntreruperea acestui echilibru i producie
excesiv de IL-4(88).
83
 Pe de alt parte, experimentele efctuate pe bovine au evideniat rolul
important al balanei IFN/IL-4 n progresia bolii. n acelai timp, nivelul expresiei
genei pentru IL-4 depinde de diversitatea i virulena tulpinilor de M. tuberculosis.
De exemplu, lipidele sau lipoproteinele din peretele celular al tulpinii
epidemice M.tuberculosis Beijing pot produce cantitai apreciabile de IL-4
i IL-13 n celulele umane comparativ cu tulpinile neepidemice n timp ce studiile
pe animale arat c glicolipidele din peretele micobacteriilor inhib rspunsul imun
mediat celular (IMC) (186).
Dup cum se observ n fig. nr. 21 micobacteriile beneficiaz i de alte
posibiliti i folosesc mai multe strategii pentru a contracara aciunea bactericid a
fagocitelor .

Rezisten la distrugere a peretelui

celular dur;
Superoxid dismutaz Radicali liberi
Capturarea bacilului tuberculozei pe reziduali
calea Recep. Manoz.
Blocarea Ca2+ prin
Recep.Complement Intensific eliberarea
:TNF-2 solubil, IL-10,
TGF,IL-6

M.tuberculosis
Scade secreia TNF-
MF i expresia Fas
Blocarea receptorului complement

H+

LAMP-1
Modificarea structural a LAM
Controlul semnalelor celulare;
fagosomilor n fagosomi toxici; Activarea fosfo-tirozin-fosfatazei
Aleterri ale veziculelor fagosomale SHP-1
(PTP);
i lipsa de mturare a acestora Blocarea semnalelor pentru receptorul
IFN;
Blocarea prezentrii antigenelor,
Peptide + MHC cl.II

Fig. 21 Ci i mijloace utilizate de micobacterii pentru contracarea aciunii bactericide a

fagocitelor.

Este posibil blocarea capturrii M.tuberculosis de ctre macrofag pe calea

receptorului pentru manoz (RM) i n continuare, restricionarea ionilor de Ca2+
care mediaz receptorii pentru complement (RC) (143, 184).
De asemenea, micobacteriile pot inhiba acidifierea fagosomului modificnd
traseul intracelular al vacuolelor fagosomale care devin compo-nente ale
compartimentelor endosomale, mai precis, fagosomi (271). Aceste vacuole elibereaz
cantiti nsemnate de Lipoarabinomanan (LAM) care se insereaz n structura
glicosil - fosfatidil - inositol (GPI) prezent n cantiti apreciabile n membrana
celular (318). Lipoarabinomananul (LAM) are capacitatea de a inhiba numeroase
funcii ale macrofagelor, inclusiv funcia de prezentare a antigenelor
micobacteriene la celulele TCD4+.
Studii recente asupra LAM n infecia tuberculoas au demonstrat c acesta
acioneaz prin activarea proteinei fosfataz-tirozina-1 (SPH-1) care blocheaz cile
de semnalizare celular i iniiaz eliberarea unor citokine din macrofagele
infectate, cum ar fi: factorul de Necroz Tumoral-hidrosolubil (TNF-h),
interleukina-1o (IL-10), Factorul de cretere Tumoral (TGF) i interleukina-6
84
(IL-6). Eliberarea citokinelor menionate determin diminuarea activrii
macrofagelor i alterarea funciei acestora de recrutare a limfocitelor T. Dup cum
este cunoscut, recrutarea limfocitelor Th1 necestit eliberarea IL-12 care este
inhibat de producia execisiv a TGF ca i IL-10 care diminueaz funcia
microbicid a macrofagelor i, n plus IL-10 contribuie la eliberarea n exces a
receptorului 2-TNF blocnd funcia TNF- de activare a macrofagelor.
Aadar, evoluia procesului patologic depinde de cantitatea de bacili tuber-
culoi ingerat de ctre celulele fagocite, de virulena acestora, dar mai ales, de
relaiile intercelulare, componente ale sistmului imun, care modific raportul ntre
celulele Th1/Th2, precum i a altor componente implicate n balana imunologic,
aa cum sunt: limfokinele i kemokinele. S-a demonstrat c pentru a distruge celula
gazd sunt necesari minimum 5 bacili extrem de viruleni. Totui, exist numeroase
dovezi care atest c un procent suficient de mare dintre indivizii infectai cu M.
tuberculosis i bovine infectate cu M. bovis nu fac boala clinic, sau cel mult
infecia rmne inaparent i numai atunci cnd o serie de factori extrinseci
(malnutriia, condiiile precare de via, stresul prelungit, etc.), asociai cu
dezechilibre pronunate ale balanei imunologice provocate de infcii cu virusuri
imunodepresive (HIV, BLV, .a.), boli autoimune sau dereglri imunologice de
natur genetic conduc la dezvoltarea tuberculozei active sau la reactivarea infciei
latente.
Macrofagele infectate apoptice sunt ingerate de alte macrofage proaspt
recrutate la locul infeciei, care sub aciunea toxinelor bacteriene , metaboliilor i
rezidiilor celulare , sufer modificri imortante exprimate prin cretere n volum i
diviziune nuclear, transformndu-se n celule gigante, multinucleate de tip
Langhans n jurul crora se produce o reacie inflamatorie proliferativ cu esut
reticulohistiocitar de granulaie format din celule epitelioide i limfoide dispuse
deobicei periferic (Fig.22).

Fig. 22 Mecanismul clasic de formare a granulomului tuberculos .

Acesta este mecanismul clasic de formare a granulomului tuberculos.

Dup U r l i c h , T. e t a l ., 2004 (289), celulele gigante , multinucletate pot s
apar n urma fuziunii celulelor epitelioide. Zona central a focarului infecios constituie
mediu ostil pentru dezvoltarea micobacteriilor; analizele chimice au evideniat n aceast
zon numeroase enzime litice , radicali liberi toxici i concentraie apreciabil de hidrogen.

85
 Cercetri recente, utiliznd probe de esuturi pulmonare prelevate de la
pacieni decedai din cauza tuberculozei, analizate prin metode imunohistochimice
i PCR, au demonstrat c, n cazuri cu totul excepionale, bacilii tuberculozei au fost
gsii n zona central cazeonecrotic a focarului infecios.
Prezena masiv a bacililor tuberculoi a fost dovedit n infiltratul leucocitar
de la periferia granulomului, confirmnd c prezentarea antigenului micobacterian
are loc n zone specializate de la periferia granulomului (289).
Pe de alt parte, s-a constatat absena celulelor T-CD8+ n zona central a
granulomului , demonstrnd astfel c aceast populaie de celule joac un rol minor
n distrugerea celulelor prezentatoare de antigen (APC) i creterea progresiv a
materialului necrotic .
Celulele T-CD8+ se gsesc din abunden la periferia granulomului unde,
mpreun cu celulele T-CD4+, cu celulele prezentatoare de antigen (APC)i cu
celulele B formeaz agregate asemntoare foliculilor limfoizi cu activitate
proliferativ intens .
Evoluia i structra granulomului tuberculos au fost intens cercetate n
ultimele decenii. n acest context, un numr apreciabil de studii au formulat
concluzii similare privind evoluia structural a granuloamelor tuberculoase n
diferite stadii evolutive ale bolii (169). Aceste constatri au servit la elaborarea unor
strategii adecvate n direcia profilaxiei i terapiei tuberculozei.
Pentru ncadrarea granuloamelor n diferite stadii de dezvoltare s-a avut n
vedere studiul populaiilor de celule din structura acestora, ca baz a procesului
patologic, localizarea subseturilor de limfocite, distribuia celuleor apoptice,
rspunsul fibrotic, etc. (169, 36, 170, 171).
ntr-un amplu studiu pe cobai infectai pe cale aerogen cu tulpina Erdman
de Mycobacterium tuberculosis, T u r n e r, O. C., e t a l, 2003 (285), descriu 4
stadii de dezvoltare a granuloamelor.
- Stadiul 1, n general, cuprinde perioada ncepnd din a 11-a zi i pn n a
21-a zi post infecie i formaiunea granulomatoas are, n mod obinuit,
dimensiuni reduse, cu diametrul de pn la 500 m, n structura creia au fost
observate acumulri de macrofage epitelioide i granulocite cu granulaii
eozinofilice distincte localizate n citoplasm. Datorit caracteristicilor granulaiilor
intracitoplasmatice, unii autori au denumit aceste celule pseudoeozinofile. n acest
stadiu, granuloamele au fost observate cel mai frecvent n parenchimul
principalelor ci respiratorii, n vecintatea vaselor de snge, determinnd
estomparea i dilatarea cilor septumurilor alveolare.
- Stadiul 2. ncepnd din a 21-a zi dup infecie, leziunile au distribuie
similar cu cele din stadiul 1, dar dimensiunile granulomului ajung pn la 1,0 mm.
n acest stadiu, n structura granulomului , pot fi observate macrofage epitelioide n
numr apreciabil dar i neutrofile i limfocite distribuite numai n zona periferic.
Zona central a granulomului se prezint ca o acumulare de detritus celular n
cantitate redus dar distinct i material fibrilar eozinofilic. Depozite eozinofilice
similare au fost observate n vecintatea zonei centrale a granulomului (169). De
asemenea, n acest stadiu de evoluie a bolii s-a constatat dezvoltarea pronunat a
limfadenitei granulomatoase (48).
- Stadiul 3. ncepnd din ziua a 31-a , se configureaz procesul patologic
reprezentat de granulomul clasic , al crui diametru msoar pn la 2,0 mm., cu
o zon central eozinofilic, un pronunat proces necrotic i cantitate apreciabil de
detritus celular.

86
 n acest stadiu, zona central a granulomului tuberculos este nconjurat de
macrofage epitelioide i neutrofile. Zona periferic a granulomului apare bogat n
limfocite dispuse sub form de manon alternind cu fascicole fibroase de esut de
conexiune ;
- Stadiul 4. Leziunile caracterizeaz stadiul final al evoluiei granulomului
ncepnd din ziua 90-a de la infecie; creterea n dimensiuni i confluena
granuloamelor fac, de multe ori, dificil difereniuerea etapelor de dezvoltare a
proceselor patologice i evaluarea parenchimului pulmonar normal. Aria necrotic,
de dimensiuni apreciabile, este tipic mineralizat i nconjurat de macrofage
epitelioide. O caracteristic important a granulomului n vrst de peste 90 de zile
este prezena regulat a esutului fibros care nconjoar o zon de macrofage
gigante, cu citoplasm spumoas i un numr redus de celule multinucleate
Langhans . De asemenea, structura granulomului este completat cu aflux de
neutrofile i limfocite rspndite la ntmplare pe toat aria procesului inflamator.
Bacilii tuberculoi pot fi observai n acest stadiu mai frecvent n interiorul
macrofagelor recrutate la nivelul procesului inflamator i mai rar n zonele cu
detritus i material supurativ.
Studiul subpopulaiilor de celule T (CD3+, CD4+, CD8+, WC1+ i CD25) a
relevat diferene notabile n ceeace privete distribuia acestora n granulomul
tuberculos la bovine, n fucie de stadiul evolutiv al procesului patologic dar i
comparativ cu leziunile granulomatoase descrise la oameni (169).
Cercetrile ntreprinse de L i e b a n a, E., e t a l., 2 0 0 7 (169), utiliznd
metode imunohistochimice au demonstrat c celulele TCD8+ i TCD25+ au fost
prezente n majoritatea granuloamelor n stadiul I/II cu frecven crescut n zona
macrofagelor ceeace explic rolul de activatoare n aciunea de blocare a dezvoltrii
granulomului.
n acelai timp, celulele TCD4+ au fost observate n manonul limfocitar
distribuite egal n toat aria intern a granulomului, n timp ce limfocitele WC1+,
prezente n numr apreciabil, par a fi dispersate n jurul macrofagelor
caracteriznd leziunile tuberculoase incipiente la bovine, diferite de cele observate
n tuberculoz i sarcoidoz la oameni unde numrul celulelor T, dei crescut,
practic receptorii celulari (TCR) i (TCR) sunt distribuii n proporie egal pe
suprafaa acestora (152, 171).
Experimentele pe bovine cu depleia celulelor T-WC1 au confirmat c acestea
reprezint o particularitate a granulomului tuberculos la bovine i ele intervin n
modularea rspunsului imun fa de infecia tuberculoas (25)(150).
Independent de stadiile de dezvoltare ale granulomului tuberculos, procesul
patologic variaz de la individ la individ n funcie de capacitatea idividual de
aprare i reactivitate imunologic a organismului gazd, de virulena bacililor
tuberculoi, doza infectant dar i de aciunea unui complex de factori intrinseci i
extrinseci care influeneaz evident reactivitatea gazdei .
Dup ptrunderea bacililor pe una din cile amintite, acetia pot s fie
distrui n urma interveiei componentelor celulare ale sistemului imun (fagocite,
limfocite, neutrofile .a.) la poarta de intrare aa nct procesul patologic este stopat
la poarta de intrare.
S-a constatat c la cel puin 10,0% dintre pacienii infectai bacilii
tuberculozei se multiplic totui in interiorul macrofagelor producnd n 8-15 zile o
leziune denumit afect primar sau ancru tuberculos promotorul granulomului
descris mai sus. n continuare, micobacteriile pot fi drenate pe cale limfatic n
nodurile limfatice regionale producnd adenopatii satelit, observate i desrise
pentru prima

87
dat de Perrot (adenopatia Perrot). Afectul primar mpreun cu adenopatia satelit
formeaz complexul primar care poate s fie incomplet sau disociat i complet.
n funcie de localizarea complexului primar au fost descrise urmtoarele
etape ale procesului patologic tuberculos:

-Etapa primar: primo-infecia. Localizarea complexului primar este

foarte diferit. Studiile de specialitate ntreprise pe animale au dovedit c organele
cele mai frecvent afectate sunt pulmonii, tubul digestiv, ficatul, glanda mamar,
organele genitale , conjunctiva (72).
Tabelul : 6
Localizarea complexului primar (72).

Organ Vaci Alte bovine Caprine ovine cai porci Cini Pisici
Pulmoni 38 % 90-95 % 100% 100% + + - 50%
Tub dig. 13% 5-10 % + + 100% 100% 100 % 50 %
Ficat 49 % - - - - - - -
Org.genit. - + - - - + - +
Gl. Mamar - + - - - - - -
Ochi.conj. - - - - - - - +
+: Observat ocazional; - : nu s-a observat niciodt.

Potrivit datelor furnizate de autorul citat, formele digestive de tuberculoz

deineau 3,8 % din totalul cazurilor diagnosticate n perioada 1995-1998 n
deparatmentul Lotet Garonne .
Totodat, s-a observat c complexul primar are o localizare cu preponderen
digestiv sau multivisceral la pacienii infectai cu virusul HIV.
Astfel, la 61,1 % dintre copiii seropozitivi pentru HIV a fost observat
tuberculoz pulmonar i la 22,6 % s-a constatat tuberculoz extrapulmonar, n
timp ce la pacienii seronegativi pentru HIV, tuberculoza pulmonar a fost
constatat n 64,3 % din cazuri i tuberculoza extrapulmonar n 20,6 % (74).
Complexul primar reprezint punctul din care Mycobacterium tuberculosis
disemineaz pe cale limfatic sau, cu totul excepional i n numr infim, pe cale
sanguin, producnd forma septicemic de tuberculoz. Dup diseminare, se
produc 3 fenomene importante: antagonismul ntre micobacterii i sitemele de
aprare ale organismului gazd, stabilizarea complexului primar i generalizarea
complexului primar.
a). Antagonismul ntre micobacterii i organismul gazd, se realizeaz prin
reacie imunitar specific i nespecific n scopul eliminrii micobacteriilor din
organism i iniierea procesului de vindecare.
b). Stabilizarea complexului primar, este definit ca echilibrul care survine
ntre micobacterie i mijloacele de aprare ale organismului. Intervenia meca-
nismelor imunologice de tip celular provoac leziuni de necroz cazeoas unde
multiplicarea bacililor tuberculozei este redus substanial din cauza anoxiei. Aici,
numrul bacililor este considerabil diminuat cu toate c un procent mic dintre
acetia supravieuiesc i i pstreaz virulena. n evoluie, leziunile cazeoase se pot
calcifica sau se pot transforma n formaiuni chistice.
Stabilizarea este relativ frecvent la om i la bovine n timp ce la carnasiere s-a
observat destul de rar sau nu a fost observat niciodat (72).
c). Generalizarea complexului primar, corespunde trecerii de la infecie la
boal.Generalizarea complexului primar nu este sistematic, dar cnd se produce,
corespunde multiplicrii bacililor i diseminrii acestora n organism pe cale lim-

88
fatic sau sanguin. Astfel, se dezvolt leziuni tuberculoase n toate organele
afectate definind forma de tuberculoz secundar, tuberculoza cronic a
organelor sau generalizarea tardiv.
Literatura de specialitate descrie i o form de generalizare precoce a
complexului primar tuberculos cu evoluie acut i lent.
Generalizarea precoce acut se caracterizeaz prin diseminarea intens
simultan a micobacteriilor n mai multe organe i esuturi. In aceast form ,n
general toate leziunile se gsesc n acelai stadiu de voluie.
n generalizarea precoce lent diseminarea se produce succesiv i ca urmare,
leziunile apar n stadii evolutive diferite.
Generalizarea precoce lent a fost observat cel mai frecvent la carnivore, cal,
porc i la psri.
- Tuberculoza secundar. Leziunile iniiale n care bacilii tuberculoi vii
se multiplic i pot disemina numai n organele de origine, motiv pentru care,
aceast form de boal a fost denumit tuberculoza cronic a organelor ntlnit
mai frecvent la bovine sub dou forme distincte: tuberculoza cronic a organelor
cu leziuni deschise i forma cu leziuni nchise.
a).Tuberculoza cronic a organelor cu leziuni deschise , cuprinde leziuni n
stadiul de ramolisment care se deschid ntr-o cale de drenaj natural (bronhii,
trahee, tub digestiv, etc.) i n final se produc ulcere i caverne.
b).Tuberculoza cronic cu leziuni nchise, se mai numete tuberculoz
inaparenta sau latent. n aceast form leziunile sunt n majoritate cazeoase i
simptomele sau semnele clinice specifice sunt inaparente.
Purttorii aparent sntoi afectai de o form de tuberculoz deschis joac
un rol important n transmiterea bolii.
n general, se apreciaz c cel puin 30,0 % dintre persoanele care au venit n
contact cu pacieni ale cror expectoraii conin bacili (tuberculoz deschis)
dezvolt o infecie tuberculoas dup IDR pozitiv dar mai puin de 10,0 % dintre
contacii cu pacieni cu examenul sputei negativ (forma de tuberculoz nchis) nu
dezvolt infecia.

Mecanisme imunologice si biochimice n tuberculoza latent.

Aa cum s-a precizat anterior, dup contactul cu micobacteriile, organismul

gazd se comport n dou modaliti distincte:
- bacilii M.tuberculosis pot sa fie distrui imediat ca urmare a interveniei
prompte i eficiente a sistemului imun nscut;
- capacitatea slab att pentru controlul infeciei iniiale dar i pentru un
rspuns imun protector durabil pentru a preveni boala.
n general, este cunoscut c majoritatea persoanelor infectate cu M.
tuberculosis face o infecie latent, semnele clinice i simptomele de boal fiind
inaparente dar cu IDR- pozitiv. Aceti pacieni nu sunt contagioi pentru alte
persoane cu care eventual vin n contact. Cu toate acestea, la un numr relativ redus
de persoane cu infecie tuberculoas latent s-a constatat revenirea la statusul PPD-
negativ, generd dificulti n ncadrarea acestor persoane n categoria infectate
cu M. tuberculosis i apreciere eronat cu privire la eliminarea total a bacililor din
oranism.Aproximativ 5 10 % cu infecie latent trec n faza de reactivare a
tuberculozei. S-a estimat c pn la 1/3 din populaia globului este infectat cu M.
tuberculosis, reprezentnd un important rezervor pentru reactivarea tuberculozei.
89
 Infecia cu M. tuberculosis se produce iniial n macrofagele alveolare unde
bacilii se replic i induc producia de citokine care iniiaz rspunsul inflamator n
pulmon.
Macrofagele i limfocitele migreaz la locul infeciei i formeaz granulomul
tuberculos descris anterior (61), al crui principal rol este de a segrega infecia i de
a preveni rspndirea ei n esutul pulmonar neafectat i n alte organe. Totodat,
granulomul i exercit funcia de concentrare a rspusului la locul infeciei .
Granulomul tuberculos se menine n infecia tuberculoas persistent,
probabil datorit stimulrii cronice a celulelor imune i constituirii bazei pentru o
leziune tuberculoas.
Studiile asupra leziunilor tuberculoase latente au dovedit c bacilii au putut fi
izolai din granuloame sau tuberculi cu localizare pulmonar de la persoanele cu
tuberculoz inactiv, sugernd ideea persitenei bacililor n granuloamele
tuberculoase perioade ndelungate de timp , care pot s ajung la mai muli ani (225,
240).
n acelai timp, aceste studii au emis ideea fundamental conform creia
tuberculoza latent poate fi considerat ca un echilibru ntre gazd i bacili. Cele
mai multe persoane infectate cu M. tuberculosis evideniaz un rspuns imun
robust care culmineaz cu formarea unei leziuni granulomatoase. Echilibrul ntre
gazd i bacilii tuberculoi este meninut de raspunsul imun, suficient de puternic
n majoritatea cazurilor pentru a bloca apariia tuberculozei active. Ocazional,
sistemul imun al gazdei eueaz n exercitarea funciei protectoare permind
reactivarea infeciei i n unele cazuri generalizarea acesteia.
Dei mecanismele implicate n tuberculoza latent par simplificate totui, mai
multe ntrebri ateapt nc rspuns. De exemplu, ar fi important s se cunoasc:
- cum controleaz gazda infecia iniial pentru a preveni boala?
- care factori imuni sunt implicai n stabilizarea infeciei?
- ce componente imunologice intervin n meninerea infeciei latente i n
prevenirea reactivrii tuberculozei?
- prin ce mijloace aprarea gazdei este nfrnt de ctre baclii tuberculozei i
cum supravieuiesc bacilii n faa unui raspuns imun puternic?
- este bacilul tuberculozei hibernant capabil de replicare lent, intermitent,
sau biologic activ?
Toate aceste ntrebri au impact puternic asupra dezvoltrii vaccinurilor
antituberculoase cu eficien maxim dar i n optimizarea programelor de
eradicare a bolii. n acest scop, s-au ncercat numeroase modele experimentale pe
anmale i s-a ajuns la concluzia c modelul murin este cel mai potrivit pentru
studiul caracteristicilor rspunsurilor imune n tuberculoza latent. S-a demonstrat
c n primele 2-4 sptmni de la infecie , sistemul imun al animalelor este capabil
s controleze multiplicarea bacililor M. tuberculosis astfel nct numrul acestora
n pulmoni se menine n platou i infecia devine persistent sau cronic timp de
mai multe luni fr evidenierea semnelor clinice caracteriznd un echilibru real
ntre gazd i bacilii tuberculoi (198, 257).
Unele cercetri asupra biologiei micobacteriilor n pulmonii oarecilor arat
c M. tuberculosis poate s parcurg un stadiu de linite , fr a se multiplica activ
n cursul fazei persistente, particularitate relativ similar cu cea observat n
tuberculoza latent la oameni (81).
n numeroase alte lucrri, modelele murine au fost utilizate extensiv pentru
cercetarea factorilor legai de organismul gazd i implicarea acestora n controlul
infeiei iniiale cu M. tuberculosis.
90
 F l y n n , J. L., i E r n s t J.D. 2000 (83), au demonstrat c celulele TCD4+
i TCD8+ particip activ la protecia mpotriva tuberculozei. Aceste celule
funcioneaz pentru activarea i distrugerea macrofagelor infectate cu M.
tuberculosis.
Totodat, s-a dovedit rolul important al intermediarilor azotului reactiv (RNI)
care sunt produi n interiorul macrofagului asigurnd protecie mpotriva infeciei
prin inducerea sintazei oxidului azotic (iNOS) (37, 38, 179).
Experimentele pe oareci cu deficiene genetice pentru sinteza gamma-
interferonului (IFN) i utilizarea anticorpilor neutralizani specifici au artat c
diferite citokine i populaii de celule sunt eseniale pentru controlul infeciei cu M.
tuberculosis .
O citokin cosiderat pivot n rspunsul imun fa de M. tuberculosis este
gamma-interferonul (IFN). Cercetari experimentale pe oareci cu deficiene ale
gnei responsabile de IFN au demonstrat c acetia au fost cei mai susceptibili la
infecia tuberculoas i boala a avut ntotdeauna sfrit letal (50, 84).
Interferonul gamma (IFN) intervine n activarea macrofagelor i n
producia de compui intermediari ai azotului reactiv (RNI), singurul mecanism
cunoscut prin care macrofagele pot s distrug bacilul tuberculozei (50,39,84).
De asenmenea, IFN- intervine prin mecanisme ajuttoare n controlul
tuberculozei.
Pacienii cu deficiene ale genei pentru IFN- sau absena receptorilor pentru
IFN- au prezentat susceptibilitate crescut la infecia cu micobacterii, inclusiv
Mycobacterium tuberculosis.

Factorul de Necroz Tumoral (TNF-), este cea mai important citokin

care intervine n formarea granulomului. Experimentele pe oareci au confirmat c
lipsa acestei citokine ntrzie formarea granulomului, favoriznd multiplicarea
rapid a bacteriilor n esuturile afectate i moartea animalelor.
Efectele TNF- asupra rspunsului fa de M. tuberculosis sunt multiple i
includ:
- activarea macrofagelor i producia RNI (intermediari ai azotului reactiv);
- formarea granulomului tuberculos, i:
- inducerea procesului patologic (14, 85, 151);
Cercetrile lui M o h a n V, P., e t a l, 2001 (198), au scos n eviden relaia
strns ntre TNF- i evoluia procesului patologic. Autorii au constatat c un
deficit relativ n TNF- poate determina un proces imunopatologic distructiv chiar
dac numrul micobacteriilor rmne relativ constant.
Exist situaii cnd n urma tratamentului cu anticorpi anti-TNF- are loc o
exacerbare a procesului patolgic in urma infiltrrii masive n esutul pulmonar
infectat cu M. tuberculosis a celulelor macrofage i limfocitelor fr int
prestabilit.
De asemenea, experimente pe oareci cu infecie mixt M. tuberculosis i
Adenovirus care neutralizeaz TNF- solubil, au demonstrat creterea dramatic a
ncrcturii bacteriene cu sfrit letal al animalelor infectate.
De aceea, ncercarea de neutralizare a TNF- trebuie abordat cu precauie
ntruct efectele asupra rspunsului imun asupra altor infecii asociate, aa cum
este artrita reumatoid, pot fi profunde (181).

91
 Aadar, IFN- i TNF- sunt citokine care contribuie la rezistena gazdei fa
de infeciile micobacteriene att prin activarea macrofagelor ct i prin inducerea
expresiei NOS2 (83).
n infecia persistent cu M. tuberculosis aceste citokine se produc
permanent n pulmoni ceeace nseamn c activare continu a macrofagelor i
producia de RNI reprezint elemente importante n prevenirea reactivrii infeciei.
Studii aprofundate asupra infeciei micobacteriene persistente au
demonstrat prezena Acidului Ribo Nucleic mesager mpreun (mRNA-NOS2) cu
fraciunea proteic specific n infecia persistent stabilind c inhibiia activrii
NOS2 cu Amidoguanidin sau L-N6-(1-Iminothil-Lizina)(L-LIN) la oareci cu
infecie persistent a condus la creterea rapid a numrului de bacili n ficat i
splin. (86,257).
Aspecte patologice mult mai grave au fost semnalate la animalele cu deficiena
genei responsabile de NOS2 (NOS2-/-) sau la cei tratai cu inhibitori NOS2,
datorit creterii impresionante a numrului de bacili n toate organele afectate.
CeluleleT, joac un rol important n rspunsul imun mpotriva infeciei cu
micobacterii. Att celulele TCD4+ ct i cele TCD8+ particip activ la controlul
tuberculozei la animale i om (83) dei importana celulelor TCD8+ rmne
controversat (196).
La oameni, infecia cu virusul imunodeficienei umane (HIV) produce scde-
rea dramatic a celulelor TCD4 i n consecin creterea riscului la tuberculoz.
Cercetrile ntreprinse n cazurile cu tuberculoz inactiv i cu infecie mixt HIV+
M. tuberculosis au artat c cel puin 10 % dintre pacienii cu IDR pozitiv dar
negativi la HIV, erau expui la tuberculoz activ n timpul vieii n timp ce la
grupul pacienilor cu infecie mixt riscul crete pn la 15 %.
Dup cum este cunoscut, rspunsul de tip Th1, caracterizat prin producia de
IFN- de ctre celulele TCD4 este important in controlul infeciei cu M.
tuberculosis. Majoritatea lucrrilor de specialitate menioneaz c celulele TCD4+
specificce pentru micobacterii, izolate de la pacienii cu IDR pozitiv sau cu
tuberculoz activ produc IFN- i acest citokin joac rol esenial n rspunsul
protector fa de infecia cu M. tuberculosis i n activarea macrofagelor pentru
distrugerea bacililor tuberculoi localizai intracelular. Aceste constatri ar putea
contrazice rezultatele altor studii care arat c, la oareci lipsii de celule TCD4 nu
s-au observat deficiene majore n producia de IFN- i n activarea macrofagelor
dar absena celulelor TCD4+ ar conduce la creterea numrului de bacili n organe
i la progresia infeciei.
Studiul celulelor TCD4+ n infecia tuberculoas latent, la oareci cu defi-
ciena genei responsabile pentru aceste celule, au artat c funcia celulelor TCD4+
este suplinit de celulele TCD8+ care produc IFN la nivele crescute, egale cu cele
nregistrate la oarecii normali, fr disrupia genei respective. Gamma-
interferonul (IFN-) eliberat de celulele TCD8 este suficient pentru activarea
optimal a macrofagelor care produc cantitai importante de compui
intermediari ai azotului reactiv (RNI) eficient n controlul infeciei persistente.
Pe de alt parte, s-a observat c rolul celulelor TCD4 in controlul persistenei
infec-iei cu M. tuberculosis nu se bazeaz n totalitate pe producia de gamma-
inteferon (IFN-) dar este esenial n eliberarea de ctre macrofage a RNI. De
asemenea, celulele TCD4 i exercit controlul asupra infeciei cu M. tuberculosis
prin eliberarea altor citokine, cum ar fi IL-2; cooperarea cu alte populaii de celule,
cum ar fi celulele B i alte mecanisme de activare a macrofagelor .
Mijloace de eschivare a micobacteriilor fa de raspunsul imun al gazdei.
n cazul tuberculozei latente, gazda declanaz un rspuns puternic dar nu suficient
pentru a elimina infecia.
92
 S-a demonstrat c rspunsul imun protejeaz n permanen gazda i orice
disfuncie a mecanismelor imune conduc la reactivarea infeciei tuberculoase.
Pe de alt parte, supravieuirea intracelular a micobacteriilor este asigurat
de o serie de mecanisme de contracarare a aciunii bactericide dezvoltat de celula
gazd. Micobacteriile care ptrund n interiorul macrofagelor acioneaz prin
blocarea funciei acestora de stimulare a proliferrii i eliberrii unor citokine de
ctre celulele TCD4 (26,263).
De asemenea, M. tuberculosis i manifest rezistena la aciunea bactericid
a macrofagelor prin dereglarea complexelor majore de histocompatibilitate cl.II
(MHC cl.II) i, n consecin, blocarea prezentrii antigeneleor la celulele T (2009,
309).
Alte studii au demonstrat c M. tuberculosis determin macrofagele s
produc IL-10 sau Factorul de Transformare a Creterii-beta (TGF) care scad
capacitatea macrofagelor infectate de a stimula eficient celulele T (81, 82, 120, 248).
Mai mult, cercetri relativ recente au stabilit c macrofagele infectate cu M.
tuberculosis devin refractare fa de aciunea mediatoare a IFN- (275).

Rolul factorilor micobacterieni n infecia latenta.

In ceea ce privete ncrctura bacterian n tuberculoza latent, s-a observat

c dificultile n iniierea unor modele experimentale pe animale a creat obstacole
majore n studiul mecanismelor prin care M. tuberculosis persist i reactiveaz
celula gazd.
Exist totui date bazate pe rezultatele experimentale in vitro care identific
diverse componente micobacteriene ca factori persisteni cu rol important n
definirea stadiului latent al infeciei tuberculoase.
Rolul diverselor componente ale mutantelor tulpinilor M. tuberculosis , n
tuberculoza persistent a fost elucidat prin utilizarea dozei sczute de micobacterii
n modelele experimentale murine.
Studiul tulpinilor mutante ale M. tuberculosis, deficitare n unii factori
micobacterieni putativi persisteni n tuberculoza cronic murin, au relevat c
astfel de mutante manifest o deteriorare aparent a capacitilor de supravieuire
n celula gazd; aceti factori mutani pot aciona determinnd dificulti n
creterea tulpinilor sau n persistena acestora. Mutantele cu cretere defectoas nu
ating niciodat ncarctura bacilar maxim n esuturi n cursul fazei de
multiplicare rapid (53).Mutantele persistente nu sunt capabile s menin
ncrctura bacilar la cot obinuit aa cum se observ la tulpinile slbatice, dac
acestea nu manifest aberaii n cretere (177).
Rolul tulpinilor micobacteriene modificate genetic, n tuberculoza latent.
Dezvoltarea tehnologiilor genetice de investigare a enomului M. tuberculosis a
permis examinarea mecanismelor genetice n tuberculoza latent. Aplicate in
vitro, aceste mijloace s-au dovedit utile pentru caracterizarea componentelor M.
tuberculosis care pot s contribuie la stabilizarea persistenei infeciei tuberculose.
Utililiznd modelul anaerobiozei n studiul tuberculozei latente W a i n e, L.
G., i H a y e s L. G., 1 9 9 6 (302), au observat o uoar modificare a comporta-
mentului M. tuberculosis, ctre un stadiu hibernant, ntr-un mediu de cultur lipsit
de oxigen i creterea rezistenei bacililor la ageni antimicobacterieni, cum ar fi
inosidazida dar au rmas sensibili la metronidazol.
Modelul anaerobiozei in vitro a fost aplicat i pentru a demonstra
amplificarea ciclului glicosilat care faciliteaz utilizarea de ctre micobacterii a
ace-
93
tatului sau acizilor grai ca surs important de carbon pentru cretere n condiii
de anaerobioz. n acest proces s-a descoperit o enzim, izocitrat-liaza (Icl) care
intervine n activarea ciclului glicosilat. Disrupia genei responsabile de producia
izocitratliazei (Icl) atenueaz capacitatea M. tuberculosis de a persista n esuturile
afectate. Mutantele lipsite de proprietatea de a sintetiza Icl evideniaz o
ncrctur bacilar mai redus dect tulpinile slbatice. Activitatea izocitratliazei
(Icl) este mai intens n culturile de micobacterii cu cretere lent, producia acestei
enzime fiind mai crescut n mediile de cultur suplimentate cu acetat sau palmitol
(117, 177).
Factorii Sigma micobacterieni, s-au dovedit a fi eseniali n expresia genei
responsabile de virulena micobacteriilor n comdiii de stres din mediul exterior
(107).
Factorul Sigma RpoV, produsul grupei primare Sig.A, este responsabil de
exprimarea virulenei micobacteriilor ca rezultat al ncrcturii bacilare tisulare
(108). De exemplu, tulpina Mycobacteirum bovis cu virulen ascuns prezint o
mutaie aberant a genei RpoV care const n schimbarea argininei cu histidina n
poziia 522 Aceast mutaie , R522H contribuie la deteriorarea interaciunii genei
Sig A cu factori putativi transcripionali pentru exprimarea genelor virulente (47).
Recent, s-a descoperit c n cursul infectrii macrofagelor umane cu M.
tuberculosis se intensific expresia factorilor Sig E i Sig H dar semnificaia acestor
factori sigma rmne nc neelucidat (110).
Proteinele micobacteriene, reprezint factori de persisten a bacililor tuber-
culoi n interiorul celulei gazd prin inhibiia fuziunii fagosomilor cu lisosomii,
caracteristic observat frecvent la tulpinile de M. tuberculosis potenial virulente.
Bazai pe acest descoperire, D u b n a u J . e t a l., 2 0 0 0 (71) , au obinut o
cretere optimal in vivo folosind tulpini de Mycobacteirum tuberculosis cu
disrupia genei erp.
Totodat , autorii citai, au demonstrat c tulpinile de M. tuberculosis cu
disrupia genei hma prezint deficiene n sinteza acizilor micolici neoxigenai i
dificulti de cretere in vivo la oareci (71) .
Experimente pe oareci infectai cu tulpina slbatic M. tuberculosis i
mutanta cu disrupia genei pca care controleaz activitatea de ciclopropanare
proximal a acidului micolic i contribuie la morfologia n serpentin a coloniilor
(factorul cord), au artat diferene notabile n dezvoltarea reaciilor inflamatorii
sugernd c structura acizilor micolici poate s moduleze specific rspunsul imun al
gazdei (105).
Cercetrile ntreprinse de M a n a b e , e t a l., au evideniat rolul fierului n
reglarea expresiei genelor responsabile de virulena M. tuberulosis. Autorii citai,
consider c virulena M. tuberculosis se coreleaz cu expresia factorului represor
dependent de fier (IdeR) (185).
Cercetrile asupra altor specii de micobacterii patogene,utiliznd inducerea
fluorescenei difereniat, au demonstrat rolul mutaiilor survenite n structura
genelor responsabile de multiplicarea i virulena micobacteriilor.
Prin aceast metod s-a dovedit c tulpinile de Mycobacterium marinum care
au suferit mutaia genelor mag24-1 i mag24-3 se caracterizeaz prin multiplicare
lent i persistena lor n interiorul macrofagelor este mult diminuat.
Aceste gene sunt similare cu genele PE-PGRS din genomul Mycobacterium
tuberculosis care codific un complex de proteine cu coninut ridicat n glicin (240).
Cu toat complexitatea i recunoaterea performanelor strategiilor in vitro
i in vivo care au facilitat identificarea rapid a factorilor de cretere a
micobacteriilor descrii mai sus, semnificaia acestor factori asupra M. tuberculosis
de a se implica n tuberculoza latent rmne nc necunoscut.
94
 Totui, studiul factorilor micobacterieni reprezint un prim pas
important i semnificativ n caracterizarea M.tuberculosis care ar putea s
contribuie direct sau indirect la persistena bacilior tuberculozei n celula (82).

3.1.2.7. Hipersensibilitatea.

Hipersensibilitatea se refer la reacii indezirabile excesive ale sistemului

imun normal care produc alterri tisulare, disconfort i uneori chiar deces.
n funcie de mecanismle implicate i timpul de declanare, reaciile de
hipersensibilitate se clasific n: tipul I, tipul II, tpul III i tipul IV de reactivitate.
Caracteristicile dup care tipurile de reactivitate se difereniaz ntre ele sunt
sintetizate n tabelul urmtor (tabelul 7).

Tabelul:7
Caracteristicile de difereniere a tipurilor de hipersensibilitate.

Caracteristi Tip I Tip II Tip III Tip IV

ci (anfilactic (citotoxic) (complexe (tip
) imune) ntrziat)
Anticorpi IgE IgG, IgM IgG, IgM -
(Ac)
Antigene Exogene Suprafaa Solubile esuturi i
(Ag) celular organe
Timp de 15-30 Minute-ore 3-8 ore 48-72 0re
rspuns min.
Histologic: Eozinofile Anticorpi i Complement i Macrofage
i bazofile complement neutrofile i celule T
Posibilitate Anticorpi Anticorpi Anticorpi Celule T
de transfer
cu:
Produce: Alergie Eritroblastoz Lupus Reacie
astmatoge , nefrit eritematos tuberculin
na, febr sistemic (SEL), ic,
Boala fermierilor granulom,
otrava
iede-rii.

Hipersensibilitatea tip I, este cunoscut ca o reacie imediat de tip

ana filactic.
Reacia poate s apar la nivelul pielii, manifestndu-se prin: urticarie i
eczem; se poate declana la nivelul ochilor sub form de conjunctivit i de
asemenea, afecteaz cile respiratorii provocnd rinoree, rinit i astm bronhic sau
poate afecta tractusul intestinal.
Hipersensibilitatea tip I este mediat de IgE i componenta celular princi-
pal este mastocitul sau bazofilul. Reacia este amplificat de plaketele sanguine,
de neutrofile i de eozinofile, a cror prezen a fost demonstrat prin analize
biopsice ale esuturilor prelvate de la locul reaciei.
Mecanismele de producere a reaciei de hipersensibilitate tip I sunt in-
suficient nelese i de aceea imunlogia acestui tip de reactivitate este n preznt
neclar.
Totui, s-a observat c unii indivizi produc preferenial mai multe celule Th2
care secret interleukine, cum ar fi: IL-4, IL-5 i IL-13 favoriznd elaborarea unor
cantiti aprecibile de IgE cu afinitate foarte ridicat fa de acelai tip de alergen
care realizeaz legturi ncruciate cu cuplul IgE-celula activatoare
De asemenea, n hipersensibilitatea tip I se produce eliberarea unor sub-
stane farmacologic active i realizarea unor legturi ncruciate ale IgE la
receptorul celular Fc al mastocitelor activatoare.
95
 Degranularea mastocitelor este precedat de creterea influxului de Ca++
reprezentnd un proces important n sensul c ionoforii care cresc Ca++ cito-
plasmatic determin degranularea celulelor mastocite n timp ce agenii care duc la
depleia Ca++ supreseaz degranularea.
Celulele mastocite pot fi activate i de ali ageni, cum ar fi: stressul emoio-
nal, diveri ageni chimici (ionoforii de calciu, codeina, etc) i toxine anafilactice
(C4a, C3a, C5a, etc.).
Reaciile mediate de aceti stimuli, fr interaciunea alergen-IgE, nu produc
reacii tipice de hipersensibilitate, cu toate c simptomele care apar sunt
asemntoare.
Factorul de activare a plaketelor (PAF) care produce agregarea plaketelor
sanguine i elibereaz histamin i amine vasoactive contribuie la amplificarea
hipersensibilitii tip I.
Factorul chemotactic eozinofilic A (ECF-A) i factorii chemotactici neutro-
filici, atrag eozinofilele i respectiv neutrofilele care elibereaz diverse enzime
hidrolitice cu aciune necrotic.
Totodat, s-a demonstrat c eozinofilele controleaz reacia local prin
eliberarea de alte enzime, cum ar fi: arylsulfataza, histaminaza, fosfolipaza D,
prostaglandina E .a. dar mecanismul de control al reaciei prin aceste enzime nu a
fost nc elucidat.
Pe de alt parte, studii recente au semnalat rolul posibil al nucleo-tidelor
ciclice n modularea reaciei de hipersensibilitate imediat, dei funcia acestora nu
a fost clar explicat. S-a obsevat c substanele care altereaz nivelele CAMP i
CGMP, modific evident simptomele alergice. De exemplu, substanele care cresc
CAMP determin exteriorizarea simptomelor alergice n special cele
bronhopulmonare, n timp ce substanele care scad nivelul CAMP i stimuleaz
CGMP agraveaz aceste simptome.
Hipersensibilitatea tip II, cunoscut i sub denumirea de hipersensi-
bilitate cito-toxic, poate afecta diverse organe i esuturi.
Antigenele sunt obinuit endogne, cu toate c i ali ageni chimici endogeni,
(haptene) care se pot ataa la membrana celular, pot s declaneze
hipersensibilitatea tip II.
Anemia hemolitic indus de medicamente, granulocitopenia i
trombocitopenia sunt cteva exemple de hiersensibiliate tip II.
Timpul de la contactul cu alergenul i pn la declanarea reaciei este
msurat n minute pn la cteva ore.
Reacia de hipersensibilitate tip II este mediat, n primul rnd de anticorpi
din clasele IgM sau IgG i de complement. Fagocitele i celulele K (ucigae) joac
un potenial rol n dezvoltarea reaciei.
Analiza leziunilor n peparate biopsice evideniaz frecvent anticorpi,
complement i aflux de neutrofile i analizele serologice pot pune n eviden
cantiti apreciabile de anticorpi anti tisulari.
Hipersensibilitatea tip III, sau Complexul imun de hiper-sensibilitate,
se produce n 3-10 ore de la contactul cu antigenul (reacia Artus) i este mediat de
omplexe imune solubile, cel mai frecvent provenind din clasa IgG i ocazional din
clasa IgM.
Antigenele solubile pot fi exogene (infecii bacteriene cronice, infecii virale
i parazitare) sau exogene responsabile de imunitate specific anorganic aa cum
este lupusul eritematos sistemic (SEL).
Componenetele primare sunt complexele imune i complementul
(C3a, C4a, C5a).

96
 Alterarea tisular este cauzat de plaketele sanguine i neutrofile care se
acumuleaz n leziunile alergice mpreun cu complexele imune i complementul.
n ultimul stadiu al bolii alergice s-a observat prezena macrofagelor.
Afinitatea anticorpilor antitisulari i mrimea complexelor imune sunt n relaie
strns cu gravitatea bolii alergice i cu esutul imlicat.
Hipersensibilitatea tip IV . Este cunoscut ca hipersensibilitate mediat
celular sau de tip ntrziat. Exemplul clasic de astfel de hipersensibilitate este
reacia tuberculinic (reacia Mantoux), descoperit ntmpltor de L o u i s
P a s t e u r, n 1882, ncercnd s trateze cobaii de tuberculoz, folosind filtratul de
cultur mbtrnit de Mycobacteirum tuberculosis.
Ulterior, L a n s t e i n e r i C h a s e au demonstrat c reacia tuberculinic
este mediat celular, respingnd ideea implicrii sistemului imun prin anticorpi.
Mai trziu, s-a dovedit c hipersensibilitatea ntrziat se produce i dup
contactul gazdei cu alergene bacteriene, virale precum i cu proteine pure legate de
haptene-adjuvant.
Hipersensibilitatea tip IV este implicat n patogeneza multor boli
autoimune dar, fr nici o excepie apare n boli infecioase, cum ar fi:
tuberculoza, lepra, boala lui Johne, boala Crohn, morva, bruceloza, blastomicoza,
histoplasmoza, toxoplasmoza, leishmanioza .a. dar i a unor granuloame produse
de alergene nespecifice, strine organismului gazd. Astfel, dermatita de contact ,
produs de alergene, ca: otrava iederei, diverse substane chimice, metale grele .a.,
poate fi considerat ca o manifestare a hipersensibilitii tip IV cu leziuni locale
papulomatoase, diferite de cele prezente n reacia tuberculinic.
Dup aspectul clinic i particularitile histologice ale leziunilor,
hipersensibilitatea tip IV se clasific n 3 categorii (tabelul:8)
Tbelul nr.8

Tipuri de racie de hipersensibilitate ntrziat.

Tip de Timp Aspect Histologic Antigen i locul

reacie de clinic de
apariie contact
Tuberculinic 48-72 Induraie Limfocite, Intradermic
0re local, macrofage, (tuberculina,
eritem monocite lepromina,
maleina,
brucelina, etc.
Contact 48-72 Eczem, Limfocite Epiderma
ore papule, urmate de ( chimicale
uneori macrofage.Edem organice, veninul
vezicule al epidermei iederei, metale
grele, etc)
Granuloame 21-28 Induraie Macrofage, Antigen
zile celule persistent, Corpi
epitelioide, strini
celule gigante, (tuberculoz,
fibroz lepra, etc.)

Din momentul contactului gazdei cu alergenul (antigenul), reacia de

hipersensibilitate devine vizibil n 48-72 de ore i leziunile locale se caracterizeaz
prin induraie i eritem.
Imediat dup injectarea sau contactul direct al gazdei cu alergenul
(antigenul), acesta este ingerat de celulele fagocitare (macrofage, neutrofile,
mastocite), procesat i prezentat prin intermediul moleculelor complexe de histo-
97
compatibilitate cl.II (MHC II) celulelor Th1 care ajung rapid la locul de contact
mpreun cu alte tipuri de celule cum ar fi: monocitele , bazofilele, polimorfo-
nucleare .a. dispuse perivascular (Fig.23)

Ag (PPD)

Derm
Mf

L V

V V

A B C

Fig. 23 Mecanismul reaciei tuberculinice

Celulele T recunosc MHC cl. II se activeaz i elibereaz diverse citokine

inflamatorii, dintre care: interferonul gamma (IFN-), factorul de necroza tumoral
(TNF-) i factorul de necroz tumoral- (TNF) (Fig. 24) sunt cele mai
importante citokine inflamatorii care activeaz celulele endoteliale s secrete
prostaciclina, un mediator chimic implicat n stimularea produciei de enzime cu
aciune asupra membranei bazale celulare din endoteliul vascular.
Astfel, celulele endoteliale sufer modificri prin remodelarea membranei
bazale care devine permeabil facilitnd extravazarea macromoleculelor de plasm
n esuturile nvecinate. n acelai timp, fibrinogenl parsete lumenul
microcapilarelor sanguine, difuzeaz n esuturile adiacente, se transform n
fibrin i mpreun cu alte tipuri de celule (monocite, macrofage, limfocite)
particip la indurarea i ngroarea dermului la locul de administrare al
antigenului.
IFN- Activeaz
Citokine macrofagele i sporete
CPA celiberarea de mediatori cu
rol inflamator. Stimuleaz
aderarea moleculelor cu
aciune de permeabilizare
Chemokine Recruteaz macrofagele
a endoteliului vascular.la
locul de inoculare
IL-3/GM-CSF: a
Stimuleaz
TH1 antigenului
producia de monocite de
ctreTNF-,TNF-:
celulel Stem Distrug
din
Citotoxi macrofagele
mduva osoas si. alte celule
ne sensibilizate cu expresia pe
suprafat a liganzilor
Fas.
Activeaz epresia moleculelor
cu aciune n
Fig. 24 - Componente celulare, citokine, chemokine i citotoxine implicate asupra endoteliuluireaciei
producerea
tuberculinice (hipersensibilitate ntrziat- tip IV). vascular

Rspunsul complet se nregistreaz dup 24-48 de ore de la administrarea

antigenului dar la unele specii de animale, aa cum sunt bovinele, intensitatea
maxim a rspunsului se observ la 72 de ore (Popescu St., date nepublicate).
Pe de alt parte, la cobai reacia tuberculinic este diferit din punct de
vedere structural n sensul c la aceast specie predomin infiltratul neutrofilic,
comparativ cu alte specii la care componenta monocitar este principal (23).
98
 Cercetarile ntreprinse de D a n n e n b e r g J .,(60) demonstreaz implicarea
celulelor TCD4+ i TCD8+ n medierea rspunsului la tuberculin. Faptul c
celulele TCD8+ sunt implicate aproape n egal masur cu celulele TCD4+ n
mecanismul de mediere al rspunsului imun la tuberculin s-ar putea datora
particularitilor de replicare ale Mycobacteirum tubercuosis, att intracelular ct
i extracelular. Alte cercetri, evideniaz rolul esenial al celulelor Th2 n ulitma
faz a reaciei tuberculinice, cnd aceast subpopulaie de celule elibereaz
citokinele IL-4 i IL-10 care scad amplitudinea rspunsului n testul intradermic
(202).

3.1.2.8. Imunitatea umoral n tuberculoz (Fig.25).

M.tuberculosis

opsonizare

IgG. anti M. tuberculosis

MHC Macrofag
(CPA)
Chemokine TCR
(IL-1)
Endocitoz
Celula Th

MHC
Citokine
RCB (IL-4)
Celula B

Activare, expansiune clonal, difereniere

IgG

IgG

Celula B Plasmocit
cu memorie ( celul secretoare de
Ac. anti M. tuberculosis)

Fig. 25 - Mecanismul raspunsului imun umoral in infecii cu micobacterii.

Mult vreme s-a considerat c micobacteriile, fiind ageni infecioi intracelulari, nu

se confrunt cu rezisten din partea organismului gazd prin sitemul imun reprezentat de
anticorpi.
Mai trziu s-a demonstrat prezena anticorpilor anti Mycobacterium tuberculosis
n serul oamenilor i animalelor cu tuberculoz.
99
 Mecanismul de producere a anticorpilor, ca rspuns la infeciile
micobacteriene, se aseamn n general cu cel descris pentru majoritatea microbilor
(bacterii, virusuri, parazii, etc.) strini pentru organismul gazd.
Componentele principale care particip la iniierea rspunsului imun
umoral sunt: celulele B, productoare i secretoare de antisorpi specifici, celulele
prezenta- toare de antigen (CPA), reprezentate de macrofage, celule dendritice i
alte populaii cu funcii fagocitare, celulele T, unele chemokine i citokine cu rol n
medierea inter- relaiilor i cooperrii celulare n procesul produciei de anticorpi.
Dup cum se observ n schema de mai sus (Fig 25), rspunsul imun umoral
se declaneaz n momentul n care celulele macrofage vin n contact direct cu
bacilii tuberculozei fagocitndu-i. Dup fagocitare, n interiorul macrofagului se
formeaz vezicule (fagosomi) ncrcate cu bacili care vor fuziona cu lisosomii dnd
natere la fagolisosomi unde bacilii sunt procesai cu ajutorul enzimelor de digestie
i fragmentai n particule antigenice. Aceste particule antigenice se cupleaz n
interiorul macrofagului la situsurile corespunztoare ale moleculelor complexe de
histocompatibilitate cl.II (MHC cl.II) i transportate la suprafaa membranei
citoplasmatice a macrofagului unde sunt prezentate celulelor Th.
n stadiul urmtor, celula Th particip la rspunsul imun umoral fie prin
intermediul receptorilor celulari (TCR) care se leag la MHC cl.II, fie direct prin
capturarea antigenului liber. Ca urmare, macrofagul va elibera interleukina-1 (IL-1)
care intervine n activarea celulei Th. Citokinele proprii eliberate de celula Th
activat declanaz procesul de proliferare i clonare rezultnd celule Th cu recep-
tori de suprafa similari cu cei existeni pe membrana celulei mam cu specifici-
tate pentru antigenul original procesat (determinai antigenic).
n faza efectoare, celula B este componenta de baz care particip efectiv la
producia i secreia anticorpilor. Celula B matur prezint pe suprafa receptori
IgM capabili s primeasc semnale i s recunoasc acelai antigen ingerat de ctre
macrofage n faza de activare.
Receptorul celular IgM se leag la antigenul specific i mpreun sunt
ingerai de celul prin edocitoz. n continuare, antigenul este procesat n interiorul
formaiunilor fagolisosomale prin digestie enzimatic apoi componentele
antigenice sunt transportate la suprafaa celulei cu ajutorul MHC cl.II i prezentate
celulei Th. Celulele Th elibereaz citokine care stimuleaz expansiunea clonal a
celulei B.
n urma diviziunii clonale rezult populaii de celule B cu memorie nde-
lungat (n unele situaii toat viaa organismului gazd) care posed receptori
IgM/IgD i celule citoplasmatice (plasmocite) productoare i secretoare de anti-
corpi cu specificitate identic cu cei prezeni pe suprafaa celulei B paternale.
Ajuni n circuitul sanguin, anticorpii pot ntlni micobacterii libere pe care le
inactiveaz cptuind suprafaa acestora i facilitnd capturarea i distrugerea lor
de ctre macrofage prin opsonizare.
Diferenierea celulelor B. Dup cum este cunoscut, celulele B cu origine
celula Stem din mduva hematogen sunt multipotente dar nediferniate complet.
Diferenierea ncepe cu rearanjarea acidului dezoxiribonucleic (ADN) din
structura segmentelor genelor din lanurile grele ale imunoglobulinei.
n continuare se produce rearanjarea ADN n segmentele DJ ale regiunii
variabile din lanurile grele i, similar repoziionri ale genelor din structura
lanurilor uoare genernd astfel prelimfocitul B.
Stabilizarea celulelor B specifice antigenic i expresia imunoglobulinei la
suprafa se concretizeaz prin apariia celulei B cu funcionalitate complet.

100
 Aceste etape se desfoar independent de prezena sau absena antigenului
micobacterian.
Stadiile dependente de antigen se desfoar n splin , n nodurile limfatice i
alte esuturi periferice dar iniierea propriuzis a diferenierii ncepe n momentul
ntlnirii celulelor B cu antigenul, urmat de activarea acestora de ctre celulele T
i, n sfrit, transformarea lor n limfoblati B i celule plasmatice (plasmocite).
n stadiile de difereniere, celulele B nu produc dect IgM, particularitate care
corespunde rspunsului primar (Fig.26).
Unele dintre celulele B nu se difereniaz n celule plasmatice n schimb
aceste celule suport rearanjri secundare ale ADN care plaseaz genele din
regiunea constant a IgG i IgA sau IgE mpreun cu genele din segmentul VDJ
stabilind astfel fenotipul celulei noi B difereniate care a fost denumit celul B cu
memorie i cu via lung. Celulele B cu memorie sunt deosebit de active i, la
contactul cu antigenul, rspund foarte rapid producnd cantiti nsemnate de
anticorpi IgG, IgA sau IgE n rspunsul imun secundar (Fig.26)

prima inj. Ag A 2-a inj. Ag.

IgG

IgA

IgM

0 10 20 30 40 5o 60 70 80 90 100 120 140 160 180 zile

Rpuns imun primar Rspuns imun secundar

Fig.26 - Dinamica anticorpilor IgG, IgA, IgM anti M. tuberculosis n rspunsul imun primar i secundar

Ca i n alte infecii, pentru a se declana un rspuns imun primar trebuie ca

organismul gazd s nu fi venit anterior n contact cu acelai antigen micobacterian
i celulele sistemului imun s recunoasc pentru prima dat bacilii tuberculoi care
ajung n organism pe oricare din cile cunoscute.
Rspunsul imun primar cuprinde etapei de expansiune clonal i difereniere
a unui numr limitat de celule B i T din populaia de celule lifoide ale gazdei.
Un rspuns imun secundar cuprinde acele evenimente n care componen-tele
sistemului imun dein informaii complete despre antigen i recunosc acelai
antigen cu care gazda a venit n contact anterior.
n rspunsul imun secundar sunt implcate nu numai celulele B nou formate ,
mature, celulele T dar i un numr suplimentar de celule B i T cu memorie,
rezultate din expansiunea clonal iniiat de agentul imunogen, care se implic
activ n creterea n amplitudine a rspunsului imun umoral
Trebuie notat totui, c dinamica i magnitudinea rspunsului imun umoral
n infecii micobacteriene , aa cum au fost reprezentate n graficul alturat (fig.26)

101
sunt arbitrare i ele variaz n funcie de o multitudine de factori care aparin n
egal msur att micobacteriilor ct i gazdei.
Dintre factorii aparinnd agentului infecios se evideniaz: felul i natura
ntigenului (lipide, lipopolizaharide, proteine sau alte componente din celula
bacteriana ntreag), forma de prezentare a antigenelor ctre componentele
sistemului imun de aprare al gazdei (antigene singulare, complexe imunogene,
etc.), precum i cantitatea de antigen capabil s declaneze un rspuns imun
optimal din partea gazdei.
Factorii aparinnd gazdei se refer la : vrst, starea fiziologic i de
sntate, coinfecii cu ali microbi patogeni sau condiionat patogeni, configuraia
imunogenetic .a)
Interesul pentru descoperirea unor antigene micobacteriene care s satisfac
din punct de vedere al capacitii imunogene dar i al valorii diagnostice a crescut
substanial ncepnd din anul 1970 odat cu dezvoltarea i introducerea n
activitatea de cercetare aplicativ a unor metode imunoenzimatice (ELISA) bazate
pe detecia anticorpilor anti Mycobacterium tuberculosis din serul persoanelor i
animalelor bolnave de tuberculoz cu ajutorul anticorpilor mono i policlonali.
Iniial au fost folosite antigene complexe cum ar fi: bacilii ntregi, filtrate din
cultura de M. tuberculosis, extracte din corpul bacterian i derivate proteice
purificate (PPD).
Descoperirea i perfecionarea metodelor de separare electroforetic, cum ar
fi: Western blot i SDF-PEG a permis obinerea unor fraciuni antigenice din
corpul micobacteriilor cu grad nalt de purificare i cu masa molecular cuprins
ntre 6 i 85 kDa, extrase din peretele celular (lipoarabinomanani-LAM, Dimycolil-
trehaloza), extracte din corpul micobacterian (ESAT-6, proteina de 38 kDa, MPB83,
Ag,85, MPB70/80, s.a.) sau din filtratul culturii mycobacteriilor (CFP-10) (243, 139,
173, 112).
Din cercetrile lui B e c T.S. e t a l.,2005 (15) efectutate pe probe de seruri
prelevate de la pacieni cu tuberculoz i de la persoanele care au venit n contact cu
acetia, utiliznd extracte proteice cu masa molecular cuprins ntre 45 i 6 kDa,
obinute prin sonicarea M.tuberculosis, rezult c antigenele de 16 i 6 kDa (ESAT-
6) s-au dovedit capabile s detecteze IgG anti M. tuberculosis la 50,9% i respectiv
57,0% dintre pacienii cu tuberculoz latent.
Alte studii evideniaz capacitatea antigenelor ESAT-6, ferodoxina A i
proteina de 16 kDa de a declana rspuns imun umoral la pacienii cu tuberculoz,
nivelul maxim de anticorpi fiind nregistrat n faza inactiv a bolii, spre deosebire
de antigenele de 38 kDa, Rv2626c i clorindehidrogenaza care detecteaz anticorpii
specifici n faza inactiv. Totodat, experimentele pe oareci infectai cu
M.tuberculosis au demonstrat c nivelele transcripiilor genelor care codific anti-
genele studiate variaz n cursul infeciei sugernd c structura antigenic a M.
tuberculosis variaz n funcie de stadiul infeciei aa nct imunoprofilul
componentelor antigenice din structura micobacteriei poate s fac distincie ntre
stadiile bolii (63).

102
 Bibliografie la Capitolul III

1. Adams L.B., Dinauer M.C., Morgenstern D.E.: Comparison of the host response to Mycobacterium tuberculosis using
transgenic mice. Tub.Lung.Dis.1997; 78: 237- 246.
2. Aheam J.M., Fearon T.D.: Structure and function of the complement receptors CR(CD35) and CR2 (CD21).
Adv.Immunol.1989; 46: 183-219.
3. Albert R.K., Embre J.L., Mc Feely E.J., Hckstein D.D.: Expression and function beta-2 integrins on alveolar macrophages
from human and non human primates. Am. J.Respir.Cell. Mol.Biol.,1992; 7:182-189
4. Alexander D.C., Jones J.R.W., Tan T., Chen J., Liu J.: PimF a monosyl transferase of Mycobacteria is involved in the
Biosinthesis Lipoarabinomanan. J.Biol.Chem., 2004; 279: 18824- 18833.
5. Al Zahrani K., Al Jahdali H., Poirier L., Rene P., Gennaro M.L., Menzies D. Accuracy and utility commercially aviable
amplification and serologic tests for the diagnosis of minimal pulmonary tuberculosis . Am.J.Resp.Crit.Care
Med.,200; 162:1323-1329.
6. Anderson J., Smarina A., Fink J., Rahman S., Grnstrom S.: Impaired Expression of perforin and Granulysisn in CD8-T
cells at the site of infection in human cnronic Pulmonary tuberculosis . Infect. Immun. 2007, 75(11): 5210-5222.
7. Astarie-Dequekter C., NDiaye EN., Le Cabein V., Ritting MG., Prandi J., Marridonui-Parini I.: The manose receptor
mediates uptake of pathogenic and nonpathogenic mycobacteria and bypasses bactericidal responses in human
macrophages. Infect.Immun.1999: 67: 469-4777
8. Appelberg R.I., Orme M.I., de Sousa Pinto M.I., Silva M.T.: In vitro effect of interleukine-4 on interferon-gamma
induced macrophages activation. Immunity, 1992; 76: 553-559.
9. Balcewicz-Sablinska M.K., Gan H., Renold H.G.: Interleukin-10 produced by macrophages inoculated with
mycobacterium avium attenuated mycobacteria-induced apoptosis by reduction of TNF-alpha activity. J.Infect Dis.,
1999; 180(4): 1230-1237
10. Bannwart C.F., Nakaira E.T., Sartori A., Peracali M.T.S.: Interleukin-15:its role in microbial infection . J. Venom .Anim.
Trop. Dis. , 2007; 13(3):562-575.
11. Barnes P.F., Lu S., Abrams J.S., Wang E., Yamamura M., Modlin R.L.: Cytokine production al the site of disease in
human tuberculosis . Infect Immun., 1993; 61: 3482-3489,
12. Barnes P.F., Lu S., Abrahams J.S., Wang E. Yamamura M., Modlin R.L.: patern of Cytokine production by macrophages
and monocytes in diet induced obesity in the rat. J.Inflam., (Lond)., 2005; 2(1):2
13. Bra C.: Imunologie fundamental Ed.Med.Buc., 1986
14. Bean A.G.D., Roach D.R., Briscoe H., France M.P., Korner H., Sedgwick J.D., Britton W.J.: Structural deficiences in
granuloma formation in TNF gene-targeted mice underliethe heightened susceptibility to aerosol Mycobacterium
tuberculosis infection,wich is not compensated for by lymphotoxin. J.Immunol. 1999; 162: 3504-2511
15. Bec T.S., Leite M.O., Arruda S.R., Ferreira W.A.: Humoral response to low the ratmolecular wight antigens of
Mycobacterium tuberculososis by tuberculosis pacients and contacts.Brasil.J.Med.Biol.Res.,2005;38: 587-596
16. Bedoui S., Velkoska E., Bozinovski S., Jones J.E., Anderson G.P., Moris M.J.: Unaltered TNF-alpha production by
macrophages and monocytes in diet induced in diet induced- obesity in the rat. J.Inflam.(Lond)., 2005; 2(1): 2
17. Behar S.M., Divangahi M., Remold G.M.: Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis :is death an exit
strategy? Nature Rev.Microbiol., 2010; 8: 668-674
18. Bekker L.G., Maarteni G., Steyn L., Kaplan G.: Selective increase in plasma tumor necrosis factor alpha and
concomitant Clinical deterioration after tuberculosis initiating therapu in pahtients with severe tuberculosis.
J.Infect.Dis.,1998; 178:580-584.
19. Bellamy L.E., Ruwnde C., Corrah T., McAdam P.Ks. Thurez C.H., Hill A.V.: Tuberculosis and chronic hepatitis B virus
infection in Africans a variation in vitamin D receptor gene. J.Infect Dis., 1999; 179: 721-724
20. Bergeron A., Bonay M., Kambouchner M., Lecassier D., Riquet M. Soler P., Hance A., Tozi A.: Cytokine patterns in
tuberculosis and sarcoid granulomas correlation with histopatologic features of the granulomatous response.
J.Immunol. 159: 3034-3043.
21. Bermudez L.E., Goodman J., Petrofski M.: Role of complement receptors in uptake of Mycobacterium avium by
macrophages in vivo: Evidence from studies Using. Infect.Immun.,1999; 74: 1757-1767
22. Bikle D.D.: Vitamin D ND Immune function: Understanding common pathwys . Curr. Osteopor. Rep.,2009;7(2):58-
73.
23. Black C.A.: Delayed Type Hypersensibility: Curent Theorie with an Historic Perspective. Dematol. On Line J., 1999;
5(1): 7.
24. Blackwell J.M., Black G.F., Peacock C.S. Miller E.N., Sibthorpe D., W.J.J., Gnananandhor D., Sha W.J.J., Shaw M.A.:
Immunogenetics of leishmanial and mycobacterial infections : the Belem family Study. Fhilos. Trans. R. Soc. Lond.
Biol., Sci., 1997,352:1331-1345.
25. Blumerman SL., Herzig C.T., Rogens A.N, Telfer J.C., Boldwin C.L: Differential TCR gene usage between WC1- and
WC1+ ruminant gamma-delta T cell subpopulation icluding those responding to bacterial antigen. Immunogenetics,
2000; 58: 680-692.
26. Bodnar K.A., Sebrina N.Y. and Flynn J.L.: Interaction of Mycobacterium tuberculosis with murine dendritic cells.
Infect Immun. 2001; 69: 800-809
27. Boring I., Gosling J., Chensue S.W. Kunkel S.I. farese R.V.jr., Brexmayer H.E., Charo I,F.: Imparied monocyte migration
and reduced type 1 (Th1) cytokine responses in C-c Chemokine receptor -2 knokout mice. J.Clin.Invest ,1997;
100000: 2552-2581.
28. Bosio M.C., Gardner D., Elkins L.K.: Infection of B cell deficient mice with CDC1551; a clinical isolate Mycobacterium
tuberculosis:Delay in Dissemnination and development of lung Pathology, J.Immunol., 2000; 164: 6417-6425.
29. Boussittis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J., Delgado J.C., Dascher C.C., Beuzouskaya A., Russet D., Reynes J.M., Golfield
A.E.: IL-10 producing T cells suppress immune responses in anergic tuberculosis patients. J.Clin.Investig,,2000;
1o5:1317-1335.
30. Brandshaw L., Davies E., Devine M., Flanagan P, Kelly P. OConnor K., Dobniewski F., Nicolaevski V., Abubakar I.: Thr
role of Interferon gamma Release Assy in Assessing recent Tuberculosis Transmission in a Hospital Incident. PLoS
One,2011; e20770.
31. Braun R.K., Ferrick Ch., Neubauer P., Sjoding M., Kock Sterner A., Kock M. Putnei L., Ferrik D.A., Hyde D.M., Love
R.B.: IL-17 Producing T Cells are required for controlled Inflamatory Response after Bleomycin-induced Lung
Injury. Inflamation, 2008; 31(3): 167-169.
32. Brennan PJ.: Structure function, and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis . Tuberculosis
(edinburg),2003; 83: 91-97

103
33. Brigbill H.D., Libraty H.D., Krutzik R.S., Yang B.R., Belise T.J., Bleherski R.J., Matland M., Novgard V.M., Plevy S.,
Brennan J.B., Bloom R.B., Godowski J.P., Modlin R.L.: Host defense mechanisms trigged by microbial lipoproteins
thrpugh toll-like receptor. Sci., 1999;285: 732-736
34. Bueut Y., Faure E., Thomas L., Equils O., Arditi M.: Cooperation of tool-like receptor-2 signaling. J.Immunol.,2001;
167: 987-994
35. Cassarini M., Meglio F., Alemanno L., Zangrilli P., Mattia P., Bisetti A., Giosue S.:Cytokine levels correlate with
radiologic scare ,inactive pulmonary tubercuosis. Am.J.Repir.Crit.care Med., 1999; 159: 143-148
36. Cassidi JP., Bryson DG., Gutierez Cancela MM., Forster F., Polloc k JM., Neill SD.: Lymphocyte subtypes in
experimentally induced early stage bovine tuberculosis lesions .J.Comp.Pathol.,2001;124:46-51.
37. Chan J. and Flynn J.L. : Latent and reactivation of tuberculosis . Enstein Q.J. Biol..Med. 2000; 17: 69-77
38. Chan J., Tanaka K., Carroll D., Flynn J.L., Bloom B.R.: Effect of nitric oxide synthase inhibitors on murine infection
with Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immunol.1995; 63: 736-740
39. Chan J., Xing Y., Magliozzo R., Bloom B.R.: Killing of virulent Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen
intermediates produced by reactivated murine macrophages. J.Exp. Med. 1992;175: 1111- 1122
tuberculosis protein and determinating its sequences which specifically bind to two human cell-lines. Protein Sci.
2008, 17: 342- 351
40. Chakpour R., Allenbach C., Desgranges F., Charmoy M., Mauel J., Garcia I., Launois P., Cottier TF.: A new function of
the fas FasL pathway in activation macrophages . J.Immunol.,2009 ;161:1558-1567
41. Charles A,. Dinarello M.D.: Proinflamarory Cytokine. CHEST, 2000; 118(2): 503-508.
42. Chen Z.W.: Harnessing of antigen-specific T-cell Immune responses Aganinst Mycobacterial infection. US
Inf.Dis.,2008; 4(1): 20-22.
43. Chensue S.W., Warnington K.S., Allenspach E.J., Lu B., Gerard C., Kunkel S.L., Lucacs N.W.: Differential expression
and cross-regulating function of RANTES during mycobacterial (type 1) and schisostomal (type2) antigen elicited
granulomatous inflammation. J.Immunol. 1999; 163: 165-173.
44. Chroneoss Z.C., Abdolrasunia R., Whitsett A.J., Rice R.W., Sephrd L.V.: Purification of cell-surface receptor for
surfactant protein A. J.Biol..Chem., 1996; 16375-16383.
45. Chul Su Y., Jae-Min Y., Enn-Kyeong J.: The role of Nitric Oxid in Mycobacterial infections. Immune Network,2009;
9(2): 46-52.
46. Chung E.Y., Kim S.J., Ma J.X.: Regulation of Cytokine production during phagocytosis of apoptic cells. Cell.Res., 2006;
16: 154-161.
47. Collins D.M., Kawakami R.P., Jacobs B.R.Jr. : Mutation of the principal Sigma factor causes loss of the virulence
in a strain Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl.Acad.Sci.USA 1995; 92: 8036-8040
48. Colovic R., Grubar N., Jesic R., Micev M., Jancovi T., Colovic N., Atkinson DH.: Tuberculosis lymphadenitis as a cause
of obstructive jaundice: A case report and literature Review. World. J. gastroenterology. 2008 14(19): 3098-3100.
49. Condor R., Rom W.N., Liu Y.M., Schluger N.W.: Local immune responses correlate with presentation and outcome in
tuberculosis. Am.J.respir.Crit.Care med.,1998; 157: 729-735.
50. Cooper A.M., Dalton D.K., Stewart T.A., Griffin J.P., Ruissell D.G., Orme I.M.,: Disseminated tuberculosis in IFN-
gene disrupted mice. J.Exp.Med. 1993; 178: 2243-2248.
51. Cooper A.M., mayer-Barbu K.D., Sher a: role of innate cytokines in mycobacterial infection . Mucosal.Immunol., 2001;
4: 252-260
52. Cottele L.E., sargur R., Egner W., Shakley F., Greig J.: Susceptibility to mycobacterial infection in a Youngman with a
hypoglass nerve palsy: the hunt for on immunological defect. J.R.Soc.Med. Sh.Rep., 2010; 1(2): 21.
53. Cox J.S., Chen B., McNeil M., Jacobs R.J. Complex lipid determines tissue-specific replication of Mycobacterium
tuberculosis in mice. Nature, 1999; 402: 709 783
54. Crisitiansen D., Vaughan H.A., Mieland J., Dodge N., Mouhtouris E., Smyth M.J., Godfrey D.I., saudrin S.: Antibody
response to glycolipid-borne carbohydrates require CD4+ T cells but not CD1 or NK T cells. Immunol.
Cells.Biol.,2011; 89: 502 -510.
55. Croft M, i Swain L.S.: Role of cognate T-B interaction and the cytokine IL-12, IL-4 and IL-6. Immunol.1991; 146:
4055- 4064.
56. Cywes C.N., Gidenir L.N., Hoppe C.H., Scholle R.R., Stein M.L., Kirsch E.R., Ehlers R.M.: Nonopsonic binding of
Mycobacterium tuberculosis to human complement receptor type 3 expression in Chinese hamster ovary. Cells
Infect.Immun., 1996; 64: 5373-5383.
57. Cywes C.N., Hoppe C.H., Daffe M., Ehlers R.M.: Nonopsonic binding Mycobacterium tunerculosis to complement
receptor type 3 is mediated by capsular polysaccharides and is in strain dependent. Infect,Immun.,1997; 65: 4258-
4266.
58. Dahl K.E., Shiratsuki H., Hamilton B.D., Ellner J.J., Toosi Z.: Selective induction of Transforming Growth Factor-beta
in human monocytes by lipoarabinomanan of Mycobacterium tuberculosis.Infect.Immun,1996; 64(2): 399-405.
59. Danelishvili L., Wu M., Stang B., Harrif M., Cirillo S., Cirillo J., Bildfell R., Abrogast B., Bermudes L.E.: Identification
of Mycobacterium avium pathogenity island important for macrophage and amoeba infection. Proc natl.
Acad.Sci,USA,2007; 11038-11043.
60. Dannenberg J. : Delayed-Type Hypersensitivity and cell mediated immunity in pethogenesis of tuberculosis .
Immunol.Today, 1991; 12: 228-233
61. Dannenberg AM jr., and Rook GAW : Pathogenesis of pulmonary tuberculosis an interplay of tissue damaging and
macrophage activating immune responses, dual mechanisms that control bacillary multiplication, protection and
control. Am.Soc.Microbiol.,Washington DC, 1994; p 459-483
62. Davey J.E., Tumberg J., Conrad H.D., Severinson E.: regulation of cell Morfology in B lymphocytes by IL-4. Evidence
for Induced. Cytoskeletal Change.,1998; 160: 5366-5373.
63. Davidson A., Kanaujia V.G., Shi L., Kaiar J., Guo D.X., Sung N., Kaplan G., Menzies D., Gennaro L.M.: Antibody
profiles Characteristic of Mycobacterium infection. Inf.Immun.2005; 73(10): 6846-6851.
64. Demissie A., Abebe M., Aseffa A., Rook G., Fletcher H., Zumla A., Weldnigh., Brock I., Andersen P., Doherty TM>:
Helthy individual that control a latent infection with Mycobacterium tuberculosis express high levels of Th1 cytokine
and IL_4 anatagonist IL-4 delta 2. J. Immunol. 2004; 172:6938-6943;
65. De Nornha A.L., Bafica A., Nogueira L., Barral A., Neto-Barral M.: Lung granuloma form Mycobacterium
tuberculosis /HIV-1 co-infection infected of patients display decreased in situ TNF production. Pathol.res.Pract.,
2008; 204(3): 155-161.
66. de Vall Mallefyt R., Fidgor C.G., Varies J.E.: Effect interleukin-4 on monocytes functions: comparison to interleukin-
13. Res. Immunol.,1993; 144: 629-633

104
67. Dinarello C.A.: IL-18 a Th1 inducing proinflamatory cytokine and new member of the IL-1 family. J. Alerg.
Clin.Immunol. 1999; 103(1): 11-24.
68. Doherty TM., Demissie A., Olobo J., Wolday D. Britton S., Eguale T., Ravn R., Andersen P.: Immune responses to the
Mycobacterium tuberculosis specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among contacts of tuberculosis
pacients. J.Clin.Microbiol. 2002; 40: 704-706.
69. Doherty I.M., Bassett H.F., Quinn P.J., Davis W.C., M0nagham M.L.: Effect of dexamethasone on cell-mediated
immune responses in cattle sesitivised to Mycobacterium bovis. Am.J.vet.Res. 1995; 56: 1300-1306
70. Doherty I.M. and Andersen P.: Vaccines for tuberculosis : Novel concepts and Recent progresse. Clin.Microbiol.
29:2005; 18(4):687-702.
71. Dubnau E.J., Chan J., Raynaud C., Mohan V.P., Lancelle M-A., Yu K., Quemard A., Smith I., Daffe M.: A mutant of
Mycobacterium tuberculosis with no oxygenated mycolic acids is attenuated in mice. Mol.Microbiol.,2000; 36: 630-
637.
72. Dubois MFS: Le tuberculoses chez lanimal et lhome: acualites epidemiologiquetes et diagnostic These, 2002; Ecole
Nat.Vet.Toulouse , FR.
73. Dunne D.W., Resnick D., Greenberg J., Kreiger M., Joiner A.K.: The type 1 macrophage scanverger receptor binds to
gram-positive bacteria and recognized lipotheicoic acid. Proc natl. Acad.Sci.USA, 1994; 91: 1863-1867.
74. Eholie SP. Ehui E., Domoua K., et al. La tuberculose a lheure du sida au Centre antituberculeaux de Bouake (Cote
divoire). Med.Mal. Infect. 1999; 29: 9094
75. El-Masry S., Latfy M., Nasif W.A., El-Kady I.M., Al-Badrawy M.: Elevated serum level of interleukin (IL)-18, interferon
(IFN)- and soluble Fas in patients with pulmonary complication in Tuberculosis. Microbiol.Immunol.,2007; 54(1):
65-67.
76. Encarcion R-M., Dorshkind K.: New perspectives in B-1 Cells development and function. Trend.Immunol., 2006;
27(9): 428-433.
77. Ene E., Stavri H., Nicolescu O., Murgoci G., Biolan T., Nica M., Borina-Du N., Popa M., Popa G.L., Dinulescu D.:
Semnificatia clinic a testelor de diagnostic al infectiei tuberculoase in diagnosticul tuberculozei la copii si
adolescenti cu infectia HIV. Rev.Rom.Boli Infect, 2009;XII(1): 20-31.
78. Ernst J.D.: Receptor of Macrophages for Mycobacterium tuberculosis. Infect immune. 1998; 66: 1277-1281
79. Fieschi C., Bosticardo M., de Beancoundrey L., Depuis-Bosson S., Feinberg J., Santos O.F., Bustamante J., Levy J.,
Candotti F., Casanova J-L.: A novel form of complete IL-12/IL-23 receptor 1 defficiency with cell surface
expressed non functional receptor. Blood, 2004; 104: 2095-2101.
80. Fifis T., Corner L.A. Rothel J.S., Wood P.R.: Cellular and humoral immune responses to Mycobacterium bovis antigens.
Scand.J.Immun. 1994,39: 267-274
81. Flynn J.L. and Chan J., Immunology of tuberculosis;. Annu. Rev. Immunol. 2000; 19: 93-129
82. Flynn J.L. and Chan J.: Tuberculosis: Latency and reactivation. Inf.Immun.2001; 69(7): 4195 - 4201
83. Flynn J.L. and Ernst J.D. : Immune responses in tuberculosis . Curr.Opin Immunol., 2000; 12: 432- 436.
84. Flynn J.L. Chan J., Dalton D.K., Stewart T.A., Bloom B.R.: An essential role for interferon-gamma in resistence to
Mycobacterium tuberculosis infection . J.Exp. Med. 1993; 178: 2249-2254
85. Flynn J.L., Goldstein M.M., Chan J., Trichold K.J., Pfeffer K., Lowenstein C.J.. Schreiber R., Mak T.W., Bloom B.R.:
Tumor Necrosis Factor alpha is required in the protective immune response against M. tuberculosis in mice,
Immunity, 1995; 2: 561-572.
86. Flaynn J.L., Scanga C.A., Tanaka K.E., Chang J.: Effect of amidoguanidine on latent murine tuberculosis . J . Immunol.
1998; 160: 1796-1803
87. Flynn J.L., Goldstein M.M., Triebolo J.K., Koller B., Bloom R.B.: Major Histocompatibility Complex Class I restricted
T-cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. Proc.Natl. Acad.Sci.Usa, 1992; 89:
1203-12-17
88. Fletcher HA, Owiafe P., Jeffries D. Hill P., Rook GA., Zumla A., Doherty TM., Brookers R., Increased expression of m
RNA encoding interleukin (IL-4) and its splice variant IL-4-delta2 in cells from contacts of Mycobacterium
tuberculosis Imunol. 2004; 112: 669-673.
89. Forestier C. Morena E., Meresse S., Pholipon A., Olive D., Sansonetti P., Gorvel J.P.: Interaction of Brucella abortus
Lipopolisacharide with Major Histocompatibility Complex Cl.II. molecule in B Lymphocy tes. In.Immunf., 1999;
67(8): : 4048-4054.
90. Franke U., Ochs D.H.: Thr CD40 ligand gp 39 is defective in activated T-cells from patients with x-linked hyper IgM-
Syndrom. Cell.,1993; 72: 291-300.
91. Frienland J.S., Hartley J.C., Hartley C.G., Shatock R.I., Griffin G.E. : Inhibition of ex vivo proinflamatory cytokine
secretion in fatal Mycobacterium tuberculosis infection. Clin.exp.Immunol., 1995; 100: 233-238.
92. Fulton M.J., Golenback T.D.:LPS- binding proteins Receptor. J. Leukoc. Biol., 1998; 64:25-32
93. Fulton A. S., Rebo S.M., Martin T.D., Bodu W.M. : Neutrophil mentaine micobacterial immunityin the lung, during
Mycobacterium bovis BCG infection in C57* L/6 mice. Infect.immun., 2002; 70: 5322-5327.
94. Fulton A.S., Rebo M.S., Pai K.R., Pennini M., Torres M., Harding V.C., Boom H.W.: Inhibition of Major
Histocompatibility Complex Cl.II. Expression and Antigen Processing in murrine Alveolar Macrophages by
Mycobacterium bovis BCG and 10-kilodalton Mycobacterial Lipoprotein. Inf.Immun., 2004; 72(4): 2102-2110.
95. Fux B., Rodrigues V.C., Portela W.R., Silva M.N., Su C., Sibley D., Vitor A.W.R., Gozzinelli T.R. : Rple of cytokine and
Major Histocompatibility Complex Restriction in Mouse resistance to Infection with natural Recombinant strain
(typeI-III) of Toxoplasma gondi. Inf.immun.,2003; 71(11): 6392-6401.
96. Gadir N., Lee E., Toski A., Foster D.A.: Supression of TGF-beta signaling of phospholipase D. Cell..Cycle., 2007; 6(22):
2840-2845.

97. Gali S.J., Maurer M., Lautz C.S.: Mast cells as sentinels of innat immunity. Curr.Opin.Immunol.,1999; 11: 53-59.
98. Gallegas M.A., van Heijst J.W.J., Samstein M., Su X., Pamer E.G., Glikman M.S.: A gamma-interferon independent
Mechanism of CD4T cell Mediated control of M.tuberculosis infection in vivo. PLoS Pathogen, 2011; 7(5) e 10020.
99. Ganaiem M.,Abu Elhija M., Lunenfeld E., Cherny N., Weisze N., Itach S.B-S., breibant H., Apte R., Hubihel M.: Effect
of interleukin-1 Receptor Antagonist Gene Deletion on Male Mouse. Fertility-Endocrinol., 2009; 150(1): 295-303.
100. Garcia V.E., Uyemura K., Sieling PA, Ochsa M.T., Morita C.T., Okamura H., Kurimoto M., Rea T.H., Modlin R.L.: IL-
18 promotes type1 cytokine production from NKcells and T Cells in human intracellular infections.
J.Immunol.,1999; 162: 6114-6121.
101. Garcia I., Vesin D., Ollers M.J., Vassalli P.Chvatchko Y., Iacobs M., Riffel B.: Lethal Mycobacteriumbovis Calmette-
Guerin Infections in Nitric Oxid Synthase 2 Deficient Mice: Cell Mediated immunity requires Nitric Oxide
Synthase-2. Lab.Invest,2000; 80: 1385-1397.
105
102. Gaynor C.D., Mc Carrmack X.F., Vollker R.D., Mc Gown E.S. Schlesinger S.L.: Pulmonary surfactant protein A,
mediates enhanced by direct interaction with human macrophages J.Immunol.,1995; 155: 5343-5351.
103. Gelijsteinbeek TB., van Vliet SJ., Koppel EA., Hernandez-sancez M., et al.: Mycobacteria target DC-SIGN to suppress
dendritic cell function. J.Exp.Med. 2003; 197: 7-17
104. Geraso F., Nsii C., Righetti S., Micciolo R., Marchesisni M., Cazzadori A., Trichieri G.: CD4+ Cells clones producing
both interferon gamma and interleukin-10 predominate in bronhoalveolar lavage of active pulmonary tyberculosis
patients. Clin. Immunol.1999; 92: 224-234.
105. Glikman M., Cox J.S., Jacobs W.R.jr.: A novel mycolic acid cyclopropan syntetase is required for cording,
persistence and virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol.Cell,2000; 5: 717-727
106. Goldfeld A.E., Delgado J.C., Thim S., Bozen M.V., Cohen A., Yunis E.J.: Association of an HLA-DQ allele with clinical
tuberculosis. JAMA., 1998; 279: 226-228

107. Gomez J.E., Chen J.M., Bishai W.R.: Sigma factor of Mycobacterium tuberculosis. Tuberc.lung.Dis., 1997; 78: 175-
183.
108. Gomez M., Doukhan L., Nair G., Smith I.: Sig A is an essential gene in Mycobacterium smegmatis Mol.Microbiol.,
1998; 29: 617-628.
109. Gong J., Zhang M., Moldin R.L., Linsley P.S., Iyer D.V., Lin Y., Barnes P.F.: Interleukin-10 downreglates
Mycobacterium tuberculosis induced TH1 responses and CTLA-4 expression. Infect.Immun.,199664:913-918.
110. Graham J.E., Curtis-Clark J.E.: Intensification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthetised in response to
phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 1999; 96: 1554-11559
111. Grange J.M., Zumla A.: Tuberculosis, sect8, Cap.5.,2011 .

112. Harald G.W., et al.: Immunochemical characterization of the MPB70/80 and MPB83 Proteins of Mycobacterium
tuberculosis . Inf.Immun.1998; 66(4): 1445-1452
113. Harrigton L.E., Hatton D.R., Mangan R.P.: Interleukin 17 producing CD4+ effector T-cells develop via lineage
distinct from T-helper type 1 and 2 lineage. Nat.Immunol., 2005; 6(11): 1023-1032.
114. Hemmi H., Takeuki O., Kawai T., Kaiso T., Saoto S., sanjo H., Matsumoto M., Hashimo H., Tokedo K., Akira S.: A toll-
like receptor recognize bacterial DNA. Nature, 2000; 408: 740-745.
115. Henning L.N., Azad A.K., Parsa K.V.L., Crowcher J.E., Tridandapani S., Schlesinger L.S.: Pulmonary surfactant
Protein A: A key regulator of Toll-like Receptors expression and activity in human macrophages. J.Immunol., 2008;
180: 7847-7858.
116. Hernandez P.R., Orzaco R.H., Sampieri A., Pavon L., Velasquillo P.L., Shad L.J., Alcacer J.M. Madrid M.V.:
Correlation between the kinetics of the Th1/Th2 Cells and pathology in a murine model of experimental pulmonary
tuberculosis, Immunol.1996; 89: 26-33
117. Honer Z.U. Bentrup K., Miczak A., Swenson D.L., Russell D.G. Characterization of activity and expression of isocitrate
lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis .J. Bacteriol., 1999; 181:7161-7167.
118. Howard A.D., Zwilling B.S.: Reactivation of tuberculosis is associated with a shift from type 1 to type 2 cytokines .
Clin.Exp.Immunol.1999; 115: 428-434.
119. Hrisch C.S. Yoneda T., Averill L., Ellner J.J., Toosi Z.: Enhacement of intracellular growth Mycobacterium
tuberculosis in human monocytes by transforming growth factor-beta. Infect. Dis. 1994; 170: 1229-1237.
120. Hrisch C.S., Ellmer J.J., Russell G.D., Rich A.E.: Complement receptor r mediated uptake and tumor necrosis factor-
alpha mediated growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis by alveolar macrophages. J.Immunol.1994; 155:
5343-5511.
121. Hirsch C.S., Ellner J.J., Blinkhorn R.., Toosi Z.: In vitro restauration of T cell response in tuberculosis and
augmentation of monocyte effector function against Mycobacterium tuberculosis by natural inhibitors of
transforming groth factor beta. Proc natl. Acad.Sci.USA 1997; 94: 3926-3931.
126. Hrisch C.S. Toossi Z., Othieno C., Johansen J.L., Schwander S.K., Robertson S., Wallis R.S., Edmonds K., Okwera A.,
Mugerwa .,Peters P., Ellner J.J.: depressed T-cell Interferon gamma responses in pulmonary tuberculosis analysis
of undelung mechanism and modulation in therapy. J,Infect,Dis.1999; 180: 2069-2073
127. Hrisch C.S., Hung C.C., Chen M.Y., Sheng W.H., Chang S.C.: Dynamics of plasma cytokine levels in patients with
advanced HIV infection and active tuberculosis: infection for early recognition of patients with par response to anti-
tuberculosis treatment. AIDS.,1999;13: 935-941.
128. Iancovic D., Chever W.A., Kullberg C.M., Wyinn G., Yap G., Caspar P., Lewis A.F., Clynes R., Ravetch V.J. ,Shr CD4+
T-cell-mediated granulomatous pathology in Schisostomiasis in down reglated by B-cell-dependent mechanism
requiring Tc-receptor signaling. J.Exp.Med.1998; 187: 619
129. Iancovic D., Wyinn A.T., Kullberg C.M., Hieny S., Caspar P., James S., Cheever W.A., Sher A.: optimal vaccination
against Schiostosoma mansoni requires both B cell and IFN- dependent effector mechanism. J.Immunol.,1999;
162: 345.
130. Iho S., Yamamoto T., Takahashi T., Yamamoto S.: Oligodeoxinucleotides containing palindrome sequence with internal
5-cpG-3act directly on human NK and activated T Cells to induce IFN-gamma production in vitro.
J.Immunol.1999;163:3642-3652.
131. Ioachimescu O.C., Tomford J.W.: Tuberculosis. Desease Management. Project, Main, Cleveland. Clin. Center.,
Ed,Aug, 2010.
132. Jaiswal I.A., Craft M.: CD40 Ligand induction on T-Cells subsets by peptide presenting B cell. J.Immunol.,1997;
159: 2282-2291.
133. Janeway A.C., Travers P., Walport M., Shlomchil M.: Immunology, 2007, Ed. 7-th, cap.9, part.IV.
134. Janeway A,C,jr., et al.: I mmunology 6-th ed. Gerald Sci,2005.
135. Johanson C.M., Cooper A.M., Frank A.A. Bonerins B.C., Wysoki L.J. Orme M.I.: Mycobacterium tuberculosis
acrogenic rechalenge infections in B-cell-deficience mice. Tuberc.Lung.Dis.,1997;78: 257
136. Johnson B.J., Mc Murray D.N.: Cytokine gene expression by cultures of h uman lymphocytes with autologus
Mycbacterium tuberculosis infected monocytes. Infect.Immun., 1994; 64:1444-1450.
137. Juffermans N.P., Verban A., van Deventer J.S.H., Buurman A.W., van Ddeutekon H., Speelman P., van der Pall T.:
Serum concentration of lipopolysacharide activity-modulating proteine during tuberculosis . J.Infect.Dis, 1998; 198:
1839-1842.

106
138. Juffermans N.P., Verban A., van Deventer J. S,H.,van Deutekon A., Belisle J.F., Ellis M.E., Speelman P., van der Poll
T.: Elevated chemokine concentration in sera of human immunodeficiency virus (HIV) seropositive and HIV
seronegative patients with tuberculosis : a possible rol for micobacterial lipo-arabinomanan. Infect.Immun.,1999;
67: 4295-4297.
139. Julian E., Matas L., Alcaide J., Luquin M.: Comparison of antibody responses to a potential combination specific
glycolipids and proteins for test sensitivity improvement in tuberculosis serdiagnosis.Clin Diagn.lab.Immunol. 2004;
11: 70-76.
140. Juncheira Kipins A.P., Kipins A., Tomoyo M.H.,Juarreo M.G., Basaraba R.J., Orme I.M.: Interleukin-10
production by macrophages in CBA-xid mutant mice infected with Mycobacterium tuberculosis . Immunol.,2005;
115(2): 246-252;
141. Kamath B.A., Alt J., Debbabi H., Taylor C., Behar M.S.: The Major Histocompatibility Complex Halotype Affect not
resistance to Mycobacterium tuberculosis C3H Mice. Infect Immun.,2004; 72(12): 6790-6798.
142. Kasahara K., Tobe T., Tomita M., Mukaida N., Boshao S., Matushima K., Yoshida T., Sugihara S., Kabaiastri K.:
selective expression of monocyte chemotactic and activating factor, monocytes by Mycobacterium tuberculosis.
J.Inf.Dis., 1994; 170: 1238-1247.
143. Kang BK., Schlesinger LS., : caracteriztion of man ose receptor mmediates phagocytosis mediated by Mycobacterium
tuberculosis lipoarabinomana. Infe ct.Immun.1998; 66: 2769-2777
144. Keane J., Gershon S., Wise R.P., Mirabite-Levens E.,Kaszanica J., Schwieterman W.D., Siegel J.N., Braum M.M.:
Tuberculosis associated with infliximab, a Tumor necrosis factor alpha neutralisisg agent. N.Engl. J.Med.,2001;
345: 1098-1104
145. Kelller C., Hoffman R., Lang R., Brabdan S., Hermann C., Ehlers S.: Genetically determinated susceptibility to
tuberculosis in mice; causally involves accelerated and inhanced recrutiments of granulocytes. Infect immune.,2006;
74: 4295-4309.
146. Kelsoe G.: The genetical center: role crucial for Lymphocytes selection onclonal expansion. Progr.Immunol.Proc.7-th
Congr.Immunol.1990; 7: 415-423
147. Kelsoe G.: The germinal center :a cruciabil for lymphocyte selection. Sem.immunol., 1996; 8: 170-184.
148. Kleibanhoff C.A, Finkelstein S.E, Surman D.R, Lichtman M.K, Gattinoni L, Theoret M.R, Grewal N, Spiess P.J,
Antony P.A, Palmer D.C, Tagaya Y, Rosenberg S.A, Waldmann T.A, Restifo N.P: IL-15 enghances the in vivo
antitumor activity of tumor-reactive CD8+ T. Cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2004; 101(7): 1969-1974.
149. Kostka .L., Knop J., Konur A., Udey M.C., von Stebut E.: Distinct Role for IL-1 receptor type Isignaling in Early versus
Estabilished Leishmania major Infections. J.Invest.dermatol.,2006; 126(7): 1582-1589.
150. Kennedy HE., Welsh MD., Bryon DG., Cassidy J.P., Forster FI., Howard CJ., Collins RA., Pollock JM.: Modulation of
immune responses to Mycobacterium bovis in cattle depleted of WC1+ gamma-delta T-cells. Infect Immun 2000;
70: 1488-1500.
151. Kinndler V., Sappino A-P., Grau G.E., Piguet P-F., Vassalli P.: The inducing rol of tumor necrosis factor in development
of bactericidal granulomas during BCG infection. Cell 1989; 56:731-740.

152. Kita S., Tsuda T., Sugisaki K., Myazaki E., Matsumoto T. Characterization of distribution of T lymphocyte subsets and
activated T lymphocytes infiltrating into Sarcoid lesions. Intern.Med. 1995; 34: 847-855.

153. Korf JA., Verschoor J., de Baetseler P., Grooten J., : The mycobacterium tuberculosis cell wall component mycolic acid
elicits pathogen associated host innate responses. Eur.J.Immunol. 2005; 35:890-900
154. Kupfer H., Monks R.C., Kupher A.: Small splenic B-cells that bind to antigen specific T-helper (Th) cells and face the
site a cytokine production in the Th cells selective by proliferate: immunfluorescente microscopic studies of tH-B
antigen presenting cell interaction. J.Exp. Med., 1994; 179: 1507.
155. Kurashima K., Mukaida D. Fujimora M., Yosui M., Nakazumi Y., Matsuda T., Matsushima K.: Elevated chemokine
levels in bronhoalveolar lavage fluid of tuberculosis patients. Am.J.Respir,Crit.CareMed.,1997;155:1474-1477
156. Laal S., Samanich M.K., Soneberg G.M., Belisle T,J, OLeary J., Sunbergcoff S.M., Pazner-Zolla S.: Surogate marker of
preclinical tuberculosis in Human Immunodeficiency Virus infection: antibodies to an 88 kDa secreted antigen of
Mycobacterium tuberculosis J.Infect.Dis.1997; 176: 133-143
157. Ladel C.H., Blum C., Dreher A., Reifenberg K., Kapf M., Kaufmann S.H.: Lethal tuberculosis in interleukin-6 deficient
mutant mice. Inf,Immun.1997; 62(11): 4843-4849
158. Lai J-F., Zindl C.L., Dulfy L.B., Atkinson T.P., Yung Y.W., van Rooijen N., Waites K.B., Krause D.C. Chaplin D.D.:
Critical role of Macrophages and their Activation via MyD88-NKB signaling in Lung innate Immunity to
Mycoplasma pneumoniae. PLoS One,2010; 5(12): e14417.
159. Lai C.K., Ho S., Chan C.H., Chan J., Choy D., Leung R., Lai K.N : Cytokine gene expression profile of circulating
CD4+T cells in active pulmonary tuberculosis. Chest,1997; 111; 606-611
160. Lagranderie M., Goudon P., Winter- Laurent C., Energuix P., Chavarot P., Thouron F., Maranghi E., Pelicic V.,
Portonoi D., Marshal G., Giquel B.: Atenuation of virulence by disruption of the Mycobacterium tuberculosis ersp
gene . Science, 1998; 282: 759-762.
161. Lanzavechio A.: Receptor mediated antigen uptake and its effect on antigen presentation to Cl.II-restrict T
lymphcytes. Ann,J,Immunol.,1990; 8: 773-793.
162. Laurinkova B: Interleukin-1 family: from gene to human disease. Acata.Univ. Polacki, Oloume , 2001; 143: 19-29.
163. Law K., Weiden M., Harkin T.K., Tchon W., Chi C., Rom W.N.: Increased release of interleukin-1 beta, interleukin-6
and Tumor Necrosis Factor alpha by bronhioalveolar cells lavage from involved sites in pulmonary tuberculosis.
Am. J. Respir.crit.care Med. 1996; 153: 799-804.
164. Lee J., Hartman M., Kornfrct. H.: Macrophage Apoptosis in tuberculosis . Yonsey Med.J. 2009 50(1): 1-11.
165. Leinhardt CA., Azzuri A, Amedei A., Fiel;ding K., Sillah J., Sow OY., Bah B., Benagiano M., Diallo A., Manetti R.,
Manneh K., Gustafson P., Bennet S. DElios M.M., Mc.Adam Keith, Del Prete G.: Active tuberculosis in Africa is
associated with reduced TH1 and increased Th2 activity in vivo. Eur.J.Immunol.,2002; 32(6):1605-1613.
166. Leung Chi. C. Chang K.C.: Role of interferon gamma release assays in tuberculosis.2009; 14(2): 156-158.
167. Lewin H.A., Rusell G.C.: Comparative organization and function of the Major Histocompatibility Complex of
domesticated cattle. Immune.Rev.,1999; 167(2): 145-158.
168. Li B., Bassiri H., Rossman MD., et al. Involvement of the Fas/Fas ligand pathway in activation-induced cell death of
Mycobacterium-reactive human delta T cells: a mechanism for the loss of gamma delta T cells in patient with
pulmonary tubwerculosis . J.Immunol.1998, 161: 1558-1567.
169. Liebana E., Marsh S., Gough J., Nunez A., Vordemaier HM., Whelan A., Spencer Y., Hardlei-Clifton R., Hewinson G.,
Jhonson I.: Distribution and activation of T-lymphocyte subsets in Bovine tuberculosis Lymph-node Granulomas.
Vet. Pathol.,2007; 44: 366-372
. 107
170. Liebana E., Girvin RM>, Welsh M., Neill SD, Pollock JM.: generation of CD8+T-cell response s to Mycobacterium
bovis and mycobacterial antigens in experimental bovine tuberculosis . Infect. Immunol. 1999; 67: 1034-1044

171. Liebana E. Arnaz A., Aldwell FE., McNair J., Neill SD., Smuth AJ., Pollock JM.: Cellular interaction in bivine
tuberculosis release of active mycobacteria from infected macrophages by antigen-stimulated T-cells. Immunol.
2000; 99: 23-29.
172. Liu Y.J., Zhang J., Lane P.J., Chan E.Y., Mac Lann I.C.: Sites of specific B cell activation in primary and secondary
responses to T-cell dependent and T-cell independent antigens. Eur.J. Immunol. 1991; 2: 2951-2962.
173. Lopez Marin L.M., Segura E., Hermida-Escobedo C., Lemassu A., Salinas-Carmona M.C.: 6-6 Dymycolil trehalose
from rapidly growing Mycobacterium an alternative antigen for tuberculosis serodiagnosis. FEMS
Immunol.Med.Microbiol. 2003; 36: 47-54
174. Lucacs N.W., Addison C.L., Gauldie J., graham F., Simpson K., Strieter R.M., Warmington K., Chesue S.W., Kunkel
S.L.: Transgene induced production of IL-4 alte the velopment a collagene expression of T-helper cell type 1
pulmonary granulomas . J, Immunol. ,19997; 158: 4478-4484.
175. Lyn Y., Zang M., Hofman F.M., Gong J., Barnes P.F.: Absence of proeminent TH2 cytokine respons in human
tuberculosis. Infect.Immun.,1996; 64: 1351-1356.
176. Ma Y., Pannicke U., Sahwarz K., Liber R.M.: Hairpin opening and overhand processing by an Artemis DNA dependent
protein-kinase complex in nonhomologus end Joining and V(D)J recombination. Cell.,2004;108: 781-794
177. Mac Kinney J.D., Honer Z.U., Bentrup K., Elias-Munoz E.J., Miczak A., Chen B., Chan W-T., Swenson D., Sacchettini
J.C. Jacobs W.R. jr., Russell D.G.: Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice
requires the glioxilate shunt enzyme isocitrate lyase. Nature, 2000; 406: 735-738.
178. Mac.Lennan M.C.I.: Germinal centers Ann.Rev.Immunol.1994; 12:117-139
179. Mac Micking J., North J.R., La Course R., Mudgett J.S., Shah S.K. Nathan C.F.: Identification of nitric oxide synthase
as protective locus against tuberculosis . Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997;94: 5243-5248
180. Maeurer M., Selinger B., Trinder P., Gerder J., Setzer U.: Interleukin-15 in Mycobacterial infection of antigen
presenting Cells. Scand.J.Immunol. 1999; 50: 280-288
181. Main R., Clair E.W. St., Breedveld F., Furst D., Kalden J., Weisman M., Lipski P.: Infelexibile (chimeric anti-tumor
necrosis factor a monoclonal antibody) versus placebo in reumatorid arthritis: a randomized Phase III trial. Lancet,
1999; 354: 1932-1939
183. Mahon B.P.,Sheahan J.B., Griffin F., Murphy G., Millis H.K.: Atypical disease after Bordetella pertusis respirtory
infection of mice with target disruption of interferon-gamma or immunoglobulin chain genes.
J.Exp.Med.,1997,186:1843.
184. Malik AZ., Denning MG., Kusner JD.: Ihibition of Ca2+ signaling by Mycobacterium tuberculosis is associated with
Reduced Phagosome-Lisosome Fusion and induced Survival within Human macrophages J. Exp. Med. 2000; 191(2):
287-302.
185. Manabe Y.C., Saviola JB., Sun J., Murphy J.R., Bishai W.R.: Attenuation of virulence in Mycobacterium tuberculosis
expressing a constitutively active iron repressor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1999; 96: 12844-12949.

186. Manca C., Reed MB., Freeman S., Mathema B., Kreiswirth B., Bary CE., Anf Kaplan G.: Deiferential monocyte
activation underlies starin specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. Infect.Immun.. 2004; 72: 5511-5514

187. Manneh K., Gustafson P., Bennett S., DElios MM>, Mc Adam K., Delpretet G.: Active tuberculosis in Africa is
associated with reduced Th1 and increased TH2 activity in vivo. Eur.J.Immunol., 2002; 32:1605-1613
188. Masser D.M., Edwars J.P.: Exploring cefull spectrum of macrophage activation. Nature.Rev.Immunol. 2008;
8(12): 958-969.
189. Matsuda A., Ocoyama Y., Ebihara N., Yoko N., Gao P., Hamura J., Konoshita S.: High affinity receptor chain
expression in human mast cells. J.Immunol.Method. 2008; 336(2): 229-234.
190. Mazurek G.H., Lo Bue P.A., Dally C.L., Bernardo J., Lardizabal A.A., Bishai W.R., Iademarko F.M. Rothel J.S.:
Comparison wole-blood interferon-gamma assay with TST for detecting latent Mycobacterium tuberculosis
infection. JAMA,2001, 286: 1740-1747
191, Mc.Clelland E.E., Grancer L.D., Petts K.W.: Major Histocompatibility Complex. Dependent susceptibility to
Criptococcus neoformans in Mice. Infect Immun.,2003;71(8): 4815-4817
192. Mc Curdy J.D., Olynich T.J., Maher L.H., Marchal J.S.: Cuting edge:distinct Toll-like receptor antagonist on
Mycobacterium tuberculosis induced Macrophages responses. J.Immunol.2003; 170: 1625-1629.
193. Meraviglia S., El Daker S., Dieli F., Martini F., Martino A.: Cross Link innate and adaptive Immunity in
Mycobacterium tuberculosis infection. Clin,Develop.Immunol.2011: 1-11
194. Metcalfe D.D., Baran D., Mecari Y.A.: Mast cells. Physiol.Rev.,1997,77: 1038-1897.
195. Michallef M.J., Ohtsuki T., Khono K., Tanabe F., Ushio S. Namba M., Tanamito T., Torigoe K., Fujii M. Ikeda M.,
Fukuda S., Kurikoto M.: interferon-gamma-inducing factor enhance T helper 1 cytokine production by stimulated
human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur.J.Immunol. 1996; 26:1467-
1651.
196. Mogue T., Goodrich M.E., Ryan L., La Course R., North R.J.: The relative importance of T cell subset in immunity and
immunopathology of airborne Mycobacterium tuberculosis inf ection in mice. .Exp.med. 2002; 19: 271-280.
197. Mohamed K.A., Nasser N., Ward M.J. Mubarak K.K., Panadero-Rodriguez P., Antony V.B.: Mycobacterium mediated
chemokine expression in pleural mesothelial cells; role of C-c Chemokines in tuberculous pleurisy J.Infect.Dis.,1998;
178: 1450-1456.
198. Mohan V.P., Scanga C.A., Keming Yu., Holly M.S. Tanaka E.K., Tsang E., Tsai M.C., Flynn J.L, Chang J.: Effect of
Tumor necrosis Factor Alpha on Host Immune response in Chronic Persistent Tuberculosis : Posible Role for
Limiting Pathology. Infect Immun. 2001; 69(3): 1847-1855
199. Moglione J.P., Xu J., Cha J.: B cells Moderate Inflamatory Progression and Enhance bacterial Containement upon
Pulmonary Change with Mycobacterium tuberculosis. J.Immunol., 2007; 178: 7222-7234
200. Mller B, Villiger P.M.: Inhibition of IL-1,IL-6 and TNF- in immune mediated inflammatory disease.
Spring.Semin.Immunol.,2006; 27(4): 391-408.
201. Morrison P.R., Feilzer K., Tumas B.D.: Gene knockout mIce Establish a Primary Protective Role for Major
Histocompatibility Complex Class II. Restricted respons in Chlamydia trachomathis Genital Tract Infection.
Inf.Immun. 1995;63: 4661-4668.

