FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ IAŞI

Colegiul Medicilor Veterinari din România

Profilul Supraveghere şi Diagnostic de Laborator

LUCRARE PRACTICĂ ÎN VEDEREA OBȚINERII

GRADULUI PROFESIONAL DE MEDIC PRIMAR
VETERINAR

Candidat,

LUPEŞ (PLEŞCAN) Geanina Carmen

2018
 FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ IAŞI

Colegiul Medicilor Veterinari din România

Profilul Supraveghere şi Diagnostic de Laborator

RABIA. CONTROLUL EFICIENŢEI LA VULPI

VACCINATE CU MOMELI VACCINALE. METODE DE
LABORATOR

Candidat,

LUPEŞ (PLEŞCAN) Geanina Carmen

2018

2
CUPRINS

INTRODUCERE................................................................................................................4

CAPITOLUL I..................................................................................................................6

1.1 Date bibliografice privind rabia. Importanţa şi istoricul bolii............................................................6

1.2 Etiologie.Proprietaţi fizice si chimice. Structura virusului şi organizarea genomului.......................7

1.3 Proprietăţi fizice şi chimice............................................................................................................. 9

1.4 Caractere epidemiologice.............................................................................................................. 10

1.5 Patogeneza................................................................................................................................... 11

1.6 Tabloul clinic................................................................................................................................. 12

1.7 Tabloul anatomopatologic............................................................................................................ 18

1.8 Diagnosticul.................................................................................................................................. 20

1.9 Profilaxia...................................................................................................................................... 21

1.10 Combatere.................................................................................................................................. 23

CAPITOLUL II..............................................................................................................24

2.1. Scopul lucrării.............................................................................................................................. 24

2.2 Detecţia markerului vaccinal (tetraciclina) în oase recoltate de la vulpi vaccinate antirabic cu
momeli prin examen microscopic (uv)................................................................................................ 26

2.3 Detectia anticorpilor antirabici postvaccinali prin testul imunoenzimatic (ELISA)..........................31

2.3.1 PLATELIATM RABIES II........................................................................................................................32
Tehnica de lucru.......................................................................................................................................33
2.3.2 BioPro Rabies ELISA Ab...................................................................................................................36
Tehnica de lucru.......................................................................................................................................37

CONCLUZII...................................................................................................................42

BIBLIOGRAFIE..............................................................................................................45

3
INTRODUCERE

Turbarea este o boală infecţioasă, sporadico-enzootică, comună omului şi unei

variate game de specii de animale homeoterme, domestice şi sălbatice, cu un caracter
evolutiv acut si caracterizându-se prin tulburări nervoase de tip senzorial şi motor,
exprimate prin hiperestezie si agresivitate, urmate de paralizie si fără excepţie moarte.
Turbarea este răspândită în toată lumea. Unele ţări favorizate şi de poziţia lor
geografică, dar şi ca urmare a unor măsuri drastice, au reuşit să devină şi să se menţina
indemne de turbare (Australia, Islanda, Norvegia, Anglia, Portugalia, etc). În general, în
ultimul timp se observă o recrudescenţă a bolii în unele regiuni care se considerau
indemne, datorită prezenţei virusului rabic printre animalele sălbatice .
Turbarea este o boală cu o mare importanţă economică, dar şi sanitară.
Pierderile determinate prin mortalitatea sau prin sacrificarea animalelor bolnave nu sunt
prea mari, dar cele mai impotante pierderi sunt date de necesitatea de întreţinere a
institutelor antirabice, de executarea acţiunilor profilactice în masa la animale şi de
scoatere din producţie a persoanelor muşcate pe timpul tratamentului sunt deosebit de
importante. Cea mai mare cheltuială financiară, în orice ţară din lume, este dată de costul
profilaxiei post-expunere la virusul rabic. Anual, pe glob, zeci de mii de persoane sunt
supuse tratamentului antirabic de necesitate şi sute de mii de animale de interes
economic şi animale de companie sunt supuse imunizarilor antirabice preventive sau de
necesitate. Acest lucru reflectă mii de zile de muncă pierdute pe lângă suferinţe,
cheltuieli de deplasare şi întreţinere, posibilităţi de accidente postvaccinale, uneori
mortale.
Rabia la animale si om, este 100% posibil de prevenit cu tratament medical
foarte urgent. Cu toate acestea, mor anual 55000 de oameni, cei mai mulţi în Africa şi
Asia, câte o persoană la fiecare zece minute. Cea mai importantă sursă, la nivelul
intregului glob, este rabia la câine, copiii fiind cei mai expuşi la turbare, aceştia sunt cei
mai uşor muşcaţi de câini. În Romania, cu toate că, carnivorele domestice au fost
4
vaccinate anual (costul profilaxiei fiind supotat de la bugetul de stat), a început să
crească foarte mult numărul de cazuri de rabie la animalele domestice datorită faptului
că în perioada 2006-2009, nu s-a realizat nici o campanie de vaccinare a animalelor
sălbatice. Ca urmare, în această perioadă, costurile profilaxiei antirabice a crescut de la
un an la altul datorita vaccinării unui număr din ce în ce mai mare de oameni muşcaţi de
animale turbate sau suspecte de turbare.
Începând cu anul 2010, când s-a reînceput vaccinarea la vulpi cu momeli
vaccinale şi recoltarea acestora prin vânatoare de control, numărul focarelor de rabie
scăzut constant până în anul 2018. În anul 2018 nu s-a înregistrat până în prezent nici un
focar de rabie.

CAPITOLUL I

5
1.1 Date bibliografice privind rabia. Importanţa şi istoricul bolii

Rabia sau turbarea a fost cunoscută din cele mai vechi timpuri, existenţa şi
formele ei clinice fiind semnalate şi descrise încă din antichitate. Cuvântul grecesc
"lyssa" utilizat pentru desemnarea rabiei înseamnă nebunie. Cuvântul rabie vine din
latinescul "rabiere": a fi violent, care derivă din sanscrita veche "rabhas".
O descriere amplă a bolii datează din primul secol al erei noastre, şi este făcută
de Celsus. El prezintă nu numai semnele bolii, dar şi unele indicaţii privind profilaxia
(arderea regiunii muşcate de un animal turbat, cu fierul roşu, sau chiar amputarea
regiunii respective, când este posibil – mână, picior ).
Transmisibilitatea, prin muşcatură, este admisă de mult timp, însă faptul nu este
demonstrat experimental decât la începutul secolului al XIX-lea, când Zinke (1804) şi
apoi Magendie (1821) şi Hertwig (1829) reuşesc să transmită, cu regularitate, turbarea
prin saliva animalelor bolnave.
În 1881, Pasteur şi Roux au stabilit că agentul turbării se gaseşte în sistemul
nervos central la animalele bolnave şi moarte de turbare şi că, prin inocularea creierului
sau măduvei spinării, boala se reproduce totdeauna la animalele de laborator. Agentul
patogen nu s-a putut vedea la microscop şi nici nu s-a putut cultiva pe medii sintetice şi
de aceea, Pasteur, l-a denumit ”virusul rabic” (de la cuvantul latin virus-otrava).
Ulterior, în perioada 1881-1884, Pasteur a elaborat prima metodă ştiinţifică de imunizare
antirabică, folosind o tulpina de virus rabic (de vacă) a cărei patogenitate a fost
modificată prin inoculări subdurale la iepuri. După aproximativ 60 de pasaje, a constatat
că această tulpină a devenit apatogenă pentru câine, pe cale subcutanată, dar şi-a păstrat
proprietăţile imunizante, iar pe cale intracerebrală, provoacă constant turbarea paralitică,
după o incubaţie de 7 zile.
Această variantă de virus rabic obtinuţă în laborator a fost denumită de Pasteur
“virus fix”, pentru al deosebi de virusul nativ, care circulă în natură, denumit “virus rabic
de stradă”. Pentru imunizarea antirabică, Pasteur a folosit măduva spinarii de la iepuri
inoculaţi subdural cu virus fix care se usucă la 22 o C, la întuneric, în prezenţa hidratului
de potasiu, timp de 1-15 zile. Tratamentul antirabic a fost aplicat pentru prima dată de
Pasteur, în 1883, la câini şi în 1885 la om. În scurt timp, metoda pasteuriană s-a extins în
toată lumea.

6
 Primul institut antirabic este infiinţat la Odesa, de Gamaleia (1886), iar al doilea,
la Bucureşti, de Babeş (1888). In 1889, Babeş şi Lepp au aratat că în sângele animalelor
imunizate contra turbării apar anticorpi specifici, care neutralizează virusul rabic, fix, şi
de strada “in vitro”, fiind primii care au folosit serul antirabic în tratamentul oamenilor
muşcati. Roux şi Nocard (1890) au stabilit că saliva animalelor infectate cu virus rabic
de stradă devine virulenta cu 3-8 zile înaintea apariţiei primelor simptome de turbare.
În 1892, Babeş a descris modificările histopatologice în sistemul nervos central şi a
semnalat prezenţa unor incluzii oxifile în citoplasma celulelor nervoase, fară să arate
însă importanţa lor pentru diagnosticul turbării. În 1903, Negri demonstrează
specificitatea incluziilor descrise de Babeş, care au fost denumite “corpusculii lui
Negri”.
În 1950, la Congresul Internaţional de Microbiologie din Praga, aceasta denumire
s-a rectificat, şi astăzi incluziile poartă denumirea de “corpusculii Babeş-Negri“.
Descoperiri importante s-au facut şi în domeniul etiologiei, patogeniei şi
epizootologiei turbării. S-a reuşit cultivarea virusului rabic în culturi de ţesuturi, în ouă
embrionate, în tumori maligne “in vivo” şi “in vitro”, constatându-se că virusul formează
incluzii oxifile, nu numai în celulele nervoase, dar şi în celulele epiteliale din cornee.S-a
stabilit, de asemenea, că în organismul infectat virusul se propagă centripet şi centrifug,
pe traiectul nervilor, virusul nu este stabil, se poate modifica relativ usor sub influenţa
condiţiilor de mediu, observându-se că în diferite zone se întalnesc tulpini de virus
deosebite ca virulenţă şi patogenitate (VELESCU Elena,2004).

1.2 Etiologie.Proprietaţi fizice si chimice. Structura virusului şi organizarea

genomului.

