Colegiul de Ecologie

Lucrare practica numarul 3,4

Disciplina : Anatomie, histologie, embriologie

Specialitate: Piscicultură şi acvacultură

Tema: Descrierea tehnicii de executare a preparatelor histologice.

A elaborat : ______________________

A verificat : Mogildea Rodica

Nota _____________

Chisinau 2022
 HISTOLOGIA Ştiinţa care se ocupă cu studiul structurii microscopice a celulelor, ţesuturilor şi
organelor Ştiinţa care se ocupă cu studiul structurii microscopice a celulelor, ţesuturilor şi organelor
Compartimente: Compartimente: Citologia Citologia Histologia generală: studiul ţesuturilor Histologia
generală: studiul ţesuturilor Histologia specială: studiul organelor: org. tubulo- cavitare, org.
parenchimatoase Histologia specială: studiul organelor: org. tubulo- cavitare, org. parenchimatoase
Legături: Legături: Biologia celulară Biologia celulară Histopatologia Histopatologia

HISTOLOGIA ŢESUTURILE

- Structuri supracelulare alcătuite din celule unite între ele printr-o substanţă intercelulară

-Structuri supracelulare alcătuite din celule unite între ele printr-o substanţă intercelulară Celulele
îndeplinesc în organism aceeaşi funcţie sau acelaşi grup de funcţii.

4 categorii de ţesuturi: epitelial, conjunctiv, muscular, nervos 4 categorii de ţesuturi: epitelial,

conjunctiv, muscular, nervos Ţesuturile alcătuiesc ORGANE

Preparatul microscopic- Totalitatea obiectelor pregătite pentru a fi examinate la aparate optice

măritoare în vederea studierii structurii lor.
Totalitatea obiectelor pregătite pentru a fi examinate la aparate optice măritoare în vederea
studierii structurii lor.
Componentele: 1. Obiectul 2. Suportul: lama 3. Lame la
Sunt de 2 tipuri: extemporanee şi permanente

ETAPELE OBTINERII PREPARATULUI HISTOLOGIC PERMANENT

Nr. criteriu Etape Loc-Material Rezultate

Recoltare Biopsie-necropsie, act Esantion de tesut cu grosimea de
chirurgical 1cm
Fixare Fixatori simpli, amestecuri Conservarea structurilor
fixatoare
Spalare Apa distilata Indepartarea fixatorului
Deshidratare Alcool, 70,80, 90 Pregatirea tesuturilor pentru
Clarificare Xilen sau alti solventi ai includere
parafinei
Includere Xilen, parafina topita Se face in vederea obtineri unui
Sectionare Microtom bloc de parafina, in vederea
sectionarii structurii cu o grosime
de 4-5 microni
Dizolvarea Xilen Operatiuni facute in vederea
parafinei executarii colorarii in solutii
Hidratare Alcool 100,90,80,70 apoase de colorant, parafina
Colorare Coloranti in solutie apoasa sau nefiind miscibila cu apa
alcool
Deshidratare Alcool 70,80, 90 Operatiuni facute in vederea
Clarificare Xilen montarii sectiunilor colorate,
Montare Balsam de Canada, lamela montarew ce se face in rasini
nemiscibile cu apa din solutia de
colorant

REZULTATELE COLORARII, EXAMINAREA LA MICROSCOP A

PREPARATELOR REALIZATE IN COLORATII DIFERITE

TEHNICA EFECTUARII PREPARATELOR

Examinarea morfo-functionala a celulelor se face pe preparate microscopice.

 Un preparat microscopic este reprezentat de proba de studiat asezata pe o lama de sticla si acoperita
cu o lamela.

-lama, se mai numeste si « lama port-obiect » cu laturi paralele si dimensiuni de 76/26mm si 1.5-
2mm grosime.

- lamela este din sticla , are forma patrata sau dreptunghiulara, cu dimensiuni variabile de 18/18,
22/22 sau 22/32mm si o grosime de 0.16-0.18mm.

-Proba de studiat este reprezentata de un fragment de tesut sau o cantitate mica dintr-un lichid
corporal, aduse prin sectionare, respectiv etalare la o grosime de cativa microni. ; la aceasta grosime,
lumina strabate proba-(transiluminare)-permitand studierea celulelor la microscopul optic. .