108
202. Mosmann T.R., Moore K.W.: Role of IL-10 in crossregulation of Th1 and Th2 responses. Immunol. Today ,1991; 12:
A49- 53. receptenhanced or that mediates
203. Ndungu F.M., Cadman E.T.Colucher J., Nduati E., Couper E., Mac Donald D.N., Dorothy Ng., Langhorne J.:
Functional memory B cell and long-lived Plasma cells generated after single Plasmodium chabandi infection in Mice.
PLoS Pathogen, 2009; 5(12): e1000690
204. Nelson CD, Reinhardt TA, Beitz DC, Lippolis JD: Modulation of bovine innate immune response production of alpha,
25-hidroxyvitamin D3 in bovine mobnocytes. J.Dairy Sci.2010,93(3): 1041-1049.
205. Nepomucenco R. Henschen-Edman R., Burgess H.W. Tenner J.A.: CDNA Cloning and primary structure analysis of
C1qR(p) the human Cq1/MbL/SPA receptor that mediates enhanced phagocytosis in vitro. Immunity, 1997; 6: 119-
129
206. Netea M.G., Kullberg B.J., Vershueren I., van der Meer J.W.: Interleukin-18 induces production of proinflamatory
cytokine in mice: no intermediate rol for cytokine of Tumor Necrosis factor family on interleukin-1 beta.
Eur.J.Immunol., 200;30(10): 3057-3060
207. Niart A., Jepson A., Banya W., Bennett S., Wittle H.T., Martin GN., Hill VA.: Quantitative association test of immune
responses to an antigens of Mycobacterium tuberculosis : a study of twins in West Africa. Twin rec.2004; 7:578-588;
208. Noelle R.J., Roy M., Shepherd M.D., Stamenkovic I., Ledbetter A.J., Aruffo A.: A 39 kDa protein on activated helper T
cells binds CD40 and transduces the signal for activation of B cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992; 89: 6550
209. Noss E.H., Rading C.V., Boom W.H.: Mycobacterium tuberculosis inhibits MHC cl.II antigen processing in murine
boni morrow macrophages. Cell.Immunol.2000; 201: 63-74.
210. Nuzz I., Galdiero M., Bentivoglio C., Galdiero R., caraatelli-Romano C.: Apoptosis modulation by mycolic acid,
tuberculostearic acid and trehalose 6,6 dimycolate. J.Inf..2002; 44: 229-235
211. Ochoa MT, Stenger S, Sieling AP, Uzynski T S, Sabet S., Cho S., Krensky AM., Rollinghoff M, Sarno NE, Burdick EA,
Rea HT, Modlin LR: T-cell release of granulysin contributes to host defense in leprosy. Nat.Med. 2001, 7: 174-179.
212. Oddo M., Renne T., Attingen A., Bakker T., Mac Donald R.H., Meyean PP.: Fa3 ligand induced apoptosis of infected
human macrophages reduce the viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis. J.immunol.1998;169: 5448-
5454
213. Okamura H., Kashimamura S., Tsutsui H., Yoshimoto T., Nanishi K.: Regulation of the interferon-gamma production
by IL-12. Curr.Opin.Immunol. 1998 ;10: 259-264.
214. Okamoto Y., Umemura M., Yahagi A., OBrien R.L., Ikuta K., Kishihara K., hara H., Nakae S., Iawakura Y., Matsuzaki
B.: essential role of IL-17 ni the formation of Mycobacterial infection iduced granuloma in the lung. J.Immunol.,
2010; 185(4): 1991.
215. Okada S., Li Q, Whitin CJ, Clayberger C., Krensky MA., Intracellular mediators of granulysin induced cell death.
J.Immunol. 2003, 171:2556-2562. Keefe SN., Shi L., Feske S., Navara F., Kirchhausen T., Lieberman J.: Perforin
triggers a plasma membrane repair response that facilitates CTL induction of apoptosis . Immunity, 2005; 23:
249-262
216. Olas K., Butterweck H., Teschner W., Schwarz H.P., Ripert B.: Immunomodulatory properties of human serum
immunoglobulin A antiinflamatory and proinflamatory activities in human monocytes and peripheral blod
mononuclear cells. Clin.Exp.Immunol., 2005; 140(3): 478-490.
217. OLeary S., OSullivan M.P., Keane J.: IL-10 Blocks Phagosomal Maturation in Mycobacterium tuberculosis Infected
Human Macrophages. Am . J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2011, 45: 172-150.
218. Olobo J.O., Geletu M., Demissie A., Egule T, Hiwot K., Aderaye G.A., Britton S.: Circulating TNF-alpha, TGE-beta and
IL-10 in tuberculosis patients and healthy contacts. Scand, J.Immunol. 2001; 53: 85-91.
219. Orme I.M., Cooper A.M.: Cytokine /Chemokines cascades in immunity to tuberculosis. Immunol.Today., 1999; 20:
307-312.
220. ORourke L. Tooze R, Fearon T.D: Co-receptor of B lymphocytes. Curr.Opin.Immunol., 1997; 9: 324-329.

221. Osia R., Fujiwara N., Yamagami H., Maeda S., Matsumoto S., Nakamura S., Oshitani N., Matsumoto T., Arakawa T.,
Kobaiashi L.: Mycobacterial trehalose 6,6-dimycolate preferentially induce type 1 helper T-Cell response through
signal transducer and activator of transcription 4 protein. Microb.Patholog. 2005;39:35-43.
222. Othiena C. Hrisch C., Hamliton B.D., Wilkinson K., Ellner J.J., Toosi Z.: Interaction of Mycobacterium tuberculosis
induced transforming growth factor 1 and interleukin-10. Infect.immun.,1999; 67: 5730-5735
223. Ottenhoff T.H.M.: Genetics type 1 cytokines in human intracellular infections disease: a spectrum of novel genetic
deficiences demonstrate the essential role of type 1 cytokines in immunity against nontuberculous mycobacteria
M.bovis BCG and Salmonellae. J.Natl.Med., 2004; 62(3): 38-39.
224. Quesniaux V., Freemond C., Jacobs M., Parida S., Nicolle D., Yeremeev V., Bihl F., Erard F., Botha T., Drennan M.,
Soler NM., Le Bert M., Schnyder B., Riffel B.: Toll-like receptor pathways in the immune responses tu Mycobacteria.
Microbes and Inf. 2004; 6: 946-959
225. Pai SR., Actor KJ., Sepulveda E., Hunter LR.Jr. Jagannath C. : Identification of viable and nonviable Mycobacterium
tuberculosis in mouse organs by direct RT-PCR for antigen b5B mRNA. Microb. Pathogen.2000; 28: 335-342.
226. Panda Hernandez R., Salinas Chason R., lopez serafin J., Estrada I: Immunology Ptahogenesis, virulence. In:
Tuberculosis, 2007; cap.V. pp 157-205.
227. Panda Hernandez R., Salina-Chacon R., lopez Serafim J.: Tuberculosis, 2007; cap.5, 107-205
228. Pasula R., Wisinowski P., Martin W.J.: Fibronectin facilitates Mycobacterium tuberculosis Attachament to Murine
Alveolar Macrophages. Infect. Immun., 2002; 70: 1287-1292.
229. Pasula R. ,Downing F.J., Kachel L.D., Davids Jr.E.T. Martin NJ.W: Surfactant protein A (SpA) mediates attachament
of Mycobacterium tuberculosis to murine alveolar Macrophages. Am.J.Respir.Cell.Biol.,1997; 17: 209 217.
230. Patel S.Y., Doffinger R., Morales-Barcenas G., Kumararatne D.S.: genetically determined susceptibility t 1o
mycobacterial infection. J.Clin.Pathol., 2008; 61: 1006-1012.
231. Pedrosa J., Saunders B.M., appelberg r, orme I.M, Siva M.T, Cooper A.M:neutrophils play a protective nonphagocytic
role in systemic Mycobacterium tuberculosis infectionof mice. Infect.immun.,2000; 68: 557-583.
232. Peters W., Seat H.M, Chambers H.F, Flunn J.L, Chara I.F, Ernst J.D: Chemokin receptor 2 serves are early and
essential role resistence to Mycobacterium tuberculosis. Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 2001; 98: 7958-7963.
233. Peterson P.K., Gekker G., HU Solia. Sheng S.W., Anderson R.W., Ulevitch J.R., Tobias S.P., Gustafson V.K., Molitor
W.T., Chao C.C: CD14 receptor mediate uptake nonopsonised Mycobacterium tuberculosis in human microglia.
Infect. Immun.,1995; 63:1598-1603.
234. Pharm P: The immune system. Garald Sci. Pub.New York, NY. 2005 .
235. Poggi A., Catteloni S., Musso A. Zochi M.R: Gamma delta T Lymphocytes producing IFN-gamma and IL-17 in
response to Candida albicans or Mycobacterial antigens: possible implication for acute and chronic inflammation.
Curr.Med.Chem.,2009; 16(35): 4742-4749.
109
236. Powrie F, Coffman R.L.: Inhibition of cell-mediated immunity by IL-4 and IL-10. res. Immunol.,1993; 144: 699-643.
237. Prigozy T.L., Sieling A.P., Clemens D., Stewart L.P., Lehar M.S., Porcelli A.S., Bremens B.M., Modlin L.R.,
Kronenburg M.: the manose receptor delivers lipoglycan antigens to endosomes for presentation to T-cells by CD1 b
molecules. Immunity., 1997; 6: 187-197.
238. Pugin J., Heumann D.J., Tomasz A., Kravcenko V.V., Akawatsu Y., Nishi J.M., Glauser P.M., Tobias S.P., Ulrich J.R:
CD14 is a patern recognition receptor. Immunity., 1994; 1:509-516.

239. Quiraga M.F, Pasquinelli V, Martinez G.Z, Jurado J.O, Zorilla L.C., Musella R.M, Abbate E. Sielin P.A, Garcia V.E;
Inducible costimulator: a modulator of IFN-gamma production in human tuberculosis. J.Immunol.,2006; 176(10):
5965-5974.
240. Ramakrishman L., Federspell AN., and Falkow S.: Granuloma-specific expression of Mycobacterium virulence
proteins the glycine-rich PE-PGRS family. Science, 2000; 288: 1436-1439.
241. Randhowa A.K, Ziltener H.J, Merzaban J.S, Stokes R.W: CD4 is required for optimal growth inhibition of
Mycobacterium tuberculosis in macrophages in mice. J.Immunol., 2005;175: 1805-1812
242. Rane L, Rahman S., Magalhaes I, Ahmed R, Sponberg M., Kondova I, Verreck F, Anderson J., Brighenti S, Maurer M.J:
Increased (6 exon) interleukin-7 production after M. tuberculosis infection and soluble interleukin-7 receptor
expression in lung tissue. Genes and Immunity,2011;12:513-522.
243. Raquib R., Rahman J., Kamaluddin A.K., et al.: Rapid diagnosis of active tuberculosis by detecting antibodies from
lyphocytes secretion. J.Infect Dis. 2003; 188: 364-370.
244. Renshow S.F, Panatigiotidou P., Whelan A., Gordon V.S. Hewinson, Williamson A.R, Con D.M: Conclusive Evidence
that the major T cell Antigen Mycobacterium tuberculosis complex ESAT-6 and CFP-10 Form a Tight 1:1 complex
and characterization of the structural properties of the ESAT-6, J.Biol.Chem., 2002; 277(24):21598-21603
245. Riedel D.D., Kaufman S.H: Chemokine secretion by human polymorpho-nucleare granulocytes after stimulation
with mycobacterium tuberculosis and lipoarabinomanan . Infect.Immun. 1997; 65: 4620-4623.
246. Rivera-Morrero CA., Schyler W., Roser S., Ritzenhaler J.D., Neburn S.A, Roman J: M.tuberculosis induction of
matrix metallo-proteinase-9; the role of manose and receptors mediated mechanism.
A.J..Physiol.Lung.Cell.Mol.Physiol., 2002; 282: L546-L555.
247. Rizzi M, Konth R.,Hampe C.S, Lorenz P, Gugeon M.L., Lemercier B., Venhoff N, Ferrera F., Salzer U. Thiesen H-J,
Peter H-H, Walker U.A, Ebel H: Long-line Plasma cell and memory B cells produce Pathogenic Anti-GAD65
Autoantibodies in Stiff Person Syndrome. PLoS One, 2010; 5(5): e10838
248. Rojas M., Olivier M., Gross P., Barrera L.F. and Garcia L.F.: TNF- and IL_10 modulate the induction of apoptosis by
virulent Mycobacterium tuberculosis in murine macrophages. J.Immunol.1999; 162: 6122-6131.
249. Rockett K.A, Brookes R, Udalova I, Vidal V., Hill AVS, Kwiatovski D: 1,25-dihydroxivitamin D3 and suppresses growth
of Mycobacterium tuberculosis in human macrophage-like cell line. Infect.Immun.1998; 66:5314-5321.
250.Rook G.W, Seah G, Ustanowski A: M.tuberculosis. Immunology and vaccination. Eur.Respir. J.2001; 17: 537_557.
251. Ryll R., Kumazawa I., Yano I.: Immunologicall properties of trehalose dimycolate (cord facor) and othe mycolic acid-
containing glycolipids : A review. Microbiol.Immunol., 2001; 45:801-811.
252. Sabroe I, Jones E.C, Usher L.R, Whyte M.K, Dower S.K: Toll-like receptor TLR4 in human peripheral blood
granulocytes : a critical role for monocytes in leucocytes lipopolisacharides response. J.immunol.,2002, 168: 4701-
4710.
253. Samanich K.M, Keen M.A, Visa V.D, harder J.P, Spencer J.S, Belise J.T, Panzer-Zolla S., Leal S.: Serodiagnostic
Potential of Culture Filtrate Antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin.Vacc.Immunol., 2000; 7(4): 4662-4668.
254. Samuel L.P, Song Ch-H, Wei J, Roberts E.A, Dahl J.L, Bossy III C.E, JO E-K, Friedman R.L: Expression, production
and release of Eis Protein by Mycobacterium tuberculosis during infection of Macrophages and its effect on Cytokine
secretion. Microbiol. 2007; 153(2): 529-540.
255. Saunders B.M, Cooper A.M: Restraining Mycobacteria: role of granulomas in Mycobacterial infection.
Immunol.Cell.Biol. 2000; 78: 334-341.
256. Sayama K, Diehn M, Matsuda K, et al.: transcriptional response of human mast cells stimulated via the Fc epsilon RI
and identification of mast cells as source of IL-11. B.M.C., Immunol.,2002; 3: 5.
257. Scanga CA., Yu K., Scott MH., Tanaka E.K., Tsang E., Flynn JL.: Depletion of CD4+ T cells causes reactivation of
murine persistent tuberculosis despite conrinued exresion of IFN and NOS2. J.Exp.Med. 2000;192: 347-358.
258. Schwarz B.A, Bhandoola A: Traffiking the bone morrow to the thymus: a perequisite for thymopoesis.
Immunol.Rev.2006,209: 47.
259. Schlesinger L.S, Kawahara Y, Bellinger G.C, Payne R.N, Horwitz A.M: Phagocytes of Mycobacterium tuberculosis is
mediated by Human monocytes complement receptor and complement C3 . J. immunol. 1990; 144: 2771-2780.
260. Schlesinger L.S: Macrophages phagocytis is mediated by manose receptors in adition to complement receptor.
J.Immunol.1993; 150: 2920-2930.
261. Schlesinger L.S: Identification of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates with altered phagocytosis by human
macrophages due to truncated lipoarabinomanan. J.Biol.Chem., 2008; 283: 31417-31428.
262. Scrieber S, Perkins L.S. Teitelbaum L.S, Chappel J, Stahl D.P, Blum S.J: Regulation of manoze bone morrow
macrophage. Manose receptor expression and action by prostaglandin E and IFN-gamma. J. Immunol.,1993; 151:
4293-4981.
263. Serbina N.V., and Flynn J.L.: Early emergence of CD8+ T cells primed for production of type 1 cytokines in the lung
of Mycobacterium tuberculosis infected mice. Infect Immun. 1999; 67: 3980- 3988
264. Sichoni Falahi M, Kirschen D.E, Linderman J.J: The dynamics of T NF signaling controltuberculosis granuloma
formation. J.immunol.2010; 186: 3472-3483
265. Sing N, Agrawal S, rasogi K: Infection disease and immunity: special reference to Major Histocompatibility Complex.
Emerg.Inf.Dis. 1997; 3(1): 41-49.
266. Sing PK., Dong Y., Hinds L. et al.: Combined use of serum and urinary antibody for diagnosis of tuberculosis
.J.Infect.Dis., 2003; 188: 371-377
267. Sinsimer D, Follows D, Peixoto B, Karhenbuhl J, Kaplan G, Manca C: Mycobacteriium leprare actively modulates the
cytokine response in nave human Monocyte. Inf.Immun., 2010; 78(1): 293-300.
268. Srivastava S, Ayagari A, Dhole T.N, Krishmani N, Nyati K.K, Dwivedi S.K: Progression of the chronic pulmonary
tuberculosis in mice intravenously infected with ethanbutol resistant Mycobacterium tuberculosis . Ind. J. Med.
Microbiol., 2008; 26(4): 342-348.

110
269. Suqawara I, Iamada H, Mizumo S, Iwakura I: IL_4 is required for defense against Mycobacterial infection.
Microbiol.Immol., 2000; 44(12): 971-979.
270. Stokes R.W, Haidl D.J, Jefferies A.N, Speet P.D: Mycobacteria macrophages interactions. Macrophages phenotype
determines the nonopsonic binding of Mycobacterium tuberculosis to murine macrophages. J.immunol., 1993; 151:
7067-7076.
271. Sturgill-Koszyski S., Sklesinger PH., Chakraborty P., et.al. : Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes by
exclusison of the vesicular proton-ATPase. Science,1994; 263:678-681.
272. Supajatura V, Ushio H, Nakao A, et al.: Differential responses of mast cells Toll-like receptors 2 and 4 in allergy and
innate immunity. J.Clin.Invest.,2002; 104: 1351-1359.
273. Than B.M, Meinken C., Bastian M, et al.: Macrophages aquire neutrophil granules for antimicrobicital activity against
intracellular pathogene, J.Immunol., 2006; 177: 1864-1871.
274. Thang S., Xiao H, Fan Y, et al.: Changes of proinflamatory cytokines and their receptor in serum from patients with
pulmonary tuberculosis . Zhonghua Jie, He,HE, HuXi Za Zhi, 2002; 25(6): 325-329.
275. Thing LM., Kim CA., Cattamanchi A., and Erns DJ.: Mycobacterium tuberculosis inhibitor IFN-gamma transcriptional
responses without inhibiting activation STAT1. J. Immunol., 1999; 163: 3898-3906.
276. Thoma Uzynski S, Stenger S, Takeuri O, Ochoa T.M, Engele M, Sieling A.P, Barnes F.P, Rolinghoff M., Bolskei L.P,
Bloom R.B, Modlin L.R: Induction of direct antimicrobial activity through mammalian Tool-like receptors,
Science,2001; 291: 1544-1547.
277. Toossi Z, Gogate P, Shiratsuchi H., Young T, Ellner J.J: Enhanced production of TGF-beta By blood monocytes from
patients with active tuberculosis and presence of TGF-beta in tuberculosis granulomatous lung lesion. J.Immunol.,
1995; 154: 465-473.
278. Toossi Z, Ellner J.J: The role of TGF-beta in pathogenesis of human tuberculosis. Clin.Immunol.Immunopath.,1998;
87: 107-114.
279. Thornton B.B, Vetvicka V, Pitman M, Goldman C.R, Ross D.G: Anallysis of the sugar specificity and molecular
location of the beta-Glican binding lectin. J.Immunol.,1996; 156: 1235-1246.
280. Torres M, Ramachandra L, Rojas E.R, Bobadilla K, Thomas J., Canday H.D, Harding V.C, Boom H.W: Role of
Phagosomes and Major Histocompatibility Complex Cls. II ( MHC II). Comportment MHC-II Antign Processing of
Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Inf. Immun., 2006; 74(3):1621-1630.
281. Trascon E.R, Stavropoulos E, Lucacs V.K, Colston J.M: Protection against Mycobacterium tuberculosis infection by
CD8+ T cells required production of gamma-interferon. Infect.Immun.1998; 66(2): 830-834.
282. Tsao T.C, Hong J., Huang C, Yang P, Liao S.K, Chang K.S: Increased TNF-alpha, IL-1 beta and IL-6 in the
bronhoalveolar lavage fluid with the upregulation of their mRNA in Macrophages lavaged from patients with active
pulmonary tuberculosis. Tuber.Lung Dis.,1999; 79(5): 279-285.
283. Tung J, Herzenberg A.L: Unraveling B-1 progenitors. Curr. Opin. Immunol., 2007; 19(2): 150-155.
284. Turner J, Frank A.A, Brooks J.V, Juarero-Gonzales M, Orme L.M: The progression of chronic tuberculosis in the
mouse does not require of the B lymphocytes on Interleukin-4. Exp.Gerontol.,2001; 36(3): 537-545.
285. Turner O.C., Randali JB., Orme MJ.: Immunopathogenesis of Pulmonary Granulomas in Guineea pig after infection
with Mycobacterium tuberculosis. Inf.Immun. 2003: 71(3): 864-870
286. Unederhill D.M, Ozinski A. Smith D.K, Andersen A: Tool-like receptor -2 Mediates mycobacteria induced
proinflamatory signaling in macrophages. Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1999; 96: 14459- 14463.
287. Untermayr E., Bises G, Starkl F, Bevius C., Scheiner O, Nitzulescu-B.G, Wrba F, Jardin-J.E: The high affinity IgE
receptor Fc RI is expressed by human Intestinal Epithelial Cells. PLos One; 2010; 5(2): e923.
288. Urban C.F, Lourdino S., Zychlinsky A: How do microbs evade neutrophil killing? Cell.Microbiol.,2006; 8: 1687-1693.
289.Urlich T., Kosmiadi GA., Trusov v>, Jorg S., Pradi I., Titukhin M., et al. Human tuberculosis.granulomas induce
peripheral follicle like structure to orchestrate local host defense in the lung. J. Pathol.2004; 217 238.
290. Van Crevel R, Ottenhoff T.H.M, van der Meer : Innate Immunity to Mycobacterium Tuberculosis .
Clin.Microbiol.Rev., 2000; 15(2): 294-309.
291. van Crevel R. Vank A.G, Netea M.G., Kulberg B.J, van der Meer J.W: Modulation LPS, PHA and M. tuberculosis
mediated cytokine production by pentoxyfyllin and thalidomide. Eur.Cytoline Netw. 2000; 11: 574-579.

292. Van Crevel R, Ottenhoff T.H.M, van der Meer J.W.M: Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin.
Microbiol. Rev. 2002; 15(2): 294-309.
293. Van Crevel R, Ottenhoff H.M.T, van der Meer M.W.J: Innate Immunity to Mycobacterium tuberculosis .
Clin.Microbiol.Rev., 2002; 15(2): 294-309.
294. Van Pittius N.C.G, Sampson S.I, Lee H, Kim Y, van Helder P.D, Warren R.M: Evolution and expansion of the
Mycobacterium tuberculosis PE and PPE multigene families and their association with the duplication of the ESAT-6
(exx) gene cluster region. BMC.Evol.Biol.,2006;6: 95.
295. Velasquez-Velasco M.A, Barrera D, Arenas-Gonzales A, Rosales C, Hevia-Agromente J: Macrophag-Mycobacterium
tuberculosis interactions: role of Complement receptor 3. Microbiol.Pathogen., 2003; 35(3): 125-131.
296. Vermaak Y: Properties of anti-mycolic acid antibodies in human tuberculosis patients.Univ.Pretoria,USA Edt, 2005
297. Visintin A, Mazzoni A, Spitzer H.J, Wyllie D.H, Dower K.S, Segal M.D: Regulation Toll-like receptors in human
monocytes and dendritic cells. J.Immunol. 2001; 166: 249-255.
298. Vordermeier H.M, Venkataprasad N., Harris PD, Ivanyi J: Increase of tuberculosis infection in the organs of B-cell-
deficient mice. Clin. Exp. Immunol. 1996; 106: 312
299. Wang J. Wakeham J., Harkness R, Xing Z: Macrophages a semnificant source of type 1 cytokine during mycobacterial
infection. J.Clin.Investing.,1999,103: 1023-1029
300. Waters R.W, Konnecke J.B, Rahner E.T, Palmer V.M, Wipple L.D, Horst R.I: Modulation of Mycobacterium bovis-
specific responses of bovine peripheral Blood Mononuclear Cells by 1,25-Dihydro-vitamin D3.
Clin.Diagn.Lab.Immun., 2001; 8(11): 1204-1212.
301. Waters W.R, Palmer M.V, Bannantine J.P, et al. : Antibody responses in rendeer (Ranger tarandus) infected with
Mycobacterium bovis. Clin.Diagn.Lab. Immunol.2005; 12: 727-735.
302. Wayne L.G. and Heyes L.G.: An in vitro model for sequential study of Mycobacterium tuberculosis through two
stages of nonreplicating persistence. Infect.immun.1996;64:2062-2089.
303. Weikert C.D, Mc Corrmack X.F, Voelker R.D, McGown E.S, Schlesinger S.L: Pulmonary surfactant protein A,
mediates inhanced phagocytosis of Mycobacterium tuberculosis by direct interaction with human macrophages.
J.Immunol.,1995; 155: 5343-5351.
111
304.Welding K, Rosenkrands Y, Okkels L.M, Doherty T.M, Anderson P: Assessing the serodiagnostic potential of 35
Mycobacterium tuberculosis proteins and identification of four novel serological antigens. J.Clin. Microbiol.; 43:57-
65.
305. Wickremasinghe M.I. Thomas L.H, Frienland J.S: Pulmonary epithelial cells are surce of IL-8 in the response to
Mycobacterium tuberculosis: essential role of IL-1 infected monocytes in NF-kappa B-independent network. J.
Immunol., 1999; 163: 3926-3947.
306. Wilkinson R.J, Ilewelyn M, Toossi Z, Patel P., Pasvol, G, Lalvani A, Wright D, Latif M, Davidson R: Influence of
vitaminD and Vitamin D-receptors polimorfism among Gujarsti Asians in West London: a caz Control Study. Lancet,
2000; 355: 618-621.

307. Williams C.M, Gali S.J: The diverse potential effector and immunoreglatory release of mast cells in allergy disease.
J.Allergy.Clin.Immunol., 2000; 105: 847-859.
308. Wilson D.C, Matheus S, Yap G.S: Il-12 signaling drives CD8+ T Cell IFN-gamma production of LLRG1+ effector
subpopulation during Toxoplasma gondi infection. J.Immunol. 2008; 180(9): 5935-5945.
309. Woiciechowski W.J., De Sanctis J., Skamene E., Radzioch D.: Atenuation of the MHC cl.II expression in
macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis bovis BCG involves clas II transactivator and depend on the
Nramp 1 gene . J. Immunol.1999; 163: 2688-2696.
310. Zhang Y, Rom W.N: Regulation of the interleukin-1 (IL-1 beta) gene mycobacterial components and
lipolysacharides is mediated by two Nuclear factor-IL-6 motifs . Mol.Cell.Biol. 1993; 13(6): 3831-3837.
311. Zhang Y, Breser M. Cohen H, Bodkin M, Low K, Reibman J, Rom W.N: Enhanced interleukin 8 release and gene
expression in macrophages after exposure to Mycobacterium tuberculosis and its components. J. Clin.Investing.
1995; 581-592.
312. Zimmereli S,Eduards S, Ernst D.J: Selective receptor blockade during phagocytosi does not alter the survival and
growth of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol., 1996; 15: 760 - 770
313. Zlotnik A, Yoshie O: Chemokine : a new classification system and their role in immunity. Immunity, 2000; 12:121-
127.
314. Yan M., Masters A.S, GrewL s.i, Wan A, Ashkenazi A, Dixit M.V: Identification of the receptor for Blys demonstrates a
ccrucial rol in human immunity. Nat.immunol.,2000; 1: 37-41.
315. Yang X, Bremham C.R: Gene knockout B Cell-deficient mice demonstrate that B Cell play an important role in the
imitation of T Cell responses (mouse pneumonitis ) lung infection. J.Immunol.1998; 161: 1439
316. Yoshimura A. Wakabayashi Yu, Mori T: Cellular and molecular basis for regulation of inflammation by TGF-
J.Biochem. 2010; 147(6): 781-792.
317. Yu C.C, Liu Y.C, Chu C.M, Chuang D.Y, Wu W.C, Wu H.P: Interferon-gamma production in tuberculosis. J. Formos.
Med. Assoc., 2011; 110(4): 239-243.
318. Xu S., Cooper A., Sturgill-Koszyski S., et al.: Intracellular trafficking in Mycobacterium tuberculosis and
Mycobacterium avium infected macrophages. J. Immunol. 1994; 153: 2568-2578.

112
 CAPITOLUL IV

DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI

Diagnosticul tuberculozei este diferit fa de cel practicat la oameni i n

acelai timp difer de la o specie de animale la alta. Avnd n vedere complexitatea
metodelor aplicate n cadrul speciilor de animale pentru diagnosticul tuberculozei,
acestea vor fi prezentate cu prioritate i n detaliu pentru domeniul veterinar i
suplimentar mijloacele de investigare utilizate n sfera uman.
Metodele de diagnostic sunt cel mai bine descrise n literatura de specialitate
la bovine (Fig.27) ( St.Popescu, IDSA-1992, Ghid de diagnostic al tuberculozei la bovine uz
intern) i ele se grupeaz n funcie de valoarea lor de diagnostic, dup cum
urmeaz :
1. Metode de depistare;
2. Metode de confirmare.

DEPISTARE CONTROL CONFIRMARE

GENERAL Histo Bact Biol.Molec.

IN VIVO IN VITRO
COMPLEX
Analiza
epidemiologic +
Teste Teste IMC i Ac Ex. clinic
DTH GammaIFN,
IDR ELISA -
Biotest
+/ +/
- + -
+
- -
Prelevare
probe
ABATORIZARE
+
TUBERCULOZA
Ex. Anatomopatologic
Expertiza de abator +/
-

IDR la 42 zile

Fig. 27- Schema diagnosticului complex n tuberculoza bovinelor (original)

Dup cum se poate observa, exist o legtura strns ntre metodele de

depistare i cele de confirmare. n acelai timp, fiecare procedur are importan
incontestabil n activitatea de control, supraveghere si diagnostic al tuberculozei i
de aceea majoritatea acestora au fost omologate si prezentate n Manualul OIE
pentru tehnici de diagnostic i produse biologice de diagnostic.

113
 4.1. METODELE DEPISTARE.

Cuprind acele mijloace i proceduri care conduc la concluzia de suspiciune a

infeciei tuberculoase la animalul investigat i acestea se refera la: analiza epi-
demiologic i examenul clinic, teste de hipersensibilitate ntrziat (DTH) i de
imunitate mediat celular (IMC) in vivo i invitro (teste alergice, teste de
imunostimulare limfocitar TISL, inhibarea migrrii macrofagelor IMM, teste
imunenzimatice pentru detecia anticorpilor anti M. tuberculosis i M. bovis
ELISA i teste pentru detecia i cuantificarea gammainterferonului EIA-IFN),
examenul anatomopatologic (expertiza de abator).

4.1.1. EXAMENUL CLINIC

Manifestri clinice n tuberculoza bovinelor

Ca i la alte animale domestice i slbatice, tuberculoza la bovine se carac-

terizeaz printr-un tablou clinic extrem de polimorf, n care simptomele genenerale
sunt, de regul, terse , necaracteristice i nesemnificative pentru diagnostic iar
simptomele locale variaz de la un animal la altul i de la o specie la alta, n funcie
de evoluie i de localizarea leziunilor tuberculoase.
Cu toate acestea, atunci cnd sunt luate n consideraie i aspectele epi-
demiologice, deosebirile ntre manifestrile specifice unor boli medicale sau infec-
ioase precum i ali factori intrinseci i extrinseci care altereaz starea de sntate
a animalului sau care pot influena evoluia tuberculozei, se poate suspiciona
prezena infeciei ntr-un efectiv de animale. Datorit nelegerii insuficiente a
realiilor care se stabilesc intre caracteristicile epidemiologice i manifestarile
clinice ale tuberculozei, unii specialiti veterinari consider examenul clinic ca
avnd valoare extrem de redus pentru diagnostic i n consecin nu manifest
interes pentru aplicarea lui n controlul tuberculozei.
Examenul clinic se realizeaz prin tehnicile de semiologie medical
cunoscute : inspecie, ascultaie, palpare-percuie i controlul unor parametri
fiziologici (temperatura corporal, respiraie, ritm cardiac, puls, tensiunea
vascular, pofta de mncare, rumegare, etc.), pentru care sunt necesare: stetoscop
medical, termometru medical pentru controlul temperaturii corporale, eprubete,
flacoane , tampoane sterile i instrumentar adecvat pentru prelevare de secreii,
material purulent, snge, etc., soluii dezinfectante i conservante pentru stocarea i
tran-sportul probelor ctre laboratoarele specializate.
Atunci cnd tuberculoza este suspectat clinic:
- se selecteaz animalele care prezint nrutirea strii generale i de ntre-
inere cu evoluie nefavorabil pn la starea de cahexie fr cauze determinante;
- toate animalele selectate dup criteriile menionate se termometreaz pe o
perioad de la cteva zile la cteva sptmni i se analizeaz evoluia curbei ter-
mice care poate s nregistreze, de regul, o reacie moderat, n platou prelungit
sau alternnd cu perioade afebrile. n continuare, se procedeaz la ascultaie,
palpaie i percuie nsistnd asupra zonei toracice i de proiecie pulmonar. La
palpaie este obligatoriu a se aborda nodurile limfatice regionale (submandibulari,
retromandibulari, parotidieni, cervicali, prescapulari). Se noteaz prezena se-
creiilor nazale sub raport cantitativ, aspect, culoare consisten, precum i para-
metrii cardiao-respiratorii i tusea.
n funie de evoluia i localizarea leziunlor de tuberculoz, pot fi nregistrate
urmtoarele forme clinice:
114
 - Tuberculoza acut miliar, evolueaz cu fenmene generale grave de
septicemie, stare de depresiune, slbire, febr, fenomene circulatorii i respiratorii.
- Tuberculoza pulmonar, este mult mai frecvent la bovine i bubaline de-
ct celelate forme i se manifest prin:
- tuse uscat, care se intensific la schimbrile de temperatur i ca ur-
mare a creterii concentraiei de pulberi sau a altor poluani din mediul ncon-
jurtor.
La animalele la care procesele pulmonare sunt evoluate se nregistreaz:
- tuse umed, dureroas i expectoraie periodic. Secreiile nazale au
aspect filant, mucopurulent n care se pot pune n eviden (prin tehnici de colorare
a germenilor acidorezisteni) bacilii tuberculozei.
- percuia i ascultarea ariei de proiecie pulmonar, nu percep dect
leziunile extinse, situate la suprafaa esutului pulmonar i se caracterizeaz prin
prezena zonelor de matitate variabil, murmur alveolar greu perceptibil sau care
indic exces de secreii n cavitile alveolare i alterarea suflului bronhic i
traheal.
- Tuberculoza pleural, de regul nu poate fi depistat clinic. La ascultare ,
pot fi percepute zgomote de frecare ale pleurei sau zgomote specifice prezenei
lichidului pleural n exces. Palparea i percuia nregistreaz sensibilitate n zonele
cu leziuni.
- Hipertrofia nodurilor limfatice din zona capului, gtului i toracelui,
constatat prin palpare, produce la unele animale comprimri ale esofagului,
cauznd timpanism cronic. n acelai timp, clinicianul poate suspiciona tuber-
culoza limfonodal pe baza neregularitilor de pe suprafaa nodurilor (nodul
boselat), constatate la palpare.
- Pericardita tuberculoas, poate fi diagnosticat numai n stadii avansate i
se caracterizeaz prin zgomote specifice acumulrii de lichid pericardic n exces,
tulburri de ritm cardiac i insuficien cardiac.
- Tuberculoza cavitii abdominale, prezint semne clinice destul de terse,
fr relevan chiar i la animalele cu peritonit tuberculoas grav. Pot fi semna-
late tulburri manifestate prin:
- clduri false i nimfomanie, atunci cnd este afectat seroasa organelor
genitale ;
- modificarea strii generale i tulburri funcionale, cnd sunt afectate
splina, ficatul, lanul nodulilor limfatici mezenterici;
- timpanism, colici i alternarea constipaiei cu descrcri diareice n
tuberculoza localizat n tubul digestiv. Atunci cnd se constat asemenea mani-
festri clinice care se repet periodic i sunt nsoite de slbire progresiv, pn la
cahexie trebuie s se fac diferenierea ntre tuberculoz i probabilitatea infeciei
cu Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (boala lu Johne).
- Tuberculoza uterin i ovarian, se caracterizeaz prin prezena tulburri-
lor complexe de reproducie; uneori tuberculii suficient de voluminoi, situai la
suprafaa esuturilor organelor genitale pot fi palpai prin examen transrectal dar
prezena lor nu prezint un element de confirmare a bolii ntruct pot fi uor
confundai cu chisturile utero-ovariene, formaiuni tumorale, corpi galbeni persis-
teni .a.
- Tuberculoza renal, se suspecteaz n urma examenului organoleptic al
urinei cnd se poate constata: albuminurie, miros persistent amoniacal i sedi-
ment bogat n celule epiteliale. Uneori, prin metode de colorare, n urin pot fi
evideniai bacili acidorezisteni din complexul Mycobacterium.
- Tuberculoza glandei mamare, cu frecven crescut la vacile i bivoliele
care au parcurs cteva cicluri de lactaie, se caracterizeaz prin:
115
 - induraii difuze , nedureroase n esutul glandei mamare;
- atrofierea esutului mamar secretor i nlocuirea lui cu esut de fibrozare;
- hipertrofierea nodurilor limfatice adiacente glandei mamare, care prezint
la palpare consisten dur i aspect boselat. Examenul bacteriologic al laptelui, sau
tehnicile de biologie molecular executate din secreiile lactate pro-venite de la
animalele cu tuberculoz mamar stabilesc cu certitudine diagnosticul.
Aspecte clinice asemntoare se ntlnesc i n cazul tuberculozei genitale la
tauri, n special cea cu localizare testicular. n asemenea cazuri, medicul clinician
trebuie s fie rezervat n a stabili diagnosticul ntruct tuberculoza epididimului i
testiculelor poate fi confundat cu infecii ca cele produse de: Brucella, Coryne-
bacter .a. In sperma taurilor cu tuberculoz localizat n testicule pot fi pui n
eviden bacili acidorezisteni.
- Tuberculoza nodurilor limfatice. Leziunile sunt localizate n diferite regiuni
ale corpului, dar cel mai frecvent la bovine, sunt afectate nodurile limfatice
abordabile din zona capului, gtului i spetei. Acetia sunt hipertrofiai, prezint
suprafaa neregulat, fr aderene la esuturile adiacente. Uneori pot supura,
prezentnd fistule.
- Tuberculoza cutanat, este rar ntlnit i trebuie difereniat de alte boli,
cum sunt: dermatita nodular, actinobaciloza, hipodermoza, etc.
Toate materialele patologice (jetaj, scurgeri utero-vaginale, tampoane,
secreie lactat, lichid seminal, coninut din abcese i fistule, fecale, etc.) constituie
probe pentru examene complexe de laborator n vederea precizrii diagnosticului.

Aspecte clinice ale tuberculozei la om.

Tuberculoza poate afecta orice organ i esut al corpului omenesc. Datele

furnizate de Organizaia Mondial a Sntii (OMS), n 2oo6, arat c cel puin
75% din totalul bolnavilor de tuberculoz fac forme pulonare. n proporie de 15-
25%, leziunile tuberculoase sunt loclizate extrapulmonar, pe seroase (tuberculoza
seroaselor) sau n alte organe i esuturi, cum ar fi: ficatul, splina, tractusul gastro-
intestinal, aparatul genit0-urinar precum i sitemul limfatic (limfadenita
tuberculoas) i sistemul osos (osteomielita tunerculoas i artritele
tuberculoase).
Spre deosebire de procedeele tehnice de semiologie medical aplicate n
medicina veterinar suplimentar, n medicina uman se practic pe scar larg
examenul radiologic pentru depistarea formelor de tuberculoz n diverse pri ale
corpului omenesc.
- tuberculoza pulmonar. Dup cum am menionat mai sus, tuberculoza
pulmonar deine ponderea comparativ cu celelalte forme i aceasta rmne cauza
principl a numeroaselor decese n rndul populaiilor umane afectate de
tuberculoz.
Deobicei, pacienii cu tuberculoz pulmonar prezint simptomatologia unei
boli cu evoluie progresiv. Cel mai important simptom al tuberculozei este tusea
care iniial este uscat apoi devine umed cu aspect mucos, mucopurulent i n
unele cazuri, cu striuri de snge, sugernd evoluia tuberculozei pulmnare cavitare.
Tusea are caracter persitent avnd o durat care poate depi 3 sptmni.
Hemoptizia este variabil dar mult mai bine evideniat n faza avansat a
bolii.

116
 Pacientul cu tuberculoz pulmonar acuz durere pectoral profund, mai
pronunat n inspiraie sau n timpul acceselor de tuse, n asemenea cazuri fiind
afectat i pleura.
Dispneea, se observ destul de rar dar prezena acesteia sugereaz extinderea
apreciabil a procesului patologic n esutul pulmonar.
n acelai timp bolnavul este febril, prezint transpiraii nocturne nsoite de
senzaie de frig.
Scderea progresiv n greutate fr cauze determinate, pierderea apetitului
i oboseala sunt elemente care pot conduce la suspiciunea de tuberculoz. Acestea
pot fi nsoite de bti cardiace accelerate (ritm cardiac accelerat), insuficien
respiratorie, deformri n zona gtului, ca urmare a adenopatiilor tuberculoase
adiacente focarului primar, deformri ale cavitii toracice, scolioz n fazele
avansate ale bolii.
Ascultaia i percuia zonelor de proiecie pulmonar pot furniza informaii
suplimentare i pot conduce la suspiciunea de tuberculoza atunci cnd medicul
clinician
sesizeaz murmur bronhio-alveolar nrutait, frecri necaracteristice ale foielor
pleurale, sugernd aderene sau acumulri de lichid interpleural precum i zone de
matitate i densificare tisular, de dimensiuni i consisten variabile, care
semnific prezena unor procese patologice de tip productiv-exudativ.
Datorit faptului c nu toi pacienii prezint semnele clinice aa cum au fost
descrise mai sus i pentru c aceste semne au o specificitate extrem de redus
pentru tuberculoz, medicul clinician trebuie s fac diferenierea ntre entiti
morbide sistemice cum ar fi: carcinomul pulmonar, cancerul ocult, pneumonii
bacteriene, n special cele produse de Staphylococus, Klebsiella, Haemophyllus,
Chlamidya sau alte boli sistemice. Unii specialiti atrag atenia asupra necesitii
diagnosticului clinic diferenial ntre tuberculoz i: histoplasmoza pulmonar,
tumori necrozante, sau infecii parazitare (Echinoccocus sp., ) i infecii fungice.
De aceea, examenul radiologic toracal (Rx- toracal) este recomandat la toi
bolnavii cu suspiciune de tuberculoz pulmonar i cu att mai mult la cei cu
infecie asociat cu HIV sau la persoanele imunosupresate. Din acest punct de
vedere, trebuie notat c aproximativ 20-30% dintre persoanele cu tuberculoz
activ sunt nonreactive la testul tuberculinic intradermic (IDR).
La examenul radiologic al cavitii toracale, modificrile structurale se
observ cel mai frecvent n segmentele apicale i posteraioare ale lobilor superiori
sau n zonele superioare ale lobilor inferiori (Fig. 28). Cu toate acestea, n literatura
de spcialitate sunt prezentate cazuri cu tubercculoz observat la examenul
radiologic i n alte zone ale pulmonilor modificarile tisulare avnd marimi, forme
i densiti variabile.

Fig. 28 Diegnosticul tuberculozei prin examen radiologic toracal.

117
 La pacienii cu infecie asociat, HIV-tuberculoz, imaginile radiologice sunt
adesea atipice leziunile tuberculoase fiind prezente i n nodurile limfatice
mediastinale (limfadenita tuberculoas mediastinal). La copiii negativi-HIV dar
cu infecie tuberculoas incipient sau primar limfadenopatiile sunt mult mai
frecvente i leziunile sunt localizate n zonele mijlocii sau inferioare ale pulmonului.
Tuberculoza extrapulmonar, este mai puin reprezentat procentual,
comparativ cu forma pulmonar i deobicei mult mai dificil de diagnosticat clinic.
De aceea, pentru diagnostic se apeleaz frecvent la proceduri invazive i la biopsii.
Metodele moderne, cum ar fi: PCR, sunt evaluate ca avnd sensibilitate mult mai
crescut fa de metodele convenionale.
Tuberuloza extrapulmonar rspunde la tratament mult mai uor dect
tuberculoza pulonar datorit faptului c densitatea M.tuberculosis n esuturile
extrapulmonare este semnificativ mai redus dect n esutul pulmonar.
Formele de manifestare a tuberculozei extrapulmonare se grupeaz n 3
categorii:
- tuberculoza extrapulmonar miliar (diseminat);
- tuberculoza seroaselor;
- tuberculoza organelor solide.
-Tuberculoza miliar (diseminat), denumit astfel pentru c leziunile
tuberculoase, analizate individual, nu depesc mrimea unui bob de mei. Este
consecina diseminrii limfohematogene a M. tuberculosis n tot corpul.
Manifestarea clinic poate fi dramatic sau tears; cel puin 20% dintre
cazurile cu tuberculoz miliar nefiind corect diagnosticate clinic dect la autopsie.
Tuberculoza miliar se ntlnete cel mai frecvent la persoanele infectate cu HIV.
Clasic,tuberculoza miliar este rezultatul trecerii bacilior tuberculoi din pulmoni n
tuberculoas) conductul toracic i apoi n circulaia arterial sistemic. Acest
fenomen apare, de regul, dup infecia primar cu M. tuberculosis i deobicei
sistemele de aprare ale gazdei sunt nvinse determinnd exprimarea clinic a bolii.
Totodat, tuberculoza miliar apare i atunci cnd tuberculoza primar, cu
localizare n unul sau mai multe organe solide, nu este tratat.
La persoanele imunocompetente leziunile au dimensiuni reduse, bine
conturate, sub form de granuloame cazeificate care conin puini bacili
tuberculoi. La persoanele imunocompromise ca i la bolnavii cu infecie avansat
HIV, granuloamele se dezvolt insuficient dar bacilii tuberculoi invadeaz masiv
esuturile i sngele.
Incidena cea mai crescut a tuberculozei miliare se nregistreaz la copiii cu
expunere recent la infecia cu M. tuberculosis, apoi la femeile gravide, la
persoanele alcoolice, cele cu boli ale ficatului precum i cele imunocompromise din
diverse cauze.
Tuberculoza acut miliar, se manifest clinic prin: febr crescut,
transpiraii nocturne i alte simptome i semne caracteristice sindromului
infecios dramatic. Ocazional, pacientul prezint sidrom respirator acut, oc septic
i disfuncii ale organelor interne. Aceste simptome organice pot include
meningele (meningita tuberculoas) cavitatea toracic (pleurezii sau pericardite
tuberculoase) i cavitatea abdominal (peritonita tuberculoas ).
Copiii manifest frecvent semnele unui sindrom acut n timp ce tinerii acuz
un sindrom subacut. Leziunile de tuberculoz miliar pot fi observate la examenul
radiologic (r-X) dar exist riscul ca acestea s nu fie observate cnd pacientul este
examinat prima dat.

118
 Tuberculoza cronic miliar. Se manifest cu variaii importante ale tempe-
raturii corporale (febr intermitent), anorexie, scderea greutii corporale sau
disfunie organic simpl progresiv. Ocazional boala se manifest i cu
modificri
hematologice relevante, cum ar fi: reacie leukemoid, trombocitopenie, mielo-
fibroz sau policitemie.
Tuberculoza miliar cronic se nregistreaz frecvent la aduli i datorit
manifestrilor clinice terse a fost denumit tuberculoz cripto-miliar.
-Tuberculoza seroaselor. Tuberculoza seroaselor este un termen con-
sacrat localizrii leziunilor n 5 membrane seroase : pleura (pleurezia
tuberculoas), meningele (meningita tuberculoas), pericardul (pericardita
tuberculos), peritoneul peritonita tuberculoas) i articulaiile (artrita
tuberculoas). Ea se instaleaz ca urmare a diseminrii limfohematogene a bacililor
tuberculoi, sau prin extinderea n interiorul seroaselor a unei leziuni localizate,
cum ar fi granulomul tuberculos sau nodulul limfatic tuberculos. De exemplu, o
examinare atent a creierului cu tuberculoz meningeal poate evidenia un
tubercul subependimal denumit focarul lui Rich care herniaz n spaiul
subarahnoidian.
Unele lucrri de specialitate susin existena a dou procese n apariia i
dezvoltarea manifestrilor clinice: multiplicarea Mycobacterium tuberculosis n
interiorul sau pe suprafaa seroaselor i rspunsul inflamator al gazdei la genele
Mycobacterium tuberculosis (reacia de hipersensibilitate ntrziat DTH).
Pleurezia tuberculoas, apare la 5% din totalul cazurilor de tuberculoz i n
10-30% dintre cazurile cu tuberculoz miliar. Medicul clinician trebuie s
considere pacientul care la examenul radilogic (r-X) al cavitii toracice, prezint
exudat pleural fr cauze cunoscute, ca fiind suspect de pleurezie tuberculoas. n
acelai timp, medicul specialist radiolog poate s observe focare de tuberculoz
localizate subpleural sau extinse n spaiile interpleurale.
La adolesceni, boala se manifest deobicei cu febr, durere n zona pleurei
pectorale, i o accentuat efuziune pleural unilateral.
La aduli, se pot nregistra boli sitemice asociate cum ar fi : tulburri
funcionale cardiace, hepatit cronic, etc. cu manifestri clinice terse, insiduase.
n cazuri rare, se paot constata prezena coleciei purulente ntre foiele
pleurale.
Meningita tuberculoas, boal cu prognostic cel puin rezervat n privina
vindecrii bolnavilor, meningita tuberculoas (MTB) poate fi rezultatul infeciei
primare sau ca urmare a diseminrii infeciei de la un focar primar situat n alt
parte a corpului (meningita tuberculoas miliar). Meningita tuberculoas (MTB)
poate s evolueze acut (cu manifestri fulminante dramatice), subacut i cronic i
este dificil de diagnosticat clinic. De aceea, medicul clinician trebuie s noteze
cteva date care faciliteaz stabilirea suspiciunii de meningit tuberculos:
- antecedetele epidemiologice ale pacientului ( contactele recente cu bolnavi
de tuberculoz);
- analiza rezultatelor intradermotuberculinrii (IDR-testul Mantoux),n
special conversia recent;
- antecedente privind imunosupresia provocat de o boal sau dup terapie
imunosupresiv;
- dac pacientul a fost anterior vaccinat BCG.
n general, meningita tuberculoas (MTB) prezint un tablou clinic complex,
nespecific caracterizat prin: dureri de cap, vomismente, fotofobie i febr. Studiile
de specialitate au artat c numai 2% dintre pacieni au prezentat simptome de
meningit n stadiul incipient al bolii.
119
 Prezena i durata simptomelor variaz de la 1 zi la 9 luni dei alte lucrri de
specialitate menioneaz c durata simptomelor meningitei tuberculoase (MTB)
este sub 2 sptmni.
La un individ imunocompetent, tuberculoza sistemului nervos central (TB-
SNC) mbrac forma meningitei acute sau subacute manifestat prin: febr, dureri
de cap, meningism i stri de confuzie, cu durata de aproximativ 2-3 sptmni.
n primul stadiu al meningitei, pacienii prezint simptomele unei infecii ale
cilor respiratorii superioare dar este important de notat febra i starea de
iritabilitate fr motive importante prezente la majoritatea pacienilor. n aceast
faz a bolii, febra i durerile de cap nu sunt exprimate la aproximativ 25% dintre
pacieni iar indispoziia n procent de 60%. Totui durerile de cap i comporta-
mentul mental au fost observate cel mai frecvent la persoanele n vrst.
La nivelul globilor oculari, tabloul clinic se caracterizeaz prin tulburri
vizuale progresive unilaterale sau (dac leziunile sunt localizate n abii globi
oculari) bilaterale care poate ajunge pn la orbire i ocazional, apariia
oftalmoplegiei dureroase. Din punct de vedere lezional se poate observa uveita
granulomatoas. Diagnosticul greit sau ntrziat pot avea efecte dramatice asupra
structurii esuturilor oculare i sntii individului.
Localizarea leziunilor n alte zone ale sistemului nervos central, ca urmare a
difuzrii proceselor patologice de la meninge, se manifest clinic prin simptome
neurologice locale (n funcie de zona afectat), cum ar fi: monoplegia, hemiplegia,
tetrapareza aphasia. tremurturi i micri anormale (chorioathetasis i
hemibolism) au fost nregistrate mult mai frecvent la copii dect la duli.
Ali specialiti semnaleaz unele disfuncii cerebeloase i manifestri
mioclonale.
Meningita spinal tuberculoas , afecteaz membranele mduvei spinrii i
poate evolua sub form acut, subacut i cronic.
Tabloul clinic n meniningita spinal primar se caracterizeaz adesea prin:
mielopatie, paralizie progresiv ascendent uneori meningit bazal asociat cu
sechele. n unele cazuri meningita spinal tuberculoas se manifest prin
paraplegie acut cu tulburri senzoriale i retenie urinar. Asemenea tablou clinic
se aseamn cu sindromul Guallin- Barr.
Forma subacut a meningitei spinale tuberculoase se caracterizeaz prin sin-
drom compresiv lent i progresiv asupra maduvei sau arahnoidit nespecific.
Dintre segmentele mduvei spinrii se pare c segmentul dorsal este cel mai
frecvent afectat, urmat de segmentul lombar i cel cervical.
Pericardita tuberculoas, este rezultatul extinderii tuberculozei dintr-un nod
limfatic nvecinat ( nodul limfatic mediastinal) cu sacul pericardic.
Pericardita tuberculoas acut tipic se manifest prin durere substernal,
care se accentueaz n inspiraie dar care slbete din intensitate odat cu ncetarea
inspiraiei. La debutul bolii, pacientul prezint apetit redus, indispoziie i pierdere
progresiv n greutate. Nu se nregistreaz febr i vena jugular nu se evideniaz.
ntr-o serie de lucrri de specialitate se menioneaz procente variabile ale
simptomelor pericarditei tuberculoase. De exemplu: tusea a fost observat la 94%
dintre bolnavi; dispneea, la 88%; durere pectoral 76% ; transpiraie nocturn 56%
i scdere n greutate 48%. Ali autori, constat tuse, dureri pectorale i dispnee
numai la 40 50 % dintre pacienii cu pericardit tuberculoas n timp ce febra s-a
nregistrat la 70% .
Ecocardiografia relev disfuncii sistolice n ventricolul drept (VD) i la
radiografia toracic se bserv deformri costosternale mult mai proeminente n
partea stng. Sonografia abdominal relev dilatarea venei hepatice i venei cave
inferioare.
120
 Hemodinamic, se nregistreaz: hipertensiunea arterei pulmonare care poate
ajunge la valori de 41/mmHg, presiune ridicat n vena central (21 mmHg) iar
msurtorile prin cateterizare Swan-Ganz, relev scderea indicelui cardiac la
valori 1,81 L/min/m.p.
Dup o perioad de cteva luni, boala se poate agrava i la ecocardiografie se
nregistreaz frecvent hipokinezie sever a ventricolului drept (VD) i funcie
sitolic prezervat n ventricolul stng (VS).
La tomografia computerizat toracal se evideniaz cantitate nsemnat de
exudat pericardic i ngroarea difuz a pericardului care conduce la modificri
hemodinamice i disfuncii cardiace grave datorit apariiei tamponadei cardiace
(acumulare de lichid n exces n sacul pericardic, care manifest presiune crescut
asupra miocardului i constricia vaselor coronariene) cu evoluie dramatic, uneori
letal. n aceast faz, presiunea sanguin ajunge la 80/50 mmHg, ritmul cardiac :
138/min, dilataia venei cave inferiaore (23 mm) fr variaii respiratorii
semnificative. n acelai timp, la ecocardiografia Doppler se remarc deteriorri
importante ale valvulei mitrale cu efecte nedorite asupra afluxului sanguin, reflux
exagerat n vena hepatic i contracii atriale pronunate .
Pericardita tuberculoas constrictiv. Este una din cele mai grave forme ale
pericarditei tuberculoase. n ciuda aplicrii tratamentelor antituberculoase i
utilizrii de corticosteroizi, pericardita tuberculaos constrictiv este prezent la
30-60% dintre pacieni (194,138). Frecvena cea mai crescut a pericarditei
constrictive cauzat de Mycobacterium tuber-culosis a fost semnalat n Africa i
Asia (137).
Manifestrile clinice sunt extrem de variate, de la evoluie asimptomatic
pn la simptomatologia tipic de pericardit constrictiv sever i diagnosticul
clinic este evident facil.
Amplitudinea diastolic, zgomotul pericardic care coincide cu un sunet nalt
diastolic precoce i aritmiile cardiace in inspiraie sunt slab evideniate dar au fost
constatate la 21-45% dintre pacienii cu pericardit constrictiv. Aceste manifestri
nu pot fi observate de un clinician cu insuficient experien i de aceea ecografia
cardiac are posibilitatea s evidenieze elementele sugestive pentru un diagnostic
precis.
O form frecvent ntlnit n Africa este pericardita tuberculoas
constrictiv subacut n care prezena unui exudat fibrinos dens acumulat n
cantitate semnificativ n sacul pericardic reprezint semnul patognomonic i n
acelai timp principala cuz a tulburrilor circulatorii, ca urmare a compresiunii
exercitate asupra vaselor cardiace i miocardului (138). Deobicei, nu se observ
calcifieri ale pericardului) dar la radiografie se constat modificri nespecifice;
aspectul cordului este cu totul anormal, relevndu-se absena crestturii de la baza
pulmonului drept i o dilatare a venei cave superioare (138).
Cu totul ntmpltor, tuberculoza pulmonar a fost diagnosticat mpreun cu
pericardita tuebrculoas (138).
Fibrilaia atrial apare la mai puin de 5 % din cazuri dar este persistent i
deobicei prezent numai n cazul cnd pericardul este calcifiat.
Electrocardiograma (ECG) poate fi utilizat numai pentru a sesiza prezena
dereglrilor funcionale cardiace.
Evidenierea exudatului fibrinos n sacul pericardic prin ecocardigrafie explic
micrile cardiace mult diminuate dei compartimentele cardiace apar de mrime
normal i nu se observ afectarea valvulelor i hipertrofie miocardic (138).

121
 In faza terminal a bolii exudatul fibrinos se condenseaz formnd o
membran fibrotic groas, distinct, care nconjoar cordul cu consecine nefaste
pentru pacient (188) .
Peritonita tuberculoas. Datele din literatura de specialitate arat c
peritonita tuberculoas are o inciden variabil; n unele ri, aa cum sunt SUA,
aceast boal nu este cunoscut.Totui, atunci cnd se constat ascit fr cauze
determinante sau durere abdominal, asociate cu alte date epidemiologice,
pacientul trebuie suspectat ca avnd peritonit tuberculoas.
Peritonita tuberculoas afecteaz n egal msur ambele sexe, la orice vrst
i n unele ri aceasta reprezint 30 % din totalul formelor de tuberculoz
extrapulmonar i 20% dintre cazurile de ascite sunt cauzate de infecia peritoneu-
lui cu Mycobacterium tuberculosis.
Datele statistice publicate n Roamnia arat c boala este mai frecvent la
femei dect la brbai. T r c o v e a n u E., e t a l . au gsit c peritonita
tuberculoas este prezent la 0,5-1,5% din cazurile noi de tuberculoz i aceasta
reprezint ntre 4-10% din cazurile cu tuberculoz extrapulmonar. La copii i la
tineretul trecut de vrsta majoratului, frecvena peritonitei tuberculoase este
apreciabil n unele zone ale globului (221). Studiile necropsice au evideniat leziuni
de tuberculoz n 80 % din totalul deceselor cauzate de tuberculoz (13).
Din punct de vedere clinic, peritonita tuberculoas evolueaz sub trei forme:
acut, subacut i cronic.
- Peritonita tuberculoas acut.
Aproape n fiecare caz, peritonita tuberculoas apare asociat cu
limfadenopatia abdominal.Totui, literatura de specialitate menionmeaz infecia
intestinal tuberculoas, cea a aparatului uro-genital, sau circuitul sanguin ca surse
primare dar este posibil ca, n rare cazuri, focarul primar s se dezvolte chiar pe
mezenter (13).
Simptomele clasice generale n peritonita tuberculoas sunt prezente la 30%
dintre pacieni i se evideniaz prin: stare general alterat, febr ridicat dar
intermitent, adinamie, cefalee i transpiraii nocturne.
Semnele clinice locale se evideniaz prin: dureri abdominale difuze, dis-
tensie (meteorism), ascit care explic termenul de abdomen acut, vomismente
i diaree urmat de constipaie periodic .
Formele acute de boal pot fi uneori localizate: pericecal i periapendicular cu
modificarea evident a strii generale. n asemenea cazuri, diagnosticul de
peritonit tuberculoas este extrem de dificil, aceast fiind uor confundat cu
accesele de apendicit
De asemenea, pot fi observate i semne suplimentare sistemice nespecifice,
ca: scdere n greutate i oboseal care sunt dificil de evaluat dar ele apar constant
n peritonita tuberculoas. Febra se nregistreaz de regul la 30% dintre pacienii
cu ascit abdominal, semnalat clinic la 1/3 din cazuri.
Hepatomegalia i splenomegalia sunt semne clinice secundare care complic
efortul clinicianului n stabilirea diagnosticului clinic. De ceea, rezultatele
examenului clinic trebuie asociate cu o anamnez atent i cu alte investigaii
paraclinice n laborator.
-Peritonita tuberculos subacut, prezint manifestri similare cu cele
descrisen sindromul Fermet-Baulland specifice pleuroperitonite sau, atunci cnd
este afectat i mediastinul, sindromul Hutinel.

122
Primele semne care apar sunt cele de impregnaie tuberculoas, apoi se evideniaz
semnele specifice pleureziei i peritonitei unilaterale sau bilaterale.
Ceeace atrage atenia clinicianului este: abdomenul mult mrit i destins,
sensibil la palpare cu semne incipiente de ascit. La unii bolnavi se observ i
semne de pleurezie exudativ. Bolnavul este febril prezentnd starea general
uor alterat.
Analiza lichidului ascitic. n acest stadiu de evoluie al bolii, lichidul ascitic
este serocitrin cu reacia Rivolta pozitiv (concentraia proteinelor este excesiv) i
dac nivelul adenozin deaminaza (ADA) depete 32,3 U/l., atunci exist o
certitudine de 95 - 98% pentru diagnosticul de peritonit tuberculoas. Biotestul
pe cobai, prin injectarea lichidului ascitic, este de obicei pozitiv dar, nsmnarea
mediilor de cultur bacteriologic speciale ( mediul Lowenstein), nu d ntotdeauna
rezultate satisfctoare.
- Peritonita tuberculoas cronic, se poate prezenta n 4 forme : ascitic,
uscat, fibrocaseoas, adeziv.
- forma ascitic. Dup unele referine, aceast form de manifestare a bolii
este frecvent la fetele tinere i debuteaz insiduos, cu uoar febr, astenie,
inapeten, slbire progresiv, greuri i vrsturi, constipaie alternnd cu
diaree iar dup 2-3 sptmni apare meteorismul, apoi se intaleaz ascit
abundent, abdomenul bolnavului fiind asemuit cu abdomen de batracian.
Lichidul ascitic, acumulat n cantitate excesiv n cavitatea abdominal, este bogat
n limfocite.
- forma uscat, frecvent ntlnit la copii i la dolesceni, se manifest prin
semne de impregnie bacilar, dureri abdominale persistente, colici, meteorisme,
sensibilitate la palpare i la depresiune brusc. Deobicei abdomenul bolnavului
nu pare destins i nu se percepe acumlare de lichid ascitic.
- forma fibrocazeoas sau ulcerocazeoas, apare mai frecvent la aduli,
avnd evoluie destul de grav. Faza prodromal se caracterizeaz prin:
impregnare tuberculoas, alterare progresiv a strii generale, febr
neregulat, paliditatea pielii i mucoaselor, dureri periombilicale, constipaie
urmat de diaree, abdomen destins. Pe msur ce boala progreseaz, durerile
abdominale se accentueaz devin insuportabile; la percuia abdomenului se
remarc zone de sonoritate nalt (sunete timpanice) alternnd cu zone de
matitate (abdomen n tabl de ah) i la palpare abdomenul pare mpstat, cu
aspect de abdomen de plastelin (dup unii autori, abdomen de coc).
n acelai timp, clinicianul poate uneori s sesizeze prin palpare formaiuni
tumorale neomogene n cavitatea abdominal denumite generic gatouri.
- forma fibroadeziv (plastic) , este secundar uneia din formele descrise
mai sus i se manifest prin apariia de aderene multiple ntre membrana
peritoneal i esuturile nvecinate care comprim, tracioneaz sau stranguleaz
diferite organe, cel mai frecvent ansele intestinale, producnd: staz, constipaie,
fenomene subocluzive sau ocluzie intestinal.
Asemenea presiuni sau tracionri asupra filetelor neroase provoac dureri
de tip nevralgic. n unele cazuri, abdomenul apare escavat sau, n alte cazuri,
balonat, cu aspect pstos la palpare, cu sensibilitate difuz sau localizat.
Toate aceste aspecte clinice, prezente n peritonita ascitic (forma umed i
uscat) precum i n peritonitele cazeoas i fibroplastic, pot fi evideniate prin:
laparoscopie, Rx-abdominal i ultrasonografie.

123
 Aceste mijloace de investigare permit stabilirea diagnosticului diferenial
ntre pertonitele tuberculoase i cele produse de alte entiti morbide cum ar fi:
creterea n volum i balonri ale abdomenului provocate de: sarcin, chisturi
ovariene, etc. precum i diferenerea ascitelor cauzate de : ciroze, insuficiene
cardiace, tromboze portale, .a.
Diagnosticul diferenial poate fi fcut eliminnd toate cauzele menionate
mai sus inclusiv ali factori favorizani pentru producerea balonrilor i ascitelor.
Diagnosticul pozitiv, se bazeaz pe: impregnarea tuberculoas, semnele
generale i simptomatologia local abdominal, antecedentele personale i co-
laterale, eventual alte localizri ale bacililor tuberculoi.
Confirmarea diagnosticului de peritonit tuberculoas se face prin metodele
de laborator cunoscute (cultura bacteriologic, histopatologia i bioproba pe cobai
din materialele biopsice prelevate de la bolnav) i prin tehnici de biologie
molecular, cum ar fi reacia lanului polimerazic (PCR).
Tuberculoza organelor solide. Numeroase lucrri de specialitate fac
referiri la prezena tuberculozei n aproape toate organele i esuturile cu structuri
solide ale corpului uman. Unii autori sunt de prere c tuberculoza organelor
solide poate s mimeze aproape perfect cancerul de sn, cancerul metastatic la
ficat sau chiar cauza obinuit a bolii lui Addison (insuficien adrenalinic), n
prezent extrem de rar.
Limfadenita tuberculoas este cea mai comun form de tuberculoz din
exsteriorul cavitii toracice.
Incidena limfadenitei tuberculoase a crescut direct proporional cu crete-
rea incidenei infeciilor micobacteriene. Limfadenita tuberculoas a fost depistat
n aproape 35 % dintre cazurile cu tuberculoz extrapulmonar i n 15-20 % din
totalul cazurilor cu tuberculoz pulmonar . La pacienii infectai cu HIV, 53- 62 %
dintre cei infectai cu M. tuberculosis fac tuberculoz pulmonar (204, 55).
Limfadenita tuberculoas cervical i mediastinal, au fost diagnosticate de
unii autori (134) la 60 90 % pacieni, fr a fi afectate alte esuturi limfoide.
Limfadenita tuberculoas cervical, deumit i scrofula poate fi rezultatul
tuberculozei sistemice sau este posibil s apar ca entitate primar localizat la
gt. Datele din lieratura de specialitate arat c Mycobacterium tuberculosis este
agentul cauzal cel mai comun dar incidena bolii depinde de endemicitatea
bacteriei. n acelai timp, n unele zone ale globului, adenitele cauzate de
micobacterii netuberculoase (NTM), n special Mycobacterium avium
intracelulare (204).
Sunt afectai pacienii de orice vrst i de orice sex, dei susin c boala
predomin la femei. Frecvena limfadenitei cervicale pare a fi mai frecvent n
rndul populaiei asieatice.
Limfadenita cervical poate s apar n cursul infeciei primare, ca urmare a
reactivrii focarelor lente, sau prin extinderea direct a focarului infecios.
Infecia primar apare ca urmare a contactului iniial cu bacilii tuberculozei.
Dimensiunile aerosolilor ncrcai cu bacilii tuberculozei sunt suficient de
mici pentru a permite traversarea barierei de aprare mucociliar a bronhiilor i
localizarea n alveolele terminale constituind aici complexul primar. n continuare,
infecia se poate extinde din focarul primar la nodulii limfatici regionali i de aici
ajung n torentul sanguin infectnd toate organele corpului. Nodulii limfatici afe-
reni hililor pulmonari i cei mediastiali peritraheali sunt primii afectai n urma
rspmdirii infeciei din parenchimul plmonar iar nodulii supraclaviculari
reprezint punctul de plecare al drenajului limfatic ctre parenchimul pulmonar.

124
 De la limfonodulii cervicali, infecia se poate transmite la tonsile sau la oasele
etmoide.
n stadiul iniial al evoluiei infeciei, n limfonodulii superficiali are loc
multiplicarea progresiv a bacililor tuberculoi care declaneaz
hipersensibilitatea de tip ntrziat manifestat clinic prin hiperemie local (zona
de proiecie a limfonodulului afectat) ngroarea dermului i proceze de necroz i
cazeificare central (Fig.29).

Fig. 29 Tnar cu limphonodul cervical Sowlen, moale i fluctuant cu

tendina formrii de abcces ( dupa Prasanta si Ashok,2009)

Procesele inflamatoare continu prin creterea progresiv n volum a

limfonodulului; n unele cazuri, se produce confluarea ntre nodulii limfatici
nvecinai. Aderenele la esuturile adiacente produc induraii, zona fiind
consistent, ferm i decolorat urmare insuficientei vascularizri a zonei
respective.
Limfadenitele produse de micobacterii netuberculoase (NTB) sunt transmise
din mediul nconjurtor prin ingestie, inhalare, inoculare, etc. Poarta de intrare
pentru aceste micobacterii este mucoasa bu.cal sau gingival, cel mai frecvent
ntlnit la copii n perioada schimbrii dentiiei cnd micobacteriile
netuberculoase se pot localiza n alveolele dentare.
Simptomatologia limfadenitei se caracterizeaz prin manifestri locale
variate, n funcie de dispunerea anatomic a limfonodulilor sau a grupuli de
limfonoduli regionali. Cel mai frecvent sunt afectai limfonodulii cervicali (fig. 29),
urmai n frecven de cei mediastinali, axilari, mezenterici, perihepatici i portali
precum i limfonodulii ingvinali (30, 77).
Durata simptomelor este variabil, de la cteva sptmni la cteva luni. n
cazul adenitei tuberculoase cervicale, pacientul prezint uoar durere local
unilateral sau multipl, cu ngroarea ariei de proiecie a limfonodulului afectat
care, n decurs de cteva sptmni sau cteva luni, se mrete n volum.
Studiile efectuate de K a n l i k a m a, M. e t a l., 2000 (109) arat c
asemenea manifestri au fost observate n zonele de proiecie ale limfonoduluilor
cervicali posteriori i cu totul neobinuit n regiunea suprascapular.
La copii, se arat c limfonodulii submandibulari sunt cei mai afectai (109).
Apariia fistulei a fost observat n 10 % din cazurile cu limfadenit cervical ( 109).
n limfadenita cervical tuberculoas, simptomele sunt n mod obinuit
comune; de regul pacienii se prezint la unitatea medical cu uoar febr,
indispoziie i oboseal, acuz lipsa poftei de mncare i scdere evident a
greutii corporale. Transpiraiile nocturne sunt rare i, de aceea unii specialiti
consider aceste semne generale fr importan major pentru diagnosticul clinic
(57, 117, 126).

125
 Din punct de vedere al evoluiei clinice, P r a s a n t a R.M i A s h o k, K.J,
2009 (177) clasific tuberculoza nodulilor limfatici periferici n 5 stadii:
- stadiul 1, se caracterizeaz prin hipertrofierea nodulului limfatic afectat; dei
la palpare se percepe o induraie local, ca urmare a hiperplaziei moderate,
mobilitatea nodulului nu este afectat;
- stadiul 2, se caracterizeaz prin apariia reaciei eritematoase cu nroirea
ariei de proiecie a nodulilor i a esuturilor n care acetia sunt fixai, producnd
periadenit;
- stadiul 3, centrul zonei inflamate devine fluctuant datorit formrii abce-
selor;
- n stadiile 4 i 5, se remarc prezena abceselor subclaviculare care erup
formnd adevrate cratere i fistule prin care coninutul caseo-purulent i limfa se
scurg la exterior asemntor lavei vulcanice. n stadiul final, craterele sufer
procese ulcerative greu vindecabile.
Tuberculoza aparatului uro-genital (TBUG). Aparatul uro-genital este
principalul loc de elecie pentru bacilii tuberculoi n infecia secundar.
Segmenetele urogenitale dein primul loc n cadrul tuberculozei extra-
pulmonare i pot fi afectai: rinichii, ureterele, vezica urinar sau organele genitale
att la brbai ct i la femei (148).
Agentul cauzal cel mai comun este Mycobacterium tuberculosis dar s-a
demonstrat implicarea i a altor micobacterii, cum sunt: M. kansasii, M.
fortuitum, M. bovis, M. avium intracelulare, M. xenopi, M. celatum. Deobicei,
simptomele clinice apar la 10-15 ani dup infecia primar. Numai aproximativ un
sfert dintre pacienii cu tuberculoza genito-urinar (TBUG) au antecedente
cunoscute de tuberculoz; jumtate dintre acetia au examen radiologic
normal(148).
Analizele statistice arat c, n SUA incidena ridicat s-a nregistrat la
persoanele emigrante din Mexic , Asia de Est, Africa i din rile Sud Americane.
Rata infeciei tuberculoase cu localizare n aparatul urogenital la brbai fa de
femei este de 5:3 iar categoria de vrst cea mai afectat este 35-45 de ani (69)
dar, n ultimul timp, frecvena cazurilor cu tuberculoza aparatului urogenital a
crescut n rndul persoanelor n vrst de 45- 55 de ani i la cele de peste 70 de
ani. De asemenea, au fost descrise cazuri rare de tuberculoza aparatului urogenital
la copii n vrst de 5- 12 ani (148).
Bacilii tuberculozei ajung n pulmoni pe cale aerogen unde sunt fagocitai de
leucocitele polimorfonucleare i de macrofage.
Dei o cantitate apreciabil de bacili este reinut n pulmoni, o parte dintre
acetia ajunge n nodulii limfatici regionali sau, prin intermediul ca-
nalului toracic, micobacteriile intr n circuitul sanguin venos i se localizeaz n
rinichi producnd multiple granuloame situate n cortical i n glomeruli.
Pradoxal, dei ambii rinchi sunt nsmnai cu micobacterii, aproape regulat
procesele patologice se dezvolt unilateral ca urmare a rupturii pereilor capilari
din tubii contori proximali(69). Dezvoltarea granuloamelor tuberculoase produce
distrugerea sistemului caliceal permind dispersarea micobacteriilor n bazinetul
renal i mai departe n uretere, vezica urinar i n celelalte segmente ale
aparatului urogenital.
Apariia proceselor de fibrozare a esuturilor afectate i stricturii organice , cu
formarea de abcese i fistule depinde de statusul sistemului de aprare
imunologic al pacienilor. Pe de alt parte, s-a observat c boala mbrac forme
agravante i leziunile sunt mult mai extinse la pacienii cu disfuncii renale precum
i la cei cu hipertensiune arterial (HTA) (69).

126
 Tuberculoza ureterelor. Este primul segment al aparatului urogenital afectat
prin extinderea infeciei tuberculoase de la rinichi i a fost descris la jumtate
dintre pacienii cu tuberculoz extrapulmonar.
Ca i n cazul tuberculozei renale, diagnosticul clinic n tuberculoza uretere-
lor este extrem de dificil, clinicianul fiind obligat s apeleze la investigaia
radiologic, rezonan magnetic, etc.
n imaginea radiologic se observ frecvent stricturi ureterale i uneori
hidronefroz.
Tuberculoza vezicii urinare, este secundar tuberculozei renale i, deobicei
apre la deschiderea ureterelor n vezic. n faz incipient, la examenul radiologic,
se pot observa procese edematoase i granulaie urmate de fibroza i scarificaia
orificiului ureteral care duc la hidronefroz i reflux veziculo-ureteral. n leziunile
severe, peretele vezicii apare ngroat, stratul muscular fiind nlocuit de esut
fibrozat care reduce micrile peristaltice vezicale.
In stadiile avansate de boal i atunci cnd este afectat i prostata se
constat hematurie cu dureri pronunate n timpul urinrii, la peste 10 % din
cazuri. Hematuria microscopic este prezent la 50 % din cazuri (176).
Frecvena ntmpltoare la copii explic posibilitatea rspndirii infeci-ei pe
cale hematogen n timp ce la aduli infecia tuberculoas primar, realizat pe
cale ascendent, pare a fi mult mai frecvent avnd n vedere proporia mult mai
crescut a leziunilor localizate n epididim, uretr i prostat (148).
Epididimita tuberculoas. Epididimul se poate infecta pe cale hematogen,
prin intermediul retrocanaliculelelor descendente ale prostatei deja infectate sau
prin extinderea infeciei secundare de la rinichi n toate segmentele urogenitale
dar i direct pe cale ascendent prin ptrunderea micobacteriilor prin meatul
urinar, uretr i mai departe n epididim i testicole.
Formarea granuloamelor tuberculoase n epididim determin manifes-tri
clinice caracteristice.
Potrivit datelor din literatura de specialitate, incidena epididimitei
tuberculoase n unele ri n curs de dezvoltare este de 30 de ori mai mare dect n
SUA i boala s-a diagnosticat cu frecven mai mare la tineretul cu via sexual
activ, ntre 16-40 de ani. n prezent se remarc inciden crescut a tuberculozei
aparatului genital, inclusiv epididimita tuberculoas, la peste 70 % dintre
pacienii avnd vrsta de 35 de ani i la 15 20 % n vrst de 65 de ani (131).
Deobicei, pacienii se prezint cu semne tipice de epididimit: durerere local
accentuat; epididimul apare mult ngroat, mai ales n segmentul inferior (coada
epididimului), rigid la palpare, circumvoluiunile epididimale terse, uneori fiind
sesizate formaiuni granulomatoase de dimensiuni variabile.
Scrotumul apare congestionat, cald la palpare, edemaiat i cu sensibilitate
local crescut (pacientul acuz durere chiar la o atingere uoar a scrotumului).
n mod frecvent se constat epididimita unilateral, cu totul excepional bilateral
i acesta a fost observat n cazurile supuse tratamnetului carcinomului vezicii
urinare cu BCG (74,191,29).
Asociererea epididimitei tuberculoase cu cea prostatic sau vezical complic
diagnosticul clinic prin complexitatea manifestrilor clinice.
Indispoziia, febra i transpiraia rece nocturn sunt comune la pacienii cu
epididimit tuberculoas. La unii pacieni, epididimita tuberculoas a condus la
sterilitate (131). n faza incipient, epididimita tuberculoas nu se poate diferenia
clinic de epididimita infecioas produs de ali germeni dect micobacteriile.

127
 Secundar, n fazele avansate, infecia se poate extinde afectnd testicolul sau
prostata.
La palpaie, prin tueu rectal, se poate constata induraia i creterea n volum
a prostatei. Suprafaa prostatei nu mai este neted i elastic prezentnd
numeroase boseluri care pot fi atribuite prezenei granuloamelor pe suprfa sau
in esutul glandular. La unii pacieni cu infecie cronicizata pot apare sinusuri i
fistule perianale.
Volumul de lichid seminal este redus substanial sugernd extinderea
tuberculozei la lacanalul ejaculator i obstruarea acestuia.
Tuberculoza uretral, este considerat n practica medical cazuistic
excepio- nal dar, atunci cnd se constat, leziunile sunt localizate de obicei n
segmentul anterior al uretrei.
Pacientul prezint pe penis, la nivelul meatului urinar, un ulcer tuberculos
care, ulterior, se extinde n treimea anterioar a uretrei i n corpii cavernoi
formand granuloame, abcese i fistule cu consecine grave asupra actului
urinrii.
n mod similar, tuberculoza uterin se poate extinde la canaliculele Fallop i
la slapinx porducnd uterosalpingita tuberculoas sau, n cazuri mai uoare,
infecia poate s rmn localizat n uter, unde este posibil s se extind la ft
dac sarcina se dezvolt normal (11).
Aadar, diagnosticul clinic, n cazul tuberculozei urogenitale (TBUG), este
destul de dificil de stabilit i de aceea, medicul clinician trebuie s fac
diferenierea, pe baza investigaiilor paraclinice i de specialitate, fa de alte
entiti morbide, cum ar fi: carcinomul renal, schistosomiaza, colesteatoma,
pionefroza, echinococoza renal, infecia fungic, infecia colibacilar, cancerul
vezicii urinare, adenocarcinomul prostatic sau adenomul de prostat, induraii
n corpii cavernoi far cauze specifice, ulcere si erupii mecanice la nivelul
penisului, cancerul de col uterin.

Tuberculoza sistemului osteoarticular.

Tuberculoza steoarticular este recunoscut ca principala entitate morbid

nc din deceniile trecute, cnd incidena era semnificativ datorit lipsei
mijloacelor terapeutice eficiente i a msurilor adecvate de aprare a sntii
publice i pentru eliminarea factorilor de risc care favorizeaz apariia i evoluia
endemic a tuberculozei.
n prezent, incidena tuberculozei osoase i articulare a sczut substanial
odat cu descoperirea medicmentelor antituberculoase cu valoare ridicat i
aplicrii cu rigurozitate a msurilor de prevenire a rspndirii bolii n rndul
populaiilor umane.
Exist totui o inciden apreciabil a tuberculozei ososse i articulare n
rile subdezvoltate , n zonele endemice i cazuri rare n ri cu dezvoltare
economic medie.
Datele din literatura de specialitate arat c tuberculoza osteoarti-cular
reprezint aproximativ 10% din totalul cazurilor extrapulmonare i 1% din totalul
cazurilor cu tuberculoz pulmonar (223).
Tuberculoza osteoarticular se ntlnete cel mai frecvent la copii, dei este
dovedit c boala poate fi prezent la orice vrst, indiferent de sex.
De regul, Mycobacterium tuberculosis este agentul cauzal al tuber-culozei
osteoarticulare dar n rile sub dezvoltate sau n curs de dezolatere, unde
consumul

128
 de lapte de vac crud nepasteurizat, este aproape generalizat, Mycobacterium
bovis a fost izolat din leziunile pacienilor cu tuberculoz oasoas (208).
Infectarea oaselor i articulaiilor se poate realiza fie pe cale hematogen
(infecie direct) a membranei sinoviale fie indirect prin diseminarea dintr-un
focar primar (tuberculoza traheobrohic) ntr-un os adiacent sternal.
Focarul de tuberculoz osoas se extinde prin distrugerea centrifugal a
esutului nvecinat i n final ptrunde n articulaie; membrana sinovial
reacioneaz prima, iniial prin secreie seroas excesiv i ulterior prin
proliferare, ngroare i apariia esutului granular la interior precum i prezena
tuberculilor i fibrozei la exterior.
esutul granular tuberculos acoper cartilajul hialin, mpiedicnd regenerarea
acestuia i a osului subcondral.
n fazele avansate ale bolii, n focar se acumuleaz cantiti nsemnate de
material cazeo-necrotic i se produc procese exudative intense.
Ulterior, n focar se formeaz sinusuri i fistule prin care se scurge la exterior
material purulent, infectnd esuturile nvecinate cu micobacterii i flor
bacterian piogen. Asemenea procese patologice duc la distrugerea complet a
articulaiilor i oaselor afectate.
Localizarea focarelor tuberculoase este extrem de diversificat. Practic, pot fi
afectate: oasele capului i feei (180, 68, 87), coloana vertrebal (boala lui Pott)
incluznd vertebrele cervicale, toracale, lombare, sacrale i coccigiene (2, 140),
sternul i coastele (19, 206), oasele i articulaiile membrelor superioare, ncepnd
de la spat i pn la falange (209), oasele bazinului i membrelor inferioare (105).
De asemenea, tuberculoza osoas i articular poate evolua ntr-un singur
focar izolat , sau poate s fie diseminat la distan, n mai multe focare, afectnd
un grup sau mai multe grupe de oase i articulaii din componena scheletului
uman (151) .
Manifestrile clinice n tuberculoza osoas i articular sunt extrem de com-
plexe i necaracteristice, motiv pentru care n stabilirea diagnostiului clinic trebuie
s se apeleze la investigaii radilogice (Rx), imagine tomografic computerizat
(TC), rezonan magnetic (RM), etc. precum i la examene de laborator
paraclinice.
Izolarea agentului cauzal n cultur bacteriologic i examenul histopatologic
al probelor biopsice confirm diagnosticul. De regul, pacienii se prezint la
medicul clinician cu stare general alterat, cu evident scdere n greutate, (slbire
i anemie pronunate, mucoasele aparente palide), obosesc uor i
simptomatologie specific localizrii focarului tuberculos.
De exemplu, tuberculoza oaselor capului, poate afecta oricare dintre oasele
cutiei craniene i poate evolua sub diverse forme. Simptomele apar n cteva
sptmni sau luni de la diseminarea infeciei din focarul primar, de regul,
pulmonul i limfondurile gtului. Pacienii acuz dureri accentuate n zona oaselor
afectate i, uneori tulburri neurologice, lipsa poftei de mncare i transpiraii
nocturne. De aceea, n cele mai multe cazuri, tuberculoza oaselor capului este
numai suspicionat din punct de vedere clinic. n formele avansate de boal,
pacienii pot prezenta abcese reci cu formarea de sinusuri i fistule prin care se
scurge material purulent. Asememenea leziuni pot fi singulare, afectnd un singur
os sau leziuni multiple rspndite n mai multe oase din cutia cranian.
n cazurile grave, infecia tuberculoas se poate extinde la meninge i creier,
cu prognostic cel puin rezervat pentru pacienii respectivi.

129
 Investigaiile radiologice, tomografia computerizat (TC) sau rezonana
magnetic (RM) localizeaz focarele de tuberculoz dar boala trebuie confirmat
bacteriologic, histopatologic sau prin tehnici de biologie molecular.
Spondilita tuberculoas cunscut sub denumirea de boala lui Pott reprezint
peste 1% din totalul pacienilor cu tuberculoz.
Ca o consecin a proceselor litice ale vertrebelor i discului intervertrebal,
pot fi consemnate urmtoarele manifestri clinice: durere insiduas n spate,
cifoz, scolioz, paraparez i anchiloza coloanei vertebrale.
Cel mai frecvent, focarul tuberculos se localizeaz la nivelul vertebrelor
toracolombare. n 8o % din cazuri este afectat corpul vertrebal, n special
extremitile bogat vascularizate (plexul Botson) sugernd rspndirea infeciei pe
cale hematogen, cu toate c infeia se poate rspndi i pe calea ligamentelor
paraspinale sau prin continuitate (Fig.30).
n faza iniial se produc eroziuni la nivelul corpului vertrebei i ulterior
vertebra se aplatizeaz dnd natere la cifoz.
Evoluia nefavorabil a bolii conduce la formarea abceselor i fistulelor
paravertebrale care pot afecta muchii psoai sau se pot localiza subcutanat ca
abcese reci. Pe de alt parte, n faza avansat a bolii, compresia permanent pe
mduva spinrii i pe filetele nervoase adiacente provoac pareze i paraplegii, ca
forme de manifestare clinic a tuberculozei coloanei vertrebale.
Daignosticul clinic diferenial fa de alte afeciuni de natur infecioas sau
atipice este dificil de fcut. Totui, S u n g H w a n Hong e t a l., 2009 (97)
propun unele criterii de difereniere ntre tuberculoza coloanei vertrebale i
spondilita cu germeni piogeni, spondilita brucelic i spondilita aspergilar, pe
baza particularitilor analizelor prin rezonan magnetic (IMR) pentru fiecare
boal n parte.
n imaginea prin rezonan magnetic (IRM) se observ c spondilita cu
germeni piogeni afecteaz coloana vertebral lombar, de regul corpul uneia sau
dou vertebre i discul intervertebral respectiv, cu intensitate slab a semnalului
n T1(w.imr) i perderea evident a conturului suprafeelor extremitilor
vertebrale i corpului acestora.
Prin injectarea intravenoas a substanei de contrast gadolina, se pot
observa zone neconfluente de esut densificat sau sub form de benzi subiri
precum i zone de amplificarea contrastului la periferia discurilor. Pe de alt
parte , sugestiv pentru infecia piogen a coloanei vertebrale n imaginea prin
rezonan magnetic rmne extinderea procesului inflamator sub form de
flegmon su abces la foia epidural producnd compresarea mduvei spinrii cu
semnal de intensitate mixt att n T1 ct i T12 (97) (107).

Fig. 30 - Spondilit tuberculoas (boala lui Pott) (IRM, preluat de la Arh. Inst.Clemente Ferreira, Brazilia).

130
 n spondilita brucelic imaginile prin rezonan magnetic evideniaz cu
predilecie localizarea leziunilor n coloana lombar inferioar unde arhitectura
vertebral pare intact n ciuda prezenei osteomielitei difuze dar se remarc o
cretere semnificativ a intensitii semnalului n discul intervetebral pe imaginea
T2 (w.imr) cu contrast amplificat i pe suprafaa articular. Deformrile articulare
sunt destul de rare n comparaie cu cele observate n spondilita tuberculoas
(Fig. 31) .

Fig.31 - Spondilita brucelic

n spondilita aspergilar, imaginile prin rezonan magnetic se aseamn

cu cele din spondilita produs de germeni piogeni (120).
Caracteristic pentru spodilita aspergilar este absena semnalulului de
intensitate maxim n discurile intervertebrale datorit prezenei elementelor
feromagnetice n structura fungilor.
Tuberculoza oaselor i articulaiilor membrelor inferioare i superioare. Se
eidniaz cteva cracteristici cu semnificaie clinic impotant. Dac focarul este
localizat n zona articulaiei coxofemurale, pe lng simptomele generale,
pacientul prezint chiopturi i dureri, datorit imobilizrii articulaiei; zona
antomic afectat apare deformat datorit proceselor inflamatorii exudative i
proliferative.
Durerea n zona ariculaiei coxofemurale se accentueaz n cursul nopii,
motiv pentru care, acest sindrom a fost denumit criz nocturn. De asemenea,
zona afectat este cald i sensibil iar durerea se extinde odat dezvoltarea
focarului tuberculos . Pacientul manifest evident greutate n deplasare (213).
Formele avansate de boal agraveaz prognosticul prin aceea c procesele
litice oasteoarticulare produc degenerri osteoarticulare importante, apariia de
sinusuri i fistule precum i anchiloze cu imobilizarea bolnavului la pat.

4.1.2. TESTE ALERGICE.

Intradermoreacia (IDR),testul Mantoux

n principiu, limfocitele Th sensibilizate de ctre antigenul micobacterian prin

intermediul celulelor prezentatoare de antigen (CPA), la un nou contact cu acesta
(derivatul proteic purificat PPD) , elibereaz limfokine care pot recruta la locul
reaiei alte tipuri de celule a cror intervenie va provoca modoficri locale vizibile
ntr-un interval de 24-72 de ore.
La locul reaciei se produc infiltraii de limfocite, macrofage i enzime litice
capabile s declaneze procese inflamatorii care constau n permeabilizarea
pereilor microcapilarelor i invadarea locului reaciei de celule mononucleare.
131
 Cnd aceste procese se produc la nivelul dermului, zona respectiv apare
hiperemiat, congestiv, edematoas ngroat i dur la palpare.
Cnd organismul gazd vine pentru primadat n contact cu mico-bacteriile,
reacia alergic poate s apar in interval de 5-60 de zile de la con-tactul natural cu
micobateriile .
Perioada de sensibilizare i intensitatea reaciei sunt foarte variabile
depinznd de: virulena micobacteriilor de puterea lor patogen i de doza
infectant dar nu trebuie neglijat nici capacitatea imunologic a organismu-lui
gazd de a rspunde la stimulul antigenic. De exemplu, reacia alergic poate s fie
slab evideniat sau chiar absent la organismele gazd care:
- sufer de unele boli virale anergizante (viroze repiratorii);
- se gsesc n convalescen dup unele boli medicale, infecioase, para-zitare,
etc.;
- au vrsta naintat, cauz a atrofierii organelor limfopoetice;
- sufer de sindroame imunodeficitare sau infecii cu virusuri care afec-teaz
populaia limfocitar (virusul leucozei enzootice bovine LEB);
- sunt supuse unor stri de suprasolicitare (getaie sau sarcin avansat
parturiie efort fizic prelungit);
- au fost supse n ultimele 30 de zile tratamentelor cu medicaie imun0-
supresoare din grupa corticosteroizilor;
- au fost supuse tuberculinrilor repetate la intervale mai mici de 60 de zile;
n astfel de cazuri se produce desensibilizarea organismului prin blocarea
rceptorilor celulari MCH i TCR.
Reacia alergic local la tuberculin se caracterizeaz prin :
- edem produs prin extravazarea din capilarele sanguine a plasmei i a unui
numr important de monocite, limfocite i alte populaii de celule im-plicate n
raspunsul imun;
- eritem simplu papilomatos cu sau fr echimoze i necroz care deobicei
apare n centrul locului de inoculare a antigenului (PPD).
Din punct de vedere clinic, reacia alergic poate fi clasificat astfel:
- reacia de focar, dat de prezena proceselor locale exudative i con-gestive ;
- reacia general, se manifest prin febr, dispnee, stare de oc, etc.
Pentru provocarea reaciei alergice locale i/sau generale, se folosesc extracte
din culturile de micobacterii denumite generic tuberculine sau derivate proteice
purificate(PPD). n prezent, se produc, n conformitate cu reglementrile
OMS/OIE i Metodologia de preparare i control ale Laboratorului Webridge
Anglia, tuberculine tip bovin(PPD-B), cu coninut de 50.000 UTI/ml. , extrase din
culturi de Mycobacterium bovis; tuberculine tip aviar (PPD-A), cu 25.000 UTI/ml,
extrase din culturi de Mycobacterium avium avium i tuberculinele tip uman
(PPD-M), obinute din culturi de Mycobacterium tuberculosis.
Dat fiind faptul c testarea alergic (tuberculinarea) practicat n medicina
veterinar la animale difer de de testul alergic (testul Matoux) din medicina
uman, att n ceeace privete metodologia de lucru ct i sistemul de citire i
interpretare a reaciilor, cele dou proceduri vor fi prezentate separat.
Pentru depistarea bovinelor potenial infectate cu Mycobacterium bovis, sunt
omologate i se aplic la scar internaional dou proceduri de testare alergic:
testul alergic intradermic unic (IDR-TU) i testul comparativ simultan (IDR-TCS)
n conformitate cu Directiva 64/432/CEE precum i Manualul de Teste
de
Diagnostic i Vaccinuri pentru Animalele Terestre al OIE/2010 cu
modificrile ulterioare .
132
 Cu cteva decenii n urm n Romnia s-a practicat, pe scar mai restrns,
testul alergic intravenos (TIV), care evidenia n special, reacia general a
animalului potenial infectat cu micobacterii (evoluia febrei n interval de cteva
ore de la injectarea tuberculinei). Datorit dezavantajelor majore (fiecare animal
contenionat i termometrat de mai multe ori n decurs de cteva ore, specificitatea
testului extrem de redus, .a.), la asemenea procedur s-a renunat de mult.
Pentru aceleai considerente s-a renunat i la testul intradermoparpebral sau testul
oftalmic (TO). Testul se mai practic doar n unele laboratoare de specialitate
pentru diagnosticul alergic al tuberculozei la maimue.
Fiecare tuberculin (bovin i/sau aviar) se injecteaz strict intradermic, n
doz de 0,1 ml.
Pe latura gtului, n treimea mijlocie sau n pliul cozii bovinelor, sau pe
suprafaa extern a urechii la porcine, posterior articulaiei spatulohumerale la oi i
capre ori n brbie la cocoi. Citirea i interpretarea reaciilor se face la 72 de ore de
la injectarea antigenelor.

Testul intradermic unic (IDR-TU) la animalele domestice i

slbatice .

Este cunoscut i sub denumirea de metoda intradermic simpl i const n

injectarea intradermic numai a tuberculinei tip bovin (PPD-B). Pentru executarea
corect i n condiii corespunztoare a testului este obligatoriu a se aplica
urmtoarele:
a. msuri pregtitoare, cuprinznd: pregtirea animalelor care urmeaz a fi
testate, pregtirea instrumentarului i materialelor necesare desfurrii lucrrilor
de testare;
b. testarea alergic propriuzis.

a. msuri pregtitoare, materiale i echipamente necesare:

- foarfec de uz veterinar, se recomand aceea cu braele curbate, bine

ascuite;
- cutimetru cu cadran de uz veterinar , face parte din trusa de tuberculinare
Mc. Lintok. Pentru msurarea corect a grosimii pielii, ntotdeauna se va verifica
funcionarea cutimetrului care nu trebuie s nregistreze abateri n plus sau n
minus ale acului indicator. Atunci cnd cele dou brae ale cutimetrului sunt perfect
apropiate , acul indicator trebuie s se afle n poziia 0. Dac se observ abateri
ale acului indicator, se va demonta sticla protectoare a cadranului i celelalte pri
componente care vor fi curate de murdrie i rugin, vor fi gresate piesele glisante
i vor fi fcute reglajele care se impun cu ajutorul urubului de reglare. Se
recomand a nu se folosi alte tipuri de ublere pentru msurarea grosimii pielii n
afara celor omologate. Funcionarea corect a cutimetrului va fi verificat inaintea
fiecrei utlizri i prin efectuarea a minim 3 msurri de control la cel puin 3
animale la care diferenele ntre msuratori la fiecare animal nu trebuie s fie mai
mari sau mai mici dect 1,0.
seringa de tuberculinare Mc.Lintok, cu un numr suficient de ace
intradermice i piese de rezerv, are un rol esenial n obinerea i interpretarea
rezultatelor testului alergic (Fig.32).
De aceea, verificarea seringii trebuie s vizeze 3 obiective principale:
. ncrcarea complet a seringii;
. administrarea strict intradermic a cantitii de tuberculin prevzut;
133
 . realizarea unei presiuni corespunztoare pentru formarea nodulului de
inoculare.
Pentru ncrcarea complet a seringii, se verific mobilitatea pistonului i a
cursorului prin deplasarea acestuia pn la gradaia 1,0 ml., aspirnd ap distilat
i apoi acionnd prghia de presiune i urmrind ca deplasarea cursorului s se
fac astfel nct pasul acestuia s nu fie mai mare dect o diviziune (deplasare pas
cu pas cu administrare strict a 0,1 ml. PPD).

Fig.32 - Seringa de tuberculinare Mc Lintok (asmblat i pri componente). .

1. Prghie de presiune ; 2. stift de prinderea prghiei de presiune; 3. Piuli pentru reglarea tensiunii resortului de presiune
; 4. tija de susinere i resortul de presiune; 5. Tij cu pinteni echidistani limitatori i cursor cu deplasare pas cu pas
pentru doza de 0,1 ml.; 6. Rondel suport colorat (rou sau albastru); 7. Piston ; 8. Prghii de sprijin n timpul lucrului

Primul jet, n cazul ncrcrii complete a seringii trebuie s fie refulat

simultan primei acionri a prghiei de presiune i acesta trebuie s fie complet,
fr refulri ulterioare eliberrii prghiei de presiune.
Administrarea strict intradermic a tuberculinei, depinde de reglajul
lungimii acului (lungimea acului trebuie s fie 3,0 mm.) i de etaneitatea
garniturilor de asamblare a pieselor componente precum i de segmentul de
presiune al pistonului seringii. Pentru reglarea lungimii acului se fac msurtori de
prob ale grosimii pielii la 25 de bovine de vrst i sex diferite , se nregistreaz
valorile i se determin media aritmetic n funcie de care se regleaz lungimea
acului.
Controlul administrrii strict intradermic a tuberculinei, este obligatoriu i
se va face la fiecare animal n parte prin viziualizarea i palparea nodulului de
inoculare. Lipsa nodulului de inoculare impune ntreruperea lucrului i
remediere defeciunilor aprute la sering; se verific dac aceasta realizeaz
presiune corespunztoare i administreaz doza corect de la prima acionare a
prghiei de presiune.
Echipamentele de lucru (seringile de tuberculinare i cutimetrele) tre-buie s
fie verificate i echilibrate, cel puin trimestrial, de ctre o unitate de profil
autorizat care va atesta printr-un act oficial buna funcionare a acestora.
Tuberculina (PPD) tip bovin , care se folosete n testul intradermic unic
(IDR-TU), trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
- s fie atestat de ctre un laborator autorizat de stat pentru parametrii de
calitate, n conformitate cu standardele europene;
- fiecare serie de tuberculin trebuie s fie nsoit de un buletin de calitate i
instruciunile de stocare i utilizare; fiecare flacon va fi etichetat i bine nchis
pentru a se nltura orice contact al coninutului din flacon cu mediul nconjurtor;

134
 - pe eticheta flaconului vor fi inscripionate denumirea i adresa
productorului, denumirea produsului, seria, data fabricaiei i valabilitatea,
numrul de UTI/ml., coninutul n protein/ml. i numrul de doze, condiii de
pstrare; n cazul tuberculinelor liofilizate vor fi precizate instruciunle de
reconstituire a produsului;
- coninutul lichid din flacon trebuie s fie limpede, galben-citrin sau uor
brun, fr turbiditate, precipitate, etc.
Este interzis utilizarea tuberculinelor care nu ndeplinesc una sau mai multe
dintre condiiile menionate.
Alte materiale. Pentru desfurarea n condiii corespunztoare a aciunii de
tuberculnare sunt necesare :
- formulare pentru nregistrarea datelor (tabele de tuberculinare, procese
verbale de executare a aciunii, registre de evidena animalelor reagente);
- echipament de protecie (mucarni sau aparat de contenia animalelor,
halate sau salopete, cizme, personal ajuttor pentru nregistrarea datelor, materiale
igienico-sanitare).
n cadrul msurilor pregtitoare, proprietarii de animale au urmtoarele
obligaii:
- s identifice i s individualizeze corect , prin crotaliere sau prin procedee
electronice (microcip), toate animalele supuse controlului;
- s asigure toate condiiile de lucru i fora de munc necesar executrii
testului;
- s dein toate evidenele sanitare veterinare cu privire la starea de sntate
a animalelor i evidenele zootehnice completate la zi (pentru proprietarii
indviduali, carnete de sntate a animalelor);
- s nu nstrineze nici un animal, dintre cele supuse controlului, pn la
finalizarea aciunii i obinerea rezultatelor testrii ;
- s respecte i s execute orice instruciuni i dispoziii ale autoritii
veterinare implicat n executarea lucrrilor de testare.

b. Testarea alergic propiuzis (tehnica de lucru).

Stabilirea i pregtirea locului pentru injectarea tuberculinei. Locul unde se

injecteaz tuberculina, de regul pe latura gtului, n treimea mijlocie, se tunde (nu
se rade ) pe o suprafa n form deptrat (Fig.33 ), cu latura de 5,0 cm., unde nu
exist induraii, cicatrici, noduli sau alte leziuni ale pielii.

5cm

Fig. 33 - Stabilirea i pregtirea locului pentru injectarea tuberculinei n testul intradermic unic
(IDR-TU).

Cu toate c n unele ri testul alergic se practic prin injecatrea tuberculinei

n pliul caudal(157), studiile efectuate n ara noastr au demonstrat c locul cel mai
propice este latura gtului, reactivitatea local n aceast zon fiind mult mai
relevant n comparaie cu ce obinut prin injectarea tuberculinei n pliul caudal.
135
 Pe de alt parte, s-a constatat c treimea mijlocie a gtului reprezint aria de
confluen a sistemului limfatic i reactivitatea n acest zon este maxim.
La porcine, injecatarea tuberculinelor se face in dermul de pe faa superior a
urechilor (Fig.34), iar la capre i la ovine pe latura toracelui n zona posterioar
articulatiei scapulohumerale, unde pielea este depilat.

Fig.34 - Locul injectrii tuberculinelor i aspectul reaciei alergice in diagnosticul tuberculozei la

porcine (dup Manualul Merk) .

nainte de inocularea tuberculinei , animalul se examineaz sub raportul strii

generale de sntate, strii de ntreinere , aspectul nodulilor i vaselor limfatice
periferice din regiunea capului , gtului spetei i glandei mamare i toate
constatrile vor fi notate, pentru fiecare animal, n tabelul de tuberculinare. De
asemenea, se va avea n vedere i prezena: dermatitei nodulare, actinomicozei,
actinobacilozei, hipodermozei, leucozei enzootice bovine (LEB), etc. n continuare:
- se msoar, cu ajutorul cutimetrului, pliul vertical al pielii din mijlocul zonei
tunse. Deplasarea braului mobil al cutimetrului se va face moderat fr a
comprima esuturile sau acesta se deplaseaz liber n cazul cnd resortul
cutimetrului nu a fost demontat;
- se noteaz grosimea pliului n milimetri, individual, pentru fiecare animal n
parte n tabelul de tuberculinare coloana pliu iniial (PI) cu cifre arabe,
desprind cifrele ntregi de zecimale prin virgul (exemplu: 7,2 mm).
Injectarea tuberculinei bovine (PPD-B), se face cu ajutorul seringii de
tuberculinare Mc. Lintok, n mijlocul ptratului, meninnd seringa cu acul oblic,
de sus n jos cu vrful ndreptat spre capul animalului (Fig.35).
n

A B

Fig.35 - Injectarea intrademic a tuberculinei. A: introducerea acului n grosimea dermului. B:

injectarea a 0,1 ml. tuberculin ; injectarea corect este demonstrat prin apariia nodulului de inoculare
(n)
Se introduce acul n profunzimea dermului, se acioneaz prghia de presiune
i se injecteaz o,1 ml. tuberculin. Dup injectarea tuberculinei se verific dac
cursorul seringi s-a deplasat numai o singur diviziune (un pas) i dac la locul de
inoculare este prezent nodulul de inoculare care de regul nu depete
dimensiunile unui bob de linte.