Agentul etiologic al meningoencefalitei rabice este un Lyssavirus ce aparţine

ordinului Mononegavirales, familiei Rhabdoviridae, care cuprinde trei genuri
Lyssavirus, Ephemerovirus, si Vesiculovirus.
Încă din 1956, la sfârşitul primei izolări a virusului rabic în Africa, s-a dovedit că
este unic şi antigenic distinct de celelalte virusuri aparţinând fam. Rhadoviridae.
Analizele efectuate cu ajutorul anticorpilor monoclonali au pus în evidenţă deosebiri
antigenice între tulpinile de virus rabic sălbatic izolate din diferite zone ale globului.
La unele tulpini antigenice s-au găsit diferenţe atât în structura antigenelor de
înveliş, cât şi a antigenelor nucleoproteice. În genul Lyssavirus au fost clasificate 4
serotipuri, diferenţiate prin teste de reactivitate antigenică încrucişată faţă de anticorpii
7
monoclonali: serotipul 1-RABV; serotipul 2, virusul Lagos al liliecilor- LBV; serotipul
3, virusul Mokola –MOKV; serotipul 4 , virusul Duvenhage-DUVV. Ulterior izolării
unor noi lyssavirusuri la lilieci, în Europa, în Australia şi progreselor în caracterizarea
genetică a genelor (N,P si G) genul Lyssavirus a fost împarţit in 7 genotipuri. La primele
4 se adaugă : genotipul 5, virusul liliacului european-EBLV-1; genotipul 6, virusul
liliacului european-EBLV-2; genotipul 7, lyssavirusul liliacului australian (VELESCU
Elena,2004).
Fiecare genotip subliniază corespondenţa între tipul de virus care circulă în
diferitele regiuni ale globului, dar şi între acesta şi specia gazdă. Genotipurile se împart
în două filogrupuri: I-cuprinde genotipurile 1,4,5,6 şi 7 şi II-cuprinde genotipurile 2 şi 3.
Cele două filogrupuri se disting prin patogenitate şi imunogenitate. RABV, DUVV,
EBLV si ABLV, care conservă situsurile antigenice de pe suprafaţă pot fi anihilate prin
vaccinare antirabică. La diferite tulpini de virus intervin diferenţe legate de patogenitate.
Astfel, se întâlnesc tulpini de virus atenuate natural (izolate de la ierbivore), care
determină îmbolnăviri cu o perioadă de incubaţie prelungită şi cu simptomatologie
atipică. De asemenea se întâlnesc şi virusuri „întărite”, cu o virulenţa exaltată, cu o
perioadă de incubaţie şi de evoluţie scurtă (2-3 zile).Virusul „sălbatic”, prezintă unele
particularităţi şi în funcţie de specia pe care este întreţinut în cadrul enzootiilor
(VELESCU Elena,2004 ).
Virusul rabic natural, cel care provoacă turbarea spontană la diferite specii de
animale şi om şi care se transmite în mod obişnuit prin muşcătură sau zgârietură, a fost
denumit şi ”virus stradal”. Însuşirile sale pot să fie foarte variate de la o tulpină la alta.
Spre deosebire de acesta ,”virusul rabic fix”, obţinut de PASTEUR în condiţiile amintite
(prin inoculări succesive la iepure), dispune de o serie de particularităţi printre care cele
mai importante sunt:
(i)exaltarea patogenităţii pentru sistemul nervos central şi piederea ei pentru alte
ţesuturi;
(ii)constanta şi scurtarea perioadei de incubaţie (4-7 zile);
(iii)în organism nu se propagă centripet şi centrifug pe traiectul nervilor şi nu se elimină
prin salivă;
(iiii)regularitatea tabloului clinic, în sensul că boala produsă de virusul rabic fix
evolueză numai sub formă paralitică.
(iiiii) nu formează, de regulă, corpusculi Babeş-Negri, decât în anumite zone ale
sistemului nervos central şi anume în nucleii optici bazali (zona lui Nicolau).

8
 Trebuie specificat însă că aceste însuşiri dobândite în condiţii experimentale sunt
reversibile. Sub influienţa hialuronidazei, de exemplu, virusul rabic fix, nepatogen de
regulă, pe cale subcutanată, după treceri repetate, poate să recapete însuşirile iniţiale ale
virusului stradal.
În organismul animalelor bolnave sau moarte de turbare concentraţiile cele mai
ridicate de virus se găsesc în sistemul nevos central. Repartizarea în diferiţii centri
nervosi nu este uniformă. Ganglionii spinali şi ai nervilor cranieni conţin şi ei virusul, în
timp ce, nervii periferici îl conţin inconstant. Excepţie fac nerviii senzitivi faciali şi
glandele salivare, care s-a observat că sunt la fel de virulenţi ca şi creierul. Trebuie
precizat că virulenţa salivei este maximă după apariţia semnelor clinice, când ea poate fi
mai mare chiar decât a creierului. Slab virulente sau avirulente sunt sângele, ganglionii
limfatici, ţesutul muscular, lichidul cefalorahidian, laptele, urina, secreţiile genitale,
materiile fecale şi bila.

1.3 Proprietăţi fizice şi chimice

Rezistenţa virusului rabic diferă în limite largi şi depinde în mare măsură de

materialul în care se gaseşte. Procesele proteolitice care distrug substanţa nervoasă,
distrug în acelaşi timp şi virusul rabic.
În general virusul se distruge repede sub acţiunea luminii solare şi a căldurii şi se
conservă bine în stare uscată şi la temperaturi joase. În suspensii apoase de creier 1% la
56 °C , virusul este distrus într-o oră, la 60 °C în zece minute, iar la 70°C este distrus
instantaneu. Eliminat cu saliva în mediul extern, virusul rămane infectant cel mult 24 de
ore. Putrefacţia şi autoliza acţionează lent. Astfel, în cadavre virusul poate supravieţui 45
de zile. Prin uscare lentă, virusul se distruge treptat în 10-14 zile, dar prin uscare rapidă
şi congelare virusul îşi păstrează virulenţa peste 3 ani. În soluţie apoasă de glicerină 50%
şi păstrat la rece, virusul rabic de stradă se conservă până la doi ani, iar virusul rabic fix,
până la un an. Toate substanţele antiseptice distrug repede virusul (fenolul, formolul,
soda caustică distrug virusul în câteva secunde) (CARP-CARARE M.,2001).

1.4 Caractere epidemiologice

În condiţii naturale sunt receptive la infecţia rabică în masură aproape egală,

toate speciile de mamifere domestice şi sălbatice, inclusiv omul. Turbarea are caracter
sporadic, frecvenţa bolii variază de la o specie la alta, după modul de viaţă şi

9
posibilităţile de contaminare existente. Astfel, dintre animalele domestice turbarea se
întâlneşte frecvent la câine, apoi la pisici datorită modului de viaţă a indivizilor din
această specie, libertate sau semilibertate. La rumegătoare boala poate evolua sub formă
de enzootii, mai ales în sezonul de păşunat.Păsările sunt în general mai puţin sensibile la
infecţia cu virusul rabic, iar la mamiferele hibernante evoluţia bolii depinde de perioada
de hibernare – în acest timp boala stagnează.
Sursele naturale ale infecţie rabice, sunt reprezentate, în primul rând de
animalele bolnave şi cele infectate, aflate în ultima faza a perioadei de incubaţie. Virusul
rabiei se conservă în natură numai în orgnismul animalelor infectate, ca urmare, sursele
secundare au o importanţă minoră.
Rezervoarele de virus sunt în principal animalele sălbatice – vulpile, lupii,
jderii, liliecii hematofagi (la aceştia virusul nu invadează sistemul nervos deci, animalul
nu face encefalita şi nu moare, dar elimină virusul prin glandele salivare, acţionând ca
sursă de infecţie persistentă în natură). La animalele infectate şi bolnave virusul se
găseşte în sistemul nervos central şi periferic, dar repartiţia lui nu este uniformă. Virusul
se găseşte în salivă, la sfârşitul perioadei de incubaţie şi persistă pe tot parcursul
evoluţiei bolii. Laptele animalelor turbate nu conţine virus şi nu se citează cazuri de
boală transmisibilă prin lapte.
În urină virusul se găseşte inconstant şi în cantitate foarte mică. Îmbolnavirea
animalelor şi omului depinde de cantitatea de virus pătruns în organism, de numărul
muşcăturilor, de profunzimea si localizarea lor. Foarte grave sunt zgâieturile ghearelor
de pisică, deoarece aceste animale îşi ling adesea faţa palmară a labelor anterioare şi
ghearele pot fi astfel încărcate cu salivă infectantă.
Au fost şi cazuri de turbare la om prin lingerea de către câinele bolnav a pielii,
cu zgârieturi proaspete sau în cazul efectuării autopsiilor la animale şi oameni.
Turbarea este o boală cu focalitate naturală (PERIANU Tudor, 1997).
Sursele de infecţie sunt reprezentate de : muşcătura şi zgârieturile animalelor turbate,
cadavrele animalelor turbate (contaminarea se poate produce în timpul necropsierii,
recoltării creierului sau când cadavrul este devorat), obiectele murdărite cu saliva
animalelor turbate, cu condiţia ca după contaminare ele să vină în contact foarte rapid cu
o soluţie de continuitate la nivelul pielii şi mucoaselor (virusul are o rezistenţă foarte
mică în mediul extern).

10
 Apariţia şi difuziunea infecţiei rabice nu este influenţată de factorii de mediu, ci
numai de posibilităţile de contaminare, ce pot varia de la o ţară la alta, de la o regiune la
alta, şi de la un sezon la altul.
Cu cateva excepţii, rabia este întâlnită peste tot în lume. Ţări ca: Anglia, Irlanda,
Suedia, Norvegia, Finlanda, Japonia, Australia, Singapore, Indonezia, ţari insulare sunt
ferite de contaminare. O ţară este considerată liberă din punct de vedere al rabiei, dacă
nu s-au înregistrat cazuri de rabie, atât la oameni, cât şi la animale, în ultimii doi ani.
Multe ţări practică vaccinarea contra turbării şi la animalele sălbatice, dar virusul este
prezent datorită contaminarii ţărilor vecine, nefiind controlabilă mişcarea animalelor
sălbatice.

1.5 Patogeneza

Virusul turbării, odată pătruns în organism prin intermediul unei soluţii de continuitate
de la nivelul pielii sau mucoaselor, se propagă centripet (după 4-6 ore) pe calea filetelor
nervoase, pe care le invadează progresiv şi ajunge în ganglionii spinali. De aici, urmând
calea spre sistemul nervos central, ajunge în encefal, unde provoacă encefalita rabică.
Propagarea centripetă a virusului rabic de la poarta de intrare de-a lungul nervilor, a fost
denumită de LEVADITTI, neuroprobazie. În neuronii sistemului nevos central, virusul
se replică, prin prezenţa sa, determina o serie de alteraţii morfologice şi funcţionale, care
stau la baza exprimării clinice a turbării. La un anumit prag al procesului de multiplicare,
virusul se dispersează în sens invers (centrifug), tot pe traiectul nervilor, realizând aşa
numitul fenomen de septinevrită. Difuziunea virusului în organism se mai poate realiza
şi pe cale sanguină sau limfatică (spaţiile limfatice endoneurale), însă importanţa
acestora este minoră. În cursul replicarii sale în neuronii senzitivi şi motori din sistemul
nervos central (care durează 5-6 zile), virusul antrenează importante perturbări ale
funcţiilor acestora, care sunt incompatibile cu o comportare normală a animalului.
Timpul în care se produc, este variabil cu virulenţa tulpinii de virus rabic în cauză, cu
receptivitatea individuală, tipul de sistem nervos etc. . Iniţial, se produce o exaltare a
funcţiilor neuronale (tradusă prin stari de excitaţie psihică, senzitivă, motorie, prin
exagerarea reflexelor), după care datorită fenomenelor degenerative care se instalează,
apar manifestări de depresiune, paralizie şi în final, moartea. Trebuie subliniat că
pătrunderea virusului rabic în organism nu este urmată în mod obligatoriu de infecţie.
Pentru realizarea infecţiei rabice este necesar ca, la nivelul porţii de intrare să se
găsească filete nervoase recent lezionate, şi se va produce cu atât mai repede cu cât
11
cantitatea de ţesut lezionat este mai mare. În cazuri excepţional de rare , virusul rabic
ajuns în centrii nervoşi poate rămâne în stare de latenţă un timp îndelungat şi sub
influienţa unor factori favorizanţi, se poate reactiva. De asemenea, se poate întâmpla ca
virusul rabic ajuns în centri nervosi, să fie distrus de forţele de apărare ale organismului,
în timp ce leziunile provocate să ducă totuşi la moartea animalului-infecţie mortală
autosterilizantă( PERIANU Tudor, 1997). Faptul are importantă deosebită în activitatea
de diagnostic, el explicând cazurile de nereuşită a reproducerii infecţiei la animle de
experienţă, cu toate că materialul patologic provine de la animale care au murit de
turbare.