In functie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se clasifica in :

Preparate proaspete , temporare sau extemporanee

Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amanuntit al celulelor pe piese fixate
si colorate; ele rezista in timp si se pot realiza prin:

a)-metoda efectuarii sectiunilor fine

b)-metoda etalarii materialului biologic in monostrat (frotiu, amprente de organ)

Preparatele proaspete, temporare sau extemporanee, le realizam atunci cand vrem sa studiem
structura unui tesut sau organ in stare vie.

In acest scop se recolteaza din organismul animal in timpul vietii (biopsie) un fragment foarte
subtire de organ sau tesut pe care-l disociem pe lama intr-un lichid natural sau artificial, favorabil
mentinerii vietii celulelor in timpul examinarii (plasma, limfa, lichid amniotic, ser fiziologic).

Acoperim apoi preparatul cu o lamela ale carei margini le lipim cu parafina topita, pentru a evita
uscarea tesutului.

Acest tip de preparat se mai foloseste si in studiul culturilor de tesuturi. Pe astfel de preparate
proaspete extemporanee, putem examina celulele sau elementele tesutului respectiv necolorate sau
colorate printr-o metoda numita coloratie vitala.

In metoda coloratiei vitale se intrebuinteaza diferite substante colorante putin toxice, care nu
altereaza viata celulelor.

Colorantii vitali se impart in :

Colorantii vitali bazici

Colorantii vitali acizi

Examenul in stare vie sau proaspata are marele avantaj de a permite studiul celulelor in viata, de a
urmari diferite aspecte functionale ale acestora in desfasurarea lor, de a studia unele aspecte ale dinamicii
celulare.

Putem observa :

-miscarea cililor, miscarea ameboida

 -contractilitatea, fagocitoza, fecundatia, segmentarea ovulului.

Colorantii vitali Exemple Tipuri de celule, Mod de utilizare

bazici organite pe care
acestia se fixeaza
selectiv
Albastru de neurofibrile Acesti coloranti ii utilizam
metilen in solutii apoase foarte diluate.
Verdele Janus condriom
Rosu neutru vacuom Aceste solutii diluate sunt :

-injectate animalului
inainte de sacrificare = coloratie
intravitala

-sunt puse direct in contact

cu celule si tesuturi scoase din
organism inca vii = coloratii
postvitale
Colorantii vitali Exemple Tipuri de celule, Mod de utilizare
acizi organite pe care
acestia se fixeaza
selectiv
Albastrul de Comparativ cu cei Cu ei nu putem obtine
tripan acizi nu coloreaza decat coloratii intravitale, ei
Albastrul de pirol specific organite, ei punand in evidenta o functie
Carminul litinat fiind retinuti doar in celulara, nu o structura
anumite celule ,
histiocite, unde sunt
acumulati in citoplasma
sub forma de granule de
colorant

Cu toata simplitatea si avantajul pe care-l ofera acest procedeu, examenul in stare proaspata
are aplicativitate restransa. Marele dezavantaj al acestei metode este alterarea tesutului de
examinat.

De aceea s-a ajuns la necesitatea de a avea preparate microscopice durabile, permanente care
sa permita un studiu amanuntit si de lunga durata pe piese conservate si colorate.

2. Preparate permanente sau durabile,

a)-metoda efectuarii sectiunilor fine

Sectiunea este un preparat permanent in care se urmareste mentinerea tesuturilor cat mai

asemanatoare cu aspecutul lor din timpul vietii si durabilitatea in timp.

Obtinerea sectiunilor necesita efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare dintre ei avand o
influenta hotartaoare asupra reusitei finale. In ordinea executarii lor acestia sunt:

-recoltarea

-fixarea

-spalarea
 -decalcifierea (in cazul tesuturilor dure)

-includerea

-sectionarea

-aplicarea sectiunilor pe port-obiect

-colorarea

-montarea

-etichetare

Recoltarea si orientarea pieselorFragmentele de organe sau tesuturi trebuiesc recoltate in timpul

vietii, (printr-o interventie chirurgicala, cand se obtine o piesa operatorie, fie printr-un act operator mai
redus, biopsie, cand se obtine un mic fragment de tesut, fragment bioptic) sau imediat dupa moartea
animalului, pentru a evita modificarile cadaverice. Apoi, fara a le deforma sau strivi, sunt taiate la o
grosime de 2-3 mm si orientate astfel incat sa permita un studiu cat mai complet. (Ex sectiune prin colon,
nu vom face sectiunile longitudinal, sa prindem doar epiteliul de acoperire, ci transversal sa prindem toate
straturile). Piesa de material bioptic trebuie sa aiba fete plane si paralele, sa nu aiba grosime mai mare de
1-4 mm, pentru a facilita patrunderea rapida a fixatorului si a evita aparitia alterarilor post-mortem.

