TESTE DE LABORATOR UTILE ÎN AFECȚIUNI

ALERGICE ȘI INTOLERANȚE ALIMENTARE.

ALERGOLOGIA MOLECULARĂ.

1
 AGENDA

▪ NOȚIUNI INTRODUCTIVE – ALERGIE, ALERGENI

▪ ROLUL DETERMINĂRII IgE-SPECIFICE

▪ PANELURI DE ALERGENI ȘI ALERGOLOGIA MOLECULARĂ

2
 Alergie şi sensibilizare

ALERGIA = răspuns exagerat al sistemului imun față de substanțe obișnuite ce

sunt în mod normal tolerate de organism conducând la diverse manifestări clinice

ALERGENI = substanțe străine (cel mai adesea proteine) ce pot declanșa reacții
alergice

SENSIBILIZAREA ALERGICĂ = procesul propriu-zis prin care se produce

răspunsul imun față de alergeni – poate să nu genereze manifestări clinice

! Reacțiile adverse non-imunologice la alergeni - de tip toxic, iritativ, sau ca rezultat

al unor defecte enzimatice (ex. intoleranța la lactoză) - nu sunt considerate alergii

3
 Alergiile mediate IgE şi atopia
• Cel mai adesea, sensibilizarea alergică implică sinteza de anticorpi IgE → clinic, alergii
mediate IgE sau alergii de tip imediat (manifestările clinice survin de obicei în decurs de
câteva minute de la expunerea la alergen)

• Manifestările clinice ale alergiei de tip imediat: anafilaxia, rinoconjunctivita/astmul alergic,

dermatita atopică, alergia alimentară, alergia la înţepături de insecte, alergia la latex

• Alergiile de tip imediat sunt adesea legate de atopie = predispoziția personală sau familială
de a produce anticorpi IgE ca răspuns la cantităţi mici de alergeni inhalați sau ingerați, de
obicei proteine, şi de a dezvolta simptome tipice de astm, rinoconjunctivită sau
eczemă/dermatită.

• Atopia – rezultatul interacțiunii factorilor genetici, de mediu (igiena excesivă, evitarea

infecţiilor obişnuite), a unor modificări la nivelul epiteliului cutanat, bronşic sau intestinal,
precum și a unor factori declanșatori (infecţii virale, expunerea la alergeni, fumat, poluare)

4
 MECANISMUL SENSIBILIZĂRII MEDIATE IgE

Faza I (prima expunere la alergen)

- sinteza IgE specifice de către plasmocite
- legarea IgE de celulele țintă: mastocite, bazofile
- nu apar manifestări clinice

Faza II (expunerea la același alergeni)

- legarea alergenului de IgE complementare atașate
anterior pe suprafața mastocitelor și bazofilelor
- activarea celulelor → degranulare → mediatori
(ex. histamina, leucotriene) → manifestări clinice
cutanate, digestive, respiratorii

5
 Teste de laborator pentru alergiile de tip imediat

1. TESTE PENTRU SCREENING-UL ATOPIEI

IgE total (test cantitativ, nespecific!), Phadiatop Infant, Phadiatop (teste calitative)

2. IgE SPECIFICE PENTRU AMESTECURI DE ALERGENI

Ex: Polen graminee amestec, amestec alimente fx5
Rezultat Pozitiv/Negativ sau o valoare numerică care se referă la întregul amestec (nu se obțin
rezultate separate pentru fiecare component al amestecului)

3. IgE ALERGEN-SPECIFICE
Rezultat cantitativ pentru alergenul individual testat (ex. lapte de vacă, grâu, latex)

4. PANELURI DE ALERGENI – rezultate cantitative pentru fiecare component al panelului

5. IgE SPECIFICE PENTRU COMPONENTE ALERGENICE (ALERGOLOGIE

MOLECULARĂ) - rezultate cantitative pentru diverse componente ale unui alergen
6
1. TESTE PENTRU SCREENING-UL ATOPIEI

7
 IgE TOTAL
• Fiziologic, are concentrații ↓ ↓ ↓ în ser (< 0.001% din nivelul total Ig);
patologic, induce activarea mastocitelor și bazofilelor → reacții alergice de tip
imediat

