Digitally signed by

Library TUM
Reason: I attest to the

UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI

accuracy and integrity
of this document

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALĂ

Îndrumar metodic

Chișinău
2019

0
 UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI

FACULTATEA TEHNOLOGIA ALIMENTELOR

DEPARTAMENTUL TEHNOLOGIA PRODUSELOR
ALIMENTARE

Programul de studiu la masterat

Calitatea și siguranța alimentelor

MICROBIOLOGIA IINDUSTRIALĂ

Îndrumar metodic

Chişinău
Editura „Tehnica-UTM”
2019

1
CZU 579.66(075.8)
S 20

Îndrumarul metodic Microbiologia industrială este adresat masteranzilor

Facultăţii Tehnologia Alimentelor. Materialul este prezentat în conformitate cu
programul de studiu Calitatea și siguranța produselor alimentare. Lucrarea
include aspectele generale ale microbiologiei industriale, caracteristica
microorganismelor de interes industrial, procedeele de cultivare a
microorganismelor la scară industrială, metodele de cultivare și testare a
culturilor pure. Acest material poate servi drept suport bibliografic și pentru
doctoranzi.
Autori: dr., conf. univ. Elisaveta SANDULACHI
dr., conf. univ. Viorica BULGARU
Redactor responsabil: dr., conf. univ. Elisaveta SANDULACHI
Recenzent: dr., conf. univ. Artur MACARI

DESCRIEREA CIP A CAMEREI NAȚIONALE A CĂRȚII

Sandulachi, Elisaveta.
Microbiologia industrială: Programul de studiu la masterat Calitatea
şi siguranţa alimentelor: Îndrumar metodic / Elisaveta Sandulachi,
Viorica Bulgaru; Univ. Tehn. a Moldovei, Fac. Tehnologia Alimentelor,
Dep. Tehnologia Produselor Alimentare. – Chişinău: Tehnica-UTM,
2019. – 68 p.: fig., tab.
Aut. sunt indicaţi pe vs. f. de tit. – Bibliogr.: p. 64-66 (37 tit.). – 50 ex.
ISBN 978-9975-45-593-0.
579.66(075.8)
S 20

ISBN 978-9975-45-593-0 © UTM, 2019

 INTRODUCERE

Microbiologia industrială (aplicativă) reprezintă un

compartiment al biotehnologiei care are drept scop obținerea pe cale
industrială a unor produse, cu participarea nemijlocită a diferitor
microorganisme (care apar în mod natural, mutanți selectați în
laborator sau chiar organisme modificate genetic).
Microbiologia industrială lucrează asupra utilizării
microbilor în procesul de fabricare a produselor alimentare și
industriale, cum ar fi produsele din lapte (iaurt, cașcaval),
produsele din carne (salamuri crud afumate, salamuri semiafumate),
produsele de panificație (pâine), produsele vinicole (bere, vin,
whiskey, rom), produsele farmaceutice (antibiotice, hormoni,
proteine terapeutice), chimicale (acizi organici, aminoacizi,
bioinsecticide, acetonă, butanol, enzime), produsele energetice etc.
Microbiologia industrială se ocupă cu screening-ul, îmbunătățirea,
gestionarea și exploatarea microorganismelor pentru producerea
diferitor produse finite utilizate pe scară largă.
Obiectivele cursului:
 Să ofere cursanților cunoştinţe teoretice şi practice privind
instrumentele din microbiologie necesare pentru a face faţă
provocărilor / cerinţelor din ce în ce mai mari ale industriei
alimentare, farmaceutice, agricole şi ecologice.
 Instruirea masteranzilor privind analiza critică şi rezolvarea
problemelor sociale cu ajutorul microbiologiei.
 Obținerea cunoștințelor privind pregătirea prezentărilor orale
şi publicarea lucrărilor de cercetare de către masteranzi /
doctoranzi.
 Analiza și argumentarea rezultatelor obținute în cazul
lucrărilor de laborator și activității de cercetare în baza
studiului bibliografic.

3
 1. ASPECTE GENERALE ALE MICROBIOLOGIEI
INDUSTRIALE

1.1. Grupe de microorganisme utilizate în procesele

biotehnologice

Microbiologia industrială este o ramură a biotehnologiei care

aplică științele microbiene și industriale. Aceasta utilizează
microorganisme pentru a elabora un produs dorit în cantități de
masă privind obținerea unui profit. În tabelul 1sunt date informații
privind utilizarea microorganismelor în diverse biotehnologii
folosite în industria alimentară, vinicolă, farmaceutică, agricolă,
ecologică, chimică și energetică [18, 20].

Tabelul 1. Produse majore obținute pe cale biotehnologică

Producția
Tipul de microorganisme anuală
Produse de fermentație
utilizat (globală)
kg/an
Solvenți organici
Etanol (nu pentru băuturi) Sacharomyces cerevisiae 2*1010
Acetonă / butanol Clostridium acetobutylicum 2*106

Biomasă
Culturi starter și drojdii Bacterii lactice sau drojdii de 5*108
pentru industria alimentară panificație
și agricultură Pseudomonas methylotrophus 0,5*108
Proteine monocelulare sau Candida utilis

Acizi organici
Acid citric Aspergillus niger 2-3*108
Acid gluconic Aspergillus niger 5*107
Acid lactic Lactobacillus delbrueckii 2*107
Acid itaconic Aspergillus itaconicus

4
 Continuarea tabelului 1
Aminoacizi
Acid L-Glutamic Corynebacterium glutamicum 3*108
L-Lysină Brevibacterium flavum 3*107
L-Fenilalanină Corynebacterium glutamicum 2*106
L-Arginină Brevibacterium flavu 2*106
Enzime
Proteaze Bacillus spp. 6*105
Α-Amilaze Bacillus amyloliquefaciens 4*105
Glucoamilaze Aspergillus niger 4*105
Glucozizomiraze Bacillus coagulans 1*105
Pectinaze Aspergillus niger 1*104
Renină Mucor miehei sau drojdii 1*104
recombinante
Vitamine
B12 Propionibacterium shermanii 1*104
Ribovlavină Eremothecium ashbyii
Pigmenți
Β-carotene Blakeslea trispora 60
Insecticide
Spori bacterieni Bacillus thuringienis
Spori de fungi Hirsutella Thompsonii
Antibiotice
Peniciline Penicillinum chrysogenum 3-4*107
Cefalosporine Cephalosporium acremonium 1*107
Tetracicline Streptomyces aureofaciens 1*107
Antibiotice macrolide Streptomyces erythreus
Antibiotice polipeptide Bacillus brevis 2*106
Antibiotice Streptomyces griseus
aminoglicoside Penicillium griseofulvum 1*106
Antibiotice aromatice
Anticorpi monoclonali Celule de tip Hybridoma <20

5
 1.2. Procedee de cultivare a microorganismelor la scară
industrială

 Bioreactoare utilizate la cultivarea microorganismelor și

metaboliților lor
 Bioreactoarele reprezintă reactoare chimice elaborate
pentru realizarea operațiilor specifice necesare în vederea
dezvoltării culturilor de microorganisme și a sintetizării de
către acestea a enzimelor.

agitator
ieșire apă sistem de etanșare aseptic

spărgător de spumă

Serpentină de răcire
ieșire
apa
de
răcire
sicana

turbină cu palete
plane

intrare aer Menbrană

semipermiabilă
Efluent+produs
barbotor

a) b)
Figura 1. Bioreactoare cu agitare mecanică:
a) bioreactor pentru fermentații aerobe, pentru culturi aerobe [34];
b) bioreactor cu membrană [4]

Bioreactoarele trebuie să fie dotate cu aparatură de reglare,

de măsurare și control care este destinată pentru [4]:
 stabilirea compoziției și concentrației mediului de cultură;
 monitorizarea temperaturii, presiunii, pH-ului;

6
  monitorizarea oxigenului dizolvat, a parametrilor reologici
ai mediului, precum și a utilităților consumate.
Bioreactoarele se pot clasifica în funcție de modul de lucru,
principiul de realizare a biosintezei, starea fizică a mediului de
cultură și prin modul de asigurare a aerării. O caracteristică
esențială a funcționării bioreactoarelor constă în necesitatea
asigurării unor condiții aseptice riguroase pe tot parcursul
funcționării, precum și asigurarea cu aer steril.

 Curba de creștere a microorganismelor și metaboliților lor

În figura 2 este reprezentat metabolismul microbian, nutriția și
creșterea microorganismelor.

Substrat Metaboliți primari Metaboliți secundari

Log. nr. celule  viabile 

B D

A- faza Lag; B – faza de creștere exponențială; Timp

B- faza staționară; D - faza de declin.
Figura 2. Curba de creștere bacteriană cu cele 4 faze tipice de
creștere și marcarea originii metaboliților primari și secundari
recoltați prin procese industriale [5, 14]

Metaboliții primari sunt compuși chimici sintetizați de

celule necesare creșterii și înmulțirii lor (aminoacizi, acizi organici,
nucleotide, alcooli, vitamine). Sinteza acestor substanțe reglează
genetic genele, acționând doar când este nevoie, în funcție de ciclul
vital al microorganismelor și condițiile de mediu. Prin mutații ale

7
genelor care intervin în reglajul genetic al activității celulare,
acestea pot produce cantități disproporționale dintr-un anumit
metabolit. Ex.: Corynibacterium glutamicum, Brevibacterium.
Unele vitamine sunt produse ca metaboliți primari ai unor
microorganisme mutante. Astfel, bacteriile din genul Ashbya produc
cantități mari de riboflavină (de 20.000 ori mai mari decât tipul
normal), iar Pseudomonascint produc de 50.000 ori mai multă
vitamina B12 decât în mod normal.
 Izolarea şi selecţionarea de drojdii producătoare de
biomasă proteică monocelulară
Metaboliții secundari sunt compușii chimici sintetizați de
microorganisme care nu sunt necesari creșterii și înmulțirii lor
(antibiotice, alcaloizi, toxine). Astfel, antibioticele sunt produse de
microorganisme ca metaboliți secundari. Sinteza lor se realizează
prin căi metabolice în care intervin între 10-30 gene dintre acestea,
determinând sinteza unor enzime care favorizează desfășurarea unor
etape succesive necesare procesului de biosinteză a antibioticelor.
Microorganismele au în general o fază de creștere rapidă
până la epuizarea mediului de cultură în substanțele nutritive. În
faza urmatoare se realizează sinteza și acumularea de metaboliți
secundari [34].

1.3. Procedee de cultivare a unor microorganisme

 Cultivarea microorganismelor în bioreactoare

Microorganismele selectate sunt de obicei cultivate în
bioreactoare, în condiţii controlate, pentru a maximaliza producţia
de enzime. Factorii care influenţează dezvoltarea
microorganismelor sunt factorii intrinseci, extrinseci şi impliciţi.
Factorii intrinseci sunt parametrii ce caracterizează mediul
de cultură: pH-ul mediului; conţinutul de apă liberă; potenţialul de
oxidoreducere, conţinutul de nutrimenţi, conţinutul de substanţe cu
efect inhibitor asupra dezvoltării microorganismelor.

8
 Figura 3. Reprezentarea schematică a procesului de obţinere a
preparatelor enzimatice [24]

Factorii extrinseci sunt reprezentaţi de parametrii ce

caracterizează mediul ambiant în care se desfăşoară cultivarea
microorganismelor. Factorii extrinseci pot fi de natură fizică,
chimică sau mecanică. Factori fizici: temperatură, conţinut de gaze,
umezeală relativă, presiune. Factori chimici: substanţe chimice
adăugate. Factori mecanici: agitare, ultrasonore.
Factorii impliciţi sunt factorii de natură biologică
determinaţi de relaţiile ce se stabilesc la un moment dat între
microorganismele aflate pe acelaşi substrat, limitat cantitativ. În
condiţii industriale, controlul acestor parametri se realizează
computerizat [8, 9]. La cultivarea microorganismelor producătoare
de enzime trebuie ţinut cont: [8, 22] de conţinutul de oxigen necesar
pentru respiraţia aerobă sau excluderea lui pentru microorganismele
anaerobe; sursa de carbon, sursa de energie pentru respiraţie,
9
eliberarea energiei necesare pentru creşterea economică; sursa de
azot necesară pentru sinteza proteinelor.

 Procedeul de cultivare a bacteriilor lactice

Problema soluţionată în studiul [7] constă în elaborarea unei
tehnologii de cultivare a bacteriilor lactice, care să asigure un ritm
înalt de creştere a lor în timpul procesului fermentativ şi să reducă
considerabil preţul de cost al culturilor finite selecţionate. Procedeul
de cultivare a bacteriilor lactice include pregătirea mediului de
cultură, care conţine lapte sterilizat şi răcit până la temperatura de
însămânţare, adăugarea în mediul pregătit a culturii de bacterii
lactice, cultivarea şi separarea lor.

