Machine Translated by Google
Cancerul gastric (2001) 4: 113–121
Revizuieste articolul
Diagnosticul molecular al cancerului gastric: prezent și viitor
Wataru Yasui1 , Naohide Oue1 , Hiroki Kuniyasu1,2, Reiko Ito1
1Primul Departament de Patologie, Școala de Medicină a Universității Hiroshima, 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima 734-8551, Japonia
2Departamentul de Patologie Oncologică, Centrul de Cancer, Universitatea Medicală Nara, Nara, Japonia
3Hiroshima Cancer Seminar Foundation, Hiroshima, Japonia
Abstract
Deși diagnosticul histopatologic este extrem de util pentru
diagnosticul definitiv cât și de susținere de gastric
cancer în practica clinică, este limitat în anumite privințe. Peste
ultimii 15 ani, cercetare integrată în patologie moleculară
a clarificat detaliile anomaliilor genetice și epigenetice ale genelor
legate de cancer în cursul dezvoltării
și progresia cancerului gastric. Aceste anomalii, care
includ activarea telomerazei, instabilitatea genetică și anomalii în
oncogene, gene supresoare tumorale, ciclul celular
regulatori, molecule de adeziune celulară și gene de reparare a ADN-ului,
ar putea fi markeri eficienți în diagnosticul molecular al cancerului
gastric. Este posibil ca analiza moleculară a acestora
modificări ale specimenelor histopatologice pot depăși deficiențele
diagnosticelor care depind doar de histomorfologie,
și, în consecință, s-ar putea să putem îmbunătăți diferența
diagnosticarea cancerului, obținerea de informații cu privire la gradul de
malignitate și identificarea pacienților cu risc crescut de a dezvolta mai multe
cancere primare. În Hiroshima, am stabilit un sistem
de diagnostic molecular-patologic ca serviciu de rutină; despre
5000 de leziuni ale stomacului au fost supuse acestui diagnostic și s-au
obținut multe informații utile. În
viitorul apropiat, analiză genetică prin microarray ADN
poate deveni de rutină în diagnosticul cancerului gastric. Genetic
analiza probelor histopatologice poate clarifica
caracteristicile cancerelor individuale; indicând comunul
i caracteristicile specifice ale patogenezei moleculare care pot fi
conectat direct cu terapia genică sau țintit molecular
terapie. Analizând relația dintre polimorfismele cu un singur nucleotide
și susceptibilitatea cancerului, vom face
să poată obține informații despre prevenirea cancerului din probele
his-topatologice.
Cuvinte cheie Diagnostic molecular · Cancer gastric · Histopatologie ·
Alterări genetice · Alterări epigenetice
Solicitări offprint către: W. Yasui
Primit: 21 mai 2001 / Acceptat: 3 iulie 2001
2001 de către
Internațional și
Gastric japonez
Asociații de cancer
, Eiichi Tahara3 , și Hiroshi Yokozaki1
Introducere
Conform Hiroshima Tumor Registration
Comitetul, care înregistrează tumorile care au fost
diagnosticate de patologi, numărul cazurilor înregistrate a
crescut de trei ori pentru cancerul gastric și
de 20 de ori pentru adenom gastric în ultimii 20 de ani.
Acest lucru sugerează că, recent, multe tumori au fost
biopsiat sau disecat endoscopic, în timp ce țesuturile tumorale au fost
colectate numai prin intervenție chirurgicală în perioadele anterioare.
Deși diagnosticul histopatologic este, astfel, extrem
important pentru obținerea unor diagnostice definitive și de
susținere, diagnosticul care depinde doar de histopatologie are
anumite limitări. Multe leziuni au a
morfologie care se află între cea a benignă i
leziuni maligne, iar diagnosticul diferen ial este, prin urmare,
dificil. Variațiile între patologi pot
duce la modificări ale evaluărilor leziunii. Diferențele
în criteriile de diagnostic, cum ar fi cele pentru cancerul gastro-
intestinal precoce diagnosticat de occidentali și japonezi
patologii, duc la neînțelegeri de către clinicieni.
Mai mult, informații derivate din morfologie
este de utilitate limitată în determinarea gradului de malign-
nancy și a prognosticului pacientului. Nicio informație genetică
nu poate fi obținută în cancerele ereditare, cum ar fi
cancer colorectal ereditar non-polipoz (HNPCC)
rudele.
Cercetare integrată în patologia moleculară peste
ultimii 15 ani a clarificat detaliile genetice și
anomalii epigenetice ale genelor legate de cancer în
cursul dezvoltării și progresiei gastrice
cancer [1–3]. Pentru că majoritatea acestor modificări pot fi
analizate în specimenele fixate cu formol care se prelevează
în scopul diagnosticului histopatologic, acestea
alternanțele sunt ținte bune pentru diagnosticul molecular
[4–7]. Este posibil să se aplice descoperirile moleculare în țesut
probe de diagnosticare, împreună cu rezultatele morfologiei.
Astfel, diagnosticul molecular poate depăși
dezavantajele diagnosticului histopatologic și poate face
Machine Translated by Google
114
o mare contribuție la înțelegerea cancerului
histopatologie.
Această recenzie subliniază procedura pentru moleculară
diagnostic în probe gastrice care a fost de rutină
implementat la Hiroshima. O privire de ansamblu asupra geneticii
iar alterările epigenetice în cancerul gastric se dă, la
arată semnificația acestor modificări ca biologice
markeri în diagnostic. De asemenea, discutăm despre perspectivele de viitor
pentru diagnosticul molecular al cancerului gastric.
Baza moleculară a carcinogenezei stomacale în mai multe etape
În cursul carcinogenezei în mai multe etape în durerile de
stomac, diverse modificări genetice ale oncogenelor, tumori
Se acumulează gene supresoare, gene de reparare a ADN-ului,
regulatori ai ciclului celular și molecule de adeziune celulară (Fig.
1) [1–3]. Dintre diferitele modificări genetice și epigenetice,
unele se găsesc atât în tipuri bine diferențiate, cât și în tipuri
slab diferențiate de carcinom, în timp ce altele se găsesc numai în
un anumit tip histologic. instabilitate genetică,
inactivarea genelor supresoare tumorale de către insula CpG
metilarea și activarea telomerazei participă în mod obișnuit la
etapa inițială a carcinogenezei stomacului.