Recoltarea se face :

-pe o placa de pluta sau PVC

-cu pense fine pentru a nu strivi preparatul

-fasonarea piesei se face cu lame ascutite degresate ( daca tesutul recoltat este moale, de exemplu
SNC, iar fasonarea poate produce strivirea pieselor, se vor fixa fragmente mai mari de tesut, apoi se
fasoneaza).

Fixarea

Reprezinta un timp obligatoriu in realizarea preparatelor permanente. Are ca scop conservarea

constituientilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de cea din timpul vietii, conservand forma, structura
si compozitia chimica precum si raporturile reciproce existente in stare vie si pregatirea lor in vederea
manevrelor ulterioare (includere, colorare). Fixarea omoara si imobilizeaza celulele intr-un anume
moment al activitatii lor.

Aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituienti ai materiei vii, ceea ce
inseamna ca un bun fixator histologic trebuie sa fie in primul rand un bun fixator al proteinelor.
Mecanismul fixarii proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoaste faptul ca fixatorii histologici
determina o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor si in majoritatea cazurilor un anumit grad de
polimerizare a structurilor organice. O consecinta importanta a acestei coagulari a proteinelor este ca se
realizeaza blocajul reactiilor enzimatice, impiedicand astfel digestia autolitica a tesuturilor.

Fixarea trebuie privita diferit in functie de :

-gradul conservarii morfologice pe care dorim sa-l obtinem : fixarea se realizeaza in mod diferit
pentru microscopia electronica fata de cea fotonica ; in primul caz trebuiesc pastrate relatiile intre
constituientii celulei la scara moleculara.
 -de natura constituientilor chimici ce trebuie conservati : anumite structuri macromoleculare sunt
mai usor de conservat (de exemplu proteinele), in timp ce altii sunt foarte labili si dificil de fixat,
(oligozaharidele).

-de volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate : fixarea unui frotiu celular este diferita
de cea a unui organ (de exemplu encefalul) unde patrunderea fixatorului devine elementul esential al
fixarii.

-de tipul reactiilor histochimice sau de culoarea pe care dorim sa le efectuam : fixarea este diferita
cand folosim o coloratie simpla, topografica sau cand incercam decelarea lipidelor sau enzimelor.

Un bun fixator trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :

sa aiba putere mare de patrundere

sa produca o cat mai mica retractie a pieselor, evitand modificarea taliei, formei, raporturilor dintre
celule

sa nu determine aparitia de artefacte, adica modificari ale piesei care nu corespund realitatii
(retractari, umflari, vacuolizari)

sa confere o anumita consistenta piesei

sa permita colorarea pe care dorim sa o efectuam

sa nu fie toxic pentru cel care il manevreaza

sa depaseasca piesa ca volum de 30-40 de ori.

Fixarea se face cu agenti fizici sau chimici :

Agentii fizici utilizati : caldura, desicarea sau congelarea

Agentii chimici sunt cel mai frecvent utilizati, fie ca fixatori simpli, fie sub forma de amestecuri
fixatoare.

Nici un fixator citologic nu este universal si de aceea arta fixarii consta in alegerea corecta a
fixatorului in raport cu ceea ce trebuie studiat. Un fixator simplu, este greu sa indeplineasca toate
calitatile necesare unei bune fixari, motiv pentru care se recurge la amestecuri fixatoare in care diversi
compusi isi completeaza reciproc actiunea.