1.6 Tabloul clinic

Câinele dintre toate animalele domestice sau salbatice, este animalul care prezintă cel
mai frecvent infecţia rabică, este animalul care duce cu el turbarea în toate zonele lumii.
Toate rasele de câini sunt egal receptive.
Turbarea evoluează fie sub forma furioasă, fie sub forma paralitică.
În forma furioasă, tulburările sunt dependente de faza evolutivă a bolii.
a)faza prodromică poate trece neobservată, semnele clinice fiind şterse şi
nesemnificative. Primele tulburări constau în febră (hipertermie discretă-39,6-39,8°C)
urmată de semnele prodromice propriu-zise (PERIANU Tudor, 1997). Ele sunt
consecinţa acţiunii iritative a virusului asupra centrilor nervoşi ai organelor de simţ.
Animalele care în mod obişnuit sunt vioaie şi sociabile, devin indiferente, apatice,
somnolente, se retrag în locuri mai izolate, mai întunecoase, nu răspund la chemare sau
din contră, animale care sunt liniştite, blânde sau "limfatice", devin agitate, irascibile
caută anturajul altor animale sau al omului, manifestă o afectivitate exagerată faţă de
stapân sau îngrijitor. Apoi încep să devină mai neliniştite, agitate, stare care se
accentuează, răscolind aşternutul, scormonind pământul, rod cuşca, lanţul sau alte
obiecte de prin preajmă. Pot fi observate adesea semnele unei stări de halucinaţie şi
pervertirea gustului. La orice excitant (zgomot, atingere, lumină puternică) reacţia este
bruscă, nejustificat de puternică. Apetitul, dacă la început este nemodificat, acesta se
diminueaza treptat şi în final se transforma în pică (ingerarea de corpi străini) . Setea
este conservată sau chiar exagerată, spre deosebire de om la care apare hidrofobia(semn
cvasi prezent). Uneori, se pot observa semnele unei senzaţii de prurit sau durere la
nivelul muşcăturii sau cicatricii rămase, după eventuala vindecare a plăgii respective. Ca

12
urmare, animalele îşi ling, freacă sau chiar muşcă regiunea până la automutilare. La
masculi se poate observa hiperexcitaţie genezică.
Spre sfârşitul acestei faze se constată schimbări în tonalitatea şi timbrul vocii.
Prin pareza şi paralizia de origine centrală, a muşchilor laringieni şi a coardelor vocale,
vocea devine mai groasă, răguşită, iar lătratul scurt, sacadat, sfârşind printr-un urlet
prelung. În timpul lătratului se observă oprirea şi ridicarea în sus a botului. Durata
acestei faze prodromice este in medie e 1-3 zile.
b)faza de stare corespunde instalării proceselor inflamatorii de la nivelul
sistemului nervos central, cu hiperexcitaţia centrilor nervoşi corticali şi sub- corticali. Ea
se manifestă prin stări de furie şi agresivitate. Din cel mai neînsemnat motiv sau chiar
nejustificat, animalul devine furios, agresiv şi se repede să muşte. Iniţial această
agresivitate se manifestă în special faţă de animale, dar apoi şi faţa de om. Mai ales faţă
de câini, agresivitatea este foarte pronunţată. Accesele de furie sunt la început, de scurta
durată şi alternează cu perioade relativ lungi de linişte, pentru ca pe măsură ce boala
progresează să devină din ce în ce mai frecvente. Forţa cu care animalele turbate muşca
este deosebită, ceea ce face ca ele să-şi rupă dinţii şi uneori să se producă fractura
maxilarelor. Dacă sunt in cuşti, se reped la gratii, încercănd să le rupă, producându-şi
astfel leziuni foarte grave, fapt care denotă pierderea instinctului de conservare. Faciesul
este caracteristic, în cursul acceselor de furie, devine feroce, cu privirea fixă, pânditoare,
pentru ca in perioadele dintre accese să apară inexpresiv, cu privirea rătăcită. In cazul
câinilor din gospodării se constată dispariţia lor rătăcind fără nici o ţintă (dromomanie).
În calea lor atacă alte animale, se încaieră, pătrund in turme, în colectivităţi. O
carateristică a modului în care atacă este faptul că o fac prin surprindere, fără să latre
ceea ce îi fac şi mai periculoşi .Durata acestei faze este de 2-6 zile.

c)faza terminaăa (depresivă, paralitică) este anunţată de modificările vocii, care

sfârşesc prin afonie. Treptat tulburările paralitice cuprind şi alte regiuni: muşchi linguali,
maseteri, oculomotori, ai membrelor. Paralizia muşchilor maseteri face ca maxilarul
inferior să atârne inert, cu scurgerea unei salive filante, vâscoase. Limba atârnă prin gura
intredeschisă, animalul încercând din când în când, uşoare mişcari dezordonate. Pleoapa
a treia devine proieminentă. Paralizia cuprinde treptat şi alte grupe musculare.Accesele
de excitaţie devin din ce în ce mai rare şi mai şterse, iar când apare paraplegia deplasarea
nu mai devine posibilă şi, după câteva ore de agonie, survine, moartea prin asfixie.
Durata acestei faze variază intre 3 si 6 zile, rareori se lungeşte la 10-12.

13
Forma paralitica de turbare se manifestă prin lipsa oricarei manifestări de excitaţie,
furie sau agresivitate.

În faza prodromica, tulburările sunt asemănătoare cu cele descrise in forma

furioasă, dar sunt mult mai şterse. Se constată o stare de depresiune, urmată foarte
precoce de fenomenele paralitice, care constituie dealtfel, principalele manifestări
clinice. Ele incep cu muşchii maseteri şi faringieni. Deglutiţia este îngreunată, din gura
întredeschisă se scurge salivă filantă. Modificările de timbru ale vocii survin precoce,
ajungând la afonie. Faciesul exprimă tristeţe şi suferinţă, cu privire absentă, uneori cu
perioade scurte care reflectă starea de conştienţă. Apetitul este supimat. Setea, cu toate
că este prezentă animalul nu poate să bea din cauza paraliziei. Pe masură ce boala
progresează, starea generală se agravează animalul devine absent, ea se termină prin
paralizie generală. Moartea se produce dupa 2-4 zile, rareori după o săptămână sau mai
mult după apariţia semnelor clinice. In cazuri mai rare, turbarea paralitică poate să
înceapă prin paralizia unei grupe musculare, dar care evoluează spre paralizie
generalizată.

În afară de aceste forme de turbare, au mai fost descrise la câine şi forme

intermediare sau atipice. Astfel, au fost citate : forma gastrointestinală, cu vomismente,
colici, diare hemoragică, fără agresivitate; forma meningeală , cu o evoluţie supraacută;
forma consomptivă sau atrofică, în care se produce o slăbire progresivă, fără alte semne
ale turbării.

Turbarea la carnivorele sălbatice. Dacă la lup şi alte canide sălbatice,

semnele clinice sunt asemănătoare cu cele de la câine, la vulpe turbarea îmbracă o formă
atipică, lipsită de agresivitate. Vulpile au un comportament straniu, se apropie de oameni
fără nici o reţinere, pătrund în colectivităţi de oameni în plină zi fără a manifesta nici un
fel de agresivitate.Uşurinţa cu care sunt adesea capturate trebuie să constituie un motiv
de suspiciune, întotdeauna.De un pericol extrem sunt muşcăturile de lup, care prin
localizarea lor, cel mai frevent in regiunea cefalică, fac ineficient tratamentul antirabic,
persoanele muşcate, mor de turbare cu toate că se intervine rapid cu tratamentul
antirabic.

Turbarea la pisică. Turbarea se manifestă prin tulburări asemănătoare cu cele

descrise la câine. In proportie de 90% din cazuri forma de turbare pe care o fac pisicile
este cea furioasă. Perioada de incubaţie este de 10-15 zile, dar poate dura şi mai mult.

14
Încă din faza prodromică animalul devine agresiv, miauna neîncetat, cu o voce stridentă,
apoi răguşită, se repede la om şi animale, muşcă, zgârie.
Trebuie menţionat că zgârieturile de pisică sunt deosebit de periculoase deoarece, pe
de o parte, afectează un număr mare de filete nervoase, iar pe de altă parte, fiind
profunde sângereaza foarte puţin, micşorând şansele ca virusul să fie eliminat prin
sângerare. Pupilele sunt puternic dilatate, uneori inegale. In fazele de excitaţie, se
constată adesea accese convulsive, în cursul cărora pisicile cad, se rostogolesc, ţipă
strident, pot să moară subit. În faza paralitică, se produce pareza şi apoi paralizia
diferitelor grupe musculare, începând cu laringele şi maseterii. Durata bolii in aceasta
formă este de 3-6 zile.
În forma paralitică –faza prodromică este foarte scurtă, intervenind precoce
paralizia maseterilor. Animalul ţine gura deschisă, salivează abundent (are trenul
posterior umectat), prezintă agresivitate. După o evoluţie de 2-4 zile, boala se încheie cu
moartea, datorită paraliziei centrilor respiratori.