În timp ce pierderea și mutația genei p53 au loc devreme
stadiul carcinogenezei, amplificarea c-met
iar genele ciclinei E sunt frecvent asociate cu
un stadiu avansat. Expresie redusă a p27Kip1, a
participă inhibitor de kinază dependentă de ciclină (CDK).
atat in dezvoltarea cat si in progresia gastricei
cancer. Supraexprimarea factorilor de creștere și a citokinelor
participă în progresie. Mutații K-ras , amplificare-
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
activarea genei c-erbB2 , inactivarea genei APC ,
iar pierderea expresiei pS2 are loc de preferință în
tip bine diferen iat. Leziuni precanceroase, cum ar fi
metaplazia intestinală și adenomul, au diferite modificări
similare cu cele observate în carcinoamele bine diferențiate.
Pierderea heterozigozității (LOH) a genei p73
apare în mod specific în carcinoamele bine diferențiate
cu fenotip epitelial foveolar [8]. Inactivarea
cadherine i amplificarea genei K-sam i
gena c-met sunt frecvent asociate cu carcinoame slab diferențiate
sau de tip scirhos. O recenzie a
anomalii reprezentative ale genelor individuale i
moleculele și semnificația lor ca markeri pentru diagnosticul
molecular, sunt prezentate mai jos.
Menținerea telomerilor prin activarea telomerazei induce
imortalizarea celulară [9]. telomeraza puternică
activitatea este detectată în majoritatea carcinoamelor gastrice,
indiferent de tipul histologic și stadiul tumorii [10]. Relativ
S-a găsit o corelație bună între activitățile telomerazei și
nivelurile subunității catalitice a telomerazei
(TERT) expresie în carcinoamele gastrice. Unele metaplazii
intestinale și adenoame gastrice exprimă
Activitatea telomerazei la anumite niveluri, sugerând participarea
într-un stadiu incipient al carcinogenezei stomacale [11].
Activitatea telomerazei se găsește în aproximativ jumătate din
adenoamele gastrice, ale căror niveluri de activitate sunt de aproximativ
10% dintre cei în carcinoame gastrice. Proteina TERT este
exprimat în nucleii celulelor adenomului la niveluri moderate
care nu sunt neapărat comparabile cu
activitatea telomerazei. Prin urmare, expresia TERT poate
fi o condiție prealabilă pentru activarea telomerazei la început
stadiul carcinogenezei stomacului; astfel, expresia de
Fig. 1. Alterări genetice și epigenetice în
timpul carcinogenezei stomacale în mai
multe etape. LOH, Pierderea heterozigozității;
HP, Helicobacter pylori; TERT, catalitic
subunitatea telomerazei; Chr., cromo-some;
GF, factori de creștere
Machine Translated by Google
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
TERT este un marker util pentru detectarea „adevăratelor leziuni
precanceroase”.
Instabilitatea genetică determină o acumulare de genetică
modificări și participă la stadiul incipient al carcinogenezei
durerilor de stomac [3]. Cazurile în care două sau mai multe dintre adenocarcinoamele bine diferențiate.
cinci loci de microsateliți arată o eroare de replicare sunt
considerate ca indicând instabilitatea microsateliților de înaltă
frecvență (MSI-H), iar cei cu un singur loc indicând
Se consideră că erorile de replicare prezintă frecvență joasă
MSI (MSI-L) [12]. MSI-H este observată în doar 4% din
carcinoame gastrice, în special de tip bine diferențiat la pacienții
în vârstă. Frecvența MSI-L este
aproximativ 30% în cancerele gastrice primare, inclusiv precoce
cancere [3]. Unele metaplazii intestinale și adenoame
arată și MSI-L, iar acestea ar trebui considerate „adevărate
leziuni precanceroase” [13]. MSI-H este utilizat ca un indicator
al HNPCC, care este cauzat de mutația liniei germinale a genelor
de reparare a nepotrivirii, inclusiv hMLH1 și
hMSH2 [14]. În cancerele gastrice sporadice cu MSI-H,
Este asociată hipermetilarea insulei CpG a hMLH1
cu pierderea proteinei hMLH1 [15,16]. Un alt important
Aspectul MSI este că mai multe cancere primare, inclusiv
carcinoamele de stomac, colon și vezici biliare, apar
într-un singur individ afișează frecvent erori de replicare la
mai mulți loci de microsateliți [17]. Acest lucru indică
că detectarea MSI într-un cancer poate servi drept a
marker molecular bun pentru evaluarea riscului de
un al doilea cancer la același pacient.
Sunt implicate anomalii ale regulatorilor ciclului celular
în dezvoltarea și progresia cancerelor gastrice
prin proliferarea celulară nestăpânită [2,3]. Ciclina E
gena este amplificată în 15%-20% din carcinoamele gastrice.
Supraexprimarea ciclinei E tinde să fie corelată
cu agresivitatea carcinoamelor gastrice, cum ar fi
invazie profundă și stadiu avansat de tumoră. Pe de altă parte
parte, reducerea expresiei inhibitorului CDK,
p27Kip1, este frecvent asociat cu stomacul avansat
carcinoame [18]. Adenoame gastrice cu p27Kip1 redus
expresia tind să evolueze spre carcinoame [7]. Redus
expresia p27Kip1 se corelează, de asemenea, în mod semnificativ cu
adâncimea invaziei tumorale și prezența metastazelor
ganglionare. Prin urmare, amplificarea genelor și
supraexprimarea ciclinei E și expresia redusă
ai p27Kip1, sunt markeri buni pentru diagnosticul de malignitate
de grad înalt. E2F-1, o țintă a ciclinelor/CDK-urilor la
Tranziția G1/S, este supraexprimată în aproximativ 40% din
carcinoamele gastric și poate participa la dezvoltarea
a carcinoamelor gastrice [19].