• Niveluri serice IgE ↑: boli atopice în principal, dar și în alte afecțiuni: anumite
imunodeficiențe, parazitoze

• Utilitate demonstrată la: pacienții cu suspiciune de aspergiloză bronhopulmonară

alergică (ABPA), pacienții ce vor primi terapie anti-IgE (omalizumab)

• Utilitate limitată în screening-ul atopiei datorită unei specificități ↓ - factorii

mitogeni din virusuri, bacterii, helminți, cât și factorii adjuvanți din aerul poluat
stimulează producția de IgE fără a iniția o sensibilizare alergen-specifică!
(Portnoy J, WAO, 2015)

• Un rezultat negativ nu exclude atopia!

8
 Testele Phadiatop Infant/Phadiatop

• Utile pentru screening-ul atopiei

• Reactivii utilizați au la bază un amestec echilibrat de alergeni alimentari și/sau

respiratori relevanți pentru atopie (în funcție de vârstă – Phadiatop Infant 0-4 ani,
Phadiatop > 4 ani)

• Teste calitative de primă linie la pacienți cu manifestări nespecifice (ex.

infecții respiratorii repetate cu wheezing) → selectarea copiilor ce vor fi trimiși
la medici specialiști alergologi

• Detectarea atopiei este esențială pentru stabilirea deciziilor de tratament

• Mai sensibile (98%) și mai specifice (89%) decât dozarea IgE total
9
2. IgE SPECIFICE PENTRU AMESTECURI DE
ALERGENI

3. IgE ALERGEN-SPECIFICE

10
 IgE alergen-specifice
ROLURI

• evaluare obiectivă a sensibilizării la un allergen (nu stabilesc dg de alergie!)

• stabililesc încărcarea alergenică
• furnizează informaţii utile pentru management-ul bolii

• teste neinvazive (nu necesită întreruperea medicației, pot fi efectuate la bebeluși,

precum și la copiii cu antecedente de șoc anafilactic sau cu leziuni cutanate extinse)

- este detectată sensibilizarea faţă de un număr mare de alergeni individuali sau în

amestec, nativi sau recombinanţi; au fost alcătuite şi paneluri de alergeni
11
 Metoda de determinare IgE alergen-specifice

METODĂ ImmunoCap Specific IgE

• Metodă “gold-standard” pentru diagnosticul de laborator al alergiei mediate IgE

→ standardizare OMS
• Metodă bazată pe reacția antigen-anticorp cu detecție fluorimetrică
• Faza solidă: matrice spongioasă de celuloză-polimer hidrofilic flexibil inclus într-o
capsulă de care componentele alergenice sunt legate covalent (capacitate  de fixare IgE)
• Test “sandwich” cu anticorpi monoclonali anti-IgE uman
• Rezultatele sunt exprimate în kUA/L
• Domeniu de linearitate: 0.1-100 kUA/L
• Valoarea cut-off pentru rezultatele pozitive: 0.35 kUA/L

12
 Metoda de determinare IgE alergen-specifice

Factori care influențează acuratețea rezultatelor:

• calitatea extractelor de alergeni (să nu conţină alergeni contaminanţi din alte

surse; să nu dea rezultate fals crescute în prezenţa IgE total nespecific 
; să nu dea
reacţii încrucişate cu IgG de aceeaşi specificitate)

• disponibilitatea alergenilor la locul reacţiei in vitro (excesul de alergen este

esenţial pentru a asigura o capacitate de legare eficientă a IgE)

• performanţa sistemului de detecţie

13
Detecția IgE specific prin tehnica Immunoblot

• Alergenii sunt dispuşi pe membrane de nitroceluloză

(stripuri)
• În prezenţa IgE specifice în ser →benzi
• Intensitatea benzilor este evaluată cu ajutorul unui
scanner şi este convertită în clase de la 0 (absenţa reacţiei)
la VI (niveluri crescute IgE specifice)
• Rezultatele sunt semicantitative
• Reproductibilitate redusă
4. PANELURI DE ALERGENI