Turbarea la ecvine. Turbarea poate să evolueze în forma furioasă (cel mai frecvent)
sau paralitică. Perioada de incubaţie este de 1-3 luni( PERIANU Tudor, 1997 ).
În forma furioasă, se constată întâi o stare de nelinişte, manifestată prin mişcări
permanente ale cozii, bătăi din picioare( anterioare), culcări şi sculări repetate, tresăriri,
rostogoliri. Adesea boala debutează cu o hiperestezie la locul de pătrundere a virusului
(mai ales la nivelul buzelor), ceea ce se exprimă prin frecarea regiunii, de obiecte,
agitaţie. Muşchii buzei superioare sunt contractaţi în permanenţă, oferind imaginea unui
râs sardonic. Animalul manifestă agresivitate (se repede la alte animale, pe care le muşcă
sau le loveşte cu picioarele). El devine periculos, datorită forţei şi agilitaţii cu care atacă
(muşcă sau loveşte prin surprindere). Rapid se instaleaza o pareza faringiană, ceea ce
face imposibilă deglutiţia, cu apariţia la comisuri a unei salive spumoase. Tentativa de a
bea se traduce prin ridicarea capului asemenea păsărilor sau prin întoarcerea apei prin
nări. În cursul fazelor de excitaţie, animalul poate rupe căpăstrul sau ieslea, apucă
obiectele din jur, uneori cu o asemenea forţă încât işi provoacă fracturarea incisivilor,
molarilor sau chiar a maxilarului inferior. Eliberat are tendinţa de a o lua la fugă,
alergând fără a ţine seama de obstacole, distrugînd totul in cale. În cursul acceselor se
pot inregistra frecvent fracturi, chiar şi la coloana vertebrală. Accesele sunt urmate de
faze de linişte în care animalul are respiraţie accelerată, zgomotoasă, privirea fixă, cu
pupilele dilatate sau conjunctivele congestionate. Nechezatul este răguşit, gros,
prelungit. Cel mai mic zgomot este capabil să declanşeze un nou acces. Frecvent se
15
observă un prurit pronunţat, care face ca animalul să-şi smulgă porţiuni întregi de piele
sau muşchi, în special in apropierea zonei unde a fost muşcat, automutilându-se. Se
constată hiperexcitatetie genezică şi urinări frecvente. Apoi, apar progresiv semnele
paraliziei şi parezei la nivelul musculaturii membrelor (de obicei cele posterioare), ceea
ce face mersul vaccilant, apoi imposibil. Animalul cade in decubit in decurs de 4-6 zile
de la apariţia primelor semne de boală, după care se produce moartea. În forma paralitică
domină încă de la inceput, starea depresivă şi de imobilitate. Calul işi sprijină capul de
perete sau iesle, rămânând în aceeaşi poziţie ore în şir. Apoi, survin fenomenele
paralitice, care fac ca animalul nu se mai poate menţine în staţiune patrupodala,
rămânând în decubit până la moarte. La celelalte solipede turbarea se manifestă în
general ca cea de la cal, dar tabloul clinic este dominat de prurit, fără agresivitate.
Evoluţia este de regulă rapidă (PERIANU Tudor, 1997).
Turbarea la taurine. Incidenţa bolii la această specie este destul de ridicată, în
comparaţie cu alte specii de fermă. Forma clinică pe care o îmbracă poate fi furioasă sau
paralitică, faptul fiind legat şi de zona geografică în care apare. Astfel, în ţările Americii
de sud apare exclusiv forma paralitică, în timp ce, în altele predomină forma furioasă.

Forma furioasă-incepe cu căscături frecvente, salivaţie abundentă, modificarea

timbrului vocii. După un interval de 1-2 zile, apar accese de furie şi agresivitate,
manifestate prin agitaţie, lovirea ieslei, pereţilor şi a oricaror obiecte din jur, tendinţa de
a sări pe pereţi, de a se elibera din lanţ. Animalul rage frecvent, uneori fără întrerupere,
vocea fiind răguşită şi din ce în ce mai voalată. Reacţionează violent la prezenţa sau
numai la lătratul câinilor. La păşune se observă excitaţii genezice, lovirea celorlalte
animale scormonirea pământului cu coarnele etc. Frecvent se produc fracturi ale
coarnelor. Agresivitatea se manifestă şi faţă de om. Perioadei de furie îi urmează faza
paralitică, ce începe cu faringele şi laringele. La unele animale disfagia se instaleaza
foarte precoce şi se traduce prin imposibilitatea ingerării hranei şi mai ales a apei. Este
deosebit de semnificativ comportamentul animalelor din acest punct de vedere: ele
manifestă şi dorinţa de a bea apa, încearcă să bea, dar imposibilitatea deglutiţiei le
determină să verse vasul, aceasta repetându-se ori de cate ori încearcă.

In final, se produce paralizia progesivă, moartea survenind dupa 4-6 zile de la

debut. Forma paralitică se traduce, iniţial, printr-o sensibilitate a regiunii
glosofaringiene, manifestată prin salivaţie abundentă, spumoasă, încercări de deglutiţie
însoţite de mişcări permanente ale buzelor, ale limbii, scrâşniri din dinţi, răguşirea vocii,

16
mugete prelungi. Rumegarea încetează şi apare timpanismul, uneori cu diaree şi
tenesme. Secreţia lactată încetează şi ea. Alteori, apar contracţii tonice ale unor grupe
musculare (muşchii cervicali, etc.). Apoi, se instalează paralizia; ea începe cu pareze,
traduse prin mers vaccilant şi căderi în timpul mersului, ca in final animalele să nu-şi
mai poată ţine echilibrul în staţiune, să cadă în decubit, moartea survenind prin paralizie
bulbară, după o agonie de 2-3 zile. Durata totală a bolii variază între 3 si 6 zile de la
debut(PERIANU Tudor, 1997).

Turbarea la rumegatoarele mici. Tabloul clinic este asemănător cu cel întâlnit la

taurine. Perioada de incubaţie variază între 10 si 30 de zile, uneori durează chiar luni de
zile.

În forma furioasă, după o faza prodromică scurtă, manifestă o stare de agitaţie, in

care aleargă, loveşte pământul cu picioarele, scutură capul, sforăie zgomotos, behaie
mereu, cu o voce răguşită, prelungă, prezintă salivaţie abundentă spumoasă.
Conjunctivele sunt congestionate, iar pupilele dilatate, cu strabism uni-sau bilateral.
Agresivitatea se manifestă faţă de alte oi, faţă de câini şi chiar faţă de om. Frecvent se
constată prurit la locul muşcăturii, cu lingerea, frecarea sau smulgerea lânii, excitaţii
genezice sau tulburări ce denotă halucinaţii (animalul se opresşe brusc, adulmecă şi se
repede la un obiect imaginar etc.).În cursul acceselor de furie se poate produce moartea
prin edem pulmonar supraacut, când prin orificiul bucal şi nări se scurge un lichid
spumos sangvinolent. În faza finală, paraliziile progresează rapid, animalele cad în
decubit şi mor in decurs de câteva ore.

În forma paralitică, se constată stări de mioză sau midriază uni-sau bilaterală,

facies anxios, modificarea vocii, cu apariţia precoce a tulburărilor paralitice. Durata
acestei forme este de 24 de ore-3 zile. La miei se constată frecvent stări de opistotonus .

Turbarea la porcine. Predomină forma furioasă şi se traduce clinic printr-o

faza prodromică de scurtă durată, în care se constată, o hiperestezie pronunţată, după
care animalul este neliniştit, se agită tot timpul, ţipă, se repede la congeneri, alte animale
sau om, cărora le provoacă răni grave, cu smulgeri de ţesuturi. Scroafele îşi devorează
purceii. În cursul acestei perioade ingera tot felul de corpi străini, încearcă să bea apă,
dar nu reuşesc din cauza parezei faringiene. Din gura se scurge o salivă spumoasă. Apoi,
apare paralizia diferitelor grupe musculare şi animalul moare, dupa o evoluţie, în general
scurtă, uneori de 24-48 de ore de la debut.

17
 Turbarea la păsări. Infecţia rabică este extrem de rară la păsări. Cand apare,
evoluează sub forma furioasă. Boala incepe cu o stare de nelinşte, anxietate,
horiplumaţie, după care apar stări de agitaţie: cu bătăi din aripi, strabism şi agresivitate,
în cursul căroră atacă alte păsări, animalele sau omul, lovind cu ciocul, picioarele şi
aripile. Moartea survine după cateva zile, prin paralizie progresivă.

1.7 Tabloul anatomopatologic

Modificările morfopatologice variază cu forma clinică, specia afectată, faza în

care s-a produs moartea. Cu toate ca, acestea sunt în general necaracterisice, oferă uneori
indicii utile pentru diagnostic. Cadavrele animalelor turbate şi mai ales ale celor care au
facut o forma furioasă dovedesc, prin aspectul lor, starea de mizerie din ultimele faze ale
bolii: sunt deshidratate, slăbite, părul este murdar, dezordonat, pe alocuri umectat cu
salivă cleioasă; pielea este murdară, fără elasticitate, cu plăgi recente mai ales la nivelul
buzelor, limbii, feţei; incisivii si molarii sunt rupţi, uneori prezintă chiar fracturi la
nivelul maxilarului inferior; musculatura este emaciată, mucoasele sunt congestionate de
culoare roşie-închisă adesea cianotică.
La deschiderea cadavrelor, se observă stază venoasă, cu sânge slab coagulat, roşu
negricios, asfixic. Cantitatea de lichid din cavităţile seroase este foarte redusă sau chiar
absentă din cauza deshidratarii. Mucoasele căilor digestive prezintă leziuni catarale
acute, leziuni traumatice, ulcere.
În stomac se constată adesea, mai ales la câine, leziuni traumatice provocate de
ingerarea de corpi străini( bucăţi de lemn, pământ, cârpe,etc.); hiperemii, hemoragii
multiple, eroziuni, ulcere hemoragico-necrotice. La examenul stomacului atrage atenţia
lipsa conţinutului alimentar( PERIANU Tudor, 1997). Meningele si creierul apar
hiperemiate, uneori edemaţiate si cu hemoragii punctiforme. In ventriculii laterali pot fi
prezente cheaguri de sânge.

Examenul histopatologic relevă o serie de modificări tisulare şi celulare, dintre

care unele sunt specifice, altele nespecifice. Leziunile specifice constau în prezenţa în
celulele nervoase piramidale mari sau ganglionare a unor incluzii oxifile, considerate ca
fiind patognomonice, dar inconstante, turbării şi cunoscute sub denumirea de corpusculii
Babeş-Negri. Ele sunt situate in citoplasma neuronilor mari şi în prelungirile acestora;
sunt formaţiuni rotunde sau ovale de 0,25-0,3 microni diametru, alcătuite dintr-o
substanţa bazală oxifilă, în care examinarea la un grosisment mai mare se decelează

18
granulaţii bazofile. Numărul şi dimensiunile sunt mai mari în celulele piramidale din
cornul lui Ammon, dar se pot întâlni şi în alte zone ale sistemului nervos central şi
periferic, uneori chiar în unele organe şi glande. In general cu cât durata bolii este mai
lungă numărul şi dimensiunile acestora cresc. Leziunile nespecifice, au caracterele
oricărei encefalomielite infiltrative de tip limfohistiocitar, întâlnite şi în alte boli virale
(pesta porcina clasică, pseudpestă aviară, jigodia, etc.), afectând atât celulele nervoase
cât şi sistemul glial si vasculo-conjunctiv.

Se întâlnesc, atât fenomene alterative neuronale (degenerare grasă şi hidropică ,

tigroliză, picnoză, carioexă), cu infiltraţii perineuronale şi neurofagie, hiperplazii ale
celulelor gliale şi satelite, mai ales in jurul celulelor şi fibrelor degenerate, dilataţii
vasculare venelor mici, fenomen de perivascularită infiltrativă cu manşoane de celule
limfoide si plasmocite, edeme perivasculare.Focarele infiltrative şi proliferarile gliale
pot suferi, modificări necrobiotice, ducând la apariţia unor focare de ramolisment, mai
ales in zonele edemaţiate ale creierului.