Anomalii în reglarea transcripțională de către CpG
metilarea insulelor și deacetilarea histonelor sunt considerate a
fi cele mai importante dintre diferitele epigenetice
modificări [20–23]. Hipermetilarea ADN-ului este cunoscută
să fie însoțită de pierderi alelice la același loc.
Hipermetilarea insulei CpG a genelor hMLH1,
MGMT (O6 -metilguanin metiltransferaza) și
115
p16MTS1/INK4A este detectat în 20%-30% din cancerele gastrice
[24–26]. Expresia redusă a produselor genetice este
bine corelat cu hipermetilarea insulei CpG.
Hipermetilarea acestor trei gene se găsește mai frecvent în
decât în adenocarcinoamele slab diferen iate. Cu toate acestea,
cazurile cu hipermetilare hMLH1 nu
coincid cu cazurile cu hipermetilare MGMT , ca
raportat în cancerul colorectal. În plus, hMLH1
hipermetilarea are loc în metaplazia intestinală,
sugerând că expresia hMLH1 s-a redus cu
metilarea promotorului poate fi un eveniment inițial în
acumularea de anomalii genetice în carcinogeneza stomacală.
Pe de altă parte, metilarea insulei CpG a CDH-1 (E-cadherină)
și a redus constant
Expresia e-cadherinei este frecvent observată în cancerele
gastrice scir-rhous. De i enzimele ADN
metiltransferaza și demetilaza pot afecta
starea de metilare a promotorului, hipermetilarea specifică
tumorii a hMLH1, p16MTS1/INK4A și CDH-1 nu
nu depind pur și simplu de nivelurile de expresie ale enzimelor
pro-metilante (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) și anti-metilante
(MBD2) [24,26].
Nucleozomii constau din miezul histone, învelite cu
spire de ADN dublu catenar [20]. Acetilarea
a histonelor perturbă structura nucleozomilor, ducând la
Relaxarea ADN-ului și o creștere ulterioară a accesibilității
pentru factorii de transcripție. Pe Western blot,
cu histonă anti-acetilată H4, nivelul de acetilat
expresia histonei H4 a fost redusă semnificativ în 70%
a carcinoamelor gastrice în comparație cu constatările în
mucoasă normală, indicând o stare de acetilare redusă
în cancerele gastrice. Inhibitorul histonei deacetilazei,
tricostatina A (TSA), inhibă creșterea celulară și induce
apoptoza în liniile celulare de carcinom gastric [27]. TSA
induce expresia p21WAF1/cip1, CBP, Bak și
ciclina E, în timp ce reduce expresia E2F-1, E2F-4, HDAC-1 și
forma fosforilată a proteinei Rb
[27]. Aceste descoperiri sugerează că deacetilarea histonelor
poate participa la proliferarea celulară nestăpânită prin
modulând expresia regulatorilor ciclului celular și
molecule legate de apoptoză. Expresia histonei H4 cu acetilitate
este, de asemenea, redusă în 40% din stomac
adenoame i unele metaplazii intestinale adiacente
carcinom, sugerând că acetilarea histonelor a redus
poate apărea chiar și în celulele precanceroase și poate fi a
marker molecular candidat pentru a indica astfel de celule.
Diagnosticul molecular al cancerului gastric pe
specimene de histopatologie
Pe baza constatărilor patologice moleculare menționate mai
sus, este clar că putem îmbunătăți calitatea
de diagnostic histopatologic prin analiza genetică i
Machine Translated by Google
116
alterari epigenetice. Am stabilit o moleculară
sistem de diagnostic pentru probe histopatologice ale tractului
gas-trointestinal, în cooperare cu orașul Hiroshima
Laboratorul clinic al Asociației Medicale și avem
efectuat acest lucru ca un serviciu de rutină [6,7]. Acest
sistemul este conceput în principal pentru diagnosticul diferen ial
de benignitate sau malignitate, diagnostic de gradul de
malignitate, identificarea susceptibilității la multiple
cancere primare și identificarea HNPCC.
Proceduri de diagnostic molecular
Procedurile utilizate, de la primirea probei până la final
diagnostic în laboratorul de patologie, sunt conturate în
Fig. 2. Probele sunt materiale de țesut fixate cu formol
ob inut prin biopsie sau disec ie (mucoasa endoscopica
rezectie sau extirpare chirurgicala) care se depun pt
diagnosticul histopatologic de rutină. Parafină de rutină
secțiunile sunt pregătite, colorate și supuse observării histo-
patologice. Un patolog indică
cazuri care urmează să fie examinate pentru diagnostic molecular (cancer,
adenom [displazie] sau leziune limită) la examenul microscopic.
Un tehnician de laborator efectuează
imunocolorarea cu diferite moleculare și genetice
markere, descrise mai jos, și în acel moment se pregătește
alte cinci secțiuni cu colorare H&E care nu sunt
incluse prin acoperirea sticlei pentru analiza genetică. The
patologul combină rezultatele imunocolorării
iar constatările histopatologice, adaugă molecular
constatările patologice și semnificația lor dacă se obțin noi
informații, și face un molecular-patologic
raport pentru medicii curant.
Unele cazuri sunt analizate în continuare folosind ADN
extras din secțiuni de parafină. Pentru a se asigura că
se examinează cu acurate e doar por iunea îndoielnică
histologic, pozi ia urmând a fi analizată pe sec iune cu
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
Colorația H&E este marcată cu un stilou la microscop de către
patolog. Un tehnician colectează țesuturile de pe zona marcată
într-un tub Eppendorf, folosind
vârful acului și extrage ADN-ul folosind o metodă convențională
cu proteinază K și dod-cilsulfat de sodiu (SDS). Pentru acest
ADN extras, mutație sau
ștergerea genelor de interes este examinată prin analiza
polimorfismului de conformare monocatenar (PCR-SSCP) și PCR
cu reacția în lanț a polimerazei non-izotopice
polimorfismul de lungime a fragmentului de restricție (RFLP). Pentru
detectarea instabilităților genetice, loci microsateliți
sunt amplificate cu PCR, folosind colorante fluorescente marcate
primeri și analizate cu un autosequencer PRISM 310
(Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Finala
diagnostic molecular-patologic, realizat prin combinare
rezultatele analizei genetice, imunocolorării și
constatările histopatologice, este raportată clinicienilor.