15
 Panelurile de IgE alergen-specifice
• Evaluarea contribuţiei componentei alergice IgE-mediate la manifestările clinice ale pacienţilor
• ↑ acurateţea identificării statusului atopic
• Influenţează decizia de evita anumiţi alergeni
• Un rezultat pozitiv indică o sensibilizare alergică
• Un rezultat negativ nu exclude posibilitatea unei alergii sau chiar a unei anafilaxii
• Metoda gold-standard: ImmunoCap Specific IgE → rezultate individuale pentru fiecare alergen

PANELURI DE ALERGENI RESPIRATORI

• Componente panel 1: 13 alergeni comuni de “interior” şi “exterior”

• Componente panel 2 (5 alergeni): polen graminee amestec, păr pisică,
păr câine, acarieni (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae)
• Interpretarea rezultatelor obţinute va ţine cont de tipul expunerii,
natura simptomelor şi caracteristicile bolii (sezonieră vs. perenă)
16
 Panel de alergeni alimentari

• Componente: albus de ou, gălbenuş, lapte de vacă, alfa-lactalbumina, beta-

lactoglobulina, cazeina, albumina serică bovină, lapte de capră, soia, grâu, gluten,
orez, arahide, alune, morcov, cartof, peşte

• Util mai ales în practica pediatrică

• Identificarea alergenilor “trigger” la persoane cu simptome sugestive pentru o

alergie alimentară de tip imediat fără un alergen identificabil clinic

• Monitorizarea dispariţiei sensibilizării alergice.

17
 Panel de alergeni alimentari proveniți din legume şi
fructe
• Componente:
PANEL LEGUME: morcov, ceapă, cartof, roșie, țelină
PANEL FRUCTE: căpșuni, kiwi, banană, măr, portocală

• Alergiile la legume și fructe au frecvență ↓ în comparație cu

cele la laptele de vacă, ou, cereale, pește și fructe de mare

• Testele sunt utile pentru investigarea pacienților cu sindromul alergiei

orale – reacție imunologică ce se dezvoltă la unele persoane cu alergie
la polenuri în urma ingestiei de legume și fructe, fiind cauzată de
profiline, proteine similare ce se găsesc atât în polenuri cât și în
legumele și fructele crude.

18
5. IgE SPECIFICE PENTRU COMPONENTE
ALERGENICE (ALERGOLOGIE MOLECULARĂ)

19
 Alergologia moleculară
● Domeniu ce testează reactivitatea IgE față de alergeni proteici individuali sau componente
alergenice obținute prin purificare biochimică sau prin tehnici de recombinare

● Calitatea extractelor de alergeni influențează major testarea! →

discrepanțe între rezultatele de IgE specifice furnizate de
producători de reactivi diferiți

● Crosreactivitatea – reactivitatea IgE față de molecule alergenice

similare (omoloage)

● Determinanții carbohidrat crosreactivi (CCD)

→ glicani produși de plante și insecte caracterizați prin prezența unor epitopi de fucoză și/sau
xiloză
→ determină sensibilizări frecvente la pacienți (23%) însă anti-CCD au relevanță clinică ↓
→ pacienți cu IgE anti-CCD prezintă crosreactivitate față de toate plantele ce conțin epitopi
CCD și determină un nr. ↑ de rezultate (+) la testele IgE bazate pe extracte de alergeni
20
 Familii de proteine şi reactivitatea încrucişată în reacțiile
alergice
• Crosreactivitatea se produce tipic între pneumalergeni și alergeni alimentari proveniți din
fructe, legume și nuci la pacienții sensibilizați la polenuri

• Testarea IgE specifice față de componente alergenice este importantă pentru diferențierea
profilului de sensibilizare „veritabilă” la pacienții cu multiple sensibilizări la polenuri

• Proteinele PR-10 și profilinele – proteine termolabile ce determină de obicei o simptomatologie

ușoară, limitată la nivelul cavității bucale
• Proteinele de stocare și proteinele nespecifice de transfer al lipidelor (nsLTP) – proteine
termostabile ce pot induce reacții alergice moderate – severe, posibil sistemice, în urma ingestiei

Exemplu: alergia la alune de pădure (Corylus avellana)