Tipuri de Exemple Mod de actiune Avantaje Dezavantaje

fixatori
Aldehidel Formaldehida Tesuturile sunt Are putere de Actiune lenta
e (solutie standard de fixate prin penetrare buna. Nu
10% formaldehida polimerizarea modifica structura
tamponata, proteinelor. proteinelor, acestea
tamponarea previne pastrandu-si
aciditatea ce antigenitatea, metoda
favorizeaza autoliza) are aplicabilitate in
tehnici imunologice
Glutaraldehida Actiune rapida. Penetrare
Da cele mai bune slaba
detalii citoplasmatice
globale si nucleare.
 Folosita in microscopia
electronica.
Fixatori Clorura de necunoscut Detalii nucleare Penetrare
mercuriali mercur -intra in excelente, actioneaza slaba, produce
alcatuirea rapid rigiditate
amestecului fixator
Zenker
Alcoolii Metanol, Denaturare Actiune rapida, Rigiditate,
Etanol, folositi in proteine detalii nucleare Fragilitate
amestecuri, alcool- bune. Folositi in special
formol, amestecul la frotiuri
Carnoy
Agentii Permanganati, Polimerizare Aplicatii Denaturare
oxidanti Dicromati, Tetraoxid proteine specializate, se folosesc severa
de osmiu rar
Picratii Acid picric- sol Necunoscut Detalii nucleare
Buion bune, nu da rigiditate
marcata

Reguli generale ale fixarii :

-Evitarea alterarilor autolitice- fixarea trebuie facuta cat mai repede posibil dupa recoltarea
materialului biologic.

-Spalarea fragmentelor, intr-o solutie fiziologica. Nu se foloseste apa, deoarece produce umflarea
tesuturilor.

-Evitarea uscarii tesuturilor, manevrele se fac in mediu umed.

-Facilitarea la maxim a penetrarii fixatorului in organe si tesuturi. Se vor utiliza vase mari, cu
fundul plat si dop rodat, nu se va lasa sange sau mucus la suprafata piesei, se agita din timp in timp sa nu
se lipeasca de peretii flaconului.

Este etapa in care piesa , odata fixata, este procesata intr-o forma care sa permita efectuarea de
sectiuni subtiri. Aceasta se realizeaza prin inglobarea si impregnarea pisei cu o substanta solidificabila,
rezultand un bloc cu consistenta solida, omogena.

Cel mai frecvent e utilizata parafina, cu o densitate asemanatoare tesuturilor, ce permite obtinerea
de sectiuni cu grosimi de 3-10microni.

Alte substante folosite : celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronica rasinile sintetice.

Includerea la parafina- etape :

-deshidratarea

-clarificarea

-impregnarea cu parafina

-includerea propriu zisa

Deshidratarea este operatiunea in care se indeparteaza apa din piesa. Acest pas este necesar
deooarece parafina nu e solubila in apa.
 De obicei de face cu alcool in bai de concentratii succesiv crescute (70%, 95% si 100%). In acest
fel alcoolul inlocuieste treptat apa din tesuturi.

Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie sa fie de aproximativ 10 ori mai mare decat
volumul piesei.

Durata depinde marimea fragmentelor, in medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool. Ultima
baie trebuie sa se faca intotdeauna in alcool absolut nou.

Clarificarea, este operatiunea in care alcoolul din piesa este inlocuit cu o substanta care are
proprietatea de a fi miscibila atat cu alcoolul cat si cu parafina.

Dintre aceste substante mentionam xilenul, benzenul, toluenul, cloroformul. Cel mai folosit e
xilenul.

Clarificarea consta , de asemenea in bai succesive de aceeasi substanta , de obicei 3 bai de xilen cu
durata de 3-6 ore in functie de marimea fragmentului.

La sfarsitul operatiunii de carificare, piesa devine translucida.

Impregnarea la parafina- se utilizeaza parafina cu punct de topire 56°C, care e mentinuta la

aceasta temperatura printr-un termostat.

Se trec piesele prin cel putin 3 bai de parafina pentru a se indeparta orice urma de solvent din piese.

Includerea propriu –zisa, sau turnarea blocului, consta in inglobarea pieselor in parafina noua,
neutilizata, turnata intr-o forma ; frecvent se folosesc barele paralele Leuckhardt. Piesa se introduce in
parafina topita cu fata care va fi sectionata spre fundul formei. Prin racire la temperatura camerei blocul
se solidifica si va putea fi sectionat.

Exista inconveniente pentru preparatele ce contin mult tesut conjuntiv, care se sectioneaza greu.
Recomandat a se folosi incluziune in celoidina.

Sectionarea

Piesele histologice pot fi sectionate :

a)-imediat dupa fixare, fara a fi incluse

b)-imediat dupa ce au fost incluse

a)Sectionarea piesei neincluse se face in mod curent in urma intaririi ei prin congelare sub actiunea
vaporilor de bixid de carbon, proveniti dintr-o bomba mecanica, pusa in legatura printr-un ventil cu un
microtom special pentru acest scop, numit microtom pentru sectiuni de gheata.