 Laptele de capră ca sursă de izolare a tulpinilor de bacterii

lactice
Savanții cercetători [10] au studiat laptele de capră ca sursă
naturală de izolare a tulpinilor de bacterii lactice cu proprietăţi
biotehnologice importante pentru industria alimentară. Deoarece
laptele de capră ca substrat nutritiv diferă de laptele de vacă după
raportul componenţilor, valoarea biologică, indicii fizico-chimici,
apare necesitatea de izolare din microbiota spontană a laptelui de
capră a culturilor pure de bacterii lactice, studierea şi selectarea
tulpinilor cu proprietăţi biotehnologice importante.
În tabelul 2 este inclusă diversitatea microbiotei spontane de
bacteii lactice izolate din laptele de capră vizată în studiul [10].

10
 Tabelul 2. Diversitatea microflorei spontane de bacterii lactice
izolate din lapte de capră
Culturi de bacterii lactice
Țări Caracteristici Aplicare
izolate
Algeria Streptococcus thermophilus,
Marocco Lactococcus lactis subsp.
Activitate proteolitică
lactis, Lactobacillus
și fermentativă,
acidophilus,
acidogeneză activă
Lb. bulgaricus, Lb. casei, În
Lb. helveticus compoziția
India Streptococcus thermophilus Acidogeneză activă culturilor
Kazahstan Streptococcus thermophilus, starter
Lactococcus lactis subsp. Activitate destinate
Lactis, Lactobacillus antimicrobiană, fabricării
acidophilus, Lb. bulgaricus, rezistență față de produselor
Lb. casei, Lb. helveticus, antibiotice lactate
Lb. plantarum fermentate
Marocco Activitate
China Lactococcus lactis subsp. fermentativă și
Ucraina cremoris proteolitică,
acidogeneză activă
Obiectivele studiului [21] au fost înmulțirea drojdiilor pe
medii nutritive pentru a produce o singură celulă cu proteine care
pot fi utilizate ca surse de hrană. În acest sens, autorii au izolat și au
selectat câteva tulpini de drojdii din genurile Saccharomyces, care
au fost testate, studiate și verificate în laborator, având ca obiectiv
identificarea tulpinilor de drojdie cu activitate optimă și o capacitate
mare de multiplicare. Din unele microorganisme ale g.
Saccharomyces pot fi obține celule cu proteine unice cu următoarele
avantaje: conținutul ridicat de proteină microbiană care are un
conținut similar de aminoacizi cu cel al proteinelor animale sau
vegetale, selectarea tulpinilor care au cele mai potrivite
caracteristici pe care dorim să le obținem; creșterea randamentului
biomasei; microorganismele pot utiliza drept sursă organică de
carbon o gamă largă de materii prime, în special, deșeuri sau
produse secundare rezultate din alte industrii.

11
 2. IZOLAREA ȘI CULTIVAREA
MICROORGANISMELOR PE DIFERITE MEDII

 Izolarea drojdiilor pe medii nutritive

O gamă largă de drojdii și ciuperci filamentoase pot crește pe
mediile selective și diferențiate care conțin inhibitori, nutrienți
selectivi și coloranți, indicatori care sunt utilizați pentru a diferenția
sau selecta creșterea anumitor tipuri de drojdii [23].
Drojdiile psihofilice și psihotoleinante au fost izolate dintr-o
varietate de substraturi, folosind diferite metode de cultivare.
Drojdiile capabile să crească până la 0°C au fost izolate din
substraturi reci, cum ar fi ghețari, zăpadă și sedimente de mare
adâncime, dar și din zonele climatice temperate și tropicale. Pentru
izolarea și cultivarea acestora s-au folosit o varietate largă de medii
și condiții culturale. Tulpinele de drojdie adaptate la rece aparțin
mai multor specii de Ascomycotași Basidiomycota.

1 2 3 4

Figura 4. Medii pentru izolarea și întreținerea drojdiilor și a

mucegaiurilor [23]:
1 - Sabouraud Dextrose Agar; 2 - Rose Bengal Cloramfenicol Agar;
3 - Malt Extract Agar; 4- O.G.Y.E. Agar-Oxytetracycline Glucose
Extract.

12
Tabelul 3. Medii recomandate pentru izolarea și întreținerea
drojdiilor și a fungilor [31]
Caracteristica Sursa, compoziția
Yeast & Mould Agar
Un mediu recomandat pentru izolarea și întreținerea [14]
drojdiilor și a mucegaiurilor. Acest mediu poate fi, de http://www.labm.co
asemenea, utilizat pentru detectarea drojdiilor sălbatice m/products/yeast-
în bere. and-mould-agar.asp
Sabouraud Dextrose Agar
Prezentat de Sabouraud în 1910 ca mediu selectiv pentru http://www.labm.co
ciuperci și drojdii. pH-ul acid (5,6) al acestui mediu m/products/saboura
inhibă multe specii de bacterii. Mediul poate fi făcut mai ud-dextrose-
selectiv prin adăugarea suplimentului de cloramfenicol agar.asp
(X009) (X209). Caracteristicile de diagnosticare cum ar
fi structurile de spori și pigmentarea sunt bine dezvoltate
pe acest mediu.
Rose Bengal Cloramfenicol Agar
Un mediu selectiv pentru enumerarea mucegaiurilor și https://foodsafety.n
levurilor în alimente. Rose Bengal Cloramfenicol Agar eogen.com/en/ncm-
Baza este un mediu selectiv pentru enumerarea rose-bengal-
ciupercilor. În 1944, Smith și Dawson au folosit Rose chloramphenicol-
Bengal pentru izolarea selectivă a fungiilor din probele agar
de sol.
Malt Extract Agar
Un mediu acid care va susține creșterea majorității https://foodsafety.n
drojdiilor și fungilor, în timp ce inhibă majoritatea eogen.com/en/ncm-
bacteriilor. A fost descris prima dată de Thom și Church malt-extract-agar
în 1926 într-un studiu al lui Aspergillus spp., susținând
că conținutul ridicat de carbohidrați a asigurat o creștere
rapidă.
O.G.Y.E. Agar-Oxytetracycline Glucose Extract
Un mediu selectiv pentru enumerarea drojdiilor și http://www.labm.co
mucegaiurilor din alimente introdus de Mossel în 1970. m/products/o-g-y-e-
agaroxytetracycline
-glucose-yeast-
extract.asp

13
 Medii pentru izolarea bacteriilor [17]

Tabelul 4. Medii pentru izolarea bacteriilor

Tip mediu Caracteristica Sursa
Mediu pentru Un mediu selectiv de identificare http://www.labm.c
izolarea pentru izolarea Listeria om/products/listeri
Listeriei monocytogenes din alimente. a-isolation-
media.asp
Un mediu selectiv de identificare
pentru izolarea Listeria http://www.labm.c
Listeria Isolotion monocytogenes din alimente. om/products/listeri
Medium(Oxford) a-isolation-medium-
oxford.asp

Agarul de fier de lizină este

utilizat pentru diferențierea
microorganismelor pe baza https://foodsafety.n
Lysine Iron Agar producției de lizină eogen.com/en/ncm
decarboxilază și hidrogen -lysine-iron-agar
sulfurat.

Un mediu pentru izolarea

selectivă a Salmonella spp. cu
excepția S. typhiși S. paratyphi A,
din alimente și fecale. Coloniile
de salmonella sunt recunoscute
prin aspectul colonial distinct și
producția de H2S. Agarul de http://www.labm.c
M.L.C.B. Agar sulfit de bismut al lui Wilson & om/products/m-l-c-
Blair este mediul ce detectează b-agar.asp
tulpinile de lactozăși zaharoză
care fermentează.

14
 1 2 3 4
Figura 5. Medii pentru izolarea și indentificarea microorganismelor
1 – medii de izolare Listeria - indentificarea selectivă pentru
izolarea Listeria monocytogenes din alimente și materiale clinice;
2 – mediu de izolare Listeria (Oxford);
3 – agar de fier de lizină. Un mediu diferențial pentru fermentația
lactozei, activitatea de decarboxilază a lizinei și producerea de
sulfat de hidrogen;
4 – M.L.C.B. Agar.

 Metode fizice de izolare şi obţinere a culturilor pure

Există mai multe metode de izolare și obținere a culturilor
pure: metode prin răspândire, metode scarificate, metoda în strii,
metoda culturală Koch, metode prin diluare, metoda Lindner,
metoda Naumov ș.a. [27].
Metoda de izolare cu ajutorul micromanipulatorului este
o metodă precisă şi se realizează cu ajutorul unui aparat prevăzut cu
tuburi capilare cu care se poate face selecţia celulelor dorite din
preparatele studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului
se poate face recoltarea de ascospori din celulele ascogene şi este
folosită la dirijarea proceselor de fuziune a protoplaştilor pentru
conjugare etc.

 Metode biologice de obţinere a culturilor pure

Metodele biologice sunt foarte diverse şi se bazează pe
proprietăţile fiziologice ale microorganismelor de izolat care să se
diferenţieze clar de cele ale microorganismelor însoţitoare din
15
acelaşi biotop. Uneori prin aceste metode se face izolarea unui grup
cu caractere taxonomice apropiate, apoi se face izolarea de culturi
pure prin tehnici de răspândire sau prin folosirea mediilor selective.
O metodă biologică clasică este metoda Burri prin care se
face separarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen
pentru creştere. Dintr-un mediu natural se face inocularea în BCA
termostatat la 42°C şi după uniformizare acesta se introduce într-un
tub de sticlă prevăzut la un capăt cu dop de cauciuc. Prin răcire
celulele sunt imobilizate în gel şi prin termostatare în funcţie de
accesul oxigenului din aer, în zona tubului prevăzut cu dop de
cauciuc, se vor dezvolta bacterii anaerobe, intermediar bacterii
microaerofile, iar în stratul de mediu la care aerul a pătruns prin
dopul de vată al tubului, bacterii aerobe.
Prin metodele biologice pot fi selectate bacteriile sporogene
din mediile naturale pe baza termorezistenţei deosebite a
endosporilor. De exemplu, Bacillus subtilis se poate izola din
infuzia de fân, deoarece endosporii rezistă la fierbere, în timp ce alte
bacterii sunt distruse şi prin germinare trec în forme vegetative, care
prin înmulţire, sciziune rămân asociate, formând în 24 ore un voal
cutat.

 Metode de izolare a microorganismelor anaerobe

Microorganismele aerobe sunt capabile să-şi desfăşoare
metabolismul exclusiv în prezenţa oxigenului atmosferic. Din acest
grup fac parte specii ale genului Streptomyces care sunt utilizate
pentru biosinteza diferitelor antibiotice.
Microorganismele anaerobe au un metabolism care nu se
poate realiza decât în absenţa oxigenului liber, cum este de exemplu
bacteria Lactobacillus delbrueckii producătoare de acid lactic de uz
alimentar și farmaceutic.

16
Prin agenți de reducere

 bulion triglicolat
 bulion de carne fiartă Robertson (RCM)
 conține bulion nutritiv cu bucăți de carne
tocată fiartă fără grăsime din inimă de
bou

Din grupul microorganismelor facultative fac parte cele care

pot să-şi modifice metabolismul încât să realizeze atât unul de tip
aerob (respirator), cât şi unul anaerob (fermentativ). Un exemplu de
astfel de microorganisme facultative îl reprezintă drojdiile care pot
atât respira, cât şi fermenta anumite substraturi.

Metoda cultural anaerobă [15]

    Clemă cu  Palete cu 
 Producere de vid; Capac cu  șurub de  catalizator 
 Amestecarea garnitură de  fixare din paladiu
oxigenului cu alte etanșare 
gaze; Plic cu bicarbonat de 
 Absorbția sodiu și borohidrit de 
oxigenului prin sodiu 
metode chimice ori
biologice;
 Prin utilizarea Indicator anaerobic 
(metilen albastru) 
agenților reducători. 
 
Plăci Petri

17
Absorbția oxigenului prin metoda chimică [15]

 pirogalol
Indicator Recipie
 acid sulfuric și
metilen
albastru
nt cromic
anaerob
 gas-pak
Gas-
pak  disponibil în
comerț

Recipient anaerobic
1. Recipient lumânare:
 reduce mediul de oxigen;
 crește doar cantitatea de CO2.
2. Recipient gas-pak
Pelete acoperite din paladium
aluminium:
 catalizator;
 reducerea oxigenului prin metode
chimice;
 reacții dintre restul de O2 în prezența
 H2 pentru a forma H2O.