Leziunile alterative de tip distrofic se produc şi în sistemul nervos periferic..

Neuronofagia este acompaniată de mobilizari ale elementelor gliale care alcătuiesc
nodulii van Gehuchten-Neli. Leziunile sunt frecvente în ganglionii cerebrospinali
(ganglionii:Gasser, plexiform al pneumogastricului). La nivelul nervilor apar leziuni de
endo- si perinevrită traduse prin degenerări ale tecilor mielinice, infiltraţii cu celule
limfoide, mai pregnante în nervii sateliţi ai zonelor muşcate. Faptul explică, dealfel,
hiperestezia sau pruritul care se înregistrează la locul muşcaturii.

1.8 Diagnosticul

Rabia este o zoonoză majoră pentru care tehnicile de diagnostic au fost

standardizate internaţional. Atâta vreme cât nu există leziuni anatomopatologice
patognomonice evidente pentru rabie, diagnosticul poate fi efectuat doar în laborator.
Tehnicile de laborator se execută de preferinţă numai pe ţesut din sistem nervos central
(CNS) prelevat din cutia craniană. Ţesuturile preferate sunt hipocampul (cornul lui
Ammon), cerebelul şi “medulla oblongata”.

Este de preferinţă a fi executata folosind testul anticorpilor florescenţi (IFD). O

picatură de imunoglobulină purificată, în prealabil conjugată cu isotiocianat de
fluoresceină este adaugată la o porţiune de ţesut nervos fixat (CARP-CARARE

19
M.,2001), de preferinţa făcut din mai multe porţiuni din creier, incluzând hipocampul,
cerebelul şi zona medulară. Pentru un mai mare număr de probe, în cazul supravegherii
epidemiologice, tehnica imunoenzimatică poate furniza rezultate rapide (testul rapid
imunoenzimatical rabiei - RREID). Ambele teste FAT şi RREID asigură un diagnostic
precis in 98-100 din cazuri.
Pentru a evidenţia celulele nervoase infectate, pot fi utilizate şi tehnici
histologice. Procedurile vor releva agregate de material viral (corpusculii Negri) în
citoplasama neuronilor. Totuşi, exactitatea testelor histologice nu este ridicată, mai ales
în cazul care exista autoliza materialului infectat. Chiar şi în cazul materialului proaspăt
a fost observată o proporţie de 40 rezultate fals-negative .
Cum în cazul unui singur test negativ obţinut pe material proaspăt nu se exclude
posibilitatea infecţiei, testele de inoculare trebuie să fie efectuate simultan. Şoareci nou-
născuţi în vârstă de 3-4 săptămâni sunt inoculaţi intracerebral cu o suspensie de ţesut de
hipocamp sau de ţesut nervos, iar apoi sunt ţinuţi sub observaţie 28 de zile (VELESCU
Elena, 2001). Pentru fiecare şoarece care moare intre 5 şi 28 de zile, cauza morţii
trebuie confirmată prin IFD.
Ca o alternativă, materialul inoculat la şoareci va fi inoculat şi pe culturi celulare.
IFD executat după perioada de incubaţie stabilită va evidenţia prezenţa sau absenţa
antigenului viral. Ori de câte ori este posibil izolarea virusului pe culturi celulare ar
trebui să înlocuiască testele de inoculare a şoarecilor.
Identificarea agentului poate fi suplimentată în laboratoare specializate prin identificarea
oricarei tulpini virale prin utilizarea anticorpilor monoclonali, probe specifice de acid
nucleic sau reacţia polimerazica în lanţ urmată de segmentarea ADN a arealurilor
genomice (VELESCU Elena, 2001). Asemenea tehnici pot distinge în ceea ce priveşte
tulpinile virale vaccinale şi de teren, dând şi posibilitatea de identificare a originii
geografice a tulpinilor virale.
Dat fiind faptul că este transmisibil la om prin inoculare sau inhalare, toate materialele
suspecte de infectare trebuie manipulate în condiţii de maximă securitate specificate de
Organizaţia Mondială a Sănătăţii (OMS) .
Persoanele care lucreaza cu material suspect trebuie vaccinat împotriva
lyssavirusurilor sau a altor agenţi patogeni care pot fi prezenţi în probe. Laboratorul
trebuie să dispună de reguli de biosecuritate pentru a proteja personalul împotriva
contactului cu agenţii patogeni.

20
 OMS recomandă imunizarea preventivă a persoanelor expuse. Protocolul de
imunizare include trei injecţii în ziua 0, 7 şi 28. Evaluarea serologică a imunitaţii este
făcută la 1-3 săptămâni după ultima injecţie şi verificată la fiecare 6 luni în cazul
personalului din laborator sau la fiecare 2 ani pentru alţi lucrători, tocmai pentru a relua
vaccinarea când titrul este sub 0,5 UI/ml.
Din moment ce nu există leziuni postmortem concludente sau semne clinice
considerate ca patognomonice, diagnosticul rabiei se bazează pe teste de laborator.

1.9 Profilaxia

Lupta împotriva turbării include aplicarea unui complex de măsuri sanitar-

veterinare de imunoprofilaxie. Având în vedere ca prognosticul este întotdeauna
defavorabil, boala terminându-se aproape întodeauna cu moartea, un rol important îl
joacă profilaxia specifică (vaccinarea) şi nespecifică ( măsuri generale de prevenire a
apariţiei şi răspândirii bolii . Măsurile generale se adresează distrugerii rezervorului de
virus şi a vectorilor. Aceasta se poate obţine prin reducerea la maxim a carnivorelor
sălbatice, vaccinarea acestora, reglementarea circulaţiei carnivorelor domestice .
Pasteur a administrat pentru prima dată vaccinul, pe 6 iulie 1885, tânărului Joseph
Meister, care fusese muşcat de 14 ori de un câine cu 60 de ore înainte Vaccinul a fost
administrat subcutanat şi a constat în extracte de măduva spinării de la iepuri ţinuţi într-
un recipient deschis timp de 15 zile.
Vaccinurile utilizate la acest moment pot fi clasificate în vaccinuri cu virus viu
modificat şi vaccinuri inactivate.Vaccinurile cu virus modificat se obţin pe ouă
embrionate de găină, folosind tulpina Flury LEP, sau pe culturi celulare: linie celulară
canină, celule de porc, renale de bovine, linii celulare de hamster. Dozele, indiferent de
specie, sunt de 1 ml, cu rapel anual, iar la câine, pentru unele vaccinuri la 3 ani.
Vaccinurile inactivate au ca substrat în producţia virusului encefal de la
animale adulte, encefal de animale nou născute, culturi celulare şi ouă embrionate.
Pentru inactivare sunt utilizate metode fizice (temperatură, ultraviolete) sau chimice
(fenol, betapropriolactonă). Vaccinurile preparate pe encefal sunt recomandate numai
câinilor şi pisicilor, iar celelalte şi pentru alte specii de animale. Dozele sunt în general
de 1-2 ml, cu rapel anual, iar la câine, pentru unele vaccinuri la 3 ani.

21
 În România pentru imunizarea câinilor şi a altor specii de animale, se
folosesc vaccinurile : vaccinul antirabic preparat după Popovici şi Stamantin (1957),
vaccinul Rabirom, Rabivocol şi Nobivac Rabies.
Imunoprofilaxia se bazeaza pe vaccinarea antirabică oligatorie a câinilor. De
la prima vaccinare aplicată a lui Pasteur şi până în prezent s-au utilizat mai multe metode
de obţinere a materalului biologic şi imunizare: folosirea virusului rabic fix, folosirea de
virusuri vii sau atenuate, obţinute pe culturi celulare cu diverse tulpini adaptate pe
diferite celule, folosirea vaccinului inactivat cu ajutorul fenolului, formolului, alcoolului
metilic, apei ionizate, etc. În prezent legislaţia internaţională reglementează folosirea
vacinului viu doar la animalele de rentă, vaccinarea carnivorelor domestice se face doar
cu vaccin inactivat. Aceasta deoarece induce accidente postvaccinale, la animale
vacccinate de mai multe ori (carnivorele domestice –care se vacineaza anual).
Imunoprofilaxia se bazeaza şi pe vaccinarea vulpilor și a câinelui enot împotriva
rabiei, cu momeli care conţin virus antirabic atenuat tip SAD Bern. Principiul
imunizării constă în faptul că după mestecarea capsulei care conține virusul vaccinant
din interiorul momelii, acesta pătrunde prin capsula perforată în mucoasa și pe tonsilele .
De menţionat că, deşi subtipurile de virus rabic diferă mult în patogenitate, totuşi
cu excepţia serotipului 3, ele produc o imunitate încrucişată aproape perfectă. Astfel,
vaccinurile preparate cu tulpina originală Pasteur şi derivatele ei (virusul Standard
Challenge, Piman Moore, Flury, Street,Alabama, SAD,Vnukovo si Kelev) protejează
împotriva tuturor tulpinilor izolate ale serotipului 1.

1.10 Combatere
Turbarea este o boală supusă declarării oficiale şi carantinei de gradul III.
Animalele cu semne de turbare, cele suspecte de turbare (prezintă semne clinice
suspecte) indiferent de specie, ca şi carnivorele (câini, pisici) suspecte de contaminare
(muşcate, bănuite că au fost muşcate sau care au venit în contact cu animale bolnave sau
suspecte de turbare), vor fi ucise şi după prelevarea probelor pentru diagnosticul de
laborator, se distrug. Se exceptează de la această măsură solipedele, rumegătoarele şi
porcinele suspecte de turbare, dacă pot fi puse sub observaţie sanitară veterinară în
condiţii de totală izolare şi securitate, care vor fi ţinute în viaţă în scop de infirmare sau
confirmare a turbării, precum şi câinii suspecţi de contaminare, cu utilizare specială sau
câinii de mare valoare. Carnivorele suspecte de turbare şi cele suspecte de contaminare,
care au muşcat sau zgâriat sau au venit într-un alt mod în contact cu alte animale sau
oameni, precum şi solipedele, rumegătoarele şi porcinele suspecte de turbare care au
22
venit în contact cu persoane în condiţii în care ar fî putut fî posibilă o contaminare a
acestora, vor fi puse în observaţie sanitară veterinară timp de 10-14 zile. Dacă, în acest
timp nu se declară turbarea, animalele suspecte de turbare se scot din observaţie, în
schimb carnivorele suspecte de contaminare se vor ucide, ele putând face boala mai
târziu. Observaţia sanitară veterinară de 10-14 zile se aplică obligatoriu şi la animalele
fără semne de turbare sau antecedente (considerate sănătoase) care au muşcat sau zgâriat
persoane sau animale ( PERIANU Tudor, 1997).