Sectionarea la gheata este foarte expeditiva si este folosita in histologie, in histochimie,

histoenzimologie. Cu ajutorul ei se usureaza punerea in evidenta a unor componenti celulari  : grasimi,
enzime, care dispar in metodele de incluziune. Sectiunile sunt in general groase, mai mari de 10 microni.

b)Sectionarea pieselor incluse la parafina se realizeaza cu ajutorul unui alt tip de microtom. Acesta
are la baza un cutit foarte ascutit prevazut cu un mecanism care se deplaseaza de-a lungul blocului inclus
in parafina, avansand cu o distanta standard. Prin miscarea repetata a blocului in lungul cutitului se obtin
sectiuni seriate, de cativa microni (obisnuit 4-6), care adera una de alta, formand o panglica.

Etalarea
 Este o operatiune prin care sectiunile se aplica pe lama portobiect bine degresata. Pe lama de sticla
se aplica o picatura de albumina Mayer sau solutie apoasa de gelatina si se intinde bine de-a lungul lamei.

Din panglica de sectiuni se taie fragmente de 3-4 care se aplica cu fata lucioasa pe suprafata unsa cu
albumina Mayer a lamei. Se picura apa distilata la una din extremitatile panglicii astfel incat sectiunile sa
pluteasca, apoi se aseaza pe o platina incalzitoare, unde, in cateva secunde, sectiunile se descretesc si se
intind complet. Lamele se tin apoi, 24 de ore la termostat, 37°C, pentru ca sectiunile sa se usuce si sa se
lipeasca.

Astfel procesate, preparatele permanente pot fi pastrate necolorate, ferite de praf si lumina timp
indelungat.

Amestecuri fixatoare frecvent folosite

Alcool-formol Alcool 96, 90cc Durata fixarii 24h-

cateva zile
Formol comercial ,
10cc
Lichid Bouin Acid picric, 75cc Durata optima, Potrivit pentru
cateva zile toate lucrarile curente,
Formol, 20cc dar grasimile, lipidele,
aparatul reticular nu sunt
Acid acetic glacial, conservate
5cc
Lichid Zenker Bicromat de K, Durata fixarii, 8- Fixator general
2,5g 24h

Sulfat de Na, 1g

Sublimat coroziv,
5g

Apa distilata, 95cc

Acid acetic glacial,

5cc
Lichid Carnoy Alcool absolut, 60g Durata fixarii, 1-3h Dupa acest fixator
se poate folosi orice
Cloroform, 30g coloratie. Fixeaza bine
nucleul si mentine
Acid acetic, 10g glicogenul in citoplasma

-Piesele se introduc in amestecul fixator ambalate in tifon si purtand numar de identificare.

-Durata fixarii, variaza in functie de compozitia agentului fixator, structura, dimensiunea pieselor.

-Un fixator odata folosit nu se va folosi la fixarea altei piese.

Tratamentul pieselor imediat dupa fixare

 Cand se alege un fixator, se are in vedere structura ce va fi studiata, stiind ca anumite tesuturi si
componente celulare implica folosirea anumitor fixatori sau contraindica folosirea altora.

Pentru glicogen nu se folosesc fixatori aposi.

Pentru fixarea grasimilor nu se folosesc solventi ai acestora.

Spalarea

Este operatiunea in care se opreste fixarea si se indeparteaza excesul de fixator si a unor eventuale
structuri false ce pot apare in preparat datorita unor defecte de fixare.

Se poate face cu diferite substante in functie de fixatorul folosit :

-apa curgatoare pentru formaldehida

-alcool pentru fixatori cu dicromat de potasiu

-alcool absolut pentru fixatorii pe baza de alcool, amestecul Carnoy

La alcoolul in care spalam piesa se adauga in mod obligatoriu si solutie iod iodurata sau tinctura de
iod pentru a se elimina precipitatele pe care le formeaza sublimatul in tesuturi in timpul fixarii.

Includerea

Este etapa in care piesa , odata fixata, este procesata intr-o forma care sa permita efectuarea de
sectiuni subtiri. Aceasta se realizeaza prin inglobarea si impregnarea pisei cu o substanta solidificabila,
rezultand un bloc cu consistenta solida, omogena.

Cel mai frecvent e utilizata parafina, cu o densitate asemanatoare tesuturilor, ce permite obtinerea
de sectiuni cu grosimi de 3-10microni.

Alte substante folosite : celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronica rasinile sintetice.