Culturi strict anaerobe

 Pentru culturile strict anaerobe, toate urmele de oxigen
trebuie îndepărtate din mediu, iar pentru multe organisme probele
trebuie păstrate în întregime anaerob în timpul manipulărilor.
 Methanogenic archaea din instalațiile de tratare a rumenilor
și a apelor uzate poate fi distrusă chiar și printr-o scurtă expunere la
oxigen.
 Mediul de obicei se fierbe, în timpul preparării se adaugă
agent de reducere și se depozitează în condiții de vid.
18
 Acoperirea calificată a mediului este foarte esențială.
1

2
3

a  Coloni b

Figura 6. Metode sacrificate de obținere a culturii pure [6]

a) direcția este indicată de săgeți. Setul 1 de trasări este o masă din
cultura bacteriană originală. Ansa trebuie sterilizată după fiecare
set de trasări. În setul 2 și 3, ansa preia bacteriile din seria
anterioară, diluând numărul de celule de fiecare dată;
b) în setul 3 de trasări ale acestui exemplu e de menționat că au
fost obținute colonii bine izolate din două bacterii diferite, roșu
și galben.
Identificarea mediilor anaerobe
Plăcile Petri sunt controlate după 18-24 ore pentru așa specii
ca Cl. perfringens, B. Fragilis (care au o rată de creștere mai rapidă)
și după 5-7 zile pentru creșterea lentă a speciilor așa ca
Actinomyces, Eubacterium, Propionibacterium. Genul
microorganismelor este determinat prin morfologia celulei sau
cromatografia gas-lichid. Determinarea speciei microorganismelor
este bazată pe fermentarea zaharurilor și alte determinări
biochimice. Identificarea culturilor anaerobe este destul de
complexă, iar laboratoarele pot utiliza diferite sisteme de
identificare. Scopul este identificarea parțială. De exemplu, sunt
șase specii din Genul Bactericides care pot fi identificate ca grupul
Bactericides fragilis mai degrabă decât identificarea individuală.
Microorganismele sunt identificate de morfologia lor colonială și
microscopică, creșterea pe medii selective, toleranța la oxigen și
caracteristicile biochimice. Microorganismele izolate sunt de obicei
19
subcultivate, iar cultura pură este testată pentru a identifica
microorganismul.
Testarea sensibilității la antibiotice [6]
Susceptibilitatea la antibiotice este
determinată prin metoda diluării
bulionului în microtub. Mai multe
specii anaerobe sunt rezistente la
penicilină, iar unele sunt rezistente la
clindamicină și alte antibiotice utilizate
frecvent.

Selectarea unor noi bacterii lactice producătoare de

bacteriocine
Proiectul [11] şi-a propus selectarea unor noi bacterii lactice
producătoare de bacteriocine şi studiul efectelor induse de acestea
la nivelul celulelor sensibile (modificări de metabolism şi
ultrastructurale), precum şi evaluarea modului în care prezenţa
bacteriilor sensibile/rezistente afectează producerea de bacteriocine.

 Izolarea unor noi tulpini de bacterii lactice

Ca sursă de izolare pentru tulpinile noi au fost folosite: lapte
şi produse lactate fermentate (iaurt, lapte bătut, smântână, brânză)
colectate din diferite zone ale ţării, produse fabricate în mod
tradiţional în gospodării sau mici fabrici de prelucrare a laptelui.
Porţiuni din aceste probe au fost dispersate în ser fiziologic peptonat
(0,85 % NaCl + 0,1 % peptonă), făcute diluţii seriale şi însămânţate
pe medii semiselective solide: mediul MRS (peptonă 10 g/l, extract
de carne 10 g/l, glucoză 20 g/l, citrat de amoniu 2 g/l, acetat de Na 5
g/l, K2HPO4 2 g/l, MgSO4 0,1 g/l, MnSO4 0,05 g/l, Tween 80 1 ml/l,
pH6.2, agar 15 g/l) şi mediul ST (triptonă 10 g/l, lactoză 10 g/l, agar
12 g/l, extract drojdie 5 g/l, KH2PO4 2 g/l, pH 6,8, agar 15 g/l). De
pe plăcile care prezentau colonii izolate, bine diferenţiate au fost
prelevate cu ansa colonii care aveau caracteristici diferite (formă,
margini, culoare, dimensiuni etc.) şi însămânţate din nou pe mediul
solid identic cu cel de pe care s-au prelevat, în scopul purificării.
Tulpinile purificate au fost cultivate apoi în mediul lichid şi
20
depozitate la -75°C, în prezenţa unui crioprotectant (glicerol 25%,
v/v).
Pentru identificare, tulpinile au fost supuse testului catalazei şi
coloraţiei Gram. În plus, aceste tulpini au fost identificate pe baza
unor criterii fenotipice şi prin tehnici moleculare moderne
(electroforeza denaturantă a proteinelor totale, rep-PCR,
secvenţializarea ARNr 16S), în cadrul unui laborator colaborator
din Belgia (Universitatea din Ghent).

 Selecţia de tulpini bacteriene producătoare de bacteriocine

Un număr de 185 de tulpini (în principal aparţinând genurilor
Lactococcus, Leuconostoc şi Lactobacillus) au fost testate din
punctul de vedere al producerii de bacteriocine. Ca tulpini indicator
au fost folosite alte bacterii lactice, fie izolate din aceleaşi surse, fie
tulpini existente deja în colecţia laboratorului, dar şi bacterii
potenţial patogene, cum ar fi: E. coli. Staphylococcus aureus,
Salmonella panama şi Klebsiella pneumoniae. Drept metode de
testare a efectului antibacterian au fost folosite metodele descrise
de:
- Gratia (1946): coloniile de testat sunt acoperite cu un strat
de mediu slab agarizat, conţinând şi tulpina indicator; după
incubare, în jurul coloniilor apar zone clare de inhibiţie;
- Kekessy & Piguet (1970): tulpinile testate sunt inoculate cu
ansa pe medii solide, perpendicular pe tulpinile indicator; în zona de
contact se observă lipsa creşterii tulpinii sensibile;
- Mayr-Harting şi colab. (1972): culturile testate sunt
centrifugate, iar supernatantul este depus la suprafaţa unui strat de
mediu solid, conţinând tulpina indicator; după incubare, în regiunile
corespunzătoare spoturilor de supernatant apar zone clare de
inhibiţie.
Dintre cele 185 de tulpini testate, 24 au manifestat un efect
antibacterian mai mult sau mai puţin evident faţă de tulpinile
bacteriene folosite ca indicator. Majoritatea (20 de tulpini) au
manifestat un efect antibacterian doar faţă de alte bacterii lactice. L.
paracasei subsp. paracasei 46,6 a inhibat tulpina Klebsiella
21
pneumoniae K33, în timp ce Leuconostoc mesenteroides 60,2,
Lactococcus lactis subsp. lactis 100,4 şi Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus 104,4 au avut un efect inhibitor faţă de diverse
tulpini, aparţinând genurilor Bacillus, Propionibacterium şi
Clostridium.

3. CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

Mediul de cultura reprezintă substratul nutritiv folosit pentru
creșterea și multiplicarea microorganismelor în condiții
artificiale, iar cultura microbiană, totalitatea microorganismelor
dezvoltate [33]. Prin utilizarea mediilor de cultură se pot izola
microorganismele în cultură pură, ceea ce permite identificarea
lor, studiul unor proprietăți caracteristice, prepararea de
antigene, vaccinuri și alte produse biologice.
Condițiile pe care trebuie să le îndeplinească mediile de
cultură
Corectitudinea cercetărilor microbiologice depinde și de
calitatea mediilor de cultură, acestea trebuind să îndeplinească
câteva condiții esențiale:
 să ofere substanțele plastice și energetice necesare fiecărui
microorganism (să conțină o sursă de N și C, factori de
creștere, săruri minerale);
 să aibă un pH optim pentru specia respectivă, de obicei ușor
alcalin 7,2-7,4;
 să asigure, după caz, cerințele de aerobioză sau
anaerobioză;
 sa aibă un anumit grad de umiditate;
 sa fie stabil (trebuie să-si păstreze toate calitățile inițiale pe
toată durata incubării);
 să fie sterile, pentru a nu se dezvolta și alte microorganisme,
în afara celor însămânțate;
 să se păstreze ferite de contaminare atât înainte, cât și după
folosire.

22
Prepararea mediilor de cultură
La prepararea mediilor de cultură trebuie respectate
următoarele etape:
 stabilirea rețetei, respectarea cantității de ingrediente cu
amestecul acestora în proporția și ordinea indicată;
 verificarea pH-ului, eventual cu ajustarea acestuia;
 filtrarea mediului pentru degrosisare (îndepărtarea sărurilor
alcalino-pământoase);
 repartizarea în recipiente adecvate (eprubete, baloane)
și sterilizarea în condiții care nu diminuează proprietățile lor
nutritive (autoclavare).
Controlul sterilizării se face prin menținerea la termostat 24
ore, timp după care mediile trebuie să rămână în continuare sterile.
Mediul de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, cu
rol de aliment, care trebuie să asigure microorganismului ce
urmează a fi cultivat cantitatea necesară de apă, surse de carbon,
azot, substanţe minerale, factori de creştere, substanţe care să îi
furnizeze cantitatea de energie, cât şi toate elementele folosite de
celulă în procesele de creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor
vitale [12, 27]. Mediile de cultură se clasifică după mai multe
criterii:
a) După consistență:
 medii lichide (apă peptonată, bulion): folosite în special pentru
studiul unor proprietăți ale microorganismelor și obținerea
toxinelor;
 medii solide (geloză): utilizate mai ales pentru obținerea
microorganismelor în cultura pură.

b) După proveniență:
 medii naturale: nu necesită o prelucrare specială (lapte, bilă,
ser, cartof);
 medii artificiale: medii a căror prelucrare prealabilă este
obligatorie, pornind de la proteinele animale (carne și organe de
vită, faină de peste), sau vegetale (mazăre, soia, drojdie);

23
 Figura 7. Medii de cultură [25]

 medii sintetice: sunt mediile compuse exclusiv din substanțe

chimice (aminoacizi, factori de creștere, săruri). Compoziția
mediilor sintetice variază după dorința experimentatorului, cu
ajutorul lor putându-se studia necesitățile nutritive ale diverselor
specii microbiene;
 medii semisintetice: sunt mediile care pe lângă substanțe
chimice mai conțin și proteine animale sau vegetale.
c) După compoziție și modul de utilizare:
Medii uzuale sau simple
Pe aceste medii se dezvolta majoritatea microorganismelor,
având în compoziție extract de carne, peptonă, clorură de sodiu.
Acestea pot fi:
 lichide: bulion (utilizat ca mediu de înmulțire și menținere a
bacteriilor, servind ca element de bază pentru obținerea

24
 mediilor lichide complexe), apă peptonată (utilizată ca
mediu de îmbogățire pentru vibrioni);
 solide: geloză simplă (provine din bulion în care se
introduce la cald, fibrele unei alge marine din familia
Florideea cunoscute în comerț sub numele de agar-agar,
care-i conferă acestuia suportul solid). Este utilizată pentru
obținerea fie de colonii izolate, fie de culturi masive, în
funcție de scopul urmărit.
Medii complexe
Sunt mediile cu adaos de lichide organice (sânge, ser) sau
zaharuri (glucoză, lactoză etc.) la mediile simple, pentru cultivarea
speciilor mai pretențioase (gonococi, meningococi, hemofili)
sau evidențierea unor proprietăți. Prin adăugarea acestor ingrediente
se obțin medii cu bulion-sânge, bulion-ser, bulion-ascită, bulion
glucozat sau geloză ser (sânge, ascită).
Mediul geloză-sânge evidențiază fenomenul de hemoliză
caracteristic unor specii bacteriene (stafilococi, streptococi,
pneumococi). Pentru izolarea gonococilor, meningococilor se
folosește un mediu derivat al amestecului geloza-sânge, și anume,
geloza ciocolată. Acest mediu constă din sânge defibrinat de berbec
5% peste care se toarnă geloza încălzită la 70⁰C. Sub influența
căldurii se produce denaturarea mediului și punerea în libertate a
aminoacizilor necesari dezvoltării unor specii bacteriene (figura 7).