Imunocolorarea, extracția ADN-ului, PCR-SSCP,
și PCR-RFLP sunt efectuate de tehnicieni din
Centrul de laborator clinic al orașului Hiroshima Medical
Asocierea și analiza microsateliților se efectuează
la departamentul nostru (Secția I de Patologie,
Școala de Medicină a Universității din Hiroshima). Cele mai
multe cheltuieli sunt acoperite de o donație de la Hiroshima
Asociația Medicală a orașului și prin fonduri de cercetare de la
departamentul nostru. Patologii moleculari care se află în
sarcina sistemului de diagnostic patologic molecular
lucrează voluntar.
Markeri moleculari și genetici
Deoarece semnificația fiecărei anomalii genetice și epigenetice
diferă la nivelul esofagian, gastric și colorectal
cancere, rolurile anomaliilor individuale ar trebui
să fie suficient de înțeles înaintea acestor anomalii
sunt utilizate în diagnostic. În cancerul gastric, p53, APC și
Fig. 2. Proceduri pentru diagnosticul molecular-
patologic al histopatologiei
mostre de stomac. EMR, rezecție endoscopică
a mucoasei; TGF-a, factor de creștere
transformator alfa; EGFR,
receptorul factorului de creștere epidermic; PCR,
reacție în lanț a polimerazei; SSCP, polimorfism
de conformație cu o singură catenă;
RFLP, polimorfism de lungime a fragmentului
de restricție; MS, microsatelit
Machine Translated by Google
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
Tabel 1. Diagnosticul molecular-patologic al leziunilor gastrice
Diagnostic histologic Leziuni
Adenom 1154 Adenom cu potențial malign 119 (10%)
La limita 469 Adenom cu poten ial malign
s/o Adenocarcinom 250
Adenocarcinom 2969
s/o, Suspectat de
CD44 au fost utilizați ca markeri pentru diagnosticul diferențial
și factorul de creștere transformator alfa (TGFα),
receptorul factorului de creștere epidermic (EGFR), c-met, c-
erbB2, ciclina E, p27Kip1 și CDC25B pentru gradul de
malignitate. Pentru screening-ul instabilității genetice,
Se examinează expresia hMLH1. Cu PCR-SSCP și
PCR-RFLP, deleții sau mutații ale genei APC
iar gena p53 sunt examinate. Mutații ale p53
genele sunt analizate în exonii 5 până la 8, iar LOH este analizat
folosind polimorfismul la locul BamH1 al 3-
regiune netradusă a genei. Instabilitatea genetică este
monitorizat prin test microsatelit. Patru loci din două CA
se repetă (D1S191, D17S855; locus BRCA1 ) și două
tracturile poli A (BATRII; receptor TGF tip II și
BAT40) sunt examinate, iar dacă doi sau mai mulți loci cu
sunt detectate erori de replicare, se ia în considerare MSI-H
a fi prezent. Pentru MSI-H, prezența sau absența
mutația hMLH1 și hMSH2 este determinată de
Metode PCR-SSCP.
Evaluarea biomarkerilor este revizuită periodic și studiem
întotdeauna noi markeri retrospectiv
pentru a verifica utilitatea lor pentru diagnostic înainte de utilizare în
practica clinica. Figura 3 prezintă istoria moleculară
markeri pentru specimenele de stomac pe parcursul celor 7 ani care
sistemul nostru a funcționat. În 1993, diagnosticul molecular
117
Fig. 3. Modificări moleculare și genetice
markeri pentru diagnosticul molecular-
patologic al stomacului pe parcursul celor 7 ani
că sistemul nostru a funcționat.
PCNA, Proliferating cell nuclear antigen
Diagnosticul molecular
s/o Adenocarcinom 19 (2%)
6 (1%)
s/o Adenocarcinom 45 (10%)
Adenocarcinom 53 (11%)
Adenocarcinom 63 (25%)
Malignitate de grad înalt 3 (1%)
Malignitate de grad înalt 357 (12%)
nosis a fost început doar cu imunocolorarea, cu doar 6
markere; analiza genetică a genelor p53 și APC de către
PCR-SSCP și PCR-RFLP au fost introduse în 1995;
și, din 1996, analiza microsateliților a fost
efectuat cu un autosequencer. În prezent, analizăm 14 markeri
moleculari și 3 genetici.
Rezultate și evaluare
Aproximativ 5000 de leziuni histopatologice
au fost analizate probe de stomac. Diagnosticele histo-patologice
sunt adenom, displazie, leziune la margine, carcinom și leziune
suspectată de
carcinom. Rezultatele diagnosticului molecular-patologic al
leziunilor gastrice sunt rezumate în Tabelul 1. As
mentionat mai sus, diagnosticul molecular se face prin
combinarea rezultatelor analizelor moleculare si genetice si
constatările histopatologice. Definițiile pe care le folosim în
diagnosticul molecular sunt următoarele: (1) „adenom cu
potențial malign” este un adenom cu o mare probabilitate de a
deveni carcinom. Aceste tumori contin
unele anomalii moleculare și genetice, inclusiv
p53, dar aberațiile morfologice sunt în interval
pentru tumora benignă. (2) „Suspectat de (s/o) adenocarcinom”
este o tumoare care are anomalii genetice ale p53
Machine Translated by Google
118
și/sau APC, precum și expresia anormală a multor molecule legate
de cancer, cum ar fi c-erbB2, ciclina E, EGFR și c-met, în timp ce atipia
histologică nu este suficient de gravă pentru a fi considerată
carcinom. (3) „Adenocarcinom” este o tumoră ale cărei anomalii
genetice și moleculare sunt de același grad ca cele de la (2) de mai
sus, care poate fi considerată și histopatologic malign dacă astfel
de constatări moleculare sunt disponibile. Zece la sută dintre
adenoamele diagnosticate histologic au fost diagnosticate ca adenom
cu potențial malign, în timp ce 2% au fost suspectate de
adenocarcinom. Adenocarcinomul sau adenocarcinomul s/o a fost
identificat în mai mult de 20% din leziunile limită diagnosticate
histologic. Douăsprezece la sută din adenocarcinoamele
diagnosticate histologic au fost considerate ca prezentând malignitate
de grad înalt din cauza anomaliilor factorilor de creștere sau
receptorilor factorilor de creștere, regulatorilor ciclului celular și așa
mai departe, cum ar fi c-erbB2, EGFR, ciclina E și p27Kip1.