136
 Dac aceste dou deziderate nu au fost ndeplinite ,operaia de tuberculinare
trebuie s se repete cu o nou doz de tuberculin, injectat pe latura congener a
gtului, acest lucru fiind consemnat n tabelul de tuberculinare pentru animalul
respectiv.
Citirea i interpretarea reaciei tuberculinice, se face la 72 de ore de la
injectarea tuberculinei, numai de ctre aceeai persoan care a efectuat msu-
rtoarea iniial, folosind acelai cutimetru.
Citirea reaciei const n :
- msurarea pliului vertical al pielii la locul n care dimensiunea reaciei este
maxim; valorile vor fi notate n tabelul de tuberculinare n coloana pliu la 72 de
ore sau pliu final (PF);
- aprecierea caracterului reaciei (dup msurarea pliului pielii);
- msurarea n centimetri a diametrelor (vertical i orizontal) pentru
aprecierea ariei de extinderea a reaciei.
Reaciile constatate se pot prezenta sub dou forme: edem i nodul.
Din punct de vedere al consistenei , edemul poate fi:
- edem moale (e.m.), prezint dimensiuni variabile, ncepnd de la 0,5 cm.
Consistena moale a acestui tip de edem se explic prin aceea c , din punct de
vedere morfologic, predomin componenta lichid (infiltrat, exu-dat);
- edem pstos (e.p.), este considerat acela care se ncadreaz n dmensiuni
de peste 1,1 cm., cu marginile pstoase i care, la palpare, evideni-az pentru
cteva secunde amprentele digitale iar prin compresiune se dezvolt o und
pulsatil marginal. Consistena edemului pstos este dat de structura morfologic
n care elementele celulare sunt prezente n proporie de 50-60 %;
- edem dur (e.d.), are o consisten crescut pe toat suprafaa de reacie iar la
percuie poate fi perceput un zgomot mat. Aceste caractere ale edemului dur fac
aproape imposibil diferenierea lui de nodul. Componenta celular din structura
acestui tip de edem reprezint 90 %.
Din punct de vedere al aspectului , edemul poate fi:
- edem circumscris (e.c.), cu marginile bine delimitate n form oval,
circular sau declivitate, avnd form de par;
- edem difuz (e. dif.), prezint marginile terse fr a fi delimitate net.
Nodulul (nod.), este reprezentat de racia caracterizat prin ngroarea
dermului cu sau fr descuamarea stratului cornos al epidermului. Dimensi-unile
nodulului nu depesc 1,0 cm .
La citirea reaciei tuberculinice trebuie avute n vedere cteva elemente de
importan deosebit n aprecierea reactivitii specifice cu M. bovis, pre-cum:
- sensibilitatea local (prezena durerii la locul de inoculare), exudaie i
eritem local;
- leziuni la locul de inoculare exprimate prin necroz i descuamri ale
stratului superficial epidermic;
- reactivitatea organelor limfoide periferice, adiacente locului de inocu-lare,
cum ar fi: hipertrofia nodurilor limfatice, prezena coardei limfatice.
Interpretarea reaciei tuberculinice se va face pentru fiecare animal n parte,
apreciindu-se:
- dimensiunea, consistena, forma i aspectul reaciei, care vor fi consemnate
n tabelul de tuberculinare, n coloana aferent i n acelai timp, se nregistreaz
diferena ntre dimensiunile pliului final (pf) i pliului iniial (pi) precum i
caracteristicile reaciei pentru fiecare animal testat.

137
 n funcie de datele nregistrate , interpretarea reaciilor tuberculinice n
testul intradermic unic (IDR-TU) n diagnosticul tuberculozei la bovine, se face pe
baza criteriilor stabilite n Ordinul MAAP 236/05.06. 2002, prezentate n tabelul
nr. 9.
Tabelul: 9

Interpretarea i ncadradrea reaciilor tuberculinice n testul intradermic unic (IDR-TU) pentru

ndiagnosticul tuberculozei bovine

Situaii Descrierea reaciei ncadra

rea
reaciei
1 Diferena ntre pliul final (pf) i pliul iniial (pi) de 4,0 mm. sau mai POZITIV
mare, cu sau fr semne locale sau reacie cu edem moale (e.m.) sau (P)
edem pstos (e.p.)
2 Diferena ntre pliul final (pf) i pliul iniial (pi) de 2,0 -3,9, fr DUBIOAS
semne locale sau reacie cu edem dur (ed) sau nodul (nod) (D)
3 a. Nu se constat nici o reacie, sau: NEGATIV
b. Diferena ntre pliul final (pf) i pliul iniial (pi) este sub 2,0 mm., (N)
cu nodul (nod) la locul injectrii PPD

Animalele cu reacii pozitive i/sau dubioase la testul intradermic unic (IDR-

TU) vor fi izolate de restul efectivului i vor fi retestate, dup minim 45 de zile dar
nu mai trziu de 60 de zile, prin testul intradermic comparativ simultan (IDR-
TCS) sau, dup 7-15 zile de la IDR-TU, prin metode in vitro de analiz a
imunitii mediate clular (IMC).

Testul intradermic comparativ simultan (IDR-TCS).

A fost denumit i testul intradermic comparativ simplu i const n injectarea

concomitent, n puncte separate, a celor dou tuberculine: bovin (PPD-B) i
aviar (PPD-A), cu coninut de 5000 i respectiv 2500 UT/doz.
Pentru efectuarea testului intradermic compartiv simultan (IDR-TCS), sunt
necesare aceleai echipamente i materiale ca n testul unic, cu deosebirea c, n
acest az, se folosesc dou seringi de tuberculinare destinate injectrii PPD-B i
respectiv PPD-A, marcate corespunztor pe discurile montate pe corpul seringii
pentru a nu se face confunzii n timpul operaiei de tuberculinare. Tuberculina
aviar (PPD-A) trebuie s ndeplineasc aceleai condiii menionate pentru
tuberculina bovin (PPD-B).O alt deosebire fa de testul intradermic unic (IDR-
TU) este aceea c, n testul intradermic comparativ simultan (IDR-TCS) se
stabilesc i se tund, pe aceeai latur a gtului dou ptrate cu laturile de 5,0 cm.
,fiecare amplasate ca n fig.nr. 36.

PPD-A

PPD-B

5cm

Fig.36 - Amplasarea zonelor de injectarea tuberculinelor (PPD-B i PPD-A) n testul intradermic

compaativ simultan (IDR-TCS) pentru diagnosticul tuberculozei la bovine.

138
 Etapele de lucru (msurarea pliului iniial i final al pielii, injectarea
tuberculinelor i citirea reaciilor) sunt aceleai ca n testul intradermic unic (IDR-
TU) cu precizarea c tuberculina aviar (PPD-A) se injecteaz n ptratul superior
(situat deasupra liniei imaginare de proiecie a vertebrelor cervicale) iar tuberculina
bovin (PPD-B) n cel inferior (sub linia de proiecie a verteberelor cervicale).
Dup efectuarea msurtorilor i aprecierea caracterelor fiecrei reac-ii(la
PPD-B i la PPD-A) se va efectua diferena diferenelor de grosime a pliului care se
obine din diferena final nregistrat la reacia cu tuberculin bovin (PPD-B) i
cea obinut la tuberculina aviar (PPD-A). Rezultatul va fi nregistrat n tabelul de
tuberculinare n coloana corespunztoare tuberculinei cu valoarea diferenelor mai
mare. Exemplu: la PPD-B. pi= 7,2 i pf=17,5 , e.p. ; Dif.PPD-B = 17,5-7,2 = 10,3 i:
La PPD-A. pi=7,5 i pf = 10,4 ; Dif.PPD-A =10,4 7,5 = 2,9. Deci:

Dif.d. = Dif.PPD-B Dif.PPD-A = 10,3 2,9 = rPPD-

B > rPPD-A cu 7,4
Dif.d = diferena diferenelor ; rPPD = Reacia tuberculinic

Interpretarea reaciilor i ncadrarea animalelor testate se va face dup criteriile din

tabelul nr.10.
Tabelul: 10

Citirea, interpretarea i ncardrarea animalelor in funcie de reactivitatea la testul

intradrmic comparativ simultan
Situaia Descrierea reaciei ncadrarea ncadrarea
recei animalului
1 a/. Reacie pozitiv la PPD-B , mai mare cu peste 4,0 mm
dect reacia la PPD-A indiferent de prezena sau nu a
semnelor locale (e.m., e.p., exudaii, necroz, coard limfa-
tic); POZITIV Potenial infectat cu
b/. Reacie pozitiv la PPD-B , egal cu reacia la PPD-A i (P) M. bovis
prezena semnelor locale :e.p., e.m., exudaii, necroze la
locul de inoculare a PPD-B i e.d. sau nod la PPD-A

2 Reacie pozitiv la PPD-B , mai mare cu 1 - 3,9 mm dect DUBIOAS Se va recontrola

reacia la PPD-A i absena semnelor locale , sau e.d. sau (D)
nod. La PPD-B

3 a/. Absena oricrei reacii la ambele tuberculine; NEGATIV Potenial neinfectat

b/. Reacie pozitiv la PPD-B , mai mic dect reacia (N) cu M. bovis
pozitiv la PPD-A i absena semnelor locale

n vederea eliminrii unor factori subiectivi, care determin interpretarea

eronat a reaciilor, trebuie respectate urmtoarele regului:
 - este obligatorie nregistrarea grosimii pliului pielii la toate animalele, att
nainte de injectarea tuberculinelor ct i la 72 de ore cnd se execut citirea
reaciei;
- la aprecierea caracterului edemului se va ine seama de consistena acestuia .
De exemplu, dac consistena edemului este dur n centru iar zona periferic este
moale sau pstoas, edemul va fi considerat moale sau pstos;
- asupra specificitii reaciilor se va avea n vedere c n general, edemele
nregistrate la animalele infectate cu M. bovis i/sau M. tuberculosis, prezint
aderen la esuturile adiacente, n timp ce edemul nregistrat la animalele
sensibili-
139

zate nespecific (cu micobacterii din mediul nconjurtor), nu prezit aderene,

fiind mobil.
Stabilirea specificitii sensibilizrii tuberculinice. Pentru interpretarea
corect a reaciilor nregistrate la testul intradermic comparativ simultan (IDR-
TCS), n vederea aplicrii msurilor necesare, trebuie s se stabileasc dac n
efectivul de bovine testat exist o sensibilizare specific ( determinat de infecia
cu M. bovis) sau sensibilizarea constatat este consecina altor cauze (sensibilizare
nespecific provocat de dermatita nodular, paratuberculoz, actinobaciloza,
micobacterii nespesifice, micobacterii atipice sau unele infecii parazitare ca:
fascioloza, dictiocau-loza, echinococoza .a. precum i hipodermoza) (186, 73 241,
175, 194).
Cu toate acestea , oricte eforturi s-ar depune, o specificitate maxim a
testului
intradermic comparativ simultan (IDR-TCS) este extrem de dificil de obinut n
condiiile n care derivatele proteice purificate (PPD bovin sau aviar) extrase din
corpul micobacteriilor i utilizate curent pe scar larg pentru testare, conin n
structura lor o multitudine de antigene sau fraciuni antigenice, fiecare dintre
acestea fiind implicate ntr-o reea de relaii extrem de complexe cu alte
micobacterii din mediul nconjurtor sau cu ageni microbieni, parazitari ca cei
menionai anterior (147). Oricum, avnd n vedere o monitorizare epidemiologic
corespunztoare, asupra circulaiei micobacteriilor n populaiile de animale din
teritoriul controlat, ante-cedentele efectivelor de animale cu privire la evoluia
tuberculozei precum i acurateea lucrrilor de depistare a animalelor potenial
infectate cu M. bovis, periodic se impune a se stabili parametrii de specificitate i
sensitivitate a preparatelor tuberculinice (PPD) utilizate n testele intra-
dermotuberculinice nr-o populaie de animale dintr-un anumit teritoriu.
Rezultatele cercetrilor personale , au demonstrat variabilita-tea semnificativ a
parametrilor de specificitate i sensitivitate de la un jude la altul, sugernd
necesitatea stabilirii acestor parametri naintea nceperii campaniilor de
tuberculinare n mas n fiecare jude n parte (St. Popescu, date personale).
Rezultatele investigaiilor sunt susinute de numeroase stu-dii internaionale
anterioare care evidentiaz relaia stransa intre perfor-manele testelor
tuberculinice i tehnicile de de lucru utilizate, schemele de interpretare a
rezultatelor testarilor , calitatea preparatelor PPD, vrsta ani-malelor contactul cu
alte animale domestice sau salbatice dar si prezenta micobacteriilor
netuberculoase din mediul inconjurator (198,169).
In functie de factorii mentionati Monagham M.L., et al, 1994 (149), gasesc
sensitiviti ale testelor intradermotuberculinice de 68 96 % pentru testul
intradermic cervical i de 96-98% pentru testul intradermocaudal i specifiti de
 80-91% pentru testul intradermic cervical si 88-100% pentru testul
intradermocaudal .
Sensibilizarea nespecific, se consider cnd:
- printre animalele cu diagnostic negativ exist cazuri la care reacia la
tuberculina bovin (PPD-B) este negativ sau aceasta este prezent dar mai slab
exprimat dect reacia la tuberculina aviar (PPD-A);
- sunt prezente cazuri clinice sau reacii pozitive la paratuberculin (PPD-J)
precum i animale cu dermatit nodular sau alte boli infecioase sau parazitare
cu influen asupra reactivitii animalelor;
- ntreg efectivul sau n efectiv sunt prezente animale imunizate M. bovis
bacilul Calmette-Guerin (BCG);

140
- datele epdemiologice indic evoluia n efectiv a unor boli parazitare,
precum: fasciloza, dictiocauloza, strongilatoze pulmonare i gastrointestinale,
echino-cocoza, cisticercoza, .a.
Pentru stabilirea specificitii reaciilor tuberculinice se va efectua o analiz
epidemiologic minuioas, n special asupra istoricului tuberculozei n populaia
de animale domestice i din mediul silvatic n teritoriul controlat, statusul
epidemiologic al efectivului testat precum i asupra originii i trasabilitii bolii.

Testul intradermic Mantoux: intradermoreacia (IDR).

Descoperit de Matoux , testul este utilizat i n prezent la scar mondial

pentru depistarea infeciei tuberculoase la om i pentru punerea n eviden a
reaciei de hipersensibilitate ntrziat la persoanele vaccinate BCG cnd pot s
apar situaii n care testul s depisteze acele persoane la care imunitatea post
vaccinal s fie slab sau aceasta s nu se fi instalat.
Intradermotuberculinarea (testul Mantoux) se bazeaz pe rspunsul imun
mediat celuar (IMC) al organismului la contactul cu antigene micobacteriene aa
cum sunt: tuberculinele sau derivatele proteice purificate (PPD), extractul solubil
tuberculos (ESAT-6), filtratul proteic din cultura M. tuberculosis. Tuberculina
injectat provoac local o eliberare de limfokine , care n 24-72 de ore, se produce la
locul de inoculare un aflux de monocite i macrofage i a unui mare numr de
limtocite T CD4+, cu ngroarea pielii la locul de inoculare.
n acelai timp prolifereaz keratinocitele n membrana bazal a epidermului
care au pe suprafaa lor receptori celulari proteici, HLA-II. Reacia de
hipersensibilitate ntrziat este exteriorizat prin aflux celular local dominat de
macrofage i limfocite T, polimorfonucleare bazofile precum i limfocite B i
polimorfonucleare eozinofile.
Testul Mantoux se aplic n urmtoarele situaii:
- pentru analiza medical a uni caz cu tuberculoz ;
- depistarea sau supravegherea persoanelor cu expunere frecvent la infecia
cu bacilul tuberculozei;
- testarea prevaccinal cu BCG la copii n vrst de peste 4 sptmni.
Pentru executarea testului Mantoux sunt necesare urmtoarele matriale:
- tuberculina, un derivat proteic purificat (PPD) extras din culturi de
Mycobacterium tuberculosis obinut pentru prima dat de Seibert i Mundy.
Derviatul proteic purificat (PPD) (tuberculina S), obinut de Seibert i Munday
prezenta numeroase neajunsuri, n special variaii semnificative ale rezultatelor
testelor tuberculinice i de aceea s-a preparat tuberculina RT23 dintr-o cultur a 7
sue de M. tuberculosis reprezentnd tuberculina de referin OMS (Institutul
Seruri Copenhaga), stabilizat cu Tween 80 (0.005%) .
 Pn n anul 2003, n Europa s-a folosit Tuberculina Merieux care ulterior a
fost abandonat din motive bine fundamentate. n prezent, mai multe ri, precum:
Frana, SUA .a., folosesc tuberculina Tubertest sau Tubersol ;
- sering de 1,0 ml. cu ac special de calibru 25- 26 G pentru administrare
intradermic;
- rigl gradat n mm., pentru msurarea diametrelor reaciei
tuberculinice.
Tehnica de lucru. Testul intradermic (Mantoux), sau intradermo-
tuberculinarea se realizeaz n conformitate cu recomandrile OMS i Procedura de
lucru elaborat de Dr. Simona Buca de la Centrul Medical de Diangnostic Dr.V.
Babe Bucureti, injectnd n dermul de pe faa intern a antebraului doza de 0,1
ml. tuberculin.
141
Realizarea unei injecii corecte, strict intradermice , este confirmat de,
apariia instantanee, la locul injectrii tuberculinei, a unei papule (nodul de
inoculare) de culoare portocalie care dispare n cteva ore (Fig.37).

Fig. 37 - Executarea testului intradermic tubercullnic (mantoux), intradermoreacia

la om (IDR).

Respectarea cu strictee a procedeelor tehnice de execuie a testului este

esenial pentru citirea i interpretarea corect a reaciei .
Citirea reaciei trebuie s se fac la 72 de ore de la injectarea tuberculinei,
dar la persoanele n vrst este recomandat a se face o ultim citire la 5 zile.

Fig.38 - Citirea i interpretarea reaiei tuberculinice (testulMantoux) la om.

Reacia se caracterizeaz prin apariia unei zone eritematoase n jurul

puctului de inoculare i ngroarea pielii (Fig.38).
ngroarea pielii se apreciaz prin palpare i prin msurarea n mm., cu
ajutorul riglei gradate a diametrelor reaciei care poate s varieze de la 0-30 mm.
Pentru aprecierea pozitivitii reaciei se consider numai dimensiunile
induraiei pielii, diametrele reaciei eritematoase neavnd semnificaie diagnostic.
 O reacie intens pozitiv, cu prezena unei vezicule la locul de inoculare, a
fost denumit flictem i ea corespunde unei reacii locale exacerbate,
neavnd
semnificaie special, dar sugereaz c persoana testat a venit n contact direct cu
M. tuberculosis.
Notificarea rezultatelor testului Mantoux se va face preciznd tehnica
utilizat, data executrii testului, diametrul induraiei i caracterul reaciei.
Gradul de pozitivitate i interpretarea reaciei. Trebuie s se fac
diferenierea, pe de o parte a gradului de reactivitate local care constituie un
criteriu de apreciere al negativitii sau pozitivitii testului i pe de alt parte,
modalitile de interpretare care reprezint criteriile de ncadrare a
rezultatelor

142

testului pentru fiecare pacient (infecie tuberculoas latent, vaccinare cu BCG

tuberculoz activ), n funcie i de ansamblul informaiilor disponibile.
Interpretarea reacei n testul Mantoux.
- o reacie negativ, se consider atunci cnd ngroarea pielii are diametru
mai mic de 5,0 mm. ;
- o reacie pozitiv n testul Mantoux, se consider atunci cand diametrul
ngroerii pielii depete 5,0 mm..
O reacie pozitiv la tuberculin sugereaz o infecie tuberculoas lent sau
a unei tuberculoze active, vaccinare cu BCG sau contactul pacientului testat cu
micobacterii atipice care pot produce reacii alergice ncruciate.
n general ,diametrul reaciei provocate de micobacterii atipice este mai mic
dect diametrul reaciei produse de M. tuberculosis.
n aprecierea reaciei tuberculinice este necesar a se avea n vedere i cteva
elemente epidemiologice care ajut la interpretarea adecvat a testului Mantoux.
De exemplu, n zonele pronunat endemice majoritatea reaciilor corespund
infeciei tuberculoase prin contact direct cu M. tuberculosis i n asemenea situaii,
pragul de interpretare a reaciilor trebuie s fie mai mare de 5,0 mm.
Cnd prevalena tuberculozei este relativ sczut se poate considera c
persoana testat a venit n contact cu alte micobacterii i de aceea dac se
nregistreaz diametre ale reaciilor cuprinse ntre 5 9 mm, interpretarea este mai
dificil aceste reacii fiind considerate reacii slab pozitive
n general, n afara contextului special cum ar fi imunodepresia, la
persoanele cu risc pentru o infecie tuberculoas recent, se aplic urmtoarele
criterii pentru interpretarea reaciei pozitive:
- diametrul mai mare sau egal cu 10 mm., fr ca persoana s fi fost
vaccinat anterior cu BCG;
- o cretere a diametrului reaciei mai mare sau egal cu 10 mm. ntre dou
teste (IDR) efectuate la interval de 3 luni.
Pentru o interpretare corect a rezultatelor testului Mantoux, sunt necesare a
fi considerate i alte elemente,ca: antecedentele vaccinrii cu BCG, hiper-
sensibilitatea ntrziat anterioar a pacientului, existena unei eventuale imuno-
depresii, contactul cu o persoan cu tuberculoz activ i eliminatoare de bacili
tuberculoi i stabilirea unui cadru general cu criterii de ncadrare a reciilor de la
caz la caz .
a. Persoanele nevaccinate cu BCG, supuse testului Mantoux. n cazurile n
care reacia la tuberculin are diametrul mai mic sau egal cu 10 mm., se poate
interpreta c persoanele respective au venit n contact direct cu bacilii tuberculozei
i c acele persoane sunt purttoare de bacili tuberculoi viabili, fiind vulnerabile la
 o nou infecie n special dac au suferit ulterior un sindrom de imunodepresie.
Conform datelor din literatura de specialitate , riscul de a face tuberculoza activ n
cursul vieii este de 5- 15% pentru aceste persoane.
b. Persoanele vaccinate cu BCG. Cercetrile imunlogice au demonstrat c
vaccinarea cu BCG induce o reacie intradermotuberculinic al crui diametru nu
depete sau cel mult este egal cu 5,0 mm i niciodat reaciile intens pozitive nu
vor fi mai mari n diametru de 10,0 mm., n primii 2 ani de la vaccinare neavnd
semnificaie diagnostic. Dac dup 2 ani de la vaccinare se nregistreaz reacii cu
diametrul mai mare sau egal cu 10,0 mm se poate considera c persoanele
respective sunt infectate cu M. tuberculosis.

143
c. La pacienii infectai cu HIV, datorit proprietilor virusului de a
produce alterri seriose ale sistemului imunitar mediat celular (IMC), reaciile
intradermotuberculinice sunt slab reprezentate i ele pot fi utilizate n aceste cazuri
numai pentru a stabili o eventual infecie tuberculoas latent. La pacienii cu
imunodepresie sever ( limfocitele TCD4 < 200/mm3) se nregistreaz frecvent
anergie la tueberculin i de aceea reacia intradermotuberculinic i pierde total
valoarea diagnostic.
Reacia intradermotuberculinic negativ, se constat la persoane care nu
au venit niciodat n contact cu bacilii tuberculozei i nici cu micobacterii atipice. n
acelai timp, reacia intradermotuberculinic (IDR, testul Mantoux) poate fi
negativ la persoane infectate cu M. tuberculosis din urmtoarele cauze:
- erori tehnice (tuberculin alterat, injecie profund subcutanat, citirea
ntrziat a reaciei, subestimarea dimensiunilor diametrului reaciei );
- realizarea testului n timpul fazei prealergice a unei infecii latente sau
vaccinare ( la mai puin de 2 luni dup contaminare sau administrare de vaccin
BCG);
- realizarea testului n timpul evoluiei unei boli sau ntr-o faz de anergie
tuberculinic: infecii virale (rujeol, otite, mononucleoz infecioas, infecie cu
HIV), corticoterapie prelungit, tratament imunosupresor i chimioterapie
anticanceroas, malnutriie;
- realizarea testului la o persoan n vrst, la care reactivitatea la
tuberculin scade n raport cu vrsta. De exemplu, infecia tuberculoas nu este
depistat dect n proporie de 30 40 % la persoanele n vst de 65 70 de ani.
Depistarea cazurilor speciale cu infecie recent. Diagnosticul infeciei
tuberculoase recente este destul de dificil de stabilit n lipsa unei simptomatologii
relevante i de aceea se apeleaz frecvent la testul intradermotuberculinic Mantoux
(IDR) care prezint urmtoarele particulariti:
- un prim test negativ ( reacie < 5 mm.) urmat de un al 2-le test, efectuat la
2 -3 luni dup primul cu o reacie pozitiv 10 mm , sau:
- o reacie IDR slab pozitiv (ntre 5 i 9 mm) , urmat de a doua intens
pozitiv cu creterea diametrului peste 10 mm. ntre cele dou testri, sau:
- depistarea reactivitii la tuberculin la o persoan contact implic
cercetarea atent a unei eventuale tuberculoze active.

4.1.3. METODE IMUNOLOGICE DE DEPISTARE IN VITRO A

INFECTIEI TUBERCULOASE

Cercetrile din ultimii ani, efectuate n numeroase ri, au demonstrat c

testele de hipresensibilitatein vitro, care se bazeaz pe analize ale rspunsului
mediat celular (RIMC) n infecia tuberculoas n tuberculoza activ, prezint
avantaje notabile fa de testele alergice clasice, cel puin n domeniul veterinar,
astfel:
- se reduce cu 50% stresul de conteie al animalului;
- nu este influienat statusul imun al animalului; aceste teste pot fi repetate
ori de cte ori este necesar i la orice intervale la anmalele suspecte de boal;
- sunt simple i uor de executat n laboratoarele pentru diagnosticul mico-
bacteriozelor, cu dotare modest;
- indicatorii de acuratee i reproductibilitate sunt mult mai crescui dect n
testele alergice clasice;
- persoanele supuse controlului prin aceste nu trebuie s revin la cabinetul
medical pentru citire i interpretarea reaciilor.

144

Testul de imunostimulare a limfocitelor (TISL).

Principiul metodei. Limfocitele bovinelor sau cele de la oameni, sensibilizate

cu M. bovis sau M. tuberculosis i reiau activitatea mitotic in vitro n prezena
antigenului specific (stimul antigenic), cum ar fi tuberculina (PPD). Fenomenul
poate fi evideniat prin apariia unui numr sporit de mitoze n preparatele
microscopice sau prin msurarea cantitii de timidin tritiat (H-3-Tym)
incorporat de limfocite n cursul proliferrii acestora. Rezult c metoda poate fi
efectuat n dou variante. n continuare, va fi prezentat varianta testului de
imunostimulare a limfocitelor (TISL) aa cum a fost aplicat n Institutul de
Diagnostic i Sntate Animal , dup metoda de lucru elaborat de Samarineanu
M, et al.,1995 (193) , pentru diagnosticul tuberculozei la bovine, pe baza numrului de
mitoze vizualizate microscopic, din cultura de sange integral.
Materiale necesare:
- alcool sanitar;
- seringi VACUMETTE ( capacitate, 7,0 ml.) cu heparin litiat (H-li) i
ace adecvate pentru prelevarea sngelui;
- Mediu pentru culturi celulare RPMI-1640, cu L- glutamin i bicarbonat de
sodiu, pH=7,2;
- ser fetal bovin (BFS);
- antibiotice: penicilin + streptomicin sau gentamicin;
-lectine: Phytohemaglutinin (PHA), PokweedMitogen (PWM),
Concanavalin (Con A);
- alergene: tuberculin bovin (PPD-B) i/sau tuberculin aviar (PPD-A);
- colchicin sol. 0,025%;
- clorur de potasiu (Kcl), sol. 0,5%;
- acid acetic glacial;
- metanol absolut;
- sol. Giemsa;
- ap distilat;
- tuburi sau flacoane din sticl neutr (sau din material plastic special
pentru culturi celulare) cu dop din cauciuc atoxic sterile, sau plcue cu 24 de
godeuri destinate pentru culturi de esuturi;
- seringi sterile;
- repartitor manual automat;
- eprubete pentru centrifug ( vol. 15,0 ml.) cu fund rotund ;
- pipete gradate sterile (vol. 1,o 25,0 ml.);
- lame pentru microscop;
 - pens hemostatic;
- incint steril;
- incubator-termostat cu limite de temperatur 37,5 38,0 C;
- centrifug cu rotor oscilant sau, n cazul utilizrii plcilor pentru culturi de
esuturi, centrifug cu rotor pentru plci;
- microscop optic;
- balan anlitic;
- dispozitiv cu vid pentru absorbia supernatantului.
Tehnica de lucru.
a.Recoltarea i transportul probelor de snge.
Probele de snge se reolteaz aseptic, individual cu ajutorul seringilor VACUMETTE
din vena jugular sau caudal, se agit uor pentru omogenizare i se trimit la
laborator n interval de 4-8 ore de la recoltare la temperatura ambiant (22 +/- 5 C).
145

b. Realizarea i stimularea culturii de snge integral. Pentru o prob de

snge sunt necesare flacoane (tuburi) sau 3 godeuri din placa pentru culturi de
esuturi:
- un flacon, tub sau godeu ( notat cu nr.1 urmat de nr. de identificare al
probei) pentru proba de testat (stimulat cu PPD-B);
- un tub, flacon sau godeu (nr.2 ) pentru martorul control pozitiv (stimulat
cu o lectin PWM, Con A sau PHA);
- un flacon, tub sau godeu (nr. 3) pentru martorul control negativ
(nestimulat). n funcie de scopul urmrit proba poate fi stimulat simultan cu
PPD-B i cu PPD-A, n acest caz fiind necesar un flacon tub, sau godeu suplimentar
pentru o prob, destinat stimulrii cu PPD-A.
Ingredientele pentru fiecare prob sunt prezentate n tabelul nr. 11
Tabelul: 11

Ingredientele i cantitile necesare pentru fiecare prob de snge integral n testul de

imunostimulare limfocitar (TISL)

Ingrediente U.M. Gogeul nr.1 Godeul nr. 2 Godeu nr. 3

Proba test Martor pozitiv Martor negativ
Mediul de cultur:
- mediul RPMI-1640; ml. 5,0 5,0 5,0
- ser fetal bovin ( BFS) ml. 0,5 0,5 0,5
- Penicicilin (x) U.I. 1500 1500 1500
- Streptomicin (x) mcgr 500 500 500

Ageni mitogeni:
- Tuberculina bovin (PPD-B) ml. 0,1 - -
- Lectin (xx) mcgr. - 50(100) -
- TFS steril ml. - - 0,1
Snge integral ml. 0,5 0,5 0,5

(x)= Soluiile de Penicilin i streptomicin pot fi nlocuite cu gentamicina (250 mcgr./godeu)

(xx)= n funcie de lectina folosit : 50 mcgr. PWM sau Con A ; 100 mcgr. PHA

c. Etapele de lucru:
- se calculeaz numrul total de godeuri ( tuburi, flacoane) n raport cu nu-
mrul probelor de snge care fac obiectul testrii;
- se prepar cantitatea total de mediu de cultur cu componentele necesare
prevzute pentru numrul probelor de snge. De exmplu, pentru o prob trebuie:
- 5,0 ml. mediu RPMI-1640, 0,5 ml. ser fetal bovin (BFS);
- 1500 UI penicilin + 500 mcgr. streptomicin sau 250 mcgr. Gentamicin.
Toate ingredientele se omogenizeaz atent i se distribuie n godeuri
(flacoane, tuburi) dup indicaiile din tabelul nr.11.
 n continuare, n godeurile notate cu nr.1 se reparizeaz cte 0,1 ml PPD-
B/godeu i n godeurile cu notate cu cifra 2 se va repartiza una din urmtoarele
lectine: 100 mcgr. PHA sau 50,0 mcgr. ConA sau PWM,folosind alt pipet de 1,0
ml.
Se repartizeaz apoi din probele de snge (utiliznd un repartitor semi
automat la care se monteaz pipete de 5- 10 ml.) ,dup omogenizarea prealabil,
cte 0,5 ml snge integral n godeurile nr.1,2 i 3, corespunznd probei respective.
Toate opreaiunile se realizeaz aspetic n incinta steril schimbnd pipeta
pentru fiecare prob care urmeaz a fi repartizat n godeuri (tuburi, flacoane).
Incubarea culturilor de snge integral se face ntr-un ncubator, la temperatura de
37,5 38,0C i 5,0 % CO2 ( n cazul incubrii plcilor pentru culturi de esuturi),
timp de 72 de ore.

146

d. Prelucrarea probelor post-cultur.

Tratarea probelor cu colchicin (colchicinizarea). Cu 90 de minute naintea

expirrii timpului de incubaie , se adaug n fiecare godeu (flacon sau tub) cte 0,5
ml/godeu din sol. 0,025 % colchicin; culturile se reincubeaz timp de 90 de
minute i apoi coninutul se transfer n tuburi de centrifug i se centrifugheaz la
regim de 1500 2000 rpm timp de 10 min. Se ndeprteaz supernatantul folosind
trompa de vid sau repartitorul manual automat programat pentru regim de
aspiraie. Sedimentul se reine.
No t : ndeprtarea sedimentului trebuie s se fac cu atenie sporit
pentru ca leucocitele, depozitate n urma centrifugrii, n strat fin albicios deasupra
stratului de hematii, s nu fie absorbite
ocul hipotonic, se realizaez n scopul distrugerii hematiilor.
Se adaug la fiecare prob cte 5 - 6 ml. sol. de clorur de potasiu (KaCl), se
agit pn se obine hemoliza complet, se la s n repaus 15-20 de minute la
temperatura camerei, se centrifugheaz la 1000 rpm timp de 10 minute i se
ndeprteaz supernatantul prin procedeul enunat mai sus.
Fixarea, se face n 3 etape, folosind soluia fixator format din: 1 parte acid
acetic glacial + 3 pri metanol absolut.
- prima fixare: sedimentul se suspend n 2,0 ml. fixator i se menine la
temperatura camerei 5 min., dup care, proba se centrifugheaz timp de 10 min. la
1000 rpm i se ndeprteaz supernatantul;
- a doua i a treia fixare, se realizeaz dup acelai procedeu ca n prima
fixare, sedimentul fiind meninut n fixator la frigider timp de 20 de minute.
N o t : Fixatorul trebuie s fie preparat adhoc i meninut la 4C.
Etalarea: Ultimul sediment se resuspend n aproximativ 0,5 ml. fixator i
se etaleaz pe toat suprafaa lamelor de microscop (exceptnd zona marcat cu nr.
probei), prin picurare de la o nlime de 3 -4 cm. pentru o mai bun dispersie a
celulelor. Dup 4 5 sec. se flambeaz fixatorul apoi lamele se spal cu ap
distilat i se usuc la temperatura camerei.
Colorarea preparatelor. Lamele se acoper cu o soluie Giemsa (5,0 ml.
Giemsa n 100,0 ml. ap distilat ) pentru 30 35 de minute; se spal la robinet
apoi cu ap distiat i se usuc la curent de aer.

e. Examinarea preparatelor.
 Lamele preparate i colorate se examineaz la microscopul optic (Oc.10 i
Ob.10) rnd cu rnd i se numr mitozele observate. Acestea apar de regul libere
n cmp ca aglomerri de cromozomi n forma liverei V i 1 la mascul i respectv
2 la femel avnd forma literei X (total 60 de cromozomi). Examinnd cu Ob.10
al microscopului, pot aprea dificulti n a diferenia metafazele adevrate de alte
formaiuni prezente n preparat (aglomerri de bacterii, artefacte, etc.) dar o
examinare cu Ob.20 sau 40 nltur substanial aceste neajunsuri.

f. Citirea i interpretarea rezultatelor.

Se examineaz lama nr.3 (control negativ)de la fiecare prob, numrndu-

se mitozele aprute spontan in vitro; n mod normal pot fi observate pn la 10
mitoze.

147

Se examineaz lama nr.1 a fiecrei probe test i pot fi ntlnite dou situaii:
1. Numrul metafazelor (mitozelor) de pe lama aparinnd probei test s fie
de dou ori mai mare dect cel de pe lama nr.3 (control negativ), adic indicele
de stimulare (Is) mai mare dect 2N : n acest caz proba test este considerat
pozitiv i lama nr.2 (control pozitiv) nu se mai examineaz;
2. Numrul metafazelor (mitozelor) n proba test nu depete de dou ori
numrul celor observate pe lama control negativ (Is 2N), situaie n care se
examineaz i lama nr.2 i:
- dac pe lama nr. 2 (control pozitiv) , Is > 2N, testul este negativ;
- dac pe lama nr. 2 (control pozitiv), Is 2N, testul este neconcludent i
trebuie repetat pe o alt prob prelevat de la acelai animal.

g. ncadrarea animalelor n funcie de rezultaele TISL.

Toate animalele ale cror probe:

- au dat rezultate pozitive n TISL, se consider sensibilizate i potenial
infectate cu M. bovis;
- au dat rezultate negative n TISL, se consider c nu au venit n contact cu
M. bovis;
- au dat rezultate neconcludente n TISL, se recomand:
1. retestarea acelor animale n TISL, efectuat n paralel folosind ca stimuli
PPD-B i PPD-A sau paratuberculin;
2. retestarea prin TISL a acelor animale cu Is 2, dup o evaluare a
rezultatelor testelor intradermotuberculinice anterioare pentru a depista
eventuale cazuri anergice. n asemenea cazuri se recoman a se apela i la alte teste
pentru imunitate mediat celular (IMC) detecia gamma-interferonului , ELISPOT-
TB .a
Cu toate c n literatura de specialitate, testul de imunostimulare a
limfocitelor (TISL) este apreciat ca avnd o sensitivitate ntre 95,6 97,0 i o
specificitate de 80,5 90,0 % totui, prezint unele inconveniente care reduc
substanial valoarea de diagnostic. Datele personale obinute n urma aplicrii
testului la bovinele infectate cu M. bovis arat c, nerespectarea condiiilor de
acuratee, utilizarea heparinei sodice ca anticoagulant, n locul heparinei litiate dar
mai ales citirea i interpretarea subiectiv a probelor (numrarea mitoselor n
microscopie optic), duc laobinerea de rezultate false.
Masurarea gradului de imunostimulare a limfocitelor cu marker
radioactiv.

n numeroase ri testul de imunostimulare a limfocitelor (TISL) n cultur

de snge integral fost modificat prin stimularea limfocitelor n cultur pur i
cuantificarea proliferrii acestora prin msurarea nivelului de
ncorporare a tymidinei tritiate (H-3-Tym.) ca marker al intensificrii metabolismului n
cursul proliferrii celulare (158,181,218). Posibilitile de aplicare a testului cu tymidin
tritiat sunt limitate pentru laboratoarele veterinare din Romnia. Totui, interesul pentru
cercetarea imunitii mediate celular (IMC) n infecia tuberculoas la animale este
suficient de crescut, motivnd oportunitatea prezentrii metodei n varianta cu tymidin
tritiat ncorporat, cu avantaje net superioare fa de varianta clasic, n special privind
acurateea senzitivitatea i specifictatea mai crescute.

148
Procedura de lucru este cea recomandat de R h o d e s S G e t a l. (181 ) i
Q i n X u e J u n e t a l. ( 179) i const n:
- separarea celulelor mononucleare din proba de snge periferic heparinizat
de restul componentelor prin centrifugare n gradient de densitate cu Histopaque-
1077 i resuspendarea lor n mediul de cultur RPMI-1640 cu glutamax,
suplimentat cu 5 % CPRS (inlocuitorul serului fetal bovin), aminoacizi neeseniali,
antibiotice ( penicilin, 100 UI/ml; streptomicin,10 g/ml) i 5 x 10M2 -
mercaptoetanol;
- celulele se resuspend la concentraia de 2 x 10- 10 6/godeu din care
se administreaz cte 0,1- 0,2 ml n n primele 3 godeuri ale fiecrei probe din
plcua de microtitare cu 96 de godeuri (Nunc) cu fundul plat ; n urmtoarele 3
godeuri ale fiecrei probe se administreaz cte o,1 0,2 ml PBS steril cu pH=7,2,
reprezentnd proba nestimulat (control negativ, Nill). n scopul eliminrii
rezultatelor false, ca urmare a unor posibile boli ale sistemului imun celular
(immunodepresie, HIV, leucoza enzootic bovin, tratamente cu imunosupresoare,
etc) n urmtoarele 3 godeuri pentru fiecare prob se poate realiza cte un martor-
control pozitiv, repartiznd unul din substanele mitogene: PWM, PHA, ConA n
dozele i concentraiile specificate n varianta clasic a TISL;
- dup omogenizare complet culturile se incubeaz timp de 5 zile la 37 C.n
atmosfer umed i 5 % CO2. Unii autori, recomnd incubarea culturilor timp de 6
zile (179 ,247).
- cu 24 de ore naintea terminrii incubrii, culturile de celule se trateaz cu
tymidin tritiat (H-Tym.)(37kB2/godeu) dup care, culturile se scot din
incubator, se ndeprteaz execesul de tymidin i apoi celulele se supun
examinrii privind cantitatea de timidin ncorporat ncelule. Ali autori , sunt de
prere c 16 ore sunt suficiente pentru contactul timidinei cu celulele. De
asemenea , pentru recoltarea celulelor se recomand trecerea culturii prin filtru cu
fibre de sticl. ( 179, 247) .
- cantitatea de timidin tritiat ncorporat, care exprim nivelulul
metabolismului limfocitelor i implicit proliferarea acestora, ca urmare a stimulrii
specifice cu PPD, se msoar la un culter scintilograf pentru impulsuri- n
numr de impulsuri/min. (ipm);
- rezultatele testului se exprim n impulsuri/min., astfel: media
impulsurilor din proba test, stimulat cu PPD minus media impulsurilor din aceeai
prob, nestimulat.
- se consider rezultat pozitiv cnd media numrului de impulsuri n proba
stimulat cu PPD este mai mare de 3 0ri dect media numrului de impulsuri din
aceeai prob nestimulat (Nill) i mai mare dect 2,000.
 W h e l a m O A. e t a l., 2003 (247) interpreteaz rezultatele testului n
studiul modulrii rspunsurilor de hipersensibilitate ntrziat la bovine fa de
antigene micobacteriene definite printr-o lipopeptid bacterian, prin indicele de
stimulare (IS) dat de raportul ntre media impulsurilor pe min. n proba
nestimulat /media impulsurilor n aceeai prob nestimulat. Cnd acest indice de
stimulare a fost 2 i fora semnalului de 1,000 ipm, proba a fost considerat
pozitiv. Pentru a compara rspunsurile la PPD-B cu cele la PPD-A, aceeai autori
folosesc criteriul: ISPPD-B >ISPPD-A i IS PPD-B >3 cu fora semnalului >1,000 ipm.
Pentru a economisi timp i soluii de scintilaie se recomand, n prim faz a se
analiza godeurile nestimulate (martor negativ ) i cele stimulate cu mitogen
(martorul pozitiv) se compar rezultatele i:
- dac media impulsurilor n martorul pozitiv este mai mic dect cea
martorului negativ sau egal cu aceasta, rezultatul este neconcludent i testul
trebuie repetat;
149
- dac media numrului de impulsuri n martorul control - pozitiv este mai
mare de cel puin 3 ori media impulsurilor n control negativ, testul este validat i
se continu analiza probelor test, conform procedurii de mai sus.

Testul imunoenzmatic, procedeul sandwich, pentru detecia

gamma - interferonului (EIAs-IFN)la bovine.

Creterea interesului fa de infecia tuberculoas i aprofundarea studiilor

de imunitate mediat celular (IMC) la animalele bolnave, ca urmare a progreselor
nregistrate n domeniul bioingineriei genetice, s-au soldat, n ultimele decenii, cu
descoperirea unor mijloace de diagnostic al tuberculozei. Astfel, a fost descoperit i
perfecionat testul imunoenzimatic, varianta sandwich, pentru detecia gamma-
interferonului (EIAs-IFN) din sngele bovinelor infectate cu M. bovis.
Metoda a fost preluat de la CSL-Ltd, Parkville, Australia, asimilat la
Institutul de Diagnostic i Sntate Animal i omologat de Comisia Naional
Veterinar pentru Omologarea Metodelor de Diagnostic Veterinar.
Cercetrile efectuate, n anul 1998, n scopul evalurii performanelor au
demonstrat avantaje reale fa de intradermoreacie (IDR). Cu toate acestea, testul
imunoenzimatic de detecie a gamma-inteferonului (EIAs-IFN) nu are
aplicabilitate larg n diagnosticul tuberculozei la bovine n Romnia. O parte dintre
specialiti, fr argumente notabile, au manifestat scepticism cu privire la
performanele testului i doar un numr restrns specialiti din domeniul cercetrii
au utilizat sporadic metoda.

Principiul metodei. (Fig.39).

Proba de snge integral heparinizat

Cultura de snge intergal stimulat

Plasm cu PPD-B (B) i PPD-A (A) i TFS
pH=7,2 (N) i incubare 16-24 0re

B A N
Prelevare plasm

B A N
 MoAb detecie IFN EIAs-IFN

MoAb captur
EIAs-IFN Rspuns Nill
POZITIV pt. slab la
M.bovis PPD-A

Fig.39 - Principiul testului imunoenzimatic (procedeul sandwich) pentru detectarea gamma-

interferonului (EIAs-IFN) (dup ,250).

Testul imunoenzimatic , procedeul sandwich, se bazeaz pe rspunsul

limfocitelor din snge integral la stimuli antigenici, reprezentai de extractele
proteice purificate (PPD) din M. bovis i M. avium, prin eliberare de gamma-
interferon (IFN) al crui nivel este exprimat n densitate optic (DO 450 nm ) i
comparat cu cel al martorilor control-pozitiv i negativ i al probei nestimulate (N).

150
a. Tehnica de lucru.

Tehnica de lucru pentru diagnosticul tuberculozei bovinelor comport dou

etape distincte:
1. Prelevarea, transportul , realizarea i stimularea culturii de s nge
integral. Pentru efectuarea testului EIAs-IFN, probele de snge se recolteaz de la
animale , n tuburi soeciale care conin heparin litiat (Hep-LI) ca anticoagulant.
Pentru prelevarea probelor de snge heparinizat sunt necesare urmtoarle
materiale:
- tuburi tip Vacuette cu heparin litiat (15 UI/ml) i volum de colectare
minim 7,5 ml. de la un animal (Fig.40)

a b c

Fig. 40 Echipament de recoltarea probelor de snge pentru testul EIAS-IFN

a: Holder; b: tub vacuette cu Hep-Li; c: ac de recoltare

- suport (holder ) pentru fixarea acelor i tuburilor colectoare = 2-3

buc/recoltator;
- creion pentru marcarea probei de snge = 1 buc./recoltator;
- vat i alcool pentru dezinfecia locului de recoltare a sngelui.
Tehnica recoltrii sngelui. Tuburile Vacumette i acele sunt astfel
confecionate nct recoltarea probei se face steril, n vid. De aceea, se descriu n
detaliu operaiunile de reclotare.
Animalul identificat, de la care urmeaz a se recolta proba de snge, se
contenioneaz n poziie convenabil pentru evidenierea perfect a venei jugulare
(sau venei caudale).
 Se desigileaz acul de puncie, prin ndeprtarea nveliului protector (acul
de puncie este protejat de o capsul din material plastic care nu va fi ndeprtat
dect n momentul punciei vasului sanguin).
Exist mai multe tipuri de tuburi vacumette pentru colectarea sngelui:
tuburi tip sering cu piston, care se pregtesc pentru recoltare i tuburi simple
vacuumizate i etaneizate cu capac din cauciuc prin care poate ptrunde cu
uurin acul de recoltare. Tubul pentru colectare tip sering este prevzut cu un
piston care ntotdeauna este plasat n parte superioar a tubului. Pentru lucru ,
pistonul poate fi deplasat, cu ajutorul tijei din material plastic, n partea inferioar
a tubului pn se percepe acustic un cliket, dup care tija poate fi ndeprtat prin
rupere. Tubul poate fi utilizat i atunci cnd pistonul rmne n partea superioar ,
n acest caz, operatorul va deplasa uor pistonul ctre partea inferioar n cursul
recoltrii pn la sesizarea sunetului specific care confirm etaneizarea pistonului
la fundul tubului.

151

Tuburile clasice simple, prevzute cu capac din cauciuc, se utilizeaz fr

recomandri speciale.
Se dezinfecteaz locul de puncie a vasului de snge. Se ndeprteaz capsula
protectoare a prii active a acului. Se puncioneaz peretele vasului i, atunci cnd
operatorul s-a asigurat c acul a penetrat peretele vasului , adapteaz tubul colector
la ac prin inseria pintenilor existeni pe capacul tubului n canelurile din lamboul
acului apoi , prin uoar presiune i rotirea tubului de la stnga la dreapta, capacul
tubului este perforat i cantitatea de snge dorit este colectat n tub .
Dup terminarea recoltrii, tubul se detaeaz de la ac, executnd micrile
inverse celor pentru recoltare , apoi se extrage acul din lumenul vasului. Proba de
snge se noteaz cu numrul de ordine din tabelul de identificare a animalelor care
nsoete probele. Sunt necesare cteva micri de balansare a tubului n plan
vertical pentru omogenizarea perfect a sngelui cu anticoagulantul.
N o t : Adaptarea acului i perforarea supapei tubului de colectare naintea
penetrrii vasului de snge permite ptrunderea aerului n tub i devacumizarea
acestuia. n asemenea situaie tubul nu mai poate fi folosit.
Dup prelevarea i ambalarea probelor de snge, se redacteaz adresa de
expediere ctre laborator la care se anexeaz tabelul de identificare a probelor. n
tabelul de identificare a probelor trebuie s se menioneze pentru fiecare animal n
parte rezultatul ultimului test intradermotuberculinic (IDR-TU).
Transportul probelor pn la laborator se va face n interval de 4 8 ore de
la recoltare la temperatura ambiant (22 +/- 5 C ).
Stimularea culturii de snge integral. ndat ce probele au sosit la
laboratorul specializat pentru executarea testului EIAs-IFN, acestea se verific sub
raportul identitii i se supun operaiunilor premergtoare culturii. Dac acest
lucru nu este posibil, probele pot fi stocate la temperatura camerei (22 +/- 5 C )
pentru o perioad de timp care nu trebuie s depeasc 12 ore de la recoltare
(timpul de ateptare a probelor pentru procesare n laborator se calculeaz din
momentul prelevrii primei probe)
Atenie! Probele nu vor fi stocate la frig (frigider, congelator sau ghea). Este
foarte important s se respecte aceste condiii pentru a se reduce riscul de
distrugere masiv a celulelor.
Pentru desfurarea lucrrilor n condiii optimale, sunt necesare urmtoarele
echipamente i materiale:
- incint steril ................................................................................... 1;
- roller-roker pentru omogenizarea probelor de snge (opional) .. 1;
 - agitator- vibrator plcue pentru culturi de esuturi (opional)....... 1;
- pipete gradate de 1,0 ml., sterile.............................................. 3/efectiv;
- plcue pentru culturi de esuturi x 24 de godeuri ..............1/8 animale;
- piete gradate sterile de 5 10 ml ......................................... 1/animal;
- pipet semiatuomat multicanal (8 canale) 200-300l....................1
- vrfuri (tipsuri) pentru pipeta semiaut0mat........................3/animal;
- sitem Combitips-Dispenser (opional)................................................1;
-Tampon Fosfat Salin (TFS), 0,01M, pH=7,2 .................. 100l/animal;
- tuberculin (PPD) bovin (0,3 mg/ml. ........................... 100l/animal;
-tuberculin (PPD) aviar (0,3 mg/ml. .............................. 100l/animal;
-tuburi Wassermann sterile....................................................3/efectiv;
-vat steril;
- soluie pentru dezinfecia suprafeelor.

152

Pregtirea tuberculinelor pentru stimularea culturii de snge.

Deobicei, kiturile-ELISA comerciale conin tuberculinele bovin i aviar gata

pregtite pentru lucru. Totui, pentru mai mult siguran se recomand a se utiliza
tuberculinele autohtone.
n general tuberculina bovin (PPD B) comercial romneasc conine 1,0
mg/ml. protein total, echivalentul a 50.000 de UT/ml iar tuberculina aviar
(PPD A) echivalentul a 25.000 UT/ml.
Concentraia de protein pentru stimularea optimal a probei a fost calculat
a fi 300 g/ml i de aceea tuberculinele comerciale trebuie diluate 1:3 n TFS steril,
pH 7,2.
Probele de snge se depun pe sitemul roller-roker pentru o omogenizare
complet. Dac acest sistem lipsete din laborator, atunci proba va fi rotit n plan
vertical, ntre palme, de 8 10 ori.
Se desigileaz plcile pentru culturi de esuturi i se noteaz numrul probei
pe un grup de 3 godeuri: primul godeu, notat cu N va reprezenta proba
nestimulat; al 2-lea godeu cu A, reprezentnd proba stimulat cu PPD-aviar
i al 3-lea godeu va fi notat cu B reprezentnd proba stimulat cu PPD-bovin.
Cu echipamentul Combitips-Dispenser sau, n lipsa acestuia, cu o pipet de 5 -
10 ml se repartizeaz cte 1,5 ml din fiecare prob de snge n 3 godeuri ale plcii
pentru culturi de esuturi; piepeta gradat va fi schimbat de fiecare dat cnd o
nou prob de snge trebuie repartizat. Pe plac cu 24 de godeuri pot fi testate 8
probe dac sunt folosite pentru stimulare dou anti-gene (PPD-A i PPD-B).
Dup repartizarea cantitilor de snge n godeuri, cu ajutorul unei pipete de
1,0 ml. sau cu pipeta semiautomat de 200 - 300l, se repartizeaz cte 0,1 ml
(100l/ godeu) din tuberculina aviar (PPD-A) diluat 1:3 , n rdurile de godeuri
nr.2 i 5 i aceleai cantiti de tuberculin bovin (PPD-B) n rndurile nr. 3 i 6, i
n rndurile 1 i 4 cte 0,1 ml. (100 l/godeu) din TFS 0,01M ,pH7,2 steril, flosind
materiale noi pentru repartizare (Fig.41).

Cte 1,5 ml. snge n 3 godeuri pentru

 din fiecare prob
Proba nr. 1N 1A 1B 2N 2A 2B
0,1 0,1 0,1 ml.
TFS A B
Stimulare i incubare la 37C atmosfer
umed, CO2,16- 24 de ore.

P1 P2
Fig.41 - Modul de repartizare a probelor de snge integral i stimularea culturilor cu PPD-uri pentru
producia de IFN.

Atunci cnd, pentru repartizarea reagenilor n plcile pentru culturi de

esuturi, se folosete micropipeta semiautomat cu 8 canale, se blocheaz canalele
2, 4, 6 i 8 i montarea vrfurilor se va face n poziiile 1, 3, 5 i 7 iar alimentarea se
va face din tvie ELISA .
153
Ali autori, recomand seringile de tuberculinare pentru repartizarea
tuberculinelor; acestea trebuie s fie bine splate, degresate i dezinfectate nainte
de folosire (Popescu t., date personale) .
A t e n i e ! Operaiunea de repartizare a probelor de snge n godeuri trebuie
s se fac astfel nct s se evite formarea de spum care mpiedic contactul
celulelor cu antigenul determinnd denaturarea rezultatelor. Cantitile de snge i
reagenii trebuie s fie exacte i de aceea se va lucra numai cu echipamente i
instrumentar verificat metrologic.
Fiecare plac se aeaz pe platforma agitatorului vibrator pentru omo-
genizarea perfect, timp de 15-30 de secunde. n lipsa agitatorului, coninutul poate
fi omogenizat rotind fiecare plcu pe masa de lucru, cu atenie pentru a nu se
deversa coninutul dintr-un godeu n altul. Se fixeaz capacul la fiecare plac i se
etaneizeaz cu band adeziv.
Incubarea limfocitelor din sngele integral, stimulate cu PPD. Plcile cu
culturile de snge stimulat , se incubeaz la 37 C, n atmosfer umed i 5% CO2,
pentru o perioad de 16-24 de ore, calculat de la finalizarea repartizrii reagenilor
pentru ultima prob.
Pentru aceasta sunt necesare urmtoarele materiale i echipamente:
- incint-incubator cu regim fix de temperatur (37 C), prevzut cu:
- sitem de asigurare a umiditii i a un ei concentraii permanente de 5% CO2
pe toat perioada incubrii.
n cazul n care laboratorul nu dispune de incint - incubator prevzut cu
siteme de umiditate i CO2 , plcile cu probele de snge vor fi introduse n casolete
cu hrtie de filtru umezit.
Recoltarea plasmei. Pentru recoltarea plasmei sunt necesare urmtoarele
materiale:
- suport gril (rak) cu 96 de godeuri............................. 1/30 de animale;
- tuburi micronix x 1,0 ml..................................................... 3/animal;
- micropipete semiautomate monocanal x 100 - 10001/l.......1/ efectiv;
- vrfuri (tipsuri) pentru micropipete x 100 1000 l.............3/animal;
- centrifug pentru plci de culturi de esuturi (opional).........1.
Dup expirarea perioadei de incubare, se recolteaz cu atenie aproximativ
500 l de plasm de suprafaa sedimentului, uriliznd micropipeta semiautomat
de 100-1000 l i cte un tips pentru foiecare godeu.
Coninutul se transfer n tuburile micronix de stocare notate i aezate n
suportul rak aa cum se indic n tabelul nr. 12
 Tabelul:12

Modul de aezare n suportul rak i stocarea probelor de plasm pentru testul EIAs-IFN

Rnd Numrul godeurilor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1N 1A 1B 2N 2A 2B 3N 3A 3B 4N 4A 4B
B 5N 5A 5B 6N 6A 6B 7N 7A 7B 8N 8A 8B
C 9N 9A 9B X X X 10N 10A 10B 11N 11A 11B
D 12N 12A 12B 13N 13A 13B 14N 14A 14B 15N 15A 15B
E 16N 16A 16B 17N 17A 17B 18N 18A 18B 19N 19A 19B
F 20N 20A 20B 21N 21A 21B 22N 22A 22B 23N 23A 23B
G 24N 24A 24B X X X 25N 25A 25B 26N 26A 26B
H 27N 27A 26B 28N 28A 28B 29N 29A 29B 30N 30A 30B
N: proba nestimulat; A proba stimulat PPD-A ; B: proba stimulat PPD-B ; X : godeuri destinate martorilor
control (C4, 5, 6 = control pozitiv i G 4, 5, 6 = control negativ).
Godeurile C4, C5, C6 i G4, G5, G6 neocupate sunt destinate martorilor
control : pzitiv i negativ. Acest mod de repartizare i stocare a probelor de plasm
154

este convenabil pentru transferul ulterior al probelor direct n plcile ELISA cu

ajutorul micropipetelor semiautomate multicanal.
N o t : Se recomand a se evita recoltarea de material celular n plasma de
testat, dei prezena unei cantiti infime de eritrocite n plasm nu afecteaz
rezultatele testului. De asemenea, testul nu este influenat dac plasma este uor
hemolizat. Dac n unele probe exist o cantitate mai mare de elemente celulare,
acestea vor fi centrifugate la un regim de 1200 1500 rpm timp de 10-15 min., apoi
supernatantul va fi transferat n alte tuburi notate identic cu cele iniiale.
Stocarea plasmei. Plasma poate fi stocat la 2-8 C pn la 7 zile dac nu se
testeaz n ziua recoltrii dar fiecare tub trebuie s fie bine nchis cu capac etan
pentru a se evita fenomenul de evaporare, uscarea sau contaminarea probelor.
Se va eticheta fiecare lot de probe cu toate informaiile relevante incluznd
date asupra operaiunilor de procesare iniiale, coninutul tuburilor, numrul
animalelor i detalii asupra statusului epidemiologic al populaiei de animale din
care provin probele.
Probele pot fi stocate pentru perioade mai lungi (30 60 de zile) n tuburi
nchise la -20C.
nainte de introducerea probelor n testare EIAs, acestea vor fi aduse la
temperatura camerei i vor fi bine omogenizate pe un agitator magnetic.

2. Analiza imunoenzimatic pentru detecia gamma-interferonului (EIAs

-IFN).

Principiul testului este evideniat n etapele de execuie ale acestuia:

- gamma-interferonul (IFN) prezent n plasma diluat reacioneaz cu
anticorpii anti IFN fixai (anticorpi de captur) pe un suport solid (plcua
ELISA). Materialul necuplat este ndeprtat prin splare dup o perioad de
incubare;
- conjugatul peroxidaza (HRP) legat de anticorpii anti-IFN (anticorpi de
detecie) reacioneaz cu IFN din proba de testat. Excesul de conjugat nelegat se
ndeprteaz prin splare dup o perioad de incubare;
- rata de conversie a substratului adugat n test, este proporional cu
cantitatea de IFN legat.
Reacia este ncheiat dup un anumit timp i intensitatea culorii este
exprimat spectrofotometric n densitate optic (DO).
 In Romnia, a fost omologat kitul EIAs - IFN BOVIGAM destinat pentru
diagnosticul tuberculozei la bovine, produs i comercializat de CSL-Ltd, Parkville,
Australia. n unele ri, kitul a fost utilizat pentru diagnosticul tuberculozei i
paratuberculozei la ovine, caprine precum i la rumegtoarele din mediul silvatic .
ncerrile de utilizare a kitului BOVIGAM- EIAs- IFN la alte specii dect
rumegtoarele nu au dat rezultate.

Componentele kitului BOVIGAM EIAs- IFN.

Kitul BOVIGAM-EIAs IFN, comercial se prezint sub dou forme, n

funcie de numrul probelor care se testeaz: pentru 180 de testri i pentru 900 de
testri, excluznd martorii de control de pe fiecare plac:
. Plcile EIAs. Fiecare kit, conine 10 x 12F -8 plci de microtitrare cu 96 de
godeuri cptuite cu fragmente F(ab- 2) de anticorpi monoclonali IFN - 9 murini
anti -IFN bovin .

155

Plcile sunt mpachetate individual n folie metalizat mpreun cu o substan

desicant.
. Martorul control pozitiv (2 fiole x 1,o ml). Este constituit din ser normal
bovin la care se adaug o cantitate calculat de gamma inteferon recombinant
(IFN-R) astfel nct media DO450 nm s fie mai mare dect 1,5, cu coeficient de
variaie de 10 %. Conine 0,01 % thiomersal i este liofilizat. Pentru utilizare se
reconstituie cu ap distilat deionizat;
. Martorul control negativ (2 fiole x 1,0 ml). Este constituit din ser normal
bovin cu adaos de conservant), 01 % w/v thiomersal i este liofilizat . Se reconstituie
cu ap distilat deionizat. Media DO 450 nm. trebuie s fie mai mic de 0,1 iar
coeficientul de variaie s fie dub 10 % ;
. Soluia diluant verde ( 1 flacon x 6o ml.), gata pentru utilizare, se folosete
pentru diluarea probelor de plasm n godeurile plcii ELISA . Conine 0,01 %
thiomersal.
. Soluia de splare (3 flacoane x 125 ml., concentrat x 20). Conine 0,01%
w/v thiomersal Pentru lucru se dilueaz n cantitile necesare cu ap distilat
deionizat.
. Conjugatul (1 flacon x 1,5 ml., concentrat x 100). Este constituit din
anticorpi monoclonali IFN-2 murini anti- IFN bovin, conjugai cu peroxidaz
(HRP), cu adaos de conservant thiomersal 0,01% w/v . Se reconstituie cu ap
distilat deionizat nainte de utilizare;
. Soluia diluant albastru (1 flacon x 15 ml., concentrat x 5). Conine 0,01 %
w/v thiomersal. Pentru lucru, soluia concentrat va trebui diluat cu ap distilat
de-ionizat n cantitile necesare. Se utilizeaz pentru diluarea conjugatului;
. Soluia tampon-substrat enzim (1 flacon x 125 ml., gata pentru utilizare).
Conine H2O2 i se folosete pentru diluarea soluiei cromogen;
. Soluia cromogen (1 flacon x 1,5 ml, concentrat x 100). Conine 3,3, 5,5
tetrametil benzidin dimetil sulfonid (TMB). Soluia cromogen se flosete pentru
diluarea tamponului substrat-enzim nainte de utilizare;
. Soluia de stopare enzim(1 flacon x 75 ml., gata pentru lucru). Conine
0,5M H2SO4. Opional, trusa kit BOVIGAM EIAs IFN poate fi completat de
productor, la cerere, cu tuberculine (PPD-A i PPD-B) n diluiile de lucru.

Etapele de lucru.
 a. Pregtirea reagenilor.

- plcile EIAs, vor fi meninute la temeratura laboratorului cel puin 30 de

minute nainte de desigilare i ndeprtarea foliei metalice;
- martorii control-p0zitiv i negativ, se reconstiuie flacoanele corespunztoare
cu 1,0 ml. ap distilat deionizat asigurnd solubizarea complet. Martorii control-
pozitiv i negativ reconstituii pot fi stocai la 2 - 8 C. pn la 3 luni i trebuie s fie
adui la temperatura camerei i bine omogenizai nainte de utilizare;
- soluia diluant verde (tampon diluant plasmatic), se aduce la tempe-ratura
camerei i nu se dilueaz;
- soluia diluant albastru (tampon diluant conjugat), se aduce la temperatura
laboratorului i se agit foarte bine. Se prepar prin adugarea unei pri din soluia
concentrat x5 la 4 pri ap distilat deionizat. Poate fi pstrat la 2 - 8 C. pn
la 3 luni;

156
- conjugatul (concentrat x 100) , se reconstituie cu 1,5 ml. ap distilat
deionizat asigurnd solubizarea complet. Omogenizarea trebuie fcut cu atenie
pentru a nu se forma spum. Depozitat la 2-8 C, poate fi utilizat timp de 3 luni de la
reconstituire. Prepararea conjugatului n diluia de lucru se face prin combinarea
conjugatului reconstituit cu diluant albastru n volumele corespunztoare. Reagentul
conjugat trebuie folosit n 5 minute de la preparare iar cantitile nefolosite vor fi
ndeprtate. Conjugatul concentrat nefolosit va fi reintrodus imediat la 2-8 C.
Volumele de conjugat i de diluant corespunztoare numrului de plci utilizate n
test sunt prezentate n tabelul nr.13;
- soluia tampon de splare, se prepar prin combinarea unei pri din soluia
concentrat x20 cu 19 pri ap distilat deionizat. Soluia de ludru va fi folosit
numa n ziua cnd a fost preparat. Cantitatea nefolosit care rmne la sfritul
lucrrii se ndeprteaz. Rezerva de tampon de splare concentrat se va pstra la 2-
8 C.
Tabelul: 13

Cantitile de conjugat, cromogen, tampon diluant conjugat i tampon substrat-enzim necesare

funcie de numrul de plci EIAs utilizate n test.

Nr.plci Vol. conjugat sau Vol. diluant

EIAs cromogen conc. (ml) albastru sau tampon
substrat enzim (ml)
1 0,12 12,0
2 0,24 24,0
3 0,36 36,0
4 0,48 48,0
5 0,60 60,0
6 0,72 72,0
7 0,84 84,0
8 0,96 96,0
9 1,08 108,0
10 1,2o 120,0

- soluia substrat enzim. Se aduce substratul enzim i soluia cromogen

concentrat x 100 la temperatura laboratorului i se omogenzeaz foarte bine ninte
de efectuarea diluiei. Soluia de substrat enzim se prepar numai nainte de
utilizare prin diluarea soluiei cromogen concentrate n tamponul substrat
enzimatic n cantitile necesare pentru plcile EIAs utilizate.(Tabelul: 13). Soluia
substrat-enzim de lucru trebuie s fie bine omogenizat i s fie incolor; dac
soluia prezint culoare albastr, nu va fi folosit n test. Soluia substrat-enzim va
fi folosit n 10 minute de la preparare.
 N o t : Dac este posibil, pentru prepararea soluiei substrat-enzim se vor
folosi recipieni din polipropilen, de unic folosin, sterilizate prin iradiere.
A nu se folosi recipieni i pipete din material plastic (polistiren). Orice
sticlrie folosit pentru substratul enzimatic s fie tratat cu 1N H2SO4 sau HCl,
apoi cltit de 3-4 ori cu ap distilat pentru a nu rmne nici un rest de acid pe
peretele vaselor.
Se va evita contactul pielii i mucoaselor cu soluia cromogen, deoarece
dimetil-sulfonidul se absoarbe imediat.
Soluia de stopare activitate enzimatic este un acid puternic; dac soluia
vine n contact cu pielea sau cu ochii, zonele respective vor fi splate din abunden
cu ap.
b. Tehnica realizrii testului EIAs-IFN.

Pentru realizarea corect a testului, trebuie s se respecte urmtoarele

condiii:
- s se verifice dac toate componentele kitului-EIAs- IFN se gsesc n termenele de

157

valabilitate stabilite de productor; dac acest condiie nu este respectat trusa

respectiv nu va fi folosit pentru analiza probelor i se va solicita unei instituii
abilitate investigaii pentru prelungirea termenului de valabilitate care va emite
un act oficial cu rezultatele testrii;
- toi reagenii, cu excepia conjugatului concentrat x 100, vor fi readui la
temperatura laboratorului nainte de folosire; temperatura n laborator trebuie s
fie constant pe toat durata desfurrii lucrrilor ( 22 +/- 5 C) i s fie ndeplinii
parametrii de mediu: umiditate, presiune atmosferic, cureni de aer, impuriti,
contaminani, etc.);
- c0njugatul concentrat x100 trebuie pstrat n permanen la 2-8 C i scos
de la frigider pentru scurt timp, necesar pentru diluare;
- reconstituirea complet a reagenilor este esenial pentru execuia corect a
testului;
- apa distilat trebuie s fie de nalt calitate deoarece peroxidaza(HRP) este
imediat inactivat de agenii poluani din ap;
- odat ncepute, lucrrile de testare trebuie contiuate fr ntrerupere pn la
finalizare;
- vor fi utilizate vrfuri (tipsuri) pentru fiecare prob n parte pentru a evita
contaminarea ncruciat;
- fiecare prob de plasm va fi analizat n duplicat, n godeuri adiacente (de
exemplu: rndurile A i B, ncepnd de la coloana nr.1 a plcii);
- martorii: control-pozitiv i negativ trebuie s fie folosii n test n triplicat n
godeuri seriate (de exeplu: rndul F pentru martorul control pozitiv i rndul E
pentru control-negativ) din coloanele 4, 5, 6. n acest mod pot fi testate 45
deprobe/plac n duplicat.
Materiale necesare. Sunt necesare urmtoarele materiale i echipamente:
- pipete cu volume variabile pn la 1,0 ml. cu tipsuri corespunztoare;
-micropipete semiautomate multicanal de 50 i 100 l cu tipsuri
corespunztoare;
- pipete gradate de 100,0, 1000,0 i 2000,o ml. ;
- echipament ELISA prevzut cu spltor automat pentru plci (exemplu:
Nunc-Imuno- Wash 8/12) i cititor electronic ELISA (cu filtru 450 nm).
Dup pregtirea reagenilor , materialelor, echipamentelor de lucru i
probelor de analizat, se procedeaz dup cu, urmeaz:
 . Se adaug cte 50,0 l/godeu din soluia diluant verde n numrul dorit de
godeuri ale plcii ELISA.
. Se repartiseaz 50,o l/godeu din probele de plasm de testat i din martorii
control pozitiv i negativ n godeurile corespunztoare care conin diluant verde.
Martorii de control pozitiv i negativ vor fi repartizai ultimii n plcu. Se
omogenizeaz bine timp de 1 minut pe un agitator pentru plci sau, n lipsa
acestuia, prin pipetare de 5 ori.
. Se acoper fiecare plac i se menin n repaus la temperatura laboratorului
timp de 60 +/- 5 minute.
. Se agit coninutul i se spal plcile de 6 ori la temperatura laboratorului.
Se umplu godeurile cu tampon de splare, cu atenie s nu se deverseze coninutul
dintr-un godeu n altul; se agit la agitatorul pentru plci sau prin pipetare de 5 ori.
Dup a 6-a splare , plcile se lovesc energic pe hrtie de filtru pentru ndeprtarea
restului de diluant i apoi se menin cu faa n jos pentru uscare perfect.

158
Dac laboratorul dispune de spltor automat , aparatul va fi alimentat cu
tamponul de splare i va fi programat pentru 6 splri; urmtoarele operaiuni de
ndeprtare a tamponului de sp-lare vor fi efectuate manual.
. Se repartizeaz cte 100,0 l conjugat/godeu preparat proaspt; conjugatul
va fi diluat n diluant albastru, conform indicaiilor din tabelul nr.13.
. Se acoper fiecare plcu i se incubeaz la temperatura laboratorului timp
de 60 +/- 5 minute.
. Dup terminarea incubrii, plcuele se spal de 6 0ri dup procedura
indicat mai sus.
. Din soluia de substrat-enzim, proaspt preparat, se repartizeaz cte
100,0 l/godeu ; se recomand ca substratul enzim s fie preparat dup splarea
plcuelor. Se acoper plcuele i se incubeaz pentru 30 de minute la temperatura
laboratorului. Incubarea ncepe dim momentul adugrii substratului n primul
godeu. De aceea, ncrcarea godeurilor cu substra-enzim trebuie s se execute ct
mai repede posibil.
. Cnd tipul de incubare s-a ncheiat, se adaug cte 50,0 l/godeu din soluia
de stopare, cu atenie pentru a nu se transfera cromogen dintr-un godeu n altul,
apoi se agit uor. Soluia de stopare trebuie adugat n aceeai ordine i cu
aceeai vitez cu care a fost adugat soluia substrat-enzim.
. Se citete adsorbia fiecrui godeu n termen de 20 de minute de la stoparea
reaciei, folosind un echipament cititor spectrofotometric cu filtru de 450 nm. Care
va fi pus n funciune cu cel puin 15 minute nainte de citirea probelor i reglat la
o (citire n gol). Valorile adsorbiei (DO450 nm.) vor fi utilizate pentru validarea
testului i pentru evaluarea i interpretarea rezulta-telor anlizei imunoenzimatice a
probelor.
Validarea testului EIAs-IFN. Rezultatele martorilor control-pozitiv i
control- negativ trebuie analizate naintea interpretrii probelor de testat.
Mai nti se determin media adsorbiei (DO450 nm.) a martorilor control-
pozitiv i control-negativ, care trebuie s se ncadreze n urmtoarele limite:
- media DO540 nm. pentru martorul contro-negativ : mai mic de 0,130 cu o
variaie ntre replicate mai mic de 0,040;
- media DO450 nm. pentru martorul control-pozitiv : mai mare de 0,700 i
rezultatele s nu devieze cu mai mult de 30% fa de medie.
 Dac nu se ntrunete nici una dintre criteriile de mai sus, testul nu este
validat i va trebui repetat. Dac toate acele codiii au fost ndeplinite testul este
validat i se va proceda la interpretarea rezultatelor, astfel:
- se calculeaz media adsorbiilor (DO 450 nm) pentru fiecare prob nestimulat
(N), stimulat cu tuberculin aviar (A) i respectiv cu tuberculin bovin (B);
- se compar valorile medii ale DO450 nm ale probei stimulate cu PPD-B (B) cu
cele ale martorului control-negativ. Toate probele stimulate cu PPD-B la cror
DO450 nm sunt mai crescute cu 0,05 dect media DO 450 nm a martorului control
negativ fac obiectul analizei de interpretare. Toate celelalte probe cu DO450nm
egal sau mai mic dect cea a martorului control negativ vor fi considerate
negative;
- pentru probele cu media DO450nm la PPD-B mai mare cu 0,05 dect cea a
martorului control negativ se compar media DO 450nm a probelor stimulate cu PPD-
B cu media DO450nm a probelor stimulate cu PPD-A i respectiv cu cea a probei
nestimulate (N):
- toate acele probe cu DO 450 nm. la PPD-B (B) mai mare dect DO 450 nm la
PPD-A i mai mare dect proba nestimulat (N), vor fi considerate pozitive i
animalele de la care au provenit aceste probe, potenial infectate cu M. bovis;

159
- dac media DO 450 nm al probei stimulate cu PPD-A (A) este mai mare dect
media DO450 nm a aceleiai probe stimulate cu PPD-B (B), proba respectiv va fi
considerat pozitiv pentru M. avium i animalul respectiv, reactant aviar.
Productorul kitului atrage atenia c este posibil ca la un procent redus de
probe valoarea adsorbiei probei nestimulate (N) s fie egal 0,050 sau mai mare
dect cea a martorului control negativ . Acele animale de la care au provenit
probele respective pot fi considerate infectate cu M. bovis dac diferena ntre DO
450 nm pentru proba stimulat cu PPD-B (B) i DO 450 nm a aceleiai probe
nestimulate (N) este mai mare de 0,049 i DO 45o nm (B) este mai mare dect DO 450
nm.(A), adic:

DO 450 nm. B DO 450 nm. N > 0,049 i DO 450 nm B > DO450 nm A.

De asemenea, este posibil ca un numr redus de probe s prezinte valoarea

DO 450 nm (N) mai mare dect valoarea DO 450 nm (B) i/sau DO 45o nm (A). Toate
aceste probe vor fi considerate neconcludente i n buletinul de analiz se va
recomanda o retestare a animalelor respective dup o nou prelevare de snge.
Pentru o mai bun nelegere a modului de interpretare a rezultatelor testului
EIAs IFN i clasrii animalelor n funcie de rezultatele testului, n tabelul nr.
14 sunt prezentate cteva exemple:

Tabelul: 14

Model de interpretare a rezultatelor testului EIAs-IFN i clasarea animalelor n funcie

de rezultatele testului

Nr. prob DO450 DO450 DO450 Diferena Rezutat

Nestimulat stimulat stimulat DO450
(N) PPD- A PPD-B

1 0,47 0,125 0,180 B-N>0,133 POZITiV M.bovis

B>A
2 0,050 0,324 0,500 B-N >0,450 POZITIV M. bovis
B>A
3 0,040 0,200 0,125 B-N > NEGATIV M. bovis. R-
0,085 av.
B<A
 4 0,160 0,147 0,122 B < N i NECONCLUDENT.
B< A Retestarea animalului
Martori DO450 nm DO450nm DO450 DO450 Rezultat
Godeu nr.1 Godeu nr.2 nm nm
Godeu nr.
3
NEGATIV 0,043 0,055 0,049 0,049 TEST VALIDAT
POZITIV 1,513 1,495 1,584 1,519 TEST VALIDAT

n decursul timpului au fost iniiate i aplicate mai multe modaliti de

interpretare a rezultatelor testului EIAs-IFN, cum ar fi: interpretarea
semicantitativ care se bazeaz pe ajustarea sensitivitii testului prin alternarea
cut-off (de exemplu, diferena ntre adsorbana relativ probei nestimulate i
acea prob stimulat cu PPD-B i PPD-A) utilizat pentru analiza datelor. Utilizarea
testului EIAs-IFN n paralel cu intradermo-tuberculinarea a demonstrat c
detecteaz mai multe animale infectate i cu avantaje notabile atunci cnd se
urmrete creterea sensitivitii testului n programele de eradicare a
tuberculozei.

160

De exemplu, n Noua Zeeland se folosete curent, pentru bovinele cu rezultat

pozitiv la intradermotuber-culinare , urmtoarea schem de interpretare a testului
EIAs IFN:
. Proba pozitiv , se consider cnd:
DO450 (B) - DO450 (N) 100 i: DO450 (B) DO450 (A) 100
. Proba negativ, se consider cnd :
DO450 (B) - DO450(N)< 100 i:DO450 (B) - DO450 (A) < 100
Specialitii din IDSA rcomand interpretarea rezultatelor testului EIAs-IFN
n funcie de statusul efectivelor sub raportul infeciei tuberculoase, astfel:
. Pentru efective libere de tuberculoz :
- Proba pozitiv i animalul de la care a provenit proba , potenial infectat
cu M, bovis, dac:
DO450 (B) DO450 (N) 0,100 i DO 450 (B) - DO450 (A) >0,100;
- Proba negativ i animalul de la care a provenit proba , neinfectat cu M.
bovis, dac:
DO450 (B) DO 450 (N) < 0,100, sau:
DO450 (B) DO 450 (A) < 0,100
Acest criteriu confer testului o specificitate crescut dar o sensitivitate mai
redus .
. Pentru efective cu tuberculoz n care se aplic un program intensiv de
eradicare:
- Proba pozitiv i animalul de la care a provenit proba , infectat cu M.
bovis, cnd:

DO 450 (B) D) 450 (N) > 0,049 i

DO 450 (B) > DO 450 (A).

- Proba negativ i animalul de la care a provenit proba neinfectat cu M.

bovis
DO 450 (B) DO450 (N) < 0,049.
Precauii: Tratamentul recent cu medicamente imunosupresoare, cum ar fi:
cortizon, hidrocortizon, dexametazon, starea de gestaie avansat (ultimele 2 luni)
sau parturiia pot depresa rspunsurile n IFN fa de antigenele micobacteriene.
Exista date n literatura de specialitate care demonstreaz c animalele tratate cu
dexametazon n urm cu o sptmn sau cele care au ftat n ultimele 4
sptmni naintea recoltrii probelor de snge pentru EIAs-IFN au dat rezultate
fals negative i de aceea se recomand testarea acelor animale dup o perioad
suficient pentru refacerea echilibrului sitemului imun mediat celular.
Ca orice test biologic, EIAs-IFN poate s nregistreze rezultate fals negative
sau fals pozitive n condiii locale de lucru. De aceea, rezultatele testului trebuie
interpretate n contextul datelor clinice, anatomopatologice, epidemiologice,
antecedentele efectivului sub raportul tuberculozei i rezultatele anterioare
intradermotuberculinice.
Rezultatele false pot fi nregistrate datorit:
- execuiei incorecte a tehnicilor de lucru;
- utilizrii altui anticoagulant dect heparina pentru recoltarea probelor de
snge;
- nerespectrii termenului limit de la recoltare i pn la procesarea probelor
n laborator;
- nerespectrii concentraiilor i dozelor de antigene prevzute n procedur;

161

- utilizrii de reageni cu termene de valabilitate expirate, cantiti inexacte

sau reageni contaminai;
- nivelului excesiv de IFN datorit unor stri fiziologice responsabile de
creterea temporar IFN circulant sau a unor boli al sistemului imun mediat
celular. imunosupresiei naturale sau provocate ca urmare a unor tratamente cu
medicaie imunosupresoare i altor modificri operate n tehnicile de lucru
elaborate de productorul kitului.

Testul T-SPOT-TB.

T-SPOT TB, este o metod de diagnostic in vitroutilizat pentru detecia

celule-lor T- efectoare care rspund la stimuli antigenici specifici Mycobacterium
tuberculosis Numrarea celulelor T-efectoare activate i eva-luarea rezultatelor se
realizeaz printr-o metod imunospot enzimatic (ELI-SPOT).n prezent, este
recunoscut faptul c celulele T-efectoare CD4 i CD8, separate din sngele
periferic al bolnavilor de tuberculoz sau din sngele celor cu infecie latent,
produc citokina gamma-interferon (IFN) atunci cnd sunt stimulate cu antigene
M. tuberculosis (46,100,113). Cercetrile n domeniu au demonstrat c proteinele
ESAT-6 i CFP-10 sunt prezente pe secvena genei RD1 din structura genomului
micobacteriiilor aparinnd complexului Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis, M.bovis, M. africanum, M. microtti) i unele micobacterii, ca: M.
kamsasii, M. szulgai, M. marinum dar absente din structura genomului M. bovis
BCG i numeroase micobacterii din mediul nconjurtor (45, 91, 240, 242) .

Principiul metodei.

Plasma
Colectare snge Transport la Separarea Celule albe Recoltare i splarea celulelor
Heparinizat laborator celulelor Ag. separare mononucleare (celulele albe)
Mono Hematii
nucleare

Placa de microtitrare cu Repartizarea

96 de godeuri. Sunt Celulelor, Ag.A, Numrarea celulelor mononucleare i
necesare 4 godeuri Ag.B i stabilirea concentraiei standard
Incubare peste pentru fiecare prob. (Nc i Pc) controalelorpentru test
 noapte la 37 C
umiditate i
5 % CO2

Nc Ag.A Ag.B Pc
ELISPOT
Ad. conjugat Nc
Incubare, sp-
lare, ad. sub- Ag. A NUMRARE SPOTURI
strat enzim LOR, INTERPRETAREA
incubare, REZULTATELOR
splare ,uscare Ag.B

Pc

Fig.42 - Reprezentarea schematic a principiului testului T-SPOT TB (ELISPOT)

Limfocitele T-efectoare separate din sngele integral periferic re-acioneaz n

cultur fa de antigenele specifice Mycobacterium tuberculosis (antigen A: ESAT-
6 i antigen B: CFP-10), se sensibilizeaz (dac anterior au venit n contact cu
bacilul tuberculos) secretnd la suprafaa membranei celulare gamma-interferonul
(IFN-)

162
care este capturat de anticorpii monoclonali de oarece anti gamma interferon
uman i apoi evideniat printr-un procedeu enzimatic imunospot (ELISPOT)
(Fig.39).
Gradul de reacie al limfocitelor T la stimulul antigenic specific se apreciaz
prin numrul de spoturi formate n urma cuplrii IFN- de pe suprafaa limfocitelor
cu anticorpii monoclonali de detecie anti IFN-, conjugai cu fosfataz alcalin n
prezena substratului enzim. Numrarea imunospoturilor se poate face cu
ajutorul microscopului optic sau cu un echipament computerizat (Fig.42).
Domenii de aplicare.
Testul T-SPOT TB poate fi utilizat la:
- pacienii cu tuberculoz activ sau la cei cu infecie tuberculoas latent
(TBL);
- rezideni i angajai din colectiviti cu risc crescut;
- pacieni imunodepresai, inclusiv cei cu HIV;
- pacieni cu insuficien renal cronic;
- emigrani;
- militari.

Limite de aplicabilitate.

Testul T-SPOT-TB, folosete anticorpii monoclonali de oarece specifici

pentru captura gamma-interferonului (IFN) uman i de aceea testul este destinat
numai pentru diagnosticul infeciei tuberculoase la om cu urmtoarele limite de
aplicabilitate:
- componentele kitului T-SPOT-TB, trebuie pstrate la temperatura de 2 - 8
C; kitul nu trebuie s fie utilizat dup expirarea termenului de valabilitate ncris pe
ambalaj.
- kitul T-SPOT-TB este un produs detinat numai pentru o sigur utilizare;
componentele lui nu trebuie amestecate cu cele din alte loturi;
- lucrrile de testare cu kitul T-SPOT-TB trebuie efectuate numai de opreatori
cu nalt calificare i numai dup ce instruciunile de utilizare au fost citite i
nelese n totalitate;
 - sngele trebuie s fie recoltat i transportat la laborator n interval de 8 ore
de la recoltare; timpul poate fi prelungit pn la 32 de ore dac se folosete
reagentul T-cell Xtend (Oxford Immunotec);
- probele de snge trebuie pstrate i transportate la laborator la temperatura
camerei (18 - 25 C). Limtele de temperatur pentru stocarea i transportului
sngelui cresc de la 10 - 25 C dac se folosete reagentul T-cell Xtend;
- probele de snge nu trebuie refrigerate i nici congelate;
- pentru lucru trebuie s fie asigurate condiii asepsie pe toat durata desfu-
rrii lucrrilor pentru a se evita contaminarea godeurilor, suspensiilor celulare i
mediul de cultur i compromiterea rezultatelor testului;
- n timpul lucrului, trebuie evitate variaiile de pipetare i splare i
temperaturile de incubare care pot influena semnificativ rezultatele testului;
odat ncepute, lucrrile de testare nu trebuie ntrerupte;
- analiza T-SPOT-TB trebuie utilizat i interpretat numai n contextul unui
tablou clinic complet;
- ca orice test biologic, T-SPOT-TB poate oferi un procent redus de rezultate
false; unele rezultate negative nu exclud posibilitatea ca pacientul s fi fost expus
sau s fie infectat cu M. tuberculosis aa cum nici unele rezultate pozitive nu
dovedesc specificitate total.
163
Cerine pentru protecia personalului operator.

Avnd n vedere c testul T-SPOT-TB folosete pentru analiz sngele de

origine uman i diverse substane chimice periculoase pentru sntatea omului,
trebuie s fie aplicate cu rigurozitate msuri de pstrare, manipulare,
procesare i distrugerea resturilor i rezidiilor acestor materiale, n conformitate cu
prevederile codului naional de biosecuritate i reglementrile legale n domeniu.
Conjugatul conine cationul R43 care poate produce sensibilizri n contact cu
pielea. Cationii R52/53 sunt duntori pentru organisme din mediul acvatic i pot
produce fenomene adverse de lung durat n mediul acvatic.
Compuii S24 i S37 pot afecta pielea i de aceea opeatorul este obligat s
poarte mnui de protecie n timpul lucrului.
Soluia substrat BCIP/NBTplus. conine R36/37/38 care pot produce iritaii ale
ochilor ale aparatului respirator i la nivelul pielii. S23 poate fi inhalat n urma
vaporizrii produsului. Pentru protecia mpotriva compuilor S24/25, S36/37/38
se va evita contactul cu pielea i ochii, operatorul fiind obligat s poarte mnui i
ochelari de protecie n timpul lucrului.

Procedee tenhnice.

Dup cum s-a menionat mai sus, testul T-SPOT-TB (ELISPOT) folosete
pentru analiza probelor de snge, prelevate de la indivizi cu tuberculoz activ, cu
infecie latent sau suspeci de infecie, un kit imuno-enzimatic T-SPOT-TB
produs i comercializat de Oxford Immunotec,U.K.

Materialele i echipamentele necesare pentru lucru, au fost grupate astfel:

- materiale incluse n trusa kit T-SPOT-TB;

- materiale i echipamente neincluse n trusa kit;
Materialele incluse n trusa kit sunt descrise in detaliu n instruciunile de
utilizare a kitului care nsoesc fiecare lot. Instruciunile prezint fiecare produs
inclus n kit, modul de preparare, soluii i concetraii de lucru i condiii de
stocare.
 Materiale i echipamente neincluse n trusa kit.

- hot microbiologic cl.II:

- tuburi vacutainer BD-CPT cu heparina litiat i Ficoll (tuburi Leucosep);
pentru a prelungi timpul afectat transportului probelor pot fi folosite tuburi cu T-
cell Xtend;
- centrifug pentru procesarea prbelor de snge;
- echipament pentru numrarea celulelor mononucleare din sngele periferic:
manual sau un analizor hematologic automat;
- incubator cu regim la 37 C +/- 1 cu 5% CO2;
- spltor de plci de microtitrare sau un sistem manual de splare;
- pipete de diferite volume, micropipete semiautomate cu tipsuri, dispenser
pentru repartizarea reagenilor;
- PBS (Tampon Fosfat Salin), ap distilat sau ap deionizat;
- cititor automat pentru plci de microtitrare mijloace alternative de citire,
cum ar fi: microscop optic sau lup;
- mediu de cultur pentru celulele mononucleare din snge periferic, cum ar
fi: GIBCO AIM-V sau RPMI1640.
164
Etapele de lucru.

Analiza T-SPOT-TB se desfoar n 3 etape distincte: recoltarea, transportul

i procesarea probelor de snge, prepararea reagenilor , analiza imunoenzimatic
(ELI-SPOT).
a. Recoltarea transportul i procesarea probelor de snge. Institute of
Genomic Medicine , UMDNJ, USA, recomand urmtoarele cantiti de snge
integral necesare pentru analiz, n raport cu vrsta pacienilor:
- copii n vrst de pn la 2 ani = 2,0 ml.;
- copii in vrst de 2 9 ani = 4,0 ml.;
- copii n vrst de peste 10 ani, tineri i aduli = 6,0 -7,0 ml.
Analiza T-SPOT-TB necesit cantitatea de 2,5 x 10 celule mononucleare
viabile din sngele periferic per godeu.
Separarea celulelor mononucleare de restul componentelor sngelui.
Probele de snge recoltat n tuburi vacuteinere CPT cu heparina litiat (hep-li) sau
tuburi Leucosep, se supun procesrii astfel;
- probele de snge se dilueaz cu un volum egal de mediu RPMI-1640 ( o
parte snge i o parte RPMI); se dilueaz apoi cu atenie stratul de snge n
Ficoll-Paque Plus (2-3 pri snge la 1 parte Ficoll);
- centrifugare: un regim de 1000x g. la temperatura de 18-25 C pentru o
perioad de 20 de minute.
Dac centrifuga funcionez n regim rotaii pe minut (rpm) acestea vor fi
transformate n for relativ centrifug (FRC) sau g. prin msurarea razei rotorului
i utilizaera tabelului de conversie rpm n g.
- prin utilizarea tuburilor de recoltare Leucosep ( Greiner Bio-One) se obine o
economie de timp de separare apropriat de gradienii Ficoll.
- celulele mononucleare separate, de depozitul de hematii i alte componente
ale sngelui, apar ca un inel alb-lactescent cu grosime vaiabil de la individ la
individ; celulele se recolteaz aspetic prin aspiraie cu mare atenie pentru a nu
extrage rezidii i alte componente ale sngelui. Operaiunea trebuie s fie
continuat pn cnd s-a recoltat o cantitate suficient de celule din fiecare prob;
sunt necesare 2-3 splri folosind mediu de cultur sau PBS steril pentru a fi
indeprtate orice urm de corpuri strine sau alte componente ale sngelui.
 - dup splare se face numrarea celulelor pentru a stabili concetraia fix de
2 x 10 celule/godeu. Numrarea celulelor poate fi realizat manual folosind
camera de numrat i microscopul optic sau cu analizorul hematologic conform
procedurilor hematologice cunoscute. In fucie de rezultatul numrrii, celulele se
aduc la concemtraia optim cu mediu de cultur.

b. Analiza ELISPOT.

Plcile de microtitrare se scot de la stocare, se ndeprteaz folia-ambalaj i se

menin la temperatura camerei mpreun cu restul reagenilor, cu excepia conjuga-
tului pentru echilibrare:
- se administreaz cte 50 l mediu de cultur celular n fiecare godeu
control- negativ;
- se administreaz cte 50 l. fitohemaglutinin (PHA) n fiecare godeu
control-pozitiv;
- se adaug cte 50 l. antigen A (ESAT-6) M tuberculosis n fiecare godeu
din rndul A destinat probei analizate cu antigen A;

165
- se adaug cte 50 l. antigen B (CFP-10) M. tuberculosis n fiecare godeu din
rndul B destinat probei analizate cu antigen B;
- n toate godeurile se adaug cte 100 l. mediu de cultur care conine 2 x
10 celule mononucleare (n godeurile control-negativ, control-pozitiv i
godeurile test A i B);
- incubare la 37 C cu CO2 i umiditate pentru 16-24 de ore;
- splarea plcilor de 4 0ri cu PBS (200 l/godeu.);
- se administreaz n toate godeurile plcii cte 50 l. din sol.de lucru
conjugat (pentru a obine conjugat sol. de lucru 1:200 la 40 l. conjugat
concentrat se adaug 8 ml. PBS). Atenie! Soluia conjugat de lucru va fi
preparat imediat nainte de utilizare;
- incubare la 2-8 C timp de 60 de minute;
- splarea plcilor de 4 ori n PBS;
- se adaug n toate godeurile cte 50 l. BCIP/NBT soluie substrat;
- incubare la temperatura camerei timp de 7 minute;
- ndeprtarea foliei protectoare i splarea plcilor cu ap distilat sau
deionizat att n interiorul godeurilor ct i la exterior, fundul acestora;
- meninerea plcilor la ntuneric i la temperatura de 37 C, ntr-un loc bine
ventilat pentru uscare perfect;
- numrarea spoturilor cu microscopul optic, cu o lup sau cu cititorul de plci
(Fig.43).
Cititorul de plci pentru T-SPOT-TB. Pentru numrarea spoturilor produse
de celulele T-efectoare, se utilizeaz un sistem ELISPOT de citire automat a
plcilor,
nlturnd riscul interpretrilor eronate ale rezultatelor care, n mod inevitabil,
apar n cazul numrrii spoturilor cu microscopul optic. Cititorul automat de plci
este util att utilizatorilor cu specializare nalt ct i nceptorilor. El reduce
substanial timpul necesar pentru analiza unei plci.
 Fig. 43 - Cititoarele de plci tip CTL i AID utilizate pentru testul T-SPOT-TB (ELISPOT)

Pentru T-SPOT-TB (ELISPOT) sunt recomandate cititoarele de plci tip AID.

Cititoarele tip CTL i AID (Fig.43) dispun de nalt rezoluie, camer digital
cuplat la un computer care, bazat pe analiza imaginii, distinge numrul de
spoturi din godeuri prin msurarea mrimii, intensitatea i culoarea acestora.
Imaginile din fiecare godeu sunt preluate i nregistrate de camera digital cu
ajutorul unui sistem monitorizat de deplasare a plcilor sub camera de luat
imagini.
Firma care produce kitul T-SPOT-TB disponibilizeaz software pentru
cititorul AID care analizeaz rezultatele i afieaz diagnosticul pentru fiecare prob
analizat.
166
Acest software este specific pentru utilizare n T-SPOT-TB garantnd sigurana i
performanele n validarea rezultatelor.
Placa de microtitrare pregtit pentru citire se plaseaz pe suportul mobil al
cititorului i se pornete aparatul. Toate cele 96 de godeuri sunt vizualizate digital
pe monitorul calculatorului i orice spot din fiecare godeu este numrat i
nregistrat automat.
Imaginea fiecrui godeu (Fig.44) este salvat electronic astfel nct ea poate
fi analizat ulterior, ori de cte ori este necesar i constituie prob justificativ n
eventualitatea unor contestaii ale rezultatelor.
Totodat, aceste nregistrri electronice permit supervizarea labora-toarelor
pentru analiza auditului i pentru reanalizarea ulterioar a rezultatelor n cadrul
controlului calitii.

Fig.44 - Imaginea n detaliu a fiecrui godeu de pe placa de microtitrare i nregistrarea rezultatelor

Controalele negative i pozitive sunt verificate automat de software pentru

calitatea lucrrilor i validarea testului. Nu sunt necesare curbe standard sau alte
controale.
Imediat dup numrarea spoturilor, rezultatul este printat pentru fiecare prob
n parte n detaliu pentru numrul de spoturi din godeurile aparinnd controalelor
negative i pozitive, precum i godeurile pentru probele supuse analizei separat cu
antigen A i antigen B.
 Fiecare rezultat imprimat are deasemenea domeniu de nregistrare a
pacienilor cu imunodeficien (ID) precum i trasabilitatea analizei efectuate: data,
operator, numr de plac i localizarea godeurilor. De asemenea, sistemul afieaz
imaginea fiecrui grup de 4 godeuri care corespund unei probe.

c. Rezultatele testului T-SPOT-TB (ELISPOT) i interpretare.

Rezultatele testului T-SPOT-TB sunt validate cnd:

- controlul negativ are ntre 0-5 spoturi;
- o prob se consider reactiv dac:
- numrul de spoturi din godeurile aparinnd probei stimulate cu antigen M.
tuberculosis (Ai/B) minus numrul de spoturi din godeul control negativ
corespunztor probei este 6;
- dac numrul de spoturi din godeul control negativ este 6 atunci proba se
consider reactiv cnd:
- numrul de spoturi din grupele de godeuri cu antigen A i/sau B este 2 ori
dect numrul de spoturi din godeul control negativ corespunztor probei
respective
Rezultatul pozitiv n testul T-SPOT-TB demonstreaz c proba analizat
conine celule T-reactive fa de M. tuberculosis i pacientul de la care a provenit
proba este potenial infectat cu M. tuberculosis.

167
Rezultatul negativ presupune absena celulelor T-reactive din prob i
individul posibil s nu fi venit n contact sau s se fi infectat anterior cu M.
tuberculosis

Cerine minimale pentru calitatea lucrrilor.

Productorul kitului T-SPOT-TB a elaborat o serie de instruciuni tehnice

pentru recoltarea probelor de snge i procesarea acestora, medii pentru cultura
celulelor mononucleare i numrarea spoturilor.
Plcile de microtitrare sunt livrate protejate de o folie din plastic care nu va fi
ndeprtat de pe suprafaa plcii pn cnd nu s-a terminat incubarea cu substrat
BCIP/NTB -plus.
Nu se admite atingerea membranei pe care sunt fixai anticorpii anti IFN cu
vrful pipetelor sau prin splarea automat. nepturile mebranei cu pipeta sau cu
tipsurile spltorului produc artefacte generatoare de confuzii n interpretarea
rezultatelor.
Este obligatoriu ca pentru fiecare prob s se realizeze cte un control negativ
i pozitiv.

d. Performanele testului T-SOPT-TB.

Analiza performanelor testului T-SPOT-TB (ELISPOT) a constiutit

preocuparea multor specialiti, materializat n peste 80 de studii de specialitate
asupra reproductibilitii , sensitivitii i specificitii, ca principali indicatori care
exprim valoarea de diagnostic a testului.
- Reproductibilitatea, apreciat ca fiind acceptabil i n acelai timp
superioar testelor clasice (IDR, Q-FERON, proliferarea limfocitar -TISL), pe baza
datelor obinute de la cel puin 3 laboratoare de specialitate care au analizat acelai
numr de probe de control i ocazionale, utiliznd loturi diferite de reageni. Astfel,
numrul mediu de spoturi s-a ncadrat ntre 12,05-71,17, deviaia standard fiind
1,47-8,47 iar coeficientul valoric (CV%): 10,6-12,9.
- Sensitivitatea i specificitatea. Cercetrile asupra sensitivitii i
specificitii T-SPOT-TB (ELISPOT) au evideniat valori net suoperioare fa de
intradermoreacie (IDR) i QUANTIFERON dar variabile n funcie de statusul
epidemiologic regional al tuberculozei, stadiul infeciei tuberculoase i capacitatea
sistemului imunitar individual de a rspunde la stimuli antigenici micobacterieni.
Din datele Instituluilui Oxford Immunotec rezult o senitivitate a testului de
aproximativ 95% -97% care se menine chiar i la subiecii imunosupresai (174),
inclusiv la cei inectai cu HIV (66) i o specificitate de 100%.
Comparat cu alte teste de diagnostic, utilizate in practica medical, care
msoar activitatea limfocitelor la stimuli antigenici micobacterieni, T-SPOT-TB
(ELI-SPOT) detecteaz un procent crescut de subieci potenial infectai i poate s
diferenieze tuberculoza activ de infecia laent (174). De exemplu, s-a constatat c
sensititivitatea testului T-SPOT-TB (ELISPOT) nu a fost influienat, n grupul
subiecilor imunosupresai i chiar un rezultat nedeterminat ar putea sugera starea
de anergie la unii pacieni. n acelai timp, D h e d a K., e t a l., 2005 (66 ) i
J a l b M.S., 2003 (100), analiznd performanele testului T-SPOT-TB (ELISPOT)
n depistarea tuberculozei la bolnavi cu infecie HIV constat c siensitivitatea
testului nu este influenat de numrul celulelor TCD4.
Pe de alt parte, s-a dovedit c sensitivitatea i specificitatea testului T-
SPOT-TB nu sunt semnificativ afectate n cazul analizrii celulelor mononucleare

168

din exudatul pleural recoltat de la pacienii cu tuberculoz pleural, sugernd

posibilitatea utilizrii testului n practica medical clinic de rutin pentru
diagnosticul tuberculozei pleurale (130).
Alte cercetri, confirm superioritatea testului T-SPOT-TB (ELISPOT) , fa
de intradermoreacie (IDR) la subiecii vaccinai cu M. bovis BCG. Rezultatele
studiilor n aceast direcie demonstreaz capacitatea testului T-SPOT-TB
(ELISPOT) de a diferenia rspunsul imun mediat celular (IMC) indus de M. bovis
BCG de infecia tuberculoas natural provocat de tulpini micobacteriene
patogene din complexul M. tuberculosis (155,133) .
H i n k s T., e t a l., 2008 (96), susin utilitatea testului T-SPOT-TB
(ELISPOT) n diagnosticul meningitei tuberculoase prin analiza celulelor T-
specifice antigenic din lichidul cefalo-rahidian. Autorii se bazeaz pe detecia
masiv a celulelor T-secretoare a IFN, specifice pentru M.tuberculosis la 9 bolnavi
din 10 examinai n timp ce aceste celule nu au fost prezente la nici unul dintre
pacienii suferind de me-ningite cu alte etiologii .
Performanele testului T-SPOT-TB au fost demonstrate n studiul infectiei
tuberculoase latente la copii din grupele de varst o 11 ani, cu risc maxim de
expunere la infecia tuberculoas. Datele publicate arat c exist diferene notabile
privind procentul de rezultate neconcludente n testele QuantiFERON, IDR
comparate cu rezultatele testului T-SPOT-TB (ELI-SPOT).
Atunci cnd copiii au fost investigai prin testele: QUANTIFERON-G ,
QUANTIFERON-G-IT i T-SPOT-TB s-au nregistrat 12,8 % rezultate neconclu-
dente la QUANTIFERON G , 4,8 % la QFT-IT i numai 2,4 % n T-SPOT-TB,
aceste date fiind strns corelate cu grupele de vrst unde procentul de rezultate
validate pentru T-SPOT-TB a fost semnificativ superior celor din testele QFT la
grupa de vrst 3-5 ani., sugernd utilitatea acestei metode pentru depistarea
infeciei tuberculoase la copiii cu varsta redus (21). Cteva lucrri de specialitate
evideniaz utilitatea testului T-SPOT-TB (ELI-SPOT) n diagnosticul tuberculozei
pleurale prin cuantificarea celulelor mononucleare din exudatul pleural, active fa
de antigene aparinnd complexului Mycobacterium tuberculosis.
Experimentele realizate pe pacieni suferind de pleurit tuberculoas arat c
analiza prin T-SPOT-TB (ELISPOT) a celulelor mononucleare din sngele periferic
a fost pozitiv n 90% dintre subieci fa de 95% cnd au fost analizate celulele
mononucleare din exudatul pleural. Cu toate c nu exist diferene semnificative
ntre cele dou variante privind sensitivitatea, testul T-SPOT-TB (ELISPOT) pe
celule separate din exudatul pleural este recomandat a fi aplicat n practica
medical de rutin, n diagnosticul de acuratee al tuberculozei pleurale (130, 190).
Rezultate interesante s-au nregistrat n cercetri privind utilitatea T-SPOT-
TB pentru diagnosticul infeciei tuberculoase la pacieni imunocompromii ,
suferind de boli ale sistemului imun celular, cum ar fi: leucemie limfocitar acut i
cronic , leucemie mieloid acut i cronic diverse mieloame i diverse lifoame
care nu se ncadreaz n sindromul Hodkin.
Analizele comparative ntre intradermoreacie (IDR) i T-SPOT-TB arat c
17,4 % dintre subiecii investigai au rspuns pozitiv la IDR i 44,2 % pozitivi n
testul T-SPOT-TB, cu un coeficient de concordan de 67,8 % (k= 0,34, p<0,0001),
sugernd c, dei sistemul imun mediat celuar (IMC) este compromis , T-SPOT-TB
se dovedete superior IDR, depistnd un procent mai mare de pacieni potenial
infectai cu M. tuberculosis (174) .
Exist relativ puine date asupra eficienei testelor bazate pe rspunsul
celulelor T, specific pentru antigene aparinnd M.tuberculosis la pacienii infectai
cu virusul imunodeficienei umane (HIV).
169

Considernd importana capital a depistrii n faz incipient a infeciei

tuberculoase la subiecii HIV- pozitivi, C l a r k S A., e t a l , 2007 (49) au iniiat
un studiu n care s-a msurat rspunsul imun mediat celular (IMC) specific pentru
antigene tuberculoase la pacienii infectai cu HIV-1, n diferite stadii evolutive, n
special la cei cu boala avansat, la care numrul celulelor TCD4 ajunge sub 300/l.
Autorii studiului au utilizat un test enzimatic imunospot (ELISPOT) pentru detecia
i msurarea IFN secretat de celulele T efectoare i performaele testului au fost
apreciate pe baza sensitivitii i specificitii acestuia.
Din datele publicate rezult c sensitivitatea testului ELISPOT n cazurile cu
posibil tuberculoz activ a fost 90,3 % i specificitate 100 % , cu variaii
nesemnificative ntre grupele de pacieni cu mai puin de 300 celule TCD4/l i cele
cu 200 TCD4 /l cu excepia unui numr limitat de subieci cu mai puin de 100
TCD4/l., la care media sensitivitii testului a fost de 87,5 %
Aceste rezultate sugereaz c testul ELISPOT-TB poate detecta rspunsurile
imune specifice fa de antigene tuberculoase la pacienii infetai HIV-1 avnd
numr redus de celule TCD4 . Asocierea ntre testul ELISPOT-TB i numrul de
celule TCD4 permite s se fac distincie ntre tuberculoza activ i infecia latent.
Discordana ntre testul ELISPOT TB i IDR a fost 11,0 % dintre subiecii
infectai cu HIV-1, similare cu cele comunicate anterior (164).
S-a dovedit c sensitivitatea testului ELISPOT-TB a fost mai redus la copiii
HIV- pozitivi dect cea publicat n alte lucrri de specialitate (46) i de aceea s-au
formulat rezerve pentru utilizarea ELISPOT n diagnosticul tuberculozei la copiii
HIV-pozitivi (60).
 Cteva ncercri de a investiga capacitatea de diagnostic a unor antigene
(ESAT-6 i CFP-10) specifice complexului M. tuberculosis s-au fcut pe animale
infectate experimental i natural cu M. bovis (121, 240, 239).
Totodat, V o r d e r m a e i e r H .M. e t a l, 2000 (238) au evaluat testul
ELISPOT sub aspectul capacitii de diferenere ntre bovinele vaccinate BCC i cele
infectate experimental cu M.bovis patogen. Experimentele au evideniat aspecte
interesante ale dinamicii rspunsurilor imune mediate celular (IMC) la animalele
vaccinate i ulterior infectate cu M. bovis. Animalele vaccinate BCG nu au
evideniat nici un rspuns pozitiv la testul ELISPOT cu antigen ESAT-6, dar
rspnsul a fost maxim dup infectarea acestora cu tulpina patogen M. bovis. La
animalele nevaccinate, ELISPOT a fost intens pozitiv dup 3 sptmni de la
infecie i s-a meninut pentru o perioad de peste 18 sptmni, n timp ce la
animalele vaccinate rspunsurile s-au meninut pe toat perioada experimentului
la nivelul martorilor control negativ.
Cu toate c T-SPOT-TB (ELISPOT) prezint certe avantaje fa de celelalte
teste pentru controlul imunitii mediate celular n tuberculoz, productorii de
kituri nu dovedesc interes pentru nlocuirea anticorpilor monoclonali de captur i
de detecie IFN uman din kitul clasic T-SPOT-TB cu anticorpi monoclonali anti-
IFN bovin, util pentru diagnosticul tuberculozei active i latente la bovine, pentru
diferenierea ntre infecia natural cu M. bovis i diverse alte micobacterii atipice
din mediul nconjurtor, care prezint nrudiri antigenice cu M. bovis, pentru
diferenierea ntre bovinele vaccinate BCG i cele infectate natural precum i
stabilirea diagnosticului de tuberculoz la animalele imunosupresate, aa cum sunt
cele infectate cu virusul leucozei enzootice bovine (BLV) sau alte forme de leucemii
i cele tratate cu medicamente imunosupresoare de tipul dexametazonei.
170
Erori posibile n cursul etapelor de lucru.