Geloză-sânge Agar Mac Conkey

Figura 8. Medii selective [27, 28]

25
 Figura 9. Creșterea bacteriilor pe agar MRS prin tehnica
plăcii de răspândire:
izolatele au fost colectate de la următoarele:
A - conopidă; B - porumb; C - brinjal; D - broccoli [28].

 Considerații generale privind problematica

exopolizaharidelor produse de către bacteriile lactice
Scopul acestui studiu a fost selecția tulpinilor de bacterii
lactice producătoare de exopolizaharide și stabilirea parametrilor
optimi de cultivare a acestora pe medii de cultură adecvate în
vederea obținerii de exopolizaharide [2, 29]. Pentru obținerea de
exopolizaharide din tulpini de bacterii lactice principalele obiective
ale studiilor au fost stabilirea sursei de carbon, a temperaturii și a
pH-ului la cultivarea acestora.

26
 Metode actuale de izolare a exopolizaharidelor
La studierea cantitativă și calitativă a exopolizaharidelor și
la determinarea influenței nutrienților în producția tulpinilor,
biosinteza și genetica acestor biopolimeri în BAL au fost utilizate
diferite medii de cultură. Mediile care sunt cel mai des menționate
conțin lapte degresat și zer. S-a stabilit că anumite condiții de
cultivare și compoziția mediului de cultură (nu doar sursa de
carbon) influențează cantitatea de exopolizaharide, dar și
caracteristicile moleculare ale biopolimerilor. Alegerea unui mediu
adecvat are o mare importanță dată de faptul ca unele dintre aceste
componente pot interfera cu producția de exopolizaharide. Astfel,
extractul de drojdie, extractul de carne și peptona sunt responsabile
pentru 94% din exopolizaharide sintetizate prin folosirea MRS ca
mediu de creștere și sinteză a Lactobacillus delbrueckii var.
Bulgaricus [2, 3].
Alte cercetări reprezintă o izolare a exopolizaharidelor din
lapte după precipitarea proteinelor cu pronaza E provenită de la
Streptomyces griseus, care are o specifitate mare a substratului. Se
folosește la izolarea exopolizaharidelor produse de către tulpini
starter termofilice și mezofilice, precum și de către tulpini de
Bifidobacterium longum.
După inactivarea termică a pronazei și etapa de concentrare
(evaporare sau ultrafiltrare), exopolizaharidele se precipită cu
etanol. Rezultatele reprezintă variații de aproximativ 10%. În final,
o combinație a precipitării cu TCA și digestia cu proteaza a fost
utilizată pentru culturile iaurtului.
Pentru izolarea bacteriilor lactice s-a folosit mediul Man-
Rogosa-Sharpe (MRS) g/l: peptonă - 10,0; extract de carne - 5,0;
extract de drojdie - 5,0; glucoză - 20,0; K2HPO4 - 2,0; Tween 80-
1 ml; citrat de amoniu dibazic - 2,0; acetat de sodiu - 5.0; MgSO4 x
7H2O - 1.0; MnSO4 x H2O - 0.5; pH = 6,5. Pentru selecția tulpinilor
care biosintetizează acidul lactic s-a utilizat mediul MRS+CaCO3
1%. Deoarece în momentul adăugării CaCO3 are loc o alcalinizare a
mediului, a fost necesară ajustarea pH cu mediul MRS înainte de
sterilizare la pH 6,5 cu soluție de HCl 37%.
27
 Determinarea densității optice
Pentru a se urmări gradul de dezvoltare a celulelor de
bacterii din mediul de fermentație, se face o determinare
colorimetrică la un spectrofotometru de tip Heidolf (λ = 600 nm)
după o prealabilă diluare cu apă distilată. În acest scop, 1 ml de
mediu de fermentație omogen se diluează cu 9 ml de apă distilată,
se agită și se citește extincția la spectrofotometru în cuva de un cm
față de martor reprezentat de apa distilată. Densitatea optică se
calculează după urmatoarea formulă:
D.O. = E600× 10,
unde: E600 – extincția citită la 600 nm; 10 – diluția probei.
Se menționează că pe parcursul procesului de fermentație se
pot utiliza și alte diluții, în funcție de capacitatea de creștere, pentru
a putea efectua măsurătorile.

Determinarea producerii de acid lactic

Se urmărește acumularea acidului lactic în cazul mediilor de
cultură utilizate. Aciditatea s-a determinat prin titrare cu NaOH
0,1N, prin utilizarea unui titrator automat. Pentru determinare se ia
în considerație faptul ca 1 ml NaOH 0,1N corespunde la 0,009008 g
acid lactic.

 Stabilirea sursei de carbon, temperaturii și pH la cultivarea

tulpinilor Lactobacillus rhamnosus 1 și Lactobacillus rhamnosus
Influența sursei de carbon (glucoză, lactoză, sucroză) asupra celor
două tulpini de Lactobacillus a fost studiată prin determinarea densității
optice, a producției de acid lactic și de exopolizaharid. Rezultatele sunt
date în tabelul 5.

28
 Tabelul 5. Influența sursei de carbon asupra sintezei de
exopolizaharid

Exopoli-
Timp D.O. Acid lactic
Tulpină zaharid
(ore) (600 nm) (%)
(mg/L)
Sursa de carbon – glucoza
24 2,44 0,8 29
Lactobacillus
48 6,35 1,7 29
rhamnosus IL1
72 6,7 1,05 32
24 2,48 0,66 26
Lactobacillus
48 6,2 1,34 26
rhamnosus IL4.2
72 6,08 1,16 24
Sursa de carbon - lactoza
24 1,96 1,16 19
Lactobacillus rhamnosus
48 6,6 1,8 38
IL1
72 7,04 1,4 30
24 1,78 0,48 28
Lactobacillus rhamnosus
48 6,45 1,46 34
IL4.2
72 6,65 1,26 48
Sursa de carbon - sucroza
24 1,54 1,68 29
Lactobacillus rhamnosus
48 3,24 1,72 41
IL1
72 2,2 1,92 40
24 1,3 1,04 20
Lactobacillus rhamnosus
48 5,57 1,96 74
IL4.2
72 3,4 1,02 36
 

29
 Cantitatea de exopolizaharide 60 160
24 ore
24 ore
50
140 48 ore

exopolizaharide(mg/l)
48 ore
120 72 ore

Conținutul de 
40 72 ore
(mg/l)

100
30 80
20 60
40
10
20
0
0
27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
27 30 33 36 39 42 45
Temperatura Temperatura
   
Figura 10. Influența temperaturii Figura 11. Influența temperaturii
asupra sintezei de exopolizaharide asupra sintezei de
pentru tulpina Lactobacillus rhamnosus exopolizaharide pentru tulpina
IL 1  Lactobacillus rhamnosus IL 4.2
 
pH

pH

10 72 ore 72 ore
10
48 ore 48 ore
8 24 ore 8
7 7
6 6
4
4
2
2
0 20 40 60
0 50 100 150
Cantitatea exopolizaharide  (mg/l) Cantitatea exopolizaharide (mg/l)

Figura 12. Influența pH asupra Figura 13.Influența pH asupra

sintezei de exopolizaharide pentru sintezei de exopolizaharide pentru
tulpina Lactobacillus rhamnosus IL1 în tulpina Lactobacillus rhamnosusIL
MRS cu 15% sucroza 4.2 în MRS cu 15% sucroza

Din testele efectuate [2, 3] rezultă că tulpinile Lactobacillus

sp.IL1 și Lactobacillus sp. IL4.2 sunt capabile să sintetizeze
exopolizaharide când sursele de carbon sunt reprezentate de
glucoză, lactoză și sucroză. Cea mai mare cantitate de
exopolizaharide se obține când se utilizează sucroza în concentrație
de 15%, la 48 ore de fermentație. Se obțin 55 mg/L pentru tulpina
Lactobacillus sp. IL1 și 145 mg/L pentru tulpina Lactobacillus sp.
30
IL4.2. Scăderea sau creșterea valorii 7 a pH și a temperaturii de
fermentație, 370C, determină scăderea sintezei de exopolizaharide.
Această constatare este corelată cu o multiplicare mai redusă,
indiferent de valorile de pH sau temperatură folosite.

4. TESTE DE IDENTIFICARE A MICROORGANISMELOR

Caracteristicile morfologice ale microorganismelor [6]

Mediu TSI A – mediu ne inoculat, B - P.

aeruginosa, C – E. coli, D – Salmonella
typhimurium, E – Shigella flexneri

a) b) c)
Figura 14. Influența mediului asupra caracterelor morfologice ale
bacteriilor: a) Klebsiella pneumoniae, Agar Sangue: b) E. coli, Agar
Sangue e MacConkey; c) mediu MacConkey [6].

31
 Figura 15. Medii-teste pentru identificarea microorganismelor [6]

Tabelul 6. Teste pentru diferențierea entricilor comune

Genul Indol Metil roșu Voges Citrate
Proskauer

Escherichia + + - -
Citrobacter + + - -
Klebsiella/
- - V* +
Enterobacter
Serratia - V* + +
Proteus + - - +
Providencia + + - +
Pseudomonas - - - V*
*V= specii variabile.

32
 5. LUCRĂRI DE LABORATOR

Figura 16. Pașii de inoculare a unei culturi

Lucrarea de laborator nr.1

IZOLAREA MICROORGANISMELOR
AEROBE/ANAEROBE ȘI CARACTERIZAREA
CULTURAL-MORFOLOGICĂ A ACESTORA

 Medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe: mediul

Veillon, mediul Tarozzi, mediul Willis-Hobbs;
 Medii pentru cultivarea fungilor: mediul Sabouraud (geloză
cu zaharuri de tip glucoză 4% sau maltoză 4%).
 Bacteriile vinului
Bacteriile au o mare importanță pentru calitatea vinurilor.
Unele dintre ele în anumite condiții pot contribui prin activitatea lor
la îmbuntățirea acestuia; cele mai multe pot provoca vinurilor
transformări nedorite și chiar îmbolnăviri grave. În perioada
recoltării strugurilor, pe pielița boabelor, pe langă levuri și
mucegaiuri, se găsesc și bacterii, dar pot fi întâlnite de asemenea și
în crame, și pivnițe, îndeosebi pe suprafața internă a butoaielor și

33
cisternelor în care se fermentează mustul sau se păstrează vinul și
care nu au fost corect curățate și întreținute. După procesele pe care
le declanșează, bacteriile au fost grupate astfel: bacterii lactice;
bacterii acetice.
Bacteriile acetice
Sunt microorganisme aerobe, se întâlnesc atât pe strugurii
sănătoși, cât și pe cei vătămați, precum și în musturi sau vinuri, mai
ales când sunt păstrate în vase incomplet pline. Bacteriile acetice
care se dezvoltă în vin formează la suprafața acestuia un val sau o
peliculă care uneori poate fi alburie, subțire, aproape transparentă cu
reflexe irizante și care poate urca rapid pe pereții vasului. Alteori
acest val este mai gros, uleios, hidrofob și se colorează pe măsura
îmbătrânirii în brun. Într-un al treilea caz, valul format atinge mai
mulți milimetri din grosime, este vâscos, greu de desfăcut și care cu
timpul cade la fundul vasului, cunoscut și sub numele de cuib de
oțet.
Genul Acetobacter
Acest gen grupează specii cu celule sub formă de bastonașe
dispuse izolat, în perechi sau lanțuri ce sunt imobile sau prevăzute
cu cili dispuși peritriche. Speciile genului Acetobacter produc
oxidarea etanolului până la acid acetic, la un pH de aproximativ 4,
precum și a acidului acetic a lactațiilor și aminoacizilor. Ciclul
Krebs este prezent și activ. Se dezvoltă la temperaturi cuprinse între
5-42oC, cu un optim de 30oC. Speciile cele mai importante sunt:
Acetobacter aceti; Acetobacter pasteurianus; Acetobacter
peroxydans.
Genul Gluconobacter
Cuprinde bacterii asemănătoare din punct de vedere
morfologic cu speciile genului Acetobacter. Singurul criteriu de
diferențiere îl reprezintă flagelatia când aceasta există. Astfel,
speciile genului Gluconobacter sunt lofotriche (3-8 cili la fiecare
pol) față de ciliatia peritriche la Acetobacter. Produc oxidarea
moderată a etanolului până la acidul acetic la un pH=4,5.
Temperatura optimă de dezvoltare este 25-30oC, dar variația
acesteia poate fi cuprinsă între 7-41oC. Fiziologic se deosebește de
34
genul Acetobacter prin următoarele proprietăți: ciclul Krebs nu este
complet; nu oxidează acidul acetic și lactații până la CO2.
Bacteriile lactice
Reprezentanții acestui grup sunt facultativi-anaerobi și
participă la o serie de transformări în vin, și anume: transformarea
glucidelor în acid lactic și alți produși secundari (glicerol, alcool
etilic, acid acetic etc); fermentația malolactică; degradarea acidului
tartric, citric; degradarea glicerolului și a altor componenți.
Genul Pediococcus
Cuprinde bacterii Gram (+) cu aspect sferic grupate sub
formă de diplococi sau tetracoci.
Sunt nesporulate, imobile, homofermentative. Fermentează
glucidele, iar acidul malic numai la pH ridicat. Nu degradează
acidul citric și tartric, din acest motiv nu sunt considerate
dăunătoare. Cuprinde două specii importante: Pediococcus
cerevisiae; Pediococcus pentosacens.
Genul Leuconostoc
Cuprinde bacterii Gram (+) cu celule de formă sferică,
ovoidă sau alungită, dispuse sub forma unor șiraguri de mărgele ca
și streptococii. Produc fermentația malolactică numai în vinuri
foarte acide, nesulfitate sau cu un conținut redus de SO2.
Principalele specii: Leuconostoc gracile este specia cea mai
frecventă în vinuri. Descompune energic acidul malic și în măsură
mai mică acidul citric; Leuconostoc oinos A, X, P.
Genul Lactobacillus
Grupează bacterii Gram (+) și cuprinde atât specii
homofermentative, cât și specii heterofermentative. Specii
homofermentative: Lactobacillus plantarum se prezintă sub formă
de bastonașe scurte, izolate sau grupate. Lactobacillus casei, se
prezintă sub forma unor bacili lungi și subțiri izolați sau grupați.
Specii heterofermentative: Lactobacillus fructivorans;
Lactobacillus hilgardii.