Prognosticul pacienților diagnosticați cu aceste anomalii a avut
tendința de a fi prost la observația de urmărire. Aproximativ 4%
dintre cancerele gastrice au prezentat MSI-H prin analiza
microsateliților (Fig. 4). La jumătate dintre pacienții care au prezentat
MSI-H, au fost confirmate cancere primare multiple sincrone sau
asincrone clinic. Am găsit mutații germinale și somatice ale genelor
de reparare a nepotrivirii ADN-ului în unele cazuri, sugerând o rudă
a HNPCC, dar majoritatea cazurilor au arătat inactivarea epigenetică
a hMLH1, posibil cauzată de metilarea insulei CpG.
Puncte în litigiu
Cu sistemul nostru de diagnosticare, porțiunea din secțiune folosită
pentru extracția ADN-ului este marcată cu un stilou, iar țesutul din
zona marcată este colectat cât mai precis posibil. Una dintre
problemele tehnice ale acestui sistem este că colectarea precisă a
probelor este uneori dificilă, iar analiza genetică nu se poate face
în cazurile în care un număr mic de celule canceroase sunt
distribuite în
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
Fig. 4. Un caz reprezentativ de cancer dublu
(cancer gastric și de colon) cu instabilitate a
microsateliților de înaltă frecvență (MSI-H).
ADN-ul a fost extras și supus testului cu
microsateliți, așa cum este descris în text.
Trei loci (D17S855, D1S191 și BAT-40) au fost
prezentate atât în cancerul gastric, cât și în
cel de colon, dar nu și în omologii normali.
epiteliul mal, cum ar fi în carcinomul cu celule cu inel sigiliu sau când
celulele canceroase sunt infiltrate difuz în stroma fibroasă, cum ar
fi în carcinomul sciros. Pentru a rezolva aceste probleme, introducem
microdisecția cu laser [28] pentru utilizare de rutină. Cu această
tehnică, celulele tumorale pot fi separate distinct de epiteliile
mucoase normale.
O altă problemă cu sistemul nostru este că nu avem destui
markeri moleculari; avem nevoie de markeri suplimentari, de
exemplu, pentru diagnosticul diferențial, gradul de malignitate și
sensibilitatea la medicamente, pentru a face diagnosticul mai eficient.
Tehnica de microarray ADN este un instrument puternic pentru a
identifica noi gene care participă la dezvoltarea și progresia
cancerului gastric. Figura 5 prezintă rezultatul reprezentativ al unui
profil comparativ de expresie genică a adenocarcinomului bine
diferențiat și a carcinomului gastric sciros slab diferențiat, obținut
prin tehnica microarray ADN.
Expresia puternică a cadherinei, a regulatorilor ciclului celular și a
kinazelor proteinei activate de mitogen (MAP) a fost observată la
tipul bine diferențiat, în timp ce supraviețuirea, factorii de creștere
(TGF, factorul de creștere derivat din trombocite [PDGF], factorul de
creștere asemănător insulinei [1]). IGF]), și proteazele
(metoproteinaza matriceală [MMP]-2, MMP-3, activator de
plasminogen [PA]) s-au dovedit a fi puternic exprimate în carcinomul
de tip scirhos. Un număr mare de gene sunt exprimate diferențiat
în diferite tumori, dar rolul lor în carcinogeneza stomacului nu este
cunoscut. Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a verifica
valoarea unor astfel de gene în diagnosticul molecular, atât
retrospectiv, cât și prospectiv.
O altă contribuție a analizei moleculare la descoperirile
clinice
Diagnosticul super precoce al cancerului gastric
După cum s-a descris mai sus, multe anomalii genetice și epigenetice
se găsesc în intestinul de tip incomplet
Machine Translated by Google
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
Fig. 5.A,B. Diferen ial
expresia genică a bine
adenocarcinom diferențiat
(A), detectat de Cy5,
si slab diferentiat
carcinom sciroas (B)
detectat de Cy3, folosind
microarray ADNc
metaplazie fără aberație morfologică evidentă.
Prin urmare, dacă analiza moleculară este extinsă la intestinal
metaplazia, diagnosticul super-precoce al cancerului gastric poate
fi făcută. De exemplu, mutații ale genelor p53, APC sau K- ras au
fost detectate în metaplazia intestinală,
de i la frecven ă joasă [29]. Metaplazia intestinală în 30% din
cazurile de cancer gastric prezintă activitate telomerazică slabă,
dar semnificativă, sugerând existența
„hiperplazia celulelor stem” sau „celule somatice deja imortalizate”
în metaplazia intestinală [3]. Proteina TERT este
exprimată în unele metaplazii intestinale de tip incomplet
adiacente carcinoamelor [11]. Expresia lui
histona acetilată este redusă în metaplazia intestinală.
Examinări ale focarelor cu instabilitate genetică în stomac
rezecate din cauza cancerului gastric au arătat, focare pozitive
pentru eroare de replicare localizate atât în cancer cât și în
metaplazia intestinală din jurul cancerului [13]. niste
metaplaziile intestinale arată hipermetilarea insulei CpG a genei
hMLH1 și expresia redusă a acesteia
(Fig. 6). Focuri cu eroare de replicare și porțiuni cu
expresie redusă a hMLH1 în mucoasa neoplazică
sunt leziuni care sunt susceptibile la progresia cancerului
(adevărate leziuni precanceroase), iar instabilitatea genetică este a
marker genetic puternic pentru a prezice o astfel de afecțiune.
Diagnosticul prezenței cancerului
Este inutil să precizăm că metastaza ganglionilor limfatici este
cel mai important factor determinant al rezultatului pacientului. Cu
toate acestea, cu examinarea histopatologică de rutină a
secțiunilor reprezentative ale suprafeței tăiate a ganglionilor limfatici,
există șansa ca micrometastaza să fie trecută cu vederea.