Ca n oricare analiz biologic i n testul T-SPOT-TB (ELISPOT) pot s apar erori

thenice sau generate de calitatea reagenilor i materialelor folosite n decursul
lucrrilor. n tabelul de mai jos sunt prezentate erorile, care pot sa apar n fiecare
etap a testului T-SPOT-TB i recomandri de remediere a acestora (Tabelul nr. 15)
Tabelul: 15
Erori posibile n testul T-SPOT-TB, cauze i remedoerea acestora
 Nr. redus de PBMCs - Recoltare insuficient a stratului de PBMC dup - Recoltarea cu atenie a stratului de
viabile separare; PBMCs , fr a fi ecoltat lasm ori
- Donator cu sistem imun compromis; Ficoll; -
- Meninerea prelungit a probei pn la prepararea Recoltarea cantitii suficiente de snge;
PBMCs - executarea testului n flux continuu.

Detritus execesiv i -Celulele pot fi afectate n timpul splrilor; -Resuspendarea cu mult atenie a
celule moarte -S-a depi timpul prevzut pentru separarea celulelor celulelor;
observate la numrare - Separarea celuleor 7ntr-un timp ct mai
scurt de la recoltare

Spot slab, redus n - BCIP/NBT nu a fost readus la temperature camerei Toi reagenii cu excepia conjugatului s
intesitate n control- nainte de utilizare. fie echilibrai la temperatura camerei
negativ

Nr. Excesiv de spoturi - Lotul de ser folosit n mediul de cultur slab calitativ; - Schimbarea lotului de ser i testarea
mici n M. control- - Contaminarea culturilor n timpul incubrii; calitii lui;
negativ - asigurarea coindiiilor de asepsie n
timpul realizrii i incubrii culturii;

Culoarea foarte - Concentraie excesiv de celule; - - Renumrarea elulelor i asigurarea unei

intens dezvoltat Variaii ale temperaturii n laborator; conc.de 2x10 celule/godeu; -
dup adugarea - Prelungirea timpului de contact al BCIP/NBT Asigurarea temperaturii optime i
BCIP/NBT constante pe toat durata lucrului;
- Respectarea instructiunilor de lucru.

Forme de semilun - Defeciuni ale spltprului de plci: - Reglarea dispenserului i nlimea

observate la citire - Fisuri ale membranei provocate de tipsurile pipetelor; varfurilor de apiraie al spltorului;
- Vrfurile pipetelor nu trebuie sa ating
membrana godeurilor;

Lipsa spoturilor n M. - Numr insuficient de cellule n godeuri; - Reverificare numarului de cellule,

control-pozitiv - Realizare incorrect a testului, celulele nu ecunosc asigurarea numarului fix de cellule
antigenele. viabile; - verificarea condiiilor de stocare
a reagenilor; -
Refacerea testului.

Aglomerare excesiv - Intreruperea testului sau adugarea incorect a - S se reciteasc instructiunile de

de spoturi; variaie reagenilor preparare a reagenilor i procedurile
notabil a densitii incluse n kit.
spoturilor n plac

Secionari, deteriorri - Fluctuaii de temperature n timpul lucrului sau n - recitirea instruciunilor inserate n kit
i franjurri ale incubator. asupra temperaturilor n timpul lucrului.
membranei

Culoare purpurie sau - Splarea insufficient a plcilor; - Recitirea instructiunilor kitului;

godeuri colorate - Incubarea cu conjugat fr controlul temperaturii ; - Asigurarea temperaturii de 2 - 8 C ;
intens - Prezena detergenilor n PBS Utilizare numai PBS pur, fr detergeni
- Splarea insuficient a plcilor;
-- Prelungirea timpului de procesare a probei i de
Pete nespecifice - Citirea atent a instr.kitului;
preparea a PBMCs;
intens colorate n Lucrrile sa fie fcute n flux continuu
- Stocarea incorrect a probei
godeuri respectnd timpii n fiecare etap;
- Procesarea probei s fie fcut ct mai
repede posibil.
4.1.4. METODE SEROLOGICE PENTRU DETECTIA ANTICORPILOR N
DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI.

Studii recente, care au folosit preparate antigenice crude din Mycobacterium

tuberculosis, au demonstrat prezena anticorpilor serici reactivi la paienii cu
tuberculoz.
171
Cu toate c unele dintre metode evideniaz reacii ncruciate la indivizi
sntoi ca urmare a relaiilor antigenice ntre M. tuberculosis i micobacterii
atipice din mediul nconjurtor, sau post vaccinare cu M. bovis BCG (118), n cursul
ultimelor dou decenii au fost testate un numr important de antigene purificate,
cum sunt: proteinele de 38 kDa (Phos), 30/31 kDa, lipoproteinele de 85 i 19 kDa ,
14 kDa i 16 kDa (ACR) precum i lipoarabinomamaul (LAM) (249,59).
Antigenul 38 kDa a dovedit o sensitivitate i specificitate nalte (249). Este
interesant de notat c anticorpii anti-38 kDa par a fi restricionai n tuberculoza
avansat (59), n opinia autorilor, reprezentnd prinicipala cauz a transmierii
tuberculozei i sugernd c cercetarea anticorpilor prin metode bazate pe antigen
38 kDa nu corespunde scopului urmrit.
De asemenea, exist referine asupra antigenelor 16 kDa i 88 kDa fa de care
anticorpii sunt prezeni n faza incipient a bolii (118).
Unii autori suin c ar exista asociere ntre tuberculoz i nivelul anticorpilor
specifici antigen-leucocite umane (HLA) i aceast asociere ar putea fi responsabil
de rspunsurile imune heterogene fa de antigene tuberculoase n populaiile
umane . Totui, W e l d i n g e t a l ,. 2005 (246), ntr-un studiu cu 35 de antigene
prezente n M. tuberculosis dar absente din M. bovis-BCG, au identificat cteva a
fraciuni antigenice suplimentare care, utilizate n teste-le serologice, au
mbuntit substanial sensitivitatea acestora la populaiile Africane.
S e r v a r a j e t a l . , 1998 (203 ), au observat c, n timp ce dinamica
rspunsului imun nregistreaz o curb ascendent, exist unele gene care
supreseaz rspunsul spontan i rspunsul limfocitelor indus de antigene
micobacteriene la pacienii cu RD2 pozitiv i tuberculoz activ.
Deasemenea, W e l d i n g e t a l ., 2005 ,(246) cercetnd 35 de antigene
proteice prezente n M. tuberculosis dar absente n M. bovis-BCG, au identificat
cteva antigene suplimentare utilizate pentru mbuntirea sensitivitii testelor
de diagnostic al tuberculozei la populaiile Africane. Rezultatele autorilor nu au fost
confirmate ulterior de alte studii. Cercetrile s-au focalizat n special pe obinerea
n cantiti comerciale a unor antigene micobacteriene recombinante cu o mai mare
stabilitate, sensitivitate i specificitate acceptabile. Astfel s-au dezvoltat, n decursul
ultimelor decenii, sisteme de exprimare i fuzionare a proteinelor care au fost
ncorporate n lanul DNA recombinant standard.
Un aspect interesant,sesizat de S a m a n i c h M.K, et al, 2000 (192) , reine
atenia supra masei moleculare, profilului i conformaiei chimice a unui antigen
pentru studiul raspunsului imunologic i mbuntirea perfor-manelor testelor n
diagnosticul tuberculozei. Dup autorii citai, unele antigene obinute din filtratul
de cultur M.tuberculosis sunt recunoscute de anticorpii din serurile pacienilor cu
tuberculoz cavitar i noncavitar, demonstrnd c profilul antigenelor este
corelat cu evoluia bolii. Totododat, antigenul 88 kDa este un candidat promitor
pentru serodiagnosticul tuberculozei la indivizii infectai cu HIV. Att extinderea
bolii ct i ncrctura bacterian joac un rol important n profilul antigenului
recunoscut de anticorpi.
S i n g h K. K., et al., 2005 (207), utiliznd antigenele 88kDa i MPT51 obin
rezultate pozitive la aproximativ 90 % dintre pacienii cu tuberculoz infectai cu
HIV.
Numeroase studii ntreprinse pe animale au scos n eviden alte elemente
care pot s intervin n evaluarea calitativ a antigenelor folosite pentru diagnostic
i care pot s influeneze substanial rspunsul imun umoral n cursul infeciei
tuberculoase.

172

ntr-un studiu privind rspunsurile imune la bovine , consecutiv infectrii cu

tulpini de Mycobacterium bovis cu virulen diferit, W e d l o c N.D. e t a l.,
1999, (243) costat c nivelul anticorpilor serici este n strns legtur cu virulena
tulpinilor M. bovis; animalele infectate cu M. bovis virulent au evideniat nivele
ridicate de anticorpi comparativcu animalele infectate cu tulpini slab viruente, la
care nivelul anticorpilor s-a situat uor deasupra valorilor martorului negativ.
Nivelul crescut al anticorpilor s-au corelat cu exprimarea clinic a bolii (90) .
Totodat, B u d d l e B M., e t a l., 1994, (34) arat c gestaia avansat i
doza de Mycobacterium bovis au efecte notabile asupra rspunsului imun i
asupra distribuiei leziunilor la bovinele infectate experimental.
De asemnea, s-a demonstrat c terapia cu antiinflamatoare, cum sunt:
cortizolul, hidrocortizonul , dexametazona, glucocorticoizi precum i unele
disfuncii ale axei hipotalamo-adrenal-pituitar conduc la dereglri importante ale
rspunsurilor imune: umoral i mediat celular (IMC), prin schim-barea expresiei
citokinelor Tip 1 (IFN i TNF ) n citokine Tip 2 i inactivarea efectelor
antimicobacteriene ale macrofagelor (15,93).
Studiile ntreprinse pe animale infectate cu M. bovis i M.tuberculosis i
supuse tratamentului susinut cu dexametazon demonstreaz influena acesteia
asupra rspunsurilor mediate celular (IMC) i umorale (14).
De asemenea, n literatura de specialitate se menioneaz aciunea puternic cu
infeciei tuberculoase. G a b a l M A., e t a l. 1998 (76) , constat titruri i nivele
semnificativ sczute la iepurii infectai cu M. bovis i tratai susinut cu aflatoxin.
n aceeai manier, s-a constatat c IgA secretorie a sczut dramatic la
copiii din populaia Gambian , hrnii cu alimente coninnd doze cresute de
aflatoxin, ca urmare aciunii blocante a aflatoxinei asupra sistemului imun
umoral(234).
Influena nefast a aflatoxinei asupra sistemului imun umoral a fost dovedit
la pacienii cu HIV, alimentai cu doze crescute de aflatoxin, la care procentul de
celule B era redus semnificativ comparativ cu grupa de control. (102)
Aadar, multitudinea factorilor enumerai, asociai cu posibile erori i
nonconformiti n respectarea procedurilor, ar putea s explice scepticismul
specialitilor din unele laboratoare de diagnostic serologic al micobacteri-ozelor
asupra performanelor metodelor avizate de OMS i OIE.
n Romnia, metodele serologice pentru detecia anticorpilor antituberculoi
se aplic frecvent n medicina uman, specialitii veterinari nu recurg la cercetarea
anticorpilor prin metode serologice considernd pro-centul inacceptabil de reacii
ncruciate nregistrate i specificitatea redus a acestor teste. Cu toate acestea,
eforturile susinute de purificare a antigenelor micobacteriene, utilizarea
antigenelor recombinante i a anticorpilor monoclonali constituie argumente
serioase ca: testele imunoenzimatice (ELISA), testele serologice rapide s fie
generalizate i n domeniul veterinar pentru diagnosticul tuberculozei n faza
avansat, la animalele domestice i slbatice din mediul silvatic sau din captivitate.
De asemenea, testele serologice sunt indispensabile pentru cercetarea i evaluarea
capacitii imunogene a vac-cinurilor antituberculoase.

Testul imunoenzimatic (ELISA) de detecie a anticorpilor.

Rspunsul imun umoral la antigene micobacteriene poate fi evaluat utiliznd,

n special testele imunoenzimatice (ELISA) dup metodologii i protocoale care, cu
certitudine , difer de la un laborator la altul .

173

Dup modalitile de detecie a anticorpilor sau a antigenelor micobacteriene.

Sunt descrise dou modele de teste ELISA:
- testul ELISA direct utilizat cel mai frecvent pentru detecia antigenelor ;
 - testul ELISA indirect cu utilitate larg pentru detecia anticorpilor specifici
pentru antigene micobacteriene. Odat cu dezvoltarea produciei anticorpilor
monoclonali s-a extins tot mai mult testul ELISA indirect n sandwich (DAS-ELISA)
cu valoare de diagnostic superioar testelor clasice.
- Testul ELISA direct, presupune fixarea pe fundul fiecrui godeu al plcii
ELISA a antigenelor micobaceriene neidentificate, urmat de punerea n contact cu
conjugat anticorpi specifici anti micobacterieni cuplai cu o enzim (fosfataz
alacalin , peroxidaz, etc.).
Prezena complexului stabil antigen-anticorp-enzim este evideniat cu
ajutorul substratului enzim (p-Nitrofenil-Fosfat, pentru fosfataz alcalin sau
TMB pentru peroxidaz). Reacia de culoare care indic prezena complexului Ag-
Ac-Enzim poate fi interpretat vizual sau cu ajutorul readerului pentru msurarea
densitii optice (DO).
Dup clasele de imunoglobuline care pot fi detectate, exist kituri ELISA
pentru detecia anticorpilor IgG, IgM i IgA. n general, procedeele de lucru sunt
similare, diferenele se regsesc n componentele kiturilor; fiecare kit conine
conjugat specific anti IgG, IgM sau anti IgA ori antigene micobacteriene specifice
fiecrei clase de imunoglobuline. De exemplu, n unele teste ELISA a fost utilizat
antigenul M. tuberculosis A60 pentru detecia IgG sau antigenul Kp90 pentru
detecia IgA (48, 111). De aceea, mai jos este prezentat procedeul de lucru n testul
ELISA pentru detecia anticorpilor IgM anti M. tuberculosis conform
recomandrilor productorului de kit.

Testul ELISA pentru detecia IgG, IgM i IgA.

Kitul ELISA pentru detecia IgG, IgM, IgA anti M. tuberculosis produs de
Gen Way Biotech,. Inc, USA este destinat analizei imunoenzimatice (ELISA )
pentru detecia anticorpilor IgG, IgM i IgA anti M.tuberculosis din probele de ser
sau plasm prelevate de la oameni n scopul stabilirii diagnos-ticului presumtiv al
infeciei acute, recente sau tuberculozei active.
Spre deosebire de intradermoreacie (IDR) , testul ELISA pentru anticorpi
IgG, IgM i IgA poate s detecteze pacienii cu infecie mixt, HIV/TB i nu prezint
reactivitate ncruciat cu rspunsul imun provocat de vaccinul BCG.
Principiul testului. Sistemul Gen Way Bio ELISA este destinat s
detecteze IgG, IgM i IgA anti M. tuberculosis din serul sau plasma uman.
Godeurile strpisurilor din material plastic, cptuite cu o combinaie de proteine
recombinante i fracionate din M. tuberculosis, servesc pentru captura i detecia
imuno-enzimatic a anticorpilor specifici anti M. tuberculosis prezeni n serul sau
plasma indivizilor suferind de tuberculoz. Fenomenul imunologic se produce n 3
etape principale:
a). Faza solid de captur: incubarea serului de testat (diluat
corespunztor) n microgodeurile cptuite cu antigenul M. tuberculosis.
Anticorpii din proba de testat se vor lega la antigenul fixat n godeuri formnd un
complex solid antigen-anticorpi rezistent la splrile ulterioare care ndeprteaz
numai anticorpii nelegai i alte componenete din proba de testat;
b). Faza de detecie. IgG, IgM i IgA (lanul - specific) de capr anti IgG, IgM
i respectiv IgA de om conjugate cu peroxidaz(HRP), se leag la anticorpii din pro-
ba de cercetat formnd un complex antigen - anticorp - conjugat rezistent la
splrile
174

efectuate pentru ndeprtarea execesului de conjugat i a altor rezidii nespecifice;

 c). Faza de evideniere i de determinare a concentraiei de anticorpi
specifici (IgG, IgM, IgA) anti M. tuberculosis. Complexul antigen-anticorp-
conjugat este pus n eviden cu ajutorul substratului enzim TMB, a crui
hidroliz produce modificarea culorii. Reacia este stopat dup o perioad de timp
(stabilit de productorul kitului) i intensitatea culorii, care depinde de
concentraia de anticorpi prezenti n reacie, care este msurat spectrofoto-metric
i exprimat n densitate optic (DO).
Componentele kitului Way-Bio-ELISA-TB
Fiecare set ELISA conine urmtoarele componente n cantitile nece-sare
pentru numrul de teste indicat pe ambalaj:
- Stripsuri de microtitrare: 12 strpisuri cu cte 8 godeuri fiecare , cptuite cu
antigen M. tuberculosis complex, pregtite pentru utilizare. Stripsurile sunt sigilate
n pungi metalizate mpreun cu material desicant;
- Conjugatul: 1 flacon 15,0 ml. cu IgG, IgM, IgA de capr anti IgG, IgM sau
IgA de om conjugate cu peroxidaza (HRP). Produsul este gata preparat pentru
utilizare;
- Diluent pentru probe: 1 flacon cu 30,0 ml. IgA, IgG au IgM diluent pentru
prob gata pregtit pentru utilizare;
- Substrat-peroxidaz, Tetrametil benzidin (TMB) : 1 flacon cu 15,0 ml TMB
gata preparat pentru utilizare;
- Soluie stop : 1 flacon cu 10,0 ml. 0,5 M H2SO4 , gata preparat pentru utili-
zare;
- Soluie tampon de splare: 1 flacon cu 25,0 ml. soluie tampon de splare
concentrat 20 %. Pentru lucru se diluaez taponul de splare conc. 20 x n 475,0
ml. ap bidistilat sau ap deionizat. Tamponul de splare poate fi stocat la
temperatura camerei, separat de restul componentelor kitului. Soluia tampon de
splare de lucru va fi pstrat la 2-8 C.
- Ser negativ (control negativ): o fiol cu 0,2 ml., ser normal uman lipsit de
anticorpi (IgG, IgM,IgA) specifici pentru M. tuberculosis;
- Ser pozitiv (control pozitiv) : o fiol cu 0,2 ml. ser uman cu un coninut
determinat de anticorpi (IgA, IgG, IgM) anti M. tuberculosis.
Materiale necesare neincluse n kit.
- cititor ELISA pentru microplci cu capacitate de citire a absorbiiei la 450 nm
cu referin de 630 nm.;
- pipete pentru repartizare reageni de 10,0 200,0 l.;
- pipete multicanal pentru repartizare reageni n volume variabile de la 50,0
300,0 l.
- cutii din material plastic pentru alimentare pipete multicanal cu reageni;
- recipieni pentru splare sau sistem automat pentru splare microplci;
- ap bidistilat deionizat;
- pipete pentru serologie;
- tipsuri (vrfuri) pentru pipete;
- ceas de laborator pentru urmrirea timpilor operatori;
- Recipient cu desinfectanti pentru materialele utilizate;
- plci pentru diluia probelor.
Msuri de protecie a personalului din laborator. Pentru protecia
personalului din laborator i pentru nlturarea nonconformitilor tehnice n
timpul lucrului, este necesar a se respecta urmtoarele msuri obilgatorii:

175
- toi reagenii din componena kitului trebuie s fie manipulai cu maxim
atenie, n conformitate cu normele de protecia muncii n laboratoarele de analize;
n cazul n care ochii au venit n contact cu unul dintre reagenii caustici din
componena kitului, splai imediat ochii cu cantiti masive de ap i solicitai
medicul specialist. Pentru prevenirea unor astfel de accidente trebuie s manipulai
substanele respective purtnd halat, mnui i ochelari de prtecie ;
- godeurile stripsurilor nu conin microorganisme viabile. Cu toate acestea,
stripsurile trebuie s fie considerate ca materiale ncadrate n grupa Biohazard i
manipulate n conformitate cu instruciunile;
- Serurile umane sunt potenial materiale infeioase, ncadrate n grupa 2-a
Biohazard. Donatorii acestor produse trebuie s fie negativi pentru HIV1-Ag.,
Ag.HBs i pentru anticorpi anti HCV i HIV prin metode omlogate.
Avnd n vedere c nici o metod nu confer siguran total asupra absenei
agenilor infecioi enumerai, trebuie respectate Normele Centrelor pentru
Controlul Bolilor, Institutele Naionale de Sntate i
Biosiguran n Laboratoarele de Microbiologie i Biomedicale i Standardele
pentru ageni patogeni ai sngelui;
- respectarea timpului de lucru specificat n instruciuni pentru fiecare etap
de lucru i temperaturile ambientale i de incubare sunt esneiale pentru acurateea
testului. nainte de nceperea lucrului, toi reagenii trebuie s fie lsai la
temperatura camerei pentru echilibrare . Reagenii nefolosii trebuie s fie
reintrodui la refrigerator imediat dup folosire;
- splrile incorecte pot fi cauza rezultatelor fals pozitive sau fals negative;
naintea repartizrii conjugatului sau substratului, operatorul trebuie s se asigure
c n godeuri nu a rmas nici un rest de soluie de splare; ntre incubaii, godeurile
nu trebuie lsate s se usuce;
- tamponul de splare este iritant pentru ochi, mucoase i cile respiratorii;
- soluia stop, este toxic producnd arsuri n urma contactului cu pielea i
mucoasele i leziuni ale clor respiratorii dac a fost inhalat. n caz de accident
apelai imediat la serviciul medical de specialitate;
- substratul peroxidaz TMB este foarte caustic, producnd iritaii ale
ochilor, pielii i cilor respiratorii;
- tergei fundul exterior al godeurilor pentru a nu rmne nici o urm de
lichid,impuriti sau amprente digitale care pot altera densitatea optic (DO);
- nu folosii reageni din alte loturi de kit sau ali productori;
- culoarea soluiei substrat enzim (TMB) trebuie s fie cea indicat n
instruciunile care nsoesc kitul. Orice modificare a culorii substratului nainte ca
acesta s fie utilizat n reacie presupune alterarea soluiei care va fi eliminat;
- diluiile greite ale reagenilor i falsificarea acestora produc reezultate
eronate;
- nu folosii pipetele aspirnd cu gura reagenii i materialele de cercetat;
- evitai contaminarea microbian a reagenilor; pot s apar rezultate
eronate;
- materialele din sticl trebuie s fie riguros splate i cltite pentru a
ndeprta orice urm de detergeni;
- evitai mprtierea sau formarea de aerosoli n timpul manipulrii
reagenilor;
- nu expunei reagenii la lumin puternic n timpul lucrului, n timpul
incubrii i n perioada stocrii;
- stripsurile i suporii trebuie echilibrate la temperatura camerei nainte de
nceperea lucrului;

176
 - soluia de splare folosit trebuie depozitat ntr-un rezervor cu substan
dezinfectant;
- soluiile puternic acide trebuie s fie neutralizate;
- nu punei n contact conjugatele cu containere sau instrumentar care
anterior au coninut sau au fost tratate cu azid de sodiu ca prezervant; rezidiul de
azid de sodiu poate distruge activitatea enzimatic a conjugatului;
- nu expunei nici un reagent n contact cu soluii decolorante sau puternic
odorizante; de exemplu, cantiti infime sau numai urme de hiplocorit de sodiu pot
distruge activitatea bilogic a majoritii reagenilor din kit.

Condiii de stocare a componenetelor kitului.

- toate componentele kitului, cu excepia tamponului de splare conc. 20 x

care trebuie pstrat la temperatura camerei) vor fi stocate la 2- 8 C.;
- strpisurile cptuite se pstreaz la 2-8 C; strpisurile nefolosite vor fi
reintroduse n plicurile metalizate mpreun cu substana desicant i stocate la 2 -
8C;
- conjugatul, serurile de control (pozitiv i negativ), substratul peroxidaz,
diluantul pentru probe, soluia de stopare i tamponul de splare diluat (1x), vor fi
stocate la 2-8 C. Nu pstrai conjugatul la congelator.
Recoltarea transportul i procesarea probelor de seruri. Recoltarea probelor
trebuie s se fac n conformitate cu normele de protecia personalului din
laboratoare mpotriva bolilo infecioase transmisibile pe calea sngelui .
Derivatele sngelui trebuie s fie considerate potenial infecioase indiferent
de rezultatele testelor pentru detecia unor ageni infecioi.
Pentru testare trebuie s fie admise numai serurile sigilate i refrigerate
corespunztor, obinute prin puncie venoas. Se va evita testarea serurilor
hemolizate, lipemice sau contaminate bacterian.
Dac serurile nu sunt analizate n cel mult 8 ore de la recoltare, acestea pot fi
pstrate la 2-8 C cel mult 48 de ore.
Dac testarea probelor nu are loc n intervalul de timp menionat, acestea pot
fi stocate la -20 C. Evitai congelarea i decongelarea repetat a serurilor
ntruct asemenea operaiuni conduc inevitabil la pierderea activitii anticorpilor
prezeni i n final la rezultate eronate.

Procedeul de lucru.

Scoatei componentele kitului de la stoc i lsai-le pentru echilibrarea

temperaturii cu cea ambiental.
Determinai numrul de godeuri necesar; rezervai un numr de godeuri pe
fiecare plac pentru determinari de control: un godeu pentru test blank, un godeu
pentru control negativ i un godeu pentru control pozitiv . Stripsurile
neutilizate vor fi introduse imediat n ambalaj cu desicant, sigilate i depuse la 2-8
C.
Preparai diluia 1:21 (exemplu: 10 l. ser + 200 l. diluent penru probe), ser
control negativ, control pozitiv i din fiecare ser de cercetat.
Adugai 100 l diluent pentru prob n godeul A1 ca un reagent blank.
n restul godeurilor adugai cte 100 l n fiecare godeu din serurile de control
i serurile de cercetat diluate, dup schema din fig.nr.45:
177

A. IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA IgG IgM IgA
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A s1 s1 s1 bl bl bl 14 14 14 22 22 22
B s2 s2 s2 s9 s9 s9 15 15 15 23 23 23
C s3 s3 s3 10 10 10 16 16 16 24 24 24
D s4 s4 s4 cn cn cn 17 17 17 25 25 25
E s5 s5 s5 cp cp cp 18 18 18 26 26 26
F s6 s6 s7 11 11 11 19 19 19 27 27 27
G s7 s7 S7 12 12 12 20 20 20 28 28 28
H s8 s8 s8 13 13 13 21 21 21 29 29 29
S1-29 = Seruile de cercetat; bl- godeu blank (godeu alb fr reageni), cn= control negativ;cp = control
pozitiv.S1 dil.1:21; 100 l /godeu

IgG+HRP IgM+HRP IgA+HRP

S1 IgG S1IgM S1 IgA

Col.1 col.2 col.3

Fig.45 - Distribuia serurilor de cercetat i a controalelor ( blank, control negativ,

control pozitiv ) n rak i respectiv n godeurile plcii ELISA (A, B)

Diluarea i aranjarea serurilor de cercetat i controalelor ntr-un suport-rak n

microtuburi (micronix), numerotate ca n schema de mai sus, uureaz substanial
opraia de repartizare a probelor n godeurile plcii ELISA cu ajutorul pipetei semi-
automate multicanal. n suportul rak pot fi aezate probele de seruri i controale
diluate n unicat n cantiti suficiente pentru ca fiecare prob s fie transferat n
cte 3 godeuri de pe placa ELISA(exemplu:
dac pentru proba s1 sunt necesare 3 godeuri n care se va repartiza cte 100
l./godeu, atunci n micronixul corespunztor se va efectua diluia cu 20 l ser +
400 l diluent). Micronixul destinat martorului blank va fi ncrcat cu o
cantitate de diluent pentru probe suficient pentru 3 godeuri de pe plac
nainte de repartizarea n godeurile plcii ELISA, probele i martorii trebuie
s fie bine omogenizate.
Cu ajutorul pipetei multicanal (8 canale) vei lua cantitatea de 100 l din
coloana nr. 1 de micronixuri de pe suportul-rak i o vei transfera n coloana nr.1 de
godeuri de pe plac; ncrcai din nou pipeta cu aceeai cantitate din micronixurile
din coloana nr.1 i transferai n godeurile coloanei nr.2 de pe plac; procedai n
acelai fel cu godeurile coloanei nr.3 de pe plac. Procedura se repet asemntor
pentru fiecare prob, inclusiv pentru martori.
Atenie! Schimbai vrfurile pipetei de fiecare dat cnd o nou prob
urmea-z a fi repartizat pe plac.
Dup ce ai finalizat repartizarea probelor i a martorilor n godeurile plcii,
acoperii placa i introducei la incubator la 20 - 23 C. pentru 60 +/- 5 min. n acest
timp pregatii soluia tampon de splare 1x ; din soluia tampon
de splare concentrat 20 x vei lua cantitatea de 25 ml i vei amesteca cu 475 ml
ap bidistilat sau deionizat. Dac va fi necesar o cantitate mai mare de soluie
tampon de splare vei calcula astfel nct s rezulte diluia 1x; exemplu: pentru 1,0
l. tapon de splare 1x sunt necesari 50 ml. tapon conc. 20x + 950 ml. ap
bidistilat).
Plcile vor fi supuse unui ciclu de 5 splri succesive manuale sau cu ajtorul
spltorului de placi automat n tamponul de splare.

178

Splarea manual .
 Rsturnai energic coninutul godeurilor i scuturai placa cu faa n jos
pentru ca orice urm de reagent s fie ndeprtat.
Umplei fiecare godeu cu tampon de splare, asigurndu-v c nu s-a format
nici o bul de aer, apoi ndeprtai tamponul dup procedeul de mai sus i repetai
umplerea godeurilor cu tampon de splare i evacuarea acestuia din godeuri de 4
0ri. Dup ultima splare rsturnai placa i scuturai energic pentru a ndeprta
ntreaga cantitate de soluie tampon de splare apoi lovii faa plcii pe o suprafa
absorbant (hrtie de filtru) pentru a fi ndeprtat orice urm de reagent.
Splarea automat, folosete un apart automat pentru splarea plcilor
ELISA care poate fi programat pentru numrul de cicluri de splare (5 splri) i
cantitatea de tampon de splare necesar pentru un godeu (de exemplu: 300
l/godeu pentru o splare).
Adugai cte 100 l. conjugat IgG, IgM i IgA n godeurile din coloanele
notate pentru fiecare clas de imunglobulin n parte. Astfel, conjugatul IgG va fi
repartizat n coloanele nr. 1, 4, 7 i 10; conjugatul IgM, n coloanele nr. 2, 5, 8 i 11
i conjugatul IgA, n coloanele nr. 3, 6, 9 i 12. repartizarea conjugatului se va face
n aceeai ordine i cu aceeai vitez ca n cazul probelor de testat. Incubai placa la
20-23 C pentru 60+/- 5 min.
Dup terminarea incubrii, supunei placa unui ciclu de 5 splri sucesive
pentru ndeprtarea conjugatului n exces i altor rezidii.
Adugai n toate godeurile plcii (inclusiv n godeurile blank) cte 100 l
TMB/godeu n aceeai ordine i cu aceeai vitez ca pentru ceilali reageni.
Atenie! Substratul enzim (TMB) este fotosensibil i de aceea, imediat dup
repartizare n godeuri acoperii placa cu capac impermeabil pentru
lumin.Incubai placa la 20-23C la ntuneric pentru 14-16 min., dup care reacia
va fi stopat adugnd n fiecare godeu cte 50 l. soluie stop n aceeai ordine
cum a fost administrat TMB. Dup adugarea soluiei de stopare agitai uor placa
pentru omogenizare perfect. Culoarea n godeuri vireaz din albastru n galben n
fucie de gradul de reactivitate. Placa trebuie citit n 30 de minute dup adugarea
soluiei stop la un cititor automat pentru plci ELISA (Fig.46) reglat la 450nm cu
referin 630nm care msoar densitatea optic (DO) n fiecare godeu fa de godeul
martor blank.

Fig.46 - Diverse tipuri de cititoare automate ELISA

Controlul calitii ( valdarea testului) .

n ficare moment, analiza este urmrit n raport de martorul pentru reageni
(godeu blank), controlul negativ i controlul pozitiv. Toi aceti martori trebuie
inclui pe fiecare plac ELISA .

179
Pentru ca testul s fie validat, valorile DO ale controlului pozitiv i con-
trolului negativ trebuie s se ncadreze n urmtoarele limite (Tabel nr.16).
 Tabelul:16

Limitele DO pentru controlul pozitiv i negativ difereniate n funcie

de clasele de anticorpi anti M. tuberculosis

Anticorpi Control pozitiv Control negativ

(DO) (DO)
IgG > 0,300 < 0,250
IgM > 0,150 < 0,100
IgA > 0,250 < o,200

Interpretarea testului. ncadrarea unei probe de ser/plasm ca: negativ,

neconcludent sau pozitiv n testul ELISA IgG, IgM, IgA anti M. tuberculosis se
face dup criteriile din tabelul nr. 17.
Tabrelul:17

Interpretarea testului ELISA-IgG,IgM,IgA anti M. tuberculosis

Proba
Anticorpi Negativ Neconcludent Pozitiv

IgG <0,250 0,250 - 0,299 0,300

IgM <0,100 0,100 0,149 0,150
IgA < 0,200 0,200 0,249 0,250

O valoarea a DO < 0,250 arat c IgG anti M. tuberculosis n proba analizat

a fost nedetectabil i proba respectiv este negativ;
Dac DO 0,300, proba analizat este pozitiv;
Probele ale cror valori DO se ncadreaz ntre 0,250 0,299 sunt
considerate neconcludente i trebuie retestate.
Valoarea DO < 0,100 pentru IgM atrat c aceast imunglobulin a fost
nedetectabil i proba respectiv poate fi considerat negativ pentru anticorpi
IgM anti M. tuberculossis .
Valorile DO ncadrate ntre o,100 0,149 sunt neconcluente pentru anticorpi
IgM anti M. tuberculosis i toate acele probe trebuie retestate prin procedee
alternative.
Valorile DO 0,150 arat c probele respective sunt pozitive pentru anticorpi
IgM anti M. tuberculosis.
Valoarea DO < 0,200 sugereaz c anticorpii IgA anti M. tuberculosis au fost
nedectabili i probele respective pot fi considerate negative .
Valoarea DO 0,250 arat prezena anitcorpilor IgA anti M. tuberculosis i
proba respectiv poate fi considerat pozitiv..
Toate porbele cu DO ntre 0,200 0,249 vor fi considerate neconcludente i
acestea trebuie retestate prin metode serologice alternative.
Performanele testului. Studiul efectuat pe 163 de seruri provenind de la pa-
cieni din diverse zone ale globului (Rusia, Ucraina, Togo, SUA i Nordul Europei)
au demonstrat o specificitate a testului GenWay Biotech Inc. -ELISA IgG,IgM,
IgA TB de 100 % i o sensitivitate de 89,5 % (98 ,116). Pe de alt parte, s-a constatat
c testul nu d rezultate pozitive la persoanele vaccinate BCG. i se obin reultate
negative n infecia cu M. bovis.
Limitele testului. Ca orice test biologic GenWay Biotech Inc ELISA- IgG,
IgM, IgA-TB , are aplicabilitate limitat:
- diagnosticul nu poate fi stabilit numai pe baza rezultatelor testului;

180
- pot fi nregistrate rezultate eronate dac n test sunt folosite seruri
hemolizate, contaminate cu diverse bacterii, lipemice sau inactivate termic;
 - caracteristicile performanelor testului nu au fost stabilite pentru alt
matrice dect cea pentru seruri;
- amplitudinea rezultatelor msurat deasupra cut-off nu este un indiciu al
cantitii totale de anticorpi prezeni;
- performanele testului nu au fost stabilite pentru determinarea vizual a
rezultatelor;
- cnd se evalueaz probe provenite de la indivizi imunosupresai trebuie s se
adopte maxim precauie.
Tabelul:18

Diferene intre kit GenWay Biotech Inc. ELISA TB i kit AID ELISA-TB
Diferene Kit GenWay Biotech Inc. Kit AID ELISA-TB
ELISA-TB
Posibiliti de detecie anticorpi IgG, IgM, IgA IgM
TB
Martori control Pozitiv i negativ, Negativ, pozitiv, slab pozitiv, intens
pozitiv
Diluia serurilor de testat 1:21 (exemplu: 10l ser+20 1:101 (5 l ser+ 500 l diluent)
ldiluent)
Conjugat Anti IgG, IgM i IgA Anti IgM
Condiii de incubare 20-23 C /60 min. i 20-23C/14- Temp. camerei/60 min. ,30 min. i res-
16 min. pectiv 20 min.
Splri Ciclu de 5 splri Ciclu de 3 splri

Stabiltatea culorii reaciei 30 min. 60 min.

Sistem de validare citire i v. tab. Tabelele nr.16 i 17 DO blank DOreferin. 10%;

interpre-tare rezultate. Nu este necesar curba stanbdard Pozitiv+ DOt mai mare dect DOcut-
off; Negativ = DOt mai mic dect DO
cut off: Neconclu-dent , DOt = DO cut-
off

Procedeul testului GenWay Biotech Inc. ELISA IgG, IgM, IgA BT este
unul dintre numeroasele procedee descrise n literatura de specialitate.
Fiecare dintre testele ELISA au proceduri de lucru proprii n funcie de
caracteristicile componentele lor incluse n kit. ntre varianta ELISA, elaborat de
GenWay Biotech Inc., USA i cea iniiat de AID exist unele diferene eseniale
prezentate n tabelul nr.18. De aceea, n alegerea metodei de lucru i kitului ELISA
corespunztor este necesar s se cunoasc bine principiul, componenetele kitului,
procedeul de lucru, performanele fiecrei variante ELISA n parte i
costurile/prob. De exemplu, este clar c n varianta ELISA - GenWay Biotech Inc.
costurile sunt mai ridicate dect n varianta AID avnd n vedere c n prima
variant pot fi testate pe o plac cu 96 de godeuri numai 29 de seruri.Alegerea unui
kit-ELISA-TB i procedura de lucru depinde i de scopul urmrit i de stadiul
infeciei tuberculoase a pacinetului de la care s-a recoltat serul pentru analiz.

Teste serologice rapide.

Testele serologice rapide sunt utilizate pentru detecia i diferenierea

anticorpilor IgG de IgM anti M. tuberculosis din serul sau din plasma pacienilor cu
infecie tuberculoas.
Metodele clasice (examenul direct al sputei i secreiilor, testul tuberculinic i
examenul radiologic ) au sensitivitate redus i n plus necesit mult timp pn la
obinerea rezultatelor. De aceea, au fost elaborate i perfecionate teste rapide
pentru diagnosticul serologic al infeciei tuberculoase n diverse variante de lucru.

181
Descoperirea testelor serologice rapide a reprezentat o realizare impor-tant
la animalele slbatice din mediul silvatic, n semicaptivitate, din rezervaii, din
ferme, din parcuri i gradini zoologice.
 Testul rapid TB IgG/IgM-3, este o metod bazat pe analiza dubl cromato-
grafic prin amprentarea anticorpilor IgG/IgM-3.
Prezena anticorpilor n serul/plasma pacienilor infectai cu M. tuber-culosis
sunt evideniai cu ajutorul conjugatului anti IgG/IgM de om + Gal-ben de
Burgundia. Dac anticorpii anti M. tuberculosis (IgG/IgM) sunt prezeni n proba
de cercetat acetia migreaz ctre sectorul nr.2 pe membra-na de nitroceluloz
captuit cu un antigen recombinant M. tuberculosis, for-mnd un complex
anticorpi+ conjugat + ag. M.tuberculosis vizualizat prin apariia unei benzi sau
dou benzi cu intensitatea culorii variabile. n zona nr. 3 de pe membrana
nitrocelulozic este plasat un martor de control (Fig.47 )

Godeu Sector IgM Control Suport

Ser conjugat IgG

Membran Sector Ag.

nitroceluloz M. tuberculosis

Fig.47 - Principiul testului rapid TB-IgG/IgM-3

Reageni i materiale Kitul Rapid TB-IgG/IgM conine 25 de dispozitive de

testare (Fig.48).

Fig. 48 Diferite truse pentru diagnosticul serologic rapid al tuberculozei la animale

Fiecare dispozitiv, ambalat n folie protectoare , conine:

- o caset pentru testare;
- o pipet picurtoare (pentru fiecare prob testat);
- desicatnt;
n fiecare pachet cu dispozitive de testare se gsesc instruciunile de utilizare.
Suplimentar, sunt necesare pentru lucru sisteme de prelevare a probelor de
ser sau plasm precum i un ceas de laborator sau cronometru.
Condiii de stocare a kitului. Stocarea kitului poate fi fcut la temperatura de
4 C. Sau la temperatura camerei (18 -220 C.)
0

Fiecare dispozitiv va fi folosit numai pn la data expirrii care este ncsris

pe folia protectoare. Este interzis congelarea sau expunerea kitului la temperaturi
peste 30 C .

182
 Avertizri i precauii . Kitul rapid Tb-IgG/IgM3 este destinat numai
diagnosticului tuberculozei in vitro.
Folia protectoare nu se va deschide dect atunci cnd toate pregtirile de
lucru au fost finalizate.
Este interzis a se folosi dispozitive de testare expirate.
Probele provenind de la pacieni sau animale suspecte c sufer de boli
transmisibile vor fi manipulate respectnd normele de protecie mpotriva bolilor
trans-misibile.
Pr0bele eliminate din testare precum i materialele utililizate vor fi depuse n
containere speciale care asigur bioprotecie i vor fi transportate spre unitatea de
sterilizare unde vor vi supuse incinerrii sau altor proceduri de inactivare.
Prelevarea probelor si stocarea acestora. Sunt supuse analizei prin test rapid
IgG/IgM3 anti M. tuberculosis probe de plasm i/sau seruri sanguine provenite
de la anaimale sau de la oameni suspeci de infecie cu M. tuberculosis.
Plasma, se recolteaz prin puncie venoas, n tuburi corespunztoare care
conin EDTA, citrat de sodiu sau heparin.
Probele astfel recoltate se transport la laboratorul specializat n diag-nosticul
serologic al tuberculozei unde se separ plasma de restul componentelor sngelui
prin centrifugare.
Nu introducei proba de snge la congelator dac plasma nu a fost separat.
Serul, se recolteaz n tuburi corespunztoare care nu conin anticoagulant
dup procedeul utilizat pentru plasm. Tuburile vor fi lsate n repaus, uor
nclinate, la temperatura camerei pentru exprimarea serului.
Sngele se transport la laborator unde se separ serul de coagul.
Plasma i/sau serul pot fi supuse imediat analizei serologice sau pot fi
pstrate pn la 2 sptmni la 2-8C sau pn la 12 luni la -20C.

Procedelul de lucru:

- lsai dispozitivele, tamponul, serul sau proba de plasm i/sau martorii-

control pentru echilibrare la temperatura camerei (15-30C) nainte de nceperea
lucrului dac kitul a fost refrigerat;
- omgenizai bine fiecare prob de plasm sau ser nainte de a fi introduse n
analiz;
- deschidei dispozitivul de testare prin ndeprtarea foliei protectoare i
aezai fiecare lam pe o suprafa orizontal, curat;
- marcai fiecare dispozitiv cu numrul de identificare corespunztor unei
probe;
- alimentai pipeta picurtoare, meninei pipeta vertical i repartizai n
godeul dispozitivului 2 - 3 picturi din proba de testat (aprox. 50-90 l) fr a
forma bule de aer. Dac migrarea nu se evideniaz n 30 de secunde, adugai o
pictur de PBS (c.c.a 30 l );
- dup 5-10 minute de la repartizarea probei, citii rezultatul. Rezultatul
pozitiv poate fi vizibil n mai puin de 1 minut. Rezultatele nu vor fi citite mai trziu
de 10 minute de la repartizarea probei.

183

Interpretarea rezultatelor .
 a. Rezultatul negativ, se consider atunci cnd numai o linie de precipitare
este prezent n sectorul C ( Fig.49).
C T1 T2 C

3 9

a. Test NEGATIV c. Test POZITIV IgG

T1 T2 C T1 T2 C

7 2

b. Test POZITIV IgM d. Test POZITIV IgG i IgM

Fig. 49 a, b, c. Interpretarea rezultatelor testului serologic rapid

b. Rezultatul pozitiv pentru IgM (Fig.46 b), este considerat cnd o singur
linie de precipitare este evideniat n sectorul T1 sugernd prezena anticopilor
IgM anti-M.tuberculosis n proba analizat.
c. Rezultat pozitiv pentru IgG (Fig.46 c), linia de precipitare, evideniat n
sec-torul T2, sugereaz prezena anticorpilor IgG anti-M.tuberculosis.
Relativ recent au fost descoperite o serie de aparate electronice destinate
citirii i interpretrii rezultatelor precum i vizualizarea lor automat. Unele
dintre aceste dispozitive realizeaz citirea i interpretarea rezultatelor numai
pentru o singur prob (Fig.50).

Fig. 50 - Diverse tipuri de readere automate pentru citirea i interpretarea testului rapid TB IgG/IgM3

Exist multireadere care anlizeaz simultan un grup de probe i afieaz

rezultatele pentru fiecare prob n parte mpreun cu alte date care vizeaz
acurateea testului. De asemenea, multireaderele parformante pot face analiza
cantitativ a anticorpilor anti-M. tuberculosis prin msurarea cantitii de conjugat
transportat n sectoarele T1 i/sau T2.
Invalidarea testului.

Testul nu poate fi validat dac apar urmtoarele situaii :

a. absena liniei de precipitare n sectorul C. Linia de precipitare n sectorul
C nu este prezent cu toate c n sectorul T1, aceasta este evident (Fig. 51 a);
b. absena liniei de precipitare n sectorul C, dei prezena acesteia se
consta-t n sectorul T2 (Fig. 51 b);

184

c. Prezena liniei de precipitare n sectoarele T1 i T2 dar absent n sectorul

C (Fig. 51 c).
d. Absena oricrei linii de precipitare n toate cele 3 sectoare: T1, T2, C. (Fig.
51 d).
 Dac se constat oricare dintre situaiile menionate mai sus, testul va trebui
repetat pentru proba sau probele respective, utiliznd alte dispozitive.
T1 C T1 T2 C

a. 6 b. 5

.
T1 T2 C T1 T2 C

c. 4 d. 11

Fig. 51 (a,b,c,d) - Situaii n care testul rapid-TB- IgG/IgM3 anti-M.tuberculosis este invalidat.

Limitele testului:

- n general, testul TB-IgG/IgM 3 este limitat, el face numai detecie calitativ

a anticorpilor anti M. tuberculosis din probele de ser sau de plasm. Unele sisteme
sunt calibrate i pentru determinare cantitativ a anticorpilor;
- recunoate i anticorpii anti M.bovis i M. africanum
- nu exist nici o relaie ntre intensitatea culorii liniilor de precipitare i
concentraia de anticorpi specifici anti M. tuberculosis cnd rezultatele sunt
evaluate calitativ;
- rezultatul negativ nu exclude existena infciei tuberculoase datorit
fluctuaiei pronunate a anticorpilor n cursul infeciei sau se gsesc n canti-tate
insuficient pentru a fi detectai n stadiul incipient al infeciei;
- diagnostiul final al bolii trebuie stabilit corobornd rezultatele investigaiilor
clinice cu cele de laborator.

Avantaje i performae.

Testul rapid de detecie a anticorpilor anti M. tuberculosis pezint avanteje

superioare, comparativ cu alte teste serologice:
- este extrem de simplu rapid (timpul de la nceperea anlizei i pn la
obinerea rezultatului nu depete 20 de minute) i poate fi executat n orice
unitate medical ,n teren, sau n fermele de animale (128);
- poate fi executat de personal medical cu pregtire medie;
- nu necesit apratur i materiale de laborator complicate;
- preul de cost este mult mai redus fa de cel al altor teste serologice;
- are utilitate i eficien superioare n fermele de animale infectate cu M.
bovis dar mai ales n rezervaiile de animale slbatice infectate cu alte tipuri de
micobacterii patogene (35).
- sensitivitatea s-a situat, n general de 93,0 % n timp ce specificitatea nu a
fost niciodat mai mic de 100,0 %. De asemenea, evalurile fcute n mai multe
laboratoare folosind aceleai probe n testare au demonstrat o reproductibilitate
bun.

185

4.1.5. EXAMENUL NECROPSIC.

Examenul anatomopatologic este practicat destul de rar ca metod de

diagostic al tuberculozei la om. n domeniul medicinii umane se apeleaz la
examenul anatomopatologic anumai n scop didactic, n programe de cercetare
medical sau n investigaii medicolegale. De aceea, n aceast lucrare vor fi
prezentate sumar numai principalele leziuni produse de micobacterii patogene la
oameni i n detaliu metodologia de lucru i aspectele anatomo-patologice
constatate cu ocazia expertizei de abator la animaelele moarte sau sacrificate din
cauza tuberculozei, n special la rumegtoarele domestice i slbatice.

4.1.5.1. Examenul necropsic la bovine.

Examenul necropsic al bovinelor suspecte de tuberculoz se bazeaz pe

expertiza de abator a tuturor perechilor de noduri limfatice, n special din zona
capului, gtului, toracelui, nodurile limfatice mediastinale i traheo-bronhice,
precum i a organelor interne: cordul pulmonii, ficatul splina, ri-nichii, glanda
mamar, organele genitale femele i mascule.
n mod, obligatoriu examenul necropsic va fi efectuat cu minuiozitate la
toate bovinele cu reacii alergice pozitive i/sau dubioase, care au fost trimise la
abator, nsoite de fie pentru tiere n scop de diagnostic al tuber-culozei. De
asemenea, vor fi examinate n aceleai condiii i bovinele provenite din efective
infectate, care au fost trimise la tiere pentru alte cauze dect pentru diagnosticul
tuberculozei.
Examenul necropsic complet se va executa i la bovinele provenind din
efective indemne de tuberculoz, dar la care au fost observate leziuni localizate n
diferite esuturi i organe care s fi fost atribuite tuberculozei.
Animalele destinate tierii pentru diagnosticul tuberculozei vor fi examinate
ntr-un abator autorizat sanitar-veterinar, de ctre o comisie alctuit din:
- medicul veterinar al abatorului;
- medicul veterinar concesionar al circumscripiei din raza creia provin
animalele;
- reprezentantul Direciei Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor
(responsabil pe profil sau, dup caz, specialistul bacteriolog sau histopatolog din
cadrul LSVS judeean.
Bovinele destinate abatorizrii nu vor fi introduse n sala de tiere dac exist
neclariti privind identificarea lor sau dac documentele sanitare veterinare
nsoitoare nu sunt completate corespunztor (originea i adresa exact a
proprietarului , vrsta, sexul, starea fiziologic a animalului, rezultatele testelor
alergice i/sau ale altor teste complementare de depistare, precum i date
epidemiologice asupra efectivului de origine).
ndat dup clarificarea aspectelor de identificare a animalelor i a
documentelor n sala sanitar nsoitoare sanitare veterinare, comisia organizeaz i
dispune sacrificarea animalelor n sala sanitar sau n partid separat, dup
terminarea lotului de tieri normale.
n acest scop, comisisa trebuie s dispun de echipamentul, instrumentarul i
materialele necesare executrii unui examen complet i a prelevrii probelor
pentru investigaii de laborator n condiii corespunztoare.

186

Dup asomarea i sngerarea animalelor, medicul veterinar de abator,

mpreun cu membrii comisiei vor exmina cu atenie esutul dermic, esutul
conjuctiv subcutanat pentru depistarea unor boli cu localizare dermic (Dermatita
nodular, Actinomicoza, Actinobaciloza, Hipodermoza, etc. ), precum i nodurile
limfatice superficiale sub raportul volumului, aspectului de suprafa i eventualele
aderene. Toate observaiile vor fi notate n fia de examen necropsic al
animalului.
Comisia va supraveghea ca eviscerarea s se fac cu atenie, corect pentru ca
viscerele s nu fie secionate i s se detaeze mpreun cu forma-iunile limfoide i
esuturi adiacente cu eventuale leziuni.
Examenul necropsic se va face difereniat, pe zone anatomice i grupe de
organe , astfel:
a. Zona capului.
Se disec i se detaeaz:
- nodurile limfatice mandibulare, parotidiene, retrofarigieale (stng i
drept);
- tonsilele;
- muchii maseteri.
Cu excepia perechilor de noduri limfatice i a tonsilelor, care se examineaz
sub raportul volumului, aspectului de suprafa i prin palpare, pentru depistarea
nodulilor tuberculoi, muchii maseteri vor fi examinai la suprafa i pe seciuni
n profunzime, practicate la distan 0,5-1,0 cm. pentru depistarea prezenei
chitilor de Cysticercus spp.
b. Zona gtului.
Se vor examina:
- lanul de noduri limfatice situate n aria de proiecie a vertebrelor cervicale;
- nodurile limfatice prescapulare (stng i drept), dup tehnica descris mai
sus fr a fi secionat capsula sau zonele cu leziuni.
c. Cavitatea toracic .
Pericardul: se va examina att membrana extern ct i cea extern precum
i lichidul pericardic sub raportul cantitii culorii i turbiditii;
Cordul: se va examina suprafaa i cavitile auriculare i ventriculare precum
i seciunile practicate n miocard, notndu-se eventuala prezen a chitilor de
Cysticercus spp. ori leziuni de alt natur observate;
Nodurile lifatice mediastinale (anterior i posterior);
Nodurile limfatice traheobronhice;
Pleura costal i pulmonar.
Pulmonii, vor fi examinai pe toat suprafaa i dac nu se constat leziuni
vizibile sau detectabile prin palpare, se pot efectua seciuni multiple profunde n
esutul pulmonar inclusiv secuni pe toat lungimea bronhiilor , consemnndu-se
eventuale infecii parazitare: Dyctiocaulus spp., Protostrogylidae, Echinococcus
spp. .a. sau de alt natur. Se va efectua o expertiz atent a cavitii toracice
pentru a detecta leziunile de tuberculoz diseminate pe faa intern a coastelor sau
nodurile limfatice dispuse pe toat lungimea coloanei vertebrale sau n nodurile
limfatice sternale.
d. Cavitatea abdominal .
n cavitatea abdominal se vor examina n mod deosebit:
- ficatul i nodurile limfatice aferente;
- splina rinichii i nodurile limfatice aferente;
- limfocentrii mezenterici i mezenterul ileonul i valvula ileocecal, jejunul

187

i partea superioar a tractusului intestinal att la suprafa ct i pe seciuni

longitudinale ale acestor segmente digestive.
Dac se observ leziuni de echinococz hepatic, cisticerciza seroaselor sau
alte parazitoze sau leziuni, altele dect cele tuberculoase, acestea vor fi consemnate
n fie.
 e. Zona pelvin.
Se vor emanina:
- nodurile limfatice prefemurale (stng i drept);
- nodulii limfatici iliaci interni, iliaci mediani (stng i drept) mamari
superiori sau scrotali;
- glanda mamar sau scrotumul i testiculele (superficial i pe seciuni);
- aparatul genitourinar femel i mascul.

Descrierea leziunilor atribuite infeciei tuberculoase.

Rezultatele studiului ntreprins de A b u b a k a r U . B . e t a l ., (2011 ) (3)

demonstreaz distributia extrem de larg a leziunilor tuberculoase la animalele
infectate cu Mycobacteriu bovis. Astfel, in perioada anilor 2000- 2009, din 403.317
bovine abatorizate ntr-un abator din Nigeria, autorii au gsit leziuni atribuite
tuberculozei la 11.006 din care: 67,8 % leziuni locali-zate n pulmoni, 13,9 %
localizri limfonodale, 3,8 % n ficat 8,6 % , 3,8 % n intestine, 4,0 % n rinichi i 1,9
% leziuni generalizate.
De modul cum sunt evideniate i descrise leziunile atribuite infeciei
tuberculoase depinde acurateaea investigaiilor de laborator ulterioare pentru
pecizarea diagnosticului bolii. n acest context, examenul necropsic are importan
deosebit i de aceea trebuie s furnizeze laboratorului toate datele cu privire la
localizarea, extinderea i caracterul leziunilor precum i eventuale asocieri ale
procesului patogenetic specific tuberculozei cu alte infecii bacteriene intercurente
sau parazitare.
O atenie deosebit trebuie acordat organelor i esuturilor care pre-zint
leziuni redus ca numr i extindere.
La bovinele infectate cu M.tuberculosis sau cu M. avium , de regul, se
constat leziuni de mic intensitate (microleziuni) i n multe cazuri acestea nu se
observ macroscopic dar sunt depistate frecvent la tineretul taurin, n special n
tractusul digestiv i nodurile limfatice aferente.

Fig. 52 - Tuberculoza pulmonar bovin. Se observ numoroi noduli tuberculoi de dimensiuni

variabile cazeoi, cazeocalcificai i focare necrotice.

Pe de alt parte, gradul de extindere i caracterul leziunilor tuberculoase

(noduli cazeoi, calcificai, necroze, caverne, ulcere (Fig.52) pot s furnizeze date
preioase asupra evluiei bolii n efectivele de origine (infecie recent sau
avansat), n baza crora este posibil abordarea unei conduite adecvate n
programele de eradicare.
188
Leziunile anatomopatologice n tuberculoza rumegtoarelor au un pronunat
polimorfism, determinat de evoluia procesului patogenetic, starea de ntreinere i
gradul de reactivitate al organismului i esutului afectat la aciunea
micobacteriilor.
 n acest context, sunt prezenate, cteva caracteristici ale tabloului lezional n
tuberculoz la bovine, n sperana c acestea vor constitui puncte de reper pentru
specialitii veterinari care execut expertiza de abator a animalelor tiate n scopul
precizrii diagnosticului de tuberculoz.
a. Complexul primar, a fost descris cel mai frecvent n tuberculoza
pulmonar sub dou forme:
- complexul primar complet, se caracterizeaz prin pezena nodulilor
tuberculoi avd culoare galben-cenuie , de mrimi variabile, de multe ori cu
coninut caze0s sau cazeo-calcificai, localizai subpleural sau n esutul pulmonar i
n nodurile limfatice din zona capului i din cavitatea toracic (Fig.53).

Fig.53 - Leziuni primare de tuberculoz cu localizare n pulmoni la bovine

189
- complexul primar incomplet, se caracterizeaz prin prezena nodulilor
tuberculoi numai n nodurile limfatice din zona capului i din cavitatea toracic.
b. Tuberculoza miliar acut, este rar ntlnit i n aceast form se
observ numeroi noduli translucizi dispersai pe toat suprafaa pulmonilor care
pot sa ajung la dimensiunile unui bob de mei. n nodurile limfatice aferente sunt
prezente leziuni de cazeificare radiar, similar cu cele constatate n complexul
primar.
c. Tuberculoza pulmonar cronic. Este cea mai frecvent form
ntlnit la bovinele adulte i se caracterizeaz prin modificri diverse ale zonelor
afectate:
- forma acinoas, se aseamn cu focarul de pneumonie cataral cu lobulii
indurai, de culoare roie-violacee n care se gsesc noduli tuberculoi cu
dimensiunile unui bob de mei sau ale unui bob de mazre. Pereii brohiilor sunt
degenerai cu lumenul ncrcat cu material cazeo-purulent;
- forma lobular i lobar, se deosebete de forma acinoas prin aceea c are
caracter proliferativ cu tendin de cazeificare; focarele cazeoase sunt delimitate de
esut interlobular ngroat. n stadii mai avansate, se pot observa leziuni ntinse de
tip lobular, pneumonie cazeoas cu formare de caverne (caviti) ca urmare a
ramolismentului masei cazeoase sau a ectaziei bronhiilor. n aceste stadii, n marile
bronhii i n trahee sunt prezente ulcere cu margini ngroate i fundul granulat.
n nodurile limfatice aferente se constat frecvent leziuni tuberculoase de tip
exudativ (Fig. 54)

Fig. 54 - Tuberculoza pulmonar cronic ( forma lobular i lobar). Se observ leziuni de pneumo- nie
cazeoas, calcificri i prezena cavernelor de dimensiuni variabile (sgeata alb).

- tuberculoza generalizat, este cunoscut n literatura de specialitate sub

denumirea de tuberculoz timpurie i se depisteaz cel mai frecvent la
tineret.Evolueaz concomitent sau la scurt timp dup dezvoltarea complexului
primar i se caracterizeaz prin prezena focarelor miliare confluente similare cu
cele observate n forma cronic.
d. Tuberculoza limfonodal. Localizarea leziunilor de tuberculoz n
nodurile limfatice este foarte frecvent, n special n tuberculoza primar (248,106,251)
i de aceea, examenul anatomopatologic n aceast form trebuie s fie abordat cu
atenie sporit. n literatura de specialitate se descriu dou forme de tuberculoz
limfonodal:
- tuberculoza limfonodal nodular , cu noduli tuberculoi de diverse
dimensiuni, localizai n special n stratul cortical, care pot conflua formnd
tuberculi solitari cazeoi sau calcificai delimitai de capsul fibroas;

190
191- tuberculoza limfonodal hiperplastic, constituie forma benign de
evoluie a tuberculozei; nodulul limfatic afectat este mrit n volum, cu consisten
crescut, translucid pe seciune, cu aspect slninos, fr cazeificri.
 Fig 55 - Tuberculoz limfonodal hiperplastic

Aceste leziuni sunt adesea confundate de o parte dintre veterinari cu forma

limfoid a leucozei enzootice bovine (LEB) (Fig.56).

TB AB LEB

Fig.56 - Leziuni limfonodale la bovine cu tuberculoz (TB)(Nod limfatic mediastinal); actinobaciloz

(AB) (noduri limfatice retrofaringeale) si Lucoz enzootic (LEB) (limfonoduri mezenterice)

e. Tuberculoza seroaselor, cel mai frecvent se prezint sub form

perlat, caracterizat prin prezena pe suprafaa seroaselor a numeroi tuberculi cu
consisten dur, asemntori perlelor, cu centrul cazeos sau calcificat (tuberculoza
perlat) ( Fig.57). (56)

Fig.57 - Tuberculoza seroaselor. Numeroi noduli albi sidefii, cu consisten dur

asemntori perlelor , cazeii sau calcificai (tuberculoz perlat)

191
De asemenea, pot fi ntlnite cazuri cu pleurit, pericardit sau peritonit de
tip cazeos.
d. Tuberculoza altor organe. Leziunile de tuberculoz localizate n alte
organe, de regul, au frecven sczut, acestea fiind observate n cazurile de boal
avansat i n funcie de cile de realizare a infeciei:
 - tuberculoza intestinal, constatat de regul la viei, ca infecie primar, se
caracterizeaz prin leziuni localizate de regul n ileon i intestinul gros ca noduli n
foliculii solitari i n plcile Payer sau sub form de ulceraii cu marginile
ngroate i fundul acoperit cu cazeum. La bovinele adulte, infecia intestinal este
consecina deglutirii masei expectorante contaminat cu bacili.
Leziunile de tuberculoz intestinal pot fi foarte uor confundate cu cele de
paratuberculoz; cel mai frecvent acestea nu pot fi difereniate macroscopic,
examenul de laborator fiind cel care precizeaz diagnoticul.
- tuberculoza hepatic i a splinei, este frecvent la viei i constituie un indi-
ciu c infecia s-a realizat intrauterin;
- tuberculoza glandei mamare, este ntlnit cel mai frecvent sub forma
cronic, hiperplastic i n cele mai multe cazuri, sunt afectate sferturile
posterioare care apar indurate cu hipertrofia lobulilor iar esutul conjunctiv
interlobular este translucid, cu aspect slninos. n acest form se constat
galactoforit cazeoas. Leziunile de tuberculoz miliar caracterizeaz, de regul,
forma generalizat cnd alturi de esutul mamar sunt afectate, sunt afectate i
limfonodurile adiacente, unde se observ noduli cu tendin de cazeificare n jurul
crora exist zone congestive.
g. Tuberculoza aparatului urinar.
- tuberculoz renal, leziunile sunt localizate frecvent n zona cortical sub
form de noduli de dimensiuni variabile, nconjurai de o capsul fibroas i centrul
cazeos. n formele evoluate de boal, nodulii pot disemina n bazinet unde pot
suferi procese de ramolire i prin eliminarea masei cazeoase s se formeze caverne
(caviti).
n literatura de specialitate au fost descrise, cu frecven redus, cazuri cu
tuberculoza ureterelor, tuberculoza vezicii urinare i tuberculoza uretral.
h. Tuberculoza aparatului genital , afecteaz n egal msur apartul
genital femel i mascul:
- la femele , se pot observa noduli tuberculoi cu tendin de cazeificare,
ulceraii sau papile pe toat suprafaa uterovaginal (Fig 58). De asemenea, nodulii
tuberculoi, cu aspect slninos, cazeos sau calcificat, pot fi gsii n profunzimea
ovarelor.

Fig.58 - Tuberculoz uterin la vac. Se observ numeroi noduli

tuberculoi cazeo-calicficai, dispersai pe toat mucoasa utero-
vaginal (Center for Food Security and public Helath, foto ID: Tub_004)

192
- la masculi, sunt frecvente leziunile de tuberculoz perlat pe seroasele
scrotale sau de tip nodular n epididim i n esutul testicular.

4.2.3. Examenul necropsic la alte specii de animale.

 n general, n tuberculoza ovinelor, caprinelor, porcinelor, carnasierelor
domestice i slbatice precum i a cervideelor crescute n captivitate, semi-
captivitate sau n mediul silvatic, tabloul lezional nu difer substanial de cel descris
la bovine.
Cteva diferene, pot fi constatate numai n ceea ce privete frecvena
leziunilor i localizarea acestora. De exemplu, la ovine localizarea limfonodal este
mult mai frecvent i leziunile pot fi confundate foarte uor cu limfadenita
pseudotuberculoas produs de Corynebacterium pseudotuberculosis, n timp ce
la capre i cervidee localizarea pulmonar i pleural a fost observat n peste 80%
din cazuri sub form de tuberculoz miliar i tuberculoz perlat (Fig. 59).

Fig. 59 - Pleurit tubercuoas la cervidee. Leziunile sunt localizate pe faa intern a coastelor

La carnasierele domestice,(n special cinii si pisicile cu habitat n jurul

abatoarelor sau n incinta fermelor care se hrnesc cu confiscate i deeuri de
origine animal), leziunile de tuberculoz digestiv sunt cel mai frecvent ntlnite.
Leziuni de tuberculoz digestiv au fost descrise la carnasierele (lei, tigri, pantere)
din rezervaia Krugger Park din Africa de Sud ca urmare a consumului bivolilor
infectai cu Mycobacterium bovis (146, 63). La cinii i pisicile de apartament, forma
pulmonar a tuberculozei produs de Mycobacterium tuberculosis este mult mai
frecvent dect cea digestiv.

4.1.5.2. Tabloul lezional n tuberculoz la om.

Examenul necropsic pentru diagnosticul tuberculozei la om nu prezint

importan deosebit i de aceea el nu se practic n mod frecvent dect n scop
didactic, n cadrul programelor de cercetare sau n investigaii medicolegale.
Mijloacele moderne de detecie i localizare exact a leziunilor tuberculoase n
timpul vieii pacientului fac inutil i ineficient un examen necropsic dup decesul
acestuia.
193
Totui, dac examenul necropsic se impune, specialitii anatomo-patologi
trebuie s in sem de cteva elemente eseniale: localizarea leziunilor,
caracteristicile evolutive ale tabloului lezional i vrsta persoanei decedate.
Leziunile tuberculoase pot fi localizate ntr-un singur organ sau pot fi
rspndite n mai multe organe i esuturi (tuberculoz generalizat) cu localizare
iniial n aparatul respirator.
 ntr-un studiu efectuat de S h a r m a M . P. i M o h a n A., 2 0 0 4 (205)
pe grupe de pacienti HIV-negativi si HIV-pozitivi se evidentiaz localizarea extrem
de diversificat a leziunilor de tuberculoz extrapulmonar.
Autorii studiului constat c la pacientii HIV-negativi leziunile pulmo-nare
reprezint 75,0 % , tuberculoza pleural 20.0% , tuberculoza genito-urinar 9,0 %,
tuberculoza abdominal 3,0 % si tuberculoza limfonodal 35,0 % n timp ce la
pacientii HIV-pozitivi leziunile de tuberculoz extinse in alte organe si esuturi
reprezint 45,0 % si 35,0 % in limfonoduri.
Macroscopic, se remarc aspectul cazeumului. n tuberculoza incipient,
cazeumul are aspect glbui cu consisten brzoas dar, pe msur ce boala
avanseaz, el devine cenuiu cu tendin de calcifiere. n stadiile avansate, se pot
observa zone de necroz confluente i prezena cavitilor n pulmoni ca urmare a
eliminri materialului necrotic n bronhii.
n funcie de vrst, tuberculoza se difereniaz prin urmtoarele
caracteristici:
- tuberculoza primar;
- tuberculoza pulmonar;
- tuberculoza extrapulmonar, unde forma digestiv i adenopatiile
tuberculoase dein pondere important la copii i tineri. De asemenea, la aceaste
grupe de vrst sunt frecvente:
- formele grave de tuberculoz, cu inciden semnificativ: meningita
tuberculoas i tuberculoza miliar.
Leziunea primar (tuberculoza pulmonar primar), la un individ imuno-
competent se gsete subpleur ca un focar redus n dimesiuni (microfocar), numit
focarul primar Ghon (Fig.60) dar pot fi afectai i limfonodulii regionali. Focarul
incipient Ghon mpreun cu leziunea limfonodal constituie complexul primar
Ghon .

Fig.60 - Leziune primar n pulmon (focarul Ghon). Sgeile indic localizare

subpleural i peribrobholar

Din punct de vedere evolutiv, se pot ntlni leziuni fibro-calicificate, prezente

att n pulmoni ct i n nodurile limfatice adiacente i sunt denu-mite complexul
Ranke.

194
Tuberculoza secundar, este ntlnit cel mai frecvent la persoanele adulte i
este rezultatul reactivrii infeciei iniale sau reinfeciei, n special cnd sisteml de
aprare al pacientului este reprimat , aa cum se constat la persoanele infectate cu
HIV.
Leziunile tuberculoase secundare sunt loclizate cel mai frecvent n lobii
pulmonari apicali i se prezint n diverse stadii de evoluie , de la inflamaia
granulomatoas infiltrativ-proliferativ la granuloame tuberculoase cu coninut
necrotic-cazeo-calcificat (Fig.61 a) i formare de caviti (tuberculoza cavitar)
(Fig.61 b)

a b

Fig. 61 - Leziuni de tuberculoz pulmonar secundar n diverse stadii de evoluie: zone de inlamaie
granulomatoas ,graanuloame cu coninut necrotic-cazeo-calcificat (a) i formare de caviti (tuberculoz
cavitar)(b).

La persoanele cu rezistena organismului slab se poate constata tuberculoza

miliar, cnd n pulmoni sau n alte organe sunt prezente numeroase granuloame
avnd mrimea unui bob de mei (1-3 mm diametru) (Fig. 62)

Fig. 62 - Tuberculoz pulmonar miliar la om

Diseminarea infeciei tuberculoase n alte organe i esuturi mbrac

pariculariti i caracteristici distincte, n funie de organul sau esutul afectat.
Acestea vor fi prezentate n continuare pentru fiecare segment n parte.
a. Tuberculoza gastro-intestinal , n prezent este deosebit de rar
datorit msurilor de pasteurizare a laptelui administrat n alimentaia public. Cu
toate acestea, cazuri cu tuberculoz gastro-intestinal pot fi nregistrate ca urmare a
deglutirii sputei infectate cu cantiti impresionante de bacili eliminai n
tuberculoza pulmonar cavitar.

195

Cel mai frecvent, leziunile se gsesc localizate n tractusul intestinal, mai

precis n plcile Payer din poriunea ileo-cecal i apar sub form de ulceraii
circumvoluionale concentrice (benzi ulcerative) (Fig.63)
 Fig. 63 - Ulceraii crcumvoluionale concentrice n tuberculoz la om

Iniial, ulceraiile, singulare sau multiple, sunt superficiale (205) fr s

afecteze musculoasa i n cele mai multe cazuri sunt dispuse transversal, element de
difereniere fa de boala lui Crohn.
Vindecarea ulcerelor determin alterri structurale i funcionale ale intestinului,
cum ar fi: staz arterial, ischemie i strictur intestinal i, destul de rar,
endarterit cu hemoragie masiv. n stadiile avansate, leziunile se caracterizeaz
prin grad ridicat de fibroz a peretelui, localizate n submucoas i musculoas.
Nodurile limfatice mezenterice apar mrite n volum i pe seciune pot fi
observate unul sau mai multe granuloame (Fig. 64)

Fig. 64 - Tuberculoza nodurilor lifatice mezenterice la om.

n scop didactic, leziunile tuberculoase ulcerative din intestin au fost

clasificate in dou grupe: grupa leziunilor ulcerative i grupa leziunilor ulcero-
hiperplastice.
Formele ulcerative au fost observate mai frecvent la indivizii malnutrii n
timp ce enterita tuberculoas hiperplastic este prezent la adulii bine hrnii. La
examenul macroscopic, peretele intestinal este ngroat i suprafaa seroasei
acoperit cu numeroi noduli de dimensiuni variabile.

196

Leziunile prezente n segmentul ileo-cecal sunt preponderent ulcerative. Ansa

ileo-cecal este adesea sistrus i opturat. Ambele deschideri al valvulei ileo-cecale
sunt afectate alternd funcionalitatea acesteia. Acest aspect constituie nc un
element de difereniere fa de boala lui Crohn (211). Totodat, la examenul
macroscopic se remarc peritoneul ngroat, hiperemic i matizat, presrat cu
numeroi noduli de culoare alb-glbuie .
 Tuberculoza esofagului i tuberculoza gastro-duodenal sunt extrem de rare,
cu inciden de 0,2 i respectiv 1,0 %. De aceea, n literatura de specialitate
examenul anatomopatologic al acestor segmente digestive este considerat de
importan minor.
b. Meningoencefalita tuberculoas. Leziunile tuberculoase se gsesc
att pe foia meningeal ci n creier formnd mici focare metastatice cazeoase
denumite focare Rich (221) . Diseminarea focarelor Rich n masa cerebral este
frecvent n tuberculoza cerebral miliar. Deobicei, la examenul macroscopic al
encefalului, se remarc focare Rich de dimensiuni variabile localizate n esutul sub
arahnoidian care este distrus producnd inflamaia meningelui.
Cnd focarele Rich sunt localizate n encefal, acestea apar sub form de
conglomerate cu coninut cazeos care pot atinge dimensiuni considerabile fr a
afecta meningele (Fig.65)
La persoanele cu rezisten imunologic slab, dimensiunile masei cerebrale
afectate sunt considerabile i leziunile se prezint sub form de abcese france.

Fig. 65 - Encefalit tuberculoas la om. n masa cerebral se observ granuloame tubercuoase sferice,
galben-cenuii i zone de hemoragii n meninge

In fazele latente cronice, sunt prezeni noduli tuberculoi cazeoi ncapsulai

i exudat gelatinos n jurul vaselor sanguine meningeale i corticale care produce
obstrucie infarcte cerebrale.
De asemenea, la examenul anatomopatologic al sistemului nervos central se
pot observa 3 aspecte: procese de fibrozare, prezena aderenelor care conduc la
obliterare vascular i encefalit, uneori cu procese inflamatorii mielinice, n
special ale nervilor craniali III, IV i uneori VII.
c. Tuberculosa aparatului uro-genital. Este rar la copii i deobicei se
produce ca urmare a reactivrii focarelor de diseminare hematogen din corticala
renal afectat n perioada primoinfeciei.

197
Este cea mai comun form de tuberculoz extrapulmonar, organele uro-
genitale fiind afectate, pe plan mondial, n proporie de 27 %, cu variaii
seminifcative n rile din Africa i Asia. De exemplu, n India tuberculoza
urogenital afecteaz cca 18% dintre paciencii cu tuberculoz extrapulmonar.
Tuberculoza renal. Rinichii sunt organele cel mai frecvent afectate,
incidena ce mai crescut de cazuri nregistrndu-se in rndul populaiei adulte.
Din punct de vedere al mecanispmuli pathogen de realizare a infeciei, este cert c
rinichii se infecteaz, ca urmare diseminrii bacililor tuberculoi pe cale
hematogen din pulmoni, unde este localizat focarul primar n rinichi, sau dup
reactivarea focarului primar pulmonar dup o perioad de laten (69). De regul,
leziunile de tuberculoz se gsesc localizate ntr-un singur rinichi (tuberculoz
renal unilateral) dar sutdiile postmortem din prima jumtate a secolului XX arat
frecvena crescut a tuberculozei renale bilaterale .Cnd infecia s-a realizat pe cale
hematogen leziunile tuberculoase sunt localizate deobicei n cortical sub form de
noduli cu dimensiuni de aproximativ 1,0 mm. de culoare alb definind tuberculoza
renal miliar (Fig.66) (178, 69).

Fig.66 Tuberculoz renal miliar
Fig.67 - Tuberculoz renal n form avansat. Numeroase
granuloame epitelioide n medular cu coninut
caseo-necrotic (stnga) sau zone extinse caze0necro-
tice i calcifieri n medular cu alterri vasculare grave
i necroz papilar (Eastwood J.B., 2001 ).

ntr-o form avansat a bolii, n seciunea medularei renale pot fi observate

granuloame epitelioide cu coninut caseonecrotic care produc dsitrucia esutului
medular, alterri grave ale vaselor i necroz papilar (Fig. 67). Extinderea infeciei
n loja renal produce pielonefrita tuberculoas care, de regul, evolueaz ctre un
proces patologic similar pielonefrozei ccunoscut sub numele de rinichi de ciment
sau rinichi vros (Fig.68).

Fig.68 - Leziuni macroscropice n tuberculoz renal cu focare cazeoase , necrotice i calcifieri ,

etalnd aspect de rinichi vros sau rinichi de ciment

198
Granuloamele din cortical pot s rmn n stare latent timp de 10 15 ani
(101) dar atunci cnd procesele poatologice se reactiveaz coninutul cazeo-necrotic
se elimin formndu-se caviti i fistule care comunic cu formaiunile
pelvicalceale. n acest stadiu se produc distrugeri vasculare n zona papilar, zone
extinse de necroz i n final autonefrectomie ca urmare a distrugerii totale a
parenchimului renal cu extinderea masiv a procesului de calcifiere. n acest stadiu,
sunt prezente procese de scarificare evidente pe toat lungimea rinichiului i
caracterizate prin benzi denivelate, cicatrizate, alternnd cu zone netede de esut
aparent normal.
n seciune, bazinetul renal este dilatat i ncrcat cu cantiti masive de
material cazeos, confirmnd pionefroza
Tuberculoza ureterelor , este rezultatul extinderii infeciei de la rinichi.
Leziunile iniiale apar n vecintatea orificiului uretero-vezical i cu totul
excepional n treimea mijlocie a ureterului. Leziunile de tip proliferativ-productiv,
consitutite n noduli tuberculoi de dimensiuni variabile, produc stricturi ureterale
care conduc la blocarea drenajului urinei din bazinetul renal n vezic i n final la
hidronefroz .
Tuberculoza vezicii urinare, este secundar tuberculozei renale ceea ce
explic prezena primelor leziuni n zona orificiului de legtur al ureterelor cu
vezica urinar. Fazele incipiente ale tuberculozei vezicii urinar se caracte-rizeaz
prin prezena edemelor i proceselor de granulaie localizate n peretele vezical.
n cazurile la care evoluia bolii este grav, se constat, n proporie
semnificativ, procese de fibrozare i obstrucie a orificiului utereterovezical.
Ulterior, procesul patologic avanseaz afectnd stratul musculos prin nlocuirea
acestuia cu esut fibros care produce ngroarea i rigiditatea peretelui vezical.
Macroscopic, vezica urinar, n astfel de cazuri este redus n volum cu
suprafaa denivelat datorit prezenei zonelor calcificate. Fistulele vezicale cauzate
de infecia tuberculoas sunt extrem de rare (8).
Tuberculoz prostatei, este asociat n proporie de peste 85 % cu tuberculoza
renal. Din punct de vedere anatomopatologic, prostata cu leziuni tuberculoase
apare mrit n volum cu suprafaa neregulat datorit formaiunilor nodulare, cu
coninut necrotic cazeos sau calcificat, prezente n parenchimul glandular (Fig.69).

Fig.69 - Tuberculoza prostatei. Sunt prezente numeroase granuloame cazeoase de marimi diferite (Univ.of
Alabama at Birmingham dep. Of Patology)

n cazurile grave, prostata prezint numeroase cavitai de dimensiuni i forme

variate i fistule prin care materialul cazeo-necrotic este drenat spre exterior .
Uneori canalul ejaculator apare ngroat, rigid i obstruat (166).
199

Epididimita tuberculoas. Epididimul se poate infecta fie prin difuzarea

bacililor tuberculoi din focarul primar pe cale hematogen fie prin intermediul
canaliculeleor descendente din prostat.
Fig. 70 - Epididimita tuberculoas; leziuni de orhit i epididimit tuberculoas (Univ. Alabama at
Birmingham Dep.of Pathology).

S-au descris cazuri cu epididimit infecioas ca urmare a trata-mentului

tumorilor vezicale superficiale cu bacilul Calmette-Guerin (BCG) (29).
Prezena granuloamelor tuberculoase, cu coninut cazeonecrotic, zone de
fibroz care conduc la ngroeri ale pereilor canaliculelor i blocarea drenrii
materalului seminal, sunt aspecte morfopatologice caracteristice care se constat
frecvent n epididimita tuberculoas (Fig 65).
Uneori pe lng zone de cazeificare, necroze i noduli calcificai, la examenul
anatomo-patologic se evideniaz i procese de fibrozare ale pungii scrotale (orhi-
epididimita tuberculoas) cu multiple aderene la epididm i testicul.
Tuberculoza testicular, apare ca urmare a extinderii directe a proceselor
patologice din epididim i nvelitorile scrotale n parenchimul testicular i leziunile,
de tip proliferativ granulomatos, sunt prezente n toat masa testicular n diverse
stadii evolutive: de la formele nodulare ncapsulate sau noduli tuberculoi cu
coninut cazeo-necrotic i calcifieri la aspecte cavitare i fistule prin care materialul
necrozat i cazeos este drenat la exterior.
Tuberculoza aparatului genital la femei . Infecia tuberculoas afec-teaz n
proporie diferit toate segmentele aparatului genital femel: ovarele, trompa i
canaluculele Fallop, uterul i cervixul i cu totul excepional vaginul i vulva.
Tuberculoza trompei i canalului Fallop. Practic, n fazele incipiente trompa
i canalul Fallopsunt modificate macroscopic; diametrul canalului Fallop este
aparent normal pe toat lungimea acestuia.
n forma noidular, pot apare modificri structurale similare cu cele din
afeciunea ischiemica nodosa. Peretele tubilor, este mult ngroat, pe unele
poriuni lumenul obstruat, mpiedicnd deplasarea ovulelor ctre cavitatea
uterin.Macroscopic, leziunile sunt de tip granulomatos, cu poriuni exudativ
edematoase iar n fazele avansate, fibroz (Fig.71) i aderene la ovare i celelalte
organe pelviene, afeciune cunoscut sub denumirea de anexit cronic
tuberculoas.

200
 Fig. 71 - Tuberculoz cu localizare n tubul Fallop (Univ.Alabama at Birmingham Dep.of.Pathology).

Tuberculoza ovarelor, reprezint 10 % din totalul cazurilor cu tuber-culoz.

Din punct de vedere lezional, n tuberculoza ovarian predomin procesele fibrotice
cu aderene fimbriale unilaterale sau bilaterale i cu totul neobinuit poate fi
constatat necroza cazeoas.
Endometrita i cervicita tuberculoas, de regul diagnosticul se stabile-te pe
baza biopsiei din focar i de aceea n literatura de specialitate se fac referiri numai
la prezena ulceraiilor, necroza caseoas i hemoragii n mucoasa endometrului
(74).
De asemenea, n faza iniial a bolii, leziunile macroscopice sunt terse,
cervixul aparent este normal.
n fazele avansate ale bolii pot fi observate ulcere, formaiuni nodulare cu
coninut cazeo-purulent sau calcificat (74).

4.1.5.3. Prelevarea, conservarea i expedierea probelor pentru

investigaii de laborator.

1. De la animalele sacrificate pentru diagnosticul tuber-culozei , n

mod obligatoriu, se vor preleva probe pentru investigaii de laborator, indiferent
dac organele sau esuturile examinate anatomo-patologic au fost sau nu
evideniate leziuni care pledeaz pentru infecia tuberculoas.
Aceleai probe vor fi recoltate i vor fi expediate la laborator, n toate cazurile
de sacrificri normale sau de necesitate a animalelor provenite din efective
infectate.
Bovinele destinate pentru tiere normal provenite din efective i gospodrii
indemne, la care au fost depistate leziuni suspecte de tuberculoz, vor face de
asemenea obiectul investigaiilor de laborator pentru precizarea diagnosticului de
tuberculoz.

Nu vor fi exceptate de la exemne speciale pentru diagnosticul tuber-culozei,

bovinele autopsiate n fermele i curile infectate.
Probele prelevate de la aceste animale, destinate examenului pentru
tuberculoz, vor fi mpachetate separat de celelate probe la care se solicit alte
exemen de laborator.
201

n baza examenului necropsic, vor fi prelevate i expediate la laborator urm-

toarele organe i esuturi:
 a. De la anmalele reagente, tiate n scop de diagnostic, precum i cele
destinate sacrificrilor normale dar la care au fost constatate leziuni suspecte de
tuberculoz:
- setul complet de esuturi menionate n fie.
b. de la animalele provenite din efective sau gospodrii infectate la care nu
au fost observate leziuni macroscopice atribuite infeciei tuberculoase (NVL):
probele destinate investigaiilor de laborator vor fi reclotate n funcie de prioritate,
conform precizrilor din tabelul nr. 19
Tabelul:19

Prioriti n prelevarea probelor de la animalele abatorizate, provenind din efective infectate, la care
nu s-au observat leziuni specifice de tuberculoz (NVL).

Prioritate esutul sau organul Localizare anatomic

Esenial L.n. retrofaringeali; Stng i drept
L.n traheobronhici;
L.n. mediastinali. Anterior i posterior
Crescut L.n traheobronhici;
Alte l.n. ale cavitii toracice
Redus L.n. mandibulari, parotidieni iliac medial, Stng, drept;
popli-tei, mamar sau scrotal; Inferiori i superi-ori.
L.n. mezenterici, duodenali, jejunali i
ileocecali;
l.n. hepatici (portali).
L.n. = nod limfatic

n funcie de localizarea i extinderea leziunilor de tuberculoz depistate,

comisia care execut expertiza de abator poate s decid oportunitatea disecrii
esuturilor i organelor afectate. Astfel, dac se observ leziuni de tuberculoz
diseminate n perechile de noduri limfatice regionale, atunci va fi examinat prin
disecie numai nodul lifatic congener iar n cazul organelor (pulmoni, ficat, splin,
intestin etc.) vor fi detaate zone afectate fr a seciona formaiunile tuberculoase
(noduli tuberculoi), care vor face obiectul examenelor de laborator. Disecia i
prelevarea probelor de esuturi i organe se va face pentru fiecare animal n parte,
cu instrumentar steril, evitndu-se contaminarea n timpul examinrii i
manipularii probelor. Seciunile de disecie prevzute a fi practicate pentru
evidenierea leziunilor de tuberculoz sunt:
- noduri limfatice: seciuni distanate la 2 3 mm;
- pulmoni, splin, ficat , rinichi, etc: seciuni la distan de 20 50 mm;
- segmente de intestin: se deschid pe toat lngimea.

2. De la oameni, bolnavi de tuberculoz, pot fi prelevate urmtoarele

materiale patologice pentru investigaii de laborator:
- sput, coninutul abceselor tuberculoase deschise, secreii limfonodale (n
cazul adenopatiilor tuberculoase supurative), exudat pleural i/sau pericardic,
lichid ascitic abdominal, lichid cefalorahidian;
- probe biopsice din organele i esuturile la care exemenele paraclinice au
dovedit prezena leziunilor de tuberculoz.
De la cadavre, n general, se recolteaz fragmente numai din organele i
esuturile afectate, la care prin examene radiologice: RMN, computer tomograf
(CT), etc, s-au constatat leziuni specifice de tuberculoz. De exemplu, dac leziunile
au fost localizate n sistemul nervos central (meningo-encefalit tuberculoas),
atunci anatomopatologul va aborda numai zona capului pentru prelevare de probe.

202

Totui, n medicina uman, se apeleaz numai n cazuri excepionale la

recoltarea de probe de la pacienii decedai din cauza tuberculozei; diagnos-ticul
anatomoclinic nu ridic probleme n comparaie cu diagnosticul tuberculozei la
animale, unde confirmarea prin examene de laborator este obligatorie.

Ambalarea, stocarea i transportul probelor la laborator.

n vederea ambalrii, stocrii i transportului probelor pentru examene de

laborator n direcia tuberculozei, comisia de expertiz trebuie s dispun de:
- suficiente pungi din material plastic sterile, flacoane cu capac filetat din
material plastic sau din sticl (capacitate 200-250 ml.);
- soluie saturat boricat sau tetraborat de sodiu (borax) pulvis;
- sfoar i cear pentru sigiliu, sau sigiliu metalic;
- fie, etichete, imprimante pentru notarea datelor de identificare a probelor;
- echipamente frigorifice portabile sau staionare care s asigure tempe-raturi
ntre +4C i 1oC.
Probele destinate investigaiilor de laboator se preleveaz i se amba-leaz
separat n pungi din material plastic, cnd transportul la laborator se realizeaz
imediat, sau n flacoane cu sol. saturat boricat, cnd transportul se realizeaz n
condiii de refrigerare i cand exist riscul de contaminare a probelor cu ali
germeni din mediul ncomjurtor. Dac la locul de recoltare a probelor exist
echipament de refrigerare , probele ambalate n pungi din material plastic , cu
excepia celor destinate examenului histopatologic, recoltate n flacoane cu 10 %
formalin, pot fi meninute la -10C cel mult 24 de ore pn la expediere spre
laborator.
Utilizarea soluiei boricate saturate sau tetraboraxului sodic se recomand n
cazurile cnd se constat o contaminare masiv a probelor cu germeni de asociere i
cnd este necesar meninerea unei viabiliti optimale a bacililor tuberculosei.
Fiecare prob, ambalat separat, va fi etichetat i sigilat folosisnd modelul
de etichet alturat (Fig.72).

Specia..................... Sex................ Vrsta .................

Nr. de identificare (matricol)................................................................................
Proprietar (numele i adresa)................................................................................
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Felul probelor i zona anatomic de recoltare......................................................
..............................................................................................................................
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
Data prelevrii........................... Locul prelevrii (Abator, ferma, curte, unitate
medical,etc)..............................................................................................................
Data ambalrii...........................Conservant utilizat..............................................
Data expedierii la laborator...........................Analize solicitate............................
Semntura i parafa medicului......................... Sigilu nr.....................................

Fig.72 - Model de etichet pentru identificarea probelor expediate la laborator n vederea precizrii
diagnosticului de tuberculoz.

Dac comisia decide prelevarea de probe pentru examen histopatologic,

imediat dup expertiza de abator, se vor selecta fragmente din fiecare organ sau
esut n grosime de 5,0 mm. cu leziuni, care vor fi depuse separat n flacoane cu
10% formalin, etichetate n acelai mod ca pentru probele destinate examenului
bacteriologic .
203
Transportul probelor la laborator trebuie s se fac de preferin ntr-un
interval de cel mult 6-8 ore de la recoltarea i ambalarea acestora, n containere
speciale care asigur condiii de refrigerare de +4C pe toat perioada
transportului i de biosecuritate maxim. Containerele utilizate la transportul
probelor trebuie s fie confecionate din material care poate fi decontaminat cu
uurin.
Dac transportul probelor se face la distane ce depesc 500 km. i
temperaturile abientale depesc 22-25C, ambalarea probelor se va face n
recipieni cu tetraborat sodic (borax), asigurndu-se condiii de refrigerare pe toat
durata transportului.
Pe containerul cu probe sigilat se va aplica o eticheta cu meniunea:Atenie!
Material infecios. Se va deschide numai n spaiu care asigur condiii de
maxim biosecuritate.
Alte precizri care se refer la condutita sanitar veterinar n cazul depistrii
accidentale de animale cu leziuni de tuberculoz pe fluxul de tieri normale, sunt
cuprinse n Normele tehnice de aplicare a Legii nr. 60/1974, completat cu Legea
nr. 75/1991, cu privire la Diagnosticul, prevenirea i combatrea tuberculozei la
animale.
4.2. METODE DE CONFIRMARE A TUBERCULOZEI.

Confirmarea diagnosticului de tuberculoz presupune evidenierea i

identificarea micobacteriilor n materiale patologice prelevate de la animale i
oameni infectai cu aceste microorganisme.
Metodele de evieniere a micobacteriilor se bazeaz pe afinitatea lortinctorial,
proprietate care le difereniaz de alte microorganisme, prin aceea c, acestea sunt
rezistente la decolorare cu alcool i acizi, motiv pentru care, n preparatele colorate
prin tehnica apar colorate n rou fa de ali germeni i componente tisulare care se
colo-reaz n albastru.
Evidenierea i identificarea bacililor aparinnd complexului Mycobacterium
tuberculosis pot fi utlizate att pentru diagnosticul tuberculozei active, prin
detectarea micobacteriilor n tractusul respirator (tuberculoza pulmonar) dar i
pentru diagnosticul tuberculozei extrapulmonare prin evidenierea micobacteriilor
din probe prelevate din alte organe i esuturi.
n practica medical i veterinar sunt utilizate dou categorii de metode
pentru diagnosticul tuberculozei :
- metode bacteriologice convenionale sau clasice: bacterioscopia direct din
amprente colorate pentru microorganisme alcool-acido rezistente (BAAR),
adenozin deaminanaza izolarea (ADA) i identificarea micobacteriilor n cultur
bacteriologic.
- metode moderne de detecie i identificare a micobacteriilor : metode
automate de cultur a micobacteriilor (sisteme BACTEC, sisteme Versa-TREK ,
BacT/Alert 3D); metode de biologie molecular: Reacia Lanului polimerazic
(PCR) , Testul Direct M.tuberculosis Amplificat (AMTD), Testul Amplicor MTB,
Testul BD Probe Tec ET); Metode genetice de identificare (Analiza restriciei
Enzimatice (PRA), Probe DNA, INNO LiPA-Mycobacteria, Genotiparea
Mycobacterium i metode de secveniere genetic).
Dac n rile dezvoltate din punct de vedere economic, metodele moderne
sunt aplicate curent, n rile slab dezvoltate sau n curs de dezvoltare, lipsite sau cu
resurse financiare i materiale insuficiente, microscopia amprentelor pentru
bacili

204
alcool-acido-rezisteni (BAAR) i cul-tura bacteriologic pe mediul Lwenstein-
Jensen sunt considerate stand-arde de aur pentru diagnosticul tuberculozei
active.
Metodele convenionale constituie baza diagnosticului bacteriologic al
tuberculozei n medicina veterianar nu numai n rile n curs de dezvoltare dar i
n multe ri puternice din punct de vedre economic.

4.2.1. Metodele bacteriologice convenionale (clasice).

Metodele bacteriologice convenionale (clasice): bacterioscopia direct a

amprentelor pentru bacili alcool-acido-rezisteni (BAAR) i cultura bacteriologic,
au aplicabilitate nu numai pentru doagnosticul tuberculozei dar i pentru
monitorizarea pacienilor n perioada tratamentului antituberculos, n special
pentru testarea rezistenei micobaceriilor la medicamnetele folosite. De asemene
ele sunt necesare pentru detectarea persoanelor cu risc crescut de transmitere a
infeciei.

4.2.1.1. Examenul microscopic direct al amprentelor pentru BAAR.

Cu toate avantajele (metod rapid i cu pre de cost redus), microscopia

amprentelor pentru BAAR are sensitivitate redus, n special la copii i la
persoanele infectate HIV/SIDA.
G u p t a M. A. e t a l .,2004 (88), arat c 2/3 dintre cazurile cu amprent din
sput pozitiv rmn nedetectate prin aceast metod. Utilizarea ei depinde de
calitatea materialului patologic, de concentraia micobacteriilor n materialul
patologic i de performanele calitative ale laboratorului.
Indiferent de felul materialelor patologice: esuturi (noduri limfatice,
fragmente de organe, atc.) sau secreii (sput, scurgeri nazale, splturi traheo-
brohice, lapte, scurgeri vaginale, sperm coninut cazeo-purulent din granuloame
tuberculoase, acestea necesit o pregtire prealabil pentru investigaii
bacterioscopice i cultur bacteriologic.

Materiale necesare

Pentru pregtirea, prelucrarea i examinarea produselor patologice sunt

necesare:
- bisturiu, foarfec, pense anatomice, tvie pentru necropsie, mnui
chirurgicale. Se recomand ca pentru fiecare set de probe s existe instrumentarul
adecvat sterilizat.
- lup frontal;
- pipete, lame de microscop sterile i ans de nsmnare bacteriologic cu
circumferina buclei calibrat astfel nct s colecteze o cantitate suficient de
material patologic;
- baterie de colorani cu suport pentru lame;
- bec Bunzen i incint pentru lucru n condiii sterile;
- microscop optic cu imersie i echipament pentru examinare n lumin
fluorescent;
- mediile de cultur i reactivii necesari izolrii i identificrii micobacteriilor.
ndat dup sosire la laborator, probele destinate investigaiilor n direcia
tuberculozei, se verific sub raportul identitii corecte.

205
 Probele de esuturi i organe, se elibereaz din ambalajul de protecie i/sau
se ndeprteaz materialul conservant i se depun n tviele de necropsie, notndu-
se numrul de identificare al probei i zonele anatomice de provenien (noduri
limfatice retrofaringeale, submandibulare stng i/sau drept, noduri limfatice,
fragmente de organe i esuturi, etc.).
Fiecare nod limfatic, organ, esut sau fragmente din acestea, dac sunt
suficient dimensionate, se examineaz munuios la exterior, notndu-se eventuale
leziuni constatate (infiltraii seroase, fibrinoase, aderene, densificri, etc.).
Se ndeprtaeaz cu atenie esutul adipos astfel nct capsula nodurilor
limfatice, splinei, ficatului, rinichilor, etc. s rmn intact.
Fiecare nod limfatic, organ sau fragment de organ va fi supus unui examen de
suprafa prin vizualizare (dac este necesar, folosind lupa frontal) i prin
palparea ntregii suprafee, notndu-se modificrile constatate (volum, culoare,
consisten, etc.).
n continuare, dac volumele organelor, esuturilor ori fragmente din acestea
permit, se execut incizii transversale (n nodurile limfatice, la dis-tan de 2-3
mm.) i longitudinale n celelalte organe i esuturi la distan de 0,5-1,o cm i se
nregistreaz leziunile constatate.
Pregtirea secreiilor contaminate cu micobacterii pentru examenul
microscopic al amprentelor.
Secreiile (sputa, scurgerile nazale, lavajele traheobronhice, lapte, secre-ii
vaginale, sperma, material cazeo-purulent) sunt cele mai comune materiale
patologice care se expediaz la laborator pentru diagnosticul tuberculozei la
animale i oameni.
n general aceste produse prezint consisten crescut i, n acelai timp,
numrul microorganismelor/ml de produs este destul de redus astfel c, de cele mai
multe ori, la examenul bacterioscopic se obin rezultate fals negative .
De aceea, cercetrile n domeniu au estimat c un numr minim de 5000-
10000 bacili/ml. de sput ar fi suficient pentru a crete sensitivitatea microscopiei
amprentelor de la 50 % la pste 80 % . Cu toate acestea, valoarea diagnostic a
microscopiei directe pe amprente din materiale patologice pentru micobacterii au
rmas mult vreme sub nivelul ateptrilor, motiv pentru care numeroase studii s-
au focalizat asupra mbuntirii performanelor acestei metode.
Astfel, n literatura de specialitate sunt descrise mai multe metode de
concentrare a secreiilor dup lichefierea prealabil a acestora.
Lichefierea i concentrarea secreiilor destinate examenului bacterios-copic
direct pentru BAAR.
Metodele chimice de lichefiere se aplic n funcie de scopul urmrit:
evidenierea direct a micobacteriilor n amprente sau cultur bacteriologic. De
exemplu, lichefierea sputei cu hiploclorit de sodiu (NaClO) este frecvent utilizat
cnd materialul patologic urmez a fi concentrat i examinat prin metoda bleach
microscopy pentru prezena BAAR dar nu este rcomandat pentru cultura
bacteriologic.
De aceea, au fost descoperite alte metode de lichefiere i concentrarea a
materialelor patologice semifluide utiliznd hidroxid de sodiu- N- acetil-L- cistein
care permite examinarea BAAR att prin amprent ct i n cultur bacterilogic.
Alte metode, folosesc diverse substane pentru lichefierea i concentrarea
sputei prin sedimentarea sau centrifugare, cum ar fi: dithio-threitol (152), chitina
(70) i C(18)- Carboxypropylbetaina (200 ).

206
 S t e i n g a r t e t a l ., 2006 (214), verificd metodele chimice de lichefiere i
concentrare, au demonstrat creterea semnificativ a sensitivitii acestora fa de
examinarea direct a amprentei din sput neconcentrat.

Examenul bacterioscopic.

Indiferent de materialul patologic (amprente directe din esuturi, din produse

patologice fluide sau din cultur bacteriologic) i de tehnicile de colorare folosite, etapele
de execuie a preparatelor microscopiec sunt urm-toarele:
- etalarea materialului patologic pe lama microscopic;
- uscarea i fixarea preparatelor microscopice;
- colorarea preparatelor.

a. Etalarea materialului patologic pe lama de microscop.

Se execut n funcie de modul de prezentare a produselor patolgice:

- din seciunile de organe i esuturi, se fac amprente pe lame (marcate cu
numrul de identificare al probei i indicativul organului) prin presare din fiecare
zon n care au fost constatate: congestii, infiltraii cazeificri, densificri, etc. n
cazul n care focarele sunt ncapsulate i calcifiate, acestea se detaeaz de restul
esutului i etalarea se realizeaz prin strivire ntre duou lame;
- din secreii i material purulent, suficient de fluide, etalarea se realizeaz
prin depunerea materialului pe suprafaa lamei n pictur cu ajutorul pipetei
sau ansei de nsmnare.
Aceeai tehnic se folosete i n cazul produselor patologice solide (organe i
esuturi) care dup mojarare au fost prelucrate prin lichefiere i concentrare
dup metodele cunoscute.
Dispersia materialului patologic se va face pe o arie a lamei suficient de
ntins astfel ca s rezulte o pelicul subire uniform pe toat suprafaa acesteia
(exceptnd zona de marcare). Din fiecare seciune i zon cu leziuni vor fi efectuate
un numr de peste dou lame, care vor constitui rezerv pentru eventuale graeli de
colorare i prob de contraexpertiz.

b. Uscarea i fixarea preparatelor microscopice. ndat dup etalare,

lamele se de depun pe o suprafa plan n incinta steril, cu faa coninnd pelicula
de material patologic n sus pentru uscare. Timpul de uscare depinde de grosimea
peliculei. Dup uscarea complet a materialului pe toat suprafaa lamei, se execut
fixarea prin trecerea de 3 4 ori n flacr, timp de 3 - 5 secunde. Operatorul
trebuie s execute aceast opera-iune cu atenie pentru a evita supranclzirea
lamei i deteriorarea sau desprinderea peliculei.
Lamele astfel fixate, pot fi supuse tehnicilor de colorare imediat sau pot fi
pstrate corespunztor (ferite de umezeal, cldur execesiv, radiaii), pentru
colorare i examinare ulterioar.

c. Tehnici de colorare a micobacteriilor.

O categorie de microorganisme , denumite acido - reistente, sunt dificil de

colorat prin metodele clasice standard.

207
 Aceste microorganisme necesit procedee speciale de colorare care ajut la
diferenierea lor de alte genuri microbiene. Genurile Mycoibacterium i Nocardia
sunt dou exemple care nu pot fi evideniate dect prin proceduri de colorare
speciale, denumite acido-rezistente.
Celulele micobacteriilor sunt rezistente la colorani convenionali cum ar fi:
coloraia Gram. Aceast rezisten se datoreaz coninutului ridicat de lipide n
peretele celular care resping coloranii standard.

Tehnici de colorare la cald .

Sunt cel mai frecvent utilzate n laboratoarele de diagnostic al mico-

bacteriozelor.

1. Coloraia Ziehl-Neelsen (metoda clasic), a fost descris pentru prima dat

de cercettorii germai Franz Ziehl i Friederich Neelsen. Este recomandat n toate
lucrrile de specialitate i descris n Manualul OIE pentru metode de diagnostic
standard i n Directivele WHO pentru diag-nosticul i eradicarea tuberculozei.

Metoda utilizeaz colorarea preparatelor la cald cu o soluie de fucsin

fenicat, alcool-acid i albastru de metilen. Cu toate c n prezent metoda este larg
utilizat, ea are dezavantajul c prin nclzirea fuxinei n procesul de colorare se
degaj vapori fenolici toxici i din acest motiv apare tot mai frecvent tendina
nlocuirii ei cu alte metode colorare la rece.
- Prepararea culoranilor.
- Fuxina bazic :
- fuxina bazic (cristale)...............................................................1,0 g.
- alcool etilic 90 - 96..................................................................10,0 ml.
- fenol............................................................................................ 5,0 ml.
- ap distilat...............................................................................90,0ml.
Se dizolv fuxina n alcool prin mojarare i ntreaga cantitate se depune ntr-
un vas din sticl de culoare brun.
Se nclzete feonlul cristalizat la 41C, din care se recolteaz 5,0 ml. cu o
pipet nclzit i se amestec cu 20,0 ml. ap distilat. Se adaug restul de ap
distilat,dup care, ntreaga cantitate se deverseaz peste fuxina prepa-rat. Se
agit i menine 24 de ore la 37C., dup care, se filtreaz prin hrtie de filtru n
momentul utilirii.
- Albastru de metilen:
- albastru de metilen..................................................................... 1,0 g.
- alcool etilic de 96C................................................................ 10,0 ml.
-fenol............................................................................................ 2,0 ml.
- ap distilat.............................................................................. 90,0 ml.
Se prepar n acelai mod ca i fuxina bazic.
- Alcoolul acid :
- acid clorhidric sau sulfuric concentrat.......................................3,0 ml.
- alcool etilic de 70 ................................................................... 97,0ml.
Amestecul se realizeaz turnnd acidul peste alcool.

208
 - Alcoolul etilic de 70C. :
- Alcool etilic de 96................................................................ 365,0 ml.
- ap distilat.............................................................................135,0 ml.
Pentru prepararea soluiei de alcool, se poate folosi alcoolul medicinal.

Tehnica de lucru.