35
  Microorganisme anaerobe

3 4
2

1 5

Figura 17. Prepararea unui mediu special de cultură anaerobă

(mediu preredus) pentru cultivarea bacteriilor obligat anaerobe:
1 - mediu de cultură cu agent de reducere; 2 - cultură bacterială;
3 - pipeta Pasteur; 4 - canulă de gaz; 5 - reducerea conținutului de oxigen cu
N2. CO2 [36].

Dintre toate metodele disponibile pentru cultivarea bacteriilor

anaerobe, excluderea oxigenului din mediu este cea mai simplă
metodă. În timpul preparării, mediul de cultură lichid este fiert prin
menținerea în apă clocotită timp de 10 minute pentru a îndepărta
cea mai mare parte a oxigenului dizolvat. Substanțele lichide devin
în curând aerobe, deci, se adaugă un agent reducător (de exemplu,
cisteină 0,1%, acid ascorbic 0,1%, tioglicolat de sodiu 0,1%) pentru
a reduce în continuare conținutul de oxigen. N2 este barbotat prin
mediu pentru a menține starea anaerobă. Mediul este apoi distribuit
în tuburi, care sunt închise etanș și sterilizate prin autoclavare.
Astfel de tuburi pot fi stocate timp de mai multe luni înainte de a fi
utilizate. În timpul inoculării, tuburile sunt spălate continuu cu CO2

36
fără oxigen prin intermediul canulei de gaz, reînchise și incubate
(figura 17).

Capac 

Borcan de 
sticlă 
Lumânare
Eprubete 
cu mediu 
Placi Petri cu 
lichid 
mediu solid

Figura 18. Condiții anaerobe de cultivare a microorganismelor [15]

Pentru selectarea culturilor anaerobe se folosesc medii

speciale. Pregătirea specială a mediului de cultură pentru bacteriile
anaerobe obligă fierberea bulionului de carne (CMB; original
mediul este cunoscut sub numele de 'Robertson pe viţel-inimă
mediu') şi bulionul de thioglycollate. Particulele de carne sunt
plasate în sticle a câte 30 ml la o adâncime de aproximativ 2,5 cm și
acoperite cu aproximativ 15 ml bulion.
Alte medii care pot fi folosite pentru recuperarea bacteriilor
anaerobe sunt Brucella blood agar, Bacteroides biliar esculinei agar,
phenylethyl alcool agar canamicina blood agar etc. Bacteriile
anaerobe au cerințe nutriționale speciale față de vitamina K,
haemin, extractul de drojdie şi toate mediile nutritive de izolare
primară. Toate bacteriile anaerobe ar trebui să conţină aceste trei
ingrediente [35].

37
 Plăcile inoculate sunt
plasate în interiorul unui
recipient etanș mare unde
este plasată o lumânare
aprinsă. CO2 stimulează
creșterea majorității
bacteriilor.
Figura 19. Metoda lumânării [35]

 Principalii pași de izolare a bacteriilor aerobe:

1) Pentru a izola şi a dezvolta bacterii din mediul natural într-un

mediu de laborator este necesar a cunoaște factorii ce determină
creşterea bacteriilor de interes.
2) Bacteriile de interes ar trebui să fie separate de alte bacterii
pentru a obţine o cultură pură de un singur tip de bacterii.
Este necesar să se separe bacteriile de interes din populația
mixtă, ca și cultură pură pentru a studia caracteristicile de bacterii în
detaliu. În general, incubarea inițială a probei de laborator se
realizează utilizând bulion lichid, adică, bulion nutritiv pentru
bacterii sau creşterea numărului de bacterii din eșantionul dat, în
utilizarea mediilor de cultură artificiale de laborator.
Inocularea în bulionul nutritiv: la probele selectate trebuie să
fie adăugat bulion nutritiv aseptic pentru a evita contaminarea şi se
incubează (termostatează) pentru 24 ore la 37⁰C. În bulionul nutritiv
după incubare se determină transparența mediului. Prezența
turbidității indică dezvoltarea bacteriilor, pe când transparenţa
mediului indică lipsa creşterii bacteriilor.
Metoda strii Petri: pentru a obţine o cultură pură, este necesar
a separa o singură colonie bacteriană. În acest sens se folosește
metoda strii (figura 20).

38
 Figura 20. Metoda de izolare strii

Metoda Plăcii Petri. În câteva plăci Petri sterile se

introduce câte 1 ml de inocul diluat. Peste el se toarnă mediul de
cultură fluidizat și răcit la 45⁰C. Se repartizează inoculul prin rotirea
plăcii în sens invers acelor de ceasornic. După solidificarea
mediului, plăcile se introduc la incubare (termostatare), la
temperatura de 37⁰C, timp de 48-72 ore. Plăcile care conţin 30-300
clonii sunt numărate. Numărul total de colonii este egal cu numărul
de celule viabile bacteriene. Numărul de celule bacteriene ar trebui
să se înmulțească cu factorul de diluție. Coloniile izolate de pe
suprafaţă pot fi folosite pentru a pregăti cultura pură.
Platuri de cultură / cultura gazonului. În această metodă,
un volum mic de amestec microbian diluat, conținând aproximativ
30-300 celule bacteriene, este transferat în centrul plăcii de agar și
cu ajutorul unei spatule, se distribuie uniform pe suprafața mediului
de agar. Celulele dispersate se dezvoltă într-o singură colonie.
Numărul de colonii este egal cu numărul de organisme viabile din
eșantion. Acestă metodă este utilizată pentru testarea sensibilității la
antibiotice și consumului de stupefiante [15].

Cultivarea bacteriilor anaerobice

Medii anaerobe. • Bacteriile anaerobe au nevoie de medii
speciale pentru creștere, deoarece au nevoie de un conținut scăzut
de oxigen, micșorând potențialul de reducere a oxidării și de
nutrienți suplimentari. • Este posibil ca mediile anaerobe să fie
completate cu substanțe nutritive cum ar fi heminul și vitamina K. •

39
La fierberea mediului are loc eliminarea oricărui oxigen dizolvat.
Exemplu de mediu anaerob: • Mediu de tioglicolat.

Figura 21. Thioglycollate medium

Excluderea oxigenului din mediu este cea mai simplă

metodă. Se efectuează prin creșterea microorganismelor în mediul
lichid proaspăt aburit sau prin injectarea adâncă în agar nutritiv cu
0,5% glucoză / 1% acid ascorbic / 0,1% cisteină / 0,1% tioglicolat
de sodiu sau particule de carne în bulion de carne fiert.

Recipientul anaerobic McIntosh și Fildes. Principii,

proceduri și utilizări
Amestec de gaze 
Manometru  
Pompă de vid 
Clemă  
 
Catalizator de paladiu 
 
 
Recipient 
 
Indicator 
 
 
Plăci Petri  inoculate cu cultură 

Figura 22. Recipientul anaerobic McIntosh și Fildes [19]

40
 Recipientul anaerobic al lui McIntosh și Fildes este un
instrument folosit în laboratorul de microbiologie pentru generarea
stării anaerobe (anaerobioză) pentru cultura obligat anaerobă cum ar
fi Clostridium spp. Anaerobioza obținută prin recipientul anaerobic
McIntosh și Fildes este una dintre metodele excelente și cele mai
utilizate pe scară largă pentru anaerobioză, dar necesită aparatură
specială costisitoare și pompă de vid. Disponibilitatea alimentării cu
gaze este un alt dezavantaj major al acestui sistem. În prezent,
acesta este înlocuit cu un sistem mai convenabil de gaze (Sistemul
GasPak).
Principiu
Buteliile anaerobe McIntosh și Fildes funcționează pe
principiul evacuării și înlocuirii, unde aerul din interiorul camerei
este evacuat și înlocuit cu un amestec de gaze (compus din 5% CO2,
10% H2 și 85% N2). Este practic imposibil să evacuezi tot aerul,
astfel încât o cantitate de oxigen va rămâne în continuare. Oxigenul
rezidual lăsat în urmă este transformat în apă, utilizând un
catalizator spongios de paladiu sau platină. Catalizatorul acționează
ca un agent de catalizator care provoacă o combinație lentă de
hidrogen și oxigen pentru a forma apă. Blendul de metilen redus
este utilizat în general ca indicator (amestec de NaOH, albastru de
metilen și glucoză), devinind incolor anaerob, dar își recapătă
culoarea albastră prin expunerea la oxigen.

Monitorizarea eficacității anaerobiozelor

Indicatorul redus de albastru de metilen este utilizat pentru a
verifica eficacitatea anaerobizei. Un tub care conține o soluție de
albastru de metilen redus trebuie păstrat în interiorul vasului
împreună cu plăcile de cultură. Albastrul de metilen este incolor în
condiții reduse și devine albastru când este oxidat.
 Pregătirea mediului RCM Robertson's Cooked Medium
(RCM)
1. Într-un recipient se introduce inimă de bovină de 500 g
mărunțită în bucăți mici, 1,5 ml NaOH 1,5 N și 500 ml apă distilată.

41
 2. Amestecul obținut se agită și se menține timp de 20 de
minute în apă clocotindă.
3. Se înlătură lichidul într-un alt recipient steril care poate fi
utilizat mai târziu pentru prepararea bulionului peptonat de carne.
4. Carnea fiartă este introdusă în eprubete sterile.
5. Pentru prepararea bulionului peptonat se utilizează lichidul
separat anterior, adică 500 ml, se adaugă 2,55 g peptonă și 1,25 g
NaCl.
6. Se menține timp de 20 de minute
(100°C) și se răcește imediat.
7. Se adaugă 1 ml de HCI pur și se
filtrează.
8. Se reglează pH-ul 8,2 și aburul
timp de 30 de minute la 100°C.
9. Se reglează pH-ul de 7,8 (bureți
de infuzie de peptonă).
10. Se adaugă bulionul de perfuzie
cu peptonă la tuburile cu carne
tocată fiartă (ca mai sus), astfel încât
nivelul bulionului de perfuzie
peptonă să fie de 2,5 cm deasupra
nivelului de carne gătită.
11. Se reglează pH-ul 7,8 și Figura 23. Mediu de carne
autoclava. Robertson

Figura 24. Dezvoltarea microorganismelor aerobe și anaerobe [27]

42
 Sarcini pentru executare:
a) Cultura platoarelor:
 mediul de agar (15 ml) se fluidizează și se răcește la 45°C;
 1 ml de inocul se adaugă în mediul agarizat topit;
 se agită bine și se toarnă într-o placă Petri sterilă;
 se lasă un timp în repaus placa Petri pentru ca mediul să se
solidifice;
 se incubează (termostatat) placa testată la 37oC, coloniile
vor fi distribuite pe toată adâncimea mediului.
 se estimează valoarea numerică a bacteriilor viabile în
suspensie.

b) Cultura stab:
 este preparată prin perforarea
(ingectarea) unui agar adecvat de
gelatină-mediu sau de glucoză, cu un
fir metalic lung, cu capătul drept.
 utilizări:
- demonstrarea lichefierii gelatinei;
- cerințele de oxigen ale bacteriei
aflate în studio;
- menținerea culturilor stocuri.

c) Cultura stroke
 cultura Stoke este realizată în
tuburi care conțin pantă de agar / slan.
Utilizări:
 oferă o creștere pură a bacteriei
pentru aglutinarea diafragmei și alte teste
de diagnosticare.