La apariţia cazurilor de turbare la animalele domestice de producţie, după

uciderea celor cu semne clinice de boală, se va recurge la vaccinarea antirabică a
animalelor rămase, dacă nu au fost supuse acestei operaţiuni în ultimele 6 luni şi se vor
ţine sub supraveghere sanitară veterinară timp de 3 luni. Când într-un efectiv de
solipede, rumegătoare sau porci au pătruns carnivore domestice sau sălbatice, turbate sau
bănuite de turbare, animalele cu semne de muşcături, indiferent dacă, au fost sau nu
vaccinate antirabic anterior, vor fi sacrificate sub supraveghere sanitară veterinară în cel
mult 6 zile de la data muşcăturii, confîscându-se capul, coloana vertebrală şi zona în care
s-a produs muşcătura. Restul animalelor la care nu se constată urme de muşcătură, se vor
vaccina antirabic, dacă nu au fost vaccinate în ultimele 6 luni şi vor fi puse sub măsuri
de carantină şi supraveghere timp de 3 luni în cazul rumegătoarelor mici şi porcinelor şi
respectiv de 6 luni, în cazul rumegătoarelor mari şi solipedelor. Carnea, laptele şi orice
produse de la animalele turbate sau suspecte de turbare se vor distruge.
Locurile unde au stat sau au fost ucise animalele bolnave sau bănuite de turbare şi
obiectele care au venit în contact cu acestea se vor dezinfecta.
Stingerea bolii şi ridicarea măsurilor de carantină se face după 3 luni de la ultimul caz de
moarte sau uciderea din cauza turbării şi dacă în localitatea respectivă nu mai există
animale în carantină sau sub observaţie sanitară veterinară pentru această boală.

Capitolul II

2.1. Scopul lucrării

23
 Scopul acestei lucrări este de a prezenta metodele de determinare a eficienţei
vaccinării cu momeli vaccinale la vulpi, principalul vector al virusului rabic din mediu
silvatic.
Ca urmare a excaladării fără precedent a rabiei în România au fost aprobate o serie
de acte normative privind controlul rabiei :
-Hotărârea de Guvern nr. 55/2008 pentru aprobarea Programului strategic privind
supravegherea, controlul şi eradicarea turbării la vulpe în România, cu modificările şi
completările ulterioare;
- Ordinul Nr. 29 din martie 2008, pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind
măsurile generale de prevenire şi control al rabiei la animale domestice şi sălbatice;
- programe anuale cofinanţate dedicate mai multor boli, printre care şi cel al Rabiei.
Ulterior apare Programul de supraveghere, control şi eradicare a rabiei în România,
aprobat şi cofinanţat de Comisia Europeană (Grant Decision
SANTE/2016/RO/SI.726025), un program multianual.
-PROCEDURĂ SPECIFICĂ a Autorităţii sanitar veterinare si pentru siguranţa
alimentelor - VACCINAREA ANTIRABICĂ LA VULPI privind informarea populaţiei,
transportul, depozitarea, distribuirea, testarea vaccinului antirabic cu administrare orală
şi a eficienţei vaccinării.
Vaccinarea antirabică la vulpi s-a efectuat de două ori pe an primăvara şi
toamna, începând cu 2011, în primii doi ani în judeţele din vestul ţării, ulterior în toată
ţara. Conform Programului acţiunilor de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a
bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, protecţia animalelor şi
protecţia mediului, de identificare şi înregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor,
caprinelor şi ecvideelor, după campanile de vaccinare la vulpi, se efectuează o vânatoare
de control la 45 de zile, pentru a determina eficienţa vaccinării.
Cadavrele vulpilor se recoltează în întregime, unde se aplică recoltarea
probelor pentru control. Mai întâi se recoltează probe de creier pentru a se efectua
testul de imunofluorescenţă directă. Dacă testul este negativ ( testul se efectuează în
toate laboratoarele sanitar veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene
acreditate), se recoltează mandibula întreagă şi probă de lichid toraco-abdominal care se
expediază la cele trei laboratoare acreditate şi desemnate (Institutul de diagnostic şi
sănătate animală, Laboratoarele sanitar veterinare şi pentru siguranţa alimentelor Iaşi şi
Suceava) pentru a efectua testele de determinare a eficienţei vaccinării la vulpi. Dacă
testul de imunofluorescenţă direct este pozitiv, probele de creier se trimit la Institutul de

24
diagnostic şi sănătate animală pentru confirmare a diagnosticului şi genotipare a
virusului rabic.

Vaccinarea pe cale orală a animalelor sălbatice împotriva rabiei s-a demonstrat

eficientă în eliminarea rabiei din mai multe țări europene.

Cele două teste care se efectuează pentru determinarea eficienţei vaccinării la

vulpi sunt : detecţia markerului vaccinal (tetraciclina) în oase recoltate de la vulpi
vaccinate antirabic cu momeli prin examen microscopic (UV) şi detecţia anticorpilor
antirabici postvaccinali prin testul imunoenzimatic (ELISA), testl de cuantificarea
anticorpilor antirabici. Prima metodă demonstrează absorbţia momelii , iar cea dea doua
o imunizare eficientă.

2.2 Detecţia markerului vaccinal (tetraciclina) în oase recoltate de la vulpi

vaccinate antirabic cu momeli prin examen microscopic (uv)

Metoda se bazează pe faptul că tetraciclină, aflată în componenţa momelii

vaccinale, odată ingerată, se depune la nivelul oaselor şi dinţilor, unde poate fi
evidenţiată prin examen microscopic în lumină ultravioletă. Depozitele de tetraciclină se
vor observa sub forma unor zone circulare de culoare galbenă, în secţiunile din oase/
dinţi.

Combaterea rabiei la animalele sălbatice (vulpe) se realizează prin administrarea

de momeli care conţin tulpină virală vaccinală, înglobată într-un blister acoperit de un
amestec atractant pentru vulpe în care se află şi markerul vaccinal tetraciclina.

După consumul momelilor vaccinale, tetraciclina se depune în oase şi dinţi unde

poate fi evidenţiată prin executarea de secţiuni de grosimi care variază de la 50 la 70 µm
şi examinare la microscopul cu lampă UV cu lungimea de undă de 390 nm. Metoda se
bazează pe fluorescenţă – proprietatea pe care o au unele substanţe de a emite lumină
cât timp sunt iradiate cu radiaţii luminoase sau ultraviolete.

Aparatura necesară la realizarea testului:

-aparat pentru realizarea secţiunilor de oase şi dinţi - ISOMET Low Speed Saw;

-microscop cu UV cu filtre speciale (BG38 – filtru albastru şi VG9 – filtru verde)

pentru detecţia tetraciclinei.

25
Materiale necesare :

- probe de oase/ dinţi (canin sau molar) provenite de la vulpi care au ingerat tetraciclină;

- Martor pozitiv provenit de la National Rabies Laboratory din Wusterhausen,

Germania – secţiune de os provenită de la o vulpe care a ingerat tetraciclină;

- Martor pozitiv – secţiune osoasă provenită de la un animal care a ingerat momeli

vaccinale, de la IDSA;

- Martor negativ – secţiune osoasă provenită de la un animal care nu a ingerat momeli

vaccinale, de la IDSA;

- lame pentru microscopie;

- daltă, ciocan, fierăstrau, cuţit, foarfeci, bisturiu şi pensă.

Dacă rezultatul la testul de imunofluorescenţă directă este negativ se procedează

la prelucrarea probelor de mandibule:

 se îndepărtează ţesutul muscular de pe oase;

 se introduce o bucată de os sau dinte în menghina aparatului de secţionat oase

Fig. 1.1 şi Fig. 1.2;

 se realizează secţiuni din ţesut osos sau dinte, cu grosimea de 50-70 µm, care
trebuie degresate prin 2-3 imersii în alcool de 700 , Fig. 1.3 şi Fig. 1.4;

 se etalează pe o lamă de microscop şi se examinează în lumină UV;

 secţiunile de os şi dinte se pot depozita, la -200 C, în tuburi de plastic

criorezistente, constituind contraprobe.

26
Fig. 1.1 Secţionare os mandibular-molar

Fig. 1.2 Secţionare os mandibular-molar

27
 Fig. 1.3 Secţiuni os mandibular/molar

Fig. 1.4 Secţiuni os mandibular/molar

Prezenţa biomarkerului (tetraciclina) va fi evidenţiată prin apariţia unor zone circulare

de culoare galbenă, proba fiind astfel considerată pozitivă, Fig. 1.5, Fig.1.6 și Fig 1.7.

28
Lipsa zonelor circulare de culoare galbenă din structura osului sau a dintelui denotă lipsa
tetraciclinei - proba este negativă.

Citirea la microscop se realizează de cel puţin doi specialişti cu competenţă în

.diagnostic

Fig.
1.5

Evidenţierea markerului tetraciclina (probă pozitivă)

29
Fig. 1.6 Evidenţierea markerului tetraciclina (probă pozitivă)

Fig. 1.7 Evidenţierea markerului tetraciclina (probă pozitivă)

30
2.3 Detectia anticorpilor antirabici postvaccinali prin testul imunoenzimatic
(ELISA)

Kitul ELISA PlateliaTM Rabies II şi kitul BioPro Rabies ELISA Ab

(http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf)
sunt utilizate în controlul imunizărilor postvaccinale la câini, pisici şi vulpi. Kitul
ELISA PlateliaTM Rabies II poate fi utilizat pentru determinarea titrului de anticorpi
antirabici postvaccinali la câini şi pisici, având ca scop comerţul internaţional, prin
determinare cantitativă . Ambele kituri sunt folosite pentru determinarea prezenţei
anticorpilor antirabici postvaccinali în cadrul programelor de vaccinare orală la vulpi.

Aparatura necesară la realizarea testului:

 termostat pentru plăci ELISA (37o C ±2oC);

 spălător automat pentru plăci ELISA;
 cititor – spectofotometru pentru plăci ELISA;
 computer şi soft pentru validarea şi interpretarea rezultatelor;
 centrifugă
 pipete semiautomate monocanal şi multicanal de diferite volume 10-5000 µl,
etalonate.
Reactivi şi alte materiale necesare, neîncluse în kit:
 apă bidistilată sau deionizată;
 vârfuri pentru pipete semiautomate, de unică folosinţă;
 micronixuri pentru serurile de testat;
 stative;
 cuve pentru reagenţi;
 plastice pentru uz de laborator: cutii pentru sterilizare;
 hârtie absorbantă;
 mănuşi;
 soluţii decontaminante.

31
2.3.1 PLATELIATM RABIES II
PLATELIATM RABIES II este un test imunoenzimatic indirect pentru detecţia
anticorpilor anti-glicoproteina virusului rabic. Acest test poate fi realizat pe probe de ser
şi lichide toraco-abdominale provenite de la câini, pisici şi vulpi. Faza solidă este
constituită din glicoproteină extrasă din anvelopa virală inactivată şi purificată, care
căptuşeşte microplaca cu 96 godeuri. Conjugatul enzimatic este constituit din proteina A,
de la Staphylococcus aureus cuplată cu peroxidaza. Serurile de control pozitive calibrate
după standardele de referinţă OIE, permit determinarea calitativă şi cantitativă a titrului
anticorpilor antirabici prezenţi în serurile de testat.