Se acoper lama cu 3-4 ml. de fuxin i se nclzete prin traversarea flcrii

de 3-4 ori, timp de 10 minute, pn la emisia de vapori, fr ca fuxina s ating
punctul de fierbere pentru a evita formarea precipitatelor sau desprinderea
peliculei de pe lam. Dac este necesar, n timpul nclzirii, cantitatea de fuxin de
pe lam poate fi completat. Pentru reuita operaiei, se recomand aezarea
lamelor pe un suport n poziie perfect orizontal.
Dup expirarea termenului de contact cu fuxina, lama se spal la robinet cu
jet slab pentru ndeprtarea colorantului.
Se ndeprteaz excesul de ap i lama se supune decolorrii prin acoperirea
suprafeei cu soluie alcool-acid timp de 2 minute.
Se ndeprteaz decolorantul, se spal lama i se analizeaz sub raportul
culorii; frotiul trebuie s fie aproape incolor cu tent uor roz, dac frotiul rmne
intens n rou, se va repeta decolorarea.
Recolorarea, se realizeaz prin acoperirea lamei cu soluie de albastru de
metilen 1,0 % timp de un minut punnd n eviden elementele celulare i eventual
flora bacterian de asociaie, codiie esenial n stabilirea gradului de contaminare
a probelor cu astfel de germeni. Dup expirarea timpului de contact cu colorantul,
lama se spal la robinet, apoi cu ap distilat i se menine n repaus pn a uscare
complet, cnd preparatul poate fi examinat la microscopul optic cu obiectiv de
imersie.
Unele laboratoare de specialitate, utilizeaz metoda de colorare Ziehl-Neelsen
n diverse variante:varianta cu verde de malachit i varianta cu acid picric, care
coloreaz fondul frotiului verde i respectiv galben.
Pentru colorarea corect a frotiurilor, se vor respecta umtoarle condi-ii:
- nu vor fi folosite soluii colorante alterate, prezentnd depozite de
precipitate sau dac acestea precipit spontan pe lam;
- nu este permis colorarea mai multor lame la un loc, n bi de colorare,
deoarece se pot comite erori de diagnosit prin transfer departicule de pe un frotiu
pe altul;
- ndeprtarea soluiilor colorante trebuie s fie complet.
2. Metoda de colorare Katon-Kazmer , este asemntoare cu metoda Ziehl-
Neelsen clasic, cu deosebirea c fuxina este nclzit pe baie cu ap.
3. Metoda Holberg , folosete pentru colorare o soluie de cristal violet n
locul fuxinei.
4. Metoda Murohashi-Yoshida, este denumit i metoda vital, permind
diferenierea bacililor tuberculoi vii de cei mori, prin colorarea difereniat a
acestora.
Dup etalare, uscare i fixare, frotiul se menine 5 minute ntr-o soluie verde
de malahit 1,o % nclzit la 50 - 60C . (n baie de ap).
Se scoate lama i se rcete la temperatura camerei timp de 10 minute; n
acest timp se acoper cu aceeai soluie de verde de malahit meninut la
temperatura camerei, pentru a preveni uscarea lamei.

209
 Se spal lama la jet slab de ap i se recoloreaz cu o soluie de fucsin 1/10
( aceeai soluie utilizat n colorarea Ziehl-Neelsen) timp de 5 minute, apoi se
spal.
Urmeaz o decolorare special care nu trebuie s depeasc 20 - 30 de
secunde.
Dup splare, lama se examineaz la microscopul optic cu obiectivul de
imersie.
Interpretarea rezultatelor . Micobacteriile vii vor aprea colorate n verde iar
cele moarte vor fi colorate roz.
Rezultatele se interpreteaz raportnd numrul bacililor vii i numrul
bacililor mori la 100 de germeni numrai.
Not: Frotiurile trebuie examinate imediat dup colorare deoarece coloraia
dispare complet dup 24 de ore.
Metoda este deosebit de util n laboratorul de bacteriologie pentru aprecierea
patogenitii i virulenei mycobacteriilor, pentru determinarea dozei infectante i
realizrii cu succes a culturilor bacteriologice precum i n aprecierea eficienei
decontaminrilor.

Tehnici de colorare la rece.

Aceste metode utilizeaz substane tensioactive sau alte procedee care
faciliteaz ptrunderea colorantului n peretele celular, fr nclzire. Adugarea
dimetilsulf-oxidului (DMSO) la soluia de fucsin, permite ptrunderea
colorantului n peretele celular chiar la temperatura camerei.
1. Meoda Kinyoun , este o metod de colorare a bacteriilor acido-rezistente, n
special micobacteriile. Tehnica de colorare este similar cu metoda Ziehl-Neelsen
clasic cu diferena c nu folosete fucsina nclzit. In prima etap, metoda
Kinyoun folosete fucsina fenicat la rece, urmat de decolorare cu o soluie
alcoolic de acid i apoi contracolorarea cu albastru de metilen. Fucsina fenicat
are o concentraie crescut de fenol i fucsin bazic.
La examinarea microscopic a preparatului, microorganismele acido-
rezistente apar colorate n rou i cele lipsite de acido-rezistent albastre.
Tehnica de lucru.
- se acoper complet lama cu fucsina fenicat Kinyoun pentru 5 minute;
- splare uoar cu ap pn la clarificarea preparatului;
- se acoper complet lama cu alcool-acid ( 3% HCl n etanol) pentru 3 min;
- splare uoar cu ap pn la clarificare;
- acoperirea complet a lamei cu akbastru de metilen pentru 3 minute;
- uscarea lamelor la temperatura camerei;
n cazul microorganismelor slab acido-rezistente, cum este genul Nocar-dia,
decolorarea preparatelor poate fi fcut cu soluie 1,0 % acid sulfuric care
nlocuiete acidul clorhidric.
2. Tehnica Tan Thian Hok, utilizeaz dou soluii gata preparate pentru
colorare fr nclzire, timpul de colorare fiind de 3 minute.
Frotiul fixat este colorat timp de 3 minute cu soluie de fucsin Kinyoun
concentrat 4 x ( 40,0 g. fucsin, 80,0 ml. fenol, 200,0 ml. alcool etilic de 96 i
1000,0 ml. ap distilat).
Dup splare se face decolorarea i recolorarea timp de 1 minut cu soluie
Gabett ( 1,0 g albastru de metilen, 200,0 ml. acid sulfuric , 300,0 ml. alcool absolut
de 96 500,0 ml. ap diatilat).

210
 Dup o nou splare, frotiul se usuc i se examineaz la microscopul optic cu
obiectivul de imersie

3. Tehnica Mrgineanu.

Pe frotiul fixat, se depune fuxina fenicat la care se adaug xilol n cantitate

aproximativ egal.
Se las s se amestece cele dou soluii la temperatura camerei timp de 3
minute; amestecul fuxinei cu xilolul se evideniaz prin efervescen ca urmare a
diferenei de tensiune superficial.
Dup amestecarea complet a celor dou soluii, se procedeaz identic ca la
coloraia Ziehl-Neelsen clasic.
4. Metoda de colorare fluorescent
Este o metod de colorare la rece care folosete diverse substane denumite
fluorocromi, cum sunt: auramina i rodamina (24).
Este obligatoriu ca lamele pe care se execut pereparatele s fie curate, fr
fluorescen proprie.
a. Metoda de colorare cu Auramid O
Prepararea coloranilor pentru fluorescen.

- Soluia de Auramin O: 0,1 g Auramin O se dizolv n 10,0 ml. etanol

95%;
- Soluia de fenol: se dizolv 3,0 g fenol cristale n 87,0 ml. ap distilat.
Se amestec cele dou soluii.
- Soluia alcoolic de acid: Se adaug cu atenie 0,5 ml. acid clorhidric (HCl)
concentrat la 100,0 ml. etanol 75%;
- Permanganatul de potasiu (KMnO4): se dizolv 0,5 g permanganat de
potasiu (KmnO4) n 100,0 ml ap distilat.
Not: Permanganatul de potasiu (KmnO4) poate fi nlocuit cu o soluie de
Acridin Orange (AO) ( 0,01 g AO n 100,0 ml. ap distilat n care s-a dizolvat 0,01 g
fosfat de sodiu dibazic anhidru). Timpul de contact pentru contracolorare este 2
minute.

Tehnica de lucru.

Amprentele preparate din produse patologice suspecte de contaminare

cu micobacterii, uscate la temperatura camerei, se fixeaz pe un suport electric la
65-7oC timp de cel puin 2 ore , sau la flacra becului de gaze Bunzen - Burner.
Not: Se va evita supranclzirea lamelor .
Dup fixare, lamele vor fi acoperite cu sol. Auramin O i meninute timp de
15 minute pentru colorare. Operatorul trebuie s se asigure c Aura-mina O s-a fixat
de suprafaa lamei.
Not: Nu se va folosi cldura pentru evaporarea colorantului i nici hrtie
de filtru pentru uscare.
n continuare, se spal lamele cu ap declorinat. Pentru a evita nregistrarea
de rezultate eronate datorit posibilei interferene a clorului din ap cu
fluorocromul, se recomand splarea preparatelor cu ap distilat.
Dup splare, se acoper lamele cu soluie alcoolic de acid clorhidric i se
las pentru decolorare timp de 2 minute.

211
 Urmeaz o nou splare i uscare a preparatelor.
Se acoper lamele cu soluie de permanganat de potasiu care va rmne n
contact cu preparatele timp de 2 minute pentru decolorare. Timpul de contact cu
permanganatul de potasiu este foarte important, pentru c o contracolorare
prelungit duce la stingerea flurescenei bacililor acido-rezisteni.

b. Metoda de colorare cu Auramin O i Rodamib B . Tehinca de lucru este

asemntoare cu cea cu Auramin O, dar intervin cteva modificri importante:
- Soluia de Auramina O+ Rodamin B se prepar din: 1,5 g Auramin O i
0,75 g Rodamin B dizolvate n 75,0 ml. glicerin, 10 ml. fenol cristale nclzit i
50,0 ml. ap distilat. Soluia se filtreaz pe vat de sticl;
- Soluia de permangat de potasiu nu poate fi nlocuit, n acest variant, cu
Acrodin Orange (AO).
Dup coloare i uscare, frotiurile se examineaz la microscopul cu
fluorescen (HBO-200 i trusa de filtre de excitaie adecvate pentru intensificarea
fluorescenei coloranilor, filtre de absorbie adaptabile la ocularele microscopului
pentru selectarea luminii fluorescente emis de coloranii folosii) Examinarea
preparatelor se face n camer ntunecat.
Metoda de colorare fluorescent a micobacteriilor acido-rezistente se
folosete pentru evidenierea bacililor tuberculoi din leziunile pulmonare.

Examenul microscopic al preparatelor .

Pentru examinarea preparatelor colorate Ziehl- Neelsen, va fi utilizat un

microscop cu lumin clasic, dotat cu obiective de imersie 100x i de 90x i oculare
10x, respectiv 7x. Se consider avantajoas examinarea cu Ob.90 i Oc. 7x deoarece,
dei puterea de mrire este 630 ori, acest mod de examinare favorizeaz
cuprinderea n cmpul microscopic a unei suprafee de 4 0ri mai mare i timpul de
lucru se reduce cu 60% .

Tehnica examinrii.

Se aeaz lama pe platanul microscopului i pe una din marginile fro-

tiului se depune o pictur de ulei de cedru fr a atinge cu vrful picurtorului
suprafaa frotiului.
Se centreaz cmpul microscopic i intensitatea luminii i se obine claritatea
imaginii cu ajutorul microvizei microscopului.
Examinarea propriuzis a frotiului se realizeaz parcurgnd un numr
suficient de cmpuri, pentru a spori indicele de evideniere a bacililor alcool-acido-
rezisteni (BAAR), mai ales n produsele paucibacilare.
Cunoscnd c numrul de cmpuri microscopice pe lungimea unei lame este
aproximativ 100, se ncepe examinarea din marginea dreapta sus, se parcurge toat
lungimea frotiului urmnd apoi un traseu pe linia median de la dreapta la stnga i
apoi marginea de jos a frotiului pe direcia stnga dreapta (Fig.73 a), sau pornind
din punctul stnga sus, se urmrete un traseu n zig-zag pn laextremitatea
dreapt a lamei (Fig. 73 b)
Cnd pe un preparat au fost depistai bacili alcool-acido-rezisteni (BAAR),
acetia vor fi numrai i vor fi raportai la numrul de cmpuri examinate. De
exemplu, dac la 100 de cmpuri au fost numrai 1-3 bacili, examinarea va fi
extins, la 300 de cmpuri.

212
 Nr. Nr.

a b

Fig. 73 ( a,b) - Modaliti de examinare microscopic a frotiului pentru evidenierea bacililor

tuberculozei.

Dac bacilii se gsesc n fiecare cmp microscopic, acetia vor fi numrai n

25 de cmpuri, adic pe din lungimea frotiului.
n coloraia Ziehl-Neelsen, micobacteriile apar sub form de bastonae,
drepte sau uor curbate, cu lungimea de 1-4 i grosime de 0,3 0,6 , grupate
caracteristic, n palisad sau solitare (Fig.74). n preparatele realizate din esuturi
pot fi observai bacili grupai n citoplasma macrofagelor.

a b c

Fig. 74 - Bacili alcool-acido-rezisteni aparinnd M. bovis (a) i M.tuberculosis (b,c)

preparate din secreii traheobronhice i sput col. Ziehl-Neelsen.

Bacilii aparinnd M. bovis sunt mai scuri, se coloreaz mai slab i prezint
granulaii. n mod obinuit bacilii tuberculozei se coloreaz unifom n rou
strlucitor. Se pot ntlni i forme variate: cocoide, cocobacilare sau pseudomicelii ,
denumite n literatura de specialitate forme L, gsite mai ales n leziunile
tuberculoase vechi.

Examinarea preparatelor n lumin fluorescent.

Lama colorat cu fluorocromi se fixeaz pe platanul microscopului cu lumin

fluorescent i se examineaz fr imersie cu Ob. 20 x i Oc. 10 x.
Pe fondul ntunecat al preparatului, micobacteriile apar colorate n galben
portocaliu strlucitor, forme bacilare, uor curbate sau granulate sugernd un
rezultat pozitiv pentru proba analizat (Fig.75) .

213
 Fig.75 - Mycobacterium tuberculosis n preparat col. cu flurocromi.

Artefactele (precipitate,, depuneri de praf, striaii ale lamei, etc.) pot aprea
uneori fluorescente dar aceste sunt de culoare verde intens, fr tent glben-
portocalie.
Metoda de examinare n lumin fluorescent este mai laborioas dect
metoda n lumin optic, permind examinarea a numai 30 de cmpuri n 1-2
minute fa de 300 de cmpuri examinate n acelai interval de timp prin
microscopie n lumin clasic.
Pe de alt parte, examinarea n lumin fluorescent necesit o bun pregatire
tehnic a cadrelor de specialitate.
Metoda n lumin fluorescent este utilizat pentru triaj; probele negative
fiind eliminate iar cele pozitive urmnd s fie examinate n microscopie cu lumin
optic, dup colorare prin metoda Ziehl-Neesen clasic sau n varianta Kinyoun.

Evaluarea rezultatelor examenului microscopic.

Rezultatul examenului microscopic este exprimat prin prezena sau absena

bacililor acid-alcool-rezisteni (BAAR) n preparat.
Exprimarea rezultatelor rezultatelor se va face n funcie de numrul de
bacili prezeni n cmpurile examinate, astfel:
- nici un bacil/100 cmpuri = Negativ;
- 3 - 9 bacili/100 cmpuri = Pozitiv;
- 10-100 bacili/100 cmpuri = Moderat pozitiv;
- peste 100 bacili/100 cpuri = Intens pozitiv.

214
 Acest sistem de evaluare a rezultatelor are importan deosebit n
aprecierea gradului de infecie n populaiile umane sau n efectivele de animale din
care au provenit probele, n stabilirea indicelui de risc n transmiterea infeciei la
populaii sau efective necontaminate (risc crescut pentru animale i oameni n cazul
probelor moderat i intens pozitive, unde probabilitatea eliminarii bacililor
tuberculoi n mediul exterior, conform datelor din literatura de specialitate, este de
98 100 %) (62, 215, 216).
De asemenea, acest sistem de evaluare a rezultatelor are un rol important n
stabilirea ulterioar a conduitei de izolare, identificare i aprecierea patogenitii
tulpinilor reprezentanilor complexului Mycobacterium tuberculosis din probele
respective.

Factorii care influeneaz probabilitatea rezultatelor pozitive .

Principalii factori care influeneaz probabilitatea rezultatelor pozitive sunt:

a. Numrul de bacili pe frotiul examinat, este n strns corelaie cu
concentraia de bacili din produsul patologic. n acest context, se apreciaz c pe
suprafaa unei lame de 20 x 10 mm. se poate etala cu aproximaie 0,5 1,0 g.
produs patologic din esuturi i 0,01 ml. din suspensie din materiile fluide cu ansa
metalic, avnd diamterul buclei de 3,0 mm., ceea ce nseamn c pe suprafaa de
200 mm sunt ncadrate arpoximativ 1000 cmpuri microscopice. Astfel, dac la
100 de cmpuri s-a observat un bacil, nseamn c produsul patologic va conine
probabil 10.000 de bacili/ml. Aceast relaie depinde n foarte mare msur de
tendina micobacteriilor de grupare n grmezi i n acest situaie exist riscul ca
germenii s fie observai n toate ele 100 de cmpuri;
b. Numrul de cmpuri, numrul de eantioane i numrul de lame
examinate , influeneaz considerabil rezultatele, astfel:
- examinarea a mai puin de 50 de cmpuri microscopice, crete riscul unor
erori de diagnostic. Din acest motiv, este obligatorie examinarea a peste 100 de
cmpuri pe fiecare lam;
- numrul de eantioane din aceeai prob sporete ansele de evideniere a
bacililor. Practic, s-a demonstrat c atunci cnd au fost examinate mai mult de dou
eantioane, procentul de pozitivitate a crescut cu pn la 20% ;
- numrul de lame examinate din fiecare eantion influeneaz de asemenea
procentul de pozitivitate. S-a constat c examinarea a unui numr minim de 2-4
lame/prob crete procentul de pozitivitate de la 16,9% la 19,0%.

Cauzele erorilor n examenul bacterioscopic .

Frecvena crescut a erorilor care survin n timpul operaiunilor de pregtire,

prelucrare i examinare a probelor determin negistrarea de rezultate fals pozitive
i/sau fals negative.
a. Rezultate pozitive .
Rezultatele fals pozitive pot fi cauzate de:
- prezena pe lame a unor particule acido- rezistente, care rein fucsina n
coloraia Ziehl-Neelsen i se coloreaz asemntor cu micobacteriile.

n ceast categorie se ncadreaz: particule alimentare, uleiuri, ceruri, precipitate

organice, alte microorganisme, diverse materii organice i artefacte;
- gradul de uzur avansat al lamelor striaii, zone de matitate, etc.) ,
reinnd fucsina genereaz confuzii pentru un examinator neexperimentat. Aceleai
erori inevitabile se pot nregistra i n cazul examenului n lumin fluorescent;
215
 - prezena de microfibrile textile, hrtie de filtru, granule de polen, alte
impuriti, care pot da imaginea unor bastonae de dimensiuni diferite, forme
cocobacilare sau cocoide, colorate similar cu micobacteriile, care pot fi uor
confundate cu acestea;
- prezena sporilor de Bacilus subtilis, care rein fucsina dar care au forma
ovoidal cu dimensiuni mai mari dect bacilul tuberculozei dar care pot fi
confundate cu formele L ale M. tuberculosis. De semenea, reprezentanii genului
Nocardia n frotiu pot aprea sub form de bastonae acido-rezis-tente dar acetia
prezit grupare tipic, sub form de miceliu;
- micobacterii din mediul extern, cum sunt Mycobacterium butiris, din
alimente i Mycobacterium smegmatis, de pe tegument i mucoase pot constitui
surse importante de rezultate fals pozitive;
- persistena bacililor tuberculozei pe lame, care se folosesc fr a fi tratate
corespunztor (curire mecanic insuficient, sterilizare incorect, etc.).
Eliminarea n totalitate a acestor cauze, crete substanial acurateea
examenului microscopic. n acest scop se recomand a se respecta urmtoarele
reguli:
- utilizarea, pentru executarea frotiurilor, numai a acelor lame care nu
prezint nici un grad de uzur, foarte curate, bine degresate i care au fost tratate
termic la autoclav la peste 40C ;
- execuia corect a procedurilor de colorare;
- echiparea, reglarea i funcionaea corect a microscopului din dotare.

b. Rezultate fals negative

- recoltarea incorect a probelor, n condiii precare de sterilitate,

eantioane nerelevante, fr leziuni atribuite tuberculozei, etc.;
- transport, conservare i pstrare incorect, cum ar fi: expunere
ndelungat la aciunea razelor solare i cldurii, uscare excesiv, meninerea
produselor patologice mai mult de 7 zile la cldur i uscciune execesiv, etc;
- execuie incorect a frotiului, n sensul c nu sunt evideniate zonele cu
leziuni reprezentative din care se etaleaz frotiul sau amprenta este prea groas;
- fixarea necorepunztoare a frotiului , care poate duce la desprinderea
peliculei n procesul de colorare;
- colorare incorect, prin supranclzire,, pelicula se poate detaa sau
contactul cu fucsina este insuficient;
- decolorare prelungit sau recolorare exagerat de inens a frotiului, sunt
manevre defectuase care fac imposibil distingerea bacililor n frotiu;
- prezena n frotiu a unor forme bacilare necolorabile, care rmn viabile
i infectane dar care nu pot fi puse n eviden prin metodele clasice de colorare;
- unele defecte i stri patologice ale oranului vizual al examinatorului, cum
ar fi: daltonismul. n acest caz examinatorul va apela la tehnicile de examinare n
lumin fluorescent.
c. Rezultate eronate cauzate de factori care acioneaz asupra frotiului.
- uleiul de cedru , rmas pe suprafaa lamelor produce scderea intensitii
culorii roii a micobacteriilor.
De aceea, imediat dup examinare, lamele pozitive vor fi curate de ulei de
cedru folosint xilolul;
- meninerea prelungit a preparatelor n xilol;
- pstrarea mai mult de 7 zile a preparatelor colorate cu fluorocromi.

216
 4.2.1.2. Cultura micobacteriilor

Cultura micobacteriilor n investigaia microbiologic este relevant.

Culturile ofer rezultate incontestabile fa de bacterioscopia direct i permit
obinerea ntr-o form prelucrabil a preparatelor pentru testele urmtoare de
identificare n scopuri epidemiologice i de elaborare a programelor de eradicare a
tuberculozei.
Cultivarea micobaceriilor, constituie o etap necesar pentru determinarea
proprietilor fizico-chimice , pe baza crora se poate face diferenierea
micobacteriilor pe specii si tipuri.

Pregtirea produselor patologice pentru cultur.

Dup cum este cunoscut , unele mcobacterii, aa cum este M. bovis, pot fi
prezente n numr redus n leziuni de tuberculoz, n special n probele provenite de
la animale cu intradermoreacie pozitiv dar fr leziuni vizibile (NVL). Situaie
similar poate fi ntlnit i n cazul altor membrii ai complexului Mycobacterium
tuberculosis. Probabilitatea izolrii n culturi a acetor germeni este redus i de
aecea, produsela le patologice necesit prelucrri prealabile nainte de a fi
nsmnate n mediile de cultur. ansele de reuit depind de respectarea unor
reguli n desfurarea etapelor de lucru:
- produsele patologice trebuie s fie transportate n stare proaspt, de
preferat la rece;
- dac produsele nu pot fi meninute la rece ( +4C), nu va fi admis nici o
ntrziere n transportul imediat al acestora la laborator;
- pstrarea produselor patologice se va face la +4C., peste noapte, sau la
temperatura camerei , nu mai mult de 12 ore pn la prelucrare;
- dac probele sunt conservate cu pudr de borax sau alt conservant , aceste
substane vor fi ndeprtate prin splare cu soluie fiziologic tamponat steril sau
ap distilat;
Prelucrarea probelor, naintea nsmnrii pe medii de cultur, se va face
prin urmtoarele procedee:
- mojararea, macerarea i decontaminarea nodurilor limfatice, fragmentelor
de organe , etc.;
- concentrarea produselor patologice pentru obinerea unei densiti
corespunztoare de bacili/inocul;
- secreiile i excreiile nu ecesit a fi supuse operaiunii de mojarare dar
acestea vor fi diluate n funcie de vscozitatea lor i n continuare concentrate.

Procedee de mojarare i macerare.

Din toate esuturile cu leziuni de tuberculoz se recolteaz cantiti de 5,0

10,0 g. n mojare sterile care se supun mrunirii n fragmente cu dimensiuni
de pn la 1,0 - 20,0 mm. Dup mojarare, folosind nisip steril sau sticl mrunit,
probele se depun ntr-un echipament Colworth-Stomacher sau ntr-un
omogenizator mecanic penru macerare.esuturile fr leziuni vizibile (NVL), dup
ce au fost separate de stratul de grsime se mojareaz i se supun macerrii n 2-10
volume de ap distilat sau ser fiziologic sterile (nodurile limfatice n ntregime iar
celelalte esuturi, fragmente cu dimensiuni de 0,5-1,0 cm., n cantitate total de
10,0 g.

217
 Procedee de decontaminare.

Condiia esenial pentru ca valoarea diagnostic a examenului bacteriologic

(bacterioscopia direct i cultura micobacteriilor) s fie maxim, este ca
decontaminarea produselor patologice indiferent dac acestea au fost recoltate
steril sau nu, s se fac prin procedee care s distrug flora microbian de asociaie
dar n acelai timp s influeneze viabilitatea micobacteriilor i implicit ncrctutra
micobaceriilor per cantitate din materialul patologic procesat.
S-a demonstrat c o ncrctur de 10 1000 micobacterii viabile/ml. de
prob sun suficiente pentru o sensitivitate optimal a tehnicilor de cultur uzuale
(65, 214).
Operaiunile de decontaminare a materialelor patologice vor fi executa-te n
funcie de aprecierea gradului de contaminare cu germeni de asociaie dup
examenul bacterioscopic direct. Dac probele au fost recoltate aspetic,
decontaminarea nu mai este necesar.
Dac probele nu au fost supuse operaiunii de decontaminare, flora de
asociaie prezent va invada mediul de cultur, avnd o rat de cretere extrem de
rapid i inhibnd dezvoltarea coloniilor de micobacterii. Pentru decontaminarea
produselor patologice destinate cultivrii micobacteriilor, laboratoarele de
micobacterioze trebuie s utilizeze procedee adecvate, simple, cu pre de cost redus,
dar care s realizeze o decontaminare ntre 3-5 % . Cercetrile de specialitate au
demonstrat c o rat de decontaminare de sub 3 % a compromis considerabil
viabilitatea micobacteriilor(64). Metodele de decontaminare, a produselor
patologice n vederea cultivrii micobacterii-lor, utilizate n majoritatea
laboratoarelor de specialitate, sunt sintetizate n tabelul nr 20.

Metoda decontaminrii cu hidroxid de sodiu (NaOH, folosete hidr-oxidul

de sodiu (NaoH) n concentraii cuprinse ntre 2-4 % pentru digestie i, n acelai
timp , pentru decontaminarea probelor.
Concentraia minim a hidroxidului de sodiu (NaOH) trebuie stabilit de
fiecare laborator n parte pentru o digestie i decontaminare optimal a probelor
(64).
Timpul de contact este de 20 de minute dar n unele lucrri de specialitate se
recomand ca acesta nu trebuie s depeasc 30 de minute i obligatoriu
preparatul va fi neutralizat cu un acid ( ac.clorhidric 10,0 % , ac. sulfuric 10,0 % ac.
fosforic 10,0 %) n prezena roului fenol ca indicator (39).
Decontaminarea cu L-acetilcistein - Hidroxid de sodiu Clorur de sodiu,
este metoda utililizat pe scar larg. L acetilcisteina ajut la digestia substanelor
mucoide din componenena peretelui germenilor de asociaie facilitnd aciunea
hidroxidului de sodiu ca decontaminant (64).
Decontaminarea cu acid oxalic, este recomandat pentru decontaminarea
probelor clinice care sunt infectate cu Pseudomonas aeruginosa, precum: urina,
lavajele bronhopulmonare, de la pacienii cu fibroz chistic, .a (64).

218
 Tabelul:20

Metode uzuale de decontaminare a produselor patologice pentru cultura micobacteriilor

Metoda Utilizare Avantaje Dezavantaje Ref.

Hidroxid de Laboratoarele care Digestie/decontaminare n Necesit timp precis pentru a
sodiu (NaOH) utilizeaz concentra- acelai timp cnd NaOH este evita distrugerea icobacteriilor ;
rea prin centrifugare utlizat la conc. 2 %.; Poate distruge unele micobacterii
Pre de cost redus chiar la conc. 2 %.
N-acetil Frecvent utilizat n Aciune eficient mucolitic; Timp de valabilitate scurt al
-cystein rile dezvoltate; Utilizarea NaCl ca mucolitic reagenilor (24 de ore);
Clorur de Utilizat n combinaie reduce concentraia de NaOH Pre de cost ridicat
sodiu- cu centrifugarea i potenialul antimicobac-
Hidroxid de terian al NaOH
sodiu.
Acid oxalic Recomandat pentru Eficient n inhibarea supra- Utilitate limitat numai pentru
ndeprtarea infeciei cu Ps. aeruginosa. Psudomonas.
Ps.aeruginosa ( din
urin, probe din
fibroza chistic)
Ogawa-Kudoh Metoda ideal pentru Nu sunt necesare centri- Poate avea o rat de contaminare
seturi de resurse reduse fugarea sau concentrarea ridicat.
Pre de cost redus
Poate fi utilizat n teren
Cetylpyridin- Pentru conservare i Timp de 8 zile evit Pot s rmn active n mediile
NaCl digestie/decontaminare dezvoltarea contaminanilor bazate pe ou n agar i pot
n timpul transportului produce moartea micobacteriilor
la laborator

Metoda Ogawa-Kudoh. Aceast metod, foarte simpl, se folosete pentru

decontaminarea probelor centrifugate anterior n vederea nsmnrii lorpe medii
de cultur pentru izolarea micobacteriilor.
Procedura a fost descris prima dat de K u d o h , S. i K u d o h T. 1974,
(115) utiliznd hidroxdul de sodiu (NaOH) pentru digestie-deconta-minare nglogbat
n mediu Ogawa modificat pentru cultura micobacteriilor.
Metoda nu necesit echipamente complexe de laborator i de aceea poate fi
aplicat n teren, dup urmtoarea procedur:
- cu ajutorul unui tampon steril se obine o cantitate semnificativ din prob;
- se introduce tamponul ntr-un tub care conine 3,0 ml. hidroxid de sodiu
4,0 %:
- se incubeaz la temperatura camerei timp de 2 minute;
- se scoate tamponul din soluia de hidroxid de sodiu i se nsmneaz un
tub care conine mediul Ogawa modificat. Cu acelai tampon se realizeaz o
amprent care va fi colorat i examinat microscopic pentru alcol-acido-rezisteni
(BAAR)
Metoda decontaminrii cu Cethyl-pyrimidin i NaCl. Aceast metod este
folosit pentru conservarea probelor mpiedicnd dezvoltrea florei
microbiene de asociaie n timpul transportului ctre laborator i de asemenea
asigur decontaminarea probelor. S-a demonstrat c micobacteriile din probele
supuse decontaminrii cu Cetyl-pyrimidin-NaCl, rmn viabile timp de 8 zile
pn la nsmnarea lor n mediile de cultur (212, 202).
O alt metod, recomandat de B u n g e t z i a n u G., e t a l., 1987 (39),
utilizeaz Hexadecil-Primidin-Clorat (HPC) n concentraie de 0,075% care se
adaug la produsul patologic macerat i se menine n contact 30 de minute. Timpul
de contact se poate prelungi la 60 minute incluznd centrifugarea.

219
 Procedee de concentrare a bacililor tuberculoi n produsele pato-logice.
Metodele de concentrare sunt recomandate a fi folosite att pentru examenul
bacterioscopic direct ct i n vederea cultivrii bacililor tuberculozei, mai ales n
produsele patologice n care cantitatea de germeni este extrem de redus
(paucibacilare).
a. Concentrarea prin centrifugare, este metoda frecvent utilizat. Procedura
de lucru este urmtoarea:
- ntr-un balon steril de 100,0 ml. se pun 2,0 5,0 ml, de material patologic
omogenizat i decontaminat la care, se adaug, n funcie de consiten aceeai
cantitate de ap distilat sau ser fiziologic tamponat steril;
- coninutul se menine 20 de minute pe un agitator magnetic cu plata-nul
nclzit la 37 C., sau se introduce la termostat, dup care coninutul se transfer n
tuburi de centrifug la care se adaug 1,0 ml. alcool etilic i se echilibreaz pe
balana analitic, apoi se introduc n suportul rotor al acentrifugei i se supun
centrifugrii;
- calitatea sedimentului i implicit succesul cultivrii micobacteriilor depinde
de regimul de centrifugare aplicat. De aceea, pentru obinerea unui sediment
corespunztor este necesar a se determina fora centrifugal relativ (FCR) care
variaz n funcie de raza msurat din centru rotorului la fundul tubului de
centrifug (Rmax ) i de viteza centrifug (rpm). Astfel fora centrifugal relativ
poate fi calculat dup urmtoarea frmul:
FCR = 1,12 x R max (n mm.) x (rpm/1000) x 2
Unii autori consider regimul optim de centrifugare 3000 rot./min. timp de
10 15 min. (39), n timp ce n alte lucrri de specialitate recomand FCR exprimat
n for gravitaional (g), calculat la 3000 x g pentru 15 min. sau 2000 2500
x g pentru 20 min.(168, 202).
S-a demonstrat c fora centrifugal (FCR) lent i/sau timp redus de
centrifugare conduc la pierderea considerabil a micobacteriilor din prob, aa cum
un regim exagerat de centrifugare poate duce la distrugerea unui numr
semnificativ de germeni.
b. Metoda de concetrare prin flotaie. Este o alt metod simpl, cu
aplicabilitate larg n labaroatoarele de micobacterioze, care se bazeaz pe
propietatea micobacteriilor de a flota concomitent cu particulele de hidrocarburi
(neofalin, benzol, xilol, toluol) emulsionate n materialul patologic. Procedura de
concentraie prin flotaie este urmtoarea:
- dup omogenizare i decontaminare, peste produsul patologic se adaug
2,0 ml. benzen, xilol, toluol sau neofalin i totul se transfer ntr-un balon cu fund
plat de 250,0 ml.;
- se completeaz cu ap distilat pn la jumtate, se agit manual sau cu
agitatorul magnetic timp de 10 minute pentru o bun emulsionare a hidrocarburii i
pentru a permite flotarea bacililor pe particulele de hidrocarbur emulsiunot;
- dup agitare, coninutul din balon se transfer n eprubete, completndu-se
din nlimea acestora i se las n repaus 30 de minute pn la apariia unui inel
cremos format din particulele de hidrocarbur mpreun cu micobacteriile.
c. Preciptarea cu soluie apoas de clorur de bariu 2,5 % i clorur de
calciu 4,0%, este mai rar utilizat i se bazeaz pe precipitarea mico-bacteriilor
mpreun cu srurile respective ntr-un interval de 24 de ore.
d. Electroforeza i concentrarea pe filtre micropor din policarbonat,
necesit echipamente de lucru complexe, sunt costisitoare, motiv pentru care
acestea nu au intrat n practica laboratoarelor medicale de diagnostic.

220
 Medii pentru cultura micobacteriilor.

Mediile care se utilizeaz pentru cultura micobaceriilor trebuie s nde-

plineasc urmtoarele condiii:
- s ofere anse minime de dezvoltare a bacililor, chiar i n cazul probelor
paucibacilare; mediul trecuie s fie suficient de bogat n substane nutritive pentru
a favoriza dezvoltarea optimal a unui numr suficient de colonii de dimensiuni
considerabile i s favorizeze dezvoltarea ct mai rapid a micobacteriilor;
- s permit diferenieri morfologice ntre diferite specii i tipuri de
micobacterii;
- s nu permit dezvoltarea florei de asociaie a carei cretere este mult mai
rapid invadnd i inhibnd dezvoltarea coloniilor de micobacterii;
- s fie simplu de preparat i termenul de valabilitate s fie acceptabil n
condiii de conservare corespunztoare.
Mediile pentru cultura micobacteriilor se pot clasifica n:
- medii lichide;
- medii solide;
- medii semisolide.
Mediile lichide, prezint urmtoarele caracteristici:
- favorizeaz, n general, o cretere mai rapid a micobacteriilor . Prin
ncorporarea unor soluii tensioactive, cum ar fi Tween-80;
- permit agitarea continu cu meninerea unui grad ridicat de oxigenare i, n
consecin, creterea mai rapid a culturilor;
- permit efectuarea culturilor pe lame care reduc timpul de lucru n
precizarea diagnosticului;
- pot fi comercializate n stare liofilizat, fiind diluate n momentul utilizrii;
- prezint dezavantajul c riscul de infectare cu flor de asociaie este crescut
i nu sunt adecvate pentru testele de tipizare.
Din aceast grup fac parte: mediul Dubos, mediul Middlebrook 7H9 bulion,
mediul Proskauer i Beck, mediul Sauton, mediul Sula .a.
Mediul Middlebrook 7H9 , poate fi preparat din mediu de baz sub form de
pudr comercial suplimentat cu Middlebrook ADC mbogit dup sterilizare .
Incubarea se face n atmosfer cu 5-10 % CO2.
Mediile lichide s-au dovedit mult mai sensibile dect mediile bazate pe ou
pentru izolarea micobacteriilor din probe prelevate din teren, cu toate c preul
acestor medii este este mai ridicat (94).
Mediile solide, cel mai frecvent uilizate n practica microbiologic, se mpart
n : medii pe baz de ou i medii cu agar i pot fi preparate n tuburi cu suprafaa
nclinat sau n plci Petri.
mediile pe baz de ou, au urmtoarle avantaje :
- pot fi conservate o perioad nelungat pn la utilizare (la + 4 C ) 1-2 luni;
- prezint risc redus de contaminare dup coagulare n tuburi;
- pe aceste medii pot fi efectuate, n condiii satisfctoare, direct unele teste
de tipizare, aa cum este testul niacinei. Mediul pe baz de ou, cel mai frecvent
utilizat n laboratoarele de micobacterioze, este mediul Lwenstein-Jensen.
Ulterior, mediul Lwenstein-Jensen a fost modificat n diverse variante
pentru a satisface cerinele de cretere ale unor specii de micobacterii, cum ar fi: M.
bovis, M. microti , M. africnum .a.
Cunoscut fiind c mediul Lwenstein-Jensen conine glicerol, ca singur
surs de carbon indispensabil pentru creterea M. tuberculosis, dar nu pentru
221
 micobacteriile menionate mai sus, acesta a fost eliminat din compoziia
mediului i nlocuit cu piruvat de sodiu 0,5% .
Aa s-a elaborat reeta de preparare a mediului Stonebrink, recomandat a fi
folosit n paralel cu mediul Lwenstein-Jensen pentru nsmnarea probelor
provenite din zone cu inciden ridicat a tuberculozei bovine. nstruciunile
tehnice recomand ca n asemnenea situa-ii ntotdeauna trebuie ca din aceeai
prob s se nsmneze n celpuin un tub de mediu Lwenstein-Jensen i unul
Stonebrink (110).
O alt variant a mediului Lwenstein-Jensen este mediul Ogawa n
compoziia cruia s-a nlocuit asparagina cu glutamatul de sodiu, un aminoacid
mult mai ieftin i la ndemna laboratoarelor de microbilologie. Mai trziu mediul
Ogawa a fost modificat prin acidifiere (pH 6,4) pentru a satisface condiiile de
inoculare a probelor direct n teren (65).
Mediile Midlebrook 7H10 i 7 H11 sunt pe baz de agar. Ele au n
componen mediul de baz pudr i agarul Midlebrook OADC mbogit care sunt
disponibile comercial. Aceste medii s-au dovedit din ce n ce mai interesante n
practica laboratoarelor pentru izolarea micobacteriilor comparativ cu mediile pe
baz de ou, dar utilizarea lor pe scar larg, n special n rile subdezvoltate i
unele n curs de dezvoltare, nu este posibil din cauza costurilor ridicate.
n ultimele decenii, au fost elaborate reete de medii pentru sisteme BACTEC
pentru izolarea micobacteriilor.
Sistemul BACTEC-460 semiautomat a fost primul uilizat pentru cultura
micobacteriilor i n acelai timp servete ca etalon pentru siguran i
performan.
Ulterior, cercetrile au descoperit noi sisteme de cultur a micobacteriilor cu
performae remarcabile. Astfel, pot fi achizionate : sistemul indicator de cretere a
micobacteriilor n tub (MGIT), Bact/Alert, ESP Mice, Spetic-Chek, MB Redox,
NACTEC MGIT460 .a.
Mediile semisolide sunt utilizate pentru cercetarea unor caracteristici
difereniale ntre speciile de micobacterii, cum ar fi: creterea unor micobacterii la
suprafaa mediului ca urmare a ncesitii lor pentru oxigen i unele teste
biochimice.

Controlul calitii mediilor de cultur.

In conformitate cu Normele privind calitatea lucrrilor microbiologice,

toate laboratoarele acreditate pentru diagnosticul bacterilogic al micobacteriozelor
sunt obligate s execute periodic i ori de cte ori este necesar controlul calitii
mediilor de cultur, indiferent dac cestea au fost furnizate de firme specializate
sau dac au fost preparate n laboratorul propriu.
Rezultatele controlului de calitate vor fi evideniate ntr-un registru pentru
controlul alitii mediilor de cultur. Registrul pentru controlul calitii mediilor de
cultur trebuie s conin urmtoaele date :
Responsabil control...................................................................................
- Mediu.......................................................................... Lot nr..................
-Denumireprodus/Productor.................................................................
-Dat aexpirrii................................................................data recepiei in
laborator...............................................................................................................
-Data iniierii controlului..........................................................................
-Rezultatele controlului.............................................................................

222
 Controlul macroscopic. Din fecare lot se aleg la ntmplare 10 flacoane
(tuburi) nensmnate, nchise ermetic care se incubeaz la 37 C timp de 24-48
de ore . Dup perioada de incubare se noteaz numrul de tuburi cu :
- aspect nemodificat;
- infectate cu ali germeni;
- deshidratate;
- fisuri n mediu;
- modificri de culoare;
- alte aspecte semnalate: prezena lichidului de condens la recepie
(DA/NU), bule de gaz n poriunea inferioar a mediului (DA/NU), deshidratare la
recepie cu desprinderea mediului de pe suport (DA/NU), infec-ie evideniat n
profunzimea mediului pn la utilizare (DA/NU), numr de culuri (3
tuburi/prelevat pentru care s-a folosit mediul din lotul respectiv.
Controlul sterilitii . Datele pentru controlul sterilitii mediilor vor fi
nregistrate conform modelului din tabelul nr.21.
Tabelul:21

Contolul sterilitii mediilor de cultur pentru micobacterii

10 flacoane (tuburi) Zile (controale)

alese la ntmplare , 0 7 14 21 28 42 60
din care:
Cu aspect nemodificat
Cu mucegai
Infectate cu ali germeni
Deshidratate
Cu fisuri n mediu
Cu culoare modificat
Cu lichid de condens la
recepie

Controlul calitii mediilor de cultur pentru micobacterii. Controlul

calitii me-diilor de cultur pentru micobacterii se va efectua folosisnd o tulpin
de Mycobacterium tuberculosis H37Rv de referin care, din suspensia de 1,0 g/ml.
diluie 10-6 , cte 0,2 ml/ tub n 10 tuburi de mediu i rezultatele se nregistreaz n
tabelul nr.22.
n lipsa tulpinii de referin poate fi folosit o tulpin local de M. bovis
izolat i nregistrat n laborator, ale crei caracteristici morfologice, chimice i
patogenitate sunt cunoscute.
Tabelul :22

Controlul calitii mediilor pentru cultura micobacteriilor

Control Nr. colonii crescute pe 10 tuburi nsmnate

zile 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
21
30
60

Calitatea mediilor se apreciaz n funcie de numrul de tuburi n care s-a

observat dezvoltarea coloniilor de Mycobacterium n intervalul de control stabilit.
Dac n cel puin 60 % dintre tuburile nsmnate au fost observate cel puin 5
colonii de Mycobacterium n intervalul 21-60 de zile, lotul respectiv poate fi utilizat
pentru lucrri curente de diagnostic al micobacteri-ozelor.

223
 Tehnici de nsmnare a mediilor de cultur.

Produsele patologice destinate nsmnrii mediilor pentru izolarea

micobacteriilor , prelucrate dup metodele de concentrare i decontaminare
descrise anterior, vor fi verificate sub aspectul pH-ului final, care trebuie s fie
neutru. Atunci cnd inoculul este alcalin, bacilii tuberculozei se dezvolt greu pe
mediile Lwenstein-Jensen, n timp ce pH-ul acid intensific activitatea
antibactericid a verdelui de malachit. De aceea operaiunile de decontaminare vor
fi executate cu soluie de hidroxid de sodiu 2,0% cu adaos de N-acetil cistein i
ulterior inoculul va fi neutralizat cu acid clorhidric 8-10% sub control permanent al
pH-ului.

Tehnica de nsmnare n pictur. Cu o pipet Pasteur, cu vrful mai

gros, se aspir 1,0 - 2,0 ml. din recipientul cu produs patolologic care a fost tratat n
prealabil cu o soluie de antibiotice pentru a se evita suprainfecia inoculuilui cu
flor bacterian banal; se prefer penicilina (o pictur din soluia de penicilin
8000 UI/ml.). Antibioticele pot fi adugate direct n mediile de cultur, conform
reeteleor descrise anterior.
Se nsmneaz minim 3 tuburi cu mediu pentru fiecare prob, cu o
cantitate sub 1,0 ml./tub.
Imediat dup nsmnarea fiecrui tub, acesta se nchide cu capac sau cu
dop e-tan iar tuburile cu mediu solid se nclin pentru a se realiza dispersia
uniform a materialului pe ntreaga sprafa a mediului.
Cu excepia tuburilor cu medii lichide, cele cu mediu solid se introduc la
incubator n poziie uor nclinat, astfel nct inoculul s nu ating capacul (dopul)
i se menin 48 de ore dup care dopurile din vat se parafineaz sau se nlocuiesc
cu dopuri din cauciuc; probele se menin n continuare la incubator timp de 60 - 90
de zile
Produsele patologice lichide sau semisolide ( scurgeri nazale, lichid pleural,
sput, secreii purulente, etc.), se nsmneaz prin aceeai metod , dup o
centrifugare prealabil la turaie mic (3000 rot./min., timp de 10-15 minute).
Cnd culturile se realizeaz n plci Petri, suprafaa mediului poate fi
nsmnat prin inundare sau, cnd materialul patologic a fost prelevat pe
tampoane, mediul de cultur se nsmneaz prin tergere.
De asemenea, suprafaa mediului poate fi nsmnat folosind ansa
bacteriologic.

Incubarea culturilor de micobacterii

Indiferent de tehnica de nsmnare folosit, mediile de cultur se

incubeaz n camere de incubare care pot s asigure un regim termic constant pe
toat perioada de incubare a culturilor n fucie de specia de micobacterie
incriminat n declanarea infeciei tuberculoase.
De aceea, este necesar ca laboratoarele de micobacterioze s fie dotate cu cel
puin 3 camere de incubare n care mediile de cultur, nsmate din aceeai
prob, s fie incubate la regim de temperatur diferit: la 33 C, 37 C i 42 C.,
aceasta constituind o etap n diferenierea speciilor de micobacterii. De exemplu,
este n unanimitate acceptat c M.tubercuosis, M. bovis se dezvolt la temperatur
de 37 C , n timp ce M. marinum se dezvolt la temperatura de incubare de 33 C
iar M. avium avium la temperatur de 39 42 C. (54).

224
 P e r s i m o n i C., i S c a r p a r o C., 2009 (171) au demonstrat c, n
general, micobacteriile cu cretere rapid se dezvolt n limite de temperatur ntre
25C - 40C. Dup autorii citai, M. ulcerans se dezvolt la temperaturi de incubare
cuprinse ntre 29C i 33C n timp ce M. chelonae se dezvolt n cultur primar la
30C.
Ali autori, au demonstrat importana regimului termic de incubare asupra
activitii antimicobactericide a unor medicamente artnd c activita-tea
bactericid a inosidazidei i ramfimicinei a fost progresiv cnd culturile de
micobacterii s-au dezvoltat la 22 C - 25C dar pirazidamida i TMC207 au fost
mult mai active asupra culturilor incubate la 37C. n acelai timp, autorii au
constatat c M. xenopi se dezvolt optim la temperatur de 28C. (53).
Studiile asupra biologiei micobacteriilor au demonstrat c unele specii
necesit pentru dezvoltare atmosfer cu CO2. S-a stabilit c dezvoltarea optim a
speciilor de micobacterii din aceast grup se produce atunci cnd concentraia de
CO2 din incinta termostatului este de 5 - 10%.

Lectura culturilor de micobacterii

Apariia coloniilor de micobacterii pe mediile de cultur solide se poate

constata cepnd de la 14 zile, n funcie de specie i varant.
Mediile de cultur nsmnate cu materiale patologice suspecte de
contaminare cu micobacterii se examineaz microscopic dar i cu lupa, dup 14 zile
de incubare, de regul sptmnal. n cazul cnd pe suprafaa mediilor se observ
colonii, consemnndu-se aspectul morfologic, acidorezistena i gruparea.
Culturile negative, sunt considerate acelea care au rmas sterile dup 90 de
zile de observaie, avnd n vedere c M. bovis i M. avium paratuberculosis
(bacilul lui Johne) necesit cel puin 60 de zile pentru dezvoltarea coloniilor.
Culturile pozitive, sunt considerate acelea n care, n cursul perioadei de
observaie, s-au dezvoltat colonii cu morfologie i grupare caracterisitic fiecrui
grup i tip de miconacterie:

Fig.76 - Aspecte morfologice comparative ntre coloniile de M.bovis (A), M.tuberculosis (C) i o tulpin
nedeterminat(B) dezvoltate pe mediul cu rou bromcrezol (114)

Culturile de M. bovis (Fig. 76,)(114) pe medii solide, prezint:

- colonii netede ( S = Smouth) i cretere disgonic;

225
 - culoarea coloniilor, albicioas i aspect cremos cu disociere uoar n ap
distilat;
- caracter eugonic n culturi repetate;
- adaptabilitate uoar pe medii cu glicerin i aspectul devine rugos.
Pe medii lichide (bulion glicerinat):
- formeaz un vl subire la suprafaa mediului cu aspect neted i gras;
De asemenea, n fig. nr. 77 pot fi observate caracterele culturale distincte ntre M.
gordonae, M. fortuitm, M. avium i M. tuberculosis.

a b c d. e
Fig.77 - Aspectul coloniilor de Mycobacterium gordonae (a), Mycobacterium fortuitum (b),
Mycobacterium avium (c) Mycobacterium tuberculosis (d, e).

La examenul microscopic M. bovis nu se deosebete de M. tuberculosis dar,

uneori are tendin de a se grupa n grmezi caracteristice.
Culturile de M. tuberculosis, prezint:
- colonii rugoase (R= Rough) cu cretere eugonic, adesea cu aspect
conopidiform (Fig.78).

Fig.78 - Aspectul coloniilor de M. tuberculosis pe mediul Lwenstein-Jensen

226
 - culoarea uor glbuie i emulsioneaz greu n apa distilat; creterea
abundent a coloniilor face dificil numrarea acestora;
- examenul microscopic din coloniile emulsionate n ap distilat, evideniaz
bacilii, grupai n grmezi sau n formaiuni caracteristice denumite serpetine,
torsade sau corzi.

Fig.79 - Aspectul coloniilor M. ulcerans izolat din Australia pe mediul L-J

(WHO, 2011.Buruli ulcer- Diagnosis 0f M.ulcerans disease)

Alte micobacterii precum: Mycobacterium ulcerans prezint pe mediile

solide colonii medii cu marginile netede , intens pigmentate (Fig.79)
Aspectul culturilor n medii lichide difer n funcie de coninutul de
substane tensioactive din mediu ( exemplu: Tween-80). n absena acestor
substane, coloniile se dezvolt la suprafa sub form de vl cu tendin de
invadare a peretelui tubului, cnd creterea este abundent. n prezena sub-
stanelor tensioactive, mediul prezint turbiditate vizibil care se accentueaz pe
msur ce dezvoltarea culturii progrezeaz. Aceast caracterisitic se constat i n
cazul mediilor lichide supuse procesului de agitare continu n perioada de
incubare.
Alte micobacterii. Majoritatea reprezentailor acestei grupe prezint:
- colonii netede (S), lucioase, care se disociaz rapid n ap distilat;
- unele colonii pigmentate, propietate care nu se coreleaz cu virulena
acestor micobacterii;
- la examenul microscopic, gruparea bacililor apare neregulat, nefiind
oservate grmezi i corzi, cu excepia M. avium i M. kansasii care formeaz corzi
reduse la numr, slab evideniate.
Notarea rezultatelor. n literatura de specialitate sunt prezentate dou
modalti de nregistrare a rezultatelor dezvoltrii culturilor de micobacterii:
- calitativ, cnd se noteaz numai prezena sau absena coloniilor;
- cantitativ, care presupune numrarea coloniilor n raport cu numrul
tuburi-lor nsmnate.
Interpretarea rezultatelor se face dup urmtoarea schem:
- +++/++++ = cretere confluent;
- ++ = colonii numeroase care nu pot fi numrate;
- + = ntre 20 i 100 de colonii sau sub 20 de colonii cu precizarea
numrului;
- 0 = nici o colonie, absena dezvoltrii.
Aceste rezultate vor fi corelate n mod obligatoriu cu examenul microscopic
al frotiului executat din colniile numrate.
Surse de eroare n cultivarea micobacteriilor.
Rezultatulfals-negativ,se poate nregistra n cazul unei probe conta-
minate cu micobacterii n cazul:
- recoltrii necorespunztoare a materialului patologic i/sau deficienelor
survenite n procesul de prelucrare a acestuia;

227
 - utilizrii de medii cu compoziie necorespunztoare sau de calitate slab;
- timpului insuficient de incubare i/sau defeciunilor survenite la instalaia
de incubare n cursul perioadei de incubare (variaii frecvente de temperatur,
defeciuni ale generatorului de cldur la camera de incubare, etc);
- infectrii mediilor nsmnate cu ali germeni dect micobacterii.
Rezultatul fals-pozitiv, este consecina examinrii culturilor exclsiv
macroscopic fr control bacterioscopic, precum i:
- lipsei de experien a examinatorului, care poate confunda germenii din
genul Nocardia cu proprieti acidorezistente mai reduse, cu micobacteriile, n
special, cele cu cretere rapid;
- erorilor i nonconformitilor n etalarea i colorarea preparatelor pentru
examen microscopic.

4.2.1.3. Identificarea micobacteriilor.

Cunoaterea exact a micobacteriei, etiologic responsabil, are importan

semnificativ pentru specialitii implicai n activitile de prevenirea difuzrii
tuber-culozei, n elaborarea i aplicarea programelor de eradicare a bolii, dar i
pentru specialitii din laboratoarele de diagnostic bacteriologic care sunt chemai
s clarifice unele aspecte legate de distribuia i patogenitatea diferitelor specii i
variante de micobacterii izolate din focarele de tuberculoz.
Pentru identificarea micobacteriilor n cultur bacteriologic se folosesc
diferite teste, cum ar fi: caracterele morfologice, pigmentogeneza la lumin i
ntuneric, viteza de cretere la 37C temperatura optim de cretere, preferin
pentru oxigen, teste biochimce i enzimatice (testul niacinei,, catalazei,
peroxidazei, lipazei, amilazei,reductazei,transformarea nitriilor n nitrai, reacii
de culoare, etc.), teste imunlogice (imunoelectroforeza fuzional, electroforeza pe
gel poliacrilamidic, dubla difuziune n gel de agar, teste imunoenzimatice, etc.),
teste de sensisibilitate la chimioterapice sau alte medicamente: Hidrazida
Tiophen-2-Carboxilic(TCH), Nitrobenzoat de sodiu (PNB)i Hidroxid-Amina
(HA), etc.
Caracterele morfologice ale coloniilor de micobacterii.
Au fost descrise mai sus separat: pentru micobacteriile din grupa S i
respectiv grupa R.
Pigmentogeneza. Prezena sau absena pigmentului n culturile de
micobacterii, permite ncadrarea acestora n 3 grupe:
- grupa a I-a cuprinde micobacteriile fotocromogene , la care pigmentarea
apare dup o expunere pentru cteva ore la lumin (Fig.80).

Inainte de
expunere la
Fig. 80. Mycobacterium kansasii: Aparitia lumina
pigmentului dupa expunere la lumina

Dup expunere
la lumin

228
 - grupa a II-a ,micobacterii scotocromogene , care se pigmenteaz
puternic n galben portocaliu indiferent dac au fost expuse la lumin sau au fost
meninute la ntuneric. Din aceast grup fac parte n special micobacteriile atipice
(M. gordonae, M. marinum) (Fig.81).

M. avium

M gordonae

M. marinum

Fig. 81 - Aspecte comparative ale pigmenteogeneziei la unele specii de micobacterii

- grupa a III-a , micobacteriile lipsite de pigment (apigmentogene) . n

aceast grup a fost inclus majoritatea agenilor etilologici ai tuberculozei la
mamifere.
Aprecierea pigmentrii trebuie fcut pe culturi de micobacterii tinere i se
va avea n vedere c pigmentogeneza este favorizat de aerobioz.
Viteza de cretere la 37C., se apreciaz la 7-10 zile de la nsmnarea
culturilor i din acest punct de vedere micobacteriile se clasific n:
- micobacterii cu cretere rapid, din care fac parte: Mycobacterium
cheloneae, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium bolletti, Mycobac-terium
fortuitum complex (M. fortuitm, M.fortuitum subsp acetamidolyticum)
Mycobacterium septicum, M. senegalens, Mycobacterium vaccae, M. aurum i
alte 33 de specii atipice cu patogenitate pentru om i animale; M. avium
intracellulare, M. haemophilum, M. kansasii, M. leprae, M. marinum,
M.ulcerans, M. xenopi, M. scrofulaceum, M. malmoense, M. szulgai i alte 13
specii descoperite recent.
- micobacterii cu cretere lent, complexul Mycobacterium tuberculosis
(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), M. microti, M. kansasii M. marinum,
M. simiae M. aviaticum, M.scrofulaceum, M. szulgai, M. gordonae, M. avium. M.
avium intracelulare , M. xenopi, M. malmoense ,M. haemophilum,M. ulcerans,
M. gastri, M. noncromogenicum, M.triviale, M. terrae, M. paratuberculosis, M.
lepraemurium.
Cunoaterea apartenenei unei specii sau tulpini micobacteriene la una din
cele dou categorii este foarte important, aceasta reprezentnd prima etap n
alegerea mediului de cultur adecvat i identificare micobacteriei implicat n
infecia tuberculoas. De exemplu, o concentraie de 0,5 % clorur de sodiu n
mediile de izolare are efect inhibitor asupra micobacteriilor cu cretere lent. Alte
costatri arat c incorporarea n mediul Sauton a 0,2 % acid picric impedic total
dezvoltarea micobacteriilor cu cretere lent , cu excepia M. simiae, precum i
unele micobacterii cu cretere rapid aa cum este M. chelonei .
Rezistena tuberculostatice. Testul rezistenei la duferite tuberculostatice
sau chimioterapice este frecvent utilizat n multe laboratoare
pentru diagnosticul micobacteriozelor, nlocuind testul niacinic (Komo), datorit
riscului de periculozitate al niacinei pentru operator.

229
 - Rezistena la Hidrazida-Tiophen-2-Carboxilic (TCH),p-Nitrobenzoat de
Sodiu (PNB) i Hidroxid-Amida (HA). Unele micobacterii cum sunt: M. bovis, M
bovis-BCG, M. africanum, M.asiaticum , nu se dezvolt n prezena unei
concentraii de 5,0 % - 10,0 % TCH n mediul Lowenstein Jensen i creterea nu
este inhibat n cazul M.tuberculosis var. eurpean.
Mediul de cultur coninnd 0,5 mg/ml. PNB i 6,25 gamma/ml. HA nu
favorizea-z dezvoltarea unor micobacterii cum ar fi: M. tuberculosis, M.bovis, M.
africanum, M. microti i micobacterii atipice (M. kansasii,M. marinum).
Prezena HA ( 62,5 gamma/ml.) n mediul Lwenstein-Jensen permite
diferenierea M. tuberculosis de M.bovis.
Sensibilitatea la tuberculostatice. Testele de sensibilitate la
tuberculostatice au utilitate destul de restrns n laboratoarele veterinare dar larg
n laboratoarele de diagnostic microbiologic din medicina uman. Aceste teste au
valoare deosebit n identificarea i tipizarea tulpinilor de micobacterii. De
exemplu:
- Etinamida, adugat n mediul de cultur, difereniaz net M. tuberculosis
de M. bovis, deoarece M. bovis este de 4 10 ori mai sensibil la tuberculostatice
dect M.tuberculosis;
- Pirazinamida. Difereniaz tulpinile de M. tuberculosis de M. bovis i M.
bovis-BCG ;
- Cicloserina i PAS , de asemenea, pot fi folosite cu rezultate bune pentru
diferenierea unor tulpini de M. bovis BCG i micobacterii atipice de altele
sensibile la aceste tuberculostatice.
Temperatura optim de cretere. n general, micobacteriile cultivate
din materiale patologice se dezvolt la temperaturi de incubare diferite, n funcie
de specie. De exemplu, M. marinum se dezvolt la temperaturi care nu depesc
33C n timp ce M. avium se dezvolt la temperaturi de pn la 42C.
Preferina fa de oxigen. Studiile ntreprinse asupra preferinei
micobacteriilor n cursul dezvoltrii lor n mediile de cultur , au dovedit c unele
specii, aa cum este M. tuberculosis necesit aport de oxigen pentru a se dezvolta n
timp ce M. bovis se poate dezvolta n atmosfer srac n oxigen. Aceast
caracteristic, a fost utilizat n laboratoare pentru diferenierea speciilor de
micobacterii.
Testul preferinei micobacteriilor fa de oxigen este simplu: pe medii de
cultur adecvate (agar moale) pentru micobacterii, se nsmneaz fie direct din
materialul patologic fie pasaj din culturile primare , n cte dou tuburi din fiecare
prob i se incubeaz n condiii similare de aerobioz. n aceste condiii M.
tuberculosis se dezvolt la suprafaa mediului sau nu depete 3 mm. n
profunzime n timp ce M. bovis va forma o band de cretere de aproximativ 12 15
mm. sub nivelul suprafeei mediului (Fig.82).
Cu toate c M.bovis, bacilul Calmette-Guerrin (BCG) este varianta atenuat
a M. bovis, acesta a se comport similar cu M. tuberculosis n privina preferinei
pentru oxigen (4, 167).
a b c

Fig. 82 Creterea colonilor de M. tuberculosis (a,b) i M. bovis (c) n mediul semisolid

230
 Pentru evaluarea corespunztoare a rezultatelor, se vor folosi medii de
cultur cu asparagin, sruri minerale, concentraie crescut de glicerin (3,0 6,0
%) i pH=7,4. Agarul se folosete n concentraie de 0,1 0,2 % n cantitate de 2,0
ml./100 ml. de mediu.
nsmnarea se execut cu ansa care se ncarc cu c.c.a. 2,0 mg greutate
umed de bacili i materialul se depune pe peretele tubului apoi tubul se nclin
pn ce mediul vine n contact cu inoculul.
Teste biochimice i enzimatice de difereniere a micobac-
teriilor.

a). Testul niacinei (testul Konno), bazeaz pe proprietatea unor

micobacterii , aa cum sunt unele tulpini micobcateriene de a produce i de a
elibera n mediul de cultur niacin (acid nicotinic) n cursul dezvoltrii. Niacina
acumulat n mediul de culutr este evideniat printr-o reacie de culoare n
prezena unei soluii de anilin alcoolic i bromurii de cianogen.
Tehnica de lucru:
- n eprubetecu culturi de testat, n vrst de 15-21 de zile, se adaug 0,5 ml.
ap distilat;
- se nclzete uor eprubeta la flacr timp de 15 min., interval n care
niacina eliberat de micobacterii trece n lichid. nclzirea se va face cu atenie
pentru ca lichidul s nu ating punctul de fierbere;
- se prepar extemporaneu o slouie de alcool 90 care conine 4,0 % anilin
din care se adaug n tub n cantitate egal cu coninutul lichid al tubului; n
aceleai condiii se prepar o soluie de bromur de cianogen 10,0 % din care se
adaug 3-4 picturi.
Not: Aceast operaiune se va executa sub ni prevzut cu sitem de
evacuare corespunztoare, deoarece n timpul reaciei de degaj vapori extrem de
iritani, cu aciune cancerigen.
Interpretarea rezultatelor, sunt prezentate n fig. nr. 83, astfel:
Testul negativ: lichidul rmne incolor, indicnd absena niacinei aa cum
s-a putut constata n cazul culturilor M. bovis, M. kansasii , M. ulcerans (Fig.83 a).
Testul pozitiv: prezena niacinei coloreaz lichidul n galben, n cazul
culturilor de: M.tuberculosis, M. microti, M. simiae i M. bovis BCG (Fig.83 b);

a b
Fig. 83 - Testul niacinic pentru diferenierea micobacteriilor negativ(a) i poziiv (b)

Pentru executarea testului nu se vor folosi medii lichide cu snge aa cum este
mediul Midlebrook.
b). Testul nitratreductazei , este deosebit de valoros pentru difereni-erea M.
tuberculosis (nitrat reductaz pozitiv) de M. bovis (nitrat reductaz negativ) i alte de
micobacterii cu cretere lent. De asemenea, M. kansasii este intens pozitiv pentru
nitratreductaz , n timp ce alte micobacterii, cum sunt: M. ulcerans, M. marinum, M.
scrofulaceum, M. xenopi sunt negative n testul pentru nitratreductaz. n acelai timp,
majoritatea micobacteriilor cu cretere rapid, cu excepia M. chelonei i M. vaccae,
prezint testul nitrat-reductazei pozitiv.

231
 Tehnica de lucru:
- cu o ans spatulat, se recolteaz o cantitate suficient de colonii dintr-o
cultur de 4 sptmni care se suspend n 4,0 ml. nitrat de sodiu tamponat la pH
7,0;
- suspensia se incubeaz la baie de 37C timp de 4 ore, dup care este
acidifiat cu o soluie de acid clorhidric diluat 1/2;
- se adaug dou picturi de soluie apoas de sulfamid 0,2 % i dou
picturi de naftil-etil-diamid 0,1 %.

Interpretarea rezultatelor:

- dac cultura conine nitratreductaz apare imediat culoarea roie

deschis i testul este pozitiv ( Fig.84a);
- pentru confirmarea reaciei negative, n tuburile nereactive se adaug o
cantitate de praf de zinc care reduce imediat nitraii n nitrii n absena
nitratreductazei. (fig. 84 b).
a b

a b

Fig.84 - Testul nitratreductazei pentru diferenierea micobaceriilor: pozitiv (a), negativ (b)

c). Testul activiii catalazice. Se bazeaz pe proprietatea unor specii de

micobacterii de a elibera catalaz. Aceast proprietate este diferit de la specie la
specie i pe acest criteriu se poate face diferenierea ntre speciile de micobacterii.

Tehica de lucru.

Testul se execut pe culturi tinere sau subculturi de 15-21 de zile :

- n dou tuburi de hemoliz se repartizeaz cte 0,5 ml. dintr-o soluie de
Tween-80;
- se preleveaz cu o ans, aproximativ 5,0 mg. bacili din cultur din care se
face o suspensie foarte bine omogenizat n cele dou tuburi;
- unul dintre tuburi va fi nclzit n baie la 37 C timp de 15 minute pentru
inactivare;
- n ambele tuburi se adaug 0,5 ml. ap oxigenat 30,0 % sau cteva
picturi de perhidrol.

Interpretarea rezultatelor:

- cnd tulpina de testat este catalaz-activ, n tubul a se formeaz

nmeroase bule de gaz; n acest caz testul este pozitiv (Fig.85 a);

232
 - dac n al 2-lea tub (b) inactivat este absent eliberarea de gaz , tulpina
respectiv este catalaznegativ; astfel se difereniaz M. tuberculosis de M. bovis
(Fig.85 b);

Dac n ambele tuburi se elibereaz gaze (catalaz-pozitive) se identi-fic

micobacterii atipice.

Coloana de gaz

a1 b1 a2 b2
Fig. 85 - Interpretarea testului activitii catalazice pentru diferenierea micobacteriilor :
a1=M.tuberculosis; b1=M. bovis ; a2,b2 = micobacterii atipice.

Interpretarea cantitativ (metoda Wayne).

Se folosesc eprubete cu diametrul de de 20,0 mm. n care se prepar mediu

cu ou solidificat n poziie orizontal i nsmnat la suprafa cu colonii
micobacteriene.
Dup o incubare de 2 sptmni la 37C , se pipeteaz pe suprafaa culturii
1,0 ml. Tween-80 soluie 10,0 % n amestec egal cu ap oxigenat 30,0 %.
Dup 5 minute se msoar nlimea coloanei de gaz notndu-se
urmtoarele situaii:
- dac nlimea coloanei de gaz depete 50,0 mm. testul este pozitiv
pentru: M.kansasii (Fig.86 - 4);
- cnd coloana de gaz este sub 40,o mm., testul este pozitiv pentru:
M.tuberculosis, M. bovis i alte micobacterii patogene pentru animale i om
(Fig.86 - 2 i 3).

1 2 3 4
Fig.86 - Interpretarea cantitativ a testului activitii catalazice pentru unele specii de
micobacterii. Tubul 1 a fost insmnat cu o tulpin fr activitate catalazic (producie de gaz absent) ; tuburile 2 i 3 au
fost inoculate cu 2 tulpini slab productoare de gaz (coloana de gaz sub 45 mm) ;tubul 4 a fost inoculat cu o tulpin cu
activitate catalazic intens (coloana de gaz peste 45 mm.

n literatura de specialitate au fost descrise i alte teste de difereniere a

micobacteriilor dar care, n prezent, nu u intrat n practica laboratoarelor de
diagnostic veterinar datorit perioadei lungi de ateptare pn a obinerea
rezultatelor. Dintre aceste teste sunt amintite:

233
 .Testul hidrolizei cu Tween-80, este bazat pe schimbarea culorii n galben-
orange a unei soluii Tween-8o cu adaos de rou neutru. Soluia substrat se obine
din 0,5 ml. Tween-80 n 100,0 ml. tampon fosfat salin (TFS) cu 0,067 M, la care se
adug 2,0 ml. soluie 1,0 % rou neutru. Soluia repartizeaz n tuburi cu dop
nurubat de 16 x 125 mm.) n cantiti de 4,0 ml. i sterizate prin autoclavare.
Dup rcire se nsmneaz cu ansa micobacteriile i fiecare tub este
incubat la 3o-37C timp de 10 zile.
O modificare a culorii substratului din rou n galben-orange dup 24 de
ore sau dup 5 1o zile de incubare se consider reacie pozitiv (Fig.87).
Culoarea maxim trebuie s fie dispersat n interiorul substratului i de
aceea tuburile nu trebuie s fie agitate nainte de citirea reaciei. De asemenea,
trebuie s se in seama de faptul c uneori chiar celulele pot fi pozitive la rou
neutru care conduc la interpretri eronate ale testului (rezultate fals pozitive).

1 2

incubare 5-10 zile

1 2 + -

Fig. 87 - Testul hidrolizei cu Tween-80

.Testul activitii ureazice (metoda Steadham). Pentru realizarea

testului se folosesc coloniile de Mycobacterium dezvoltate pe mediul Lwenstein-
Jensen recoltate cu ansa bacteriologic i dispersate n 1,0 ml. de bulion cu uree
preparat astfel:
Pepton................................................................................... 1,0 g;
Dextroz.................................................................................. 1,0 g;
Clorur de sodiu......................................................................5,0 g;
Fosfat monobazic de sodiu..................................................... 0,4 g;
Uree.......................................................................................20,0 g;
Rou fenol sodic ..................................................................... 1,0 ml.
Tween-80................................................................................ 0,1 ml.
Ap distilat......................................................................1000,0 ml.
Tuburile se incubeaz la 30- 37C i citirea reacei se va face dup 1-7 zile .
Modificarea culorii bulionului-uree din galben strlucitor n roz nchis sau
rou indic scderea ureei (activitate ureazic intens a micobacteriilor testate ) i
testul va fi interpretat ca pozitiv.

234
 .Testul activitii fosfatazei acide, folosete o soluie substrat preparat
din 100 mg. pirimidin-fenolftalein-fosfat cristale dizolvat n 100 ml. tampon acid
acetic-acetat de sodiu 0,2 M (pH 5,2). Tamponul va fi autoclavat la 100 C timp de
30 de minute dup care ,va fi rcit la temperatura camerei nainte de a fi repartizat
n tuburile de reacie.
Fiecare tub care conine cte 1,0 ml. din soluia substrat tamponat se
nsmneaz cu ansa bacteriologic ncrcat cu colonii micobacteriene i cultura
astfel obnut va fi incubat la temperatura de 30 -37 C timp de 4 ore dup care
se adaug 1,o ml. din soluia 10,0 % Na 2 CO3 n H2O pentru stoparea reaciei i
evidenierea culorii.
Rezulultatele testului activitii fosfatazei acide pentru mcobacterii, se
interpreteaz comparnd intensitatea culorii din tuburile de testat cu o scar de
culori standard preparat astfel: din soluia standard stoc de fenolftalein ( 1,0 mg
fenolftalein pur/ml. etanol 95% ) se realizeaz diluii de 2,5; 5,0 i 10,0 g/ml.
H2O. Aceste diluii sunt tratate cu soluie de carbonat de sodiu n acelai mod ca i
soluiile de testat.
O prob de testat care este slab colorat sau o prob care este colorat n
roz dar culoarea este mai intens dect cea standard corespunztoare diluiei de
2,5 g. va fi considerat negativ i tulpina micobacterian respectiv inactiv
pentru fosfataz acid.
Proba a crei intensitate a culorii corespunde standardului de 10,0 g
fenolftalein va fi considerat pozitiv i tulpina micobacterian respectiv,
activ pentru fosfataz acid.

.Creterea n prezena acidului p-nitrobenzoic.

Acidul p-nitrobenzoic inhib creterea mai multor specii din cadrul
complexului M. tuberculosis: M.tuberculosis , M. bovis, M.africanum i M. microti
(122).

.Creterea n prezena hidrazidei acidului thiphen-2-carboxilic.

Acest test este utilizat pentru diferneierea M.tuberculosis, care crete n
prezena acestui compus, de ali reprezentani ai complexului M. tuber-culosis. M.
canetii i cele mai multe micobacterii netuberculoase sunt de asemmenea pozitive
la acest test (236).

.Testul pirazinamidazei.
Pirazinamidaza este o enzim care hdrolizeaz pirazin-amida n amoniac i
acid pirazinoic. Testul se utilizeaz pentru diferenierea unor specii de micobacterii
din com-plexul M. tuberculosis, negative la pirazinamidaz fa de M.
tuberculosis i M.canetti , specii pozitive la acest test.
Totui, unele tulpini de M. tuberculosis pot dobndi rezisten la pirazin-
amid datorit presiunii selective induse de tratamentul cu acest medicament.

235
 Aceste tulpini sunt negative la testul pirazinamidazei dovedind c sunt
incapabile s transforme pirazinamida n acid pirazinoic, forma activ a
medicamentului (236).
Pentru sitematizare, n scopul unei nelegeri mai bune a importanei metodelor
prezentate mai sus pentru diagnosticul diferenial
n continuare sunt prezentate cteva dintre criteriile de identificare i
difereniere ale unor specii de micobacterii (Tabelele nr. 23 i 24).
Tabelul: 23

Caracterele difereniale ale unor micobacterii (M. tuberculosis, M. bovis,

M. avium avium, M. avium intracelulare).
Criteriul de difereniere M. M. bovis M. M.avium
tuberculosis avium intracelulare
avium
Cretere pe medii cu glicerol + - - -
Medii fr glicerol +/- + + +
Medii cu piruvat de sodiu +/- + ? ?
Cretere R S R
Pigmentogenez - - - -
Catalaz (col. gaz)
Niacin + - - -
Nitratreductaz + + - -
Ureaz + + - -
Nicotinamidaz + - + +
Pirazinamidaz + - + +
Inhibare n prezena TCH - - + +
(10 mg/ml.)
Hidroliza Tween-80 (+) - - -
Acrilsulfataz - - - -
Alfa L-fucodaz - - - -
Reducere telurit - - (+) +
Temperatura de cretere la: +/- +/- - -
25C
37C + + + +
42C - - + +
Preferin pentru oxigen + - ? ?

R= cretere eugonic; S= cretere disgonic ; (+)= variabil; +/- = unele tulpini; (g.p) = pigment galben portocaliu.
ND= nedeterminat

Tabelul:24

Caracterele difereniale ale unor specii de micobacterii cu cretere rapid

Specificare M. fortuitum M. M. M. M.
A B C smegmati phlei vaccae flavescen
s s
Pigmentogenez - - - - + + +
Cretere la 45C + - - + + - -
Cretere dup nclzire la 60C - - - - + - -
Acril sulfataz la 3 zile + + + - - - +
Nitratreductaz + + + + + (+) +
Utilizarea citratului + + + + + (+) -
Alantoinaza + + + + + + -
Formare de acid din : Manitol - + + + + + (+)
Inozitol - - + + - + -
Xiloz - - - + + + -

Destul de frecvent, laboratoarele de specialitate utilizeaz ca ele-mente de

diferenierea a micobacteriilor: creterea pe mediul LwensteinJensen (L.J.),
preferina fa de oxigen, activitatea nutratreductazi rezistena sau sensibilitatea
la unele tuberculostatice. Dup aceste criterii, n tabelul nr.25, sunt prezentate
caracteristicile princi-palelor micobacterii din Com-plexul M. tuberculosis.

236
 Tabelul: 25

Caracteristicile prinicipalelor micobacterii din Complexul M. tuberculosis

Specia Cretere pe Preferin pt. Nitrat- Sensibil sau rezistent

Mediul L.J. O2 reductaz la:
TCH PZ
M. tuberculosis Eugonic Aerob + Rezistent Sensibil
M. africanum Variat Microaerofil Variat Variat Sensibil
M. asiaticum Eugonic Aerob + Sensibil Sensibil
M. bovis Disgonic Microaerofil - Sensibil Rezistent
M.bovis-BCG Eugonic Aerob - Sensibil Rezistent
TCH = Hidrazida Ac.Tiofen-2- Carboxilic; PZ= Pirazinamida

4.2.1.4. Metode bacteriologice moderne.

Prognoza nefavoabil a tuberculozei pe plan mondial a condus, n cursul

ultimelor dou decenii, la elaborarea i perfecionarea unor metode de diagnostic
bacteriologic al micobacteriozelor mai rapide, cu specificitate i sensitivitate mai
crescute dect metodele clasice. Eforturile conjugate n cercetarea mijloacelor de
investigaie n domeniul microbilogiei, biochimiei, biofizicii, informaticii i
tehnicilor de monitorizare i calcul aplicate au fost ncununate de succese
remarcabile prin elaborarea i standardi-zarea unor metode cu performane et
superioare celor clasice.
Metode de cultur a micobacteriilor n sisteme BACTEC.
Majoritatea specialitilor n domeniu sunt de acord c evidenierea
micobacteriilor prin microcopie i cultur bacteriologic clasic, n etapa actual,
constituie termen de referin (standard de aur ). Totui, metodele rapide de
cultur, rezolv n mare msur dezavantajul rezultatului tardiv furnizat de
metodele clasice i reduc substanial procentul rezultatelor false nregistrate ca
urmare a erorilor aprute n cursul aplicrii procedurilor de lucru. (144, 119).
Datele din literatura de specialitate dovedesc c, prin aplicarea metodelor
bacteriologice moderne, rezultatele finale se obin cu circa 30-40 de zile mai repede
dect n metodologia clasic (Fig.88).
nsmnare

M.bovis
Sistem BACTEC
Metoda clasic

0 10 20 30 40 60 perioada de observaie (zile)

Fig. 88 - Perioada de observaie necesar obinerii rezultaelor pentru cultura de M. bovis n sisteme
BACTEC comparativ cu metodele bacteriologice clasice.

n funcie de echipamentele, materialele i procedeele utilizate, literatura de specialitate

recomand cteva sisteme de diagnostic bacteriologic al micobacteriozelor cum ar fi:
sistemele BACTEC-TB 460 , sistemul MGIT, sistemul VersaTREK, sistemul Bact/Alert 3D.
Pricipiul i modul de funcionare precum i performanele acestor sisteme vor fi
prezentate n continuare.
237
 . Sistemul radiometric BACTEC-TB 460 (Becton Dickinson Sparcks, MD),
a fost primul i singurul procedeu automat utilizat de aproape dou decenii pentru
diagnosticul micobacteriozelor.
Pricipiul de funcionare. n cursul dezvoltrii lor, micobacteriile utilizeaz
pentru hran acidul palmitic marcat cu C (carbon radioactiv) prezent n
compoziia mediului de cultur Mddlebrook 7H9 sau 7H12. Prin metabolizarea
acidului palmitic, micobacteriile elibereaz CO2, n molecula cruia, carbonul
este marcat radioactiv (C).
Flacoanele cu mediul 7H9 sau 7H12 sunt nchise cu dopuri din cauciuc
(asemntor cu flacoanele pentru antibiotice sau unele produse bio-logice), sigilate
i prevzute cu sonde speciale pentru msurarea concentraiei de CO2 n cursul
perioadei de incubaie a culturilor.
Pentru evitarea contaminrii mediului cu flor de asociaie n timpul
insmnrii materialelor patologice, productorul livreaz mpreun cu mediul de
cultur un amestec de polimixin B, amfotericin B, acid nalidixic, trimetoprim,
azlocilin (PANTA) care se reconstituie n momentul utilizrii cu o soluie de
polioxietilen.
Modul de lucru.
Dup cum rezult din enunul pricipiului de funcionare al sistemului
BACTEC-TB 460, tehnica de lucru este destul de simpl, rezumndu-se doar la:
- pregtirea materialelor patologice, dup metodele descrise anterior,
pentru inocularea pe medii de cultur clasice;
- reconstituirea amestecului PANTA cu polioxietilen i inocularea acesteia
cu ajutorul seringii prin puncia dopului de cauciuc;
- nsmnarea mediului de cultur 7H9 n manier asemntoarea cu
soluia PANTA (cu ajutorul seringii) ; pentru fiecare prob este suficient a se
nsmna un singur flacon cu mediu 7H9 sau 7 H12 ;
- incubarea culturilor ntr-un incubator care asigur toate condiiile
necesare dezvoltrii micobacteriozelor.
Bioxidul de carbon marcat radioactiv (CO2 ) rezultat n urma
catabolizrii acidului palmitic de ctre micobacteriile vii n cursul dezvoltrii este
msurat cantitativ cu ajutorul echipamentului cu sonde de detecie, scala fiind
etalonat de la 0 999 iar rezultatele, exprimate n indice de cretere (I.G.- growth
index), sunt afiate electronic pe monitorul echipamentului pentru fiecare prob n
parte.
Necesitatea diferenierii micobacteriilor aparinnd Complexului
Mycobacterium tuberculosis de alte micobacterii, neimplicate n infecia
tuberculoas, a condus la mbuntirea performanelor sistemului BACTEC-TB
460 prin adugarea la mediul de cultur a p-nitro--amino--
hidroxipropiofenonei (NAP) i acidului p-nitro-benzoic (testul PNB) (28).
Prezena acestor compui n mediul de cultur inhib creterea
micobacteriilor din complexul M. tuberculosis fr eliberare de CO2 sau
concentraia rmne sub pragul pozitivitii pe toat perioada de observaie a
culturilor n timp ce micobacteriile, altele dect agenii cauzali ai tuberculozei, se
dezvolt n prezena NAP i, n consecin, se nregistreaz creterea progresiv a
CO2.
Performane
Sistemul BACTEC-TB 460 a fost comercializat pentru prima dat n 1980 i
ulterior acesta s-a extins n toate zonele lumii. Sistemele radiomterice BACTEC-TB
238
 460 actuale au n componen camera de incubare a probelor (capacitate
460 flacoane, cu regim termic reglabil) prevzut cu instalaie electronic de
detecie i msurare a CO2 i de prelucrare i afiare a datelor care este
programat s execute citirile de dou ori pe sptmn n cursul primelor 15 zile i
apoi sptmnal pn la 42 de zile. Rezultatele afiate sunt interpretate fa de o
scar notat cu valori de 0 999.
Sistemul BACTEC-TB 460 a dovedit superioritate incontestabil n ceeace
privete sensitivitate i perioada de ateptare pn la obinerea rezultatelor fa de
metodele clasice cu medii de cultur solide . Mai trziu, n ciuda apariiei altor
sisteme de diagnostic rapid al micobacteriozelor, metoda radiometric BACTEC-TB
460 rmne competitiv (232).
Sistemul BACTEC-TB 460 poate fi folosit i pentru realizarea culturilor de
micobacterii din probe de snge, n asemena situaii apelnduse la flacoane cu
mediu de cultur speciale.
Singurul dezavantaj al sistemului BACTEC-TB 960 const n riscul de
expunere prelungit a operatorului la emisiile radioactive prin manipula-rea
mediilor de cultur n coninitutul crora exist carbonul radioactiv (C).
De aceea , n ultimele decenii, metodele colorimetrice ctig tot mai mult
teren, majoritatea laboratoarelor apelnd la asemenea sisteme de diagnostic
bacteriologic al micobacteriilor.

. Sistemul colorimetric BACTEC-MGIT960, utilizeaz tehnologia

asemntoare cu cea pentru culturile de snge. Sistemul original (BACTEC-
MGIT9000) a fost adaptat pentru culturi micobacteriene n tuburi pentru o
manipulare mai uoar n cursul procesrii probelor.
Tuburile pentru cultura micobacteriilor conin mediu Middlebrook 7H9
modificat prin suplimentare cu un amestec de acid oleic, albumin, dextroz i
catalaz (OADC) i complexul cu antibiotice PANTA folosit n sistemul
radiometric . nsmarea mediului de culutr se face prin metoda in pictur sau
cu ansa bacteriologic tubul fiind prevzut cu capac nfiletat.
Pe fundul fiecrui tub este fixat o band de celuloid impregnat cu sare
de rutheniu, ca indicator pentru fluorescen care este evideniat cu ajutorul unui
fascicol UV, preluat de un receptor pentru fluorescen i procesat ntr-un
computer incorporat n camera de incubare cu program de monitorizare i afiare a
rezultatelor finale.
Principiul de funcionare a sistemului colorimetric BACTEC-MGIT 960 se
bazeaz pe faptul c prezena oxigenului n tubul cu mediu de cultur stinge
fluorescena natural a srii de rutheniu. n perioada de incubare (361 C ),
cantitatea de oxigen din tuburile de cultur n care se dezvolt micobacteriile se
reduce considerabil ca urmare a consumului acestuia de ctre micobacterii n
procesele metabolice active. n consecin, se nregistreaz o cretere progresiv a
intensitii fluorescenei afiat pe monitorul calculatorului pentru fiecare prob n
parte. Acele tuburi n care s-a nregistrat fluorescen vor fi considerate pozitive.

239
 Monitorizarea culturilor n sistemul BACTEC-MGIT960 se face din or n
or i atunci cnd proba se pozitiveaz se declaneaz un sistem de avertizare iar pe
monitor sunt afiate datele de identificare a probelor pozitive i perioada de
incubare consumat.
Studiile de specialitate au demonstrat perfromanele sistemului BACTEC-
MGIT 960 sunt net superioare, dovedindu-se mai rapid i mai sensibil dect
celelalte sisteme automate i convenionale de cultur a micobacteriilor (10, 43, 173,
196, 228).
Sistemul colorimetric BACTEC-MGIT960 este desinat pentru culturi
primare din probe de esuturi, secreii, sput, lichide pleurale, ascitice i lichid
cefalorahidian dar nu poate fi utilizat pentru culturi micobacteriene din sn-gele
integral.

. Sistemul VersaTREK , este destinat att pentru culturi din esuturi dar i
din produse patologice lichide i semilichide, inclusiv din snge. Iniial sistemul
VersaTREK a fost denumit ESPII.
Sistemul Versa TREK utilizeaz pentru cultura micobacteriilor mediul
Middle-brook 7H9 modificat prin adaus AODC i dou amestecuri de antibiotice.
Primul amestec, cunoscut sub denumirea AS, este compus din: Polimixina B ,
Azlocilin, Fosfomicin, Ac. Nalidixic i Amfotericina B. Al 2-lea amestec conine:
Polimixina B, Vancomicina, Ac. Nalidixic i Amfotericina B (PVNA). Complexul AS
este utilizat atunci cnd inoculul este preparat din probe sterile sau care prezint
un risc redus de contaminare.
Flacoanele cu mediul Middlebrook au pereii cptuii cu o pelicul
celulozic cu porozitate mare care permit mbuntirea creterii mico-bacteriilor i
nsmnarea se face cu ajutorul seringii prin puncionarea sptumului capacului din
cauciuc. Camera de incubare a culturilor este complet, cu un reader automat care
monitorizeaz dezvoltarea micobacteriilor, prelucreaz i afieaz electronic
rezultatele i un mecanism de agitare continu a culturilor. Fiecare flacon este
cuplat, pe toat durata incubrii, la o sond pentru msurarea i monitorizarea
presiunii n interiorul flacoanelor i datele sunt transmise la microprocesorul PC.
Consumul de oxigen din interiorul flacoanelor n care se dezvolt
micobacteriile conduce la scderea presiunii interioare ale crei valori sunt
afiate pe monitorul calculatorului. Acele culturi n care presiunea interi-oar este
redus semnificativ, sunt considerate pozitive.
Performane. Sistemul Versa TREK, extrem de simplu, realizeaz
monitorizarea individual continu a flacoanelor cu culturi de micobacterii i este
prevzut cu sistem de avertizare n momentul pozitivrii probelor i de semnalizare
a terminrii perioadei de incubare.
Studiile comparative cu culturile clasice pe medii solide, au artat c
sistemul Versa TREK a demnostrat performane superioare dar nu prezint
avantaje substaniale fa de celelalte sisteme automate i semiautomate (228, 244).
Sistemul Versa TREK este capabil s realizeze culturi numai din sedimentul
rezultat din procesarea sngelui integral prin centrifugare-liz cu saponin pentru
distrugerea celulelor sanguine i ndeprtarea supernatantu-lui prin aspirare cu
ajutorul pipetelor speciale.

. Sistemul Bact/Alert-3D, cunoscut anterior sub denumirea de MB /Bac T,

este destinat exclusiv pentru culturi micobacteriene din snge.
240
 Pentru culturi, se folosete mediul Middlebrook 7H9 supilimentat cu OADC
i complexul de antibiotice format din: Polimixina B, Amfotericina B, ac. Nalidixic ,
Trimetoprim, Vancomicin i Azlocilin, adugat n momentul utilizrii mediului.
Complexul de antibiotice protejeaz cultura de eventuale contaminri cu
microorganisme de asociere, altele dect micobacteriile i utilizarea lui nu exclude
celelalte proceduri de decontaminare a probei efectuate anterior inoculrii probei.

Lichid de
cultur

Senzor CO2

Lumina
reflectat

Fotodoid

Fig.89 - Principiul de funcionare al sistemului Bact/Alert -3 D.

Flacoanele cu mediu de cultur conin cte un senzor pentru CO2 fixat la

fundul fiecrui tub.
nsmnarea mediului se face prin penetrarea capacului de cauciuc cu
ajutorul seringii.
Sensorul pentru CO2 este impresionat de un fascicol luminos a crei
intensitate este monitorizat de o foto - diod (Fig.89).
Micobacteriile care se dezvolt n cultur elibereaz, n urma proceselor
metabolice, CO2 determinnd schimarea culorii sensorului din gri n galben i n
final se modific ntensitatea luminii captate de foto-diod
Flacoanele n care se produc modificri importante ale intensitii luminii
sunt considerate pozitive (Fig. 90).

Fig.90 -Tuburi de cultur pentru micobacteri n sistemul

BactAlert-3D pozitive (dreapta) i negative (stnga)

241
Performane. Sistemul BacT/ALERT 3D, monitorizeaz culturile de
micobacterii la intervale de 10 minute iar mecanismul de avertizare intr n
funciune cnd probele se pozitiveaz mpreun cu semnalizarea ncheierii
perioadei de incubare mai rapid i mai sensibil dect culturile pe medii
cnvenionale dar fa de alte sisteme automate i semi-automate nu s-au nregistrat
diferene semnificative (10, 32, 124, 156, 170, 187, 252).
Recent, sistemele comerciale BacT/ALERT 3D au fost mbuntite pentru
culturile de micobacterii din probe de snge, prin utilizarea mediilor de cultur
tratate cu antibiotice complexe i spectru larg antibacterian, eli-minnd etapele de
decontaminare a probelor n cursul pregtirii acestora pentru inoculare.

4.2.1.5. Metode de amplificare a acizilor nucleici.

Recrudescena tuberculozei n ultimul deceniu, rspndirea bolii pe arii

extinse ale globului pmntesc, cu peste 2,0 milioane de decese n rndul populaiei
umane i aproape 8 milioane de cazuri noi nregistrate anual, cu pierderi economice
extrem de ridicate n efectivele de animale, dar mai ales potenialul redus a
metodelor convenionale de izolare identificare a micobacteriilor (perioad de
sptmni i chiar luni pn la finalizarea diagnosticului, valoare de diagnostic
redus, etc.) au condus la preocupri susinute n domeniul cercetrii biologiei
moleculare pentru descoperirea unor metode mai rapide i cu un coeficient de
exactitate ridicat, care s satisfac nu numai dezideratul izolrii i identificrii
micobacteriilor dar i problema susceptibilitii micobacteriilor la medicamente
specifice.
Studiul diferitelor inte din structura genomului micobacteriilor au stabilit
nu numai complexitatea n cadrul diferitelor specii de micobacterii dar i
arhitectura extrem de similar a acestuia la unii reprezentai ai Complexului
Mycobacterium tuberculosis, ceea ce a condus la dificulti i confuzii n
diferenierea micobacteriilor aparinnd acestui grup. De aceea, ultimele decenii se
remarc prin cercetri susinute n domeniul inginieriei genetice i biologiei
moleculare care au descoperit n genomul a peste 95 % dintre tul-pinile de M.
tuberculosis elementul de inserie IS6110 prezent n mai multe copii, variind de la 4
20 (Fig. 91).
1 2 3 4 5 6

IS6110

Fig. 91 - Genomul unei tulpini de M. tuberculosis cu 6 copii ale IS6110

Descoperirea elementului de inserie IS6110 n genomul micobacteriilor a

reprezentat un pas important n mbuntirea sensitivitii i eficientizarea unor
metode moleculare pentru diagnosticul infeciilor tuberculoase. Alte cercetri
importante au condus la descoperirea, n structura acidului dezoxiribonucleic
(ADN) al micobacteriilor, a unor regiuni care cuprind: gena proteinei de oc termic
de 65 kDA, gena care codific proteina de fuziune de 126 kDa i gena care codific
subunitatea - polimerazei ac. ribonucleic (ARN). Reprezentanii Complezului M.
tuberculosis au n structura genomului toate aceste gene ntr-o singur copie.
O multitudine de cercetri ulterioare s-au focalizat asupra elaborrii,
dezvoltrii i omologrii, unor metode practice de diagnostic al tuberculozei i altor
infecii micobacteriene, bazate tocmai pe separarea, amplificarea ele-mentului de
inserie IS6110 i detecia genelor care difereniaz ntre ele micobacteriile
incrimate n producerea infeciilor la animale i oameni.
242

Asemenea metode au fost concepute n scopul reducerii substaniale a

timpului de ateptare pn la finalizarea diagnosticului, de la cteva sptmni la
cteva zile i, n acelai timp, stabilirea gradului de susceptibilitate sau rezisten a
micobacteriilor fa de unele medicamente antituberculoase.
Totodat, au fost perfecionate metode moleculare capabile s detec-teze
micobacteriile direct din materiale patologice provenind de la cazuri clinice. Unele
dintre aceste metode, fiind elaborate dup proceduri proprii fiecrui laborator n
parte, au primit denumirea in house methods i de aceea ele s-au utilizat la scar
mai restrns pentru diagnosticul micobacteriozelor. Alte metode, denumite
comerciale, utilizeaz echipamente, materiale i kituri omologate, procedeele de
lucru fiind standardizate i automatizate. Cteva dintre metodele comerciale
( testul MTD amplificat, testul Amplicor MTB) au fost autorizate de
Administraia pentru, Alimentaie i Medicamente din SUA (US-FDA) i n prezent
sunt utilizate pe scar larg pentru diagnosticul micobacteriozelor.

. Testul MTD-Apmlificat (E-MTD)

Testul amplificrii directe a Mycobacterium tuberculosis (AMTD) elaborat
de Institutul Gen-Probe, San Diego, CA, USA) este un sistem care realizeaz
amplificarea transcriptazei la cald (42C)
Regiunea 16S a genei ribosomale a acidului ribonucleic (ARN) din genomul
Mycobacterium tuberculosis produce acid dezoxiribonucleic (ADN) ribosomal
dublu helicoidal sub aciunea combinat a revers transcriptazei i ribonucleazei. n
retur, ARN-polimeraza catalizeaz sinteza fragmenteleor multiple de ARN
ribosomal din ADN sintetizat anterior. Un nou ciclu ncepe cnd noul ARN-
ribosomal produs suport alte transcripii prin reverstrans-criptaz.
Ampliconii ARN sunt detectai utiliznd proba ADN cuplat ester-acridin n
soluie pentru analiza hibridizrii. Dup procedeele clasice de decontaminare i
concentrare a probelor, lucrrile de amplificare a acizilor nucleici i interpretarea
rezultatelor este de 3,5 ore (210).
Sensitivitatea metodei este ridicat datorit prezenei unui numr crescut
de molecule int de 16S-ARN-ribosomal n micobacterii (c.c.a 2000) fa de numai
o singur copie a 16S-ADN-ribosomal.
Un alt avantaj al amplificrii ARN se bazeaz pe o stabilitate sczut a
acestor molecule ceea ce determin reducerea substanial a riscului de conta-
minare cu molecule int strine ARN micobacterian i n consecin scderea
semnificativ a rezultatelor fals-pozitive.
Cu excepia extraciei acizilor nucleici, care se realizeaz prin sonicare i
citirea rezultatelor finale cu ajutorul luminometrului, restul procedurilor sunt
manuale. De asemenea, etapa complet de amplificare se realizeaz ntr-un bloc
termic la 42C. Pe de alt parte, trusa cu kituri pentru MTD-amplificat nu conine
reageni de control pentru monitorizarea prezenei inhibitorilor.
Metoda a fost recomandat de ctre US-FDA pantru testarea probelor din
tractusul respirator cu examen bacterioscopic pentru BAAR pozitiv i negativ, n
funcie de care, sensitivitatea este variabil, ntre 91,7 100% pentru probele cu
examen bacterioscopic pozitiv i 65,5 92,9 % dintre probele cu examen
bacteriocopic negativ pentru BAAR (47, 22,162, 172)
243

ntr-o recenzie asupra diagnosticului micobacteriilor prin metode moleculare, S i

o n i H. i M u s s e r J. M. , 2001 (210) citeaz o serie de lucrri de specialitate n
care specificitatea testului s-a ncardat ntre 98,8 100 % n timp ce valoarea
predictiv pozitiv a fost de 83,3 100 % iar cea negativ de 98,4 99,6 %.

. Testul Amplicor MTB (Roche Molecular Systems, Basel, Switzer-land),

se bazeaz pe tehologia PCR standard.
Pricipiul metodei.
Fragmentul de 584 baze-proteice din gena ribosomal 16S-ARN, care
cuprinde o regiune specific pentru specie flancat de secvene specifice ge-nului,
este amplificat cu ajutorul primerilor cu biotin. Ampliconii sunt apoi denaturai n
fragmente simple care se repartizeaz n godeurile unei plci de microtitrare ale
crei godeuri sunt cptuite cu o oligonucleotid specific pentru M.tuberculosis
sau alt micobacterie suspectat a fi responsabil de infecie.
Conjugatul ovidin-peroxidaz mpreun cu complexul ampliconi-biotin
reacioneaz cu peroxidul 3,3,5,5-tetrametil-benzidina (TMB) n dimetil-
formamid, rezultnd o reacie de culoare care poate fi msurat la un fotometru.
Rezultatele fals-pozitive care pot s apar ca urmare a contaminrii
nespecifice a probelor n cursul etapelor de lucru sunt eliminate prin incorpoarea
UTP cuplat la uracil-N-glicolaza de restricie.
Dup decontaminarea probelor cu N-acetil-L-cistein-NaOH i con-
centrarea acestora, rezultatele testului Amplicor se obin n 6 ore.
n Europa, se utilizeaz pentru diagnosticul infeciilor micobacteriene
varianta automat Cobas-Amplicor.
Echipamentul Cobas-Amplicor elimin manevrele suplimentare care ar
putea contamina nespecific probele, acestea fiind transferate automat n staia de
detecie prin reacia cromogen a crei intestitate este nregistrat de cititorul
fotometric.
Metoda a fost aprobat de US-FDA pentru analiza probelor, pozitive la
examenul bacterioscopic pentru BAAR , recoltate din cile respiratorii.
Pentru certificarea i validarea rezultatelor, echipamentul Cobas-Amplicor
include testarea probelor n paralel cu o prob martor control compus din ADN
sintetic cu secvene identice cu ADN int micobacterian. ADN ul martor
neamplificat indic prezena inhibitorilor n prob.
Exist disponibile i pot fi comercializate i alte kituri Amplicor pentru
detecia direct a ADN-ului specific pentru M. avium i M. intra-celulare din probe
clinice .

Performane le testului.

n ultimii 10 ani, numeroase studii i lucrri de specilaitate au analizat

parametrii de performa ai testului Amplicor MTB (Cobas Amplicor ),
majotitatea stabilind c, n general sensitivitatea i specificitatea testului sunt
superioare fa de alte metode atunci cnd sunt analizate probe de la pacieni cu
tuberculoz pulmonar dar valorile acestor parametri sunt nesatisfctoare pentru
probe provenind de la pacieni cu tuberculoz extrapulmonar.

244
 O z k u t u k a K . S . e t a l., 2006 (163)., analiznd 173 eantioane
provenind de la pacieni cu tuberculoz pulmonar i 251 cu tuberculoz
extrapulmonar, utiliznd metoda COMBAS-AMPLICOR-MTB n comparaie cu
cultura bacteriologic i exmanul bacterioscopic direct pe amprente colorate pentru
BAAR, constat c sensitivitatea, specificitatea i valorile predictive pozitiv i
negativ au fost: 73,0%, 100,0 %, i 97,0 % pentru probele de la pacieni cu
tuberculoz pulmonar i: 45,0 %, 100,0% i 96,0 % pentru grupa cu tuberculoz
extrapulmonr
Valorile parametrilor analizai sunt apropiate de cele stabilite anterior de
ali autori pentru 43 de noduri limfatice recoltate de la pacieni cu infecie
tuberculoas (183).
De asemena, n studiul performanelor testului COBAS-AMPLICOR-MTB
comparativ cu metoda BD-Probe TecET pentru detecia Mycobacterium
tuberculosis din probe prelevate din cile respiratorii sensitivitile s-au situat la
valori de 78,6% pentru COBAS-AMPLICOR-TB i 86,2% pentru BD-Probe TecET i
numai 61,5% n microscopie direct pentru BAAR n timp ce specificitile s-au
ncadrat ntre 99,7% i 99,9 % pentru toate cele 3 metode. (81).
Cu toate c anterior s-a susinut ideea ineficienei testului COBAS-
AMPLICOR-MTB n diagnosticul tuberculozei extrapulmonare, ncercri recente au
demonstrat c metoda poate fi utilizat pentru detecia M. tuberculosis din probe
prelevate de la bolnavi cu tuberculoz gastr0-intestinal, renal i cu meningit
tuberculoas (52, 83).
n acest domeniu, H a l d a r S. e t a l., 2009 (89) evideniaz eficiena
diagnosticului n meningita tuberculoas prin detecia ADN- M.tuberculosis
din lichidul cherbrospinal utiliznd PCR. Autorii citai, re-comand utilizarea
filtratului din lichidul cerebrospinal pentru diagnostic n PCR avnd n vedere c n
studiile fcute au obinut o sensitivitate de 87,6 % la probele din filtrat fa de
numai 53,1 % cnd s-a analizat sedimentul din probe.

. BD Probe Tec ET. Sistemul BD Probe Tec ET utilizeaz tehnologia SDA

(Strand Displacement Amplification) pentru detecia calitativ a ADN
Mycobacterium tuberculosis din probe, cum ar fi: sputa, scurgeri nazale, splturi
bronhice, lichid pleural, biopsii pulmonare, prelevate din cile respiratorii,
decontaminate i prelucrate prin digestie. Metoda poate fi utilizat ca test direct
pentru evaluarea probelor provenind de la pacieni netratai antituberculos, dar
suspeci de tuberculoz. Prin metoda BD Probe TEC ET pot fi testate mai multe
grupe din categoria pacienilor netratai antituber-culos i anume:
- grupa pacienilor care nu au fost supui niciodat terapiei antituber-
culoase;
- grupa pacieniolr care nu au fost supui tratamentului antituber-culos n
ultimele 12 luni, sau:
- au fost tratai dar nu au trecut mai mult de 7 zile de la aplicarea
medicaiei pn la testare.
Testul BD Probe Tec ET utilizeaz reageni pentru fiecare dintre re-
prezentanii complexului M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG,
M. africanum, M. microti) prin tehnologia SDA bazat pe amplificarea
fragmentelor ADN i transferul de energie fluorescent (ET). Detecia mico-
bacteriilor enumarate mai sus se face direct din probe clinice decontaminate i
prelucrate prin digestie.

245
Pricipiul metodei.
 Mecanismul de amplificare a ADN int este extrem de complex. Testul BD
Probe Tec ET se bazeaz pe amplificarea simultan i detecia ADN int utiliznd
primeri de amplicare pentru fragmentele care limiteaz sec-vena IS6110 al ADN
specific complexului Mycobacterium tuberculosis i un marker fluorescent pentru
detecie.
Sedimentul obinut din prob dup procesarea acesteia dup proce-durile
clasice, se repartizeaz n microgodeurile n care exist primerii de amplificare,
markerul fluorescent pentru detecie i ali reageni.
Dup incubare urmeaz faza de amplificare, prin transferul ames-tecului de
reacie n microgodeurile care conin dou enzime: ADN-polimer-aza i o
endonucleaz de restricie, necesare pentru SDA.
Microgodeurile de amplificare acoperite etan, pentru a evita conta-
minarea nespecific, se transfer ntr-un echipament termo-reader controlat
fluorescent, care monitorizeaz reacia pentru de generaia de produse amplificate.
Fiecare reacie coamplific i detecteaz o amplificare intern de control (IAC), care
confirm validitatea reaciei de amplificare i identific potenialii inhibitori
prezeni n probele procesate.

Performanele testului. Studiile de specialitate au stabilit c rata

sensitivitii testului BD Probe Tec RT se ncadreaz ntre 98,5% i 100,0 % pentru
probele cu examen microscopic direct pe amprente pentru BAAR pozitiv i foarte
variabil (0,33% - 100,0 %) pentru probele negative la examenul microscopic
pentru BAAR (18,22, 136, 135, 172, 242).

Concluzii i comentarii asupra metodelor de amplificare ADN.

Rezultatele cercetrilor de specialitate conduc la urmtoarele con-cluzii i

comentarii:

. Cu toate c metodele de amplificare direct a acizilor nucleici mico-

bacterieni se utlizeaz pe scar larg, ele sunt departe de a sprijini n totalitate
microbiologia clinic. Cultura bacteriologic, mpreun cu microscopia direct
pentru detecia BAAR, rmn metodele standard de aur, tehnicile moleculare
reprezentnd mijloace prinncipale de diagnostic al tuberculozei numai n anumite
cazuri;

. Sensitivitatea nesatisfctoare, n special pentru probele cu examen

bacterioscopic negativ pentru BAAR, ar putea fi cauza major a ne-ncrederii n
metodele bazate pe amplificarea acizilor nucleici din micobacterii. n prezent,
exist date care susin ineficiena metodelor de amplificare de a detecta acizii
nucleici micobacterieni n probele paucibacilare. Pe de alt parte, sunt bine
cunoscui o serie de factori care contribuie la reducerea sensitivitii testelor, cum
ar fi:
- distribuia inegal a micobacteriilor n probe;
- extracia deficitar a acizilor nucleici. S-a dovedit c extracia cu cloroform
este cea mai potrivit metod dar aceasta este incomod pentru multe laboratoare,
necesit mult timp pentru execuie i, n acelai timp exist riscul contaminrii
probelor. Pentru a reduce acest risc, s-au dezvoltat sisteme comerciale simplificate
care se rezum la soncare sau numai la trata-mentul termic al probelor;

246
 - prezena inhibitorilor de amplificare n probe. Anumite sedimente,
obinute dup procesarea pobelor, conin substane care inhib amplificarea.
Prezena inhibitorilor n unele probe rmne necunoscut dar n prezent exist o
cerin major de a se stabili cu maxim atenie alegerea metodei de amplificare.