43
 d) Cultivarea microorganismelor anaerobe în plăci Petri
Obiectul de studiu, organisme de testare: bacteriile
anaerobe ale solului.
Materiale și echipamente: probă de sol, apă distilată sterilă
în eprubete, agitator, agar semisolid "anaerob" topit (agar de
tioglicolat), plăci Petri din sticlă sterile învelite în folie, baie de apă,
pipete sterile, termostat.
Practică:
1. Pregătiți o serie de diluții decimale din probele de sol.
2. Introduceți eprubetele cu diluții decimale într-o baie de apă
la 80°C timp de 10 minute pentru a selecta micoorganismele cu
endospori.
3. Se pipetează 100 μl dintr-o diluție dată în interiorul plăcii
Petri.
4. Se toarnă mediul de cultură (răcit până la aproximativ
45°C) în placa Petri. Se agită proba diluată cu mediul nutritiv. Se
lasă pentru solidificare.
5. Iarăși se toarnă mediu nutritiv pentru a crea condiții
anaerobe și se lasă pentru solidificare.
6. Înveliți plăcile Petri în folie de aluminiu și incubați-le timp
de cel puțin 1-2 zile, până la o săptămână, în funcție de rezultate.
7. Examinați plăcile în care a fost detectată creșterea
bacteriilor.
8. Observați coloniile individuale sub microscop și încercați
să izolați unele dintre colonii, făcând replicarea culturii în tuburi
adânci de agar (împingând firul metalicinoculants cu bacterii adânci
în centrul agarului).
9. Termostatați eprubetele cu cultură 2-5 zile.
10. Examinați coloniile dezvoltate.
e) Cultivarea bacteriilor anaerobice într-un recipient
anaerobic
Recipientul anaerob este de obicei transparent și poate fi
sigilat; conține un catalizator de paladiu, un generator de H2 + CO2
de unică folosință și un indicator redox. Culturile sunt plasate în
recipient împreună cu un plic care include două comprimate.
44
 Una dintre comprimate conține NaBH4 care generează
hidrogen când reacționează cu apa; celălalt comprimat conține acid
citric și carbonal de sodiu-hidrogen care generează CO2 când intră
în contact cu apa. CO2 contribuie la creșterea anaerobilor facultativi.
Recipientul este sigilat după adăugarea apei în plic. În prezența
catalizatorului de paladiu, hidrogenul reacționează cu oxigenul
pentru a forma apă. Această reacție elimină oxigenul liber din
atmosfera interioară a recipientului (figura 24). Schimbarea culoarii
indicatorului se referă la formarea unei atmosfere anaerobe.

1 – clemă
2 – capac
3 – catalizator de paladiu
4 – generator H2 + CO2
5 – indicator redox
6 – plăci de cultură

Figura 25. Recipient anaerobic

Obiectul de studiu: bacterii anaerobe sau bacterii din sol.

Materiale și echipamente: sol sau sediment, apă distilată
sterilă în eprubete, agitator, recipient anaerob, bandă redox indicator,
generator de gaze, catalizator de paladiu, foarfece, pipete, placi
Petri, distribuitor de plăci, alcool pentru sterilizare, bismut de agar
de sulfit, bismut de agar de sulfit de bismut (agar de tip Wilson
Blair), arzător, indicator.

Practică:
1. Pregătiți o serie de diluții decimale din probele de sol.
2. Distribuiți fiecare diluție pe mediul de agar de tip Wilson-
Blair.
45
 3. Puneți vasele Petri inoculate cu suprafața lor în borcanul
anaerobic (figura 24). Deschideți indicatorul redox și așezați-l lângă
plăci, astfel încât banda indicatoare să poată fi văzută din exterior
(banda indicatoare se va colora în albastru în câteva secunde).
4. Aveți grijă ca catalizatorul de paladiu să fie regenerat (prin
incinerare) sau să îl înlocuiți cu unul nou.
5. Tăiați plicul generatorului de gaz cu foarfecele și adăugați
8-10 ml apă cu pipeta (conform instrucțiunilor producătorului).
Închideți recipientul și înșurubați clema, apoi puneți vasul într-un
incubator la 28°C.
6. După o săptămână de incubare, determinați numărul CFU
pentru proba testată.

Lucrarea de laborator nr.2

STUDIEREA MEDIILOR NUTRITIVE SPECIFICE
CULTURII PENTRU ÎNTREȚINEREA ȘI
EVALUAREA CARACTERISTICILOR
MORFOLOGICE ALE TULPINILOR
Mediul de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, cu
rol de aliment care trebuie să asigure microorganismului ce urmează
a fi cultivat cantitatea necesară de apă, surse de carbon, azot,
substanţe minerale, factori de creştere, substanţe care să îi furnizeze
cantitatea de energie, cât şi toate elementele folosite de celulă în
procesele de creştere, reproducere şi întreţinere a funcţiilor vitale.
Sunt necesare următoarele medii de cultură:
 bacterii: populație mixtă în natură;

 prin proceduri adecvate ele trebuie crescute separat (izolate) pe

medii de cultură și obținute ca și culturi pure pentru studiu;
 mediu nutrienți susține creșterea.

46
 Medii de cultură

Medii lichide Medii solide

Mediul lichid:
 creștere difuză;
 nu există caracteristici pentru identificare;
 dificil de izolat cultura;
 cel mai timpuriu mediu lichid: urină sau bulion de carne
folosit de Louis Pasteur.
Mediul solid:
 morfologie de colonie distinctă;
 caracteristici ușor de identificat;
 colonie - colecție vizibilă macroscopic de milioane de bacterii
provenite dintr-o singură celulă bacteriană.
Medii simple / medii bazale:
 cele mai frecvente în laboratoarele de rutină de diagnosticare;
Ex .: nutrient Broth; Nutrient Agar
 NB constă din peptonă, extract de carne, NaCl, apă;
 NB + 0,5% glucoză = bulion de glucoză;
 NB + 2% agar = Agar nutritiv;
 Agar conc. Reducerea (0,2 - 0,5%) = mediu semisolid.

47
Medii complexe:
 medii, altele decât suporturile bazale;
 adăugare de ingrediente complexe, cum ar fi extractul de
drojdie sau hidrolizatul de cazeină, care constau dintr-un amestec de
mai multe specii chimice în proporții necunoscute;
 oferirea nutrienților specifici.
Medii sintetice sau definite:
 medii preparate din substanțe chimice pure;
 compoziția exactă este cunoscută;
 folosite pentru studii speciale, de ex., cerințe metabolice;
 de exemplu: apă peptonă - (1 % peptonă + 0,5% NaCI în apă).
Medii îmbogățite:
 substanțe ca sângele. Serum egg sunt adăugate la medium
bazal;
 folosit pentru a crește bacteriile care sunt exigente la nevoile
lor nutriționale;
 de exemplu: agar de sânge, agar de ciocolată.

48
  

Agar de
sânge

Agar de
ciocolată

     

Figura 26. Creșterea microbiană în agarul de ciocolată

 Prepararea agarului de ciocolată:

1. Se încălzește un volum de sânge de cal sau de oaie, care
reprezintă 5% din volumul total de mediu, fiind preparat foarte lent
la 56° C într-o baie de apă.
2. Plasați 20 ml în vase Petri de 15 × 100 mm. Lăsați mediul
să se solidifice și condensul să se usuce.
3. Așezați plăcile în pungi de plastic sterile și păstrați-le la
4°C până la utilizare.
4. Ca test de sterilitate, incubați o placă neinoculată timp de
48 de ore la 35-37°C cu ~ 5% CO2 (sau într-un borcan).

49
  Control de calitate:
1. Creșteți tulpinile Q. meningitidis, S. pneumoniae și H.
influenzae QC timp de 18-24 ore pe o CAP la 35-37°C cu ~ 5%
CO2 (sau într-un borcan).
2. Observați PAC pentru morfologia specifică a coloniilor și
pentru hemoliză.

Rezultate obținute:
N. meningitidis și H. influenzae ar trebui să apară ca colonii
mari, rotunde, netede, convexe, incolore și gri, opace pe PAC, fără
decolorarea mediului.
S. pneumoniae ar trebui să apară ca colonii mici de culoare gri
până la verde cu o zonă de alfa-hemoliză (doar puțin verde) pe
PAC.
După 48 de ore, placa de testare a sterilității trebuie să rămână
clară.

Caracteristicile coloniilor în agar de ciocolată

1. Neisseria meningitidis: creșterea pe agarul de ciocolată este o
coloană gri, nehemolitică, rotundă, convexă, netedă, umedă, cu o
margine clar definită.
2. Neisseria gonorrhoeae: coloniile pe agar de ciocolată sunt de
culoare roz-maro și translucide, reprezintă consistență lină și
margini definite și sunt de obicei de 0,5-1 mm în diametru.
3. Haemophilus influenzae: colonii nehemolitice, opace din
crem spre gri (agarul de sânge din oaie care îl însoțește nu prezintă
creștere).

Modificarea agarului de ciocolată:

1. Agar Thayer-Martin: se utilizează pentru izolarea selectivă
a N. gonorrhoeae și N. meningitidis. Thayer-Martin Media este un
agar de ciocolată suplimentat cu vancomicină, nistatină și colistină
pentru a inhiba flora normală, inclusiv Neisseria nepatogenă.

50
 2. Agar de ciocolată cu bacitracină: CAP cu bacitracină este
un mediu selectiv utilizat pentru a îmbunătăți izolarea primară a H.
influenzae din probele care conțin o floră mixtă de bacterii și / sau
ciuperci.
3. Agar de ciocolată cu bază GC și supliment de creștere: este
un mediu care suportă cerințele speciale de creștere (hemin și NAD)
necesare pentru izolarea organismelor fastidioase, cum ar fi H.
influenzae, atunci când sunt incubate la 35-37°C într-un mediu de
5% atmosferă de CO2.
4. Agar de ciocolată cu TSA și suplimente de creștere: este un
mediu care cere cerințe speciale de creștere (hemin și NAD)
necesare pentru izolarea organismelor fastidioase, cum ar fi H.
influenzae, atunci când sunt incubate la 35-37°C într-un mediu de 5
% atmosferă de CO2.

Medii de îmbogățire:
 medii lichide folosite pentru izolarea agenților patogeni dintr-
o cultură mixtă;
 stimulează creșterea bacteriilor dorite, inhibă creșterea
bacteriilor nedorite;
 mediul este încorporat cu substanțe inhibitoare pentru a
suprima creșterea organismului nedorit în organism - reducerea
numerelor de bacterii dorite;
 de exemplu. Selenite F Broth = pentru izolarea Salmonnelle,
Shigella;
 tetrationat - inhibă coliformii;
 apă alcalină peptonată Water pentru Vibrio cholera.

51
Fig.27. Creștera microorganismelor pe diferite medii nuritive [6, 25]

Figura 28. Creşterea colonială a miroorganismelor pe medii solide

[25, 27]

52
 Figura 29. Pepararea diluţiilor şi creşterea colonială a
microorganismelor [27]

Formă: (a) axul circular

(c) neregulat (d) filamentos
(e) risoid (f) punct.
Elevaţie: (g) plat (h) ridicat
(i) convex (j) pulvinat
(k) umbonat (l) crateriform.
Margine: (m) întreg
(n) ondulat (o) lobat
(p) filamentos.
Figura 30. Morfologia coloniei bacteriilor [25]

Cultivarea microorganismelor pe diferite medii

Caracteristicile morfologice și culturale
Rezultatele testării

53
 Lucrarea de laborator nr.3.
OBȚINEREA DE TULPINI NOU-IZOLATE
MICROBIENE DIN SURSE NATURALE

SEPARAREA CULTURILOR SELECTIVE

Separarea culturilor pure de microorganisme
Cultura pură de microorganisme se numeşte cultura unei
specii. Cultura pură reprezintă o biomasă de celule prin reproducere
dintr-o singură celulă aflată într-un mediu nutritiv steril, cu volum
limitat. Cultura pură poate fi considerată şi colonia care se formează
ca rezultat al izolării unei celule sau a unei unităţi formatoare de
colonie, atunci când aceasta este localizată pe un mediu nutritiv
solid. Metodele de separare a culturilor pure se bazează pe izolarea
unei celule dintr-o masă de microorganisme şi creşterea ulterioară a
acestei celule în medii nutritive, izolate de alte specii de
microorganisme.
Sunt cunoscute metode de extragere a unei celule din
suspensia de microorganisme cu aparate speciale
(micromanipulator, microselectorul Perfiliev, cu ajutorul
microscopului). Cea mai răspândită metodă de separare a culturilor
pure este inocularea amestecului de microbi în mediul nutritiv dens.
Pentru semănare mai des se folosesc mediile cu agar–agar în plăcile
Petri. Această metodă a fost propusă de cunoscutul microbiolog
german R. Koch. Metoda este bazată pe diminuarea concentraţiei de
microorganisme în materialul destinat, astfel încât la semănarea lui
în mediul nutritiv să crească colonii izolate.
Există două metode principale de diluare a materialului:
- pe suprafaţa mediului nutritiv dens prin metoda ,,semănării
epuizato”;
- diluarea prealabilă a materialului în soluţie fiziologică sau
apă sterilă de robinet şi semănarea materialului diluat, pregătit în
medii nutritive dense.
Separarea culturilor pure ale anaerobilor prin metoda Koch
cere condiţii de creştere în lipsa oxigenului.