Detectarea moleculară a ARNm exprimate
în celulele canceroase, dar nu în alte celule din ganglionii limfatici,
119
Fig. 6. Hipermetilarea insulei CpG a genei hMLH1 în
metaplazie intestinală. Starea de metilare a insulei CpG în
promotorul genei hMLH1 a fost examinată în
mucoasa metaplazică intestinală (IMM) și nemetaplastică
mucoasei (NMM) printr-o metodă PCR specifică metilării
precum ARNm pentru keratina 19 sau carcinoembrionar
antigenul (CEA) este util pentru detectarea micrometastazelor
[30,31]. Expresia acestor gene poate fi găsită prin
revers transcriptază (RT)-PCR în mulți ganglioni limfatici
care sunt histologic negative pentru metastaze. Pacienții cu
ganglioni negativi din punct de vedere histologic, cu micrometastaze
detectate prin intermediul expresiei citokeratinei, arată mai rău
prognostic decât cei fără micrometastază [32].
Detectarea celulelor canceroase în cavitatea peritoneală
are implicații prognostice importante. Examinările citologice de
rutină, însă, nu sunt sensibile și
pacien i cu cancer gastric cu citologie peritoneală negativă
prezintă uneori recidivă peritoneală. Analiza
expresia ARNm CEA prin RT-PCR este sensibilă
suficient pentru a detecta celulele canceroase libere în spălările peritoneale
care sunt negative pentru citologie anormală, indicând că
o astfel de analiză este o tehnică puternică pentru prezicerea
risc de diseminare peritoneală. RT-PCR în timp real este
mai rapid și cantitativ decât cel convențional,
și este aplicabilă pentru luarea deciziilor în timpul intervenției chirurgicale
[33]. O strategie similară poate fi folosită pentru diagnostic
prezența celulelor canceroase în sângele periferic [34].
ARNm CEA din celulele canceroase circulante este asociat
cu un stadiu avansat al bolii și este o modalitate de diagnosticare
utilă pentru a determina selecția pacientului pentru chimioterapie
după intervenție chirurgicală și pentru a determina pacientul.
prognoză.
Perspective de viitor pentru diagnosticul molecular
Secvența genomului uman, determinată atât de
Consorțiul Internațional de Secvențiere a Genomului Uman
și Celera Genomics of Rockville, a fost publicat în
Nature din 15 februarie 2001 [35] și în Science din 16
februarie 2001 [36], respectiv. Deși proiectul
nu este încă finalizat, aproximativ 3 miliarde de perechi de baze
au fost secvențiate, acoperind 90% din eucromatic
parte a genomului uman. Numărul de gene care codifică proteine
este estimat la aproximativ 30 000. Credem
că această determinare a secven ei genomului uman
este cea mai mare realizare științifică realizată în trecut
deceniu. Pentru că un principiu al genomului uman
Machine Translated by Google
120
Proiect, reflectat în Declarația Universală a
Genomul uman și drepturile omului, este acces nelimitat
la secvență, întreaga informație despre om
genomul în natură este disponibil fără restricții
(http://www.nature.com.genomics). Acesta este începutul
a erei post-secvente. Tehnologia microarrayului ADN
au fost stabilite, și cu această tehnologie, informații despre
mutația și expresia multor gene în
cancerele umane pot fi detectate rapid, stocate și
analizate. Este un timp de evoluție în acea moleculară
diagnosticul în domeniul patologiei trebuie să corespundă
această nouă eră științifică. Constatările care au deja
acumulate pe mecanismele moleculare ale dezvoltării și
progresiei cancerului gastric și constatări
care va fi clarificat sistematic în viitor va fi
combinate, iar diagnosticul genetic prin intermediul ADN-ului
microarray va deveni cu siguranță o rutină în diagnostic
a cancerului gastric. Dacă anomaliile esențiale și modificările
secundare pot fi clarificate în multele genetice și
alterări epigenetice identificate în cancere, examinări de o
sută până la câteva sute de gene ar trebui să fie
suficient pentru diagnosticul cancerului gastric. Este important
ca caracteristicile fiecărui cancer, adică
trăsăturile comune și caracteristicile specifice în dezvoltarea
și progresia fiecărui cancer sunt clarificate astfel
că terapia genică sau terapia intită molecular poate fi
legate direct de rezultatele diagnosticului molecular al
probe histopatologice. Intenționăm să creăm ADN
miniarrays pentru diagnosticarea cancerului gastric pentru a prezice
susceptibilitatea pacientului și gradul de malignitate
și chemosensibilitatea cancerului.
Cele mai multe variații genetice între oameni individuali sunt
se crede că este cauzată de polimorfisme cu o singură
nucleotidă (SNP). Informațiile despre SNP-urile identificate la
data este disponibilă publicului. Deși frecvența medie a SNP-
urilor este estimată la 1 bp la 1,2 până la 1,9 kbp,
mai puțin de 1% din toate SNP-urile duc la variații ale proteinelor
[37]. Deși sarcinile de a determina care
SNP-urile au o consecință funcțională rămâne, în mare parte, să
fi elucidat, s-au găsit unele dovezi în legătură
la starea patologică. Polimorfismul genetic al
Genele CYP sunt legate de predispoziția la cancer, inclusiv
cancer de plamani. SNP din gena RAD51 modifică sânul
riscul de cancer la purtătorii BRCA2 [38]. SNP în
Gena interleukinei-1- este asociată cu un risc crescut
a cancerului gastric [39]. SNP din gena E-cadherin pro-moter
modifică activitatea transcripțională [40] care este asociată
cu cancerul gastric scirhos. Relația
între SNP-uri și chimiosensibilitatea a fost de asemenea
remarcat. Odată cu progresul în analiza SNP, asocierea unor
stări sau sensibilități patologice specifice
cu diferite SNP-uri vor fi clarificate și, în apropiere
pe viitor, se pot obține informații care să conducă la
farmacoterapie și profilaxia cancerului
din probe histopatologice.