. Specificitatea metodelor de amplificare ADN-micobacterian este maxim

dar posibilitatea nregistrrii unor rezultate fals-pozitive trebuie s fie luat n
considerare de ctre microbiologi i clinicieni.
Cauza principal a nregistrrii rezultatelor fals-pozitive este conta-minarea
nespecific a probelor n faza pre-analitic dar cel mai frecvent n faza analitic,
care explic prezena inhibitorilor n probe. Aplicarea unor proceduri, cum ar fi:
utilizarea uracil-N-glicolaza sau a camerelor de ampli-ficare etaneizate, este strict
necesar pentru reducerea sau eliminarea contaminrii probelor n procesul de
extracie i amplificare a acizilor nucleici.
O categorie special de rezultate fals-pozitive se nregistreaz datorit
probelor obinute de la persoane aflate sub tratament antituberculos. La aceste
persoane, ADN-micobacterian poate fi detectat timp ndelungat chiar dac
eficiena tratamentului este maxim.
De aceea, metodele de amplificare ADN-micobacterian nu sunt
recomandate pentru monitorizarea terapiei antituberculoase.
Pentru a nelege mai bine locul i rolul metodelor de amplificare a acizilor
nucleici (AAN) n diagnosticul tuberculozei la om i animale, n fig.nr. 92 este
prezentat schematic un model de interpretare a acestor teste.

Microscopie
NEGATIV direct pe am- POZITIV
prent pentru
BAAR

AMPLIFICARE ACIZI NUCLEICI AMPLIFICARE ACIZI NUCLEICI

(AAN) (AAN)

AAN AAN AAN AAN AAN

-/- +/- +/+ TB +/+ -/-

Negativ Retestare
TB
Inhibitori prezeni Inhibitori abseni

Negativ pentru M. tuberculosis

Fig. 92 - Model de interpretare a testelor de amplificare a acizilor nucleici

pentru diagnosticul tuberculozei.

Cu toate c CDC-US nu recomand utilizarea metodelor de amplifica-re

PCR pentru diagnosticul infeciilor tuberculoase din probe extrapulmonare, s-au
publicat totui lucrri care demonstreaz utilitatea acestor tehnici pentru
diagnosticul micobacteriozelor din alte organe i esuturi dect cele aparinnd
cilor respiratorii (89, 123, 183, 167, 163).
247
 Unele cercetri consider originea extrapulmonar a probelor ca fiind
cauza principal a sensitivitii sczute a testelor de amplificare ADN n unele
cazuri alte studii comparative demonstreaz c sensitivitatea acestor metode
variaz n funcie de incrctura de micobacterii dn probe. De aceea, etapa de
concentrare a micobacteriilor inainte ca probele s fie supuse analizelor de
amplificare a ADN este extrem de important pentru probele paucibacilare .

. n acelai timp, este obligatorie aplicarea unor msuri generale de

protecie a lucrrilor de amplificare, cum ar fi:
- decontaminarea spaiilor de lucru;
- meninerea pipetelor, tipsurilor i suprafeelor de lucru sub aiunea
razelor ultraviolete pe toat perioada ct acestea nu sunt utilizate.

4.2.1.6. Metode genetice de identificare a micobacteriilor .

Dezvoltarea extraordinar a tehnologiilor de biologie molecular n

ultimele decenii a reprezentat nceputul iniierii i generalizrii unor metode
genetice cu aplicabilitate larg n diagnosticul micobacteriozelor care au condus n
scurt timp la nlocuirea procedurilor de identificare fenotipic a mico-
bacteriilor.Mai multe ncercri genetice iniiate n uitile de cercetare au devenit
rapid disponibile i utile pentru laboratoarele de diagnostic, cteva dintre acestea
au condus la descoperirea unor kituri comerciale de diagnostic care au simplificat
semnificativ activitatea de identificare a agenilor implicai n bolile micobaceriene.
Importana clinic i epidemiologic a identificrii speciei responsabil de
producerea infeciilor micobaceriene la animale i oameni este covritoare i de
aceea au fost iniiate i avizate o serie de tehnici genetice cu aplicabilitate larg, n
special n laboratoarele aparinnd medicinii umane i extrem de puin rspndite
n domeniul veterinar, care vor fi prezentate mai jos.

. Analiza PCR prin restricie enzimatic .

Metodele de analiz PCR prin restricie enzimatic (PRA) se bazeaz pe
amplificare unui fragment de 441 baze proteice (bp) ale genei hsp 65 prin PCR,
urmat de digestie enzimatic a produsului amplificat cu dou enzime de restricie
BstII i Hae III, conform procedurii descris anterior (16, 122).
Produsele de digestie sunt apoi separate prin electroforez n gel de agaroz
i n final vizualizate (Fig.93) i comparate cu modelul algoritmic PRASTE oferit de
ctre comercianii de kituri. Aceast baz de date cuprinde 74 de modele PRA care
corespund unui numr de 38 de specii de micobacterii definite. n ultimii ani, au
fost descrise diverse modele pentru caracterizarea a noi specii .

BstEII HaeIII
Fig. 93 - Modele de PRA pentru diverse specii de micobacterii (dup Leao S.,)(122).

248
 Metoda PRA de asemenea poate fi utilizat cu alte regiuni genomice pentru
identificarea unor specii de micobacterii, cum ar fi genele rpoB i gyrB cu rezultate
promitoare (127, 82).
De asemenea metoda PRA poate fi aplicat pentru testarea suspensiilor
inactivate prin cldur i splturilor obinute din medii de cultur solide sau
lichide. Exist extrem de puine referine cu privire la aplicare metodei PRA
utiliznd probe clinice (132).
Fiind o metod in house, ulterior standardizat, PRA devine o alternativ
la metodele comerciale de identificare mult mai costisitoare.
Numeroase studii de specialitate privind aplicarea metodei PRA hsp-65
pentru identificare rapid a micobacteriilor semnaleaz c, n general aceasta s-a
dovedit practic,cu pre de cost convenabil i acuratee nalt pen-tru identificarea
micobacteriilor, demonstart n 8 laboratoare de specialitate din America Latin n
care au fost testate cte un set de probe codificate pentru identificarea
micobacteriilor. De asemenea, metoda este uor de realizat chiar i n laboratoarele
cu minim dotare pentru lucrri de gemnetic bacterian. Unii specialiti au reuit
mbuntirea acurateii metodei prin asocierea rezultatelor cu unele caracteristici
microbiologice specifice mico-bacteriilor cum, ar fi: rata de cretere i pigmentaia.
Cu toate acestea, operatorii trebuie s respecte cteva detalii tehnice
extrem de importante pentru evitarea erorilor i nonconformitilor procedurale,
cum sunt: prepararea gelului de agaroz i o bun pregtire de specialitate n
executarea lucrrilor i interpretarea modelelor (123).

. Proba-ADN
Tehnologia probei ADN pentru identificarea rapid a microorganis-melor
bacteriene este una din cele mai de succes proceduri n diagnosticul molecular i de
aceea ea este rspndit n lumea ntreag.
Rolul jucat de probele ADN comerciale n calitatea mbuntirii
identificrii micobaceriilor n laboratoarele clinice nu poate fi subevaluat.
Tehnologia probei ADN a stat la baza descoperirii unor metode prac-tice de
identificare a micobacteriilor din care, vor fi prezentate urmtoarele:
- Accu Probe. Sistemul precursor , Accu Probe (Gen-Probe, San Diego, CA)
a fost descoperit de mai mult de dou decenii n urm. Este totui o metod foarte
cunoscut i foarte apreciat, n special datorit procedeului de lucru extrem de
simplu. n aceast metod, amplificarea iniial a intei nu este necesar.
Accu Probe este o oligonucleotid a fragmentului simplu ADN com-
plementar la o secven scurt specific speciei din interiorul regiunii hiper-
variabile 16S a ADN ribosomal. Aceast oligonucleotid este cuplat cu un ester
acridinic, o molecul chim-luminiscent care emite lumin sub aciunea unui
stimul excitant. Liza celulelor micobaceriene, care urmeaz a fi supuse testului
Accu Probe, se realizeaz prin sonicare; extractul este amestecat cu proba n con-
diii riguroase, permind hibridizarea numai dac aceasta posed com-
plementaritate 100 %.
Orice hibridizare este nsoit de o emisie luminoas care va fi detec-tat cu
ajutorul luminometrului.
Exist disponibile diferite kituri pentru identificarea micobacteriilor
aparinnd: complexului Mycobacterium tuberculosis, comlexului Mycobacteirum
avium i speciilor M.kansasii, M.gordonae, M. avium i M. intracellulare. Aceste
kituri pot fi utilizate pentru identificarea mico-bacteriilor n culturi micobacteriene
pe medii solide sau n medii lichide.
249
 Aparatura i echipamentele necesare nu sunt sofisticate i se rezum numai
la un sonicator pentru liza celulelor micobactriene i un luminometru pentru citirea
final .
Performane. Un numr impresionant de studii, efectuate n ultimii 20 de
ani au demonstrat superioritatea merodei Accu Probe fa de alte proceduri clasice
pentru identificarea micobacteriilor.
Majoritatea lucrrilor de specialitate raporteaz valori ridicate ale
sensitivitii i specificitii metodei pentru probele supuse testrii (38, 125, 226, 227).
Valoarea de diagnostic superioar a metodei a fost dovedit i prin
numrul extrem de redus chiar nesemnificativ al reaciilor nespecifice. Rezultatele
cercetrilor sugereaz c aceste reacii s-au semnalat numai cnd s-a utilizat Proba-
complex Mycobacterium avium care hibridizeaz ncruciat i cu alte micobacterii
descoperite mai recent, cum sunt: Mycobacterium palustre (225), Mycobacterium
parascrofulaceum i Mycobacterium saskot-chewanense (233).
- Analiza liniei-prob, se bazeaz pe tehnologia revers hibridizrii (hibridizare
invers) cu diferite probe ADN specifice transpuse n linii paralele pe o panglic de
hrtie. ADN-ul int, extras din celulele micobacteriene cu vapori fierbini, este
amplificat prin PCR cu ajutorul primerilor cu biotin i n final produsul de
amplificare este incubat pentru transpunere pe panglica de hrtie (Fig. 94).
Fosfataza

Streptavidin
Biotin

5
int amplificat

Proba ADN

Band nitrocelulozic

Fig. 94 - Analiza ADN prin metoda Linie - Prob.

Proba hibridizat este reprezentat de o band colorat care poate fi

vizualizat prin adugarea unei enzime conjugat cu streptavidin i un substrat
cromogen.
Specificitatea metodei este dat de poziia liniei colorate aparinnd unei
probe de analizat fa de linia obinut cu o prob etalon cunoscut.
De aceea, au fost elaborate 3 metode comerciale disponibile pentru
laboratoarele de specialitate: INNO LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Ghent,
Belgium) GenoType Mycobacterium (Hain, Germany) i Genotype MTBC (Hain
Germany).
- INNO LiPA Mycobacteria. n aceast metod liniile probe sunt fragmente
specifice speciei de micobacterie prezente n spaiile interne transcrise (SIT) din
regiunea interpus ntre secvenele 16S i 23S ale genei ARN-ribosomal.
Sistemul include o prob specific genului Mycobacteirum , dou probe
specifice complexului M. tuberculosis i complexului M. avium i alte 23 de probe
corespunztoare identificrii a 18 specii i mai multe variante din cadrul grupului
M. cheloneae abscesus i M. kansasii

250
 . Genotiparea micobacteriilor.
Probele linie ale genotiprii Mycobacterium (GTM) sunt fragmente din gena
23S a ARN ribosomal direcionate spre mai multe specii, identificarea bazndu-se
pe specificitatea unei singure linii i pe diferitele combinaii ale mai multor benzi
care caracterizeaz fiecare specie.
Cteva carcterisitci ale testului care caracterizeaz tulpina cercetat,
asigurnd acurateea i siguran-a testrii, se refer la evaluarea guanisinei i
citosinei, prezente n cantiti apreciabile n cadrul genului Mycobacterium la
complexul M. tuberculosis i la alte 35 de specii micobacteriene. Totodat, metoda
GMT este capabil s fac distincie ntre dou variante intraspecie aprinnd M.
fortuitum.
Sistemul GMT este disponibil cu dou kituri care pot fi livrate separat: kitul
GenoTyp TM care detecteaz mai frecvent micobacteriile cu 17 linii probe i
GenoTyp AS care include 18 linii-probe pentru identificarea speciilor
micobacteriene mai puin comune.
- Genotiparea MTBC. Metoda se bazeaz pe revers-hibridizare n scopul
identificrii acelor specii aparinnd complexului M. tuberculosis care nu pot fi
difereniate prin analiza oricrei regiuni dintre cele mai frecvent certate, cum ar fi:
16S- ADN ribosomal, ITS, 23S-ADN ribosomal i altele.
Kiturile pentru genotiparea MTBC au inte multiple, identificate prin PCR
multiplex.
Pe un strip din componena kiturilor pentru genotipare MTBC se gsesc
fixate 11 probe: una are int poriunea 23S din gena ADN-ribosomal, 9 dintre
probe au inte 4 regiuni din gena gyr B i una pentru locusurile care delimiteaz
regiunea RD1.
Proba specific pentru 23SADN-ribosomal confirm apartenena izo-latului
analizat la complexul M. tuberculosis.
Cele 9 probe de hibridizare sunt ndreptate ctre diverse regiuni din ge-na gyr
B unde, n funcie de specia micobacterian, identific mutaiile unui singur
nucleotid care difereniaz ntre ele M.tuberculosis, M. africanum tip II, M. bovis.
M. capre, M. microti i face distincie ntre M. tuberculosiis i M. africanum tip II
i M. canetti. Dei posibil, diferenierea ntre M. bovis i M. bovis BCG nu este
fesabil pe baza mutaiilor genei gyrB; ar fi posibil obinerea unei probe pentru
identificarea regiunii RD1 care caracterizeaz M.bovis BCG dar aceast prob este
complementar pentru cele dou regiuni care delimiteaz RD1.
Performane. ntruct analiza liniei-prob permite testarea simultan a
microorganismelor cu un anumit numr de probe incluse n kiturile comerciale,
aceasta reprezint un real progres pentru tehnologia ADN-prob.
Studiile de specialitate, ntreprinse n perioada anilor 2001-2006 pentru
evaluarea performanelor testului, arat c specificitatea i sensitivitatea s-au
ncadrat frecvent ntre 70 80 % iar reaciile ncruciate au fost sporadice ,
semnalate la micobacteriile cu cretere rapid sau la speciile nedescrise anterior
descoperirii kiturilor (230).
S-a constatat de asemenea, prezena unui numr de abloane de hibridizare
care sunt purtate de dou sau mai multe specii cu variabilitate moderat a genei
23S-ADN- ribosomal i care limiteaz performanele Geno-Tiprii.

. Secvenierea genetic.
inte. Pn acum se cunoate c fiecare regiune genetic din genomul
microorganismelor se caracterizeaz prin conservabilitate nalt dar, n acelai

251
 Timp, n aceste regiuni pot s fie incluse secvene cu variabilitate moderat
reprezentnd inte posibile pentru identificarea microorganismelor.
Cteva dintre aceste inte sunt cunoscute n genomul microorganismelor vii,
precum: 16S-ADN-ribosomal, 23S-ADN-ribosomal, fragmentul ITS .a.
- 16S-ADN-ribosomal, posed n jur de 1500 bp (baze perechi) i este fr
discuie cea mai comun gen, existnd i o baz larg de date disponi-bil. n
aceast gen exist secvene universale organizate practic n funcie de organismul
viu. Aceste secvene universale coexist cu secvene specifice genului, comune
microorganismelor aparinnd genului respectiv (ex. genul Mycobacterium) dar i
cu secvene specifice speciei care difereniaz o specie de alta.
Referitor lar micobacterii, majoritatea secvenelor caracterizate prin
variabilitate specific speciei sunt localizate n prima treime a genei constituite
fiecare din cte dou segmente hipervarabile, denumite: regiunea A i regiunea B
(Fig. 95).

Fig. 95 - Secvena 16S ARN-ribosomal

Regiunea hipervariabil A conserv nucleotidele cuprinse ntre poziiile 130

i 210 n timp ce regiunea hipervariabil B cuprinde nucleotidele situate ntre
poziiile 430 i 500. Aceste poziii corespund genei 16S-ARN-ribosomal din
genomul E.coli
Din punct de vedere aplicativ, determinarea secvenelor nucleotidice a
primelor 500 bp ale genei permit diferenierea majoritii micobacteriilor
cunoscute pn n prezent.

Principiul secvenierii genetice.

Secvenierea genetic se ralizeaz n prezent cu echipamente auto-mate

care confer o reproductibilitate ridicat metodei.
Iniial, regiunea int este amplificat utiliznd PCR cu primer adec-vat i
nucleotide standard. n continuare produsul de amplificare este denaturat dup
care sufer o amplificare secundar n care sunt utilizai (n tuburi de analiz
separate) primerii 3 i 5.
n aceast faz, se adaug la nucleotidele standard o proporie redus de
nucleotide speciale marcate cu fluorocromi care delimiteaz lungimea frag-
mentului nucleotidic.

252
 ncorporarea ntmpltoare a nucleotidelor terminale n cursul amplificrii
(cele 4 baze sunt marcate cu fluorocromi diferii) produc fragmente ale cror
greuti se ncadreaz de la cea a primerului care a supor-tat
elongaia pn la cea a nucleotidului terminal; aceste fragmente, dispuse n ordinea
greutii lor, sunt evideniate prin mijloace electroforetice.
Modelele care rezult n urma identificrii nucleotinelor amplificate de ctre
markeri, determin secvena genetic a regiunii. Pentru a evita eventuale dis-
crepane n interpretare, este foarte important a se utiliza att secvenierea
fragmentului 3 anterior ct i a fragmentului 5 (de inversare).
Baza de date . Dup ce o secve nucleotidic a fost determinat, este strict
necesar ca aceasta s fie comparat cu secvene cunosute nregistrate n diferite
baze. Mai multe dintre baze de date sunt disponibile pe internet, precum
GenBank , EMBL Nucleotide Sequence Database, DNA Data Bank din Japonia .a.
Secvenele disponibile n aceste baze de date sunt n continuu actua-lizate.
Asemenea caracteristici sunt avantajoase dar n acelai timp au dezavantajul unui
control foarte dificil al secvenelor noi propuse i prezenei fragmentelor scurte
( sunt acceptate secvene mai lungi de 50 bp), deter-minate n ultimii ani n care
tehnica secvenierii a fost totui perfecionat.
Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms, este un domeniu
public de baz de date limitat la secvenele 16S-ADN ribosomal i regiunea 16S-
23S ITS. Aceast baz de date este strict controlat i nu permite propuneri noi ale
utilizatorilor. Din pcate baza de date RIDOM, care reprezint n sine o inovaie
ambiioas, a fost mai puin utilizat din cauza lipsei de actualizare n ultimii ani.
Performanele tehnicii de secveniere genetic. Indiscutabil, secven-ierea
genetic reprezint metoda de referin pentru identificarea nu numai a
micobacteriilor dar a tuturor microorganismelor. Secvena 16S-ADN ribosomal este
incontestabil cea mai important int pentru diferenierea micobacteriilor i
atunci cnd se realizeaz segvenierea poriunii 5 ( cu aproximativ 500 bp)
furnizeaz rezultate pentru marea majoritate a membrilor genului Mycobacteirum.
Determinarea genei complete este necesar pentru a distinge M. peregrinum de M.
septicum(199,229) M.murale de M. tokaiense , M. marinum de M. ulcerans (112), M.
novocastrense i M. flavescens sqv.II.
Speciile care nu pot fi distinse una de alta pe baza 16S-ADN ribo-somal
sunt: M. kansasii de M. gastri, M. mucogenicum de M.phocaicum, M.
fluoranthenivorans de M. kaclensackense, M.abscessus de M. massiliense i
M.bolletti de toatespeciile menionate (6, 7, 231).
Datorit variabilitii largi (lungimea se ncadreaz de la 270 la 400 bp),
ITS poate fi utilizat prin secveniere la diferenierea micobacteriilor cu cretere
rapid care au ralaii mult mai strnse ntre ele dect micobacteriile cu cretere
lent (188).
Cu excepia M. cheloneae i M abscesus, micobacteriile cu cretere rapid
au cte dou copii ale operonului ribosomal i o singur celul micobacterian
poate s posede dou copii diferite ale ITS. Aceasta poate crea dificulti n
interpretarea electroforegramelor datorit prezenei n electroforegram a dou
vrfuri supra-puse.
Pentru rezolvarea acestei probleme specialitii n domeniu recomand
necestitatea clonrii genetice a regiunii naintea secvenierii acesteia. O alt
int
frecvent utilizat pentru identificarea micobacteriilor este secvena 65 kDa a genei
de oc proteic a crei lungime este de 1623 bp. Baza de date corespunztoare a fost
completat n ultimii ani.
253
Ca i n cazul regi-unii ITS, aceast gen prezint o variabilitate mult mai larg
dect gena 16S ADN ribosomal. Pentru diferenierea micobacteriilor, cele mai
importante inte descrise n literatura de specialitate sunt genele recA, implicat n
reconstrucia ADN,(25), sodA carea codific superoxid dismutaza (37) i rpoB pentru
subunitatea beta a ARN polimerazei.Ultima int care iclude regiuni hipervariabile,
prezent ntr-o singur copie n toate micobacteriile, a fost recent propus ca
standard de aur pentru diferenierea rapid a micobacteriilor (5).

4.2.1.7. Metode neconveionale pentru diagnosticul fenotipic al

micobacteriozelor.

Suplimentar la metodele convenionale pentru diagnosticul tuber-culozei i

alturi de metodele automate i moleculare de diagnostic descrise anterior, au fost
elaborate cteva tehnologii noi, precum: analiza bazat pe fagi i detecia rapid
prin examen microscopic al coloniilor n mediul solid i lichid.

Analize bazate pe fagi .

Testele cu bactriofagi se bazeaz pe capacitatea micobacteriilor de a sprijini

creterea unui micobacteriofag infectant. Numrul de fagi endogeni se coreleaz
strns cu numrul de bacili tuberculoi viabili i n final reprezentat de o plaj a
micobacteriei cu cretere rapid cum ar fi: M.smegmatis (141)
Analiza bazat pe bacteriofagi se poate realiza n varianta FAST Plaque TB
- FAST Plaque TB , este un test comercial utilizat pentru detecia incipient a
M. tuberculosis (9) din probe clinice cum ar fi: sputa sau diverse secreii,
conform schemei de principiu din fig.nr. 96.
Micobacteriofagi (Actifagi)

Bacil tuberculos
Infecia bacilului tuberculos

Tratament cu virus0l

Neutralizarea soluiei virusol

Adugarea celulelor senzori

Repartizarea amestecului n plci

Petri; incubare peste noapte.

Formarea plajelor

Fig. 96 - Principiul metodei FAST Plaque TB de tipizare a micobacteriilor cu ajutorul fagilor.

254
 n primul rnd probele menionate se supun decontaminrii conform
procedurilor clasice decrise anterior.
n continuare, celulele micobacteriene int sunt rapid infectate cu un
bacteriofag specific (Actifag) care se adaug la proba decontaminat (Fig.97) .

Fig.97 - Fagul D29 adsorbit de M. ulcerans (184)

Amestecul rezultat este apoi tratat cu o soluie virulicid (Virusol) pentru a

distruge toi bacteriofagii care nu au ptruns n celula int producnd infecia
acesteia. n consecin, rmn numai bacteriofagii protejai n interiorul celulei
int. Aceti bacteriofagi vor continua s se replice dnd natere la bacteriofagi
progeni care vor produce liza celulei gazd.
Bacteriofagii progeni sunt n final amplificai prin introducerea unei
micobacterii nepatogene cu cretere rapid, (M. smegmatis) denumit celul
sensor. Bacteriofagii progeni i reiau rapid ciclul de infecie, replicare i liz
evideniat prin prezena unor zone (plaje) clare n stratul confluent de celule
sensor. Dac n proba analizat nu exist celule bactriene int sau acestea sunt
neviabile, nu se va produce replicarea bacteriofagilor i n final nu vor fi prezente
plaje in stratul de celule sensori.
Componentele kitului Bio-FASTPlaque TB TM comercial (BIOTEC), sunt
descrise n detaliu n prospectul care nsoete fiecare lot de kituri mpreun, cu
tehnica de lucru i precaiunile de care se va ine seama n toate etapele de lucru.
Interpretarea testului FASTPlaque TB. Pentru interpretarea rezultatelor
testului FASTPlaque TB este necesar ca martorii control negativ i control pozitiv s
se ncadreze n limitele de specificate, situaie n care testul este validat i
rezultatele analizelor probelor vor fi interpretate n funcie de valorile martorilor
control. Dac rezultatele pentru martorii control negativ i pozitiv nu se ncadreaz
n limitele stabilite, interpretarea rezultatelor pentru probele supuse testrii nu
trebuie fcut, urmnd a se elimina toate erorile i nonconformitile survenite n
cursul etapelor de lucru. n testul comercial FAST Plaque TB se consider valide
urmatoarele valori pentru:
- martor control negativ = pn la 10 plaje;
- martor control pozitiv = 20 de plaje sau mai multe.
Interpretarea rezultatelor testului FAST Plaque TB pentru probe clinice
(sput, secreii sau alte materiale patologice) decontaminate este urmtoarea:
- ntre 0 19 plaje pe plac = rezultat NEGATIV;
- 20 de plaje sau mai multe = resultat POZITIV.
Performanele tetului FASTPlaque TB. S-au efectuat diverse studii pentru
detecia n faz de cretere incipient a M. tuberculosis cu ajutorul testului FAST
Plaue TB (9).
255
 ntr-un studiu comparativ cu examenul microscopic direct pe probe
colorate cu auramin i exemnul culturii bacteriologice n mediul Lwenstein-
Jensen s-a constatat c FAST Plaque TB a detectat tubercuoza la 75,0% din cazurile
cu tuberculoz confirmat n cultur i 70,0 % dintre cazurile cu diagnostic clinic de
tuberculoz, cu specificitate de 98,7 % i respectiv 99,0 %. Pe de alt parte ,
amprenta concentrat, colorat cu auramin a avut o sensinsitivitate de 63,4 % i
63,3 % i o specificitate de 97,4 % i 97,3 % n culturi confirmate i i respectiv
cazuri confirmate clinic.
ntru-un alt studiu, M u z a f f a r R. et al., 2002, (154), au comparat testul
FAST Plaque TB cu examenul microscopic direct al amprentelor colorate Ziehl-
Neelsen i cu culturile de Mycobacterium tuberculosis n mediul Lwenstein
Jensen i au obinut o sensisitivitate i specificitate de 87,4 % i respectiv 88,2 % n
amprentele pozitive, colorate pentru acidorezisteni i o sensitivitate i spcificitate
de 67,1 % i respectiv 98,4 % n probele cu amprente negative.
Rezultatele cercetrilor asupra performanelor testului FASTPlaque TB
conduc la concluzia c testul este capabil s detecteze micobacteriile n 50-60 %
dintre probele cu examen microscopic direct negativ, pe amprente colorate pentru
acidorezisteni i combinarea testului cu examenul micro-scopic direct, pe
amprente colorate pentru acidorezisteni, a confirmat pre-zena M. tuberculosis n
80,0 - 90,0 % din probele pozitive n cultura bacteriologic.
n acelai timp, testul FAST Plaque TB nu a fost capabil s detecteze n jur
de 13,0 % dintre probele cu examen microspopic pozitiv al amprentelor colorate
pentru acido-rezisteni i ntre 8,0 -19,0 % dintre probele cu examen microscopic al
amprentelor negativ, acestea fiind considerate rezultate fals-pozitive (220).
Datele comparative ntre meto dele originale, care au folosit reageni
proprii i FASTPlaque TB TMcomercial, arat c nici o metod nu este capabil s
depeasc performaele microscopiei directe din sput atunci cnd ratele
contaminarii probelor n testul FASTPlaque TB au fost de 40,0 % (139). De aceea, s-
au adus unele modificri testului FASTPlaque TB n sensul includerii n sistem a
unui amestec de antibiotice pentru a reduce rata contaminrii probelor analizate.
Alte cteva tehnologii care utilizeaz micobacteriofagi pentru detecia
rapid i identificarea M.tuberculosis au fost recent elaborate dar aceste nu au fost
evaluate complet pe probe clinice din ri cu evoluie endemic crescut a
tuberculozei (17).
Limitele testului FASTPlaqueTB.
a/. Detecia M. tuberculosis cu testul FASTPlaque TB depinde de cantitatea
i calitatea probelor recoltate, de perioada de stocare a lor pn la
procesare i numrul de bacili viiprezeni n prob;
b/. Probele paucibacilare pot afecta specifictatea testului;
c/. Testul FASTPlaque TB a fost evaluat numai pentru probe de sput; alte
materiale patologice nu au fost utilizate suficient pentru evalyuarea testului;
d/. Decontaminarea probelor trebuie s fie efectuat utiliznd metoda
NALC-NaOH. Alte metode de decontaminare a probelor destinate testrii prin
FASTPlaque TB au fost insuficient evaluate aa nct unii ageni de decontaminarea
ar putea s afecteze eficiena testului;
e/. Regimul jos de centrifugare reduce numrul de bacili din sediment i n
consecin sensitivitatea testului este nesatisfctoare;
f/. Testul FASTPlaque TB necestit prezena bacililor tuberculoi viabili n
probele de analizat.

256
 Chimioterapia antituberculoas distruge bacilii tuberculoi aa nct acetia
nu mai pot fi detectai prin testul FASTPlaque TB; efectul unui spectru larg al
antibioticelor nu a fost complet evaluat n testul FASTPlaque TB;
g/. Concentraia crescut de snge n proba de sput (> 10,0 % ) poate
afecta performanele testului;
h/. Testul FASTPlaque TB nu poate diferenia speciile de micobacterii ntre
ele: o prob pozitiv n testul FSATPlaque TB poates conin: M. tuberculosis,
M.bovis sau M. africanum. Studii de laborator (testarea culturilor pure, fr a fi
decontaminate) au demonstrat prezena a diferite tulpini e micobacterii, altele
dect cele responsabile de producerea tuberculozei (MOTTs);
i/. Rezultatele testului FASTPlaque TB trebuie s fie interpretate n raport
cu alte rezultate de laborator i informaii clinice; este posibil s se nregistreze
procente variabile de rezultate falspozitive i falsnegative.

Posibile erori care survin n etapele de lucru i modaliti de eliminare.

Pentru interpretarea corect a rezultatelor testului FASTPlaque TB,

valorile controalelor, pozitiv i negativ, trebuie s se ncadreze n limitele precizate
n instruciunile de lucru care nsoesc kitul.
n tabelul alturat sunt prezentate cteva erori posibile care survin n cursul
etapelor de lucru cauzele i modaliti de eliminare (Tabelul.26 )
Tabelul:26

Erori posibie n testul FASTPlaque TB, cauze i modaliti de eliminare

Erori Cauze Modaliti de eliminare

Peste 10 plaje Cantitate insuficient de virusol pentru
obinute inacti-varea excesului de bacteriofagi
n martorul Mediul sau echipamentele de lucru,
control-negativ celulele senzori sau Actifagii sunt posibil
infectate cu M. tuberculosis
Sub 20 de plaje Diluia celulelor senzori s-a fcut in
n proba martor corect n timpul preparrii martorului torilor control
control-pozitiv control-pozitiv
S-au adugat celule sensori n exces, cu
termen de valabilitate expirat , pentru
prepararea mar-torului control-pozitiv.
Recitii cu atenie procedura de lucru din
instruciunile care n soesc kitul
Verificai toi reagenii. Dac acetia sunt
contaminai, trebuie ndeprtai i
echipamentele resterilizate.
Recitii procedura de Preparare a mar-
A se consulta cu atenie reconstituirea,
stocarea i reutilizarea componentelor
kitului.

Actifagii utilizai n exces, cu termen de

valabilitate expirat.
S-au adugat insuficieni Actifagi Recitii cu atenie procedeul delucru
Creterea bacteriilor Interval prelungit ntre recoltarea i Revedei instruciunile pentru recolta-rea
contaminante pe procesarea probelor permite suprainfecia i transportul probelor.
plac mpiedic cu microorgan-isme de asociaie.
dezvoltarea celulelor Reageni contaminai cu microorganisme Preparai reageni noi i verificai
sensori i de asociaie condiiile de stelitate i aseptizare
mascheaz pla-jele
Rata rezultatelor Decontaminarea probelor exagerat, cu Corectai concentraia de NaoH i timpul
pozitive sczut con-centraie excesiv de NaOH , sau timp de incubare.
sub ateptri prelungit de incubare.
Plajele nu se Agarul nu a fost topit complet, cu Asigurai-v c agarul este suficient
evideniaz clar fragmente de agar solidificate . nclzit i topit complet
Agarul incomplet Agarul insuficient omogenizat sau nu a Asigurai-v c agarul a fost complet topit
solidificat fost complet topit inainte de utilizare i bine omogenizt cu proba .

257
 Metoda microcoloniilor.

Metoda microcoloniilor sau tehnica de cultur n strat subire de agar a fost

descris cu muli ani n urm i ea permite detecia rapid i identificarea
prezumtiv a izolatelor bazte pe caracteristicile morfologice ale micobacteriilor. n
acelai timp, metoda se realizeaz n laboratoare de bacteriologie modest utilate la
un pre de cost sczut. De aceea, metoda a fost propus ca o alternativ la tehnicile
clasice de cultivare a micobacteriilor (245).
Cu civa ani n urm , M e j i a e t a l , 2004 (143), a descris o metod
bazat pe acest pricipiu pentru detecia rapid a microcoloniilor de M. tuberculosis
din probe recoltate de la cazuri clinice cu tuberculoz i examinate la microscopul
optic obinuit utiliznd agar 7H11 n strat subire. Metoda a permis detecia a peste
6o,0 % din probele cu cultura bacteriologic pozitiv n primele 10 zile i peste 80,0
% dup dou sptm.ni de incubare comparativ cu mediul Lwenstein-Jensen unde
s-au identificat numai 10,0 % dintre probe.
Aceeiai autori, constat o sensitivitate a metodei TL7H11 de 72,0 %
comparat cu cea a metodei de cutltur standard cu mediul Lwenstein-Jensen,
sugernd c utilizarea simultan a ambelor medii crete substanial sensitivitatea
testului (143).
Tehnica de lucru nu implic operaiuni complicate i materialele i
echipamentele necesare nu sunt diferite de ele folosite n cultura bacteriologic
clasic.
ntr-un studiu pentru evaluarea metodei, desfurat n 6 laboratoare din
America Latin pe un eantion semnnificativ de probe de sput, R o b l e d o J. A.
e t a l, 2006 (185), au gsit c toate probele pozitive la examenul bacterioscopic
direct din amprent au fost pozitive i n culturi, n timp ce probele negative la
examenul microscopic direct din amprent au produs M. tuberculosis n 3,2 %
dintre probele n culturi pe mediul Lwenstein - Jensen comparativ cu 4,4 %
culturi obinute n tehnica n strat subire de agar (TL-7H11). Sensitivitatea
metodei TL7H11 a fost 92,6 % (95,0% CI=87,9-95,9) i cea a culturii n mediul
Lwenstein-Jensen , 84,7 % ( 95,0% CI = 78,78 89,9) cu un timp mediu de
detecie de 11,5 zile ( 95,0% CI 9,3-15,0) pentru TL7H11 i 30,5 zile (95,0 % CI
26,9-39,0) pentru tehhnica cu mediul Lowenstein-Jensen. Rata contaminrii a fost
5,1 % n metoda culturii pe agar n strat subire i 3,0 % pentru cultura pe agar
Lwenstein Jensen (185).
Intr-o variant cu mediu lichid tehnica microcoloniilor a fost utilizat cu
avantaje notabile pentru detecia rapid a micobacteriilor i n acelai timp pentru
testarea susceptibilitii micobacteriilor la diverse medicamente antituberculoase
(44, 150).

4.2.1.8. Analiza acizilor micolici din peretele micobacteriilor.

Micobacteriile au un coninut extrem de ridicat n lipide. Aceste lipide

includ acizii micolici i ali acizi grai saturai i nesaturai. Acizii micolici fac parte
din grupa acizilor grai cu lan lung, prezeni n peretele celular a unui numr
limitat de microorganisme.
De exemplu, n peretele celular al genului Nocardia se gsesc ntre 44 60
atomi de carbon, alctuind lungimea lanului de acizi grai, astfel difereniindu-se
de genul Mycobacterium, al crui lan este alctuit din 60-90 atomi de carbon.
Prezena combinaiilor variabile a gruprilor funcionale din structura
258
acizilor micolici n peretele celular al micobacteriilor, clasific acizii micolici n 7
categorii: alfa-mycolai, alfa-mycolai, omega-mycolai, metoxy-mycol-ai, keto-
mycolai, epoxy-mycolai i esteri cerai.
Analizele coninutului n lipide al peretelui celular micobacterian au fost
larg utilizate n incercri de identificare a micobaceriilor.
Majoritatea tehnicilor utilizate se bazeaz pe separarea fizic ntre dou
faze (staionar i mobil) a unui singur lipid prezent n peretele celular
micobacterian.
Extraia lipidelor din coloniile bacteriene este etapa preliminar care se
folosete n toate tehnicile care vor fi descrise n continuare.

Cromatografia n strat subire (TLC).

Principiu. Pe suprafaa plcilor cu silicagel (silica-plci) se depun probele

de acizi micolici extrai din peretele micobacteriilor (faza staionar), care sunt
separai datorit afinitii lor diferit pentru un solvent (faza mobil) , deplasndu-
se prin capilaritate. Dup colorarea plcii, fiecare specie micobacterian etaleaz o
amprent model specific, conform coninutului acesteia n acizi micolici care poate
fi identificat prin comparaie cu tulpini etalon de referin cu coninut n acizi
micolici cunoscut (Fig.98).

Fig.98 - Cromatograma esterilor metyl acizi micolici. Solvent Diclorometan. Linile 1-4 :tulpini de referin
Liniile 5-9 tulpini analizate 1-Mycobacterium cheloneae, 2- M. tuberculosis 3.M. avium 4-M. foprtuitum,5-
M.tuberculosis 6- M.smegmatis ,7- M.scrofulaceum ,8- M.cheloneae ,9-M.fortuitum (50).

Procedura de lucru elaborat n 1983 de D a f f e t a l. a suferit unele modificri

neeseniale n urmtorii ani (50, 95)
Conform procedurii recomandate de H i n e s s II M. E. e t a l. 199
3 (95), cte 5,0 l din fiecare fraciune de acizi grai extrai din peretele celular al
micobacteriilor studiate au fost spotate ntr-un numr de intervale separate
(corespunztoare fiecrei specii de micobacterie studiate) pe plcile TLC (Thin-
Layer Chromatography) acoperite cu silicagel. Operaiunea se repet de 3 ori aa
nct pe fiecare interval s se administreze n total 15,0 l. pentru fiecare specie
micobacterie.
n etapa urmtoare, plcile au fost meninute la temperatura camerei
pentru uscare apoi introduse n camera TLC care conine 100 ml. soluia apoas de
methanol cloroform (faza mobil ) n ormtoarele proporii: 5 pri cloroform: 4
pri eter i 1 parte ap.

259
 Cnd extractele s-au deplasat pe coloan aproximativ 10 cm. se scot plcile
din camera TLC.
n faza final plcile se pulverizeaz cu H2SO4 10,0%, uscate la curent de
aer, introduse la 110 - 120 C i fotografiate.
Rezultatele se apreciaz prin raportarea lungimii coloanei produsului
decercetat (de la start la vrful coloanei) la lungimea coloanei tulpinii de referin
(masurat n acelai mod).
Ali autori, utilizeaz diferite sisteme de eluie n faza mobil cum ar fi:
dietil eterul/eter de petrol (12:88 v/v) cu 3 dezvoltri ale cromatogramei i
diclorometan , cu o singur dezvolatre. Ca revelator, autorii citai au folosit
aspersarea cromatogramelor cu 0,01 % (w/v) rodamin n tampon fosfat (50).
(Fig.91).
Recent, au fost standardizate tehnologiile de extracie a acizilor micolici din
peretele celular al micobacteriior pentru tehnicile cromatografiei n strat subire
(TLC) i cromatografia de nalt performa n lichid ( UV-HPLC) (40).
Protocolul de procesare a probelor pentru extracia acizilor micolici const
n: recoltarea celulelor micobacteriene, saponificarea, extracia acizilor grai,
separarea prin derivaie i purificarea sau clarficarea pentru obinerea acizilor
micolici care se supun analizelor de detecie.
a./ Celulele micobacteriene se recolteaz de pe agarul Lwenatein-Jensen
cu un tampon steril de vat poliesteric care se imerseaz n 2,0 ml. de reagent de
saponificare compus din 25,0 % hidroxid de potasiu ntr-un ameste 1:1 v/v metanol
i ap;
b/. Dup agitare riguroas, amestecul se autoclaveaz 1 or la 121C, apoi se
rcete la temperatura camerei;
c/. Cnd amestecul s-a rcit, se adaug 2,0 ml. cloroform i apoi 1,5 ml.
detergent de acidifiere, constituit din: ap i acid clorhidric concentrat n proporie
1:1 v/v care se adaug lent; soluia se amestec energic apoi se las n repaus pentru
separarea straturilor;
d/. Stratul inferior organic se transfer cu o pipet Pasteur ntr-un tub nou
i se introduce ntr-un bloc termic la 85 - 105 C cu curent de aer;
e/. Reagentul comercial de derivaie se suspend n aceton-nitrit i este
constituit din PBPA i eter. Probele de acizi micolici sunt derivai n esteri prin
adugare a 20,0 mg bicarbonat de potasiu 50,0 l. reagent de derivaie i 1,0 ml.
cloroform.
f/. Tuburile nchise cu capace din teflon se supun unui regim termic la 85 -
105C pentru 20 de minute;
g/. Dup rcire, probele se supun clarificrii sau purificrii prin: filtrare pe
membrane filtrante 66 cu porozitate de 0,45 m sau fracionare lichid cu o soluie
apoas de metanol acidifiat. Produsul rezultat este stabil i poate fi stocat pentru
mai multe luni la temperatura de 4 C i ntuneric.
Extracia acizilor micolici i proceduri de metilare.
Aproximativ 20-25 mg de micobacterii, recoltate de pe suptafaa mediului
Lwenstein-Jensen se dispersez n 5,0 % (w/v) hidroxid de potasiu n 2-
metoxietanol.
Amestecul se menine la 110C pentru 2 ore , rcit i acidifiat cu 1,0 ml. acid
sulfuric 20,0% (w/w) .
Acizi micolici sunt extrai prin agitare de dou ori n 5,0 ml. dietil eter i
splare de 3 ori cu 2,0 ml. ap. Eterul se ndeprteaz pe o baie marie i acizii
micolici se supun metilrii prin adugarea a 1,0 ml. soluie eter-diazo-metan.

260
 Limitele cromatografiei n strat subire (TLC). Numrul ridicat de specii
micobacteriene , aproximativ 130 de specii, deja identificate pe baza
cizilor micolici prezeni n peretele celular, scad relevana TLC pentru identificare
la nivel de specie. Cu numai 7 tipuri de acizi micolici i cu cele mai multe
micobacterii care includ nu mai mult dect 2-3 dintre acetia , numrul de abloane
TLC, mprite prin mai mult dect un acid micolic i adesea de mai multe sepcii,
este adesea ridicat.

Gaz-lichid cromatografia ( GCL).

Metoda se bazeaz pe transportul cu ajutorul unui gaz (faza mobil) a unui

lichid pe lungimea unei coloane (faza lichid). ndat ce lipidele, extrase din
tulpina micobacterian au au fost injectate n coloan supus unei temperaturi de
aproximativ 300 C. se produce clivajul acizilor micolici n esterimetil saturai cu
lungimi de 22-, 24- i 26- atomi de carbon. mpreun cu aceste fragmente ale
acizilor micolici saturai, sunt eluai i acizi grai nesaturai, inclusiv acidul
tuberculostearic i diveri alcooli.
Recunoaterea duferitelor produse de eluie se obine deobicei prin mass-
spectrometrie. Produsele de clivaj, care sunt invariabile ntr-un singur tip de acid
micolic, produc mpreun cu acizii grai i alcooli, modele cores-punztoare pentru
specii unice i pentru diferenierea acestora.
Cu toate avantajele recunoscute, metoda prezint totui reproduc-tibilitate
limitat interlaboratoare.

Lichid-cromatografia cu nalt performan (HPLC).

n general metoda este similar cu GLC cu deosebirea c acest sistem

folosete presiunea nalt pentru transportul lichidului (faza lichid) care conine
extracte din proba de analizat mpreun cu alte particule (faza staionar) prezente
n coloan. Sunt separai n coloan diveri acizi micolici, saponificai anterior,
extrai din proba de analizat i fraciomai n bromfenol-esteri i eluai la momente
diferite (Fig.99).

Sistem PC de control i afiare

cromatogram

Pomp Inj.
Coloana cromatograf
Inj.P

Solveni

Supresie Trace Dec

Fig.99 - Instalaia de separare a acizilor micolici prin HPLC

261
 Pe baza absorbanei ultravilolete, detectorul ploteaz o singur fraciune
care ordoneaz vrfurile cromatogramei ntr-un profil al speciei micobacteriene
studiate. Profilul fiecrei specii micobacteriene este diferit de altele (Fig.99)
element esenial pentru identificare i comparare vizual cu alte profile ale unor
micobacterii cunoscute (40, 227) .
Pentru citirea i interpretarea rezultatelor poate fi utilizat un sistem bazat
pe fluorescen, mult mai sensibil dect cel cu UV.
HPLC este considerat singura metod disponibil pentru diferenierea
majoritii micobacteriilor. Cu toate acestea, numrul micobacteriilor dificil de
difereniat sau nedifereniabile a crescut recent datorit descoperirii unor specii
noi, n special n cadrul grupului micobacteriilor cu cretere rapid .

4.2.1.9. Teste de patogenitate i virulen.

Testarea patogenitii i virulenei micobacteriilor, reprezint o etap

important i indispnsabil nu numai pentru identificarea acestora epidemio-logia
tuberculozei.
Aceste teste se bazeaz pe capacitatea micobacteriilor de a asimila, sintetiza
i elebora substane cu aciune distructiv asupra celulelor organismului gazd pe
seama cruia se multiplic activ, n funcie de specia de micobacterie i organismul
afectat.
Testele de patogenitate i virulen pot fi realizate in vitro i in vivo, pe
animale de exeperien.

a). Testele de patogenitate i virulen in vitro , se grupez n:

- teste de culoare;
- teste de rezisten fa de ageni bactericizi.

- Testele de culoare, cuprind:

i. Reacia Dubos, se bazeaz pe capacitatea oxidoreductoare a bacililor

viruleni care, tratai cu alcool meytilic i n contact cu rou neutru pot evidenia
urmtoarele rezultate:
. Bacilii viruleni, se coloreaz n rou;
. Bacilii cu virulen atenuat, etaleaz culoare portocalie;
. Bacilii nevruleni, se coloreaz n galben.

ii. Reacia Desbordes, folosete drept idicator albastrul de Nil, n prezena

zruia :
. Bacilii viruleni se coloreaz n albastru;
. Bacilii cu virulen atenuat, se coloreaz n albastru-cenuiu;
. Bacilii lipsii de virulen, se coloreaz n galben cenuiu.

iii. Testul Wilson, se bazeaz pe detecia dehidrogenazei enzim prezent

numai la micobacteriile virulente.

262
 b). Teste de patogenitate i virulen in vivo (bioteste).

Inocularea produselor patologice sau suspensiilor de micobacterii n

cultur pur la animale de laborator a fost considerat mult timp cea mai
sensibil metod de izolare, identificare i testare a ptogenitii i virulnei bacililor
tuberculozei. i n prezent, majoritatea laboratoarelor veterinare apeleaz la
aceast metod, dei n Manualul OIE pentru metode standard de diagnostic ,
aceasta nu este recomandat dect pentru testarea capacitii revelatoare a
tuberculinelor.
Cu toate c biotestul are un grad ridicat de fidelitate, totui nu sunt rare
cazurile cnd, datorit unor erori tehnice, rezultatele false nu pot fi evitate. De
aceea, n multe laboeratoare veterinare de diagnostic microbiologic ,n special n
rile dezvoltate, s-a renunat la acest metod, fiind nlocuit cu metode de tipizare
moderne, descrise anterior.
Totui, specialitii din laboratoarele de diagnostic bacteriologic, care
utilizeaz curent biotestul ca metod pentru confirmarea tuberculozei, trebuie s
respecte urmtoarele reguli:
. Testarea se va face pe animalul cel mai sensibil pentru specia mico-
bacterian incriminat, cunoscnd c:
- cobaliul, este sensibil la infecia cu M. tuberculosis, M. bovis i rar cu
micobacterii din complexul M. avium. Bazai pe aceste elemente, muli specialiti
veterinari fac diferenierea ntre infecia tuberculoas la bovine i paratuberculoz;
- iepurele, este sensibil la infecia cu M. bovis i M. avium;
- gina, sensibil la infecia cu M. avium.
Alte animale, cum sunt: oarecele alb i hamsterul sunt moderat sen-sibili
la infecia tuberculoas.
Instruciunile tehnice privind Diagnosticul, prevenirea i combate-rea
tuberculozei la animale recomand efectuarea biotestului simultan la cele trei
specii atunci cnd, pentru investigaii se folosete inocul obinut direct din produse
patologice recoltate din teren.
. Se vor folosi pentru inoculare, produse patologice procesate cores-
punztor prin concentrare i decontaminare, dup metodele descrise ante-rior, n
doze determinate n prealabil i administrate pe cale subcutanat (s.c.),
intraperitoneal (i.p.) sau intratraheal (i.t.):
- nu va fi folosit penicilina pentru decontaminarea inoculului ntru-ct
aceasta este toxic pentru cobai;
- animalele supuse experimentului vor fi, n prealabil, testate tuberculinic ,
pentru a exculde posibilitatea unei tuberculoze preexistente;
- pentru a provoca agravarea bolii la cobai, simultan cu produsul patologic,
se pot injecta hormoni corticoizi, siliciu, cristale de cuar, sau Candida albicans. De
exemplu, dac la inocul se adaug un volum egal dintr-o suspensie de particule
foarte fine de cuar (c.c.a. 5,0 g.), randamentul rezultatelor pozitive crete cu 15,0
%
Dozele patogene pentru animale de laborator, la unele specii de
micobacterii, sun redate n tabelul nr.26

263
 Tabelul:26

Caracterizarea principalelor specii de micobacterii n funcie de sensibilitatea animalelor i dozele

inoculate

Specia Iepure Cobai Gaina

1,0 mg 0,01 mg 1,0 mg 0,01 mg 0,1 mg 0,01 mg
M.tuberculosis + - +++ +++ - -
M. bovis +++ ++ +++ +++ - -
M. avium ++++ +++ - - ++++ ++

- : nici o reacie; +: rare leziuni n pulmoni; ++: tuberculoz generalizat dup 30-60 de zile; +++: tuberculoz generalizat; +
++: tuberculoz septicemic.

- din fiecare prob vor fi inoculate cte dou animale/specie;

- animalele selectate pentru investigaii trebuie s fie perfect sntoase, s
nu fi fost supuse anterior unor tratamente i greutatea corporal s fie cuprins
ntre 250-300 g.
. Tehnica inoculrii animalelor. Materialul patologic, bine omogeni-zat,
sau suspensia de bacili se inoculeaz sub cutanat pe faa intern a coapsei, dup o
prealabil depilare i dezinfectare a locului de puncie. Fiecare animal va fi notat cu
numrul probei respective, data i felul materialului inoculat, nregistrndu-se i
semnele particulare ale animalului.
Animalele de experien infectate vor fi meninute , pe toat perioa-da de
observaie, n ncperi i cuti separate i vor fi ngrijite de personal pregtit i
instruit n respectarea msurilor de prevenire a rspndirii infeciei i a normelor
de securitate a muncii.

. Monitorizarea animalelor infectate

Animalele infectate vor fi observate periodic , timp de cel mult 90 de zile,

perioad n care se instaleaz posibile leziuni de tuberculoz i alergia.
Dup prima sptmn de inoculare:
- se palpeaz apariia nodulului de inoculare i a hipertrofiei nodului
limfatic zonal (nodul limfatic ingvinal); prezena acestor leziuni presupune
sacrificarea unia dintre animale n vederea cercetrii leziunilor din organe. Atunci
cnd produsele patologice sunt intens virulente, nodulul de inoculare este evident,
cu margini detaate i tendin de ulcerare i eventual scurgeri de coninut cazeos.
n cazul unor produse paucibacilare, leziunile locale pot fi absente dar se pot
evidenia leziunile viscerale;
- la 5-6 sptmni de la inoculare, se poate face controlul instalrii alergiei
tuberculinice, injectndu-se strict intradermic cte 0,1 ml. din tuberculinele PPD-
bovin i PPD-aviar, separat pe laturile flancului dup ce zona de inoculare a fost
depilat.
Reacia pozitiv, se caracterizeaz prin apariia unei infiltraii cu
ngroarea dermului de pn la 5,0 mm.
Reacia intens pozitiv, se caracterizeaz prin prezena unui nodul de
reacie de consisten variabil, cu zona central necrozat.
Reacia alergic poaitiv i/sau intens pozitiv presupune sacrificarea
animalelor i examinarea leziunilor din organe.
Animalele cu reacie alergic negativ se menin n continuare n via pn
la 90 de zile, dup care vor fi sacrificate.

264
 . Sacrificarea animalelor de experien infectate.

Eutanasierea animalelor infectate experimental se va face cu eter (tampon

mbibat cu eter), ntr-o incint nchis pentru cobai, sau prin injecie intravenoas
la iepure.
Cadavrele se fixeaz cu faa n sus , ntr-o tav cu hrtie de filtru umezit cu
5,0 fenol, cu membrele poziionate lateral. Se dezinfecteaz cu sol. 5,0 fenol
suprafaa toracelui i abdomenului i se secioneaz pielea printr-o incizie median
pornind din zona cervical, torace, abdomen, pn la pubis.
Se detaeaz pielea i esutul conjunctiv subcutanat pe toat aria toracal i
abdominal i se rsfrnge spre exterior.
Se secioneaz cavitatea abdominal, ncepnd de la pubis i pn la vrful
sternului, apoi cu dou incizii unghiulare se ndeprteaz calota sternal. Inciziile
vor fi executate cu mult atenie pentru a nu seciona organele interne.
Se noteaz leziunile cazeoase i dimensiunile acestora n diferite organe.
Splina se va examina cu atenie, msurnd diametrele n centimetri,
apreciind numrul i dimensiunile leziunilor i calculnd indicele splenic prin
raportarea greutii splinei la greutatatea cobaiului x 100.
Din toate organele cu leziuni, vor fi efectuate frotiuri directe (amprente)
care vor fi examinate bacterioscopic dup colorare prin metoda Ziehl-Neelsen,
pentru evidenierea bacililor alcool-acido-rezisteni (BAAR).
Examenul microscopic al amprentelor din organele i esuturile animalelor
infectate experimental este obligatoriu avnd n vedere c leziunile macroscopice
constatate pot fi confundate cu unele abcese, prezente m ficat i splin, provocate
de Pasteurella pseudotuberculosis, Pneumococcus sp., Salmonella sp., care la cobai
produc leziuni de pneumonie i pleurezie.
n mod obligatoriu, din organele i esuturile cu leziuni vor fi fcute
nzmnri pe mediile de cultur pentru micobacterii disponibile i vor fi recoltate
probe pentru examenul histopatologic i teste de biologie molecular.
Pe baza leziunilor constatate n organe, se poate stabili gradul de
patogeitate a tulpinii izolate, calculnd indicele Feldmann.
Conform datelor din tabelul nr.27 se acord un numr de puncte, n funcie
de constatrile fcute pentru fiecare organ.
Valoarea maxim a indicelui Feldmann este 100 exprimnd un grad foarte
ridicat de patogenitate a tulpinii inoculate.
Tabelul:27

Stabilirea patogenitii unei tulpini de Mycobacterium pe baza indicelui Feldmann

Evidenierea i caracterul leziunilor Splin Pulmon Ficat Loc.Inoc. i Ln Pulmon=N

satelit Ex.L.n. Tr.Br.
I. LEZIUNI PROGRESIVE 30 30 25 10 10
Invazie extensiv
Invazie moderat 20 20 20 10 10
II. LEZIUNI NEPROGRESIVE 3 3 2 1 1
Fibroz tuberculi duri
Fibroz sau numai calcifieri 1 1 1 1 1
VALORI MAXIME, TOTAL =100 Pct. 30 30 20 20 10
Ln.Tr.Br.= Nod limfatic traheo-bronhic

Rezultatele pozitive, coroborate cu examenle bacterioscopice, histo-

patologice, analizelor de biologie molecular i, dup caz, cu examenele cultu-rale,
confirm diagnosticul de tuberculoz cu o tulpin de Mycobacterium intens
patogen sau mode-rat patogen.

265
 Not:
Pentru infecia experimental la psri, sunt preferai cocoii deoarece
testarea alergic se poate efectua cu uurin n brbie.
Dac animalele mor n primele 7 zile de observaie, aceste vor fi examinate
i n acelai timp vor fi infectate alte animale din aceeai specie cu material
patologic pstrat la frigider pe toat perioada experimentului.
Toate constatrile fcute n cursul experimentului vor fi nregistrate n fia
de observaie a animalului.

4.2.2. EXAMENUL HISTOPATOLGIC.

Examenul histopatologic are importan semnificativ n precizarea

diagnosticului de tuberculoz. Tehnicile de lucru utilizate pentru prelucrarea i
examinarea preparatelor histologice permit evidenierea, n primul rnd, a
modificrilor tisulare specifice infeciei tuberculoase dar i a micobacteriilor
prezente n granulomul tuberculos.
Datele din literatura de specialitate arat c 75-90 % dintre leziunile
tuberculoase neobservate macroscopic pot fi evideniate i difereniate prin examen
histologic .
Metodele de investigare histopatologice, prezint avantaje net supe-rioare
fa de alte metode, cum ar fi:
- procedurile de lucru utilizate sunt simple i nu necesit echipamente i
aparatur complicate:
- permit diferenierera leziunilor caracteristice infeciei tuberculoase de alte
infecii care produc leziuni macroscopice asemntoare tuberculozei;
- permit evidenierea micobacteriilor prin tehnici speciale de colorare a
seciunilor tisulare;
- metodele moderne imuno-histochimice ctig tot mai mult teren, nu
numai pentru diagnosticul tuberculozei, dar mai ales pentru cercetarea proceselor
imunologice i mecanismelor celulare de aprare specifice n cursul evoluiei
infeciei tuberculoase. Literatura de specialitate public numeroase studii cu
importan aplicativ incontestabil asupra rolului unor interleukine n
mecanismele de activare sau de blocare a celulelor macrofage i limfocitelor n
aprarea antituberculoas, rol demonstrat cu ajutorul metodelor
imunohistochimice (153, 159).
Dezavantajele metodelor histologice clasice i imunohistochimice sunt
determinate de nivelul de dotare al laboratoarelor de morfopatolgie, acurate-ea
tehnicilor de prelucrare, colorare examinare a eantioanelor precum i de gradul de
pregtire a personalului de specialitate pentru diagnosticul tuberculozei, n special
la animale.

4.2.2.1. Metode histopatologice clasice.

Procedee de lucru.

Dup includerea la parafin, fragmentele de esuturi se supun operaiunilor

de secionare, deparafinare, etalare i colorare prin tehnicile clasice cunoscute cu
hematoxilin-eozin-abastru (HEA), pentru evidenierea modificrilor tisulare i
celulare specifice i prin metode de colorare Ziehl-Neelsen sau Auramin-O pentru
evidenierea bacililor acidorezisteni.
266
 Unele leziuni necesit a fi supuse operaiunilor de decalcifiere. n acest
scop, esuturile destinate examenului histopatologic vor fi tratate cu o soluie de
Acid-Dietilen- diamin-Acetic (EDTA).
Utiliznd soluia saturat de EDTA pentru decalcifiere, este necesar un timp
ndelungat.
Atunci cnd rezultatul examenului histopatologic trebuie obinut de
urgen, esuturile pot fi decalcifiate n 24 de ore folosind o soluie de citrat de
sodiu (C6H5Na3O7.H2O) Acid formic(Ch2O2). De asemenea, pentru decalcifiere
se poate utiliza i acidul nitric (HNO3).
Din fiecare fragment de esut se vor examina cel puin dou preparate
histologice; al 2-lea preparat, constituie rezerv pentru eventuale greeli de etalare
i colorare sau ca prob de contraexpertiz i va fi pstrat n lamotec n
conformitate cu prevederile legale. n acelai scop, pot fi pstrate i fragmentele de
esuturi incluse la parafin.
Avnd n vedere c unele micobacterii, aa cum este M. avium
paratuberculosis (bacilul lui Johne), n special la rumegtoare, produc leziuni
localizate exclusiv n mucoasa tractusului intestinal (ileon, jejun, valvula ileo-
cecal) i n limfocentrii mezenterici este necesar examenul histopatologic din
aceste zone pentru diagnostic diferenial ntre paratuberculoz i tuberculoz.

Examinarea preparatelor histologice i interpretarea rezultatelor.

Infecia cu reprezentani din complexul M. tuberculosis, incluznd M.

bovis, se caracterizeaz printr-o reacie tisular de tip granulomatos (tuber-cul)
care, n funcie de evoluia procesului patogenetic , poate fi ntlnit sub 3 forme:
a). Pregranulom (granulom macrofagic), prezent de regul n lezi-unile
incipiente de tuberculoz, se caracterizeaz prin : invazie de neutrofile, histiocite,
limfocite i macrofage n focar;

b). Granulomul tnr (granulom epitelioid) , caracterizat prin prezena

masiv a granulocitelor i celulelor epitelioide;
c). Granulomul matur , se ntlnete frecvent n formele avansate de
tuberculoz i prezint urmtoarele caracteristici:
- o zon central de necroz i cazeificare;
- procese de calcifiere n zona de cazeificare;
- cordon de celule epitelioide care nconjoar zona de cazeificare;
- frecvente celule gigante, multinucleate de tip Langhans la periferia
zonei epitelioide;
- zon periferic de limfocite T i B (n care celulele T sunt deobicei
predominante), macrofage i plasmocite ;
- n general, zona periferic a granulomului tuberculos este nconjurat de
un esut fibros.
Bacilii M. bovis pot fi observai n seciunile colorate Ziehl Neelsen, care
apar colorai n rou, dispui n grupuri sau dispersai n citoplasma macrofagelor i
n celulele gigante la periferia granulomului.
n general, bacilii sunt observai n numr redus n leziunile de tuberculoz
natural bovin.
De asemenea, pot fi observate forme cocoide (forme L).
Diagnostic diferenial. Diagnosticul diferenial trebuie fcut fa de alte
entiti morbide care produc leziuni de tip proliferativ-productiv (Tabelul nr.28).

267
 Tabelul: 28

Principalele caracteristici ale granuloamelor produse de alte infecii dect cele micobacteriene

Denumire Caracteristici

Localizat n special n mucoasa intestinal i n zona valvulei ileo-

Granulomul produs de M. av. Paratuberculosis
Granulomul brucelic
Granulomul Rhodococcus equi
Granulomul Nocardia i Streptomyces
Chistul hidatic
Granulomul de tip sarcomatos i alte neoplasme
Granulomul produs de corpi strini
cecale , cel mai frecvent n jurul plcilor Payer i n limfocentriii
mezenterici. Se caracterizeaz prin aglomerare masiv de
macrofage, limfocite, neutrofile i celule gigante de tip Langhans.
n centrul granulomului se poate observa o zon de necroz.
Submucoasa i seroasa intestinal sunt infiltrate cu macrofage i
limfocite. n citoplasma macrofagelor i celulelor epitelioide pot
fi observai bacili acidorezisteni (BAAR)
Acumulare de celule epitelioide n zona central cu nucleu palid
iar la periferie celule limfoide, polinucleare neutrofile i
plasmocite., celule Langhans frecvente n nodurile limfatice n
zona central. Zona central poate suferi proces de necroz
fibrinoid sau infiltraie masiv cu neotrofile.
Infiltraie neutrofilic n zona de necroz; calcifierea zonei
cazeoase este comun dar localizat mai frecvent la periferie;
coloraia Gram pune n eviden prezena bacililor Gram-pozitivi.
Celule gigante foarte numeroase dar tipice de corp strin;
calcifierea este mai rar ntlnit; neutrofilele prezente deobicei n
zona de necroz; Agenii cauzali se evideniaz n seciunile
colorate Gram sau prin metoda Gomori cu impregnare argentic
(GMS)
Uneori se pot observa necroze, cazeificri i calcifieri; prezena
celulelor Langhans i/sau celule tipice de corp strin; infiltraie
masiv cu eozinofile (aspect patognomonic): prezente fragmente
din capsula chistului format dintr-un strat fin de celule
aplatizate nucleate.
Infiltraie de celule multinucleate, limfocite T, histiocite,
fibroblaste i monocite.
Prezena macrofagelor, fibroblastelor i celulelor gigante tipice
de corp strin.

4.2.2.2.Metode imunohistochimice.

Imunohistochimia este recunoscut ca una dintre cele mai eficiente

mijloace de diagnostic al majoritii entitilor morbide infecioase i de studiu al
mecanismelor imunopatologice care au loc la nivel celular n cadrul e-suturilor i
organelor afectate. n prezent, metodele imunohistochimice au o larg
aplicabilitate n medicina uman pentru diagnosticul micobacteriozelor, n evoluia
proceselor canceroase, etc. dar n domeniul veterinar sunt utilizate sporadic, n
special n cercetare, dei avantajele sunt pe deplin motivate, reproducnd o celebr
remarc: ...Nu exist satisfacie mai mare dect aceea pe care ne-o ofer cu
generozitate imunohistochimia, de a asista la lupta ncrncenat ntre arsenalul
sistemului imun celular i microorganismul agresor. Imunohisto-chimia ne ajut s
nelegem i s identificm care dintre componentele celulare au capitulat n faa
agresorului. Este suficient s fie citate numai cteva referine asupra avantajelor
substaniale obinute prin aplicarea metodei imunohistochimice n diagnosticul
micobacteriozelor a crei valoare de diagnostic a fost, dup unii autori (153), net
superioar tehnicilor PCR. Fiind simpl, rapid uor de ralizat cu aparatur,
materiale i spaii de lucru obinuite, metoda este recomnadat pentru examinarea
n special a probelor cu rezultate negative prin tehnicile convenionale de diagnostic
al tuberculozei (159).
Principiul metodei, este identic cu cel al testului imunoenzimatic (ELISA)
n sandwich, unde antigenul micobacterian este detectat cu ajutorul anticorpilor
policlonali specifici de captur i, n faza urmtoare, evideniat cu ajutorul
anticorpilor de detecie conjugai cu peroxidaz, printr-o reacie de culoare.

268
 Procedeul de lucru, pentru varianta deteciei antigenului, este relativ
simplu i parcurge urmtoarele etape:
- deparafinare i rehidratarea seciunilor, dup tehnicile clasice
cunoscute;
- imersarea seciunilor n tampon-citrat, pH 6,2 i:
- introducerea seciunilor n incint cu electro-microunde cu program n
dou cicluri: primul ciclu timp de 10 min. la 75o W i al 2-lea ciclu timp de 15 min.
la 35o W.
- rcire 20 min. la temperatura camerei i apoi incubare cu peroxid -
hidrogen tim de 5 min. ;
- aplicarea anticorpilor policlonali anti BCG dil. 1:5000 i anticorpi anti
MPT64 dil.1:250 timp de 45 min.
Not: Anticorpii policlonali anti-Mycobacterium, pot fi procurai de la
diverse firme porductoare (exemplu: Dako). De aceea, utilizarea unui anumit tip
de anticorp este opional, n funcie de scopul urmrit de fiecare laborator. De
exmplu, unele laboratoare au folosit n experimente, cu rezultate acceptabile,
anticorpi anti- ESAT- 6 anti-ag. 38 kDa, NP10, sau fa de alte fraciuni antigenice
micobacteriene (247, 80).
- splare i incubarea timp de 45 min. a seciunilor acoperite cu un
polimer-dextran anti-iepure (sau un anticorp policlonal anti-iepure) conjugat cu
peroxidaz (HRP), adugarea substratului 3-amino-9-etil carbonat +H2O, timp
de 10 min. i splare, contracolorare cu HEA i examinarea seciunilor la
microscopul optic.

Fig.100 Model de celule MPT64 pozitive n cazuri de tuberculoz aa cum a fost detectat prin
imunohistochimie. (a) Mpt64 exprimat ntr-un caz de limfadenit tuberculoas. Antigenulse evidenaz n special n
celulele gigante i epitelioide i nu n centrul necrotic (NC). n jurul nodului limfatic se observ esutul
negativ. ( b) Zona marcat n (a) cu obeictiv cu capacitate crescut de marire. (c) O zon reprezentativ din granulom cu o
celul gigant multinucleat colorat intens pentru MPT64.

269
 Rezultate. n seciunile pozitive pentru antigen specific reprezen-tanilor
complexului Mycobacterium tuberculosis se observ agregate sau formaiuni
solitare colorate n brun-rocat pe fond colorat HEA, localizate n macrofage sau n
spaiile intercelulare (Fig.100 i 101)

Fig 101 - Seciune n esutul ileal colorat cu anticorpi de iepure anti M. bovis . Reaciile pozitive apar
su form de granulaii distincte de culoare brun in interiorul macrofagelor i celulelor gigante multinucleate

Avantajele i dezavantajele metodei. Metoda imunohistochmic are un

spectru larg de aplicabilitate. n domeniul diagnosticului infeciilor naturale i
experimentale cu micobacterii exist studii diversificate care, utliznd tehnica
imunohistochimic, aduc informaii extrem de importante asupra mijloacelor de
agresiune ale micobacteriilor asupra celulei gazd, comportamentul micobacteriilor
i mecanismele de supravieuire n interiorul celulei gazd dar mai ales
mecanismele de rezisten ale unor tulpini fa de unele medicamente
antimicobacteriene.
Immunohistochimia ofer date importante cu privire la stadiul evoluiei
tuberculozei (stadiul incipient, tuberculoz activ, tuberculoz latent i, n acelai
timp, date asupra intensitii activitii celulelor macrofage limfocitelor T i B
receptorilor i principalilor mediatori chimici i limfochine eliberate de acestea n
cursul infeciei micobacteriene (12).
Metoda immunohistochimic este simpl, ieftin i rapid cu o
specificitate ridicat i un coeficient de corelare cu PCR de aproximativ 87,0 % (153),
dar n diagnosticul veterinar al tuberculozei la animale n Romnia, aceasta nu a
trezit interes.
Totui, literatura de specialitate public date cu privire la utilitatea
immunohistochimiei n numeroase entiti morbide cu etiologie viral (31, 204, 219)
pneumonia progresiv (Maedi/Visna), Adenomatoza pulmonar la ovine i caprine
(182, 161, 26, 235, 61, 160) i etiologie bacterian (85, 84, 204, 224), fungic (104), parazitar
( 85, 71, 36), boli ale sistemului imunitar celular, boli tumorale i cancer (92, 75, 197).
Dezavantajele imunohistochimiei. Cu toate avantajele prezentate i
entuziasmul multor patologi, care pledeaz pentru aplicarea metodei n
diagnosticul morfopatologic a numeroaselor boli infecioase i neinfecioase, exist
numeroi factori extrinseci i intrinseci, care acioneaz pe toat durata lucrrilor,
ncepnd de la prelucrarea probei i pn la montarea seciunii, denaturnd
rezultatele testului. Aceti factori pot aciona uneori chiar i n laboratoarele
perfecionate, atunci cnd unele condiii sunt neglijate, gene-rnd variabilitate
notabil a rezultatelor de la o determinare la alta.

270
 Dintre factorii extrinseci, cei mai importani sunt:
- gradul de pregtire i perfecionare a personalului de specialitate n
execuia i reapectarea cu strictee a etapelor de lucru n condiiile cerute de
productorii de kituri i reageni utilizai n test;
- condiiile de prelevare,transport, conservare i procesare a probelor pot
influena semnificativ acurateea rezultatelor.
n ceeace privete pregtirea personalului operator i de specialitate,
verificrile parametrilor de calitate n laboratoarele de morfopatologie, n care se
utilizeaz curent metoda immunohistochimic pentru diagnosticul mico-
bacteriozelor, au dovedit frecvente erori i nonconformiti n palicarea proce-
durilor, din cauza inabilitilor n execuia etapelor de lucru, a examinrii
seciunilor i interpretrii corecte a rezultatelor, generatoare de rezultate false i n
acelai timp scderea seminificativ a reproductibilitii metodei.
Condiiile de prelevare, transport, conservare i procesare a probe-lor au
importan deosebit asupra rezultatelor examenului imunohisto--chimic. n acest
contesxt se are n vedere prelevarea corect a probelor de esuturi respectnd
prelevarea cerinele de calitate i cantitate .
Este important ca proba recoltat s includ att esut cu modificari
patologice specifice pentru infeciile micobacteriene dar i zone de esut normal.
De asemenea, se va acorda atenie evitrii prelevrii de esuturi alte-rate,
cu procese necrotice avansate i fenomene biologice cum ar fi: autoliza,
ramolisment pronunat i procese hemolitice sau fenomene fizice, ca: distrucii
tisulare (striviri, celule ratatinate) care pot s reduc intensitatea sau s stopeze
reacia immunohistochimic prin blocarea parial sau total a epitopilor specifici
celulelor tisulare sau micobacteriilor pentru anticorpii de captur i de detecie.
n cazul prelevrii probelor prin biopsie factorii amintii mai sus sunt
eliminai n parte sau n totalitate.
Factorii endogemi, acioneaz n egal msur asupra sensitivitii i
specificitii conducnd la rezultate fals-pozitive i respectiv fals-negative n
coloraia imunohistochimic (IHC).
Sensitivitatea.
S-au identificat cteva situaii cu origine endogen care altereaz
sensitivitatea metodei imunohistochimice (IHC):
a). Epitopii celulari sunt dificil de detectat prin microscopie optic avnd
capacitate redus de a lega anticorpii specifici dtorit unor anomalii de
conformaie.
Pentru a elimina acest inconvenient se poate apela la o tehnic de re-
cuperare a antigenului cu ajutorul enzimelor proteolitice sau tratamentul sec-iunii
de esut cu o soluie tampon;
b). Anticorpii primari care posed constant situsuri de legare sunt greu de
protejat n cursul derulrii etapelor de procesare a probelor de esuturi. De
exemplu, anticorpii utilizai pentru testele ELISA posed o afini-tate mai slab
dect cei pentru IHC pentru c, n cazul testelor ELISA, tipul de reacie este
competitiv n timp ce n IHC reacia depinde de situsurile cu afinitate nalt care
rezist operaiunilor etapizate de procesare a seciunilor de esuturi;
c). Celula infectat cu micobacterii este inaccesibil pentru penetrarea
reagenilor imunohistochimici, datorit prezenei biotinei n structura esutului
analizat care se poate cupla nespecific cu anticorpii primari blocnd situsurile de
legtur ale acestora

271
 De aceea, unii autori recomand blocarea biotinei naturale prin imer-sarea
esutului n H2O2 conentraie 3,0 % timp de 10 min, 3 splri n PBS (fiecare
splare cu durata de 3 minute), pretratamentulseciunilor cu citrat, EDTA su Tris-
HCl, tratamentul termic cu vapori timp de 10-20 minute i incubarea probei cu un
ser normal (exemplu ser normal de bovine) pentru blocarea situsurilor nespecefice,
rcirea n soluie tampon la temperatura camerei i splarea n PBS de 3 ori cte 1
minut (27).
d). Degradarea receptorilor celulei gazd i cei ai celulei micobac -teriene,
determin pierderea imunoreactivitii.
Cercetrrile asupra receptorului estrogen, keratinei, receptorilor p53, i K1-
67 au artat c n seciunile parafinate i stocate n azot lichid acetia au fost
detectai prin IHC dup 60 de ani, comparativ cu probele neparafinate i meninute
la temperatura camerei unde rceptorii au fost detectai numai pn la 3 luni (67, 99).
e). Procesarea esutului . S-a dovedit c etapele multiple de procesare
afecteaz diferite antigene. M e n g h e l M., e t a l. , 2 0 05 (145) , arat c
frecvena celulelor tumorale K-67 pozitive depinde de natura i durata etape-lor
procedurale n metoda IHC .
Specificitatea .
Coloraia IHC nespecific poate uneori s conduc la rezultate fals-
pozitive evideniate prin prezena unor celule sau molecule antigen nespeci-fice
din urmtoarele cauze:
a). Similitudinea ntre epitopul fals i cel adevrat (celular sau
microbian), care are afinitate crescut i situsuri de legtur pentru anticorpii
primari;
b). Epitopul celular sau tisular poate fi reprezentat de o structur proteic
njumtit, urmare a unei mutaii translaionale comun mole-culelor
nefuncionale (epitop fals);
c). Eliberarea i pierderea antigenului din diferite compartimente al
celulei gazd , ca urmare a procesului de autoliz;
d). Prezena peroxidazei endogene n cantitate suficient paentru a induce
un semnal fals, independent de reacia adevrat de imunolocalizare. Acest
fenomen este posibil n cazul pezenei cantitilor excesive de eritrocite i neutrofile
sanguine n probele de esuturi;
e). Cauzele idiopatice generatoare de rezultate false, includ procesele
necrotice, prezena artefactelor i precipitatelor care se coloreaz fals IHC.
f). Supraexpunerea esutului la aciunea peroxidazei ca urmare a efectului
de margine n urma desprinderii seciunii de esut de pe lam pe ambele suprafee.
Evitarea acestor neajunsuri i eliminarea rezultatelor fals-pozitive s-ar
putea realiza prin preabsorbia epitopilor nespecifici cu seruri normale, cu toate c
nu ntodeauna rezultatele vor fi cele ateptate, datorit conformaiei proteinei
antigenice din celulele tisulare care este diferit de cea liber.
Controlul specificitii poate fi demonstrat i prin imunoprecipitare cu
anticorpi direcionai ctre antigenul cutat.

272
 4.2.3. BULETINUL DE ANALIZ.

Buletinul de anmaliz este actul oficial emis de un laborator autorizat n

care sunt comunicate rezultatele examenelor i analizelor efectuate pentru
precizarea diagnosticului de tuberculoz sau infecie micobacterian.
Laboratorul de specialitate poate emite un buletin de analiz cu rezul-tate
pariale (pentru ex. anatomopatologic, bacterioscopic direct i histopatologic)
atunci cnd acestea sunt pozitive pentru tuberculoz.
Buletinul de analiz va fi numerotat cu numrul din registrul unic de
diagnostic al laboratorului de specialitate acordat probelor la primrea acestora n
vederea analizelor i un numr de nregistrare din registrul de ieiri cu data (ziua,
luna, anul) expedierii buletinului.
La redactarea buletinului se va avea n vedere urmtparele:
1). Se va meniona corect numrul i felul probelor, numrul de animale de
la care provin acestea, specia vrsta, mprejurrile i motivul trimiterii (exemplu: ..
animale pozitive la testul IDR, animale moarte sau abatorizate pentru precizarea
diagnosticului de tuberculoz).
Pentru persoane se va specifica: numele pacientului, vrsta i adresa
(localitatea, strada, numrul, sector/jude ).
2). Starea n care s-au primit probele (proaspete, ngheate, alterate, etc) .
Se va specifica n detaliu condiiile de recoltare (n gospodrie, abator, pune etc.),
data recoltrii (ziua,anul, ora), conservare i transportul probelor (numele
persoanei fizice sau juridice care a trimis probele, data primirii probelor la
laborator (data primirii probelor la laborator trebuie s coincid cu data
nregistrrii n registrul unic pentru intrare probe). Dac exist neconcordan ntre
data primirii i data nregistrrii probelor, se vor ntreprinde msuri de eliminare a
nonconformitii constatate.
3. Numele i prenumele proprietarului animalelor; adresa complet,
inclusiv telefon, fax sau adresa electronic (proprietarul poate s fie persoan fizic
sau juridic).
4. Numrul i data notei care nsoete probele; numele persoanei care a
emis nota de nsoire (nota de nsoire a probelor va fi emis numai de autoritatea
medical veterinar local sau judeean).
5). Se va specifica m buletin , examenele i analizele solicitate n nota de
nsoire (exemplu: examene i analize pentru diagnosticul tuberculozei).
6). La capitolul Rezultate , vor fi menionate n detaliu: rezultaele ex.
anatomo-clinic (rezultat din nota de nsoire), i anatomopatolgic, cu descrierea
leziunilor macroscopice i localizarea acestora i, n continuare, restul examenelor
de confirmare, ncepnd cu examenl bacterioscopic direct , culturi bacteriologice,
examen histopatologic i/sau IHC, biotest (infecie experimental pe animale de
laborator: cobai, iepure, pasre) i finaliznd diagnosticul cu teste biochimice i
analize genetice i biologie molecular pentru identificarea i determinarea speciei
incriminate n infecia tuberculoas.
7). Capitolul Diagnostic este partea cea mai important a buletinului de
analiz. Toate metodele de lucru utilizate pentru precizarea diagnosticului de
tuberculoz se completeaz reciproc n ceeace privete valoarea lor de diagnostic.

273
 De aceea rezultatele investigaiilor de laborator n direcia tuberculozei vor
fi notificate i analizate prin asociere, rezultnd o palet de situaii, care conduc la
rezultatul final (Tab:29) n funcie de care se consemneaz diagnosticul i concluzia
final n buletinul de analiz.

Tabelul: 29

Modele de interpretare a rezultatelor investigaiilor de laborator n diagnosticul tuberculozei

Situ EXAMENE (ANALIZE) BIOTEST REZULTAT

aii ANATOMO- BACTERIOLOGI HISTO- (Inf.exp.) FINAL
PATOLOGIC C PATOLOGIC
DIRECT CULTUR SAU IHC
1. - - - - - NEGATIV
2. + - - - - NEGATIV
3. - +/- + + X POZITIV
4. + + + + X POZITIV
5. - - + + X POZITIV
6. N.C. - +/- +/- +/- POZITIV
(Necestit ti-
pizare).
N.C. = Neconcludent; X= examenul nu mai este necesar

Dac nu au fost efectuate teste i analize pentru determinarea i

identificarea speciei micobacteriene sau aceste investigaii sunt n curs de finalizare
n buletinul de analiz, la capitolul diagnostic se va utiliza formularea: Pozitiv
pentru micobacterii alcool-acido-rezistente (BAAR) ncadrate n grupa patogene
pentru animale i om , sau Infecie cu micobacterii alcool-acido-rezistente
(BAAR) patogene pentru animale i om.
8). La capitolul Comentarii i observaii, cnd investigaiile de
identificare a speciei micobacteriene nu au fost finalizate pn la emiterea
buletinului de analiz, dar reultatele examenelor de confirmare meionate n tabelul
nr 29 au fost pozitive pentru BAAR , se va meniona: Testele pentru identificarea
speciei micobacteriene izolat sunt n curs de finalizare. Rezultatul acestor teste
va fi comunicat ulterior.
Dac testele de identificare a speciei micobacteriene au fost finalizate, n
buletinul de analiz la capitolul Diagnostic se va specifica: Tuberculoz. Prin
analize specifice s-a identificat M.tuberculosis sau M. bovis, sau ali reprezentani
ai Complexului M. tuberculosis
9. Cnd s-a confirmat diagnosticul de tuberculoz, la capitolul
Recomandri trebuie s se menioneze complexul de msuri de profilaxie
general, imunoprofilaxie specific, chimioterapie precum i msuri adecvate de
lichidare a focarului de tuberculoz (creterea frecvenei depistrilor, eliminarea
animalelor pozitive la testele IDR sau imunitate mediat celular (IMC) i/sau
lichidare prin depopulare total a fermei de animale n care s-a diagnosticat
tuberculoza).
Responsabilitatea nregistrrii, notificrii, declarrii oficiale i raportrii n
fia de epizootii a tuberculozei i aplicrii programelor de eradicare a bolii, revine
autoritii medicale veterinare competente, n conformitate cu legislaia veterinar
intern i internaional.

274
Bibliografie la Cap. V.

1. Aaron L. Saadoum D, Calatroni E.T, et al; Tuberculosis in HIV infected patients a comprehensive review. Clin.Microbiol.
Infect. 2004; 10: 388-398.
2. Aboy-Raya S., Aboy-Raya A: Spinal tuberculousoverlooked? J. Intern .Med.2006; 260: 160-163.

3. Abubakar U.B, Shehu S.A, Mohamed F,U.: Retrospective study of Tuberculosis in Slaugtered Cattle at Maiduguri
Abattoir, Nigeria, Vet.Res., 2001; 4(1): 1-4.
4. Addo K.K, darko-O K., Manu-Y D., et al.: Mycobacterial Species causing pulmonary tuberculosis at the Korle Teaching
Hospital ACCRA, Ghana. Ghana Med.J., 2007; 41(3): 52-57.
5. Adekambi T., Colson P., Drancourt M.: rpoB bases identification of nonpigmentated and late pigmentated rapidly
growing mycobacteria. J.Clin.Microbiol.,2003 41: 5699- 5708.
6. Adekambi T., Berger P., Renoult D., Drancourt M.: rpoB gene sequence based characterization of emerging
nonotuberculou mycobacteria with description of Mycobacterium bolletti sp.nov. Mycobacterium phocacium
sp.nov. Mycobacterium aubagnense sp.nov. Int. J.Syst. Evol.Microbiol. 2006; 56: 133-143.
7. Adekambi T., Reynaud-Gaubert M., Greub G., et. al.: Amoebal coculture
Of Mycobacterium of Mycobacterium massiliene sp.nov. from sputum of patients with heopticpneumonia.
J.Clin.Microbiol., 2004; 42: 5493-54501.
8. Alan J.W., Louis R.K, Andrew C.N., et al.: Editors Campbell-Wals Urology. 9-th New York saunders, Elsevier, 2006.
9. Albert H., Heydenriych A., Brookes R., et al: Performance of a rapid phage-based test FAST-Plaque-TB, to diagnose
pulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa. Int.J.Tuberc. Dis. 2002; 6: 529-537.

10.Alcaide F, Benitez M.A, Martin R., Escriba J.M.: Evaluation of the BACTEC460 and MB-BCT/T system for rutine
detection of Mycobacterium tuberculosis. J.Clin.Microbiol., 2000; 38: 3131- 3132
11. Aliyu MH, Aliyu S.H, Salihu H: Female genital tuberculosis: a global review. Int.Fertil.Womens.Med. 2004; 49(3): 123-
126
12. Ashok M. Neelam K. Beena K.R: Immunohistochemical detectection Mycobacterial Antigen Tuberculous
Lymphadenitis. Ind.J.Tuberc., 2002; 49: 213.
13. Aston N.O: Abdominal tuberculosis. World.J.Surg. 1997; 21: 492
14. Anup K, K., Mendez S.E, Hatew C.L, Molina-Lopez J, Katherine A.M., Pitt L.M, Danneberg A.jr, Manabe Y.C:Effect of
Dexamethasone and transient malnutrition on Rabits infected wirh aerosolised M. tuberculosis CDc 1551.
Infect.Immun., 2005; 73(10): 7056-7060.
15. Baker B.R, Honour J., et al.: Increased cortisol: cortisone ratio in acute tuberculosis . Am.J.Resp.Crit. Care Med.,
2000; 162: 1641-1647
16. Balz M., Telenti A., Marchezi F., Bally F., Bottger E.C., Bodmer T.: Rapid identification of the mycobacteria to the
species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J.Clin.Microbiol., 1993; 31: 175-178.
17. Banaiee N. Bobadilla., del Valle M., Bardarov S.Jr et al..: Luciferase reporter mycobacteriophages for detection,
identification and antibiotic susceptibility testing Mycobacterium tuberculosis in Mexico. J.Clin.Microbiol., 2001;
39: 3883-3888.
18.Barett A., Magee J.G., Freeman R.: An evaluation of the BD Probe Tec ET system for detection of Mycobcterium
tuberculosis in respiratory samples. J. Med. Microbiol., 2002; 51: 895-898.
19. Bathia V.Y, Aggarwall V, Sharma U, Gupta A: Primary Tuberculosis sternal osteomyelitis: A critical rarity. Asian
Cardiovasc,Thoracic Ann.,2009; 17(3): 310-312.
21. Bergami M.B., Losi M., Vienti F., Meacci M., Meccugni B., De Giovani D., Melnari C. Richeldi L.: Performance of blood
test for diagnosis of Latent tuberculosis Infection in Children. Congres ERS, Berlin, 2008; Oct. 5-th; S39, p.1s
22. Bergmann J.S., Williams Bouyer N.: Clinical evaluation of the Gen-prope Aplified Mycobacterium tuberculosis
Direct test for rapid detection Mycobacterium tuberculosis in select nonrespiratory specimens. J.Clin.. Microbiol.,
2001; 39:747-749.
23. Bergmann J.S., Keating W.E., Woods Gl.: Clinical avaluation of the BD Probe Tec ET system for rapid detection of
Mycobacterium tuberculosis . J.Clin.Microbiol., 2002; 38: 863-865.
24. Bird B.R., Madison B.M. Use of Fluorochrome staining for detecting acid-fast Mycobacteria. CLPS-Dep. Health and
Human Serv.Centers for Disease Contr.And.Prev.Atalanta GA3033, 2000: p.1-17
25. Blackwood K.S., He C., Gunton J., Turenne C.Y., Wolfe J., Kabani A.M: Evaluation recA sequence for identification of
Mycobacterium species, J.Clin.Microbiol., 2000; 38: 2846-2852.
26. Boden A.L., Houston F., Fryer R.H., Kao R.R.: Use of preclinical test in the control of classical of bovine spongiform
encephalopathy in sheep. J..en. Virol., 2010; 91(pr.10): 2642-2650.
27. Bodog A.: Contributii la stabilirea diagnosticului i conduita therapeutic in tumorile ovariene secundare. Teza de
doctorat, rez., UMF Oradea, 2009
28. Borchers F.: Introducing liquid culture medium for tuberculosis in northeast Thailanda : an evaluation of changes in
culture yield and speed of drug susceptibility. Dissertation. Med.Fak.Charite, Univ.Berlin, 2009; pp. 17-27
29. Briceo-Garcia E.M., Gomez Pardal A, Alvarez-Bustos G, Artero-Munoz I:Tuberculois Epididymitis after
BCGTherapy for blader cancer. J.Ultrasound.Med., 2007; 26(7): 977-979.
30. Brizzi M.G, Celi G, Scaldaza A.V, Barbaro B: Doagnostic imaging of abdominal tuberculosis: gastrointestinal
tract,peritoneum, lymph node. Pub.Med.gov. Rays 1998; 23: 115-125
31. Brodersen B.W.: Immunochemistry used as a screening method for Bovine Dihareea Virus Infection. Vet,Clin.
North.America .Food Anim. Pract., 2004; 20:85.
32. Brunello F., Favari, Fontana R.: Comparison of the Mb.Bact T and BACTEC 460 TB systems for recovery of
mycobacteria from various clinical specimens. J.Clin.Microbiol. 1999; 37: 1206-1209.
33. Buca Simona: Testul intradermotuberculinic (Mantoux ). Centrul Medical de diagnostic, Dr. V.Babes, Bucuresti.
34.Buddle B.M, Aldwell E.F., Pfeffer A., de Lisle W.G, Corner L.A.: Experi-mental Mycibacterium bovis infefction of catlle.
Efect of dose of M. bovis and pregnancy on immune responses and distribution of lesions. New.ZVet,J,, 1994; 42:
167-172.
35. Buddle R.M., Wilson T., Denis M., Greewald R, Esfandiari J, Liaschenko P.K., Liggett S, Mackintoch C.G: Sensitivity,
specificity and confounding factors of Novel serological test used for the rapid Diagnosis of Bovine Tuberculosis In
farmed red Deer (Cervus elafus). Clin. Vacc.Immunol.,2010; 17(4) 626-630.

275
36. Buffet M., Grange P.A.,Gerhardt P., carlotti A., Calvez V., et al.: Diagnosing Treponema pallidum in secondary syphilis
by PCR and Immunochemistry. J.Invest. Dermatol., 2007, 127: 2345- 2350.
37. Bull T.J., Shanson D.C., Evaluation of a Cheiluminiscent Gen Probe Accu Probe for rapid identification of
mycobacteria including MAIC X , isolated from blood and other sites, from pathients with AIDS. J.Hosp.Infect,
1992; 21: 143-149.
38. Bull TJ., Shanson D.C., Archard L.C.: Rapid identification from AIDS patients by capillary electrophoretic profiling of
amplified SOD gne . J.Clin,Pathol.Mol. Pathol. 1995; 48: 124-132.
39. Bungetzianu G., Moldovan Olga: Investigatia microbiologic in tuberculoz i micobacterioze ,Ed. Acad.RSR,
Bucuresti,1987.
40. Buttler R.W., Guthertz L.S.: acid mycolic analysis by High-Performance Liquid Chromatography for identification of
Mycobacteria species. Clin.Microbiol.Reviews., 2001;15(4): 704-726.
41. Camp R.L., Charette L.A., Rimm D.L. : validation of tissue microarray technology in breast carcinoma. Lab.Invest.,
2000; 80: 1943-1949.
42. Cardoso T,C,, Castanheira T.L.L, Teixeira M.C.B., Rosa A.C.G., Hirata K.Y, Astolphi R.D., Luvizotto M.C.R.: Validation
of an Immunohistochemistry Assay to detect Turkey Cor0na virus. A Rapid and Simple Screening Tool for Limited
resource Setting Poultry Science, 2008, 87: 1347-1352.
43. Casal M., Gutierez J., Vasquero M.: Comparative evaluation of mycobacteria growth Tube with BACTEC 460 TB system
and Lowenstein-Jensen medium for isolation of mycobacteria from clinical specimens. Int.J. Tuberc.Lung. Dis.,
1997; 1: 81-84.
44. Caviedes L., Lee T.S., Gilman R.H., et al.: Rapid efficient detection and drug susceptibility testing Mycobacterium
tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures J.Clin.,Microbiol., 2000; 38: 1203-1208.
45. Chakerian A.A, Perera T.V, Behar S.M: Gamma-Interferon CD4+T lymphocytes iron the lung correlate with resistance
to infection with Mycobacterium tuberculosis . Infect Immun. 2001; 69: 2666-2670
46. Chapman A.L.N, Muncanta M, Wilkinson K.A, Pathon A.A, Ewer K, Ayles H., et al.: Rapid detection active and latent
tuberculosis infection in HIV positive individual by enumeration of Mycobacterium specific T cells.
Am.J.Resp,Crit.Care Med., 2002; 163: 824-828.
47. Chedore P.,Jamieson F.B.: Rapid molecular diagnosis of tuberculous meningitis using the Gen-Probe amplified
Mycobacterium Tuberculosis direct test in a large public health laboratory. Int.J.Tuberc.Lung.Dis., 2002; 6: 913-
919.
48. Chiang I-S., Suo J., Bai K-J., Lin T-P, Luh K.T., Yu Ch-J., Yang P-Ch.: Serodiagnosis in tuberculosis .
Ann.J.Respir.Crit., Care Med. 1997; 156: 906-911
49. Clark S.A, Martin S.L. Pozniak A, Steel A, Ward B, Dunning J, Henderson D.C, Nelson M, Gazzard B, Kellher P:
Tuberculosis Antigen Specific Immune responses can be detect using Enzyme-Linked Immunospot Technology in h
uman immunodeficiency virus (HIV-1) patients with advances disese. Clin.Exp.Immunol., 2007; 150(2): 238-
244.
50. Clarise QueicoFujimura L. et al.: Memorias do Instituto Oswaldo Cruz., 1998. 93(6): 801-806
51. Clarise Queico Fujimura L., Clows Wesley Oliveira de Souza, Sergio Roberto de Andrade Leite: Identification of
Mycobacteria by Thin-Layer Chromatography Aanalysis of Mycolic Acids and conventional method: Four years of
experience .Mem.Inst.Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 1998; 93(6): 801-805
52. Clonel J.L., Shutt C., Aldous W., Woods G.: Evaluation of a Modified Gen-Probe Amplified Direct Test for detection of
Mycobacterium tuberculosis Complex Organism in Cerebrospinal Fluid. J.Clin.Microbiol., 2004;42:5341-5344.
53. Coleman D., Waddell J.S., Mitchinson A.D.: Effect of low incubation temperatures on the bactericidal activity of anty-
tuberculosis drugs. J.Antimicrob.Chemother.,2011; 66(1): 146-150
54. Collins C.H.: Mycobacterium marinum infections in man .J.Hyg.Com.1985; 94: 135-149.
55. Corbett E.L, Watt C.J, Walker N, et al. The growing burden: global trends and interaction with HIV epidemic.
Arch.Intern.Med. 2003; 163: 1009-1021
56. Damina M.S., Owoludun O.A, Chukwukere S, Ameh J,A. Aliy MM: The use ofdeletion Analysis of Detection of
Mycobacterium tuberculosis,and Mycobacterium africanum in Palteau State North Central Nigeria, Nigerian Vet.
J., 2011;32(1): 9-15.
57. Danenport M.C, Mishra B.M, Dash S.P, Kar P.K: Periferal lymph node tuberculosis: a review of 80 cases. Br.J.Surg.
1990; 77: 911-912.
58. Danielidis V, Patrikakos G, Moeman M, Bonte K, Dhooge C, Vermeersch H: Diagnosis management and surgical
treatment of non-tuberculosis mycobacterial head and neck infection in children. ORL.
J.Otholaryngol.Relat.Spec.,2002; 64:284-289.
59. Davidow A, Kanaujia G,V, Shi L, et al.: Antibody profiles charaterisitc of Mycobacteriun tuberculosis I nfection state.
Incet.immun. 2005; 73:6846-68-51.
60. Davies Mary-Ann, Cornwell T, Johannisen C, Wood K, Piennar S, Wilkinson K, Wilkinson R.J, Heather Z, J, Eley B.,
Dacid B, Curtis N, Nicol M.P.: Detection of Tuberculosis in HIV infected children using Enzyme-Linked
Immunospot Assay. AIDS, 2009; 23(8): 961-969.
61. De Beer Sabine. Barron T.G.M., Bencsik A.A.: Transmissible Spongiform Encephalopathy Diagnosis Using PRPsc
Immunohistochemstry on fixed but Previously Frozen Brain samples. J.Histochem. Cytochem., 2002; 50(5): 5611-
5616.
62. De Kantor N.I., Kim S.J., Frieden T., Laslo A. et al: laboratory services in tuberculosis control, Microscopy, Part.II.,
WHO/TB/, 1998; p. 35-44.
63. De Lisle G.W., Mackinstosh C.G., Bengis R.G: Mycobacterium bovis infree living captive Wildlife, including farmed
deer. Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz., 2001; 20(1): 66-111.
64. Della Latta: Mycrobiology and Mycobacteria susceptibility tests. In. Clinical Mycrobiology Procedures Handbook,
Second edition, 2007, Henry D.Isenberg Ed. In Chief ASM Press
65. De Waard J.H., Robledo J.: Convenctional methods for tuberculosis diagnosis ( In : Tuberculosis ,2007; cap. 12
p.401-420. Leao, Palmino and Ritacco Eds.)
66. Dheda K, Lalvani A., Miller C.F., et al.:Performances of the T-cell based diagnostic test for tuberculosis infection in HIV
infected individuals is independent of CD4 cell count. AIDS, 2005; 19: 2038-2014.
67. Divito K.A., Charette L.A., Rimm D.L., et al.: Long term preservation of antigenity on tissue microarray. Lab.Invest.,
2004, 84: 1071-1078
68. Duyora B,Kumar R., Modgi R. Sharma a: calvarial tuberculosis: A report of eleven patients. Neurol.India, 2009;
57(5):607-612
69. Estawood J.B, Carbishley C.M, Grange J.M: Tuberculosis and kidney. J.Am.Sc.Nephol. 2001;12: 1307-1314.
 276
70. Farnia P., Mohammadi F., Zarifi Z., et al.: Improving of direct microscopy for detection of acid-fast bacilli in sputum:
use of chitin in mucus digestion. J.Clin.Microbiol. 2002; 40: 508-511.
71. Fernando-J. Torres Velez, Eva K.. Nace, Kimberly Y Won, et al.: Development of Immunohistochemical Assay for the
detection of babesiosis in Formalin-Fixed, Parafin-embledded Tissue Samples. Am.J.Clin. Pathol., 2003; 120: 833-
838.
72. Figueredo A.A., Lucon A.M., Junior R.F., Srougi M.: Epoidemilogy of urogenital tuberculosis worldwide.
Int.J.Urol.,2008;15: 827-832.
73. Flyn R.J, Manion C, Golden O, Hacariz O, Mulcahy G: Experimental Fasciola hepatica infection alter response to test
used for diagnosis of bovine tuberculosis. Inf.Immun., 2007; 75(3): 1373-1381.
74. Folkensammer C., Grazzi C, Hager M, Maier H,Bartsch G, Holti L: Latte occurrence of bilateral tuberculous
epididymo-orchitis after intravesical bacillus Calmette-Guerin therapy for superficial blader carcinoma. Urology
2005; 65(1): 175.
75. Gaal J., Stratakis C.A, Carney J.A. Ball E.R., et al.: SDHB Immunohistochemistry: a useful tool in the diagnosis of
Camey-Stratakis and Camey triad gastrointestinal stromal tumors. Mod.Pathol., 2011, 24(1): 147-151.
76. Gabal M.A. Dimitri R.: Humoral immunosuppressant activity of aflatoxin in rabbits measured by response to
Mycobacterium bovis antigen enzyme-linked immunosorbent assay and serum protein. Mycoses. 1998; 41(7-8):
303-308.
77. Geldmacher H.,Taube C, Koeger C, Magnussen H., Kirsten D.K: Assessement of lymph node tuberculosis in northen
Germany. Chest, 2002; 121:1177-1182. of Skul. A Case report. Ind.J.Tuberc.1998; 45: 231.
78. Gheorghe L., Gheorge C: Tuberculoza peritoneal In: Peritonitele sub Red. Popescu I., Vasilescu C.Ed.
Celsius,pag.77-83.
79. Goel A., Seth A., KumarR.: Autocystectomy following extensive genitourinary tuberculosis: presentation and
management. Int.Urol.Nephrol. 2002; 34: 325-327.
80. Goel M.M., Budhwar P: Immunohistochemycal location of Mycobacterium tuberculosis complex antigen with antibody
to 38 kDa antigen versus Ziehl-Neelsen staining tissue granulomas of extrapulmonary tuberculosis .
Indian.J.Tuberc., 2007 54(1): 24-29
81. Goessens F.W., de Man P., Koeleman M.G.J. Luidendijk A., Endtz P.H., de Witt R., van Belcum A.: Comparison of the
COBAS-AMPLICOR MTB and BD-Probe Tec ET Assay for detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory
Specimen. J.Clin. Microbiol. 2005; 43(6): 2563-2566
82. Goh K.S., Fabre M., Huard R.C., Schimd S., Sola C, Rastogi N: Stydy of the gyrB gene polimorfism as a tool
differentiate amomg Mycobacterium tuberculosis complex subspecies further underlines older evolutionary age of
Mycobacterium canetti. Mol.Cell. Probe., 2006; 20: 182-190.
83. Guadelupe G-E., Carlos G-O., Guadelupe C-M., Cesar G-B.: utilidad de la clinica de la reaccion en cadena de la
polimerasa anidada para el diagnostico de tuberculosis extrapulmonare . Salud.Pub.Mex., 2009; 51: 240-245.
84. Guarner J., Zaki S.R.: Histopathology and immunohistochemstry in the diagnosis of Bioterorism Agents.
J.Histoch.Cytochem, 2006; 54(1): 3-11.
85. Guarner J., Bartlett J., Wun-Ju Shiehs , et al.: Histologic spectrum and Immunohistochemstry diagnosis of amebic
meningoencephalitis, Madem.Pathol.,2007; 20: 1230-1237.
86. Guarner J., Michelle M., Packard M., Nolte K.B., et al.: Use fullness of Immunohistochemstry in the diagnosis of
Streptococcus pneumoniae in Formalin fixed, Paraffin Emblended specimens compared with cuture and Gram
stained techniques. Am.J.Clin.Pathol., 2007; 127:612-618.
87. Gupta K.B, Sanjeev T, Ranjeev S, Rajuish K: Tuberculous of the Flat Bon of the Vault of Skull. Acase report
Ind.J.Tuberc. 1998; 45:231.
88. Gupta M,A., Espinal M.A, Raviglione M.C.: tuberculosis as a major global helth problem in the 21-th century: a WHO
perspective. Semin.Resp.Crit.Care Med.2004; 25: 245-253.
89. Haldar S., Sharma N., Gupta K.V., Tyagi S.J.: Efficient diagnosis of tuberculous meningitis by detection of M.
tuberculosis DNA in cerebrospinal fluid filtrates using PCR. J.Med.Microbiol., 2009; 58: 616-624.
90. Hanna J., Neill S.D, OBrien J.J.: Tests for antibodies in experimental bovine tuberculosis . Vet. Microbiol.1992; 31:
243-249.
91. Harboe M.T, Ottinger T, Wiker H.G, Rosenkyands I, Andersen P: Evidence for occurrence of ESAT-6 protein in
Mycobacterium tuberculosis and M. bovis and its absence in Mycobacterium bovis BCG. Infect.Immun., 1996; 64:
16-22.
92. Hein-Hall J., Yohne S.L.: Application of immunocemstry to soft tisue neoplasms. Arch.Pathol.Lab.Med., 2008;
132(3): 476-479.
93, Hernandez-Pando R, de la Luz Streber M., Orzoco H, et al.: The effect of androstenediol and dehidroepiandrosterone
on tuberculosis in Balb/c mice Q.J.Med. 1998; 95: 234-241.
94. Hines N.,Payeur J.B., Hoffman L.J.: Comparison of the recovery of Mycobacterium bovis isolates using BATEC MIGT
960 system , BACTEC 460 System and Mddlebrook 7H10 and 7H11 solid media. J.Vet.Diagn. Invest., 2006; 79: 33-
37.
95. Hiness II E.M., Frazier S.K.: Differentiation of Mycobacteria in the Basis of the Chemotype Profiles by Using Matrix
Solid- Phase Dispersion and Thin- Layer Chromatography. J.Clin.Microbiol. 1993; 31(3): 610-614.
96. Hink T., Thomas M., Roghuraman S., Ramalingam N, Erns M., Naw R, Koesters K, Gnanamuthan C, Joh G, Marshall B,
Lalvani A.: Congress ERS, Berlin, Oct.5-th 2008, S39, 1s
97. Hong S.H., Chai Ja-Y, LeeJ.W, Kim Na Ra, Choi J-Ah, Kang H.S: MRI imaging Assessement of the spine: Infection or
imitation? Radiograph. 2009;29:599-612.
98. Imaz M.S., et al.: Evaluation of the diagnostic value of measuring IgG, IgM and IgA to recombinann 16 kDa antigen
Mycobacterium tuberculosis in childhood tuberculosis Int. tuberc. Lung.Dis. 2001; 5(11): 1036-1043.
99. Jacobs T.W., Prioleau J.E., Stillman I.E., et al.: Loss of tumor marker immunostaining intensity on storeed paraffin
slides of breast carcinoma. Lab.J.Natl.Cancer.Inst., 1996; 88: 1054-1059
100. Jalb M.S: A stating point to a better detection of active and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals.
AIDS,2003; 17(12): 1859
101. Janette C.J., Olson L.J., Schwartz M.M., Silva F.G: Hospitals pathology of the kidney. 6-th, vol.2. Lippinscott Williams
and Wlkins eds. p.1010
102. Jiang Yi., Jolly P., Preko P., Wang J-S., Williams O.E., Fillips T.D.,Williams J.H.: Aflatoxin related Immune
Disfunction in Health an Human Immunodeficiency Virus Disease. Clin.Develop.Immunolog., 2008; 1-12

103. Jann-Yuan W., Chien-Hong C., Li-Na L. Asio-Leng H, I-Show J, Po-Ren H, Pan-Cyr Y., Kwen-Tay L: Diagnosis of
tuberculosis by Enzyme Linked Immunospot Assay for Interferon-gamma. Emmerging Inf.Dis., 2007; 13(3):
553-557.
 277
104.Jensen H.E., Cristiansen J.P, Bisgaard M., Nielsen O.L.: Immunocheistry for the diagnosis of the Aspergillosis in
Turkey poults. Avian. Pathol., 1997; 26(1): 5-18.
105. Jerome J.T.J., Varghese M.,Pai M.C, Tuschoko R: Tuberculosis of the foot . Podiatry Internet.J.2007; 2(2): 5
106. Johnson L.K., Liebana E., Nunez A., Spencer Y., Hadley-C.R., Jahnas K., Ward A., Bardow A., Delahay R: Histological
observations of bovine tuberculosis in wild red deer and wild boar. Vet.Rec., 2008; 163: 43-47.
107. Jung Na-Y, Jee W-H, Ha K-Y, Park Ch-K Byun J-Y: discrimination of the Tuberculous Spondilitis from Pyogenic
Spondilitis on MRI. AJR<,2004; 182:1405-1410
108. Kanishi K, Yamane H, Iguchi H., et al.: Study of tuberculosis in the field of otorhinolaryngology in the past 10
years.Acta Otolaryngol.Supp. 1998; 538: 244-249.
109. Kanlikama M., Mumbuc S., Baiazit Y, Sirikci A: Management strategy of Mycobacterial cervical lymphadenitis. J.
Laringol.Otol., 2000; 114: 274-278.
110. Keating L.A., Wheeler P.R., Mansoor H., et al.: The pyruvate requirement of some members of the Mycobacterium
complex is due to an inactive pyruvate kynase: implication for in vivo growth. Mol.Microbiol. 2005; 56: 163-167.
111. Khosravi A.D., Torahizadeh R., Abdulamir L. : investigation of the level of IgG, IgM, and IgA antibodies against A60
Antigen in tuberculosis Patients Refered to PHIS, AHVAZ, Iran. Pak,J.Med.Sci.2005; 26(4):465-469
112. Kirschner P;. Springer B., Vogel U., et al. : Genotypic identification of Mycobacteria by nucleic acid sequence
determination: report of a 2- year experience clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 1993: 31: 731-736.
113. Kong Y.A, Lee H.W, Hwang S.S, Um S-W,Shim Y-S, Yim J-J: Unfulness of Whole - blood interferon-gamma Assay and
interferon-gamma Enzyme-Linked Immunospot Assay In the Diagnosis of active pulmonary tuberculosis .
CHEST,2007; 132: 959-965.
114. Kubika T., Agzamova R.Wright A., Rakishev G., Gerds-R. S. Nieman S.: Mycobacterium bovis Isolates with
M,tuberculosis Caracteristics. Emerg.Inf.Dis.,2006; 12(5): 763-765.
115. Kudoh S, Kudoh T.: A simple technique for culturing tubercle bacilli. Bull.World.Health.Organ.,1974; 51: 71-72.
116. Kustova J.: Serological IgG,IgM and IgA diagnosis and prognosis of mycobacterial diseases in routine practice.
Eur.J.Med.res., 1996; 24(8): 393-403.
117. Kvaemer K.J, Kvestad E, Orth M: Surgey required to verify atypical mycobacterial infections. Int.J. Pediatric
Otorhinolaryngol. 2001;61; 121-128.
118. Laal S., Samanich K.M, Sonnenberg M.G: Surrogate marker of preclinical tuberculosis in huma immunodeficiency
virus infection: antibodies to 88 kDa secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis. J.Infect>Dis.,1997; 176: 133-
143.
119. Lakshmi V., Patil M.A., Subhadha K., Himabindu V.: Isolation of Mycobacteria by BACTEC 460 System from clinical
Specimen. Indian.J.Med.Microbiol., 2006; 24(2): 124-126
120. Lang E.W, Pits L.H: Interval disck space infection caused by Aspergillus fumigans . Eur.Spin.J. 1996;5: 207-209
121. Laurens A.H, van Pixteren P.R, Else M-E, Pollock J., Andersen P: diagnosis of Tuberculosis Based on Two specific
Antigens ESAT-6 and CFP-10 . Clin. Diagn.Lab.Immunol. 2000; 7(2): 155-160.
122. Leo S.C., Martin A., Mejia G.I., Palomino J.C., Robledo J. Telles M.A.S., Portales F.: Practical handbook for the
phenotypic and genotypic identification of Mycobacteria. Brugges Vanden Broelle, 2004; p.164.
123. Leo S.C., Bernardelli A.Cataldi A., et al: Multicentre evaluation of mycobacteria identification by PCR restriction
enzyme analysis in laboratorie From Latin America and Caribbean. J. Microbiol.Methods., 2005; 16: 193-1999
124. Laverdiere M. Poirier L., Weiss K., Beliveau C., Bedard L., Desnoyers D.: Comparative evaluation of the MB/bac T and
BACTEC 460 TB systems for the detection of mycobacteria from clinical relevance of higher recovery rates from
broth-based detection systems. Daign. Microbiol.Inf.Dis. 2000; 36:1-5.
125. Leburn L. Espinasse F., Poveda J.D., Vincent Levy- Frebault V: Evaluation of nonradioactive DNA probes for
identification of mycobacteria. J.Clin.Microbiol.. 1992; 30: 2476-2478.
126. Lee K., Tami T.A, Lalwani A.K, Schecter G: Contemporany management of cervical tuberculosis. Laryngoscope, 1992;
102: 60-64
127. Lee H., Park H.J, Cho S.N, Bai G.H., Kim S.J.: Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment for
identification of Mycobacterium species in cultured strains and clinical specimens. J.Clin.Microbiol. 2000; 38:
2966- 2971.
128. Liaschenko K.P., Esfandiari R.G.I, Vordermeier H., Palmer M., Waters W.: Rapid lateral Flow test for Bovine
Tuberculosis. 4-th Int.Vet.Vacc.Diagn.Conf., 2006, June 25-29,Oslo, Norwa,
129. Liaschenko K.P., Greenvald R., Esfandari J, Greenwald D, Nancy C.A, Gibson S, Didier P.J., Washington M.Szeczerba
P., Metzel S. Handt L., Pollock J.M., et al: Prima TB-STAT PAK Assay a novel , rapid, lateral-Flow test for
tuberculosis in Nonhuman Primates. Clin.Vacc.Immunol.,2007; 14(9): 1158-1164.
130. Losi M., et al.: Use of a T-cell interferon-gamma release assay for the diagnosis of tuberculosis pleurisy. Eur.Resp.J.,
2007;30: 1173-1179.
131. Madeb R., Marshall J, Nativ O: Epididynmal tuberculosis case report an review of literature. Urology, 2005; 64(4):798.
132. Magalhaes V.D., de Melo Azevedo Fda P., Pastemak J., Valle Martino M.D: reability of hsp 65-RFLP analysis for
detection of Mycobacterium species in cultured strains and clinical specimen. J. Microbiol.Methods., 2002; 49:
295-300.
133. Mamayown S. Stephen E, Weis E, Klucar P, Lalvani A. Moon P.K, Pogoda J.M, Bames PF: Enzyme-Linked
Immunospot and Tuberculin Skin Testing to detect latent tuberculosis Infection. Am.J.Resp.Crit.care Med. 2005;
142: 1161-1168
134. Manolidis S., Frenkiel S., Yoaskovitch A, Blac M: Mycobacterial infectious of the head and neck. Otolaringol.Head,Nek
Surg. 1993; 109:427-433
135. Mazzareli G., Rind L., Piccoli P., Scarparo C. gazarelli C., Toroli E: Evaluation of the BD Probe Tec ET system for
direct detection in pulmonary and extrapulmonary saples: a multicenter study. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 1779-
1782.
136. Maugein J., Fourche J., Vacher S., Grimond C., Bebear C.: Evaluation of the BD Probe Tec ET- DTB assay for direct
detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from clinical samples. Diagn.Microbiol.infect.Dis., 2002; 44:
151-155.
137. Mayousi B.M., Volmink J.A., Commerford P.J.: Pericard disease:an evidence-based approach to diagnosis and
treatment In: Yusuf S, Cairns J.A, Comm A.J., Fallen B.J. Eds. Evidence-based cardiology, 2-end Ed.London, BJM
Books, 2003,735-748
138. Mayousi B.M, Burgess L.B, Doubell A.F: Tuberculous pericarditis. Circulation, 2005; 112: 3608-3616.
139. Mbulo G.M., Kambashi B.S., Kinkese J., et al.: Comparison of two Bacteriophage test and nucleic acid amplification
for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in Sub-Saharian Africa. Int.J.Tuberc.Lung.Dis., 2004; 8: 1342-1347.
 278
140. McDewitt P.J., Moyer M.T., Goldman J.N, Matew A: Extrapulmonary tuberculosis Presentig Potts Disease With
Associated with Paraesophagial Fistula,Hospital Physician, 2008 Sept.,36-40
141. McNemey: Phage replication technology for diagnosis and susceptibility testing. In: Mycobacterium tuberculosis
protocols. Method in Molecular Med., Parish T., Stocker N.G., (editors), toowa, NY, Humana Press., 2001; pp. 145-
154.
142. Mejia G.I., Castrillon L., Trujillo H., Robledo J.A.:Microcolony detection in 7H11 thin layer culture is an alternative for
rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Int.J.Tuberc.Lung.Dis., 1999; 3: 138-142.
143. Mejia G.I., Guzman A., Agudelo C.A. Trujillo H. Robledo J.: Cinco anos de experiencia con el agar de capa delgada
para el diagnostico rapido de tuberculosis. Biomedica, 2004; 24(supp.1): 52-59.
144. Mendoza M.T., Reyes L.F., Pascual M., Torres-Tan T.: Culture isolation of mycobacterium tuberculosis Using
Radiometric Bactec System compared with the conventional Lowenstein-Jensen. Phil.J.Microbiol.Infect.Dis. 1993;
22(1): 17-22.
145. Menghel M., hebel K., Kreipe H., et al.: Standardised on slide control for Quality assurance in the
Immunohistochemical assessement of therapeutic target molecules in breast cancer. Breast J., 2005; 11: 34-40
146. Michel A.L. Bengis R.G, Keet D.F., Hofmeyer M., De Klerk L., Corss P.C., Jolles A.E., Cooper D., Whyte I.J., Buss
P.,Godfroid J.: Wlidlife tuberculosis in South Africa Conservation Area: implication and challenges. Vet. Microbiol.,
2006; 12: 91-1000.
147. Miciora R: Surse de eroare in diagnosticul alergic al tuberculozei bovine. Rev. Rom.Med.Vet. 1996; 6(1): 39-46)
148. Mohamad S.,Solliman , Klaus-Dietter L., Hazid Hashmat: Tuberculosis of genito-urinary system. eMedicine ,
Speciality, Urolog.De., 2007.
149. Monagham M.L, Doherty M.L, Collins J.D, Kazda J.F, Quinn J.P: The tuberculin test. Vet. Microbiol., 1994; 40: 111-
124.
150. Moore D.A., Evans C.A., Gillman R.H., et al.: Microscopic observation drug-susceptibility assay for diagnosis of TB,
N.Engl.J. Med. 2006; 355: 1539-1550
151. Muradanayagam A.: Multifocal skeletal tuberculosis;A report of the three cases. Iowa, Orhop.2006; 26: 151-153
152. Murray S.J., Barret A., Magee J,G., Freeman R: Optimization acid fast smears for the direct detection of mycobacteria
in clinical samples J.Clin.Pathol.,2003; 56: 613-615
153. Mustafa T., Wiker H.G., Mfinanga S.G., Mrkve O., Sviland L.: Immunohistichemystry using Mycobacterium
tuberculosis complex specific antibody for improved diagnosis of tuberculosis lymphadenitis. Mod.Pathol.,
2006;19(12): 1606-1614.
154. Muzaffar R., Batool S., Aziz F., Naqvi A., Rizvi A.: Evaluation of the FAST Plaque TB assay for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Int.J.Tuberc.Lung.Dis., 2002; 6: 635-640
155. Nicoll P.M, Davies Mary-Ann, Wood K, Hoterill M, Warkman L, Howkridge A, Eley B, Wilkinson K, Wilkinson J.R,
Hanekorn A.W, Hussey G.B.: Comparison of T-SPOT-TB Assay and Tuberculin Skin Test for Tuberculosis in
Community Seting. Pediatrics, JAAP, 2009; 123: 38-43
156. Nogales C., bernal S., Chavez M.: Comparison of the Mb/BAC T and BACTEC 460 TB systems. J.Clin. Microbiol.
1999; 37: 3432.
157. Norby B, Barther C.P, Granger M.I, Bruning-Fan S.C. Wipple L.D. Payeur B: The sensitivity of gross necropsy, caudal
fold and Comparative cervical Tests for diagnosis of bovine tuberculosis. J.Vet. Diagn.Invest.2004; 16: 126-131
158. O.I.E.: Manual of Diagnostic tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Cap.2.4.7.: Bovine tuberculosis. Ed., 2009.
159. Omar V.S., Kaba K., Ismail A.N, Jubert F.H., Hoosen A.A.: Evaluation of the Immunohistochemystry on Pleural Fluid
for diagnosis of Pleural Tuberculosis. Curr.Res. Tuberc., 2011; 3(1): 20-24.
160. ORourke K.I., Baszler V.T., Besser E.T., Miller M.J.., et al.: Preclinical diagnosis of scrapie by Immunohistochemstry
of third Eyelid Lymphoid Tissu J.Clin.Microbiol., 2000, 38(9): 3254-3259.
161. O Rourke K.I., Dougyne Z. Trusce T.C. Huijan Y., et al: Sparse PrPsc accumulation in the placentas of goats with
naturally acquired scrapie . BMC.Vet.Res., 2011;7(7):
162. O Sullivan C.E., Miller D.R., Schneider R.S. Roberts G.D: Evaluation Gen Probe Amplified Mycobacterium
tuberculosis Direct test by using respiratory and non respiratory specimens in a tertiary care centre laboratory.
J.Clin.Microbiol. 2002; 40: 1723-1727
163. Ozkutuka K.S., Ozden S., Esen N.: Evaluation of COBAS-AMPLICOR MTB test for detect Mycobacterium
tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary specimens. New.Microbiol., 2006;29(4): 269-273
164. Pai M, Menzies D: THE NEW igra and old TST , making good use of desagrement . Am. J.Res.Crit.Care Med. 2006;
175: 618-627.
165. Pai M, Mezies D., Comstak G: Meta-analisys. New tests for diagnosis of latent tuberculosis infection: areas and
recomandation for research. Am.Intern.Med. 2007; 146: 340-350
166. Paick J., Kim S.H, Kim S.W.: ejaculatory duct obstruction in infertile men. B.J.U.Int. 2000; 85(6): 720-724.
167. Parsons L.M., Brosch R., Cole S.T., Somoscovi A., et al.: Rapid and Simple approach for Identification of
Mycobacterium tuberculosis Complex by PCR-based genomic detection Analysis. J.Clin.Microbiol. 2002; 40(7):
2339-2345.
168. Perera J., Arachichi D.M.: The optimum relative centrifugal force and centrifugation time for improved sensitivity
of smear and culture for detection of Mycobacterium tuberculosis from sputum. Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 1999;
93: 405-409.
169. Perez-Proao F., Ortiz-benitez W, Erazo-Celi M, Garido-Ron L, Capistros-Benitez R., Portales F, Rigouts L, Linden A:
Comparative Intradermal Tuberculin Test in dairy cattle in North of Ecuador and Risk Factor Associated with
Bovine Tuberculosis. Am.J.Trop.Med.Hyg.,2009; 81(6): 1103-1109.
170. Permisioni C., Scarparo C., Callegaro A., et al.:Comparison of MB/Bac T ALERT 3D System with radiometric
BACTEC sustem and Lowenstein- Jensen medium for recovery and identification of mycobacteria from clinical
specimen; a multicenter study.J.Clin.Microbiol.2001; 39: 65.
171. Persimoni C., Scarparo C.: Infectious Associated with Nontuberculous Mycobacteria in immunocompetent persons.
Emerg.Inf.Dis. 2009; 15(9): 1351-1358.
172. Permisioni C., Scarparo C: Relevance of commercial amplification methods for direct for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis Complex in clinical samples. J.Clin.Microbiol. 2003; 41: 5355 53 65.
173. Pfyfer G.E., Welscher H.M., Kissling P., et al., Comparison of the Mycobacteria Growth Indicator Tub (MIGT) with
radiometric and solid culture for recovery of acid-fast bacilli. J.Clin. Microbiol. 1997; 35: 364-368.
174. Piana F, Codecasa R.L, Baldan R, Mott P, Ferrarese M, Cirillo M.D.: Use of T-SPOT-TB in latent tuberculosis infection
diagnosis in general and immunosupressed. New Microbiologica, 2007; 30: 286-290.