54
 Dacă diluarea materialului cercetat este efectuată corect pe
suprafaţa mediului nutritiv sau în interiorul lui (în dependenţă de
metoda semănării), se formează colonii izolate de microorganisme
care sunt vizibile cu ochiul liber.
Fiecare colonie include celulele unei specii, însă pentru
separarea culturii pure este necesară reinocularea coloniei într-un
mediu separat, adică izolarea ei de alte specii de microorganisme.
Etapa finală de separare a culturii pure de microorganisme de specie
necunoscută este controlul vizual al purităţii ei în mediul izolat (cu
ochiul liber) şi microscopia preparatului.
Separarea culturii efective a Proteus din carne
Proteus vulgaris
Se ia eprubeta cu mediul nutritiv APC şi se introduce o
bucăţică de carne alterată, astfel încât ea să nu atingă suprafaţa
mediului. Pentru aceasta, eprubeta se ţine în poziţie orizontală cu
mediul nutritiv în sus. Bucăţică de carne se plasează cu penseta pe
peretele eprubetei, cu ajutorul ansei ea trebuie deplasată pe sticlă
până la începutul pantei mediului nutritiv. Eprubeta se închide cu
dop şi în poziţie verticală se introduce în termostat la temperatura
de 370C,timp de 24 de ore.

Figura 31. Proprietăţile culturale şi morfologice ale Proteus sp.[25]:

A – creşterea colonială pe medii solide BCA; B – testul uriazei;
C – prezenţa flagelilor, bacterie peritrihială; D – testul Gram (G-).
După termostatare se studiază caracterul creşterii culturii pe
suprafaţa mediului nutritiv, se efectuează colorarea după Gram a
microorganismelor şi se examinează la microscop.

55
  Caracteristica generală a Proteus sp.
Bacili Gram negativi (G-); facultativ anaerobi; mobilitate
peritrichială; nu formează capsule; nu fermentează lactoza
(Lactoza-); hidrolizează gelatina.
Proteus sp. se găsesc cel mai frecvent în tractul intestinal
uman ca parte a florei intestinale umane normale.
 Separarea culturii selective B. subtilis
O cantitate mică de fân mărunţit se introduce într-un balon
cotat. Se adaugă 50cm3 de apă de robinet. Balonul se închide cu un
dop de vată şi se fierbe timp de 10 min. După răcire, balonul se
introduce în termostat la temperatura de 250C, timp de 24 ore. După
termostatare observăm prezenţa peliculei pe suprafaţa fânului. Se
efectuează analiza acestei pelicule (fragilă zbârcită). Se prepară un
frotiu şi se studiază la microscop.

Figura 32. Caracteristicile morfologice şi culturale ale

Bacillus cereus [25]

 Caracteristica generală a Bacillus subtilis

Bacili Gram pozitivi (G+); mobilitate peritrichială, nu
formează capsule; formează spori, catalază pozitivă; hidrolizează
gelatina.
 Separarea drojdiilor
Separarea drojdiilor se efectuează prin semănarea unei stafide
sau boabe de struguri în eprubetă cu must de struguri cu plutitor
steril. Eprubeta se introduce în termostat la temperatura de 300C.

56
După termostatare timp de 24-48 de ore se urmăreşte acumularea
drojdiilor:
- după proprietăţile culturale, notând prezenţa sedimentului de
microorganisme;
- după acumularea CO2 în plutitor sau după degajarea gazului
prin agitaţia eprubetei (se formează spumă);
- după proprietăţile morfologice ale celulelor predominante în
frotiul din sediment colorat cu fuxină.

Figura 33. Saccharomyces [6, 32]

 Separarea culturii pure de halofili

Halofilii sunt microorganisme, care au proprietatea de a se
dezvolta în medii cu conţinut mare de sare. În natură putem întâlni
halofili în bazine cu apă sărată. Aceste microorganisme se dezvoltă
pe suprafaţa sării sau în produsele alimentare sărate şi pot provoca
alterarea acestora. Se întâlnesc halofilii aerobi, anaerobi cu spori şi
fără spori, în formă de coci şi bastonaşe.
Tehnica semănării
În trei eprubete cu bulion de carne, cu concentraţii diferite de
sare (NaCl-0,5%,10%,15%), se introduce cu pipeta câte o bucăţică
de scrumbie sărată. Se închid cu dop şi se termostatează la
temperatura de 30-350C, timp de 24-36 ore.
Se pregăteşte frotiul fixat şi se colorează după Gram. La
microscopie trebuie atrasă atenţia asupra formei culturii, prezenţei
sau absenţei sporilor, coloraţiei celulelor predominante. Să se
observe dacă cultura este aceeaşi în toate eprubetele sau sunt

57
prezente şi alte microorganisme, în dependenţă de concentraţia sării
în mediu.
 Studierea şi identificarea culturilor pure de
microorganisme
Denumirea specifică a culturilor pure pentru maturitatea
microorganismelor se determină după studierea proprietăţilor
morfologice, culturale şi fiziologice. Pentru identificarea ciupercilor
de mucegai e suficient a fi studiate proprietăţile morfologice şi
culturale. După semnele studiate se determină starea taxonomică
(starea sistematică) a microorganismelor, folosind determinanţi
speciali.
Proprietăţile morfologice ale microorganismelor se
cercetează prin microscopia preparatelor native sau fixate şi
colorate. Caracteristica morfologică include forma celulelor,
combinarea şi dimensiunea lor, mobilitatea, proprietatea de a forma
spori, prezenţa incluziunilor.
Proprietăţile fiziologice ale microorganismelor sunt
determinate de activitatea enzimatică, deci, exprimă particularităţile
metabolice ale celulei. Acesta este un criteriu diferenţial important,
ce se foloseşte la identificarea microorganismelor microbiene,
drojdiilor ş.a. În practica microbiologică, o metodă răspândită de
studiere a proprietăţilor fiziologice ale microorganismelor este
cultivarea lor în medii diferențiale – de diagnosticare, care permit
evoluarea activităţii biochimice a microorganismelor în funcţie de
substanţele introduse în mediu. Cele mai importante proprietăţi
fiziologice sunt următoarele: comportarea faţă de oxigen (felul de
respiraţie) care se determină după caracterul creşterii în bornă de
agar–agar (APC) după semănarea prin injecţie. După incubarea în
termostat timp de 48 ore, la o temperatură de 30-380C, sunt posibile
trei moduri de creştere, în dependenţă de modul de respiraţie:
formarea unei pălării pe suprafaţă (aerobe); creşterea omogenă pe
toată lungimea injecţiei (aerobe facultative).
Proprietăţile proteolitice. Capacitatea de descompunere a
proteinelor se determină după degajarea gazelor din mediile
nutritive. În acest scop, cultura se cultivă în mediul lichid (bulion de
58
carne şi peptonă sau apă de carne) în eprubete, unde se întăreşte o
fâşie de filtru, îmbibată cu reactivul care detectează prezenţa
gazului. Degajarea amoniacului se detectează cu ajutorul hârtiei de
lacmus, îmbibată cu acetat de plumb; degajarea iodului se determină
cu ajutorul hârtiei de filtru îmbibată cu acid oxalic.
Proprietăţile proteolitice ale microbilor sunt determinate şi
după capacitatea lor de a lichefia gelatina. Prin injectare cu acul în
borna gelatinei, peste 2 ore de cultivare se înregistrează prezenţa şi
caracterul lichefierii (în straturi, în formă de pâlnie).
Proprietăţile zaharolitice. Se determină în medii care conţin
un glucid sau alţi îndulcitori şi un indicator. Degradarea glucidelor
sub acţiunea microbilor este însoţită de schimbarea culorii
indicatorului ca rezultat al acidificării mediului. În mediile lichide,
în unele cazuri, se formează gaze care se captează cu ajutorul
,,supapei” (un tubuşor mic de sticlă, sudat la un capăt, introdus la
fundul eprubetei). Gazul format substituie mediul şi se acumulează
în supape sub formă de bule.
 Indicații generale privind prepararea culturilor
Tehnica de preparare a culturilor cuprinde următoarele faze:
reactivrea culturilor liofilizate (uscate), obținerea culturilor de
laborator și a culturilor de producție.
Materia primă
Laptele trebuie să fie de cea mai bună calitate,
proaspăt, cu un număr redus de germeni, provenit de la
animale sănătoase, preferabil de la anumite ferme-
gospodării controlate din punct de vedere igienico-sanitar și unde
nu se folosesc în general nutrețuri însilozate. A c i d i t a t e a
laptelui nu trebuie să depășească 18T, densitatea să
fie de minimum 1,029, durata de la proba reductazei
s ă f i e d e m i n i m u m 3 o r e , i a r g r a d u l d e impurificare I.
Condiții de lucru
Asigurarea unei igiene cât mai severe la
p r e p a r a r e a c u l t u r i l o r e s t e c o n d i ț i a principală de care
trebuie să se țină seama pentru a putea obține culturi de calitate și
cu eficiența dorită în procesul de fabricație a diferitelor produse
59
lactate. Prepararea culturilor în încăperi destinate special pentru
acest scop, în care se poate m e n ț i n e o s t a r e d e i g i e n ă
perfectă (sterilizarea aerului prin folosirea lămpilor
U V ) , sterilizarea cu grijă a vaselor, a aparaturii și folosirea laptelui
corespunzător, pasteurizat la 90-95°C cu menținerea timp de
30 minute sunt factorii principali în realizarea unor culturi
de calitate.
Reactivarea culturilor liofilizate
În cazul culturilor liofilizate, pentru a se restabili viabilitatea
bacteriilor, se face o însămânțare pe lapte. În laborator, în
condiții aseptice, se taie gâtul fiolei cu ajutorul unei pile,
iar cu o baghetă sterlizată se zdrobește conținutul pentru a obține o
pulbere care se introduce într-un balon de sticlă cu lapte pasteurizat
(circa 200 ml). Laptele se agită cu grijă, pentru a nu se uda dopul de
vată al balonului și se termostatează la temperatura indicată.
Prepararea culturilor de laborator
Din cultura lichidă sau din cea liofilizată reactivată, prin
pasaje succesive, se obțin culturile de laborator: cultura-mamă
cultura secundarăși terțiară.
Ziua I - din cultura selecționată se
î n s ă m â n ț e a z ă 3 e p r u b e t e c u l a p t e pasteurizat (a, b, c).
Ziua II: a - este conservată la 10°C ca rezervă în cazul în care
se produce ulterior o infectare;
b - din care se însămânțează mai multe baloane B;
c - din care se însămânțează două eprubete b și c pentru a fi
folosite a doua zi.
Ziua III – baloanele B servesc la prepararea culturilor de
producție; b și c se procedează ca în ziua a doua. Reînsămânțarea se
face zilnic, procedând în modul urmator:
- se pasteurizează laptele la 90-95°C timp de 30 minute;
- se răcește rapid la temperatura de însămânțare
corespunzătoare;
- se însămânțează inițial cu o cultură selecționată în
proporție de 2-3%; ulterior cantitatea poate fi redusă la 1-2% ;
- se termostatează la temperatura corespunzătoare
până la coagulare, evitându-se prelungirea duratei pentru a nu
afecta calitatea culturii;
60
 - după coagulare, culturile se răcesc rapid la
temperatura de 8-10°C, dacă sunt utilizate în câteva ore; când
trebuie păstrate mai mult de 12 h, temperatura este de 4-6°C.
Prepararea culturilor de producție
Culturile de laborator se consideră reactivate după
cele trei pasaje, când prezintă caracteristici nespecifice, putând
fi folosite la obținerea culturilor de producție. Tehnica de preparare
a acestor culturi este asemănătoare cu cea utilizată la obținerea
culturilor de laborator, întrebuințându-se însă cantități mai mari de
lapte în funcție de producția zilnică a fabricii. Culturile de
producție nu pot fi folosite fără o menținere la rece timp
de 5-6 ore, regulă ce trebuie respectată și în cazul culturilor de
laborator. În fabricație nu se vor folosi culturi de producție
mai vechi de 48 ore. Paralel cu prepararea culturii de producție,
se va asigura zilnic însămânțarea culturilor de laborator, acestea
constituind rezerva pentru înlocuirea culturii la nevoie.
Defectele culturilor de bacterii lactice
Activitatea necorespunzătoare a unor culturi în producție se
datorează fie folosirii u n u i l a p t e d e c a l i t a t e j o a s ă , f i e
condițiilor de preparare sau degenerării culturii
inițiale. Calitatea culturilor de laborator și de producție
trebuie verificată permanent prin examen organoleptic și
chimic.
Testul de fermentare a zahărului [32]
Toate izolatele selectate au fost examinate pentru capacitatea
lor de a fermenta diferite zaharuri așa cum este descris de Harrigan
(1998). Soluția de zahăr 10% (10 g zahăr dizolvat în 100 ml apă
distilată) a fost preparată și sterilizată. Peptona apă (peptone 1 g,
NaCl 0,5 g, apă distilată 100 ml; pH 7,2). Din această apă peptonă,
5 ml au fost distribuite în tuburi de testare separate împreună cu
indicatorul roșu fenol (0,01%) și plasate în tuburi inversate Durham,
apoi sterilizate. La fiecare eprubetă de apă cu peptonă se adaugă 0,5
ml soluție de zahăr 10% (separate pentru fiecare tip de zahăr) și se
inoculează cu două picături de suspensie izolată individuală din
bulionul MRS. Tuburile se incubează timp de 7 zile. Rezultatele
pozitive sau negative au fost observate prin schimbarea culorii de