 Componentele kitului PLATELIATM RABIES II:

 2 microplăci de căptuşite cu antigen cu 96 de godeuri (R1);
 soluţie de spălare (R2);
 flacoane cu ser martor negativ (R3);
 flacoane cu ser martor pozitiv de câine cu 0,5 EU (R4a);
 flacoane cu ser martor pozitiv de câine cu 4 EU (R4b);
 flacoane cu diluant pentru probe (R6);
 flacoane cu conjugat concentrat (anticorpi monoclonali specifici-conjugaţi cu
peroxidază) (R7);
 flacoane cu substrat (R8);
 cromogen (R9);
 flacoane cu soluţie pentru stopare (acid sulfuric) (R10);
 folie adezivă pentru microplăci.

Tehnica de lucru
Prepararea probelor de ser şi a serurilor martor
Serurile martor R3, R4a, R4b din kitul ELISA şi serurile de testat se diluează 1/100 în
diluantul R6 (ex. 10 µl probă în 990 µl lichid de diluţie R6).
R4b este serul martor livrat de producător şi este utilizat în tehnica ELISA pentru
determinarea cantitativă a anticorpilor antirabici postvaccinali.
Martorul pozitiv R4b (4 UI/ ml) corespunde standardului de cuantificare S6. Prin diluţii
seriate ale martorului pozitiv R4b se obţin standardele de cuantificare S1....S5. Aceste
diluţii se realizează în diluantul R6.
Prepararea reactivilor

32
 Soluţia de spălare -soluţia de spălare (R2) este concentrată de 10 ori. Se diluează 1
parte soluţie de spălare concentrată cu 9 părţi apă distilată.
Diluantul (R6) acest diluant este gata pregatit de către producător.
Conjugatul (R7) se prepară cu puţin timp înaintea utilizării. Conjugatul este concentrat
de 10 ori. Pentru utilizare, acesta se diluează în soluţie de spălare (R2); 1 parte conjugat
concentrat se diluează cu 9 părţi soluţie de spălare (R2) 1X.
Etape de lucru
 înainte de lucru, toţi reactivii (cu excepţia conjugatului) trebuie să fie aduşi la
temperatura camerei;
 se ordonează probele de ser şi se înregistrează în Fişa de lucru;
 probele de testat şi serurile martor se diluează şi se pun în godeuri, respectând
Fişa de lucru;
 placa se acoperă şi se incubează la 37ºC (± 2ºC), timp de 60 minute ± 5minute;
 se spală de 3 ori, folosind spălătorul automat de plăci ELISA;spălarea se poate
efectua şi manual cu pipeta automată multicanal distribuindu-se câte 300 µl
soluţie de spălare;
 dupa îndepartarea totala a solţiei de spalare prin scuturare energică, se adaugă în
fiecare godeu câte 100 µl conjugat diluat 1/10;
 placa se acoperă şi se incubează la 37ºC (± 2ºC), timp de 60 minute ± 5minute;
 se spală de 5 ori, folosind spălătorul automat de plăci ELISA;spălarea se poate
efectua şi manual cu pipeta automată multicanal distribuindu-se câte 300 µl
soluţie de spălare;
 dupa îndepartarea totala a solţiei de spalare prin scuturare energică, se pun în
fiecare godeu câte 100 µl soluţie revelatoare (1 ml R8+ 11 ml R9 pentru o placă);
 placa se acoperă şi se ţine la temperatura camerei, timp de 30 minute, la
întuneric;
 se adaugă în fiecare godeu câte 100 µl soluţie de stopare;
 se agită placa, pentru omogenizarea culorii;
 citirea se face la spectrofotometru, cu filtru dual, lungimea de unda de 450 - 620
nm.
Reacţia este validă dacă

Densitatea optică R3 <0,05.Absorbanţa fiecărui martor negativ trebuie sa fie mai mică
de 0,5.

33
0,300≤ Densitatea optică R4a ≤ 1,200.Valoarea densităţii optice a fiecărui R4a trebuie
sa fie între 0,300 şi 1,200.

1,500≤ DO R4b ≤ 3,500.Densităţile optice ale fiecărui martor R4b, trebuie să fie
cuprinse între 1,500 şi 3,500.

Testul trebuie repetat dacă densităţile optice a celor ficărui martor nu sunt incluse între
valorile mai sus enunţate.

Interpretarea rezultatelor testului pentru determinarea calitativă

Valoarea limită este egală cu media celor doi martori pozitivi R4a şi corespunde cu
seroconversia valorii limită la 0,5 EU/ ml.
Limita superioară a seroconversiei este egală cu media celor doi martori pozitivi R4b sau
cu valoarea unui singur martor, dacă celălalt are o valoare aberantă.
Seroconversie +++ Densitatea optică probă > Densitatea optică R4b. Probele cu
valoarea densităţii optice mai mare decât valoarea seroconversiei,, limită superioarăʼʼ
provenită de la animale care au o seroconversie mare după vaccinare în acord cu testul
PLATELIA Rabies II
Seroconversie + Densitatea optică R4a ≤ Densitatea optică probă ≤ Densitatea optică
R4b. Probele cu valoarea densităţii optice mai mare sau egal decât valoarea limitei
inferioare (0,5 UI) şi mai mică sau egală cu valoarea limitei superioare provenite de la
animalele cu seroconversie după vaccinare în acord cu testul PLATELIA Rabies II
Fără seroconversie Densitatea optică probă < Densitatea optică R4a. Probele cu
valoarea densităţii optice mai mică decăt valoarea limită provenite de la animale care
prezintă un nivel de seroconversie insuficient pentru a evalua eficienţa

34
 Fig. 1.8 Interpretarea densităţilor optice pentru PLATELIA Rabies II

2.3.2 BioPro Rabies ELISA Ab

BioPro Rabies ELISA Ab este un test imunoenzimatic de blocare pentru detecţia

anticorpilor biotinilaţi antirabici(www.rabieselisa.com). Dacă proba analizată conţine
anticorpi anti-rabie specifici aceştia blocheaza legarea anticorpilor ant rabie cu antigenul
specific de pe placă. Dacă proba analizată nu conţine anticorpi antirabie specifici, atunci
anticorpii antirabici biotinilaţi vor forma un complex antigen anticorp biotinilat. După
spălare în godeuri se adaugă conjugat streptavidina peroxidaza. Aceasta se va lega de
complexul antigen anticorp biotinilat . După încă o spălare în godeuri se adaugă TMB
formând un complex albastru care devine galben dupa reacţia de stopare. Intensitatea
culorii se citeşte la lungimea de undă a spectofotometrului de 450nm şi scăderea în

35
intensitate comparativ cu controlul negativ este proporţională cu numărul de anticorpi de
blocare din proba analizată.
Componentele kitului BioPro Rabies ELISA Ab:

 Micropläci cäptuşite cu antigen rabic 2 x 96 godeuri;

 Control rabic pozitiv 1 fiola (0.6 ml), capac rosu;

 Control rabic negativ 1 fiola (0.6 ml), capac albastru;

 Ser control rabic 1 1 fiola (0.3 ml) ;

 Ser control rabic 2 1 fiola (0.3 ml);

 Ser control rabic 3 1 fiola (0.3 ml);

 Diluant probä ( gata de folosire)1 sticla (15 ml);

 Diluant pentru Anticorpi anti-rabie biotinilaţi (gata de folosire) -1 sticlă (30 ml);
 Anticorpi anti-rabie biotinilaţi (concentrat 100x) 1 fiolă (0.3 ml), capac galben;
 Diluant pentru conjugat Streptavidina peroxidaza (gata de folosire)- 1 sticlă (30
ml);
 Conjugat Streptavidina peroxidaza ( concentrat 100 X) 1 fiolă (0.3 ml), capac
verde;
 Substrat TMB (gata de folosire) 1 sticla (30 ml);
 Soluţie stopare; 0,5 M H2S04 (gata de folosire ) 1 sticla (15 ml);
 Soluţie spälare ( l0 x concentrat ) 1 sticla (250 ml)
 Folii adezive 6 folii
Kit-ul trebuie depozitat la întuneric, în loc uscat, la 2-8 o C.

Tehnica de lucru
Pregatirea micropläcilor - micropläcile trebuie aduse la temperatura camerei (18-25
0
C) înainte de folosire. Strip-urile deschise si nefolosite se pot pästra în pungi de plastic
cu desicant la 2-8 0C, la întuneric dar nu mai mult de 1 lunä.
Pregatirea reactivilor
Soluţia de spälare concentratä (10x) trebuie adusä la temperatura camerei înainte de
folosire. Poate forma cristale la 2-8 0C, care vor dispare la temperatura camerei (18-25 0

C). Dacä nu dispar solutia trebuie läsatä la temperatura camerei timp mai îndelungat sau
se poate încälzi solutia la370C si se va amesteca uşor pânä la dispariţia cristalelor. Pentru
prepararea soluţiei de spälare se amestecä 1 volum solutie de spälare concentratä (10 x)

36
cu 9 volume apä distilatä sau deionizatä (ex. 50 ml soluţie de spälare concentratä (10 x)
se adaugä la 450 ml apä distilatä sau deionizatä ).
Anticorp biotinilat anti-rabie se dilueazä anticorpul biotinilat anti-Rabie cu diluant
pentru anticorp biotinilat 1/100. (de ex. Cantitatea necesarä pentru o placä este
reprezentatä de amestecul a 110 µl anticorp biotinilat anti-rabie concentrat si 11 ml
diluant pentru anticorp biotinilat) Soluţia de lucru preparatä trebuie folositä în decurs de
8 ore!
Conjugat Streptavidin peroxidazä- se dilueazä conjugatul Streptavidin peroxidazä
concentrat cu diluantul pentru Conjugat Streptavidin peroxidazä în proportie de 1/100
(ex. Cantitatea necesarä pentru o placä este reprezentatä de amestecul a 110 µl conjugat
biotinilat Streptavidin peroxidazä concentrat si 11 ml diluant pentru conjugat
Streptavidin peroxidazã)
Soluţia de lucru preparatä trebuie folositä în decurs de 8 ore!

Etapele de lucru
Probele trebuie diluate 1/2 în diluant pentru probe ( ex: 60 µl +60 µl ) într-o placä sau în
microtuburi. Serul control pozitiv, serul control negativ şi serurile control trebuie diluate
în acelaşi mod ca şi probele de ser.
Procedura de testare
Incubarea probelor si a controalelor
Toti reagenţii kit-ului trebuie aduşi la temperatura camerei (18-250C)
 Incubarea martorilor, serurilor de control şi a probelor. Se pun 100 µl din
controlul pozitiv diluat în godeurile A1 si B1.
 Se pun 100 µl din controlul negativ diluat în godeurile C1 si D1.
 Se pun 100 µl din controlul 1 diluat în godeul E1.
 Se pun 100 µl din controlul 2 diluat în godeul F1.
 Se pun 100 µl din controlul 3 diluat în godeul G1.
 Se pun 100 µl din probele de ser diluate în godeurile rämase.
 Se acoperä placa cu folie adezivä si se incubeazä în timpul noptii (18-24 ore) la
2-8ºC pe un agitator orbital.
 Se îndeparteazã folia şi se goleşte conţinutul pläcii şi se spalä de 6 ori cu soluţia
de spälare. Se scuturä ferm placa pe o hârtie abosorbantä dupä ultima spälare.