279
175. Popescu S. Radulescu R.A., Petriceanu G. Alexandru V: Some feature of immune mediated cellular response in
naturally infected cattle with Mycobacterium bovis and Echinococcus spp. IX-th EMOP, Valencia, Spain 18-23
July,p.333.
176. Porter M.P, Eubank W.B, Krieger J.N: Genitourinary Tuberculosis : a focused update for practicing
urologist.Contemp.Urol.2001; 13: 34-48.
177. Prasanta R.M., Ashok K.J.: Tuberculosis lymphadenitis. JAPI., 2009; 57: 585-590.
178. Prasenjit D., Arvid A. Siddhartha D.G. : Incidence, ethiopathogenesis and pathological aspects of genitourinary
tuberculosis in India: A jurney revisied. Ind.J.Urol. 2008; 24(3): 356-361.
179. Qin Xue-J, Shi-Huan Z, Liang Qui-L, Huang Lu-Y, Yang Hoi-Bo: C D4+ CD25 regulatory T Lymphocytes in
tuberculosis pleural effusion. Chinese.Med.J.,2008; 127(7): 581-586.
180. Rant A.A, Nagar A.M., Muzumdar D. Chavea A. J, Narlawar R.S, Fattepurkar S, Bhatgade V.L.: Imaging Features of
the calvarial Tuberculosis: a study of 42 cases. ANJR.AM.J,Neuroradial., 2004,25: 409- 414.
181. Rhodes G.S, Widen-Gavier D, Buddle M.B, Whelam O.A., Singh M, Hewinson G., Vordermeier M.H.: Antigen
specificity in Experimental Bovine Tuberculosis Infect.Immun.2000; 68(5): 2573-2578
182.. Richt A.J., Kunke A.R. Alt D, Nicolson M.E. et al.: Identification and caraterization of two Bovine Spongiform
Encephalopathie cases diagnosed in United State.J.Vet.,Diagn.Invest., 2007;19: 2142-2134
183.Rimek D., Tyaji S., Kappe R: Performance of an IS6110 Based PCR Assay and the COBAS Amplicor MTB-PCR
system for detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA in Human Lymph Node Samples.
J.Clin.Microbiol. 2002; 40(8): 3089-3092.
184. Rimniker J., Stefanie Kramme, Pamela L. Small:Host range of 14 Mycobacteriophages in Mycobacterium
ulcerans and seven other mycobacteria including Mycobacterium tuberculosis application for identification and
susceptibility testing. I.Med.Microbiol. 2006 55: 37-22
185.Robledo J.A., Mejia G.I., Morcillo N., et al.: Evaluation of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis : a Latin
American Multicentre study. Int.J.Tuberc.Lung.Dis., 2006; 10: 613-619.
186.Rodriguez M.M, Boscaridin B.S, Vasconcelos R.J, Hiyane I.M, Salay G, Soares S.I.: Importance of CD8T Cell-mediated
Immun responses during intracellulare parasites inf ection and its implication for development of effective
vaccines. Annals.Brasill.Acad.Sci.,2003; 75(4): 443-468.
187. Rohner P., NinetB., Metral C., Elmer S., Auckenthaler R.: Evaluation of MB/Bac T system and comparison to the
BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens, J.Clin.Microbiol.1997;
35: 3127-3131.
188.Roth A., Fisher M., Hamid ME., Michalke S., Ludwig W., Mauch H.: Differentiation of phylogenetically related slowly
growing mycobacteria based on 16S 23S r RNA gene internal transcribed spacer sequences. J.Clin.Microbiol.
1998; 36: 139-147.
189. Royoke T., Kakukawa H, Kunichika H, Nishimura Y, Sakai H, Minami Y, Fujii, T, Natsuzaki M.: subacute tuberculosis
matpericarditis with Fibroblastic Constriction Diagnosed upon Pericardiectomu Jpn.Clin.J., 2000; 64: 380-392.
190.Sable S.B, Kumar R, Karla M., Verma I, Khuller G.K, Dobos L, Belisle J.T: Peripheral Blood and Pheriferal Fluid
Mononuclear Cell Responses to Low-Molecular Mass Secretory Polypeptids of Mycobacterium tuberculosis in
Human Models of Immunity to tuberculosis . Infect. Immune. 2005; 73: 3547-3558.
191.Salvador R., Vilana R., Bargallo X., Araque X, Nicolau C: Tuberculous Epididymo-orchitis after intravesical BCG
therapy superficial blader 0lcarcinoma: sonografic findings. J.Ultrasound.Med., 2007; 26(5): 671-674.
192. Samanich M.K., Keen A.M, Vissa D.V, Harder D.J, Spencer S.J, Belisle T.J, Pazner-Z. S, Laal S: Serodiagnostic of
Potential of Culture Filtrate Antigens of Mycobacterium tuberculosis. Clin.Diagn.Lab.Immunol., 2000; 7: 662-
668.
193.Samarineanu M, Miciora R, Popovici V: Rezultatele unui test de immunostimulare a limfocitelor (TISL) aplicat in
diagnosticul tuberculozei la bovine.Rev.Rom.Med. Vet.,1995;5: 21-30
194. Samarineanu M: Un test de imunostimulare a limfocitelor cu lichid hidatic (TISL-LHd) pentru diagnosticul
echinococozei (hidatidozei) rumegatoarelor. Rev.Rom.Med.Vet.,1998; 4: 61-66
195. Sargista Sauleda J., Permanyer Miralda G, Soler-Soler J: Tuberculous pericarditis: ten-year experience with a
prospective protocol for diagnosis and treatment .J.Am.Coll.Cardiol. 1988; 11:724-728
196. Scarparo C., Piccoli P., Rigon A., Ruggiero G., Ricordi P, Permisioni C.: Evaluation of the BACTEC-MIGT 960 in
comparison with BACTEC 460-TB for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens.
Dagn.Microbiol. Infect.Dis., 2002; 44: 157-161.
197.Sato-Kaubara Y., Neves J.I., Fregnani J.H. Sallum R.A., et al.: Evaluation of gene amplification and protein expression
of HER-2/ neu in esophageal squamous cell carcinoma using Fluorescence (FISH) in situ Hibridation and
immunohistochmistry. B.M.C. Cancr, 2009: 96

198.Schiler I, Oesch B, Nordermeier M.H., Palmer M.V., Harris N.B, Orloski A.K, Budlle M.B, Thacke C.T: Bovine
and Eradication. Transbourdary and Emerging Dis..,2010;57(4): 205-220
199 Schincsky M.F., Mc Neill M.M., Whintney A.M., et al: Mycobacterium septicum sp.nov. a new rapidly growing species
associated with catheter-related bacteria. Inst.J.Syst.Evol.Microbiol. 2000; 50: 576-581.
200.. Scott C.P., Dos Anjos Filho L., De Queiroz Mello F.C., et al.: Comparison of C(18)p carboxypropylbetaine and
standard N- acetil-L-Cysteine-NaOH processing of respiratory specimens for increasing tuberculosis smear
sensitivity in Brazil. , J.Clin.Microbiol.,2002; 40: 3219-3222, .
201. Selvakumar N., Sekar M.G, Ilampuranan K.J, Ponnuraja C., Narayanan P.R: Increased detection by restaining of
acid-fast bacilli in sputum samples transported in cetylpyrymidinium-chloride solution. Int.J.Tuberc. Lung Dis.
2005 9: 195-199.
202. Selvakumar N., Gomathi S.M., Kumar V., Bhashkar Rao D.V., Rahman F., Narayanan P.R.: Sensitivity of Ziehl-
Neelsen method for centrifuged deposit smears of sputum samples transported in cetyl-pyrimidin chloride .
Indian.J.Med.Res., 2006;124: 439-442.
203.Selvaraj P., Uma H, Reetha A.M., Xavier T, Pranbhokas R, Narayanan P.R.: Influence 0f HLA-DR2 phenotype on
human immunity and Lymphocyte response to Mycobacterium tuberculosis culture filtrate antigens in pulmonary
tuberculosis . Indian. J.Med.Res. 1998; 107: 208-217
204. Shancar B.P.: Advances in diagnosiof rabies. Vet.World, 2009, 2(2): 74-78.
204. Shanon A. Martinson, Paul E. Hanna, Basil O. Ikede, et al.: Comparison of the Bacterial culture. Histopathology and
Immunochestry for Diagnosis of the Johnes Disease in culled Dairy Cows. J.Vet. Diagn.Inv., 2008; 20(1): 51-57.
205.. Sharma S.K, Mohan A.: Extrapulmonary tuberculosis. Indian J.Med.Res. 2004; 120:316-353.
206 Sharma S., Juneya M, Garga A: Primary tubercular ostemyelitis of sternum.Indian. Pediatr.., 2005;72: 709-7101
280
207. Singh K.K, Dong Y, Belisle T.J, Herder J, Arora V.K, Laal S.: Antigens of Mycobacterium tuberculosis recognized by
Antibodies during incipient, subclinical tuberculosis .Clin Daign.Lab.Immunol., 2005; 12(2): 354-358.
208. Singh A.P: Tuberculous arthritis. Pathology and Clinnical Aspects. Bone and Spine 2008.

209. Singh A., Chatrjee P., Pai M.C, Chako T: Tuberculous osteomielitisof the scapula masquerading as metastasis. J.R
adiolog.Case Rep.,2009; 3(1): 27-31
210. Sioni H., Musser J.M.: Molecular diagnosis of Mycobacteria . Clin.Chem., 2001;47(5): 809-814
211. Sisodia S.M., Binayke R., Jindani N.: Clinicopathological Study of tuberculous Lesions of small and large Bowel
(excluding appendix) Bombay Hosp.J., 2011; 53(1): 11-15.
212.Smithwick R.W, Stratigos C.B, David H.L.: Use of cetylpyrymidin chloride and sodium chloride for decontamination
of sputum specimens that are transported to laboratory for the izolationof Mycobacterium tuberculosis
J.Clin.Microbiol., 1975; 1: 411-413.
213. Spieghel D.A, Singh G.K., Banskota K: Tuberculosis of the musculoskeletal. Tech.pediatrc. 2005; 20(2):167-168.
214.. Steaingart K.R, Vivienne Ng .V. Henry M. et al.: Sputum processing methods to improve sensitivity of semar
microscopy for tuberculosis: a systematic review. Lancet Infect Dis. 2006; 6: 664-674.
215.Steingart K.R., Ng. V., Henry M., et al.: Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis :
a systematic review. Lancet.Inf.Dis.,2006; 6(9): 570-581.
216.Stoicescu I.P., Crian M., Macri A., Moian D., Murgoci G., et al: Ghidul pentru diagnosticul i tratamentul tuberculozei
la copii. INCDS, Publ.H Press, Bucureti, 2006, p.25-32.
217. Sumi S., Radhakrishan V.V.: Evaluation of immunohistochemystry with a panel of antibodies against recombinant
mycobacterial antigens for diagnosis of tuberculous lymphadenitis. Int.J.Med.and Med. Sci., 2009; 1(5): 215-219.
218. Surujballi O.,Wallace Lutze C, Turcotte C, Savic M., Stevenson D, Romanowska A, Surujballi- Berlie G, Taugorra E:
Sensitive diagnosis of bovine tuberculosis in a farmed cervid herd use MPB70 proteine fluorescence polarization
assay. Can.J.Vet. Res., 2009; 73(3): 161-166.
219.. Tahis Larissa, Castanheira L., Ferrari F.H., Luvizoto M.C.R., Cardoso Tereza C: Immunochemistry assay to Dtect
Turkey Corona Virus (TcoV) from experimentally ifected Poults. Am.J.Immunol., 2007, 3(2): 31-34
220.Takiff H., Heifets L..: In search of rapid diagnosis and drug-resistance detection tools: is the FAST-Plaque-TB the
answer? Int.J.Tuberc.Dis.,2002;6: 56-561.
221Taracad S.R.: Tuberculous meningitis. eMedicine, 4, Dec.2008
222.Tarcoveanu E. Filip V, Moldovanu R., Dimofte G, Lupascu C, Vlad N, Vasilescu A, Epure Oana: Tuberculoza
abdominal, o realitate. Chirurgia, 2000; 102(3): 303-308.
223. Terrence J., Jerome J, Varghese M. Aran B: Tuberculosis of toot: A case report .Internet. Pediatry J. 2007,2(2): 5.
224,Thacher Eleen R.: Diagnosis of Mycoplasma hyopneumonie. J.Swinw. Health Prod., 2004; 12(5): 252-254.
225. Torkko P., Sumalainen S., Liavainen E., et al., : Mycobacterium palustre sp.nov. a potentially pathogenic slow-growing
mycobacterium isolated from veterinary and clinical specimens and finish stream water .
Int.J.Syst.Evol.Microbiology., 2002; 52: 1519-1525.
226Tortoli E.Simonetti M.T., Lacchini C., Penati V. Permisioni C., Morbiducci V.: Evaluation of a commercial DNA probe
assay for identification of Mycobacterium kansasii . Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 1994; 13: 264- 267.
227. Tortoli E., Simonetti M.T., Lavinia F.: Evaluation of reformulated chemiluminiscent DNA Probe (AccuProbe) for
culture identification of Mycobacterium kansasii. J.Clin.Microbiol. 1996; 34: 2838- 2840.
228. Tortoli E., Cichero P, Permisioni S. Simonet M.T., Gesu G., Nista D: Use of BACTEC-MIGT for recovery of
Mycobacteria from clinical specimens : multi center study. J.Clin.Microbiol., 1999; 37: 3578- 3582.
229. Tortoli E., Mariottini A., Mazzarelli G.: Evaluation of INNO-LiPA Mycobacteria v2 : improved reverse hybridization
multiple DNA-probe assay for mycobacterial identification J.Clin.Microbiol., 2003; 41: 4418-4420.
230. Tortoli E., Chionura L., Fabbro L., et al.: Infectious due to the newly described species Mycobacterium
parascrofulaceum. J.Clin.Microbiol. 2005; 43: 4286-4287.
231. Tortoli E.: The new mycobacteria an update. FEMS Immunol.Med.Microbiol., 2006; 48: 159-178.
232. Tortoli E., Palomino J.C.: New diagnostic methods. In: Tuberculosis , 2007, Leao, Palomino and Ritacco eds.,
2007, 44- 441-486.Bernard Sebastian an Patricia Kamp (BernardKamp.com).
233.. Turenne C.Y., Cook V.J, Burdz T.V., et al.: Mycobacterium sakachewanense sp.nov., a novel slowly growing
scotocromogenic species from human clinical isolates related to Mycobacterium interjectum and AccuProbe
positive for ycobacterium avium complex.Int. J.Syst.Evol.Microbiol., 2004; 54: 659-667.
234.Turner P.C, Moore S.E, Hall A.J., Prentice A. M, Wild C.P.: Modification of immune Function through Exposure to
Dietary Aflatoxin in Gambian Chldren. E.H.P, 2003; 111(2): 217-220.
235.Van Keulen M.J.L., Vromans W.E.M., Dolstro H.C., Bossers A., van Zijderveld G.F.: Pathogenesis of Bovine
Spongiform Encephalopathiy in sheep. Arch. Virol.,2008; 153(3): 445-453.
236.Vincent V., Brown-Elliot B., Jost K.C., Wallace R.J.: mycobacterium Phenotypic and genotypic identification.pp. 560-
584. In: Manual of Clnical Microbiology, 8-th edition Murray P.R., JoBaron E., Jorgensen J.H., Pfaller M.A.,
Yolken R.H. editors. ASM Press, Washington, DC, 2003.
237. Von Reyn F., Rovn P, Horsburg C.R, Alexander L.N, Andersen P.: Cellular Immune responses to ESAT-6 discriminate
between patient with pulmonary disease Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn. Lab, Immunol. 1999; 6: 606-
609
238. Vordermeier H.M, Cockle P.J., Whelan A, Rhodes S, Hewinson R.G: Towards the development of diagnosis assay to
discriminate between Mycobacterium bovis infection and BCG vaccination in cattle. Clin. Inf.Dis. 2000; 30: S291-
S-298.
239. Vordermeier H.M, Whelan A., Cockle P.J., Farrant L, Palmer N, Hewinson R.G: use Synthetic peptides derived from
Antigen ESAT-6 and CFP-10 for differential diagnosis of bovine tuberculosis in cattle. Clin.Diagn.Immunol. 2001;
8: 571-578.
240.. Vordermeir H.M., Chambers A.M, Cockle P.J., Whelan J, Simmon J, Hewinson G.R: Correlation of ESAT-6 specific
gamma-interferon production with Pathology in cattle following Mycobacterium bovis BCG vaccination against
experimentas l bovine tuberculosis. Infect.Immun., 2002; 70(6): 3026-3032.
241. Vuitron A.D, Gettstein B: Echinococcus multilocurais and its intermediate Host: A model of Parasite Host Interplay,
J.Biol.Biotechnol., 2010 , March,p. 1-4
242.. Wang X.G., Song H.L., Tay L.: Preliminary study on rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex
isolate by BD Probe Tec ET system. J.Med.Microbiol. 2004; 53: 57- 59.
243.Wedlock N.D, Frank E, Aldwell D., Collins M, Geoffrey W, de Lisle Theresa Wilson, Buddle B.M.: Immune responses
Induced in cattle by virulent and Attenued Mycobacterium bovis strains; Correlation of Delayed-Hipersensitivity
with Ability of Strains to grow in Macrophages.Infect.Immun.,1999; 67(5): 2172- 2177.
281
244.Williams Boyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L.: Comparison of the BACTEC MIGT 960 and ESP culture System
II for growth and detection of mycobacteria J.Clin.Microbiol. 2000; 38: 4167-4170.
245Welch D.F., Gunswamy A.P., Sidess S.J., Shaw C.H., Gilchrist M.J.R.: Timely culture for mycobacteria wich utilizes a
micro-colny method. J.Clin.Microbiol. 1993;31: 2178-2184.
246. Welding K., Rosenkrand I, Okkel L.M, Doherty T.M, Anderson P.: Assessing serodiagnostic Potential of 35
Mycobacterium tuberculosis proteins and identification of four novel serological antigens J.Clin.Microbiol.,2005;
43: 37-45.
247.. Whelam O.A, Hope C.J, Howard J.C. Cliford D, Hewinson G.R, Vordermeir M.H.: Mycobacterial antigens by a
Syntetic Bacterial Lipopeptide. Inf.Immun., 2003; 71(11): 6420-6425.
248. Widdison S., Watson M., Coffey T.J.: Correlation between lymph node pathology and chemokine expression during
bovine tuberculosis. Tuberculosis (Edimb), 2009; 89(6): 417-422.
249. Wilkinson R.J, Haslov K, ., Rappouli R., et al.: Evaluation of the 38 kDa antigen of Mycobacterium tuberculosis as a
potential immunodiagnostic reagent. J.Clin.Microbiol., 1997; 35: 553-557
250. Wood P.R, Corner L.A, Rothel J.S, Ripper J.S., Fifis T, Mc Cormick B.S, Francis B, Melville L, Small K, Cocs J.C: A
field evaluation of Serological and cellular tests for bovine tuberculosis. Bet.Microbiol., 1992,31: 71-79).
251. Zanella G., Duvauchelle A., Hars J., Moutu F., Boschirolli M.L., Durand B.: Patern of lesions of bovine tuberculosis in
wild red deer and wild boar. Vet.Rec., 2008; 163: 43-47
252. Yan J. Huang A., Tsai S., Ko W., .Jin Y., Wu J.: Comparison of the MB/Bac T and BACTEC-MIGT 960 system for
recovery of mycobacteria from clinical specimens. Diagn.Microbiol,Infect.Dis. 2000; 37: 25-30
253. Yeh I.T. Mies C.: Aplication of immunochemistry to breast lesion. Arch.Pathol.Lab.Med., 2008; 132(3): 349-358

282
 CAPITOLUL V

CLASIFICAREA EFECTIVELOR DE BOVINE SUB RAPORTUL

TUBERCULOZEI

n conformitate cu Ordinul 236/12/2002 al MPAM i n concordan cu

Directiva 64/432/CEE Anexa A, efectivele de bovine din Romnia se clasific sub
raportul tuberculozei astfel:

5.1. Efectiv de bovine oficial indemn de tuberculoz, dac:

a). toate bovinele nu prezint nici un semn clinic de tuberculoz;

b). toate bovinele n vrst de peste 6 sptmni au reacinat negativ la
dou teste tuberculonice consecutive, efectuate la interval de 6 luni, sau cnd
efectivul respectiv a fost constituit din animale originare din exploataii oficial
indemne de tuberculoz, situaie n care ste suficient numai un test tuberculinic,
efectuat naite cu 60 de zile de constituirea efectivului;
c). n efectiv nu a fost introdus nici un animal n vrst de peste 6
sptmni din exloataii custatut epidemiologic incert sau n care a fost constatat
tuberculoza.

5.2. Satatutul de efectiv oficial indemn de tuberculoz se menine,

dac:

a). sunt ndeplinite n continuare toate condiiile specificate la pct.4.1.

lit.a,b,c i n plus, efectivul rezpectiv se afl sub control veterinar oficial i n cursul
a cel puin 3 ani n urm nu s-a diagnosticat nici un caz de tuberculoz;
b). toate animalele intrate n exploataie, provin din efective oficial indemne
de tuberculoz;
c). toate animalele n vrst de peste 6 sptmni din exploataie au fost
supuse testelor intradermotuberculinice de rutin cu rezultate negative;
d). naintea introducerii n efectiv, toate nimalele achiziionate au fost
supuse unei perioade de carantin profilactic cu o durat de cel puin 45 de zile i
n acest timp au fost testate tuberculinic, cu rezultate negative;
e) toate bovinele tiate sau moarte au fost examinate pentru depistarea
leziunilor de tuberculoz i orice prob cu leziuni suspecte a fost supus examenelor
pentru precizarea diagosticului, cu rezultate negative.

5.3. Suspendarea statutului de efectiv oficial indemn de

tuberculoz

Statutul de efectiv oficial indemn de tuberculoz se suspend i efectivul

respectiv se consider suspect de infecie tuberculoas, dac:
a). condiiile menionate la pct. 4.1. i pct. 4.2. lit.a,b,c,d,e nu mai sunt
ndeplinite, sau:
b). unul sau mai multe animale sunt ncadrate cu reacii tuberculinice
pozitive sau dubioase , sau este suspectat cel puin un caz de tuberculoz la
examinarea post mortem;
c). procentul de animale reagente la testul tuberculinic depete 0,1 0,2
% din totalul animalelor controlate.
283
 Statutul de efectiv suspect de tuberculoz se menine pn cnd sunt
finalizate toate examenele de laborator efectuate pe probe de la anmalele
abatorizate, suspecte de tuberculoz.
Statutul de efectiv suspect de tuberculoz se ridic, dac:
- rezultatele examenelor de laborator au fost negative la toate ani-malele
reagente, abatorizate, i:
- rezultatele testrilor tuberculinice efectuate la cel puin 42 de zile de la
eliminarea animalelor reagente , la toate bovinele n vrst de peste 6 sptmni, au
fost negative sau reactivitatea de 0,1 - 0,2% din totalul animalelor controlate, s-a
dovedit a fi nespecific.

5.4. Efectiv de bovine declarat oficial cu tuberculoz.

Un efectiv de bovine va fi declarat ocicial cu tuberculoz, dac:

a). n efectivul respectiv s-a confirmat tuberculoza la unul sau la mai multe
animale, prin examene de laborator;
b). n efectivul respectiv au fost introduse animale din exploataii cu
tuberculoz i la acestea s-a diagnosticat boala;
c). s-a constatat reactivitate specific infeciei tuberculoase mai crescut de
0,2 % dintre animalele controlate.
Statututl de efectiv declarat oficial cu tuberculoz poate fi ridicat i
focarul de boal stins, dac:
- toate animalele reagente n urma tuberculinrilor au fost eliminate din
efectiv n condiiile prevzute de lege:
- n cursul ultimelor 12 luni, la nici un animal dintre cele moarte ori
abatorizate nu au mai fost constatate leziuni caracteristice i infecia nu a fost
confirmat prin examene de laborator;
- au fost aplicate msurile specifice de decontaminare i protecia mediului
i eficiena decontaminrii a fost verificat prin teste de laborator cu rezultate
negative.
n plus, pentru efective n care s-a aplicat programul de eradicare prin
depopulare total restriciile veterinare se ridic i focarul de boal se declar
stins, dac:
- ultimul animal a fost eliminat din efectiv, i:
- au fost efectuate toate aciunile de curenie mecanic, deconta-minare i
protecia mediului i eficiena acestora a fost verificat prin teste de laborator
specifice, cu rezultate negative.

284
 CAPITOLUL VI

PREVENIREA, PROFILAXIA I COMBATEREA

TUBERCULOZEI

Cu multe secole n urm problema prevenirii, profilaxiei i combaterii

tuberculozei la animale i oameni a trezit interesul a numeroi oameni de tiin i
eforturile susinute i concertate de a gsi mijloace adecvate de prevenirea
rspndirii i combaterii bolii au fost n parte ncununate de suc-ces, n special n
rile cu potenial economic dezvoltat. n rile subdezvoltate i n cele n curs de
dezvoltare tuberculoza continu s se menin la cote alrmante, cu toate c unele
msuri profilactice au fost aplicate. Factorii demografici, socio-economici, nivelul
de via precar n rndul populaiilor umane favorizeaz substanial ntreinerea
rezervoarelor naturale active i circulaia intens a micobacteriilor patogene pe arii
extinse n rndul populaiilor din aceste zone ale lumii. Aplicarea msurilor radicale
n efectivele de animale infectate cu bacilii tuberculozei au condus la scderea
semnificativ a incidenei cazurilor dar tuberculoza nc mai evolueaz sporadic sau
endemic n altele.
Costurile pentru eradicarea bolii se ridic la sume uriae, nsumnd zeci sau
sute de milioane de dolari.
De aceea, Organizaia Mondial a Sntii (OMS) mpreun cu alte
organisme internaionale: Oficiul Internaional de Epizootii (OIE), FAO i altele,
sunt implicate permanent n elaborarea strategiilor bazate pe:
- imunoprofilaxie (vaccinri n zonele endemice i de risc);
- msuri de profilaxie general (decontaminri, controlul circulaiei
animalelor i persoanelor din focarele de boal, controlul produselor de origine
animal provenite de la animale infectate cu bacilul tuberculozei , destinate
consumului uman);
- msuri de combatere a tuberculozei i reducerea mortalitii cauzat de
tuberculoz prin programe de chimioterapie specific, aa cum este programul
DOT.

6.1. Imunoprofilaxia specific. Vaccinarea antituberculoas.

n rile cu economii subdezvoltate, unde incidena tuberculozei este

ridicat i riscul de transmitere a bolii crescut, mai ales n populaiile umane unde
evoluia HIV/SIDA este endemic, bolnavii nu beneficiaz de un trata-ment
antituberculos complet; n multe teritorii medicaia antituberculoas este
insuficient i de aceea, necesitatea imunizrii populaiilor umane a devenit o
prioritate urgent.
n prezent se depun eforturi susinute pe plan mondial pentru descoperirea
unor vaccinuri noi antituberculoase cu performane imunogene mai bune dect
vaccinul BCG (Bacilul Calmette-Guerin), singurul utilizat n programele de
uimunizare antituberculoas.
Cu toate neajunsurile demonstrate, care vor fi prezentate n continuare,
vaccinl BCG continu s fie utilizat pe scar larg, administrndu-se, potrivit
datelor OMS la peste 2,5 bilioane de oameni.

285
 Vaccinul BCG nu i-a gsit utilitate n domeniul veterinar nici n scopul
prevenirii tuberculozei la animale sntoase i nici n scopul combaterii bolii n
efectivele de animale infectate, cu toate c, experimentele pe modele animale au
dovedit reale caliti imunogene ale acestui vaccin (88).
Pentru a nelege necesitatea folosirii vaccinurilor n campaniile de
combatere a tuberculozei, n continuare vor fi prezentate n detaliu vaccinul BCG,
vaccinuri noi i vaccinurile candidate pentru producie n serie i utilizare pe scar
larg.

6.1.1. Vaccinul BCG (Bacilul Calmette-Guerin).

Vaccinul BCG (Bacilul Calmette-Guerin) este singurul disponibil pentru

prevenirea tuberculozei la oameni.
Este un vaccin viu atenuat obinut dup 230 de pasaje succesive n
laborator dintr-o tulpin patogen de Mycobacterium bovis izolat de la o vac cu
mastit tuberculoas.
Vaccinul poate fi administrat nc de la natere, n primele ore i produce
att rspunsuri umorale ct i raspunsuri mediate celular de lung durat.
Studii relativ recente au demonstrat c administrarea unei singure doze de
vaccin la copii declaneaz un rspuns imun solid care se menine pn la vrsta de
50-60 de ani (6) asigurnd protecie mpotriva formelor de tuberculoz, precum:
tuberculoza miliar, tuberculoza cu localizare pulmonar i meningita tuberculoas
grav. De aceea, OMS a inclus n calendarul vaccinrilor obligatorii 64 de ri cu
inciden i prevalen cresute i n 167 de ri vaccinarea se practic sistematic .
Nivelul proteciei conferit de BCG este extrem de variabil; aceasta difer n funcie
de frorma pulmonar de tuberculoz i poate fi slab la persoanele suferind de
tuberculoz asociat cu HIV/SIDA .
De asemenea, protecia mpotriva tuberculozei, conferit de vaccinul BCG,
difer ntre populaiile umane n funcie de zona geografic. Astfel, n India BCG nu
confer nici o protecie la populaiile btinae, n timp ce n Regatul Unit al Marii
Britanii procentul de persoane imunizate se ncadreaz ntre 50-80 % .
Nivelul sczut al proteciei antituberculoase este cauzat de contactul
permanent cu micobacterii din mediu care exercit influen important asupra
rspunsului imun mascnd sau inhibnd efectul vaccinului BCG ( 4).
Experimentele pe animale confirm ineficiena vaccinului BCG n asigurare
unei protecii solide i durabile n acele ri n care exist inter-ferene pronunate
ntre antigenele vaccinale i micobacterii din mediul nconjurtor (14, 25, 56).
Vaccinurile noi , obinute din antigene majore fracionate, vor trebui s
rezolve problema efectului antagonic constatat la indivizi care anterior vaccinrii au
venit n contact cu micobacterii din mediu (26).

Mecanisme imunologice iniiate prin vaccinare BCG.

Rspunsul imun iniiat n urma vaccinrii BCG este extrem de hetero-gen

aa nct sistemul imun al indivizilor vaccinai recunoate un ansamblu de fraciuni
antigenice din structura BCG.
La o parte dintre persoanele vaccinate, rspunsul imun se carac-terizeaz
prin producie de cantiti semnificative de IFN n urma stimulrii celulelor
secretoare de IFN cu antigene extrase din filtrate de cultur tnr de M.
tuberculosis, avnd masa molecular redus.

286
 Astfel de antigene, reprezentate de ESTAT-6 i CFP10 sunt considerate inte
principale ale rspunsului imun de memorie. n cercetri genetice recente s-a
demonstrat lipsa genei ESAT-6 din tulpinile BCG i micobacteriile din mediul
nconjurtor dar prezent n genomul M.tuberculosis i alte micobacterii
patogene.
Rspunsul imun mediat celular specific iniiat n urma vaccinrii BCG se
bazeaz pe dou mecanisme efectorii: Secreia de IFN i activarea mecanismelor
citotoxice . Prezena celor dou mecanisme imunologice a fost demonstrat pe
animale, dar implicarea acestora la specia uman a fost dovedit numai indirect. S-
a constatat c la persoanele care au capcitate de a controla evoluia infeciei
tuberculoase, activitatea citotoxic este intens iar numrul de celule LT secretoare
de IFN este mare comparativ cu pacienii cu forme avansate de tuberculoz (96).
Dei unii imunologi consder c celulele LTCD4+, reprezentate n principal
de LTh1 ar fi implicate n mecanismele citotoxice, nu s-a demonstrat nc
implicarea acestora n ambele funcii efectorii la specia uman unde la aceeai
persoan pot fi constatate i fenomeme citotoxice nespecifice (neiniiate prin
vaccinare) sau asemenea fenomene pot fi atribuite i altor populaii de LT
(LTCD8+, LT, celule NK ). Antigenele M. tuberculosis declaneaz rspunsuri
imune asemntoare, att la persoanele nesensi-bilizate ct i la cele sensibilizate,
care se caracterizeaz prin activarea celule-lor Th1 i citotoxice, diferene
constatndu-se numai n dinamica rspunsuri-lor imune .
Pe baza studiilor de citrometrie n flux, efectuate pe celule monucleare
izolate din sngele periferic de la persoane vaccinate BCG i stimulate in vitrocu
diverse antigene micobacteriene s-a semnalat prezena n proprorie semnificativ a
unei populaii de celule reprezentate de LT care ar putea fi implicate n iniierea
unui rspuns de memorie indus de vaccinarea BCG (96).
Recent, s-a dovedit c extractele micobacteriene stimuleaz peferenial
celulele LT9+2+ care se gsesc n numr apreciabil la persoanele pozitive la
tuberculin, asimptomatici, persoane infectate cu M. tuber-culosis, sugernd un
posibil rol al LT9+2+ (69, 63).
Celulele LT9+2+ prolifereaz la stimuli micobacterieni numai n prezena
IL-2, sintetizat de limfocitele ThCD4+ (63, 99).
Pe de alt parte, LT ndeplinesc funcia celulelor helper pentru
limfocitele T CD4+ i TCD8+ n reglarea rspunsului imun in vitro.
O alt funcie important a celulelor LT este cea de sintez a IFN n
caniti semnificative i particip mpreun cu limfocitele T i celulele NK la
iniierea rspunsului imun tip 1 (81, 82, , 94).
Prin stimularea sintezei IFN la nivelul LT n urma vaccinrii cu BCG
este posibil ca celulele LT s fie implicate n etapele iniiale ale rs-punsului
imun primar in vivo dar i n activitatea citotoxic a limfocitelot T stimulnd i
funciile micobactericide ale macrofagelor. Se pare c n rs-punsul local iniiat,
celulele LT contribuie la sinteza IL-1 , un indicator important al activrii
monocitelor sau macrofagelor.

Analiza genetic a vaccinurilor BCG.

Cercetrile asupra vaccinurilor BCG au continuat n diferite laboratoare din

ntreaga lume pentru obinerea unor noi variante din subculturi BCG, cum ar fi:
BCG Pasteur, BCG Brazilia sau BCG Moscova, diferite ntre ele dar i de tulpinile
parentale sub raportul proteciei eficacitii. Din acest motiv OMS recomand
vaccinul BCG liofilizat.
Din punct de vedere genetic vaccinuile BCG se clasific n dou grupe:
 287

1. Vaccinuri preparate din tulpinile BCG Tokio, Moreau, Moscova i

Suedia, care secret cantiti importante de gene MPB70, cu dou copii ale
secvenei IS6110. Aceste a MPB64 (73).
2. Vaccinuri BCG Pasteur, Copenhaga, Glaxo i Tice, care secret mici
cantiti de MPB70, au o singur copie a IS6110 i nu conin metoximicolai i gena
MPB64 (73).
Analiza genomic comparativ a evideniat mai multe regiuni specifice M.
tuberculosis care au fost deletate n BCG , alctuite din peste 100 de gene n unele
tulpini, sau mai puine n altele.
Rearanjarea genomic complex, exprimat prin modificri ale numrului
de copii IS6110 i deletarea, difereniaz fenotipic, imunologic i implicit eficiena
variabil a vaccinurilor, tulpina original din 1921 de cele obinute prin tehnici
genetice n 1961 (9).
Valoarea imunogen a acestor vaccinuri ar trebui s se exprime prin
activarea pronunat a celulelor TCD4+ i TCD8+ care migreaz din alveolele
pulmonare infectate spre nodurile limfatice adiacente. n acelai timp, generaia de
vaccinuri noi antituberculoase, obinute trebuie s activeze celeulele dendritice
infectate pentru secreia unor interleukine, ca IFN i IL-12 n cantiti suficiente
pentru a media rspunsul imun mediat celular i pentru a intensifica activtile de
cooperare intercelulare n cursul rspunsului imun anti tuberculos.
Cercetrile ntreprinse de F l y n n J L.. 2 0 0 4 (33) evideniaz rolul
esenial al recept0rilor celulelor Th1 pentru IFN i IL-12 n protecia
antituberculoas, demonstrnd susceptibilitatea extrem de crescut a pacienilor cu
deficiena receptorilor Th1 pentru cele dou nterleukine la tuberculoz.

6.1.2. Perspectiva vaccinrii antituberculoase.

Dezavantajele vaccinului BCG, dar mai ales eficiena limititat a acestuia, au

determinat reorientarea ctre producia de vaccinuri noi, utiliznd ingineria genetic
sau unele tulpini micobacteriene saprofite.
Majoritatea cercetrilor n domeniul vaccinrii antituberculoase i
concentreaz activitatea, n prima etap asupra izolrii i seleciei acelor frac-iuni
antigenice din M. tuberculosis care s rspund dezideratului inducerii n organismul
gazd a unui rspuns protector solid i durabil, fr reacii postvaccinale severe i, n
etapa ur mtoare inseria acestor fraciuni anti-genice sub form de copii multiple n
vectori potrivii.
Administrarea de micobacterii saprofite, din mediul nconjurtor, s-a dovedit
promitoare pentru c ele sunt lipsite de potenial patogen i nu pro-duc reacii
locale puternice n urma administrrii la persoane reactive la preparatele
tuberculinice.
Mycobacterium vaccae, micobacterie nepatogen, cu cretere rapid i cu
potenial imunoterapeutic, este un exemplu relevant privind caracteris-tice meionate
mai sus, verificate la bolnavii cu tuberculoz activ.
S-a demonstrat c M.vaccae i M.smegmatis au cretere de 10 ori mai rapid
dect M. tuberculosis. Totodat, M. smegmatis, produce 4 dintre proteinele majore
prezente n structura M. tubercuolosis, din care cea mai
important este proteina cu masa molecular de 30 kDa urmat n ordine
descrescnd de proteinele de 23,5 i 16 kDa.
M.vaccae a fost utilizat n experimente clinice ca agent imuno-terapeutic
adjuvant antituberculos, mai ales n cazurile cu multirezisten la chimioterapice i n
infecia micobacterian asociat cu HIV.
 288
Spre deosebire de BCG preparatul M. vaccae este un vaccin inactivat.
Vaccinul preparat din M.vaccae are n acelai timp proprieti tera-peutice
i profilactice n infecia cu M.tuberculosis i poate fi folosit ca adjuvant util pentru
a iniia, mpreun cu antigenele asociate, un rspuns imun tip 1.

6.1.3.Vaccinuri antituberculoase pe baz de recombinani

genetici .

Tehnologia ADN-recombinant reprezint una dintre tehnicile de inginerie

genetic utilizat n perspectiva producerii unor noi vaccinuri anti-tuberculoase.
n principiu, tehnologia ADN pentru porducia de vaccinuri re-combinante
se bazeaz pe separarea genei care codific antigenul mico-bacterian dorit i, n
continuare, inseria acesteia n genomul unui micro-organism-vector ales. Astfel,
gena inserat n genomul vecorului este tran-scris i translatat, rezultnd
antigenul protector dorit mpreun cu alte proteine aparinnd microorganismului
vector.
n strategia de de producere a vaccinurilor den BCG-recombinant (rBCG) se
folosesc diferite strategii , precum:
a). Producia rBCG n cantiti mari din antigene autologe pro-tectoare,
care contribuie la mbuntirea imunogenitii fa de alte antigene BCG prin
creterea expesiei genelor acestora , aa cum este cazul antigenelor tuberculoase
imunodominante.
- Tulpina vaccinal rBCG30, face parte din acest categorie de vac-cinuri;
exprim i secret proteina major de 30 kDa a M. tuberculosis denumit i
antigen-a sau Ag85B (42) i confer cea mai bun protecie i rat de supravieuire
pentru animalele infectate, comparativ cu BCG administrat pe cale parenteral (43).
b. Creterea capacitii intrinsec, relativ redus a BCG, de a induce
rspunsuri celulare TCD8+. Vaccinurile rBCG au capacitatea de a crete
permeabilitatea membranelor fagosomilor din celula gazd i de a permite accesul
micobacteriilor n citoplasma celular.
Complexele majore de histocompatibilitate Cl.I (MHC cl.I ) restric-ionate
pentru TCD8+, joac un rol important n protecia antituberculoas atunci cnd
antigenele micobacteriene sunt eliberate din vacuolele fago-somale n citoplasma
celulei gazd. Astfel, MHC cl.I preiau i prezint mult mai intens antigenele libere
din celula gazd ctre celulele TCD4+ i TCD8+.
Bazndu-se pe acest mecanism imunologic , cercetrile n acest do-meniu
au descoperit , la nceput listeriolizinul (citolizin-sulfihidril), activator estenial
pentru eliberarea Listeriei monocitogenes din vacuolele fagosomale n citoplasma
celulelor gazd i ulterior, s-a obinut un vaccin rBCG cu listeriolizin secretat
biologic activ (hly+ - rBCG) care a sporit substanial funcia MHC clI de prezentare
a proteinei cofagocitate. hly+ - rBCG s-a dovedit superior fa de BCG clasic,
asigurnd o protecie durabil a oarecilor infectai cu M. tuberculosis (38). Ulterior
s-a obinut o variant a hly+ -rBCG deficient n gena care codific sinteza ureazei
C i care confer potecie mbuntit substanial fa de M.tuberculosis la oareci
i cretere semni-ficativ a apoptozei macrofagelor infectate.
Deficiena ureazic permite acidifierea fagosomului astfel nct lis-
teriolizinul devine mult mai activ la pH optim, perfornd membrana fago-somal.
Continund cercetrile, G r o d e L. et al 2 0 0 5 (38) constat c eficiena
crescut a vaccinului hly+ -rBCG deficient n ureaz ar fi rezultatul prezentrii
extra-
 289

celulare a antigenului micobacterian de ctre MHC cl.I la celulele TCD8+,

implicate n producerea apoptozei.
O alt variant vaccinal a rBCG a fost obinut pentru stimularea
produciei de citokine, cum sunt: IFN i IL-2 i n consecin, mbuntirea
proprietilor imunostimulatoare ale BCG (66).
Totodat, s-au ntreprins cercetri cu rezultate promitoare pentru
folozirea rBCG ca vaccin vehicul cu capacitatea de a exprima simultan numeroi
ageni patogeni n controlul infeciilor majore. Astfel, s-au obinut o gam de
vaccinuri rBCG-vehicul capabile s induc la oareci i primate cu infecie mixt
micobacterian i alte micobacterioze prin asocierea proteinelor micobacteriene cu
antigene bacteriene sau inseria secvenelor proteice mico-bacteriene n genomul
unor bacterii cum ar fi E.coli sau Bacillus subtilis .a. (93, 112) .
Vaccinuri ADN antituberculoase . Vaccinarea ADN este mtoda cea
mai eficient de exprimare a antigenelor non-self in vivo i de imunizare a
animalelor i oamenilor mpotriva diferiilor ageni infecioi (virusuri, protozoare,
bacterii) i, n ultimul deceniu, mpotriva infeciilor micobacteriene.
Vaccinurile ADN sunt preparate din plasmide ADN, n structura crora
exist gene care codific sinteza unui anumit imunogen.
Plasmidele ADN sunt nvelite n microsfere din aur n soluii apoase, care se
administreaz parenteral, prin injecii subcutanate sau intramusculare.
Mecanismul de iniiere a rspunsului imun nu este complicat; plasmidele
vector ptrund la locul inoculrii n celulele musculare i se localizeaz
extracromozomal unde sunt transcrise i translatate n proteina dorit care este
procesat i transportat cu ajutorul MHC Cl.I la celulele LT citotoxice , limfocitele
Th i limfocitele B, urmnd a fi activate i sensibilizate fa de M. tuberculosis .
Dezavantajul major al vaccinului ADN antituberculos const n
posibilitateas integrrii n genomul celulei gazd, producnd fenomene de
mutagenez ocogen.
n acelai timp, vaccinul ADN antituberculos poate iniia sinteza de
anticorpi autoimuni.
n urma administrrii experimentale a plasmidelor ADN s-a obinut
secreia de proteine in vivo implicate n declanarea unui rspuns umoral i
celular i n final , protecia animalelor i persoanelor vaccinate fa de boli
infecioase, justificnd astfel tendina nlocuirii vaccinurilor vii cu vaccinuri ADN.
Eficiena vaccinrii ADN depinde de natura populaiei de celule pre-
zentatoare de antigen (CPA) i modul n care antigenul este procesat de aceste
celule. De asemenea, dup administrarea vaccinului ADN- micobacterian,
rspunsul este influenat de fragmentele ADN care stimuleaz IL-2, TNF-
i celulele NK. 1
n urma administrrii sub form de vaccin ADN, proteinele mico-
bacteriene sunt implicate n inducerea rspunsului imun protector prin diver-se
mecanisme, n funcie de caracteristicile fenotipice i genotipice i funciile
proteinei, astfel:
- antigenul de 38 kDa, este implicat n transportul de fosfai bacterieni.
Vaccinul ADN care conine genele glicoproteinei de 38 kDa are cea mai nalt
specifictate comparat cu cea a altor vaccinuri ADN i numai M. intracelulare
conine o protein cu structur asemntoare cu cea anti-genului prezentat;
- antigenul hsp 65 kDa, este un veritabil transportor universal, n
numeroase situaii persoanele se sensibilizeaz fa de acest protein dup
contactul cu microbi consensuali, cu reactivitate ncruciat.
290
 - proteina de 36 kDa, se gsete n structura M. leprae i prezint secvene
identice cu un polipeptid codificat n genomul M. tuberculosis.
S-a dovedit c antigenele 85B i 38 kDa care induc un rspuns protector
durabil, sunt proteine secretate de micobacteriile vii, caracteristic neobservat la
antigenele hsp65 i 38 kDa.

6.1.4. Subuniti vaccinale candidate pentru producia BCG.

Subunitile vaccinale neviabile s-au folosit , n primul rnd din motive de

securitate n trialuri pe populaii umane i, n al doi-lea rnd, pentru eficiena
crescut a acestora comparat cu cea a vaccinului BCG integral.
Rezultatele obinute cu diferite subuniti vaccinale sunt ncuraja-toare,
efectul protector ns este cel puin echivalent cu cel al BCG n testrile pe polupaii
umane.
Subunitile vaccinale cuprind diferite antigene tuberculoase dominante,
cum ar fi: ESAT-6, int antigenic secretoare cu masa molecular de 6 kDa,
confer un oarecare grad de protecie mpotriva M. tberculosis la oarece (75) i mai
recent la primate (53) .
Unele ncercri de fuziune proteic ntre ESAT-6 i Ag.85B mpreun cu un
potenial adjuvant , au condus la un rspuns proteic cu imunitate dependent de
doz la oarecii infectai experimental (74). Vaccinul preparat din cele dou antigene
fuzionate induce memorie imnologic eficient, stabil timp de 30 de sptmni (2).
A g g e r E M, e t a l. 2006 (2) a reuit creterea rspunsului imun i
eficienei protectoare a combinaiei Ag85B ESAT-6 la oareci folosind adjuvantul
sintetic IC-31.

6.1.5. Vaccinuri vii obinute din tulpini atenuate de M.

tuberculosis.

Din cele 6 antigene imunodominante aparinnd M. bovis (ESAT-6, CFP10,

Ag.85, MPB64, MPB70, MPB83) 5 sunt deletate din cteva sau din toate tulpinile.
Pe de alt parte, n regiunea RD1, prezent n genomul M. tuber-culosis dar absent
M. bovis-BCG se gsesc antigenele se gsesc genele care sunt responsabile de
secreia antigenelor ESAT-6 i CFP10 i care s-au dove-dit a avea importan
major pentru protecia mpotriva infeciei cu M. tuberculosis la cobai (84).
Ca rezultat al adaptrii progresive a tulpinilor la condiii de laborator,
cteva sute de gene deletate din BCG se gsesc nc n genomul M. tuber-culosis,
ceeace a condus la ideea utilizrii acestor tulpini atenuate de M. tuberculosis la
producerea unui vaccin.
Dezvoltarea cercetrii n deomeniul tuberculozei i realizarea pro-filului
complet al secvenei genomice a M. tuberculosis au facilitat nelegerea contribuiei
individuale a genelor responsabile de virulena M. tuberculosis (23, 16) i au permis
obinerea unor tulpini noi atenuate, cum ar fi:
-Tulpina A. M. tuberculosis-phoP, a fost obinut dintr-o singur disrupie
de gen (80) dup multiplicri repetatein vitro,n cultur de macro-fage de oarece
i apoi atenuat in vivo pe oareci infectai.
Gena phoP poate s fie implicat n reglarea complexului lipidic
micobacterian, responsabil de virulena M. tuberculosis (37). Cercetrile pe animale
au condus la obinerea mutantei phoP-M.tuberculosis, un candidat promitor
pentru producerea unui vaccin atenuat (59).

291
 - Tulpina A.M.tuberculosis-mce. Recent s-a demonstrat c lipsa expresiei
genei mce (mamalian cell entry) la unele tulpini M. tuberculosis reduce
substanial virulena i crete imunogenitatea, asigurnd o protecie
antituberculos mai bun la animale comparativ cu vaccinul BCG.
- Mutantele auxotrofice, sunt acele mutante obinute prin adausul de
nutrieni necesari pentru dezvoltarea i supravieuirea micobacteriilor n mediul de
ultur. De aceea, aceste mutante pstreaz capacitatea infectant dar n condiii in
vivo repicarea lor este limitat.
Aceste tulpini ateniuate pe diferite gazde, au potenial variabil de a candida
la producia de vaccinuri n serie dup cum s-a dovedit n experimentele pe animale
(59, 101).
Majoritatea lucrrilor de specialitate care abordeaz utilizarea
mcroorganismelor vii se refer n special la protecia i reglementrile speciale
privind riscul infectrii gazdei prin administrarea de vaccinuri preparate din astfel
de mutante ale M.tuberculosis. De exemplu, utilizarea BCG contaminat accidental
cu o tulpin virulet de M. tuberculosis n Germania n 1927 s-a soldat apariia
tuberculozei la peste 25 % dintre copiii vaccinai.
La Conferina Mondial de la Geneva din 2005, s-a elaborat prin consens
un document care vine n sprijinul promovrii celor mai promitoare vaccinuri
candidate pentru controlul clinic al tuberculozei (50) . n document au fost incluse
mai multe criterii care trebuie s fie respectate n timpul proceselor de producere a
vaccinurilor. Unul dintre criterii se refer la prezena obligatorie a cel puin dou
mutaii independente i ireversibile pe genomul micobacterian.
n acest context, recent au fost descrise mutante dublu auxotrofe (92,90, 91).
Unele dintre aceste vaccinuri vii candidate iniiaz rspunsuri imune
protectoare similare cu BCG la oareci dar mai puterice dect BCG la cobai (111) .
Rezultatele acestor studii sugereaz posibilitatea extinderii cercetrilor asupra
vaccinrii antituberculoase la primate.
Se pune ntrebarea dac rspunsurile imune provocate de vaccinurile vii
pot fi blocate datorit pre-expunerii gazdei la micobacerii din mediul nconjurtor,
aa cum s-a demonstrat n cazul vaccinului BCG (32)
Recent D e m a n g e l C., 2 0 0 5 (26), a dovedit experimental c reaciile
ncruciate sunt determinate de antigenele deletate ale BCG, cum ar fi Ag.85B i
micobacterii din mediul n conjurtor, dar aceste reacii nu se
constat n cazul antigenelor deletate ale BCG, precum ESAT-6 i CFP10.
Rezultatele autorului citat sunt foarte importante, sugernd c expunerea
anterioar la micobacterii din mediul nconjurtor iniiaz sistemul imun al gazdei
mpotriva antigenelor micobacteriene nrudite i c o nou stimulare a memoriei
rspunsului imun conduce la scderea proteciei antituberculoase. Acelai autor
arat c persistena BCG in vivo ar putea fi sporit substaial prin inseria stabil
a RD1 cu gene esat 6 i cfp10.
Tulpinile atenuate de M. tuberculosis care includ regiuni deletate ale BCG
cu antigene majore nenrudite cu micobacterii din mediu nconjurtor vor rezolva
probabil problema efectului antagonic al BCG fa de imunizarea cu micobacterii
din mediu. Mutantele M. tuberculosis candidate la vaccinuri pot s induc
rspunsuri imune celulare de lung durat, esenial pentru protecia
antituberculoas.
 292

6.1.6. Vaccinarea antituberculoas n Romnia.

n Romnia, vaccinarea BCG se practic nc din anul 1948 i de atunci

aciunea este inclus n programele guvernamentale, toate costurile fiind suportate
de ctre statul romn. Se apreciaz c n Romnia se vaccineaz anual mpotriva
tuberculozei ntre 150.000 300.000 de persoane.
Principalul scop al vaccinrii antituberculoase este de a preveni cazurile
grave de tuberculoz , n special meningita la copilul mic.
Vaccinul BCG se prepar la Institutul Cantacuzino, Bucureti din culturi
aviru-lente de Mycobacterium bovis Calmette-Guerrin, suspendat n soluie de
glutamat de sodiu 1,5 % cu o concenmtraie de 4-5 milioane de germeni vii.
Productorul comercializeaz vaccinul sub form liofilizat ca o pulbere alb, fin
neaderent la pereii flaconului. Un flacon conine 20 de doze vaccinale cu cte 0,1
mg. mas bacterian/doz.
Vaccinul BCG se livreaz n trus care conine alturi de flacoanele cu
vaccin un numr egal de fiole cu diluant reprezentat de mediul Souton (lichid
limpede, incolor ) necesar pentru reconstituirea suspensiei vaccinale. Dup diluare
vaccinul trebuie utilizat n termen de 30-60 de minute. n stare liofilizat, vaccinul
se pstreaz la ntuneric i la 4C, ferit de umiditate.
Indicaii pentru administrarea vaccinului. Conform normelor tehnice al
Minis-terului Sntii si Familiei (MSF) i instruciunilor de utilizare a vaccinului,
se supun vaccinrii:
1. Toi nou-nscuii cu greutate corporal mai mare de 250 g. n primele 24
de ore, cei sub 250 g. ntre ziua a 47-a pn la 2 luni i sugarii n vrst de pn la
12 luni, cu revaccinare celor la care, n decurs de 6 luni, cicatricea postvaccinal
depete 3,0 mm.
Sunt exceptai de la vaccinare nou-nscuii ai cror mame sunt pozitive
pentru BAAR la examenul sputei; la acetia , ntr-o prim etap se aplic
chimioterapia sau terapia antituberculoas (dac este cazul) apoi pot fi vaccinai;
2. Sugarii i copiii cu IDR negativ la tuberculin, care:
a). prezint risc crescut de expunere apropiat i prelunigit la persoane
adulte cu tuberculoz pulmonar netratat sau insuficient tratat i nu pot fi
separai de sursa de infecie sau nu pot primi chimioprofilaxie de lung durat, sau:
b). sunt expui permanent la persoane cu forme de tuberculozrezistente la
medicamente antituberculoase.
3. Copiii nscui din mame HIV pozitive, deja infectai, trebuie vaccinai
imediat dup natere, deoarece:
- confer o protecie ncruciat fa de micobacterii atipice din mediul
nconjurtor care genereaz n proporie crescut nbolnviri i decese la pacienii
infectai cu HIV;
- nu determin apariia de efecte secundare.
Unii specialiti recomand revacinarea BCG la vrsta de 13- 14 ani (Cl.VIII-
a) (60).
Documentele oficiale emise de MSF care reglementeaz vaccinarea
antituberculoas n Romnia prevd ca revaccinarea la vrsta de 13-14 ani s se fac
numai n situaii deosebite, n zonele cu prevalen crescut a bolii i numai aceii
copii cu risc crescut de expunere la infecia tuberculoas.
 293

Precauii . dei reaciile anafilactice sunt rare, n timpul vaccinrii trebuie

avut la ndemn tratamentul adecvat antianafilactic, pentru a se interveni de
urgen.
Persoanele pozitive la tuberculin (reacie peste 9,0 mm la 2 Unit.PPD) nu
necesit vaccinare BCG ntruct administrarea vaccinului la aceste persoane poate
declana o reacie local sever.
Inocularea prea profund a vaccinului sporete riscul apariiei limf-
adenitelor i formrii de abccese.

Contraindicaii. Vaccinul BCG este contraindicat la:

- persoanele cu IDR pozitiv;
- bolnavii de SIDA;
- personele cu stri febrile sau n convalescen dup boli infecioase;
- timp de 6 luni dup hepatita viral;
- afeciuni dermatologice acute;
- femeile gravide i mamele care alpteaz ;
- nou-nscui cu greutate sub 250 gr.;
- pacieni cu imunodeficiene congenitale;
- bolnavi de leucemii, limfoame sau boli maligne.

Tehnica administrrii vaccinului. Pentru administrarea vaccinului sunt

necesare:
- seringi sterile de 0,5-1,0 ml. prevzute cu ace intradermice pentru
injectarea vaccinului i ace cu lungime obinuit pentru suspensionare ;
- alcool sanitar.
Pentru a putea fi administrat, vaccinul BCG liofilizat trebuie supensionat.
Fiola de vaccin se nvelete n folie din material plastic, n zona marcat cu alb,
dup care gtul fiolei se rupe cu mna. Imediat dup deschiderea fiolei cu vaccin, cu
ajutorul unei seringi cu ac lung se introduc n fiol 2,0 ml. din lichidul de
suspensionare (Sauton diluat), dup care coninutul fiolei se amestec prin 2 - 3
manevre de aspirare i refulare a coninutului seringii. Suspensia obinut este
omogen, uor opalescent.
Vaccinul se administreaz strict intradermic, n partea postero-extern a
braului stng n treime medie. Injectarea se face cu cu o seringa de 0,5 1,0 ml.
prevzut cu ac pentru injectare intradermic. Locul de injectare trebuie s fie
curat, necontaminat cu substane antiseptice i fr leziuni ale pielii.
Se injecteaz strict intradermic, 0,1 ml. suspensie de vaccin BCG, astfel:
- se prinde pielea ntre degetul podice i arttor;
- acul seringii trebuie s fie paralel cu suprafaa pielii i se introduce
uor cu bizoul n sus, aproximativ 2, 0 mm., n stratul superficial al dermului;
- acul trebuie s fie vizibil prin epiderm n timpul penetrrii pielii;
- coninutul seringii se administreaz lent;
- o papul cu dimensiuni de 6,0-7,0 mm. la nou nscui, n care foliculii
piloi sunt vizibili este semnul unei injectri corecte. Papula dispare n aproximativ
30 de minute;
- locul injectrii va fi lsat descoperit pentru a se facilita vindecarea.
Interaciuni. Vaccinarea BCG intradermic poate fi administrat
concomitent cu alte vaccinuri inactivate sau vii, inclusiv vaccinul combinat rujeolic,
urlian i rubeolic.
 294

Vaccinurile care se administreaz concomitent cu BCG nu trebuie injectate

n acelai bra.
Dac alte vaccinuri nu sunt adminstrate concomitent cu BCG, acestea vor fi
planificate a se injecta dup cel puin o lun . Nici o alt vaccinare nu va fi efectuat
n acelai bra timp de cel puin 3 luni pentru a preveni apariia limfadenitelor
regionale
Reacii adverse . O reacie normal dup vaccinarea BCG demons-treaz
succesul vaccinrii BCG i este exprimat prin induraie la locul administrrii
vaccinului , urmat de o leziune local care poate ulcera cteva sptmni i care se
vindec spontan n decurs de cteva luni (3 luni ele obinuite, 6 luni ele ulcerate)
formnd o cicatrice uor depigmentat . n cazuri rare, dup 1-3 luni de la
vaccinare, se poate produce o adenopatie axilar. Nodulii limfatici sunt mici (sub
1,0 cm.) duri, mobili, nedureroi i nu se depisteaz dect la palpare sistematic.
Reaciile postvaccinale includ:
Reacii foarte rare:
Sistemice: complicaii BCG diseminate (osteite, osteomielite) reacii
alergice inclusiv reacii anafilactice;
Locale: adenopatii regionale (mai mari de 1,0 cm) ulceraii supurate la locul
inoculrii;
Reaciile adverse cauzate de vaccinul BCG-I.C. sunt foarte rare (1/10.000).
Adenopatiile mai mari de 10-15 mm i adenitele supurate sunt reacii excepionale,
provocate n majoritatea cazurilor de nerespectarea tehnicii de vaccinare.
Ca un rspuns excesiv la vaccinare este posibil s apar ulceraii la locul de
administrare; dac leziunea persist este necesar intervenia medicului specialist.
Pentru tratatmentul local al coleciilor purulente (abcese subcutanate, adenopatii
supurate), dup puncie i evacuarea puroiului, se pot introduce local
tuberculostatice (soluie de rifampicin, sau soluie izoniazid plus streptomicin).
Supradozaj . Supradozajul are loc cnd se administreaz mai mult de 0,1
ml. suspensie de vaccin BCG (0,1 mg. bacili Calmette-Guerin) per doz injectat
intradermic; supradozajul crete riscul apariiei reaciilor adverse locale sau
sistemice. n consecin supradozajul poate cauza limfadenita axilar cu sau fr
supuraie care, de regul se rezolv spontan.
n cazul n care limfadenita axilar persist este necesar prezentarea la
medicul specialist.
Atentionri speciale. Sarcina i alptarea. Dei pn n prezent nu s-au
semnalat efecte nocive asupra dezvoltrii ftului, se recomand s nu se
administreze vaccinul BCG pe perioada sarcinii sau alptrii. Totui, n zonele cu
risc crescut de infectare tuberculoas, vaccinul BCG se poate administra n cursul
sarcinii i
alptrii dac se face o evaluare exigent asupra beneficiilor n raport cu riscul
perturbrii dezvoltrii ftului.
- Capacitatea de a conduce vehicule sau de a folosi utilaje. Nu s-au
semnalat i nu s-au descris efecte asupra capacitii de a conduce vehicule sau
utilaje.

6.2. Chimioterapia antituberculoas.

n domeniul veterinar, tratamentul medicamentos mpotriva tuberculozei la

animale nu s-a folosit niciodat i acesta nu constituie un mijloc de lupt mpotriva
infeciei tuberculoase.
295
 Durata tratamentului, de peste o jumtate de an i costurile extrem de
ridicate/ animal pentru trata-ment, motiveaz ineficiena chimioterapiei
antituberculaose la animale.
Implementarea chimioterapiei n Programele de control i com-batere ale
tuberculozei ar reprezenta o utopie , avnd n vedere c animalele depistate ca fiind
infectate cu micobacterii ar trebui izolate de restul efectivului pe toat peroioada
tratamentului, ele sunt scoase din circuitul productiv (carne, lapte, ntreruperea
ciclului de reproducere, etc.), cheltuieli inutile pentru ngrijire i n acelai timp
existena lor n exploataie pe durata tratamentului, fie i izolate, reprezint un real
pericol pentru restul efec-tivului, pentru personalul dinexploataie i pentru
rspndirea tuberculozei n teri-toriu la animale i oameni.
ansele de succes n aciunile de combatere i eradicare a tuberculozei sunt
mult mai mari dac se aplic strategiile i msurile generale cuprinse n Programul
anual de aciuni strategice n combaterea bolilor la animale. Totui, este posibil ca
n unele clinici veterinare s se apeleze la unele scheme de tratament antituberculos
la animalele de apartament i de companie.
n medicina uman, tratamentul contra tuberculozei a fost i rmne
principalul mijloc de reducere a incideneei bolii i a numrului de decese cauzate
de tuberculoz dar i pentru evitarea rspindirii infeciei n rndul populaiilor
umane sstoase. De aceea, nc din secolul al XIX-lea au fost ncercate diverse
scheme de tratament medicamentos. De exemplu, ncepnd din anul 1944 s-au
folosit streptomicina (SM) i acidul paraaminosalicilic (PAS) pn n anul 1952,
cnd s-a descoperit izoniazida, al 3-lea medicament care s-a adugat combinaiei
SM+PAS, mbuntind substanial starea de sntate al pacienilor, dar care nc
trebuia administrat pe durata a 18-24 de luni.
Civa ani mai trziu, n 1960 cercetarea farmaceutic avea s descopere
etanbutolul (EMB) care a nlocuit acidul paraminosalicilic (PAS), reducnd durata
tratamentului la aproximativ 18 luni, iar dup un deceniu durata tratamentului
antituberculos a fost redus la 9 luni graie introducerii rifampicinei (RIF) n
combnaia medicamentoas utilizat anterior.
Dup ali 10 ani, n 1980, odat cu descoperirea pirazinamidei (PZA) i intro-
ducerea acesteia n tratamentul antituberculos, durata tratamentului s-a redus la 6
luni.
n alegerea combinaiei de medicamente antituberculoase trebuie avute n
vedere cteva particulariti importante pentru succesul tratamentu-lui:
1. Tratamentul tuberculozei n faza activ cu un singur medicament
exercit o selecie intens asupra micobacteriilor dnd natere la sue rezis-tente la
acel medicament i insuces n vindecarea bolii;
2. Diverse sue de micobacterii cu susceptibilitate diferit la medica-
mentele antituberculoase folosite pot coexista la acelai pacient (97).
3. O alt particularitate a tratamentului antituberculos este continui-tatea
acestuia pe toat durata prevzut, de cel puin 6 luni, utiliznd combi-naia de
medicamente prevzut att n prima faz ct i n faza final.
Studiile pe grupe de pacieni supui chimioterapiei antituberculoase cu
continuitate pn la ncheierea perioadei prevzute, grupe de pacieni care au
ntrerupt administrarea medicamenelor pentru cel puin 2 luni din durata
trata-
mentului i pacienii care au ntrerupt definitiv tratamentul, au artat c
ntreruperea temporar sau definitiv a tramentului antituberculos conduce
inevitabil la decese n proprorie de 12-20 % comparativ cu grupele care au primit
tratament nentrerupt, n special n rndul persoanelor suferind de HIV/SIDA.

296
 De aceea, coala romneasc de ftiziologie condus de Acad. C. Anastasatu
se pronuna, cu aproape 3 decenii n urm, asupra necesitii introducerii
chimioterapiei antituberculoase n regim permanent, pe toat durata prescris i
sub strict supraveghere. Metoda, considerat cea mai eficient n combaterea
tuberculozei, cu efecte imediate i cu influene favorabile pentru viitor, se baza pe
strategia lansat de OMS n 1955, care prevedea generalizarea tramentului de scurt
durat, sub strict supraveghere n cadrul Programului internaional DOTS
(Directly Observed Treatment Short-Course), al crei scop era reducerea ratei
deceselor i diminuarea riscului de transmitere a infeciei n rndul populaiei
umane sntoase.
Dup introducerea terapiei combinate i a medicamentelor noi pentru
tratamentul tuberculozei , rezistena bacililor tuberculoi a nceput s scad
simitor i controlul bolii prea a fi la paramteri acceptabili, ceeace a determinat
OMS s estimeze c tuberculoza ar putea fi eradicat pn la sfritul secolului al
XX-lea. Din pcate, cu ocazia Zilei Modiale a Luptei contra Tuberculozei din martie
2011, OMS raporta creterea ngrijortoare a incidenei i extensivitii
tuberculozei, astfel c, n anul 2009, se nregistrau 9,4 milioane bolnavi din care la
o persoan din 10 infectate, tuberculoza a evoluat sub form activ, nregistrndu-
se la nivel modial 1,7 milioane de decese, din care 380.000 de persoane erau
infectate cu M. tuberculosis i HIV. Rezult din datele OMS c, pe plan mondial se
nregistreaz zilnic n medie 470.000 de decese ceeace nseamn c n fiecare minut
se produc aproximativ 325 de decese din cauza tuberculozei.
n final, OMS a lansat un apel ctre toate guvernele statelor cu peste 100 de
cazuri de tuberculoz la 100.000 de locuitori i n special ctre guvernele din cele
22 de ri unde numrul de bolnavi a reprezentat 80,0 % din totalul cazurilor
nregistrate la nivel mondial, pentru:
- finanarea prioritar i corespnztoare a Programelor Naionale de Lupt
mpotriva Tuberculozei care s acopere cheltuielile necesare n sistemul medical de
supraveghere, depistare i diagnostic precoce, cheltuielile n sistemul de cerectare,
producie i aprovizionare cu produse biologice i medicamente antituberculoase de
ultim generaie, cu parametri superiori de eficien, care s elimine riscul apariiei
tulpinilor micobacteriene multi-rezistente la medicamente (MDR: Multidrog
Resistence) i n acelai timp s reduc ct mai mult posibil durata tramentului;
- guvernele statelor afectate grav de tuberculoz s se implice activ n
organizarea i finanarea corespunztoare a serviciilor medicale de sntate i
asisten social , a clinicilor , preventoriilor TBC i instituiilor medicale de
specialitate;
- asigurarea fondurilor bneti i materiale pentru aplicare eficient a
msurilor de prorofilaxie general n combaterea tuberculozei.
n continuare, se vor prezenta cteva referiri asupra principiilor i criteriilor
de aplicare a schemelor, formulelor chimioterapice pentru tuber-culoz i
modalitile de aplicare a tratmentului n scopul vindecrii complete a bolnavului
i de a evita apariia suelor de bacili tuberculoi cu multi-reazisten la
medicamente antituberculoase i n acelai timp de obine dis-trugerea bacililor n
stare de laten (bacilii somnoleni) din esuturi adiacente focarului activ.
n acest context, trebuie menionat c medicamentele antituberculoase
actuale se comport diferit n funcie de virulena bacililor tuberculoi.
De exemplu, INH este foarte eficient mpotriva micobacteriilor active RIF i
PZA au aciune bactericid maxim mpotriva micobacteriilor care nu se divid (79).
297
 Din aceste motive se recomand folosirea terapiei combinate
antituberculoase, cu medicamente clasificate n dou grupe:
1. Grupa medicamentelor de prim linie, cuprinde: INH, RIF, PZA
i EMB dar pot fi ncadrate i medicamente de ultim generaie, precum:
rifanpentina i rifambutina precum i civa derivai ai fluorochinololului care n
viitor pot completa tratamentul standard antituberculos;
2. Grupa medicamentelor din linia a 2-a. Din aceast grup fac
parte:
- aminoglicozidele: kanamicina i amicocina;
- capreomicina, PAS, cicloserina;
- diverse fluorochinolone: moxifloxacinul, levafloxacinul i goti-floxacinul.
Unii specialiti ncadreaz streptomicina (SM) n grupa a 2-a, considernd
utilizarea ei tot mai restrns n ultimii ani.

6.2.1. Formule de tratament antituberculos.

Tratamentul antituberculos urmrete realizarea a dou eziderate

importante (76):
1. Necesitatea distrugerii rapide a bacililor tuberculoi extracelulari din
leziunile pulmonare cavitare care au metabolism intens i se divid per-manent.
Scopul este negativarea examenului sputei i prevenirea transmiterii infeceii la
oameni sntoi.
2. Necesitatea sterilizrii complete a oranismului n paralel cu dis-
trugerea micobacteriilor cu rat redus de multiplicare n mediul acid sau n
mediul anoxic. n asemenea cazuri se recomand folosirea combinaiei de
medicamente din prima linie.
Tratamentul curent, de scurt durat pentru eliminarea complet a
bacililor tuberculoi activi i cei n stare de laten (bacili somnoleni), cuprin-de
dou faze :
- faza primar (iniial) , n care sunt folosite timp de 2 luni, n mod
obinuit, izoniazida (INH), rifampicina (RIF), etanbutolul (EMB) sau strepto-
micina (SM), medicamente care nu permit replicarea i distrug bacilii activi, avnd
rezultat negativarea sputei.
- faza secundar (de continuare) . n aceast faz se folosete de-obicei
izoniazida i rifampicina timp de 4-7 luni cu aciune asupra bacililor lateni
(somnoleni) prevenind recidivele.

62.2. Doze terapeutice.

n general, n schema standard de tratament se folosesc urmtoarele

medicamente din prima linie: INH, RIF, EMB, PZA i SM n urmtoarele doze
recomandate n tabelul nr.30.

298
 Tabelul : 30

Doze recomandate pentru medicamentele antituberculoase din prima linie

DOZE ADULI DOZE COPII *

Zilnic mg/kg Sptmnal Zilnic Sptmnal
MEDICAMENT (doza max. de 30ri de 2 0ri mg./kg De 3 ori De 2 ori
mg.) mg/kg mg/kg (doza mg/kg. mg/kg
(doza (doza max.mg) max.mg.) (Doza (doza max.)
max.mg.) max.mg.)
INH** 5,0 (300) 10,0-15,0 15,0 (900) 10,0- - 20,0-30,0
(900) 15,0(300) (900)
RIF 10,0 (600) 10,0*** (600) 10,0*** (600) 10,0 -20,0 - 10,0-20,0
(600) (600)
PZA**** 18,2-26,3 (1-2 27,3-39,5 36,4-52,6 (2,0- 15,0-30,0 ( 2 - 50,0 (2,0 g)
g.) (1,5-3,0 g) 4,0 g) g)
EMB**** 14,5- 21,1 (8oo- 21,8-31,6 36,4-52-6 (1,2- 15,0-20,0 - 50 ,0 (2,5 g)
1600) (1,2-2,4) 2,4) (1,0 g)
SM 15,0 (1,0 - - 20,0-40,0 - 20,0 (1,0 g)
g)***** (1,0 g)

* : Pacieni pn la vrsta de 15 ani.

Dac se suspecteaz sau se constat apariia suelor de bacili rezisteni la

medicamentele din prima linie, sau se nregistreaz fenomene adverse, se va
schibma formula medicamentoas introducnd medicamente din linia a 2-a, n
dozele recomandate n tabelul nr.31
Tabelul: 31

Dozele recomandate pentru medicamente antituberculoase din linia a 2-a

Mdicamentul ADULI COPII *

Doze (doza max.) Durata Doze (doza max.) Durata
zile/spt. zile/spt.
Rifanpentin** 10 mg/kg(600 mg) 1 - -
Rifabutin*** 5 mg/kg (300 mg) 2-3 sau 7 - -
Cicloserina 10-15 mg/kg (1,0 g) 7 10-15 mg/kg (1,o g) 7
Etionamida 15-20 mg/kg (1,0g) 7 15-20 mg/kg (1,o g) 7
Amicocina 15 mg/kg (1,0 g) 1-3 sau 7 - -
Kanamicina - - 15-30 mg/kg (1,o mg) 2 sau 7
PAS 8-12 g 7 200-300 mg/kg (10 g) 7
Levofloxacin 500-1000 mg/kg 7 - -
Moxifloxacin 400 mg/kg 7 - -
Gatifloxacin**** - - - -
*: Pacieni pn la vrsta de 15 ani; **: Nu a fost aprobat pentru utilizare la copii; ***: Dozele pot fi ajustate la
pacienii HIV-pozitivi; Nu a fost aprobat petru utilizare de lung durat la copii i adolesceni.

6.2.3. Regimuri terapeutice

Centrul pentru Controlul i Prevenia Bolilor, 2003 i OMS reco-mand

diverse regimuri de tratament n funcie de mai muli factori, cum ar fi:
- localizarea i gravitatea bolii;
- rezultatele examenului sputei;
- infecia asociat cu virusul HIV;
- prevalena rezistenei la medicamentele utilizate;
- medicamente disponibile, costul tratamentului i supravehere me-dical;
- tratamente atituberculoase anterioare aplicate pacientului;
- bugetul alocat pentru sntate public;
- dac serviciile de sntate public acoper n ntregime teritoriul i
gradul de calificare al personalului din sntate la nivel teritorial.

299
 OMS sugereaz alegerea i instituirea unui regim de tratament
antutuberculos n funcie de forma evolutiv a bolii, astfel:
a). Categoria a I-a, cuprinde pacienii programai pentru tratament cu
maxim prioritate, depistai pentru prima dat (cazuri noi de tuberculoz), cu
examenul sputei pozitiv i pacienii cu examenul sputei nega-tiv dar cu tuberculoz
pulmonar extins n aproape tot parenchimul pulmonar precum i pacienii cu
HIV/SIDA sau cu forme severe de tuber-culoz extrapulmonar;
b). Categoria a II-a : pacienii care revin la tratament sau la care
tratamentul anterior a euat;
c). Categoria a III-a: pacienii nou nregistrai cu tuberculoz
pulmonar, alii dect cei din categoria a I-a , cu examenul sputei negativ, la care se
constat dispariia formelor severe extrapulmonare;
d). Categoria a IV-a: pacienii cu tuberculoz cronic i examenul
suptei pozitiv, confirmai sau suspeci de infecie cu sue micobacteriene
multirezistente la amedicamentele antituberculoase (MDR).
Centrul de Control i Prevenie a Bolilor, SUA (CDC-USA), reco-mand
suplimentar pentru pacienii din grupa I-a tratamente n faz continu cu INH i
Rifam-pectine, o dat pe sptmn, timp de 4 luni (18).
Acest regim de tratament poate fi utilizat cnd examenul sputei pentru
BAAR s-a negativat dup primele 2 luni, dar n cazul n care examenul sputei este
nc pozitiv, tratamentul trebuie continuat pe o perioad de 9 luni.
. Pacienii cu infecie mixt (TB+HIV), nu trebuie ncadarai n regim de
tratament continuu, cu Rifampectine.
. Pacienii cu tuberculoz pulmonar cavitar: se va prelungi faza
continu de tratament la 7 luni dac dup primele 2 luni de tratament examenul
bacteriologic n cultur este nc pozitiv.
Dac se constat rezisten la medicamentele folosite , acestea vor fi
nlocuite cu combinaii de cel puin 3 medicamente pe care pacientul nu le-a primit
niciodat i care sunt confirmate c nu produc rezisten ncruciat cu
medicamentele folosite anterior. n asemenea situaii, tratamentul este de lung
durat , cu grad ridicat de toxicitate, mai scump i eficiena se reduce simitor,
comparativ cu medicamenele duin prima linie , administrate sub observaie direct.
. La copii, pot fi instituite aceleai regimuri terapeutice ca la aduli, cu
condiia eliminrii din schema de tratament a EMB care prezint toxicitate ridicat
la aceast categorie de vrst.
De asmenea, Rifampentina nu a fost aprobat pentru a fi utilizat n
pediatrie.
. La femeile gravide, pot fi prescrise regimuri terapeutice ca la br-bai
dei SM i unele medicamente din linia a 2-a: aminoglicosidele nu vor fi
administrate pentru c produc ototoxicitate la fetus.
Cercetrile n domeniu s-au concentrat asupra caracteristicilor
farmacodinamice i fenomenelor adverse ale PZA, INH, RIF i EMB la femeile
gravide, constatndu-se c acestea sunt compatibile cu perioada de alptare dar
sugarii ar trebui s beneficieze de tratament prin laptele matern pe o peroad de cel
puin 3 luni dup ce testele specifice pentru tuberculoz, efectuate mamei s-au
negativat.

300
 . Regimul medicamentos pentru bolnavii HIV/SIDA, este cel prescris n
cazurile cu tuberculoz activ datorit riscului crescut de a contracta tuberculoz
pulmonar i/sau extrapulmonar sau infecii cu alte micobacerii oportuniste (108).
Severitatea efectelor adverse ale medicamenelor antituberculoase este
excesiv la pacienii HIV/SIDA datorit interaciunii acestora cu medica-mentele
antiretrovirale , motiv pentru care i mortalitatea este mai ridicat n rndul acestor
bolnavi. Deobicei, pacienii pozitivi HIV rspund mulumitor la trtamentul
antituberculos standard de scurt durat; insuccesle nregistrate pot fi atribuite
capacitii reduse a tubului digestiv al acestor pacieni de a absorbi medicamentele
antimicobacteriene (malabsorbie).
Pe de alt parte, OMS nu recomand utilizarea SM sau Tiacetazonei la
pacienii HIV pozitivi din cauza frecventelor cazuri de reacii adverse amplificate
i de asocierea acestor medicamente cu cele retrovirale. De asemenea, Rifampicina
i Rifanbutina interacioneaz cu unele medicamente folosite n terapia retroviral.
Aceste medicamente intervin n metabolismul agenilor retrovirali prin blocarea
revers-transcriptazei de ctre inhibitori non-nucleozidici, cum este zidovudina i
inhibitori ai proteazei.
La pacienii HIV/SIDA pot fi prescrise regimuri terapeutice bazate pe
INH, EMB, PZA i SM, administrate zilnic timp de 2 luni i n continuare INH, PZA
i SM, sptmnal timp de 7 luni. Totui completarea tratamentului antituberculos
cu RIF, mbuntete rezultatele la pacienii HIV.
. La pacienii asimptomatici, la care testul tuberculinic este pozitiv, fr a
prezenta forme de tuberculoz activ (tuberculoz latent) dar cu risc de reactivare
a bolii,n special la bolnavii HIV se recomand numai INH n doze de 300 mg/zi
timp de 6-9 luni, cu toate c exist riscul apariiei rezistenei bacililor la INH (8, 18,
103) dar dac se suspecteaz acest fenomen INH poate fi nlocuit cu RIF, PZA sau
EMB dei este posibil s apar reacii adverse. Cu toate acestea administrarea RIF
la concuren cu INH, reduce tratamentul profilactic la 3 luni.
Acceptarea din partea pacientului a regimului terapeutic complet, pe toat
durata prescris i cooperarea cu personalul medical sunt de importan
primordial pentru vindecarea complet i succesul tratamentului dar mai ales
pentru prevenirea instalrii rezistenei la medicaia antituberculoas. Din acest
motiv, bolnavul supus regimului terapeutic antituberculos trebuie supravegheat
permanent. Aceste deziderate sunt de multe ori dificil de rea-lizat; de aceea, s-a
recurs la administrarea medicamentelor de 3 ori, de 2 ori/zi i apoi sptmnal
pentru a facilita participarea continu a pacientului la tratament i monitorizarea
lui.

6.2.4. Preparate medicamentoase disponibile.

Majoritatea medicamentelor utilizate n tratamentul antituberculos (INH,

RIF, Rifapentina , Rifabutin, PZA, EMB i Etionamida-ETH) sunt dis-ponibile
comercial sub form de tablete sau capsule i pot fi administrate oral.
Totui, INH poate fi achiziionat i sub form de granule destinate trata-
mentului antituberculos n pediatrie i soluii apoase pentru injecii intravenoase.
RIF este disponibil subform de pudr pentru prepararea suspensiilor
administrate oral i sub form de soluii apoase pentru injecii intravenoase sau
intramusculare.
Aminoglicosidele (SM, Kanamicina i Amicacina) i Capreomicina fac
excepie fiind disponibile numai sub form de soluii apoase injectabile iar PAS este

301
disponibil sub form de granule care se administreaz n amestec cu bolul
alimentar sau tablete precum i sub form de soluii injectabile.
Fluorochinolonele sunt disponibile sub form de tablete sau soluii
injectabile.
Cele 3 medicamente pricipale utilizate n regimul standard anti-tuberculos
(INH, RIF, PZA) pot fi combinate ntr-un singur preparat, n doze fixe (77, 18, 113).
Exist diverse combinaii: INH+RIF; INH+EMB; INH + RIF + PZA i INH + RIF
+ PZA + EMB. Dac aceste combinaii de medicamente sunt disponibile, ele trebuie
utilizate pentru c reducerea numrului de tablete administrate o singur dat,
crete ncrederea pacientului, accept mai uor tratamentul i coopereaz mai bine
cu personalul medical , dar aspectul cel mai important este acela c utilizarea
preparatelor combinate reduce simitor riscul instalrii rezistenei micobacteriilor
la medicamente.

6.2.5. Structura, aciune farmacodinamic i toxicitatea

medicamentelor antituberculoase.

n acest subcapitol sunt prezentate structura, proprietile generale,

aciunea framacodimac i toxicitatea principalelor medicamente utilizate n
tratamentul tubercu-lozei aa cum cum au fost publicate n mai multe lucrri de
specialitate (18,28, 34, 54, 71, 95, 116).

1. Izoniazida (INH).

Structur i proprieti generale.

Izoniazida (INH) este un pro-medicament care necesit procesare de ctre
enzima catalaz-peroxidaza bacterian pentru a deveni activ. Odat acti-vat,
izoniazida (INH) inhib biosinteza acizilor micolici care sunt com-ponente eseniale
ale peretelui celulei micobacteriene. Acest medicament este bactericid mpotriva
bacililor cu metabolism activ i bacteriostatic pentru bacilii reziduali.
INH este activ mpotriva Mycobacterium tuberculosis, Myco-bacterium
bovis i Mycobacterium kansasii. Fa de tulpinile susceptibile de M. tuberculosis,
concentraiile minime inhibitorii se ncadreaz ntre 0,02 i 02, mg/l.
INH (hidrazida acidului N-izotonic: C8H7NO3, masa molecular: 137,1),
este unul dintre multe medicamente cu putere total mpotriva M. tuberculosis.
Activitate farmacodinamic.
INH este absorbit n tractusul gastrointestinal, dei unele referine susin
c medicamentul se absoarbe mai slab n prezena alimentelor din lumenul
intestinal. Absoria este destul de bun atunci cnd INH este administrat prin
injecii intra musculare (i.m.). Vrful concentraiei din sn-ge, de 3,0-8,0 mg/l, se
nregistreaz dup 1-2 ore de la ingerarea a 300,0 mg INH.
Medicamentul difuzeaz uor n toate esuturile corpului, inclusiv n
lichidul cefalorahidian.
INH este metabolizat n ficat i n intestinul subire mai nti, de ctre
INH-N-acetiltransferaza acetilat, care produce izoniazida i apoi un produs compus
este suplimentar acetilat n diacetil hidrazid.
Nici unul din aceti metabolii derivai din INH nu au nici o activitate
antituberculoas.

302
 In funcie de procesul de acetilare (determinat genetic) a INH n intestinul
subire, pacienii tuberculoi se ncadreaz n dou grupe:
- pacieni la care intestinul subire acetileaz lent INH;
- pacieni la care intestinul subire acetileaz rapid INH.
Concentraiile INH din plasm sunt mai sczute la pacienii cu aceti-lare
rapid a INH n intestin comparativ cu pacienii cu proces de acetilare lent unde
concentraiile din plasm sunt semnificative. Aceste diferene nu au efecte notabile
asupra eficienei tratamentului.
INH i metaboliii si se elimin prin urin.

Toxicitate.

n dozele recomandate, INH este bine tolerat cu toate c la pacienii cu

procese de acetilare slab pot acumula concentraii crescute de INH i la acetia
exist risc crescut de apariie a fenomenelor adverse.
ntre 10 20 % dintre pacieni pot dezvolta creterea tranzitorie a
enzimelor hepatice la nceputul tratamentului. La aceste persoane, admini-strarea
INH trebuie s fie stopat.
Funcia hepatic va fi monitorizat nainte i n timpul tratamentu-lui, n
special la acei pacieni cu disfuncii hepatice i/sau renale constate anterior
tratamentului. La acetia, dozele trebuie reduse pentru a preveni alterarea grav a
funciilor hepatice i/sau renale.
Efectele neurologice sau hematologice i reacii de hipersensibilitate au
frecven destul de redus.
O doz zilnic de 10,0 mg. de piridoxinhidroclorat se recomand pentru a
reduce toxicitatea neurologic i pentru a preveni apariia fenomene-lor adverse
cauzate de INH.

2. Rifampicin (RIF).

Structur i proprieti generale

Se mai numete i rifampin i se prezint ca o pudr de culoare rou-brun
cristalin puin solubil n ap dar se dizolv n alcool metilic i poate fi stocat la
temperatura camerei protejat de lumin.
RIF inhib transcripia genei, prin interaciunea cu subunitatea enzimei
polimeraza acidului ribonucleic (ARN). Este bactericid pentru micobacterii n
diviziune dar i impotriva bacililor non-divizibili. M. tuber-culoasis este sensibil la
0,1 2,0 mg/l.
Utilizarea RIF contribuie la reducerea duratei tratamentului de la 1 an la 9
luni i n asociaie cu PZA durata tratamentului se reduce la 6 luni.
RIF este activ nu numai fa de micobacterii dar activitatea bacteri-cid se
exprim faa de un larg grup de microorganisme, cum sunt: stafilo-coci, Neisseria
spp., Haemophilus influenzae i Legionella spp.

Activitate farmacodinamic.

Acest medicament este absorbit uor n tractusul gastrointestinal (dar

coninutul alimentar din tubul digestic scade absorbia); n decurs de 2-4 ore de la
ingerarea dozei de 600 mg. concentraia maxim n plasm poate fi de 7 -10 mg/l.

303
 RIF poate fi administrat prin injecii intravenoase. n snge RIF este legat
de proteinele plasmatice, i difuzat n toate esuturile i umorile corpului, inclusiv
n lichidul cefalorahidian i n laptele matern i traverseaz bariera placentar.
Perioada vieii medii a RIF este ntre 2 i 5 ore. Medicamentul este
metabolizat n ficat i excretat n bil, fecale i urin.

Toxicitate.

RIF este bine tolerat, cu toate c efectele pot s apar n cursul teraiei
intermitente sau cnd s-a reluat tratamentul dup o perioad de ntrerupere.
Efectele adverse sunt diverse i ele afecteaz tractusul gastro-intestinal, pielea,
rinichii i sisteml nervos. RIF poate produce de asemenea trombocitopenie.
n ura tratamentului cu RIF, umorile corpului, cum ar fi: urina, lacrimile,
saliva, transpiraia, sputa i fecalele, se coloreaz n rou-portocaliu.
Datorit faptului c medicamentul este metabolizat n ficat, funciile
acestuia trebuie controlate naintea nceperii tratamentului i monitorizate regulat
pn la terminarea trtamentului. Atenie deosebit trebuie acordat pacienilor cu
boli hepatice preexistente. La analizele biochimice poate fi observat o cretere
moderat a fosfatazei caline.

3. Pirazinamida (PZA).

Structur i proprieti generale.

Pirazinamida (Acidul amid-pyrazinoic: PZA), pudr de culoare alb
cristalin, solubil n ap este un medicament cu aciune bactericid numai
mpotriva Mycobacterium tuberculosis i lipsit de activitate in vitro mpotriva
altor micobacterii sau oricror microorganisme. Susceptibilitatea M tuberculosis
este evident la 20,0 mg. PZA/l la pH 5,6. Acivitatea PZA se manifest att
mpotriva bacililor tuberculoi activi n diviziune ct i mpotriva bacililor n stare
de laten precum i mpotriva formelor bacilare reziduale intracelulare, devenind
inactiv la pH neutru.

Introducerea PZA n regimul terapeutic antituberculos determin

reducerea duratei tratamentului la 6 luni.
PZA este un pro-medicament xare necesit conversia n acid pirazi-noic
pentru a fi eficient aceast conversie se realizeaz cu ajutorul pirazin-amidazelor.

Aciune farmacodinamic

PZA se administreaz pe cale oral i este uor absorbit n tubul

gastrointestinal. Concentraiile serice ating vrful maxim de 66 mg/l. la 2 0re de la
administrarea medicamentului. Difuzeaz n toate esuturile corpului i n umori ,
inclusiv n lichidul cefalo-rahidian i n laptele matern. Perioada medie de
remanen este de 9-10 ore. PZA este hidrolizat n ficat, unde este convertit n acid
pyrazinoic i ulterior hdrolizat i excretat n urin.

Toxicitate.

PZA este hepatotoxic n manier dependet de doz.

304
 Ca urmare a dozei zilnice de 3,0 mg PZA, 15,0 % dintre pacieni pot
prezenta afeciuni hepatice, cum ar fi: creterea tranzitorie a enzimelor hepatice.
Hepatomegalie, splenomegalie i icter. Hepatita a fost raportat la 3,0 % din cazuri.
De asemenea PZA poate produce hiperuremie precursoarea gutei. De
aceea, se recomand testele hepatice nainte i n timpul tratamentului i nu trebuie
administrat pacienilor cu boli hepatice preexistente sau la cei cu antecedente de
gut.

4. Etambutolul (EMB).

Este o pulbere cristalin de culoare alb cu masa molecular de 277,2,

solubil n ap i alcool care poate fi stocat ferit de aer.
EMB este utilizat pentru trtamentul TB i a altor micobacterii oprtuniste
netuberculoase, cum este Mycobacerium kansasii. M. tuberculosis devine sensibil
la doze de 0,5-8,0 mg/l. EMB este activ numai fa de micobacteriile n diviziune;
mpotriva formelor n stare latent el devine bacteriostatic.
ntruct afecteaz biosinteza peretelui celular, s-a sugerat c EMB
contribuie la creterea susceptibilitii M. tuberculosis la alte medicamente.

Aciune farmacodinamic.
Etambutolul (EMB) se administreaz pe cale oral i el este bine absorbit
n tractusul gastrointestinal ( nu este afectat semnificativ de prezena resturilor
alimentare ) cu toate c parial este excretat n fecale. Dup absorbie,
medicamentul difuzeaz n toate esuturile corpului, n lichidul cefalorahidian i
laptele matern; traverseaz de asemnea bariera placentar. Vrful concentraei de
5,0 mg/l. n ser, se nregistreaz dup 4 ore de la administrarea a 25,0 mg EMB/kg.
greutate corporal. Remanena medicamentului n organismul uman este de 3-4
ore. Numai o fraciune din EMB este metabolizat n ficat; restul medicamentului
nemodificat i metaboliii si sunt excretai n urin.