Includerea la parafina- etape :

-deshidratarea

-clarificarea

-impregnarea cu parafina

-includerea propriu zisa

Deshidratarea este operatiunea in care se indeparteaza apa din piesa. Acest pas este necesar
deooarece parafina nu e solubila in apa.

De obicei de face cu alcool in bai de concentratii succesiv crescute (70%, 95% si 100%). In acest
fel alcoolul inlocuieste treptat apa din tesuturi.

Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie sa fie de aproximativ 10 ori mai mare decat
volumul piesei.

Durata depinde marimea fragmentelor, in medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool. Ultima
baie trebuie sa se faca intotdeauna in alcool absolut nou.
 Clarificarea, este operatiunea in care alcoolul din piesa este inlocuit cu o substanta care are
proprietatea de a fi miscibila atat cu alcoolul cat si cu parafina.

Dintre aceste substante mentionam xilenul, benzenul, toluenul, cloroformul. Cel mai folosit e
xilenul.

Clarificarea consta , de asemenea in bai succesive de aceeasi substanta , de obicei 3 bai de xilen cu
durata de 3-6 ore in functie de marimea fragmentului.

La sfarsitul operatiunii de carificare, piesa devine translucida.

Impregnarea la parafina- se utilizeaza parafina cu punct de topire 56°C, care e mentinuta la

aceasta temperatura printr-un termostat.

Se trec piesele prin cel putin 3 bai de parafina pentru a se indeparta orice urma de solvent din piese.

Includerea propriu –zisa, sau turnarea blocului, consta in inglobarea pieselor in parafina noua,
neutilizata, turnata intr-o forma ; frecvent se folosesc barele paralele Leuckhardt. Piesa se introduce in
parafina topita cu fata care va fi sectionata spre fundul formei. Prin racire la temperatura camerei blocul
se solidifica si va putea fi sectionat.

Exista inconveniente pentru preparatele ce contin mult tesut conjuntiv, care se sectioneaza greu.
Recomandat a se folosi incluziune in celoidina.

Sectionarea

Piesele histologice pot fi sectionate :

a)-imediat dupa fixare, fara a fi incluse

b)-imediat dupa ce au fost incluse

a)Sectionarea piesei neincluse se face in mod curent in urma intaririi ei prin congelare sub actiunea
vaporilor de bixid de carbon, proveniti dintr-o bomba mecanica, pusa in legatura printr-un ventil cu un
microtom special pentru acest scop, numit microtom pentru sectiuni de gheata.

Sectionarea la gheata este foarte expeditiva si este folosita in histologie, in histochimie,

histoenzimologie. Cu ajutorul ei se usureaza punerea in evidenta a unor componenti celulari  : grasimi,
enzime, care dispar in metodele de incluziune. Sectiunile sunt in general groase, mai mari de 10 microni.

b)Sectionarea pieselor incluse la parafina se realizeaza cu ajutorul unui alt tip de microtom. Acesta
are la baza un cutit foarte ascutit prevazut cu un mecanism care se deplaseaza de-a lungul blocului inclus
in parafina, avansand cu o distanta standard. Prin miscarea repetata a blocului in lungul cutitului se obtin
sectiuni seriate, de cativa microni (obisnuit 4-6), care adera una de alta, formand o panglica.
 Etalarea

Este o operatiune prin care sectiunile se aplica pe lama portobiect bine degresata. Pe lama de sticla
se aplica o picatura de albumina Mayer sau solutie apoasa de gelatina si se intinde bine de-a lungul lamei.

Din panglica de sectiuni se taie fragmente de 3-4 care se aplica cu fata lucioasa pe suprafata unsa cu
albumina Mayer a lamei. Se picura apa distilata la una din extremitatile panglicii astfel incat sectiunile sa
pluteasca, apoi se aseaza pe o platina incalzitoare, unde, in cateva secunde, sectiunile se descretesc si se
intind complet. Lamele se tin apoi, 24 de ore la termostat, 37°C, pentru ca sectiunile sa se usuce si sa se
lipeasca.

Astfel procesate, preparatele permanente pot fi pastrate necolorate, ferite de praf si lumina timp
indelungat.