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
Examinarea modificărilor morfologice în relație cu anomaliile
genetice și epigenetice este principala
beneficiul analizei genetice a histopatologice
specimene, iar acest lucru va îmbunătăți calitatea
diagnosticului histo-patologic. „Histopatologia” a descoperit
anomalii histologice minuscule și are îndeaproape
stări patologice clasificate prin acumulare
cunoștințe obținute din observații morfologice.
O altă misiune importantă pentru diagnosticul genetic în
domeniul patologiei este de a clarifica modul în care anomaliile în
func iile genelor i moleculelor se reflectă în
morfologie. Obiectivul final al patologiei moleculare este acela
că anomaliile morfologice din toate
bolile descrise în literatura de patologie vor fi
s-a constatat că corespunde modificărilor genetice și
epigenetice. În domeniul carcinogenezei, patologia moleculară
trebuie să evolueze în genomica morfologică.
Mulțumiri Această lucrare a fost susținută, parțial, de
Granturi în ajutor pentru cercetarea cancerului de la minister
de educație, cultură, sport, știință și tehnologie
al Japoniei; și de la Ministerul Sănătății, Muncii și
Bunăstarea Japoniei. Dorim să mulțumim Dr. S. Usui
și Dr. T. Yamagata (Hiroshima City Medical Association) pentru
sprijinul lor continuu în acest proiect. Mulțumiri speciale sunt
adresate domnului M. Matsumoto, domnului T.
Kabuto și alți membri ai personalului Patologiei
și Divizia de Citologie, Laboratorul Clinic al Asociației Medicale
a orașului Hiroshima, pentru priceperea lor tehnică.
asisten ă.
Referințe
1. Tahara E. Mecanismul molecular al carcinogenezei stomacului. J
Cancer Res Clin Oncol 1993;119:265–72.
2. Yasui W, Yokozaki H, Fujimoto J, Naka K, Kuniyasu H, Tahara
E. Alterări genetice și epigenetice în carcinogeneza în mai multe etape
a stomacului. J Gastroenterol 2000;35:111–5.
3. Yokozaki H, Yasui W, Tahara E. Modificări genetice și epigenetice
în cancerul de stomac. Int Rev Cytol 2001;204:49–95.
4. Yasui W, Ito H, Tahara E. Analiza ADN a materialului de arhivă și
aplicarea lui la patologia tumorală. În: Herrington CS, McGee
JO'D, editori. Patologia moleculară diagnostică, o abordare practică.
Oxford: Oxford University Press; 1992. p. 193–206.
5. Yokozaki H, Tahara E. Analiza PCR a ARN. În: Levy ER,
Herrington CS, editori. Metode non-izotopice în biologia moleculară, o
abordare practică. Oxford: Oxford University Press; 1995.
p. 201–12.
6. Yasui W, Yokozaki H, Tahara E. Diagnosticul molecular al cancerului gas-
trointestinal. În: Tahara E, editor. Patologia moleculară
a cancerului gastroenterologic: aplicare în practica clinică.
Heidelberg Berlin New York Tokyo: Springer; 1997. p. 187–207.
7. Yasui W, Yokozaki H, Shimamoto F, Tahara H, Tahara E.
Diagnosticul molecular-patologic al țesuturilor gastrointestinale și
contribuția sa la histopatologia cancerului. Pathol Int 1999;49:763–
74.
8. Yokozaki H, Shitara Y, Fujimoto J, Hiyama T, Yasui W, Tahara
E. Alterările p73 apar preferen ial în adenocarcinoamele gastrice cu
fenotip epitelial foveolar. Int J Cancer 1999;83:192–
6.
Machine Translated by Google
W. Yasui et al.: Diagnosticul molecular al cancerului gastric
9. Yasui W, Tahara H, Tahara Ej, Fujimoto J, Nakayama J, Ishikawa F și colab.
Exprimarea componentei catalitice a telomerazei, transcriptază inversă a
telomerazei, în carcinoamele gastrice umane.
Jpn J Cancer Res 1998;89:1099–103.
10. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL și colab.
Asocierea specifică a activității telomerazei umane cu celulele nemuritoare
și cancerul. Science 1994;266:2011–5.
11. Yasui W, Tahara Ej, Tahara H, Fujimoto J, Naka K, Nakayama J și colab.
Detectarea imunohistochimică a telomerazei umane reverstranscriptazei
în mucoasa normală și leziuni precanceroase ale stomacului. Jpn J Cancer
Res 1999;90:589–95.
12. Thibodeau SN, French AJ, Cunningham JM, Tester D, Burgart LJ, Roche PC, et
al. Instabilitatea microsateliților în cancerul colorectal: diferite fenotipuri
mutatoare și implicarea principală a hMLH1. Cancer Res 1998;58:1713–8.
13. Hamamoto T, Yokozaki H, Senba S, Yasui W, Yunotani S, Miyazaki K și colab.
Microsateliți alterați în metaplazia intestinală de tip incomplet adiacent
cancerelor gastrice primare. J Clin Pathol 1997;50:841–6.
14. Nakahara M, Yokozaki H, Yasui W, Dohi K, Tahara E.
Identificarea mutațiilor concomitente ale liniei germinale în genele hMSH2
și/sau hMLH1 la rudele ereditare japoneze de cancer colorectal non-polipoz.
Biomarkeri de epidemiol de cancer Anterior 1997;6:
1057–64.
15. Toyota M, Ahuja N, Suzuki H, Itoh F, Ohe-Toyota M, Imai K, et al. Metilarea
aberantă în cancerul gastric asociată cu fenotipul metilator al insulei
CpG. Cancer Res 1999:59:5438–42.
16. Fleisher AS, Esteller M, Wang S, Tamura G, Suzuki H, Yin J și colab.
Hipermetilarea promotorului genei hMLH1 în cancerele gastrice umane cu
instabilitate a microsateliților. Cancer Res 1999; 59:1090–5.
17. Horii A, Han HJ, Shimada M, Yanagisawa A, Kato Y, Ohta H, et al. Erori
frecvente de replicare la loci microsateliți în tumorile pacienților cu cancere
primare multiple. Cancer Res 1994;54: 3373–5.