37
  Incubarea cu anticorp biotilinat.Se pun 100 µl anticorp biotinilat anti-rabie diluat
per godeu. Se acoperä placa cu folie adezivä şi se incubeazä 30 minute la 370C pe
un agitator orbital.
 Se îndeparteazã folia şi se goleşte conţinutul pläcii şi se spalä de 6 ori cu Soluţia
de spälare Se scuturä ferm placa pe o hârtie abosorbantä dupä ultima spälare.
 Incubarea cu Streptavidin peroxidază.Se pun 100 µl conjugat Streptavidin
peroxidazä şi se incubează 30 minute la 370C pe un agitator orbital.
 Se îndepärteazä folia de pe placä, se goleste continutul pläcii si se spalä de 4 ori
cu Soluţia de spälare. Se scuturä ferm placa pe o hârtie abosorbantä dupä ultima
spälare.
 Revelarea.Se pun 100 µl Substrat TMB " gata-de folosire" per godeu. Se
incubeazä placa 15-20 minute la temperatura carnerei (18-250C), pe un agitator
orbital, la distantä de lumina solarä directä.

 Stoparea reacţiei.Se pun 100 µl soluţie de stopare per godeu.

 Citire. Se citeşte densitatea opticä la 450 nm.

Reacţia este validă dacă îndelineste următoarele criterii de validare:

Densitatea optică a controlului negativ trebuie sä fie mai mare decât 1 ,0.
Diferenţa dintre media densitatea optică a controlului negativ şi a controlului pozitiv
trebuie sä fie egalä sau mai mare decât 0,8.
Procentul de blocare pentru serul control 1 trebuie sä fie între 45% si 70%
Procentul de blocare pentru serul control 2 trebuie sä fie între 25% si 45%
Procentul de blocare pentru serul de control 3 ar tebui sa fie mai mic de 30%

Se calculeazä procentul de inhibiţie (PB) pentru fiecare probä:

OD CN- ODproba
x I 00
OD - ODcp
Probele de ser cu PB mai mic de 40% sunt considerate negative pentru anticorpii anti-
rabie-absenţă anticorpi.
Probele de ser cu PB egal sau mai mare de 40% sunt considerate pozitive pentru
anticorpii anti-rabie-prezenţă anticorpi.

38
Probele de ser cu PB egal sau mai mare de 70% sunt considerate ca probe de ser cu un
nivel al anticorpilor egal sau mai mare de 0,5 UI /ml pe baza testului FAVN.
Se romandă folosirea primului cut-off pozitiv (PB egal sau mai mare de 40%) în scopul
eväluarii eficacitäţii imunizärii orale. Folosirea cut off-ului pozitiv -PB egal sau mai
mare de 70%- pentru interpretarea rezultatelor obtinute pe serul de vulpe nu este
recomandat datoritä faptului cä majoritatea serurilor de vulpe sunt de fapt fluide
corporale cu un factor de diluţie necunoscut, care va face aproape imposibil de mäsurat
nivelul exact al protecţiei

1.9 Citire densităţi optice BioPro Rabies ELISA Ab

39
 Fig. 1.10 Interpretarea densităţilor optice pentru BioPro Rabies ELISA Ab

Datorită faptului că testele imunoenzimatice ELISA sunt teste cu sensibilitate foarte

mare, rezultatul acestora trebuie susţinut de : utilizarea de materiale de referinţă
secundare ( controale de lucru comerciale) reprezentate de seruri de control, pozitive
şi negative din kitul de diagnostic specific analizei . Acestea trebuie sa indeplinească
condiţiile de validare specifice kitului.
-monitorizarea valorilor densitaţilor optice pentru materialul de referinţă secundar
reprezentat de serul ,, care se coloreazăʼʼ din kit ( controlul de lucru-media ), pentru
fiecare fişă de lucru, prin prelucrarea statistica si înregistrarea valorii în Harta de
control. Se prelucreaza statistic valorile densităţii optice a martorului ,, care se
coloreazăʼʼ din kit , fie din testul de validare sau dintr-un studiu de repetabilitate (minim
6 testari), in vederea determinarii deviatiei standard (ds). Harta de control evidenţiaza

40
valoarea medie a martorului ,, care se coloreazaʼʼ rezultată din testarea acestuia într-un
număr relevant din punct de vedere statistic, ± 3 deviaţii standard.
Criterii de excludere a rezultatelor obtinute:
3ds: dacă un rezultat pentru control utilizat depaşeşte ± 3 ds
2ds: dacă 2 rezultate succesive (două testari consecutive ) pentru control depăşesc ± 2
ds
4ds: daca 2 rezultate succesive (două testari consecutive) pentru control sunt la o
distanţa de 4 ds ( ex. Prima valoare depaşeşte -2 ds şi a doua valoare depaşeşte +2 ds.
-asigurarea calităţii rezultatelor prin control extern, se efectueaza prin participarea la
scheme de încercari de competenţă prin comparări interlaboratoare
Anticorpii neutralizanţi sunt cel mai sigur parametru de evaluare a eficienţei
vaccinării pentru că aceştia sunt corelaţi cu protecţia impotriva virusului rabic.
Metodele de referinţă recomandate de OIE şi OMS pentru cuantificarea anticorpilor
antirabici sunt FAVN şi RFFIT (COETZER A., SABETA C.T., MARKOTTER W.,
RUPPRECHT C.E. & NEL L.H., 2014). Cu toate acestea sunt metode costisitoare ,
necesită tehnicieni ultraspecializaţi , menţinerea culturilor celulare, laboratoare cu nivel
ridicat de izolare , dar sunt teste sensibile la orice produs citotoxic.C a urmare, au fost
dezvoltate testele imunoenzimatice ELISA prezentate mai sus care sunt mai rapide , uşor
de efectuat, nu necesită virus rabic viu sau cultură celulară, sunt adecvate examinării pe
scară largă , pot fi automatizate şi efectuate în orice laborator(http://www.rr-
asia.oie.int/fileadmin/Regional_Representation/Programme/JTF_One_Health/2014_Rabi
es_Training/AQS-2_ELISA_for_rabies.pdf)

CONCLUZII

De reţinut, este faptul că până în anul 2007, au fost efectuate vaccinări antirabice
la vulpe, prin administrarea de momeli vaccinale, în toate fondurile de vânătoare
existente in Romania. Programele de vaccinare antirabică la vulpe, au facut parte în toţi
aceşti ani (2002-2006), din programele strategice de supraveghere, prevenire şi control
al bolilor la animale, al celor transmisibile de la animale la om, protecţia animalelor şi

41
protecţia mediului, fiind subvenţionate de la bugetul de stat. În această perioadă focarele
de rabie erau sporadice conform figurii Fig.1.11

Fig. 1.11 Distribuţia focarelor de rabie ROMANIA 2003

Odată cu întreruperea vaccinării antirabice la vulpe, începând cu anul 2007, se

înregistrează o recrudescenţă a fenomenului rabiei. Fenomen ce a atins nivelul maxim
în perioada 2008-2009 , cu toate că la începutul anului a fost dată o hotărâre de guvern
H.G. 55/2008, care aproba programul strategic de vaccinare de necesitate la vulpi pe
întreg teritoriul ţării, când au fost confirmate un număr record de focare conform
Fig.1.12 .

42
 Fig. 1.12 Distribuţia focarelor de rabie ROMANIA 2008-2009

Însă odată cu declanşarea vaccinărilor la vulpe şi vânătorilor de control , se observă că

numărul focarelor a scăzut . În Tabelul 1.1 şi Fig. 1.12 , este pezentată dinamica
focarelor de rabie înainte şi după 2009, conform OIE
(http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/statusdetail)

Tabel 1.1 Situaţia supravegherii rabiei în ROMÂNIA

43
 2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2012

2013

2014

2015

2016

2017

2018-prezent
2011
ROMÂ
NIA

Total 67 119 354 222 276 922 205 434 290 383 379 168 30 14 2 0

Fig. 1.12 Reprezentarea grafică a focarelor rabie 2003-2018

BIBLIOGRAFIE

44
1. CARP-CARARE, M.,2001. Microbiologie veterinara.Virusologie. Casa de
Editura Venus, Iaşi.

2. VELESCU, Elena, 2001.Diagnosticul bolilor infecţioase. Manual practic. Ediţia

a II a, Ed. Vasiliana ʼʼ 98, Iaşi.

3. VELESCU, Elena,2004.Patologia bolilor infecţioase la animale. Editura

"TERRA NOSTRA" Iaşi.

4. PERIANU Tudor, 1997. Bolile infecţioase ale animalelor. Viroze. Editura

Fundaţiei Chemarea, Iaşi.

5. WHO expert consultation on rabies. First report. Geneva, World Health

Organization, 2005 (WHO Technical Report Series No. 931; ISBN 92 4
1209310.

6. WHO Expert Committee on Rabies. Eighth report. Geneva, World Health

Organization, 1992 (WHO Technical Report Series, No. 852; ISBN 92 4120
8244).

7. COETZER A., SABETA C.T., MARKOTTER W., RUPPRECHT C.E. & NEL
L.H. 2014. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in
an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine
diagnosis of rabies in southern Africa. PLoS Negl. Trop. Dis., 8, e3189.

8. EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0. , 2013, . Monograph 0746: Rabies

vaccine (live, oral) for foxes. European Directorate for the Quality of Medicines
and HealthCare (EDQM), Council of Europe, Strasbourg, France.

9. WASNIEWSKI M., ALMEIDA I., BAUR A., BEDEKOVIC T., BONCEA D.,
CHAVES L.B., DAVID D., DE BENEDICTIS P., DOBROSTANA M., GIRAUD
P., HOSTNIK P., JACEVICIENE I., KENKLIES S., KONIG M., MAHAR K.,
MOJZIS M., MOORE S., MRENOSKI S., MÜLLER T., NGOEPE E.,
NISHIMURA M., NOKIREKI T., PEJOVIC N., SMRECZAK M.,
STRANDBYGAARD B., WODAK E., CLIQUET F. , 2016. First international
collaborative study to evaluate rabies antibody detection method for use in
monitoring the effectiveness of oral vaccination programmes in fox and raccoon
dog in Europe., J. Virol. Methods, 238, 77-85.

45
 10. SERVAT A., WASNIEWSKI M., CLIQUET F., 2006. Tools for rabies serology
to monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild
carnivores. Dev. Biol.(Basel)125, 91-94.

11. MOJZIS M., KORYTAR P., JERG S., 2008. Development and validation of
ELISA test for detection of rabies anti-glycoprotein antibodies. International
Conference on Rabies in the Americas( TITA XIX) , Atlanta, PP 48-49.

12. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES
.pdf.

13. http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/statusdetail.

14. www.rabieselisa.com.

15. http://www.rr-
asia.oie.int/fileadmin/Regional_Representation/Programme/JTF_One_Health/20
14_Rabies_Training/AQS-2_ELISA_for_rabies.pdf.

46