Amestecuri fixatoare frecvent folosite

Alcool-formol Alcool 96, 90cc Durata fixarii 24h-

cateva zile
Formol comercial ,
10cc
Lichid Bouin Acid picric, 75cc Durata optima, Potrivit pentru
cateva zile toate lucrarile curente,
Formol, 20cc dar grasimile, lipidele,
aparatul reticular nu sunt
Acid acetic glacial, conservate
5cc
Lichid Zenker Bicromat de K, Durata fixarii, 8- Fixator general
2,5g 24h

Sulfat de Na, 1g

Sublimat coroziv,
5g

Apa distilata, 95cc

Acid acetic glacial,

5cc
Lichid Carnoy Alcool absolut, 60g Durata fixarii, 1-3h Dupa acest fixator
se poate folosi orice
Cloroform, 30g coloratie. Fixeaza bine
nucleul si mentine
Acid acetic, 10g glicogenul in citoplasma

Agentii Fixatori

Acid osmic Fixeaza bine Patrundere scazuta-piesele trebuie sa

fie subtiri
Grasimea, mielina, diferite granule,
profermentul din celulele glandulare se Iritant pentru conjunctive, bronhii,
coloreaza in negru, ele devenind insolubile trebuie manipulat cu precautie
 in dizolvantii obisnuiti

Fixeaza foarte bine protozoare,

globule sanguine
Alcool etilic Conserva corpii Nissl din celula Patrunde greu, produce contractia
nervoasa, fibre conjunctive din vase si  tesuturilor, impiedica colorarea
glande.
Formolul Conserva lipidele Deterioreaza citoplasma

Permite orice colorare Se opune impregnarii argentice

Perfect pentru taiere la microtomul Pentru a evita se adauga creta

prin congelare
Alcool Pentru elementele sg,(frotiu) fixator
metilic pur rapid 3-5min

Decalcifierea

Pentru a efectua preparate din piese ce contin in ele formatiuni impregnate cu saruri de calciu, cum
sunt oasele sau dintii este necesar dupa fixare sa procedam la decalcifierea acestora.

Dupa fixare, spalam bine piesa in apa curgatoare, respectiv cu alcool, apoi o trecem printr-o serie
de alcooluri cu concentratii crescande pana la 96°, apoi din nou in apa. Apoi se trece la decalcifiere.
Piesele sunt trecute prin cateva bai de solutie decalcifianta pana se demineralizeaza.. Dupa decalcifiere,
piesele sunt trecute pentru neutralizare printr-o solutie de sulfat de Na 5% timp de 24h, apoi bine spalate
in apa curgatoare, 48h.

Unii fixatori, Bouin, Zenker, actioneaza si ca solutii decalcificatoare dar doar la piese foarte mici.

Consideram incheiata decalcificarea cand piesele sunt moi si se pot taia usor.

Dupa decalcificare, piesa e supusa tehnicii de impregnare ca orice alt tesut necalcificat.

Colorarea sectiunilor

Sectiunile piselor incluse in parafina si lipite pe lama, nu pot fi colorate in aceasta stare , deoarece
solutiile colorante nu le pot patrunde , din cauza parafinei cu care a fost impregnata piesa in timpul
incluziei. De aceea aceste sectiuni trebuiesc in prealabil deparafinate si apoi hidratate pentru a le face apte
de a fi colorate cu diferite substante colorante , care sunt folosite in majoritatea lor , in solutii apoase.

Deparafinarea, se face prin trecerea lamelor pe care sunt lipite sectiunile , prin 3 bai successive care
contin unul din solventii parafinei amintiti la incluzie, xilen, benzene, toluene, pentru a elimina parafina.

In fiecare vas cu xilen se va tine lama aproximativ 1, 3 minute. Apoi, lamele sunt trecute mai
departe prin 3 bai de alcool de 96° cu scopul de a elimina solventul parafinei.. In fiecare baie de alcool,
lama va fi lasata 1, 2 minute.

In sfarsit, lamele sunt cufundate intr-un vas cu apa pentru a fi rehidratate sectiunile.

Colorarea propriu zisa, ocupa un loc important in tehnica histologica. In stare vie, constituientii
tisulari , au indici de refractie practic asemanatori, din care cauza la examenul cu microscopul obisnuit
apar omogeni. La fel raman tesuturile si dupa fixare. Principiul coloratiei histologice este de a folosi
substante colorante care se combina in mod selectiv numai cu una sau o parte din structurile unui tesut ,
pe care in acest fel le pune in evidenta. Folosirea a doi sau mai multi coloranti intr-o metoda va da o
imagine de ansamblu diferentiata a diferitilor componenti tisulari.