Cor a 1 (PR-10) – reacționează încrucișat cu Bet-v1 din polenul de Betulla (mesteacăn)
Cor a 8 (LTS) – component responsabil de reacții alergice severe sistemice – reacție „veritabilă”

21
Familii de proteine şi reactivitatea încrucişată în reacțiile
alergice
● Parvalbumina - proteină termostabilă, rezistentă la digestie; alergen major din pește,
responsabil de reacțiile încrucișate dintre diferite specii de pește și amfibieni; induce adesea
reacții sistemice (și față de alimentele procesate)

● Tropomiozina - clasă de proteine înalt conservate, termostabile, rezistente la digestie;

responsabile de reacțiile încrucișate dintre crustacee, acarieni și gândaci; induce adesea
reacții sistemice (și față de alimentele procesate)

● Albumine serice - proteine prezente în diferite fluide biologice și componente solide

provenite de la animale (lapte de vacă și carne de vacă; ouă și carne de pasăre);
responsabile de crosreactivitatea dintre albuminele provenite de la diverse specii de
animale (de exemplu, reacții la ingestia de carne de porc la persoane sensibilizate la
epiderme de pisică)
23
Componentele alergenice şi severitatea reacțiilor alergice
la alimente
● Severitatea reacțiilor la un aliment depinde de componentele alergenice față de care este
sensibilizat pacientul

● Sensibilizarea la arahide – evaluarea riscului de reacții sistemice

PROTEINELE DIN ARAHIDE (COMPONENTE ALERGENICE)
Ara h 1 - proteină de stocare
Ara h 2 - proteină de stocare
Ara h 3 - proteină de stocare
Ara h 8 - PR-10
Ara h 9 - nsLTP

Ara h 1-3 = proteine alergenice majore (McDermott et al. Clin. Exp. Allergy 2007)
IgE specifice față de Ara h 2 - cel mai important factor predictiv pentru alergia „veritabilă”la arahide
(Nicolaou et al. JACI 2010)
IgE specifice față de Ara h 9 - risc variabil de reacții sistemice
IgE specifice față de Ara h 8 - simptome ușoare, locale, asociate cu sensibilizarea față de polenul de
mesteacăn 24
 Componentele alergenice şi persistența alergiei la ou
● Alergia la proteinele din ou – una din cele mai frecvente alergii înregistrate la copilul
mic

PROTEINELE MAJORE DIN OU (COMPONENTE ALERGENICE)

Gal d 1 - ovomucoid (termostabil și rezistent la proteaze)
Gal d 2 - ovalabumină
Gal d 3 - conalbumină
Gal d 4 - lizozim

● IgE specifice față de ovomucoid se asociază cu persistența alergei la ou

● IgE specifice față de albușul de ou (+) tolerabilitate față de mâncăruri

IgE specifice față de ovomucoid (-) gătite cu ou

25
 Alergia la proteinele din laptele de vacă
• Reacție imunologică la una sau mai multe proteine din laptele de vacă

• Debutează de obicei în primele săptămâni de la introducerea laptelui de vacă (incidență

maximă la vârsta de 3 luni)

• Prevalență 2-3% în primul an de viață; dispare în 85% din cazuri până la vârsta de 3 ani

• Proteinele din laptele de vacă: 3-3.5 g/100 g lapte

→ peste 20 fracțiuni proteice pot prezenta grade variabile de antigenicitate
→ principalele clase de proteine ce induc alergie (Cortez et al. 2007):

BETA-LACTOGLOBULINA - 66-82% (frecvența sensibilizării)

CAZEINA - 43-60%
ALFA-LACTALBUMINA - 41-53%
GAMA-GLOBULINA BOVINĂ - 27%
ALBUMINA SERICĂ BOVINĂ - 18% 26
 ALLERGY EXPLORER (ALEX)
● Profil extins de IgE specifice față de 282 alergeni - 152 extracte de alergeni „integrali” +
125 componente moleculare

● Acoperă marea majoritate a alergenilor inhalatori, alimentari, latex și veninuri de