61
mediu sau formarea bulelor de aer în tubul Durham, indicând
producția de gaz, respectiv [32].
Producția de acid
Cultura de LAB vechi de 48 de ore a fost inoculată în mediul
bulion de lactoză cu reactiv Bromocresol violet (BCP), incubat timp
de 48 ore și observat pentru schimbarea culorii de la roz la galben
[46].
Producția de gaze. Cultura LAB veche de 48 de ore a fost
inoculată în mediul de bulion de lactoză adăugat cu BCP, conținând
tuburile lui Durham incubat timp de 48 ore. Formarea bulelor de aer
în Tuburile lui Durham au fost observate și au fost înregistrate
rezultatele [46].
Acidul lactic bacterian spp. a fost izolat din diferite surse
naturale (legume și suprafețe de frunze legume, produse alimentare
fermentate și suprafețe de frunze) obținute din locații diferite.
Culturile obținute au fost adăugate în mediile de îmbogățire și au
fost cultivate prin metoda standard.
Plăcile Petri, conținând mediu MRS steril solidificat în
condiții aseptice, și culturile au fost păstrate pentru studii
suplimentare, fiind denumite culturi bacteriene izolate pe baza
sursei de izolare. Rezultatele sunt date în tabelul 7. Printre sursele
pentru izolare, iaurtul are cel mai mare număr de bacteri lactice
acide urmate de cheag, murături, siloz și legume. Cel mai mic
număr de izolate a fost înregistrat în sursele de plante.

Tabelul 7. Caracterizarea morfologică și biochimică a LAB

izolată din substraturi naturale
Sl. Reacție
Izolați Nr. Formă Motilitate Catalază Endospore
Nr. Gram
1 CU1 + Tijă - - -
2 CU2 + Tijă - - -
3 CU3 + Tijă - - -

62
 Tabelul 8. Testul pentru producerea de acid și gaz de izolatele
LAB izolate din substrate naturale
Sl. Izolați Producția Producția Homo Hetero
Nr. Nr. de acid de gaz fermentative fermentative
1 CU1 + + - +
2 CU2 + + - +
3 CU3 + + - +
4 CU4 + + - +
+ =Pozitiv - =Negativ

PLACA 1: creșterea LAB pe MRS Medium

PLACA 3: test de producție a acidului

PLACA 2: vedere microscopică a plăcii LAB

4: test de producție de gaz [6, 32].

63
 BIBLIOGRAFIE

1. AB's Veterinary Mirobiology. Cultivation of bacteria: Aerobic

and Anaerobic
http://veterinarymicrobiology.in/aerobic_anaerobic_cult/
2. Alan D. Welman and Ian S. Maddox, 2003, Exopolysaccharides
from lactic acid bacteria: perspectives and challenges, TRENDS in
Biotechnology, 21, 269 – 274.
3. American Public Health Association, Standard Methods for the
Examination of Dairy Products, 1978, 14th Ed., Washington D.C.
4. Anca Galaction Echipamente speciale de biosinteza
http://www.umfiasi.ro/masterate/Suporturi%20de%20curs/Facultatea%20
de%20Bioinginerie/Echipamente%
5. Anca-Irina Galaction, Dan Cascaval. Metaboliți secundari și
bioreactoare. Iasi, Ed. Bit, 2004.
6. Ary Fernandes. Familia Enterobacteriaceae. Departamento de
Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociencias–UNESP.
7. Azzouz Abdelkrim ș.a. Brevet de invenție nr.MD 2969 Procedeu
de cultivare a bacteriilor lactice (variante) http://ott.usm.md/wp-
content/uploads/2016/04/Cultivarea-acteriilor-lactice.pdf .
8. Beg Q. K. et al. Production and characterization of thermostable
xylanase and pectinase froma Streptomyces sp. QG 11-3. J. Ind.
Mecrobiol. Biotechnol. 24:396-402, 2000.
9. Blancoa P.et al. Production of pectic enzymes in yeasts. FEMS
Microbiol. Lett. 175: 1-9, 1999.
10. Bogdan N., Rudic V., Coev G. Actualitatea studiului laptelui de
capră ca sursă de izolare a tulpinilor de bacterii lactice// Buletinul AȘM
„Științele vieții” nr. 3(333), 2016.
11. Cultivarea bacteriilor lactice pe mai multe
mediihttps://biblioteca.regielive.ro/referate/industriaalimentara/cultivarea-
bacteriilor-lactice-pe-mai-multe-medii-80517.ht
12. Dan V. Microbiologia produselor alimentare. Vol. I. Galaţi,
1999, p.201.
13. Dehydrated Culture Media. Endo Agar Base. Thermo
Scientific.http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=
CM0479&org=64&c=uk&lang=EN

64
 14. Herlea. Microbiologia generală http://www.bio.unibuc.ro/pdf/
micro/documente_de_studiat/Herlea_Micro%20Generala%20157-162.pdf
15. Kalpesh Anil Zunjarrao. Culture Media & Culture Methods
https://www.slideshare.net/KalpeshZunjarrao/cultural-media-methods
16. Laws A.P. and Marshall V.M., 2001, The relevance of
exopolysaccharides to the rheological properties inmilk fermented with
ropy strains of lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 11, 709–721.
17. Linical Lab M
http://www.labm.com/sectors/clinical/?index=56
18. Marian Jelea. Microbiologie generală. Note de curs. Procese
metabolice ale microorganismelor şi aplicaţii în industria alimentară
http://chimie-biologie.ubm.ro/Cursuri%20online/JELEA%2
19. Mclntosh and Fildes”anaerobic Jar> principle, Procedure and
Uses, Microbe Online, 2016.
https://microbeonline.com/mcintosh-fildes-anaerobic-jar-principle-
procedure-uses/
20. Microbiologia industrială http://www.math.md/stireal/
biologie/microbio_ind.
21. Mihaela Begea, Cristina Stoicescu ș.a. Izolarea şi selecţionarea
de drojdii producătoare de biomasă proteică monocelulară. Institutul de
Cercetări Alimentare. Lucrări știinţifice. Vol. 51, seria Agronomie.
Bucureşti.
22. Purification and Characterisation and Fruit Juice Aplication,
Romanian Biotechnological Letters. Vol.15 nr. 2, 2011.
23. Ramanjayulu Golla How do y isolate from soil
https://www.researchgate.net/profile/Elsiddig.../post/...isolate_yeast./Kyri.
PDF
24. Sandulachi E. Caracteristica enzimelor pectolitice utilizate la
fabricarea sucurilor // Meridian ingineresc, nr. 1, 2012, pp. 46-53,
Chişinău. https://ibn.idsi.md/ro/vizualizare_articol/26019
25. Sandulachi L., Rubţov S. ş.a. Controlul microbiologic al
produselor alimentare. Indicaţii metodice privind controalele
microbiologice. Chişinău: UTM, 2017. - 126 p.
26. Sandulachi L., Bulgaru V. Microbiologia generală. Note de curs.
Partea III. Chişinău: Ed. ”Tehnica-UTM”, 2016. - 63 p.
27. Sandulachi L., Popescu L., Bulgaru V. Microbiologia generală.
Note de curs. Partea II. Chişinău: Ed. ”Tehnica-UTM”, 2016. - 56 p.

65
 28. Sihina Sabeen Shembil, Isolation of Lactic Acid Bacteria with
Antimicrobial Activity,Dhaka, Bangladesh, 2016
http://dspace.bracu.ac.bd/xmlui/bitstream/handle/10361/7881/11336003_
Biotechnology.pdf?sequence=1&isAllowed=y
29. Studii biotehnologice privind influența sursei de carbon și a
parametrilor de fermentare.
http://www.rasfoiesc.com/sanatate/medicina-veterinara/LUCRARE-
DE-LICENTA-BIOTEHNOLOG92.php
30. Tofan C., Bahrim G., Nicolau A., Zara M. Microbiologia
produselor alimentare. Tehnici şi analize de laborator. Bucureşti: Editura
AGIR, 2002.
31. Yeast & Mould Agar Lab M
http://www.labm.com/products/yeast-and-mould-agar.asp
32. http://krishikosh.egranth.ac.in/bitstream/1/82383/1/Thesis.pdf
33. http://www.esanatos.com/ghidmedical/microbilologie/Izolarea-
bacteriilor-in-vitro-25687.php
34. https://www.slideshare.net/gooft/41273130-biotehnologiecurs
35. https://www.slideshare.net/sasiprasad/culture-methods
36. http://www.biologydiscussion.com/microorganisms/culture-
media-for-cultivation-of-anaerobic-bacteria-4-types/55049
37. https://www.slideshare.net/doctorrao/anaerobic-culture-
methods

66
 CUPRINS

INTRODUCERE 3
ASPECTE GENERALE ALE MICROBIOLOGIEI
1. 4
INDUSTRIALE
1.1. Grupe de microorganisme utilizate în procesele
4
biotehnologice
1.2. Procedee de cultivare a microorganismelor la scară
6
industrială
1.3. Procedee de cultivare a unor microorganisme 8
IZOLAREA ȘI CULTIVAREA
2. 12
MICROORGANISMELOR PE DIFERITE MEDII
3. CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ 22
TESTE DE IDENTIFICARE A
4. 31
MICROORGANISMELOR
5. LUCRĂRI DE LABORATOR 33
Lucrarea de laborator nr.1. Izolarea microorganismelor
6. aerobe/anaerobe și caracterizarea cultural-morfologică a 33
acestora
Lucrarea de laborator nr.2. Studierea mediilor
7. nutritive specifice culturii pentru întreținerea și 46
evaluarea caracteristicilor morfologice ale tulpinilor
Lucrarea de laborator nr.3. Obținerea de tulpini nou-
8. 54
izolate microbiene din surse naturale
9. Bibliografie 64

67
 MICROBIOLOGIA IINDUSTRIALĂ

Îndrumar metodic

Autori: Elisaveta SANDULACHI

Viorica BULGARU

Bun de tipar 29.08.19 Formatul 60x84 1/16

Hârtie ofset. Tipar RISO Tirajul 50 ex.
Coli de tipar 4,25 Comanda nr.70
Universitatea Tehnica a Moldovei
Bd. Ştefan cel Mare și Sfânt, 168, MD-2004
Editura „Tehnica-UTM”
str. Studenților, 9/9, MD-2045
Chișinău, Republica Moldova

68