18. Yasui W, Kudo Y, Senba S, Yokozaki H, Tahara E. Expresia redusă a
inhibitorului kinazei dependente de ciclină p27Kip1 este asociată cu
stadiul avansat și invazivitatea carcinoamelor gastrice.
Jpn J Cancer Res 1997;88:625–9.
19. Suzuki T, Yasui W, Yokozaki H, Naka K, Ishikawa T, Tahara E.
Exprimarea familiei E2F în carcinoamele gastrointestinale umane. Int J
Cancer 1999;81:535–8.
20. Merlo A, Herman JG, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB și colab.
Metilarea insulei 5CpG este asociată cu tăcere transcripțională a
supresorului tumoral p16/CDKN2/MTS1 în cancerele umane. Nature Med
1995;1:686–92.
21. Grustein M. Acetilarea histonelor în structura cromatinei și tran-
scriere. Nature 1997;389:349–52.
22. Luo RX, Postigo AA, Dean DC. Rb interacționează cu histon deacetilaza
pentru a reprima transcripția. Cell 1998;92:463–73.
23. Nan X, Ng HH, Johnson CA, Laherty CD, Turner BM, Eisenman RN, et al.
Reprimarea transcripțională de către proteina de legare a metil-CpG
MeCP2 implică un complex de histon deacetilază. Nature 1998;393:386–
9.
24. Kanai Y, Ushijima S, Kondo Y, Nakanishi Y, Hirohashi S. Expresia ADN
metiltransferazei și metilarea ADN-ului insulelor CPG și regiunilor satelit
peri-centromerice în cancerele colorectale și stomacale umane. Int J Cancer
2001;91:205–12.
25. Oue N, Shigeishi H, Kuniyasu H, Yokozaki H, Kuraoka K, Ito R și colab.
Hipermetilarea promotorului MGMT este asociată cu pierderea de proteine
în carcinomul gastric. Int J Cancer 2001;93:805–9.
121
26. Oue N, Kuraoka K, Kuniyasu H, Yokozaki H, Wakikawa A, Matsusaki K și colab.
Starea de metilare a ADN-ului hMLH1, p16INK4a și CDH1 nu este asociată
cu nivelurile de expresie a ARNm ale ADN-metiltransferazei și ADN
demetilazei în carcinoamele gastrice. Oncol Rep 2001;8:1085–9.
27. Suzuki T, Kuniyasu H, Hayashi K, Naka K, Yokozaki H, Ono S, et al. Trichostatin
A inhibă creșterea celulară și modulează expresia moleculelor legate de
ciclul celular și apoptoză în liniile celulare de cancer gastric și oral uman.
Int J Cancer 2000;88:992– 7.
28. Fend F, Emmert-Buck MR, Chuaqui R, Cole K, Lee J, Liotta LA, et al. Immuno-
LCM: microdisecție cu captură cu laser a secțiunilor congelate imuno-
colorate pentru analiza ARNm. Am J Pathol 1999; 154:61–6.
29. Ochiai A, Hirohashi S. Genetic alterations in the precursors of gastric cancer.
În: Tahara E, editor. Patologia moleculară a cancerului gas-troenterologic:
aplicare în practica clinică. Heidel-berg Berlin New York Tokyo: Springer;
1997. p. 43–53.
30. Mori M, Mimori K, Inoue H, Barnard GF, Tsuji K, Nanbara S și colab. Detectarea
micrometastazelor canceroase în ganglionii limfatici prin reacția în lanț a
transcriptază inversă-polimerază. Cancer Res 1995;55: 3417–20.
31. Noguchi S, Hiratsuka M, Furukawa H, Aihara T, Kasugai T, Tamura S, et al.
Detectarea micrometastazelor de cancer gastric în ganglionii limfatici prin
amplificarea ARNm a keratinei 19 cu reacție în lanț de transcriptază
inversă-polimerază. Jpn J Cancer Res 1996; 87:650–4.
32. Nakajo A, Natsugoe S, Ishigami S, Matsumoto M, Nakashima S, Hokita S, et
al. Detectarea și predicția micrometastazelor în ganglionii limfatici ai
pacienților cu cancer gastric pN0. Ann Surg Oncol 2001;8:158–62.
33. Nakanishi H, Kodera Y, Yamamura Y, Ito S, Kato T, Ezaki T și colab. Detectarea
cantitativă rapidă a celulelor tumorale libere care exprimă antigenul
carcinoembrionar în cavitatea peritoneală a pacienților cu cancer gastric
cu RT-PCR în timp real pe LightCycler. Int J Cancer 2000;89:411–7.
34. Mori M, Mimori K, Ueo H, Tsuji K, Shiraishi T, Barnard GF și colab. Semnificația
clinică a detectării moleculare a celulelor carcinomului din ganglionii
limfatici și din sângele periferic prin reacția în lanț a polimerazei-
transcriptază inversă la pacienții cu carcinoame gastrointestinale sau
mamare. J Clin Oncol 1998;16:128–32.
35. Consorțiul Internațional de Secvențiere a Genomului Uman. Secvențierea și
analiza inițială a genomului uman. Nature 2001;409: 860–921.
36. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Richard JM, Sutton GG, Hamilton OS, et al.
Secvența genomului uman. Science 2001;291:1304–51 37. The International
SNP Map Working
Group. O hartă a variației secvenței genomului uman care conține 1,42 milioane
de polimorfisme cu o singură nucleotidă. Nature 2001;409:928–41.
38. Levy-Lahad E, Lahad A, Eisenberg S, Dagan E, Paperna T, Lasinetz L, et al. Un
singur polimorfism de nucleotide în gena RAD51 modifică riscul de cancer
la purtătorii BRCA2 , dar nu și BRCA2 .
Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:3232–6.
39. El-Omar EM, Carrington M, Chow WH, McColl KE, Bream JH, Young HA, et al.
Polimorfismele interleukinei-1 asociate cu risc crescut de cancer gastric.
Nature 2000;404:398–402.
40. Li LC, Chui RM, Sasaki M, Nakajima K, Perinchery G, Au HC, et al. Un singur
polimorfism de nucleotide în promotorul genei E-cadherinei modifică
activitățile transcripționale. Cancer Res 2000;60: 873–6.