Toxicitate.

EMB produce inflamaii neuronale retrobulbare cu reducerea acutitii

vizuale, constricia cmpului viziual, pn la orbire unilateral sau bilateral (35).
Severitatea afeciunilor nervoase i oculare depinde de doza i durata tramentului.
Deobicei, vederea revine la normal la cteva sptmni dup terminarea
tratmentului, cu toate c, n unele cazuri, vederea poate s revin mai trziu, dup
cteva luni.
De aceea, tratamentul cu EMB este contraindicat la persoanele cu afeciuni
ale nervilor optici i trebuie utilizat cu precauie la persoanele cu afeciuni oculare.
Sunt necesare examene oftalmologice amnunite nainte i n timpul
tratamentului. EMB nu se administreaz copiilor pn la vrsta de 6 ani, la acetia
fiind dificil moni-torizarea acuitii vizuale, doar dac este suspectate rezistena
micobacteriilor la INH i RIF.
Alte efecte adverse se refer la reducerea excreiei urailor care genereaz
apariia gutei, tulburri gastrointestinale i hipersensibilitatea pielii.

5. Streptomicina (SM).

Structur i proprieti generale.

305
 Streptomicina (SM) se prezit ca o pulbere cristalin de culoare alb, cu
grad ridicat de higroscopicitate, solubil n ap care trebuie stocat n flacoane
nchise etan. Masa molecular a SM este 581,6.
SM este un antibiotic produs de unele tulpini de Streptomyces gri-seus. A
fost primul medicament descoperit, cu aciune antituberculoas. Cele mai multe
tulpini de M. tuberculosis sunt sensibile la 1-8 mg/l.
Medicamentul poate fi folosit pentru tratamentul altor infecii bacteriene
cum ar fi: Yersinia pestis, Frascinella tularensis i Brucella spp.

Aciune farmacodinamic.

Streptomicina (SM), asemenea majoritii aminoglicozidelor, se absoarbe

greu la nivelul mucoase gastriintestinale i de aceea, trebuie admini-strat n
injecii intramusculare (i.m.).
Utilizarea SM n tratamentul tuberculozei este din ce n ce mai rar
datorit toxicitii crescute i introducerii altor medicamente care se admini-streaz
pe cale oral precum i producerii de tulpini rezistente la medica-mente
antituberculoase.
La 2 0re dup injectarea a 1,0 g, nivelul SM n snge atinge 50,0 mg/l.
unde 1/3 din cantitate se gsete legat de proteinele plasmatice. Durata medie de
via este de 2,5 ore.
SM i alte aminglicozide difuzeaz uor n majoritatea lichidelor
extracelulare, cu excepia lichidului cefalorahidian. Difuzeaz extrem de uor n
perilimfa urechii interne producnd efecte ototoxice. Aminoglicozidele au tendina
de a se cumula n esuturile corpului, cum ar fi rinchii. SM nu este metabolizat ,ea
se elimin nemodificat n urin.
Prezena altor boli poate afecta aciunea farmacodinamic a SM. Aceast
concuren a diferitelor boli cu acune supra SM devine relevant ntruct exist
diferene nesemnificative ntre dozele teraputice i toxicitatea aminoglicozidelor.
Pacienii cu afeciuni renale vor avea concentraii plasma-tice crescute de SM, n
timp ce pacienii care sufer de boli ascitogene, cum ar fi ascite, ciroze, insuficien
cardiac, malnutriie), concentraiile plasmatice ale SM sunt reduse.

Toxicitate.

Asemenea majoritii glcozielor, SM are efecte ototoxice, afectnd

vestibulul auricular mai mult dect funcia auzului, care se manifest prin ameeli i
dezechilbru.
SM este slab nefrotoxic comparativ cu celelalte aminoglicozide, dei poate
produce disfuncii renale cnd este administrat mpreun cu ali ageni nefrotoxici .
De aceea, pacienii supui tratamentului cu SM trebuie monitorizai prin analize de
specialitate ORL i urologice. n cazul cnd se nregistreaz fenomene adverse
extreme se recomand eliminarea SM prin dializ
Este posibil s apar i alte fenomene advesre dup injecii cu SM, cum
sunt: parestezia, simpotome neurologice, neuropatii periferice, inflamaii al
nervului optic i tulburri ale vederii i reacie de hipersenzibiltate a pielii (prurit).

Alte medicamente antituberculoase.

Medicamentele din acest grup prezint interes din mai multe motive:

306
 . Larg utilizate n trecut dar n prezent ele sunt declasate prin incadrarea n
grupa medicamentelor mult mai efeciente i/sau mai puin toxice;
. Se utilizeaz atunci cnd este suspectat sau a fost confirmat rezistena
la medicamentele antituberculoase din prima linie;
. Se utilizeaz cnd se constat fenomene adverse la alte medicamente
anti-tuberculoase;
. S-au descoperit recent i de aceea fac parte potenial din prima linie i n
consecin s fie incorporate n schemele de tratament antituberculos standard.
. Pot fi adminitrate n doze intermitente ceeace faciliteaz acceptarea
tratamentului de ctre pacient.

1. Acidul paraaminosalicilic (PAS).

Acest compus i srurile sale sunt active numai mpotriva M. tuberculosis

care este inhibat la doza de 1,0 g de PAS/l. PAS poate fi administrat pe cale oral n
doz zilnic de 10-12 g., divizat n 2-3 reprize. Este bine absorbit de mucoasa
tractusului gastrointestinal i difuzeaz uor n tot corpul , dei n lichidul
cefalorahidian se gsete n cantiti neglijabile. Este metabolizat n intestin i n
ficat i este excretat n special n urin.
PAS produce efecte digestive, cum ar fi: grea, vomismente, diaree i
reacii de hipersensibilitate motiv pentru care trebuie administrat cu pecauie la
pacienii cu afeciuni hepatice i renale. Poate fi utilizat n siguran la femeile
gravide dar nu este recomandat datorite intoleranei gastrointestinale.
Utilizarea PAS a devenit tot mai rar n ultimul timp datorit introducerii
n regimurile terapeirice a RMP i EMB; datorit preului redus, medicamentul se
utilizeaz mai frecvent n rile cu resurse finaciare reduse.

2. Capreomicina.

Este un polipeptid cu aciune bacteriostatic fa de numeroase

micobacterii inclusiv fa de M. tuberculosis; tulpinile susceptibile sunt inhi-bate la
doza de 10,0 mg/l. capreomicin.
Dozele uzuale de 1,0 g. se administreaz n infecii intramusculare sau
intravenoase.
Medicamentul este excretat n urin i de aceea trebuie administrat cu
precauie la pacienii cu afeciuni renale, hepatice sau cu disfuncii audi-tive.
Capreomicina afecteaz frecvena urinrii sau cantitii de urin
elminat, creterea senzaiei de sete i scderi ale apetitului, grea i vomis-mente.
Datorit efectelor toxice capreomicina trebuie administrat n com-binaie
cu aminoglicozidele kanamicina sau streptomicina.

3. Cicloserina.

Aceste este un antibiotic cu spectru larg care inhib majoritatea

microorganismelor, cum sunt: E.coli, Staphylococcus aureus, Nocardia spp.,
Chlamydia i M. tuberculosis.
Datorit toxicitii ridicate cicloserina este utilizat numai mpotriva
bacililor rezistenti la principalele medicamente antituberculoase.

307
 Doza de 500,0 mg se adiministreaz de dou ori pe zi pe cale oral. Este
destul de bine absorbit de tubul gastrointestinal i difuzeaz n majoritatea
esuturilor i lichidelor corpului, inclusiv n lichidul cefalorahi-dian.
Cicloserina este matobolizat i excretat n urin de aceea trebuie
administrat cu precauie n cazurile cu afeciuni renale .
Medicamentul produce duiverse reacii adverese care implic sistemul
nervos central: dureri de cap, agitaie pn la psihoz sever i agre-sivitate motiv
pentru care este contraindicat la bonavi de epilepsie, cei cu drepresie sau anxietate.
De asemenea, se poate constata hieprsensibilitate dermic.

4. Aminoglicozidele.

Amicacina i kanamicina, sunt active mpotriva unui mare grup de

bacterii care include i M.tuberculosis.
Amikacina este activ de asemenea fa micobacterii atipice care produc
infecii oportuniste, cum este complexul Mycobacterium avium.
Ambele medicamente sunt considerate ca fcnd parte din linia a 2-a; sunt
preferate alte medicamente care prezint siguran pentru tratamentul
tuberculozei.
Aceste medicamente sunt deseori combinate cu EMB, ciclofoxacina i
macrolide. Asemenea streptomicinei (SM), amikacina i kanamicina se
administreaz prin injecii intramusculare, deobicei n doze de 0,2-1,0 g. Dup
administrare amikacina i kanamicina difuzeaz n toate esuturile i lichidele
corpului cu excepia lichidului cefalorahisdian. Asemenea majoritii
aminoglicozidelor, amicacina i kanamicina afecteaz funcia auditiv motiv pentru
care se va acorda mult atenie pacienilor cu disfuncii auditive. De asemenea cele
dou medicamente produc fenomene nefrotoxice cu tulburri ale funciei renale la
aproximativ 8,0% dintre pacieni.
Kanamicina poate produce unele efecte gastrointestinale, cum ar fi: greaa,
vrsturi, stomatite n special cnd medicamentul vine n contact cu mucoasa
bucal.
Ambele medicamente sunt excretate n urin nemodificate.

5. Thioamidele.

Exist dou medicamente pricipale din familia thioamidelor care pot fi

utilizate n tratamentul tuberculozei: ETH i prothionamida.
Ethioamida (ETH), are structur analog cu INH demonstrat prin
prezena unei rezistene ncruciate la ambele medicamente.
ETH este activ fa de M. tuberculosis, M. leprae, M. kansasii i fa de
unele tulpini din complexul M. avium. Tulpinile M.tuberculosis susceptibile la ETH
sunt inhibate la doze de 0,2-2,5 mg/l.
Pentru tratamentul tuberculozei, dozele de 15,0-20,0 mg ETH/ kg greutate
corporal se administreaz pe cale oral pn la doza de 1,0 g zilnic.
Este bine absorbit de mucoasa gastrointestinal i difuzeaz n toate
esuturile i licidele corpului,inclusiv n lichidul cefalorahidian. Perioada medie de
remanen n organism este de 2 ore.
ETH este metabolizat n ficat i excretat n urin ceeace nseamn c
acest medicament nu trebuie administrat paciencilor cu disfuncii hepatice.

308
 Efectele adverse provocate de acest mediucament se refer la tulburrile
gastrointestinale, cum ar fi: anorexia, salivaie excesiv, grea, vomismente, dureri
abdominale i diaree. De asemenea produce tulburri mentale: depresie, axietate,
psihoz, ameeli, somnolen i dureri de cap i hipersensibilitate dermic.
Protionamiamida, este foarte asemntoare cu ETH, de aceea s-a observat
frecvent rezisten ncruciat ntre ele dou medicamente.
Se poate administra pe ale oral n doze similare cu ETH. Este bine
absorbit de mucoasa gastrointestinal i difuseaz uor n esuturile i lichide-le
corpului, inclusiv n lichidul cefalorahidian.
Este metabolizat n ficat i excretat n urin.

6. Fluorochinolonele.

n grupul fluorochinolonelor exist medicamente cu diverse grade de

activitate anti M. tuberculosis (36).
n timp ce norfloxacina nu este activ fa de micobacterii, cipro-
floxacina i ofloxacina sunt frecvent utilizate n tratamentul tuberculozei, n special
cnd se constat prezena suelor M. tuberculosis rezistente la alte medicamente
antituberculoase. De asemenea, ofloxacina este activ fa de micobacteriile
oportuniste.
Celelalte fluorochinolone cum sunt: sparfloxacina, gatifloxacina i
moxifloxacina sunt mult mai active dect ciprofloxacina pentru tratamentul
tuberculozei fiind comparabil cu INH.
Fluorochinolonele sunt bine absorbite de mucoasa gastrointestinal, cu
toate c prezena alimentelor reduce absorbia i concentraiile maxime din plasm
se nregistreaz de regul dup 1-2 ore de la administrare, atunci cnd ele sunt
legate de proteinele plasmatice. Remanena n organism este de la 4 ore n cazul
cirpofloxacinei pn la 10-13 ore n cazul moxifloxacinelor.
Fluorochinolonele difuzeaz uor n toate esuturile corpului i n final
sunt eliminate n urin.
n general, fluorochinolonele sunt bine tolerate n organism feno-menele
adverse se refer la tulburri gastrointestinale , ale sistemului nervos i ale pielii. De
aceea, nu trebuie administrate la pacieni cu tulburri nerv-oase preexistente, cum
ar fi epilepsia.

Fluorochinolonele nu sunt recomandate la copii i la femeile gravide.

Interaciunile cu mai multe medicamente sunt rare.

7. Rifamicinele.

Familia rifamicinelor include: RIF, unul din cele mai potente anti-biotice
din prima linie de medicamente antituberculoase. Din aceast familie mai fact parte
rifabutinul i rifapentina al cror mod de aciune i spectru anti bacterian sunt
similare cu cele ale RIF evideniate prin gradul ridicat de rezisten ncruciat
constat.
Rifapentina i rifabutinul au totui cteva proprieti distincte comparate
cu RIF care le recomand a fi utilizate n dferite situaii.
Rifabutinul, poate fi utilizat n tratamentul tuberulozei n doze de 150 -450
mg. zilnic, combinat cu alte medicamente pentru a evita apariia rezistenei la
medicamente.
309
 De asemnea, este utilizat frecvent pentru profilaxia infeciilor cu M. avium
la pacienii imunocompromii i pentru trtamentul altor infecii micobacteriene
oportuniste.
Rifabutinul este greu absorbit la nivelul mucoasei gastrointestinale dar
ndat ce medicamentul a trecut n circuitul sanguin, legat de proteinele plasmatice,
el difuzeaz n toate esuturile.
Rifabutinul este metabolizat n ficat unde iniiaz eliberarea de enzime
microsomale.
Rifabutinul este excretat n urin.
La doze zilnice de peste 1,0 g. pot s apar poliartrite. De asemenea la
pacienii care au primit tratamente cu macrolide i antifungice pot s apar uveite.
Rifabutinul reduce concentraiile plasmatice a diferitelor medica-mente
antiretrovirale cum ar fi zidovudina. Cu toate acestea, rifabutinul, n doze reduse,
este recomandat n locul RIF n tratamentul tuberculozei la pacienii cu HIV/SIDA ,
n scopul eliminrii interaciunilor majore ale RIF cu medicamentele
antiretrovirale.
Rifapentina , este considerat ca fiind o rifamicin cu aciune ndelungat.
Ea poate fi administrat n doze de 600 mg de 2 ori pe sptmn sau o singur
dat pe sptmn la nceputul fazei iniiale a tratmentului tuberculozei (109).
Este bine absorbit n tractusul gastrointestinal.
Rifapentina i RIF prezint rezisten ncruciat.
Fenomenele adverse sunt similare cu cele ale RIF, cu excepia hiper-
uremiei.
Medicamentul nu a fost aprobat pentru utilizare la copii din cauz c la
acest categorie de vrst nu s-au verificat protecia i eficiena.
Rifapentina nu este recomandat la pacienii cu HIV/SIDA din cauza
riscului apariiei rezistenei la rifamicin.

8. Thiacetazona (Thioacetazona).

Acest medicament este un bacteriostatic fa de M. tuberculosis, tulpinile

susceptibile ale M. tuberculosis sunt inhibate la doza de 1,0 mg./l.
Adesea, poate fi observat rezisten ncruciat cu ethionamida i
prothionamida.
Poate fi utilizat n regimurile terapeutice antituberculoase, cu toate c
acest medicament nu a fost eficient n terapia standard de scurt durat. Este bine
absorbit n tubul digestiv i concentraia maxim de 1-2 mg./l. se nregistreaz
dup 4 ore de la administrarea dozei de 150 mg.
Thiacetazona se elimin n urin. Medicamentulproduce diverse fenomene
adverse, precum: tulburri gastrointestinale i reacii de hiper-sensibilitate, iclusiv
urticarie, mult mai frecvente la nolnavii HIV/SIDA. De asemenea, pot s apar:
conjunctivite, ameeli, dermatite toxice necrolitice, dermatite exfoliative, cu anemie
hemolitic i hepatit toxic cu icter. De aceea thiacetazona nu va fi administrat
pacienilor cu afeciuni hepatice sau a cei cu HIV/SIDA. Unele ri cu venituri
sczute pe cap de locuitor utilizeaz thiacetazona din cauza costului sczut al
acesteia.

6.2.6. Mecanismele rezistenei micobacteriilor la medica-

mentele antituberculoase.

Exist dou tipuri de rezisten a micobacteriilor la medicamentele

antituberculoase: rezistena natural i rezistena dobndit.
310
 Rezistena natural a medicamentelor.

Rezistena natural a medicamentelor anti M. tuberculosis este un

obstacol important pentru tratamentul i controlul tuberculozei. Aceast rezisten
a fost atribuit nveliului celular multistratificat i sitemelor de respingere efflux
(efflux pumps) (27,47).
Ipoteze recente n cadrul mecanismelor care neutralizeaz toxicitatea
antibioticelor n citoplasma celular au evideniat alte si steme care funcio-neaz
sinergic cu bariera de permeabilitate i sistemele efflux pentru a iniia rezisten
natural ( 55, 70).
Rezistena dobndit.

Cunoaterea bazei moleculare a rezistenei M.tuberculosis la medicamente

s-a amplificat n urma secvenierii genomului i descoperirii mijloacelor moleculare
n cercetare (3, 23). La alte specii micobacteriene , rezistena la medicamente este
mediat de plasmide i transposoni, contrastnd cu M. tuberculosis la care rezis-
tena la medicamente dobndit este determinat de gene cromozomale (44). Pn
n prezent nu s-a gsit nici o mutaie pleiotropic n structura M. tuberculosis
resposabil de apariia fenotipului M.tuberculosis rezistente la diferite
medicamente antituber-culoase (MDR).
Rezistena fenotipic la medicamente antituberculoase este deter-minat
de acu-mulri secveniale ale mutaiilor din diferite gene implicate n rezistena
individual la medicamente, datorit tratamentului necorespunz-tor sau
ntreruperii tratamentului (115). Totui este important de precizat c unele tulpini
rezistente nu prezint aceste mutaii clasice, sugernd posibili-tatea existenei altor
mecanisme cum ar fi respingerea efflux (efflux pumps) i alterri ale
permebilitii peretelui celular. Aceste constatri conduc la concluzia c
mecanismele rezistenei micobacteriilor la medicamentele utlizate frecvent n
terapia tuberculozei sunt extrem de diversificate i ele sunt specifice pentru fiecare
medicament n parte; din aceste motive mecanismele apariiei rezistenei vor fi
prezentate separat n cadrul fiecrui medicament sau grup de medica-mente.

Rezistena la izoniazid (INH) i ethionamid (ETH).

Primele indicaii asupra mecanismului de aciune a INH, au fost furnizate

odat cu aplicarea tratamentului cu INH, n urma cruia s-a consta-tat pirderea
rapid a acido-rezistenei bacililor tuberculoi. Mai trziu, s-a constatat c INH
inhib sinteza acizilor micolici cu pierderea acidorezistenei bacililor (11) .
In ciuda structurii simple, n care sunt prezente piridina i grupul
hidrazid, ambele cu activitae ridicat fa de M. tuberculosis, modul de aciune al
INH este extrem de complex.
Un aspect important care trebuie menionat este c aciunea antibiotic a
medicamentului depinde de activarea bacterian de ctre enzima catalaz-
peroxidaz (KatG) (114) pentru a elabora radicali reactivi, care atac mult iple inte
din M. tuberculosis (115). Mecanismele de aciune al INH i ETH sunt similare dar
mecanismele de activare sunt diferite aa nct tulpinile
rezistente la INH datorit mutaiilor surventite n gena KatG, sunt susceptibile fa
de ETH , sugernd c n activarea ETH intervin alte enzime (11).

311
 Rezistena micobacteriilor la INH, este n general asociat cu mutaiile sau
deletrile care survin n gena katG; alte mutaii legate de rezistena INH apar n
regiunea decodoare a genei inhA (sau promotorii acestora) i genei kas A.
n acelai timp au fost identificate mutaii i n alte gene dar acestea sunt
cu frecven redus i legtura lor cu rezistena la INH este neclar (86).
Corleaia ntre expresia pronunat a ahpC i rezistena la INH a fost
investigat dovedindu-se c o cretere a expresiei ahpC suplinete pierderea sau
scderea activitii catalazice produs de alterarea genei katG. Probabil aceast
cretere a expresiei ahpC nu are nici o legtur cu rezistena la INH (87, 98). Relativ
recent au fost identificate i alte mecanisme de rezisten la INH n urma studiilor
pe M. smegmatis care este de 300 de ori mai rezistent dect M. tuberculosis .
Aceste mecanisme se bazeaz pe sistemele efflux pumps (21, 22).
Rezistena la rifampicin (RIF).

RIF este o ansamicin lipofilic, considerat mpreun cu INH baza

tratamentu-lui de scurt durat (87).
RIF se ascociaz cu subunitatea a polimerazei acidului ribonucleic
(ARN) inhibnd alungirea ARN-mesager (11). ARN-polimeraza este un oligo-mer
format dintr-un nucleu ezimatic, catalitic competent alcturit din 4 sub-uniti:
dou subuniti , o subunitate i o subunitate care se ascociaz cu alte
subuniti sigma, capabile s iniieze transcripia genttic (115).
Ca i n cazul Escherichia coli, mjoritatea izolatelor clinice de M.
tuberculosis rezistente la RIF prezint mutaii pe gena rpoB care codific beta-
subunitile ARN polimeraz rezultnd modificri conformaionale importante
care determin afinitate sczut a acestor subuniti la RIF i, n consecin
rezisten la medicament (49, 109).

Mutaiile care onfigureaz rezistena la RIF se gsesc segmente scurte

situate n regiunea central a subunitilor ale genei:
- segmentul I constituit din aminoacizii 512 534;
- segmentul II constiutit din aminoacizii 563-574;
- segmentul III conine numai aminoacidul 687 (115).
Cutoate c mutaiile n rpoB sunt responsabile de grad ridicat de rezisten
i frecven crescut a rezistenei ncruciate cu alte rimfamicine, mutaiile la
codonii 511, 516, 518, 522, 529, 533 au fost implicate n scderea nivelului de
rezisten la RIF i/sau al susceptibilitii la rifabutin i rifamicin KRM 1648 (12, 17,
64, 119, 110).

Rezistena la pirazinamid (PZA).

Din punct de vedere structural, PZA este similar cu nicotinamda i este

convertit n acid pirazinoic de pirazin amidaza bacterian (Pz-aza) (52).
Este activ fa de bacilii tuberculoi somnoleni ( inactivi).
Introducerea PZA n tratamentul primar al tuberculozei a permis
reducerea tratamentului de la 9 luni la 6 luni. Aceast proprietate a fost atribuit
capacitii PZA de a inhba bacilii somnoleni n medii acide (65).
Aciunea antimicrobian a PZA este specific fa de M. tuberculosis cu
activitate slab sau inactiv fa de alte micobacterii, cum este: M. bovis.
Explicaia specificitii PZA fa de M. tuberculosis se refer la capacitatea
medicamentului de a aciona numai n stare activat de ctre enzi-ma
priazinamidaza (PZA-za), elaborat n cantiti insuficiente de M. bovis.
312
 Pe de alt parte n structura genomic a M.bovis nu se produc mutaii
speci-fice pentru rezisne la PZA aa cum s-au identificat n cazul unor tulpini
rezistente de M. tuberculosis unde regiunea de codare a genei pncA, respon-sabil
de mutaiile consatate la tulpinile M.tuberculosis rezistente la PZA nu prezint nici
o alterare.
n alceai timp s-a emis o ipotez potrivit creia rezistena unor tulpini de
M.tuberculosis ar fi rezultatul unor mutaii sur-venite n gena reglatooare pscA
necunoscut (20).

Rezistena la etambutol (EMB).

EMB este un compus sintetic utilizat ca medicament din prima linie n

tratamentul tuberculozei, n combinaie cu alte medicamente conform
recomandrilor OMS.
S-a demonstart c EMB acioneaz asupra enzimelor implicate n
biosinteza arabinogalactanilor(105) inhibnd polimerizarea arabinomananului din
peretele celular, arabinogalactanului i lipoarabinomananului (62).
n structura genomic a M. tuberculosis, operonul emb are 3 gene : embC,
embA i embB care codific arabin-ozil-transferazele micobacteriene (106),
considerate inte pentru EMB. S-a dovedit c substituirea codonului 306 din embB
al M. tuberculosis este cea mai frecvent i predictiv mutaie ntlnit la tulpinile
rezistente la EMB (102). Tulpinile M. tuberculosis la care s-au produs
reamplasamente Met-306Leu sau Met306 Val, au prezentat EMB MICs mai
ridicate (40 mg/l) dect tulpinile cu substituiri n Met306Ile (20 mg/l).
Cercetrile genetice ulterioare au identificat dect cele embB alte mutaii
aso-ciate cu rezistena la EMB care afecteaz secvena putativ reglatoare din
regiunea inter-genic embC-embA (85).
Rezistena la streptomicin (SM).

Streptomicina (SM) este un antibiotic glicozidaminociclic, utilizat prima

dat n tratamentul tuberculozei.
Inhib iniierea tranlatrii mARN. Mutaiile din genoml M. tuber-culosis,
asociate cu rezistena la SM, au fost identificate n ARN ribosomal-16S (rARN)
gena rrs i gena rpsL care codific proteina ribozomal S12 (31). Majoritatea
punctelor n care se produc cele mai multe mutaii comune schimbrilor survenite
n configuraia lanurilor de aminoacizi, cum ar fi: AAG n AGG din codonul 43
avnd ca rezultat subtituirea Lys n Arg.
Frecvena schimbrilor AAG n AGG i substituirea Lys n Thr observate de
Bottger 1994 i Musser 1995 a fost redus (13).
Un mecanism secundar al rezistenei bacililor tuberculoi la SM se refer
la mutaia n rrs care survine n genomul unor tulpini. Mutaiile n rrs mpreun cu
cele rpsL au fost identificate 50 % i respectiv 20% dintre izolatele clinice rezistente
la SM la nivele riidcate sau intermediare. Unele izolate clinice ale M. tuberculosis la
care s-au constatat nivele sczute de rezisten nu au prezentat mutaii n rpsL sau
rrs (115).
Un alt mecanism care explic schimbrile n concentraiile
intracitoplasmatice ale SM este legat de activarea sitemului effluent pumps la
unele tulpini de M. tuber-culosis care ar putea s reprezinte baza molecular a
rezistenei la SM (3, 61, 100).

313
Rezistena micobacteriilor la Fluororchinolone.
 Principalele inte ale fluorochinolonelor sunt enzimele: ADN-gyraza i
ADN-top0izomeraza tip II , compuse din dou subuniti A i B codate de genele
gyr A i res-pectiv gyr B i ADN-topoizomeraza tip IV (29).
Aceasta este topoizomeraza tip II codificat numai n genomul
M.tuberculosis (23) i deci este unica int pentru fluorochinoloni (7).
Ineraciuni medicamentoase.

n general, cnd dou sau mai multe medicamente sunt administrate

simultan la un pacient, exist posibiltatea ca acele medicamente s inter-acioneze
n tre ele.
Aceast interaciunese manifest prin:
- modificri ale concentraiilor, fie n cretere fie n scdere a unui singur
medi-cament sau mai multor medicamente;
- mbogirea efectelor adverse produse de unul dintre medica-mentele
administrate, care se rezolv prin utilizarea alternativ a medica-mentelor care nu
sunt afectate de interaciune.
Dup cum este bine cunoscut, tratamentul antituberculos se bazeaz pe
utilizarea a cel puin dou medicamente, n unele situaii, admnistrate simultan i
cu alte egimuri medicamentoase (exemplu: tratamentul anti-retroviral asociat cu
cel antituberculos. De aceea, este extrem de important s se cunoasc acele
interaciuni medicamentoase care influeneaz negativ eficiena tramentului
antitubercuos.
S-a demonstrat c sunt puine medicamente care n urma interaciunii
altereaz concentraiile medicamentelor antituberculoase (18, 120).
Medicamentele antituberculoase afecteaz mult mai frecvent alte tipuri de
medicamente.
Majoritatea dintre interaciunile relevante clinic includ rifamicinele: RIF,
rifamicina, rifabutinul. De asemenea au fost semnalate alte interaciuni care
afecteaz medicamentele antituberculoase din prima linie.

Rifamicinele.

Rifamicinele sunt metabolizate n special n ficat i mai puin n intestin, unde

acestea induc, pe diferite ci, enzimele sitemului citocrom P450 aa cum este
enzima CYP3A4 (Yew 2002).
Inducerea izoenzimei CYP3A4 depinde de rifamicin. Pornind de la
necesitatea prezenei rifamicinelor pentru inducerea izoenzimei CYP3A4 , s-a
dovedit c RIF este cel mai potent inductor n acest proces n timp ce rifapentina
este un inductor modrat i rifabutinul posed cel mai slab potenial inductor dar
este un substrat indispensabil pentru CYP3A4. Au fost identificate i alte
medicamente care prezint nivele semnificative de interaciune cu rifamicinele i
pot aciona ca inductori asupra sistemului citocrom P450.

Medicamente care afecteaz rifamicinele.

Ritonavir, un inhibitor proteazic care se combin cu inhibitori ai revers trans-

criptazei n cursul terapiei anti HIV, este un potenial inhibitor al izoenzimei

314
CYP3A4, enzim care metabolizeaz rifabutinul rezultnd nivele de rifabutin
crescute la valori de 4 ori mai mari dect cele normale mpreun cu ali metabolii
derivai din rifabutin i n cele din urm pericolul apariiei leucopenia sau alte
fenomene adverse.
Efavirenz, alt medicament retroviral care induce izoenszima CYP3A4
conducnd la scderea concentraiei rifabutinului la 1/3 din concentraia seric
normal.
Clofaziminul, medicament utilizat pentru tratamentul leprei, poate s reduc
absorbia RIF.

Medicamente afectate de rifamicine.

ntruct rifamicinele induc sinteza de enzime microsomale n ficat ele

acclereaz metabolizarea altor medicamente, reducnd perioada de njumtire a
i concentraiile acestora, uneori la nivele subterapeutice. Rezolvarea unei
asemenea situaii const n creterea dozei medicamentului afectat, dup care se va
reveni la dozele normale la dou sptmni de la completarea trataemntului cu
rifamicine. Excepie de la acest regul general fac contraceptivele orale.
Maybe, ce a mai important familie de medicamente afectate de rifamicine,
sunt ageni antiretrovirali prin inhibarea porteazelor i revers-transcripatezelor
nonnucleozidice.
RIF nu trebuie administrat simultan cu medicamente anti HIV, cum ar fi:
zidovudinul, inhibitor al revers transcriptazelor non-nucleozidice i inhibitor
proteazic HIV , ntruct RIF poate s induc metabolizarea acestor medicamente n
ficat.
n unele situaii, poate fi utilizat rifabutinul n locul RIF.
Cercetrile efectelor RIF asupra altor medicamente au demonstrat
incontestabil c exit un grup important de medicamente ale cror concentraii
serice sunt serioa afectate.
Din acest grup fac parte: atovaquone, azatioprinul, cloramfenicolul,
ciclosporina, cimetidina, clofibratul, corticosteroizii, anticoagulante Cuma-rinice,
dapsone, diazepam i alte benzodiazepine, eoxiciclina, fluconazolul, haloperidolul,
hexabarbitalul, itraconazolul, ketoconazolul, lamotrigina, metadona, ondasetronul,
hipoglicemice orale, fenitoinul, chinina, rofecoxibul, statinele, sulfasalazina,
tacrolimus, teofilina bronho-dilatatoare, hormoni tiroidieni, diverse medicamente
cardiovasculare care includ beta blokeri alca-loizi digitalin, medicamente
antiaritmice cum sunt: disopiramida, lorcainida, mexiletina, propafenona,
quinidina, tocainida i verapamilul.

Izoniazida (INH)

Alcoolismul cronic poate amplifica metabolizarea INH n ficat. Aluminiul

cu coninut n antacizi reduce absorbia INH. Alimentele, cum ar fi: brnza, petele
i vinul rou pot produce fenomene adverse.

Medicamente afectate de izoniazid.

INH este un potenial inhibitor al diverselor izoenzime, citocrom

P450, i este capabil s intefereze cu diveri inhibitori ai metabolismului
hepatic influennd un mare numr de medicamente astfel nct crete perioada

315
medie de via i toxicitatea medicamentelor, cum sunt: antiepilepticele,
carbamazepina, etiosuximida i fenitoinul, benzodiazepinele i clorzaxazona.

Combinaia INH i rifamicinele (RIF).

n regimurile de tratament antituberculos standard, RIF este administrat

simultan cu INH n tratamentul complet (faza iniial i faza continu). Cunoscut
fiin faptul c ambele medicamente sunt metabolizate n ficat, incidena
intoxicaiilor mhepatice medicamentoase poate fi crescut i de aceea funcia
hepatic trebuie monitorizat regulat pe toat erioada tratamentului. Riscul
hepatotoxicitii poate s creasc i atunci cnd tratamentul antituberculos se
asociaz cu alte medicamente.
Medicamentele care pot interaciona att cu INH ct i cu RIF, sau
simultan cu ambele, producnd efecte adverse. Cnd ambele medicamente (INH i
RIF) sunt admni-strate simultan, efectul RIF este mult mai important dect al INH
pentru c acesta scade concentraiile medicamentelor afectate.

Pirazinamida (PZA).

Probenecidul, un medicament care este utilizat pentru tratamentul gutei,

poate bloca excreia PZA i administrarea simultanm a ambelor medicamente
afecteaz. pot fi excreia de urai. De asemenea pacienii care primesc zidovudina n
tratamentul anti-HIV au nivele diminuate ale PZA.

Etanbutolul (EMB).

Hidroxidul de aluminiu care conine antacizi poate reduce absorbia EMB

pn la 20 %. Aceti compui pot fi administrai la cel puin dou ore dup
ingerarea EMB pentru a evita interaciunea ntre cele dou medicamente.

Streptomicina (SM).

Administrarea SM cu alte medicamente nefrotoxice, inclusiv unele

aminoglicozide, vancomicina i cteva cefalosporine, sau medicamente cu aciune
ototoxic, cum ar fi acidul etacrynic sau frusemida trebuie s fie evitate ntruct
acestea cresc riscul toxicitii.

Fluorochinolonele.

Mai multe medicamente, cum sunt cele care conin cationi bivaleni,
inclusiv antacizii sau suplimentele vitaminice, scad absorbia fluorochinolone-lor
(36). Administrarea acestor medicamente dup dou ore de la ingerarea
fluorochinolonelor rezolv problema interaciunilor.
Unele fluorochinolone pot inhiba metabolizarea altor medicamente, cum
ar fi teofilina, amplificnd efectele toxice. Cele mai noi fluotochinolone descoperite:
moxifloxacinul, gatifloxacina, etc. au efecte toxice mult di-minuate.

316
 6.2.7. Medicamente noi pentru tratamentul tuberculozei.

n ultimii 40 de ani, s-au descoperit sau au fost introduse medica-mente

noi specifice , cu aciune special mpotriva M. tuberculosis.
Tratamentul disponibil a stabilit un regim multimedicamentos care
dureaz minimum 6 luni, cu toate c nu exist garania unei steriliri complete a
infeciei. Pe de alt parte, creterea cnmrlui de cazuri cu tuberculoz cauzate de
tulpini rezistente MDR (rezisten la medicamente) sau XDR i coinfecia cu HIV
au susinut necesitatea urgent de a descoperi medicamente noi pentru tratarea
tuberculozei.
Cercetarea pentru descoperirea medicamentelor noi a condus la utilizarea
a noi strategii n diferite organizaii din lume, att n instituiile academice ct i n
companiile industriale, ambele finanate din fonduri pri-vate sau guvernamentale
au condus la cercetarea medicamentelor extrase din surse naturale sau sintetice .
Principalul scop al medicamentelor noi este scurtarea tratamentului,
distrugerea bacililor persisteni activi i s fie active fa de tulpinile rezis-tente.
Totodat medicamentele noi trebuie s fie specifice M. tubercuolosis compatibile
cu medicamente antituberculoase care exist i s nu induc enzime P450 n urm
administrrii lor .
n continuare sunt prezentate cteva grupe de medicamente analoge cu
medica - mente le antituberculoase i derivai ai acestor , produse moleculare
utilizate n trialuri cli-nice.

6.2.8. Produse analoge i derivai ai medicamentelor anti-

tuberculoase.

Descoperirea de molecule medicamentoase noi mpotriva tuber-culozei, a

cror rezultate sunt deja cunoscute, au fost utilizate n terapia tuberculozei mai
muli ani. Aceasta este o strategie atractiv din punct de vedere economic,
farmaceutic i clinic. T0tui, rezistena ncruciat putativ cu moleculele parentale
ar putea fi un punct nega-tiv.
Cu toate acestea, mai multe produse analoge derivate din princi-palele
medicamente antituberculoase sunt analizate i cteva rezultate preli-minare sunt
promitoare.

Produse analoge ale etambutolului.

Etambutolul este unul doin principalele medicamente urtilizate n

tratamentul tuberculozei i n majoritatea rilor el este nlocuit cu SM i
tiacetazona. Structura EMB este favorabil preparrii de produse analoge prin
tehnici chimice combinate. Unele produse analoge, cum ar fi: NIH241 i SQ109 au o
eficacitate comparabil i chiar mai bun dect EMB (83).
Studiile in vitro au artat c SQ109 interacioneaz sinergic cu INH i
RIF i experimentele pe animale au relevat c tratamentele care onin SQ109 au
fost cu 25 % mai scurte dect tratamentul standard al tuberculozei.
SQ109 are un spectru larg fiind activ fa de M. tuberculosis i M.bovis
BCG i activitate redus fa de M. smegmatis.

317
 SQ109 este n faza I-a de traluri clinice i el poate nlocui unul sau mai
multe dintre medicamentele antituberculoase din prima linie simplificd terapia i
scurtnd regimul de tratament (48, 19).
Produse analoge ale izoniazidei (INH).

Diverse produse analoge i derivai ai INH continu s fie sintetizai i n

pre-zent. Aceti compui sunt probabil ineficieni mpotriva tulpinilor
micobaceriene rezis-tente la INH din cauza asemnrilor lor structurale strnse cu
INH (46). Totui, avnd n vedere c INH este un medicament foarte important n
arsena-lul terapeutic mpotriva tuberculozei, eforturile fiind fcute pentru a gsi noi
derivai ai INH cu activitate mai mare , toxicitate mai redus i mai puine efecte
secundare. Recent moleculele de INH au fost incorporate n nucleu pirazolinic i s-
au dovedit active fa de diverse tulpini de M. tuberculosis, att ele susceptibile ct
i cele rezistente la INH. Ali compui cu grupe fenil substiutite cu halogen s-au
dovedit mult mai active (89).
Studiile asupra derivatului INH,1-izonicotinil-2-nonanoil hidrazid, au
demon-strat activitatea pronunat mpotriva M. tuberculosis tulpina H37Rv a
acestui produs. Este posibil ca ataarea grupelor chimice care ajut la penetrarea
INH ar putea s fac M. tuberculosis mult mai suceptibil la acest medicament (57).

Derivai ai rifamicinei (RIF).

RIF este un medicament important pentru tratamentuul TB.

Introducerea RIF n terapia antituberculoas a mbuntit substanial
controlul bolii. Au fost descoperii civa derivai ai RIF.
Rifabutinul are activitate intens i este utilizat la pacienii care sunt n
acelai timp tratai pentru HIV, din cauz c rifabutinul induce la un nivel extrem

de sczut enzi-me oxidative al citocromului P-450 comparativ cu alte rifamicine (15).

Rifalazil KRM 1648 (benzoxazinorifamicin) , este rifamicina sinte-tic cu
perioad lung e remanen n organism i mult mai activ dect RIF i rifabutinul
npotriva M. tuberculosis att in vitro ct i in vivo la oareci.
Nivelele ridicare de tulpini rezistente la RIF (MIC>32 mg/l) prezint
rezisten ncruciatla toate rimfamicinele, totui nivele sczute de tulpini
rezistente (MIC< 32 mg/l) sunt susceptibile la derivaii noi ai rimfamicinei. (116)
Quinolonele.
Fluoroquinolonele au fost utilizate spoadic nc din anul 1980 n princip
pntru tratamentul tuberculozei produs de micobacterii rezistente sau din cauza
intoleranei la medicamentele din prim linie existente .
Recent au fost descoperite dou produse moleculare noi: moxi-floxacinul
i gatifloxacinul cu perioad lung de remanen care, se presu-pune c, au
activitate crescut in vitro mpotriva M. tuberculosis urmat de levofloxacin i
ofloxacin (68).
Moxifloxacinul, se pare c distruge bacilii tuberculoi rezisteni la RIF (45).
n tipul trialurilor n faza a II-a s-a constatat c atunci cnd s-a utilizat
gatifloxacinul n locul etambutolului , regimul standard de 6 luni al tratamentului a
fost redus la 4 luni . Cercetrile ntreprinse de N u e m b e r g e r E.L. e t a l .,
2004 (72) au demonstart c moxifloxacinul n combinaie cu RIF i PZA a fost mult
mai eficient dect combinaia clasic INH, RIF i PZA .

318
 Motivul acestei creteri a efcienei ar fi c moxifloxacinul este activ fa de
subpopulaiile de micobac-terii care nu au fost afectate de celelalte medicamente,
sau efciena moxi-floxacinului s-ar datora anatagonismului care apare ntre INH i
pZA (39, 45) .
Recent s-a publicat c gatifloxacinul poate declana att hipo-glicemia ct
i hiperglicemie la pacienii diabetici dar i la cei fr diabet , acesta constuind un
serios obstacol pentru utilizarea acestui medicament n practic (117, 118).
6.2.9. Produse moleculare medicamentoase noi utlizate n
trialuri clinice.

DARQ (Diarilquinolinele).

Diarilquinolinele (DARQ) sunt diferite structural de fluoroquinolone dar i

de alte clase de quinoline .
DARQ R207910, este un medicament antituberculos nou, promi-tor,
dovedind eficien att fa de tulpinile suceptibile ct i fa bacilii tuber-culozei
rezisteni la medicamente . Nivele sczute de MIC au fost deasemenea observate i
n cazul altor specii de micobacterii, cum sunt: M. bovis, M. kansasii i M. ulcerans
precum i specii rezistente natural fa de muli ageni tuberculoi care sunt
implicai n infecii oportuniste ca: complexul M. avium, M. abscessus, M.
fortuitum i M. marinum.
Activitatea R207910 pare s fie specific pentru micobacteriile care au un
MIC ridicat pentru Coryne-bacterium, Helicobacter pylori, Nocardia,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus aureus, Enterococcus faecalis,
Escherichia coli i Haemofillus influenze.
Studii moleculare au identificat subunitatea c a ATP-sintazei care este
inta R207910. Inhibarea funciei ATP-sintazei poate conduce la depleia ATP i
dezechilbru n homeostaza pH , att depleia ATP ct i dezechilibrul homeostazic
pH contribuind la scderea supravieuirii bcateriilor. Tulpinile rezistente ale M.
tuberculosis i M. Smeg-matis prezint mutaii n gena atpE care codeaz o parte
din subunitatea FO a ATP-sintazei (5).
Specificitatea R207910 pentru micobacterii se explic prin aceea c exist
o similitudine ntre secvena redus a proteinelor AtpE ale mico-bacteriilor i alte
microorganisme. Totui, datorit specificitii altor medicamente antituberculoase,
pre-cum: INH, ETH i PZA pentru mico-bacterii, acest promedicament necesit
activarea de ctre o enzim mico-bacterian, dei structura sa chimic nu d nici un
indiciu asupra sutusurilor de activare (23)
Compusul R207910 n prezent denumit TMC 207 , a fost utilizat n trialuri
faza II-a pentru tratamentul tuberculozei active . n experimentele pe oareci cu
tuberculoz compusul R207910 a artat c este semnificativ de activ comparativ cu
regimul standard RPM, INH i PZA. Pe de alt parte, cd este utilizat n formula
RIF, INH i PZA, R207910 contribuie la scurtarea perioade de tratament.

Nitroimidazolii.

Un grup de nitroimidazofurani, iniial investigai ca radiosensibili-zani

pentru chimioterapia cancerului, s-au dovedit a poseda activitate m-potriva
replicrii culturilor de M. tuberculosis i au activitate semnificativ in vivo la
oarecii infectai cu M. tubwrculosis.

319
 Principalul compus al acestei serii, CGI-17341 a demonstrat proprie-ti
mutagenice ceeace a descurajat cercetrile ulterioare asupra acitivtii
antibacteriale a compuilor din serie . Studiile ulterioare au concluzionat to-tui, c
nitroimidazolii biciclic pot fi poteniali ageni antituberculoi. De aceea, n ultimul
timp au fost sintetizai o serie de 328 nitrimidazopirani (NAP) pe baza structurii
CGI-17341. Astfel, compusul PA 824 etaleaz un MIC sczut (0,015-0,25 mg/l)
mpotriva M. tuberculosis (30).
Tulpinile multirezistente s-au dovedit susceptibile la PA-824 ceeace
nseamn c nu exist posibilitatea existenei rezistenei ncruciate cu
medicamente antituberculoase curente.
Pe de alt parte, PA-824 s-a dovedit activ fa bacilii M. tuberculosis, care nu sunt
n fa-z de replicare n culturile anaerobe .
De fapt, metronidazolul, un antibiotic utilizat n tratamentul infeciilor
provo-cate de bacterii anaerobe, posed activitate mpotriva M. tuberculosis n faz
staionar, care supravieuiesc condiiilor de anaerobioz (104). n plus, compusul
nu posed proprieti mutagene i nici interaciuni importante cu citocromul P-450
i nici o activitate semnificativ mpotriva bacteriilor Gram-pozitive i Gram-
negative (76). Similar derivatelor metronidazolului i CGI17341, PA-824 este un
promedicament din clasa nitroimidazolilor care necesit activare bioreductiv a
unui grup nitro-aromatic pentru a exercita efect antitberculos (58).
PA-824 este activ n condiii microaerofilice i/sau condiii anaerobe
conducnd la concluzia c acest medicament este capabil s sterilizeze com-plet
esuturile de M. tuberculosis.
Produsele analoge, PA-822 i PA-644, sunt mult mai acitve in vitro dect
PA-824 dar nu sunt active in vivo.
Studiile comparative pe obolani au demonstrat c PA-824 are un grad
ridicat de penetrare n esuturi i remanen activ crescut, spre deosebire de PA-
647 i PA-822 care au etalat un grad redus de penetrare tisular i remanen activ
slab. n pus, PA-824 are perioad de njumtire lung dar puritatea PA-822 i
PA-647 pare mai bun dect cea a PA-824.
Studiile de specialitate au identificat o diversitate de surse i strategii
pentru cercetarea a noi meidcamente pentru tratamentul tuberulozei.
Cercetarea surselor naturale i sintetice, mpreun cu tehnologiile
bioanalitice i tehnicile screening au constiuit pai importani n descoperirea
mijloacelor eficiente n tratamentul tuberculozei i disponibilizarea unor
medicamente care s ndeplineasc cele trei criterii importante: reducerea sau
elminarea riscului apariiei de tulpini micobacteriene rezistente la medica-mente i
riscului rezistenei ncruciate, reducerea sau elibinarea efectelor adverse n special
efectele toxice i scurtarea duratei tratamentului (1, 10, 78). De asemenea au fost
identificate i propuse strategii care s detecteze inte noi utiliznd sisteme
computerizate software pentru a cerceta funciile vitale n cursul tratamentului
(40) sau utilizarea mijloacelor genetice aa nct randomizarea mutagenezei s
sprijine identificarea de noi inte pentru medicamentele noi antituberculoase (51) .
6.3. Programe de combatere i profilaxie general.
6.3.1. Terapia sub observaie direct (DOT).
Este denumirea dat de Organizaia Mondial a Sntii (OMS) strategiei
de control a tuberculozei care cuprinde urmtoarele componente:

320
 1. Politici guvernamentale cu cretere i susinere financiar prin:
- legislaie, planificare;
- resurse umane;
- management i sisteme educaionale.
2. Depistare sistematic a cazurilor cu tuberculoz prin:
- mbuntirea calitii mijloacelor bacteriologice de detecie a bacililor
tuberculozei n sput i alte materiale patologice;
- ntrirea i creterea competenei laboratoarelor TB;
- supravegherea permanent a rezistenei la medicamente anti-tuberculoase.
3. Regimul de tratament standardizat sub observaie direct (DOT):
- aplicat pe o perioad de cel puin 2 luni de personal de speciali-tate sau
persoane fizice instruite ;
4. Aprovizionare susinut cu medicamente care presupune:
- disponibiliti de medicamente antituberculoase;
- managementul medicamentelor antituberculoase;
- nlesniri globarle i acces nelimitat la medicamente anituber- culoase.

5. Sistem standardizat de nregistrare i raportare care permite :

- analiza rezultatelor tratamentului;
- control i raport global al tuberculozei;
- date i profilul rii;
- planuri i mijloace bugetare;
- supraveghere epidemiologic de OMS.
Tehnica strategiei DOT a fost elaborat nc din anul 1980 n Tanzania. n 1989,
OMS mpreun cu Banca Mondial au analizat posibili-tatea extinderii acestei strategii n
alte pari ale lumii. Astfel, n anul 1990, Richard Bumgamer, Directorul Bancii Mondiale,
mpreun cu OMS i iniia-torul programului DOT (Dr. Carel Styblo) au elaborat i aplicat
proiectul de control al tuberculozei n China, cu rezultate excepionale chiar din anul
urmtor.
ncepnd din anul 1991 programul de terapie antituberculoas DOT s-a dezvoltat
i s-a extins substanial astfel nct n anul 2009 circa 6 milioane de oameni erau integrai
n programul strategic DOT.
Programul DOT a fost inclus n Programele Naionale ale tuturor rilor angajate n
combaterea i eradicarea tuberculozei pentru c:
- elimin posibilitatea rspndirii tuberculozei de la un pacient la altul;
- reduce semnificativ riscul apariiei bacililor tuberculoi rezisteni la
medicamentele utilizate n terapia antituberculoas;
- reduce substanial costurile pentru spitalizarea i ngrijirea bol-navului pe toat
perioada tratamentului
- elimin eventuale erori n aplicarea tratamentului i recderile.
n realizarea programului DOT pot fi implicate:
- infirmiere sau oricare persoan angajat ntr-o instituie public, instruit
pentru monitorizarea tratamentului pe toat perioada stabilit;
- clinicieni, ageni sociali de ngrijire la domiciliu. De asemenea. n unele situaii
regimurile medicamentoase din programul DOT pot fi aplicate n centrele de tratament,
coli, etc. de ctre angajai publici instruii n depar-tamentele locale de sntate.
Pentru regimurile medicamentoase complexe care includ medicaii IV/IM sau
dac este necesar administrarea dozelor de dou ori pe zi, departamentele locale de
sntate pot prelua unele dintre atribuiunile asistenlori sociali familiali.

321
 n rile n care resursele financiare, umane i materiale sunt limi-tate
pentru implementarea programului DOT, se va acorda prioritate pacieni-lor cu rsic
maxim de expunere.
Persoana angajat n derularea programului DOT , trebuie:
- s urmreasc admnistrarea corect a medicamentelor prescrise;
- s nu permit pacientului s ia medicamentele n lipsa asistentului; n
zilele din weekend, pacienii care beneficiaz de tratament zilnic pot s-i
administreze singuri dozele, n asemenea situaii fiind asistai de un membru al
familiei;
- s observe i s notifice dac apar efecte secundare n urma administrrii
medicamentelor;
- s urmreasc pacientul pentru ca acesta s ia toate medicamentele n
dozele prescrise;
- s fac vizite de documentare i s fie pregtit pentru a rspunde tuturor
ntrebrilor i problemelor reclamate de pacient;
- s elimine situaiile cnd pacientul incearc, contient sau involun-tar
s ascund medicamentele, n special cnd acesta consider DOT ca o msur
punitiv. n asemenea situaii exist anse reduse de succes n completarea terapiei.
- s cunoasc metodologia de raportare a datelor privind derularea
programului DOT i s respecte secretul confidentialitii.
Cadrele de specialitate din farmacii trebuie s susin programul DOT
explicnd pacienilor c acesta este generalizat n toat lumea i este foarte eficient.
De aceea, respectarea i aplicarea corect a regimului terapeutic antituberculos
duce cu siguran la vindecare. Pacientul inclus n programul DOT trebuie s fie
ajutat s menin legturi permanente cu cadrele medicale, care vor prezenta
informaii cu privire la tratament i rezultatele acestuia.
De asemenea, pacienilor inclui n programul DOT se pot acorda diverse
stimulente prin serviciile sociale i faciliti n transport.

6.3.2. Strategia DOT i Programul National de Control al

Tuberculozei (PNTB) n Romnia.

n Romnia proiectul DOT a fost introdus n anul 1998 la recomandarea

OMS, cu sprijinul Fondului Global de Lupt contra HIV/SIDA, Tuberculozei i
Malariei. ncepnd din anul 2005, controlul tuberculozei prin strategia DOT are
acoperire 100 % .
Strategia DOT este component esenial a Programului National de
Control al Tuberculozei elaborat, pentru o perioad de 4 ani, prin corobora-ea
subprogramului de supraveghere i control al tuberculozei cu subrogramul de
terapie antituberculoas a bolnavilor i coordonat din punct de vedere tehnic de
Institutul Naional de Pneumologie Marius Nasta i consiliat de Comisia de
specialitate din Ministerul Sntii Publice (MSP). Din punct de vedere financiar,
material i resurse umane, Programul este susinut de Guvernul Romniei prin
Casa National de Asigurri de Sntate.
Programul National de Control al Tuberculozei n Romnia elaborat
pentru perioada 2007-2011 se deruleaz pe 3 nivele :
- primul nivel cuprinde reeaua de pneumoftiziologie a MSP, alte
ministere cu reele proprii de srvicii de sntate i laboratoarele de bacteriologie
specializate n izolarea i identificarea micobacteriilor;
- al doilea nivel este reprezentat de Unitatea Judeean prin coor-
donatorul judeean al PNCT care, de regul este pnemoftiziolog nominalizat de
322
 Autoritatea General Public de Sntate Public din MSP pentru a
asigura, mpreun cu coordonatorul de programe din cadrul Ageniei judeene de
Snatate Public, aplicarea programului;
- al treilea nivel este constitutit din Unitatea Central de Manage-ment
a PNCT din cadrul Institutului de Pneumologie Marius Nasta con-dus de
coordonatorul tehnic i are n structur 5 deparatamente : de Supraveghere
epidemiologic a tuberculozei, de monitorizare a PNCT, de informare, educare i
comunicare i unitatea de cercetare.
Scopul i obiectivele Programului. Programul Naional de Control al
Tuberculozei (PNCT) urmrete mbuntirea strii de sntate i limitarea
raspndirii infeciei i tuberculozei n rndul populaiei avnd ca obiective :
- meninerea procentului de 100% din populaie inclus n strategia DOTS;
- meninerea la peste 70 % a ratei de depistare a cazurilor noi cu
tuberculoz pulmonar pozitive prin creterea calitativ a microscopiei pentru
BAAR i modernizarea laboratoarelor de diagnostic bacteriologic al mico-
bacteriozelor;
- atingerea ratei de succes terapeutic de 85 % pentru cazurile noi de
tuberculoz pulmonar pozitive la microscopie i/sau confirmate bacteriologic;
- scderea ratei mortalitii din cauza tuberculozei la 8 %000.
Finanarea PNCT. Asigurarea bugetului necesar pe toat perioada de
derulare a PNCT constituie condiia esenial pentru antingerea scopului i
obiectivelor stanbilite n program i aceasta reprezint o problem guverna-
mental. n estimarea bugetului alocat pentru perioada prevzut, trebuie s se in
cont de acoperirea cheltuielilor tuturor activitilor declanate cu finanare extern
dar i derularea corespunztoare i finalizarea cu succes a activitilor de depistare,
diagnostic, profilaxie i combatrea a tuber-culozei prevzute n program. De aceea,
bugetul trebuie s cuprind:
1. Chetuieli pentru activiti curative:
- medicamente anti tuberculoase asociate;
- investigaii pentru diagnostic i monitorizare tratament;
- examene bacteriologice;
- examene radiologice;
- examene biochimice, hematologice, bronhi0logice, morfopato-logice,
etc.
2. Activiti profilactice:
- cheltuieli materiale i servicii necesare realizrii programului;
- cheltuieli de personal;
- cheltuieli pentru procurarea de materiale pentru prevenirea
transmiterii infeciilor (materiale de protecie, dezinfectani, detergeni ,
echipamente i aparatur, etc.);
- cheltuieli pentru utilizarea i ntreinerea mijloacelor de trans-port
necesare derulrii programului;
- cheltuieli pentru implemetarea i funcionarea sistemului infor-
maional i colectare de date;
- cheltuieli pentru funcionarea Unitii Centrale de Coordonare a
Programului i monitorizarea derulrii Programului;
- cheltuieli pentru activitai de documentare, cercetare, formare i
perfecionarea personalului integrat n derularea programuuli i dezvolta-rea
resurselor umane;
- cheltuieli pentru cercetri operaionale utilizate n dezvoltarea PNCT;

323
 - cheltuieli pentru idendificarea prevalenei tuberculoz- HIV i
testarea bolnavilor de tuberculoz.
3. Cheltuieli de capital pentru:
- asigurarea infrastructurii corespuunztoare derulrii i finali-zrii
programului;
- achiziionarea i asigurarea cu aparatur i echipamentele necesare
desfurrii n condiii optime a activitilor de depistare, diagnostic profilaxie i
combatere a tuberculozei.
Pentru o evaluare apropiat de realitate toate unitile cu activiti incluse
n PNCT trebuie s comunice n timp rezonabil estimarea cheltuielilor necesare
pentru acreditare, pentru procurarea de aparatur radiologic spitalizarea
tratamentul i ngrijirea bolnavilor, innd cont c:
- pentru un bolnav cu MDR ( multi drug resistance) costul
tratamentului poate fi cu peste 200 ori mai mare dect a unui bolnav cu tuberculoz
cauzat de bacili sensibili;
- unitile din reeaua de pneumoftiziologie, unitile sanitare din
reea, laboratoarele bK, spitale ambulatorii i secii de specialitate trebuie s
ndeplineasc condiiile de acreditare, pentru care ar fi necesari cca 3 mil.
roni/unitate.

6.3.3. Programe de supraveghere, propfilaxie i combatere a

tuberculozei la animale.

S-a demonstrat practic c n rile dezvoltate, ale cror teritorii sunt libere de
tuberculoz, aplicarea metodelor perfecionate de depistare i diagnostic i mai ales
finanarea de ctre statele respective a programelor la nivelul cerinelor, au avut rol
esenial n eradicarea bolii.
Pentru Romnia este evident c, dei nc din anul 1949 s-au semnalat
preocupri n elaborarea de Programe Naionale de combatere a tuberculozei,
prevalena bolii a continuat s creasc ngrijortor pentru c acele programe nu
dispuneau de baza material, resurse umane, infrastructur, mijloace de depistare
i diagnostic adecvate precum i susinerea financiar necesar. Ele erau transcrise
dar fr a fi implementate i aplicate n teritoriu
Ulterior, n perioada anilor 1960 1989, se nregistreaz dezvoltarea i
perfecionarea bazei materiale i mijloacelor de supraveghere i diagnostic dar
eficiena acestora au rmas la nivel nesatisfctor avnd n vedere c n perioada
menionat au fost ignorate sistematic normele i msurile preveni-rea difuzrii
bolii.
n acea perioad, politica guvernamental n Romnia era: creterea
efectivelor de bovine prin reducerea drastic a ratei mortalitii, tierilor de
necesitate sau nejustificate i imbuntirea indicatorilor de reproducie, n
special natalitatea.
Urmare acestei strategii, serviciile veterinare implicate n lupta mpotriva
tuberculozei la animale s-au gsit n incapacitate de a-i exercita corespunz-tor
atribuiunile de serviciu i de a aplica masuri radicale de combaterea a tuberculozei
prin eliminarea necondiionat i abatorizarea tuturor animalelor depistate cu
tuberculoz i restricionarea micrilor de animale din efective contaminate ctre
ferme indemne.

324
 De aceea, s-a adoptat o msur de compromis: nfiinarea centrelor de izolare
TBC n care erau colectate toate animalele pozitive la testele de depistare i/sau
confirmate cu infecie tuberculoas n cadrul Programului Naional de asanare
prin extracie a efectivelor cu tuberculoz. Iniial, aceste centre au funcionat ca
ferme de vaci pentru lapte i activitate de reproducie normal, dovedindu-se mai
trziu adevrate focare de infecie necontrolat i risc major pentru sntatea
public i pentru populaiile de animale receptive din zon.
Costatnd ineficiena i pericolul real de transmitere a infeciei
tuberculoase la oameni i la alte specii de animale receptive prin consumul de
produse lactate i carne neprelucrate industrial i furaje contaminate autoritile s-
a hotrt transformarea acestor centre n ngrtorii care ulterior s-au dovedit tot
att de ineficiente ca i fermele de vaci, centre de izolare TBC.
Pe de alt parte, la meninerea incidenei ridicate a tuberculozei n
efectivele de bovine din Romnia au contribuit i factori de natur tehnic cum ar
fi:
- lipsa unei strategii i obiective clare cu privire la supravegherea,
diagnosticul i profilaxia tuberculozei n populaiile de animale;
- adoptarea i aplicarea unui sistem complicat, cu limite extrem de largi (7
categorii de incadrare a reaciilor alergice) de interpretare a rezultatelor teste-
lor alergice care permitea meninerea n efectiv a unui numr semnificativ de
animale real infectate cu M. bovis;
- baz material i infrastructur precum i resurse umane i financiare
insuficiente pentru desfurarea activitilor de depistare n condiii optimale.
ncepnd din ianuarie 1990 au intervenit schimbri radicale n siste-mele de
cretere i exploatarea bovinelor; s-au desfiinat fermele de vaci de lapte,
ngrtoriile i centrele de izolare pentru tuberculoz aparinnd fostelor CAP-uri
i IAS-uri i animalele au fost distribuite comunitilor locale din mediul rural
pentru ngrijire i exploatare fr a se respecta cerinele minimale de sntate i
statusul animalelor sub raportul tuberculozei.
Autoritile statului din acea perioad au dispus desfiinarea fermelor far a
consulta serviciile veterinare cu privire la starea de sntate a animale-lor.
n faa unei asemenea situaii, autoritatea serviciilor veterinare a fost grav
afectat i n consecin, capacitatea de meninere sub control a tuber-culozei a fost
substanial diminuat aa nct, la sfritul anului 1991 boala era prezent la
bovinele din aproape toate judeele, fiind afectate peste 10.000 de gospodrii.
A urmat o perioad extrem de dificil pentru autoritile veterinare. Era
necesar corectarea erorilor din anul 1990 n regim de urgen prin elborarea unui
Program Naional strategic de Combatere a Tuberculozei elaborat n concordan
cu normele U.E. , avnd la baz :
- intensivizarea, generalizarea i creterea frecvenei aciunilor de depistare a
animalelor bolnave i suspecte de tuberculoz prin mbuntirea mijloacelor
tehnice de lucru i creterea nivelului de pregtire profesioanal a cadrelor
medicale implicate n program;
- eliminarea necondiionat a tuturor animalelor suspecte de infecie sau
confirmate cu tuberculoz i dirijarea acestora spre abator;
- aplicarea riguroas a msurilor de profilaxie general n gospodriile
supuse programului de depopulare total.

325
 Studiul pentru evaluarea Programelor nationale de supraveghere,
diagnostic, profilaxie i combatere a tuberculozei la animale, n perioada 2004-
2005, arat c tuberculoza bocinelor a nregistrat o scderea evident, fiind
prezent n 7 judee cu 76 de focare fa de perioada anterioa anului 2005 cnd
tuberculoza era prezent n 16 judee cu 265 de focare.
Analiza cauzelor i factorilor care au contribuit la meninerea prevalenei
tuberculozei bovinelor la un nivel relativ ridicat a scos n eviden urmtoarele :
1. Meninerea focarelor active de boal, procent crescut de animale cu
rezultate neconcludente la testele de depistare a infeciei tuberculoasei originea
necunoscut a infeciei n judeele afectate, sunt consecina:
- circulaiei necontrolate a animalelor n teritoriu;
- nerespectrii regimului de carantin profilactic pentru animalele vii
comercializate;
- interterferenei i contactului cu posibile rezervoare de micobacterii.
2. Baza material disponibil n anul 2005 pentru activitile de
supraveghere i depistare a fost insuficient:
- peste 12,23 % dintre medicii veterinari concesionari din 72,2 % ju-dee au
utilizat truse de tuberculinare defecte sau acestea au lipsit din dotare;
- aprovizionarea i gestionarea necorespunztoare a produselor tuber-
culinice i altor produse biologice demonstreaz management defectuos n
aplicarea programelor de supraveghere i control.
3. Resurse umane. Analizele efectuate pe baza datelor furnizate de DSVSA
i LSVS judeene arat ca la sfritul anului 2005 reeaua sanitar veterinar
implicat n aciunile prevzute n Programul National de Supra-veghere i
Controlul Tuberculozei la Animale nu au avut eficiena ateptat datorit:
- lipsei specialitilor din serviciile de epidemiologie n 20 % dintre judee;
- lipsei specialitilor histopatologi n 4 % dintre judee;
- activitilor deficitare privind cultura i identificare a micobacteriilor
acestea fiind realizate n cadrul laboratoarlelor de bacteriologie general. Sistemul
de organizare al laboratoarelor veterinare de diagnostic era total diferit de cel
existent n medicina uman (laboratoarele pentru diagnosticul micobacteriozelor,
organizate pe 3 nivele ) i pn la sfritul anului 2005 nu era organizat i atestat
Laboratorul Naional Veterinar de Referin pentru Diagnosticul Bacteriologic al
Micobateriozelor. Toate laboratoarele veterinare s-au bazat n diagnosticul
tuberculozei numai pe examinare bacterioscopic direct a amprentelor din
materiale patologice suspecte de infeie i infecie experimentl pe animale de
laborator (bioteste pe cobai) n procente nesemnificative;
- pregtirii profesionale insuficiente a specialitilor implicai n reali-zarea
programelor de supraveghere, diagnostic profilaxie i combatere a tuberculozei la
animale. Dup cum arat datele furnizate de autoritile veterinare judeene pentru
anul 2005 (Fig.102) au pariticipat la cursurile de perfecionare pe profil mico-
bacterioze numai 56,0 % dintre inspectorii veterinari zonali, 51,5 % dintre medicii
veterinari din circumscripii i 41,6% dintre medicii veterinari din abatoare dar nici
unul nu a primit atestat cu excepia a 8% bacteriologi i histopatologi care au fost
atestai pe profil.

326
 Fig.102 - Numrul de specialiti instruii i atestai pe profil micobacterioze

4. Erori i nonconformiti n executarea lucrrilor de depistare i

diagnostic al infeciei tuberculoase., manifestate prin:
- nerespectarea prevederilor Programului strategic al aciunilor sanitare
veterinare i reglementrilor n domeniu.
De exemplu, n anul 2005 nu s-au tuberculinat prin IDR-TU 3,0% dintre
bovine, n trim.I-II i n procent similar n trim. III-IV, ceeace nseamn c
aproximativ 2274 de animale au rmas necontrolate pe toat perioada anului 2005
n 64,0% dintre judee, cu o rat probabil de transmitere a infeciei de 1:25 n
fermele cu peste 100 de bovine i 1:5 n gospodriile individuale;
- acurateea discutabil i erori n interpretarea i nregistrarea rezul-tatelor
ca urmare a gradului ridicat de uzur a instrumentarului, aparaturii i utilizarea
unor tehnici de lucru neomologate, incompetena operatorilor sau valoarea
biologic revelatoare sczut a produselor biologice folosite n tes-tare a cror
specificitate, deobicei se ncadreaz n limite de 50,0 - 60.0% i sensitivitatea nu
depete 75,0-80,0%;
- evidenieri eronate i neclariti privind animalele cu reacii pozitive la
testele IDR-TCS i ntrzieri semnificative n eliminarea acestora din ferme i curi.
De exemplu, datele arat c n anul 2005 au fost tiate 93,2 % din totalul
bovinelor pozitive la IDR-TCS i 6,8 % avnd destinaie necunoscut
( comercializare, dispariie);
- confuzii ntre leziunile provocate de infeii parazitare (Echinococcus sp.
Actinomyces, etc.), lisa de interes i competen n examinarea tuturor animalelor
tiate normal n abatoare, provenind din exploataii i localiti declarate oficial cu
tuberculoz sau din exploataii i localiti considerate indemne dar n care s-a
nregistrat reactivitate semnificativ la testele de depistare;
- posibiliti i capaciti restrnse n laboratoarele de bacteriologie i
histopatologie veterianare de a diversifica metodele de lucru pentru confirma-rea
diagnosticului de tuberculoz. n proporie de peste 98,0 % dintre probe au fost
examinate, n anul 2005, numai prin bacterioscopie direct i histo-patologic prin
metoda clasic, cu numai 0,11 rat de examinare prin biotest.
5. Lipsa fondurilor necesare derulrii corespunztoare e Programului
naional de supraveghere, diagnostic, profilaxile i combatre a tuberculozei la
animale. Programele de supraveghere, profilaxie, diagnostic i combatere nu au
fost fundamentate financiar n nici un jude pe baza datelor statistice anterioare i
prognozelor i n consecin:
327
 - nu au fost alocate fonduri suficiente pentru procurarea de instrumen-tar,
aparatur, echipamente, reageni i produse biologice de supraveghere i
diagnostic;
- nu sa-u alocat fonduri suficiente pentru activiti de instruire, control i
ndrumarea specialitilor;
- s-au nregistrat ntrzieri substaniale in efectuarea plilor pentru
despgubirea proprietarilor animalelor care au fost abatorizate n cadrul
programului de eradicare a tuberculozei datorit procedurilor complicate de
evaluare i atribuire a sumelor aferente despgubirii sau nealocarea de fonduri n
acest scop.
Considernd factorii menionai mai sus cu pronunat influen ne-gativ
asupra derulrii programelor de supraveghere, diagnnostic profilaxie i combatere
a micobacteriozelor, cu referire special la tuberculoza i para-tuberculoza
animalelor i recunoscnd importana major a acestor entiti morbide pentru
sntatea animalelor i oamenilor, se propuneau, n anul 2005, cteva
oportuniti pentru creterea calitii managementului programelor i realizarea
obiectivelor programate pe termen scurt mediu i lung.
Din pcate, aceste oportuniti nu au fost analizate la nivelul ANSVSA n
scopul eficientizrii activitii de supraveghere i coordonare a activitilor de
combatere a micobacteriozelor. Propunerile se refereau la:

mbuntirea structurii organizatorice pentru coordonarea

activitii de combatere a micobacteriozelor .

n acest sens, s-a propus, constituirea la nivel central a Comisiei

Naionale pentru Micobacterioze, ca organ tehnic consultativ al ANSVSA, n
cpmponena creia ara inclui experi din domeniul medicinii veterinare i umane (
cadre universitare, specialiti din Institutele de cerce-tare de profil , specialiti din
laboratoarele naionale de referin i diag-nostic micobacterioze, specialiti din
DSVSA i Sntate Public judeene).
Comisisa urma s-i desfoare activitatea n subcomisii i/sau grupe de
lucru:
a. Subcomisia pentru analize epidemiologice, programe i strategii de
supraveghere i controlul micobacteriozelor ;
b. Subcomisisa pentru completarea, armonizarea i implementarea
normelor care reglementeaz supravegherea, controlul, diagnosticul, pro-filaxia
i combaterea micobacteriozelor i prevenirea transmiterii acestor boli de la
animale la om;
c. Subcomisisa pentru resurse umane, mijloace tehnice, materiale i
financiare. Metodologii i metode de lucru n lupta mpotriva tuberculozei i
paratuberculozei;
d. Subcomisisa pentru control i monitorizare a aplicrii programelor i
strategiilor de lupt mpotriva tuberculozei i paratuberculozei n teri-toriu.
Comisia Naionala pentru Micobacterioze, trebuia s analizeze
periodic (semestrial i anual) stadiul realizrii programelor i strategiilor de lupt
mpotriva tuberculozei i paratuberculozei (boala lui Crohn) la scara ntregii ri
sau, dup caz, zonal formulnd concluzii i eventuale propuneri la ANSVSA pentru
eficientizarea acestora.

328
 La nivelul DSVSA i LSVS judeene, s-au formulat urmtoarele
oportuniti:

a). Pe termen scurt:

- titularizarea i permanentizarea specialitilor cu responsabiliti n

micobacterioze din cadrul seciilor de Epidemiologie-Sntate animal, Poli-ie
Sanitar Veterinar, inspectorilor veterinari zonali, medicilor veterinari care
execut expertiz pentru tuberculoz i paratuberculoz n abatoarele autorizate,
precum i specialitilor din laboratoareele implicate n diagnos-ticul acestor boli;
- evaluarea gradului de pregtire profesional, a capacitii i apti-tudinii
tuturor specialitilor cu atribuii n supravegherea, controlul, diagnos-ticul i
profilaxia tuberculozei i paratuberculozei n funcie de situaia epi-demiologic din
fiecare jude sub raportul bolilor menionate.

b). Pe termen mediu i lung:

- reactualizarea programelor de investiii i cheltuieli pentru achiziii de

aparatur, echipamente, materiale i produse biologice de diagnostic necesare
aplicrii metodelor autorizate, n conformitate cu standardele actuale n domeniul
micobacteriozelor;
- reactualizarea programelor cifrice i stabilirea costurilor estimative pentru
activitile de supravegherea, control, diagnostic i profilaxie;
- mbuntirea sistemului informaional de nregistrare, gestionare i
raportare a activitilor de supraveghere, control diagnostic i profilaxie.

Strategii i mijloace de depistare, control, diagnostic, profilaxie

i combatere.

Avnd n vedere normele europene privind controlul tuberculozei i situaia

epidemiologic a tuberculozei i paratuberculozei pe teritoriul Romniei s-au
formulat urmtoarele:
a). Elaborarea i oficializarea normelor metodologice de supraveghere
diagnostic, profilaxie i combatere a tuberculozei i paratuberculozei de prevenire a
transmiterii acestor boli de la animale la om;
b). Aciunile de depistare n cazul tuberculozei trebuie s se desfoare
difereniat astfel:
- n judeele n care, n decursul ultimilor 3 ani consecutiv, tuberculoza nu a
fost diagnosticat, notificat i declarat oficial la bovine i/sau la alte specii
receptive, circulaia animalelor pe teritoriul judeelor respective se afl sub contrlol
sanitar veterinar oficial i nu exist suspiciuni cu privire la existena unor
rezervoare
naturale sau prezena infeciei tuberculoase la animale din mediul silvatic,
interferene pe puni, n trguri expoziii, etc., intradermotuberculinarea (IDR-
TU) se poate efectua o singur dat pe an la toate bovinele n vrst de peste 6
luni utiliznd antigene cu nalt specifi-citate (ESAT-6 i CFP-10), concomitent cu
creterea exigenei expertizei de abator precum i a examenelor de laborator
pentru precizarea diagnosticu-lui de tuberculoz;

329
 - n judeele cu focare de tuberculoz declarat oficial i cu risc crescut,
intradermotuberculinarea (IDR-TU i IDR-TCS) se va efectua trimestrial la toate
bovinele existente n focar ncepnd de la vrsta de 6 luni.
- efectivele contaminate n care tuberculoza a fost confirmat clinic,
anatomopatologic i prin investigaii specifice de laborator iar testele de depi-stare,
pozitive la mai mult de 10% din efectivul controlabil, autoritatea veteri-nar poate
elabora un program de asanare prin depopulare total, bazat pe:

- ntreruperea imediat a ciclului de reproducere la animale;

- stabilirea numrului de femele gestante i stadiului de gestaie;
- elaborarea graficului de afluire ealonat a animalelor la abator, pri-mele
loturi fiind alctuite din animale reformate, animale aflate n repaus mamar,
animale cu diverse afeciuni cronice, animale neproductive;
- elaborarea i implementarea planului de profilaxie general.
Autoritatea veterinar poate decide depopularea total i in acele gospodarii
individuale (curi) in care tuberculoza fost constatat dac:
- propietarul deine numai 1-5 animale;
- propietarul nu deine femele gestante;
- riscul transmiterii infeciei la alte curi i animale este iminent.
Efectivele de porcine, ovine i caprine, pot fi supuse programului de asanare
prin depopulare total indiferent de procentul de infecie constatat i de numrul
de animale existente n cresctorie.

Creterea calitii diagnosticului n micobacterioze.

Creterea calitii diagnosticului micobacteriozelor trebuie s vizeze

urmtoarele obiective:
. Organizarea, dotarea, evaluarea i agreerea laboratoarelor specia-lizate
n diagnosticul micobacteriozelor, n conformitate cu cerinele norme-lor
europene n domeniu. Din acest punct de vedere, laboratoarele respective trebuie s
funcioneze cel puin cu minimum de personal de specialitate, bine pregtit,
competent i capabil s execute toate procedurile de lucru omologate prevzute n
normele tehnice de diagnostic.
. Elaborarea, uniformizarea i omologarea metodologiilor de lucru n
laboratoarele specializate, inclusiv procedurile complementare care pot substitui
unele metode clasice de diagnostic. La agreerea laboratoarelor specializate n
diagnosticul micobacteriozelor trebuie s se acorde atenie sporit volumului,
complexitii i calitii lucrrilor pentru izolarea i identificarea micobacteriilor.

330
 Bibliografie la Cap.VI.

1. Ahmad Z., Shama S, Khuller G.K.: Azole antifungal as novel chemotherapeutic agents against murine tuberculosis
FEMS. Microbiol. Lett., 2006; 261: 181-186.
2. Agger E.M., Rosenkrands I., Olsen A.W., et a;l.: protective immunity to tuberculosis with Ag85-ESAT6 in a synthetic
adjuvant system IC31. Vaccine, 2006; 24: 2542-2560.
3. Ainsa J.A., Martin C., Gicquel B.: Mononuclear approaches to tuberculosis . Mol.Microbiol., 2001; 42: 561-570.
4. Andersen P., Doherty T.M.,: The success and failure of BCG-implication for a novel tuberculosis vaccine..
Nat.Rev..Microbiol.,2005;3: 656-662.
5. Andries K., Verhasselt P., Gullemont J. et al.: Diarylquinoline drug active on the ATP synthase of Mycobacterium
tuberculosis. Sci., 2005; 307: 223-227.
6. Aroson, N.E. , Santosham M., Comstock G.W.,,et al.: Long term efficacy of BCG vaccine in American Indians Alaska
Natives: a 60-year follow-up study. JAMA, 2004 291: 2086-2091.
7. Aubry A., Pan X.S. Fisher L.M., Jarlier V., Cambau E.: Mycobacterium tuberculosis DNA gyrase: interaction with
quinolones and correlation with antimycobacterial drug activity. Antimicrob.Agent.Chemother. , 2004; 48: 1281-
1288.
8.Balcells M.E., Thomas S.L., Godfrey-Faussett P., Grant A.D.: Isoniazid preventive therapy and riskfor resistant
tuberculosis. Emerg . Infect.Dis., 2006, 12: 744-751.
9. Behr M.A.: BCG different strain, different vaccines? Lancet Infect Dis., 2002; 70: 672-678.
10. Biava M., Porretta G.C., Poce G., et al.: Antimycobacterial agents. Novel diarylpyrole derivates of BM212 endowed with
high activity toward Mycobacterium tuberculosis and low cytotoxicity. J.Med. Chem., 2006; 49: 4946-4952.
11. Blanchard J.S.: Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Annu. Rev.Biochem., 1996;
65: 215-239.
12. Bodmer T., Zurcher G., Imboden P., Teleti A.: Mutation position and type of substitution in the beta-subunit of RNA-
polymerase infunce in vitro activity of rufamycins in rifampicin-resitant Mycobacterium tuberculosis.
J.Antimicrob. chemotherapy., 1995; 35: 345-348.
13. Bottger E.C.: resistance to drugs targeting protein synthesis in mycobacteria. Trends. Microbiol., 1994; 2: 416-421.
14. Buddle B.M., Skinner M.A., Wedlock D. N., Collins D.M., de Lissle G.W.: New generation vaccines and delivery systems
for control of bovine tuberculosis in cattle and wildlife.. Vet.Immunol.Imunopathol., 2002;87: 177-185.
15. Burman W.J., Gallicano K., Peloquin C.: Comparative pharmacokinetics and pharmacodinamics of the rifamycin
antibacterials. Clin.Pharmacokinet., 2001; 40: 327-341.
16. Camacho L.R., Ensegueix D., Perez E., Giquel B., Guilhot C.: Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium
tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol.Microbiol., 1999; 34: 257-267.
17. Cavusoglu C., Karaca-Derici Y., Bilicic A.: in vitro activity of rifabutin against rifampicinm-resistant Mycobacterium
tuberculosis isolates with known rpoB mutations. Clin.Microbiol.Infect., 2004; 10: 662-665.
18. Center for Disease and Prevention (CDC): Treatment of tuberculosis. Am.Th.Soc.; CDC and Inf.Dis.Soc. of America.
<orbidity and Mortality Wekly Report, 2003 ; 52(11): 301-305.
19. Chen P., Ghearhart J., ProtopopovaM., et al.: Synergistic interactions of SQ109 a new ethylene diamine, with front-line
antitubercular drugs in vitro. J.Antimicrob. Chemother., 2006; 58: 332-337.
20. Cheng S.J. Thibert L., Sanchez T., et al.: pncA mutation as a major mechanism of pyrazinamide resistance in
Mycobacterium tuberculosis spread of the monoresistant strain in Quebec. Canada Antimicrob.Agent. Chempther., 2000; 44:
528-532.
21. Choudhuri B.S., Sen S., et al.:Isoniazid accumulation in Mycobacterium smegmatis is modulated by proton motive for-
driven and ATP-dependent extrusion systems. Biochem.Biophys.Res. Commun., 1999; 256: 682-684.
22. Colangeli R., Helb D., Sridharan S., et al.: the Mycobacterium tuberculosis iniA gene is assential for activity of an efflux
pump that confer drug tolerance to both isoniazid and ethanbutol. Mol.Microbiol., 2005: 55: 1829-1840.
23. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al.: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome
sequence. Nature, 1998; 393: 537-544.
24. Cole S.T., Alzani P.M.: Microbiology TB a new target, a new drug. Sci., 2005; 307: 214-215.
25. De Lisle G.W., Wards B.J., Buddle B.M, Collins D.M.: The efficacy of live tuberculosis vaccines after pre-sensitization
with Mycobacterium avium. Tuberculosis (Edinb), 2005,85: 73-79.
26. Demangel C., Garnier T., Rosenkrands I., Cole S.T.: Differential effect or prior exposure to environmental
mycobacteria on vaccination with Mycobactect. rium bovis BCG or a recombinant BCG strain expressing RD1
antigens. Inf Immun.2005; 73: 2190-2196.
27. De Rossi E., Ainsa J.A., Riccardi G.: Role of Mycobacterial efflux transporters in drug resistance to antibiotics. FEMS.
Microbiol., Lett., 2006; 30: 36-52.
28. Douglas J.G., McLeod M.J.: Pharmakinetics factors in the modern drug treatment of tuberculosis. Clin. Pharmacokinet,
1999; 37: 127-146.
29. Drlica K., Malik M.: Fluoroquinolones action and resistance. Curr. Top.Med. Chem., 2003; 3: 249-282.
30. Duncan K.: Progress in TB drug development and what is still needed. Tuberculosis (Edinb), 2003; 83: 201-207.
31. Finken M., Krischner P., Meier A., Wrede B., Bottger E.C.: Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium
tuberculosis : iteration of the ribosomal protein S12 gene and point mutation within a functional 16S ribosomal
RNA pseudoknot. Mol. Microbiol. 1993; 9: 1239- 1246.
32. Flaherty D.K., Vesovsky B., Beamer G.L., Stromberg P., Turner J.: Exposure to Mycobacterium avium infection
generated by Mycobacterium bpvis BCG. J.Leukoc. Biol., 2006; 80: 1262-1271.
33. Flynn J.L.: Immunology of tuberculosis and implicationin vaccine development.. Tuberculosis (Edinb), 2004; 84:93-
101.
34. Forget E.J.: Adverse re actions to first-line antituberculosis drug. Expert.Opin. Drug., 2006; 5: 231-249.
35. Fraumfelder F.W., Sadun A.A., Wood T.: Update on ethanbutol optic neuropath. Expert.)pin. Drug. Saf., 2006; 5: 615-
618.
36. Ginsburg A.S. Grosset J.H., Bishai W.R.: Fluoroquinolones tuberculosis and resistance. Lancet Infect.Dis., 2003; 3:
432-442.
37. Gonzalo Asensio J., Maia C, Ferrer N.L., et al.: The virulence associated two-component PhoP-PhoR system controls
the biosynthesis of polyketide-derived lipids IN Mycobacterium tuberculosis. J.Biol. Chem., 2006; 281: 1313-1316.
38. Grode L., Seller P., Baumann S. et al.: Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium
bovis Calmette-guerin mutants that secrete isteriolysin . J.Clin.Invest., 2005; 115: 2472-2479.

331
39. Grosset J., Truffot-Pemot C., Ji B.: Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifamicin against
tuberculosis infection in mice. Antimicrob.Agents. Chemother., 1992; 36: 548-551.
40. Hasan S., Daugelat S., Rao P.S., Schreiber M.: Priotritizing genomic drug targets in pathogens : application to
Mycobacterium tuberculosis. PLoS .Comput.Biol., 2006; 2(6): e61.
41. Heym B., Honore N., Truffot-Pemot C., et al.: Implication of multidrug resistance for future of short-curse
chemotherapy of tuberculosis: a molecular study. Lancet, 1994; 344: 293-298.
42. Horwitz.,M.A.., Harth G.A., Dillon B.J., Maslesa S.: Recombinant bacillus Calmette Guerin (BCG) vaccines
expressing the Mycobacterium tuberculosis 30 kDa major secretory protein ind in Mycouce greather protective
immunity against tuberculosis than conventional BCG vaccines in higly susceptible animal model. Proc.
Natl.Acad.Sci.USA, 2000; 97: 13953-13958.
43. Horwitz M.A., Harth G.A.: A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the
current vaccine in the guinea pigs model of pulmonary tuberculosis . Infect. Immun., 2003; 71: 1672-1679.
44. Horvitz M.A.: Recombinant BCG expressing Mycobacterium tuberculosis major extra cellular proteins. Microb. Infect.,
2005; 7: 947-954.
45. Hu Y., Coates A.R., Mitchinson D.A: Sterilising cavities of fluorochinolones against rifampin-tolerant populations of
Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob.Agents. Chemother., 2003; 47: 653-657.
46. Hudson A., Iamamura T., gutteridge W., Kanyok T., Nunn P., The current anti TB drug research and development
pipeline. World Health Organization on be half of the special programme for research and Training in Tropical
Diseases, 2003, 1-44.
47. Jarlier N., Nkaido H.: Mycobacterial cell wall: structure and role in natural resistance to antibiotics. FEMS. Microbiol.
Lett., 2004; 123: 11-18
48. Jia L., Tomasowschi J.E., Hanrahan C., et al.: Pharmacodinamics and Pharmacokinetics of SQ109, a new diamine-
based antitubercular drug . Brit. J.Pharmacol., 2005; 202: 45-58.
49. Jin D.J., Gross C.A.: Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead ro rifampicin
resistance. J.Biol., 1988; 202: 45-58.
50. Kamath A.T. Fruth U., Brennan M.J., et al.: New life mycobacterial vaccines: the Geneva consensus on essential steps
towards clinical development. Vaccine, 2005; 23: 3753-3761
51. Kana B.D., Mizrahi V.: Molecular genetics of Mycobacterium tuberculosis in relation to the decovery of novel drugs and
vaccines. Tuberculosis (Edinb)., 2004; 84: 63-75.
52. Konno K., Feldmann F.M., McDemott W.: Pyrazinamide susceptibility and amidase activity of tubercle bacilli.
Am.Rev.Resp.Dis., 1967; 95: 461-469.
53. Langermans J.A., Doherty T.M., Vervenne R.A. et al.: Protection of macaques against Mycobacterium tuberculosis
infection by subunit vaccine based on fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. vaccine, 2005; 23: 2740-2750.
54. Launary-Vacher, Izzedine H., Deray G: Pharmacokinetic conside-rations in the treatment of tuberculosis in the
patients wirh renal failure. Clin.Pharmacokinet,, 2005; 44: 221-235.
55. Lomovskaya O., Bostian K.A.: Practical application and fesabiity of efflux pump inhibitors in the clinic: a vision for
applied use. Biochem. Pharmacol., 2006; 71: 910-918.
56. Lozes E., Huygen K., Content J., et al. Immunogenity and efficacy of tuberculosis DNA vaccine encoding the
components of the secreted antigen 85 complex. Vaccine, 1997; 15: 830-833.
57. Maccari R., Ottana R., Vigorita M.G.: in vitro advanced animycobacterial screening of isniazid-related hydrazones,
hydrazides and cyanoboranes. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005; 15: 2509-2513.
58. Manjunatha U.H., Boshoff H., Dowd C.S., et al.: Identification of a nitroimidazo-oxazine-specific protein involved in
PA-824 resistance in Mycoibacterium tuberculosis. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2006; 103: 431-436.
59. Martin C.: Tuberculosis vaccines: past, present and future. Curr. Opin. Pulm. Med., 2006; 12: 186-191.
60. Matei D., Iancu Adela, Matei Rodica, Cintez Eliza, Comneci Florica: tendinte actuale privind folosirea vaccinurilor in
Romania. Practica Med., 2009; 4(16): 1-10.
61. Meier A., Sander Schaper K.J., et al.: Correlation of molecular resistance mechanisms and phenotypic resistance levels
in streptomycin resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob.Agents., Chemother. 1996; 40: 2542- 2544.
62. Mikusova K., Slyden R.A., Besra G.S., Brennan PJ.: Bigenesis of the mycobacterial cell wall and the site of action of
ethanbutol. Antimicrob.Agent. Chemother., 1995; 39: 2484-2489.
63. Milington K.A., Innes J.A., Hackfont S., ,et al.: Dinamic relationship between IFPN gamma and IL-2 Profile of
Mycobacterium tuberculosis specific T-cells and Antigen Load. J.Immunol., 2007;178(8): 5217-522sehh6.
64. Moghazeh St., Pan X., Arain T., et al.: Comparative animycobacterial activities of rifampin, rifampentine, and KRM-
1648 against collection of rifampin resiser,, tant Mycobacterium tuberculosis isolates with known rpoB
mutations. Antimicrob. Agent. Chemother., 1996; 4: 2655-2657.
65. Mitchinson D.A.: The action antituberculosis in short course chemotherapy. Tubercle., 1985; 66: 219-225.
66. Murray J.F.: Current clinical manifestations of tuberculosis. Rev.Prat.1996; 46: 1344-1349.
67. Musser J.M.: Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin.Microbiol. rev., 1995; 8:
496-514.
68. Nahid P., Pai M., Hopewell P.C.: Advances in the diagnosis and treatment of tubercuosis . proc..AM.Thorac.Soc., 2006;
3: 103-110.
69. Newton D.J, Andrew E.M., Dalton J.E., Mears R., carding S.R.: Identification of Novel(gamma)(delta) T cells:
Homeostatic control (gamma)(delta T cells. Infect. Immun., 2006; 74(2): 1097-1105.
70. Nguyen L., Thompson C.J.:Foundations of antibiotic resistance in bacterial physiology: the mycobacterial paradigm.
Trend.Microbiol., 2006; 14: 304-312.
71. Nuembergher E.L., Grosset J.: Pharmacokinetic and pharmacu dynamic regimen greatly reduces time tu culture
conversion in murine conversion. 2004; 23: 243-255.
72. Nuemberger E.L., Yoshimatsu T, tyagi S., et al.: Moxifloxacin- containing regimen reduces ime to culture conversion in
murine tuberculosis. Am.J.Resp.Care Med., 2004b 169: 421-426.
73. Ohara N, Yamada T.:Recombinant BCG vaccines. Vaccine, 2001; 19: 4089- 4098.

332
74. Olsen A.W., Laurena A,H., van Pixteren Okkels L.M., Rasmussen P.B., Andersen P.: Protection of Mice with a
Tuberculosis subunit vaccine Based on fusion Protein of Antig n 85B and ESAT-6. Infect.Immun.,2001; 69(5):
2773-2778.
75. Olsen A.W., Williams A., Okkels L.M., Hatch G. Andersen P: Perotective effect of a tuberculosis subunit vaccine bassed
on fusion of antigen 85B and ESAT-6 in the aerosol guinea pig model. Infect.Immun., 2004; 72: 6148-6150.
76. Oneyebujoh P., Zumla A, Robeiro I., et al.: Treatment of tuberculosis: present status and future prospects.
Bull.EorldHealth.Oran., 2005; 83: 857-865.
77. Panchagnula R., Agrawal S., Asholraj Y., et al.: Fixed dose conmbinations for tuberculosis.Lessons lerned from clinical,
formulation and regulatory perspective. Methods Find Exp.clin.Pharmacol.,2004; 26: 703-721.
78. Pauli G.F., Case R.J., Inui T., et al.: New prspective an natural products in TB drug research, 2005; 78: 485-494.
79. Pedro Almeida da Silva. Jose A.Ainsa: Drugs and drug interactions. In: Tuberculosis2007. Palmino, Leao,
Rotacco ,eds, cap.18. pp. 593- 633.
80. Perez E., Samper S., Bordas Y., Guilhot C., Giquel B., Guilhot C.: efficient allelic change and trasposon mutagenesis in
Mycobacterium tuberculosis . Mol.Microbiol., 2001; 41: 179-187.
81. Poggi A., Castellani S., Musso A. Zacchi M.R.: gamma delta T Lymphocytes Producing IFN-gamma and IL-17 in
response to Candida albicans or Mycobacterial antigens: Possible implication for Acute and Chronic Inflamation.
Curr.Med.Chem., 2009; 63: 369-376
82. Price S.J., Hope J.C.: Enhanced secretion of interferon-gamma by bovine gamma-delta T cells induced by coculture
with Mycobacterium bovis infected dendritic cells: evidence for reciprocal activating signals. Immunol., 2009;
126(2): 201-208.
83. Protopova M., Hanrahan C., Nikonenko B., et al.: Identification of new antitubercular drug candidate, SQ109, from
combinatorial library of 1,2-ethylene diaminase. J.Antimicrob.Chemother., 2005; 56: 968-974.
84. Pyn A.S. Brodin P., Majilessi L., et al.: recombinant BCG exporting ESAT-6 confer enhanced protection against
tuberculosis. Nat.Med. 2003; 9533-539.
85. Ramaswany S.V., Amin A.G., Gokel S., et al.: Molecular genetics analysis of nucleotide polymorphism associated with
ethanbutol resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agent. Chemother., 2000; 44: 326-336.
86. Ramaswany S.V., Reich R. Dou S.J., et al.: Single nucleotide polymorphism in genes associated with isoniazid
resistance in Mycobacterium tuberculosis . Antimicrob.Agent.Chemother. , 2003; 47: 1241-1250.
87. Rattan A., Kalia A., Ahmed N.; Multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspective. Emerg..Int.Dis.,
1998;4: 195-209.
88. Rdu Maria : Cercetri privind antigenitatea i specificitatea unor extracte tuberculinice. Teza pentru obinerea
titlului de Doctor n Medicin Veterinar, Nr. 2008, ASA-FMV, Buc, 2007 ,
89. Saharyar M., Siddiqui A.A., Ali m.A. Sriram D., Yogeeswari P.: Synthesis in vitro antimycobacterial activity of N1-
nicoinoyl-3-(4-hydroxy 3- methyl-phenyl)-5-[ (subphenyl)]-2- pyrazoline. Bioorg.,Med.Chem.Lett, 2006; 16: 3947-
3949.
90. Samandamurthy V.K., Dernik S.C., Jalapathy K.V., et al.: Long term protection againsttuberculosis following
vaccination with a severely attenuated double lysine and panthoteauxotroph of Mycobacterium tuberculosis.
Infect.Immun., 2005; 73: 1196-1203.,
91. Samandamurthy V.K., Dernick S.C., Hsu T., et al.: Mycobacterium tuberculosis delta-RD1 delta pan CD: a safe and
limited replicating mutant strain that protects immunocmpetent and immunosupressed mice against experimental
tuberculosis. Vaccine, 2006; 24: 6309-6320.
92. Sampson S.L., Dascher C.C., Samandamurthy V.K., et al.: Protection elicited by a double leucine and panthotenate
auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect immune., 2004; 72: 3031-3037.
93. Santangelo M.P., McIntoch D., Bigi F., et al.: Mycobacterium bovis BCG as a delivery system for the RAP-1 antigen
from Babesia bovis. Vaccine, 2007; 25: 1104-1113.
94. Sardinho L.R.,Elias R.M., Mosca T., et al.: Contribution of NK,NK-T Gamma-delta T and alfa-beta T cells to the
gamma-interferon response Required for liver protection against for liver protection against Tripanosoma crusi.
Infect.Immun., 2006, 74(4): 2031-2042.
95. Saukkonen J.J., Cohn D.L., Jasmer R.M., et al.: An official ATS statement-hepatotoxicity of antituberculosis therapy.
Am.J.Resp.Crit.Care Med., 2006; 174: 935-952.
96. Scott A.Fulton, Thomas D.Martin, Raymond W.Redline , W.Henry Boom: Pulmonary immune responses during
Primary Mycibacterium bovis-calmette-Guerin Bacillus Infection C57B/6 Mice. Am.J.Cell.Resp. Med. Biol. 2000;
22(3): 333-343.
97. Shamputa I.C., Jugheli L., Sadradze N., et al.: Mixed infection and clonal representativness of a single sputum sample
in tuberculosis patients from a penitentiary hospital in Georgia. Resp.Res., 2006; 7: 99.
98. Sherman D,I, Mdlui K., Hickey M.J., Barry C.E., Stover C.K.: AhpC, oxidative stress and drug resistance in
Mycobacterium tuberculosis . Biofactors., 1999; 10: 211-217.
99. Sho C., Zang Y.H., Zang T., Wang L., Xu Z.: Cell-mediated Immune responses and Perspective Efficacy against infection
with Mycobacterium tuberculosis indced by Hsp 65 hIL-2 fusion Protein in Mice, Immunol. ,2009; 69(2): 140-149.
100. Silva P, Bigi F., Santangelo M.P., et al.: Characterization of P55 a multidrug efflux pump in Mycobacterium bovis and
Mycobacterium tuberculosis . Antimicrob. Agents. Chemother. 2001; 45: 800-804.
101. Smith D.A., Parish T., Stoker N.G., Bancroff G.J.: Charaterization of auxotrophic mutants Mycobacterium tuberculosis
and their potential as vaccine candidates. Infect Immun., 2001; 69: 114-150. .
102. Sreevestava S., Garg A., Ayagari A., Nyati K.K. et al: Polymorfism Associated with Ethanbutol Resistance in clinical
isolates of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Microbial., 2006; 53: 401-405.
103. Stout J.E.: Safety of rifamicin and pyrazinamide for treatment of latent tuberculosis infection. Expert Opin.Drug Saf.,
2004; 3: 178-198.
104. Stover C.K., Warrener P., VanDevanter D.R. et al.: A small-molecule nitroimidasopyran drug candidate for treatment
of tuberculosis. Nature, 2000; 405: 962-966.
105. Takayama K., Kilburn J.O.: Inhibition of sunthesis of arabinogalactan by ethanbuhol in Mycobacteriumsmegmatis.
Antimicrob.Agent. Chemother., 1989; 33: 1493-1499.
106. Telenti A., Philipp W.J., Sreevastava S., et al.: The emb operon, a gene cluster of Mycobacterium tuberculosis involved
in resistance to ethan butol. Nat.Med., 1997; 3: 567-570.
107. Temple M.E. , Nahta M.C.: Rifapentine: its role in the treatment of tuberculosis. Ann. Pharmacother., 1999; 33: 1203-
1210.
333
108. Tuberculosis Colaition for Technical Assistance (TCTA): International Standards for Tuberculosis Care (ISTC).
The Hague: TCTA, 2006
109. Williams D.L., Waguespack C., Eisenach K. et al.: Characterization of rifampin-resistance in pathog
Antimicrob.Agent.Chemother., 1994; 38: 2380-2386.
110. Williams D.L., Spring L. Collins L. et al.: Contribution of rifampin-resistance in Mycobacterium tuberculosis.
Antimicrob.Agent.Chemother. 1998; 42: 1853-1857.
111. Williams A., Hatch G.J., Clark S.O., et al.: Evaluation of vaccines in the EU TB vaccine Cluster using a guinea pig
aerosol infection model of turberculosis. Tuberculosis (EdinB), 2005; 85: 29-39. nic mycobacteria.
112. Winter N., Lagranderie M., Gangloff S., Leclerc C., Gehorghiu M., Gicquel B.: recombinant BCG strains expressing the
SIVmac251 nef gne induce proliferative and CTL response against nef syntetic peptides in mice. Vaccine, 1995; 13:
471-478.
113. World Helath Organization (WHO): Treatment of tuberculosis : Guidelines for National Programmes. , 3-rd
Edition, 2003, Geneva.
114. Zhang Y., Heym B. Allen B., Young D.,Cole S.: Th catalase paeroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium
tuberculosis. Nature, 1992; 358: 591-593.
115. Zhang Y., Telenti A.: A genetics of Drug resistance in Mycobacteirum tuberculosis. In: Molecular genetics of
Mycobacteria,,2000.
116. Zhang Y.: The magic bullet and tuberculosis drug targets. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2005 45 : 529-564..
117. Zvonar R. : Gatifloxacin-induced dysglycemia. Am.J. Health Syst.Pharm. , 2006; 63: 2087-2092.
118. Yamada C., Nagashima K., Takahashi A., et al.: Gatifloxacin actually stimulates insulin secretion and chemically
suppresses biosynthesis. Eur.J.Pharmacol., 2006; 553: 67-72.
119. Yang B., Koga H., Ohno H., et al.: relationship between antimycrobacterial activities of rifamycin, rifabutin and
KRM1648 and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis . J.Antimicrob.Cemother., 1998; 42: 621-628.
120. Yew W.W.: Clinically significant interactions with drugs used in the treatment of tuberculosis. Drug, Saf., 2002; 25: 111-133.

334
 CUPRINSUL

Pag.

CAPITOLUL I.
CONSIDERAII GENERALE ASUPRA TUBERCULOZEI..............1

1.1. Definiie .1
1.2. Istoric.....1
1.3. Distribuia geografic a tuberculozei la animale domestice
i slbatice. .........................................................................................7
1.4. Distribuia tuberculozei bovinelor n Romania.........................................9
1.5. Distribuia geografic a infeciei cu Mycobacterium bovis la oameni .9
1.6. Importana economic i sanitar...........................................................,13
Bibliografie la capitolul I. ....15

CAPITOLUL II.
ETIOLOGIA TUBERCULOZEI.................................................. ..........16

2.1. Taxonomie i clasificarea micobacteriilor.. 16

2.2. Morfologia i structura micobacteriilor 19
2.3. Rezistena bacililor tuberculozei la factori fizico-chimici27
2.4. Particulariti epidemiologice....30
2.5. Surse i ci de infecie.35
Bibliografie la capitolul II.37

CAPITOLUL III.
MCANISME IMUNOLOGICE I IMUNOPATOLOGICE N
INFECIA TUBERCULOAS ...............................................................41

3.1. Rspunsul imun mediat cellular..41

3.1.1. Componenta antigenic 43
3.1.2. Componenta celular.. 44
3.1.2.1. Neutrofilele . 45
3.1.2.2. Celulele mastocite (eozinofile i bazofile) . 46
3.1.2.3. Macrofagele 46
3.1.2.4. Leucocitele: Limfocitele T i B..60
3.1.2.5. Interleukinele i chemokinele..75
3.1.2.6. Patogeneza n tuberculoz...80
3.1.2.7. Hipersensibilitatea..95
3.1.2.8. Imunitatea umoral n tuberculoz..99
Bibliografie la capitolul III103

CAPITOLUL IV.
DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI............................................113

4.1. METODE DE DEPISTARE 114

4.1.1. EXAMENUL CLINIC 114
4.1.2. TESTE ALERGICE 131
- Intradermoreacia (IDR), testul Mantoux. 131
 - Testul intradermic unic (IDR-TU) la animalele domestice 133
- Testul intradermic comparativ simultan (IDR-TCS) 138
- Testul intradermic Mantoux (intrdermoreacia- IDR)... 141

4.1.3. METODE IMUNOLOGICE DE DEPISTARE IN VITRO A INFECIEI

TUBERCULOASE ... 144
- Testul de imunostimulare a limfocitelor (TISL); 145
- Msurarea gradului de imunostimulare a limfocitelor cu ajutorul
markerilor radioactivi.....148
- Testul imunoezimatic, procedeul sandwich, pentru detecia gamma-
Interferonului (EIAs-IFN) la bovine ..... 150
- Testul T-SPOT-TB...................162

4.1.4. METODE SEROLOGICE PENTRU DETECIA ANTICORPILOR N

DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI.........171
- Testul imunoenzimatic (ELISA) de detecie a anticorpilor... 173
- Testul imunoenzimatic (ELISA) pentru detecia IgG, IgM, IgA;.. 174
- Teste serologice rapide..... 181

4.1.5. EXAMENUL NECROPSIC.... 186

41.5.1 Examenul necropsic la bovine........ 186
4.1.5.2. Tabloul lezional n tuberculoz la om ..... 193
4.1.5.3. Prelevarea,conservarea i expedierea probelor pentru investigaii de
laborator......201

4.2. METODE DE CONFIRMARE A TUBERCULOZEI .....204

4.2.1. Metode bacteriologice convenionale .... 205
4.2.1.1. Examenul microscopic direct al amprentelor pentru BAAR.....205
4.2.1.2. Cultura micobacteriilor.... 217
4.2.1.3. Identificarea micobacteriilor...228
4.2.1.4. Metode bacteriologice moderne.................................................... 237
4.2.1.5. Metode de amplificare a acizilor nucleici .... 242
4.2.1.6. Metode genetice de identificare a micobacteriilor...248
4.2.1.7. Metode neconvenionale pentru diagnosticul fenotipic al
micobacteriozelor..............................................................................254
4.2.1.8. Analiza acizilor micolici din peretele micobacteriilor...258
4.2.1.9. Teste de patogenitate i virulen....262

4.2.2. EXAMENUL HISTOPATOLOGIC.....266

4.2.2.1. - Metode histopatolgice clasice........266
4.2.2.2. Metode imunohistochimice ......268

4.2.3. BULETINUL DE ANALIZ ..... 273

Bibliografie la capitolul IV.....275

CAPITOLUL V.
CLASIFICAREA EFECTIVELOR DE BOVINE SUB
RAPORTUL TUBERCULOZEI.............. ............................. 283
5.1. Efectiv de bovine indemn de tuberculoz...283
5.2. Statutul de efectiv indemn de tuberculoz....283

5.3. Suspendarea statutului de efectiv oficial indemn tuberculoz ..283

5.4. Efectiv de bovine declarat official cu tuberculoz..284
 CAPITOLUL VI.
PREVENIREA, PROFILAXIA I COMBATEREA
TUBERCULOZEI.........................................................................285
6.1. Imunoprofilaxia specific. Vaccinarea antituberculoas285
6.1.1. Vaccinul B.C.G. (Bacilul Calmette-Guerin)..286
6.1.2. Perspectivele vaccinerii antituberculoase......288
6.1.3. Vaccinuri antituberculoase pe baz de recombinani genetici.. 289
6.1.4. Subuniti vaccinale candidate la producerea B.C.G...291
6.1.5. Vaccinuri vii obinute din tulpini atenuate de M. tuberculosis.291
6.1.6. Vaccinarea antituberculoas n Romnia .293
6.2. Chimioterapia antituberculoas...295
6.2.1. Formule de tratament antituberculos...298
6.2.2. Doze trapeutice .298
6.2.3. Regimuri terapeutice...299
6.2.4. Preparate medicamentoase disponibile.301
6.2.5. Structura, aciunea farmacodinamic i toxicitatea medicamente-
lor antituberculoase.......302
6.2.6. Mecanismele rezistenei micobacteriilor la medicamentele anti-
tuberculoase.310
Medicamente noi pentru tratamentul tuberculozei...317
6.2.8. Produse analoge i derivai ai medicamentelor antituberculoase..317
6.2.9. Produse moleculare medicamentoase noi utilizate n trialuri
clinice...319
6.3. Programe de combatere i profilaxie general...320

Bibliografile la Capitolul VI.......................................................................331