Hymenoptere

● Tehnologie „macroarray”
ELISA multiplex

● Rezultate cantitative IgE

alergen-specifice în domeniul:
0.3–50 kUA/L cu evidențierea
clasei de sensibilizare

27
 Indicațiile şi avantajele testului ALEX

• Permite caracterizarea sensibilizării IgE: reacție alergică „veritabilă” vs crosreactivitate

• Indică riscul de reacții alergice severe la alimente

• Furnizează informații privind indicarea unei imunoterapii specifice, în special pentru alergiile
respiratorii și cele provocate de veninurile de insecte

• Specificitate ↑↑ prin utilizarea de inhibitori CCD

• Validare clinică: corelație bună cu testul ImmunoCAP ISAC (Heffler E et al, WAO J. 2018)

BENEFICIU MAXIM:
- pacienți polisensibilizați
- pacienți cu sindromul alergiei orale

28
Algoritmul de diagnosticare începe în mod tradițional cu istoricul („de sus în jos”),
urmat de testele cutanate, apoi teste IgE allergen-specific la care se adaugă teste
moleculare pentru „diagnosticul rezolvat pe componente” (CRD)
Algoritmul nou inversează ordinea testelor („de jos în sus”) și începe cu un test IgE
multiplex (adică bazat pe microarray) și multe componente. Apoi, istoricul este revizuit
pentru concordanță.
 IgE ALERGEN-SPECIFICE ȘI ALERGIILE ALIMENTARE

• Solicitarea determinării IgE specifice trebuie efectuată într-un context clinic sugestiv pentru o alergie
mediată IgE și nu pentru o alergie non-IgE mediată sau o intoleranță alimentară (mecanism non-imun,
cauză metabolică):

Non-IgE
Debut clinic în decurs de ore sau zile de la
IgE
ingestie
Debut clinic în decurs de 2 ore de la ingestie
Rezoluție simptome după > 12 ore sau câteva
Rezoluție simptome în decurs de 12 ore
zile
Vărsături, diaree, dureri abdominale
Diaree, colici abdominale, scaune cu sânge,
Simptome de anafilaxie
refuz alimentar (simptome limitate de obicei la
tractul digestiv)
33
Sampson HA et al. J Allergy Clin Immunol 2014
 REACȚIILE ADVERSE LA PROTEINELE DIN
LAPTELE DE VACĂ
■ ALERGIA LA LAPTELE DE VACĂ - mecanisme imune
→ mediate prin anticorpi IgE - reacții de tip imediat, cu debut acut, manifestări digestive,
cutanate, respiratorii, uneori anafilaxie potențial amenințătoare de viață
→ non-IgE mediate – reacții tardive, cronice, mediate celular sau mixt, manifestări
limitate de obicei la nivelul tractului digestiv

■ REACȚII NON-IMUNE – INTOLERANȚA LA LACTOZĂ

→ deficit parțial/total de lactază persistent (intoleranță primară) sau tranzitoriu
(intoleranță secundară)

Probleme: - confuzii de diagnostic între cele 2 entități, mai ales când predomină
manifestările digestive
- management diferit: excluderea proteinelor din lapte (alergie) sau a
alimentelor ce conțin lactoză (intoleranță)
Bahna SL. Ann Allergy Asthma Immunol 2002
34
 ALERGIILE NON-IgE MEDIATE
- Dau reacții întârziate cu debut al simptomelor până la 48 h de la ingestie (uneori chiar după 1
săptămână!)

TIPURI DE AFECȚIUNI:
● esofagita eozinofilică
● reflux gastro-esofagian indus de proteinele din lapte de vacă
● gastroenterita eozinofilică
● enteropatia indusă de proteinele din laptele de vacă: diaree severă, vărsături, letargie, deshidratare
● gastroenterocolita eozinofilică
● proctocolita indusă de proteinele din laptele de vacă

DIAGNOSTIC:
- clinic – proba de eliminare a proteinelor din laptele de vacă – rezoluția simptomelor
- IgE specifice negative; nu prezintă utilitate testarea de IgG alergen-specifice
- endocopie, biopsie
Koletzko S et al. JPGN 2012
35
VĂ MULȚUMESC PENTRU ATENȚIE!
36