Curs xv.

Genus Staphylococcus

1. Minidefinitie
II. Incadrare taxonomica
III. Habitat
IV. Implicare in patologia umana
V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in
patogeneza si
diagnosticul microbiologie
VI. Factori de patogenitate
VII. Patogenie
VIII. Raspunsul imun
IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale
X. Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: coci gram pozitivi, dispoziţie În ciorchine, halofili,

catalază
pozitivi, fermentează glucoza fără producere de gaz;
S. aureus: coagulază pozitiv, proteină A pozitiv, DNA-ză termostabilă
pozitiv,
leziuni purulente, toxinoze, toxiinfecţii;
Stafilococi coagulază negativi (SCN): kit-uri (galerii multitest), infecţii
de corp
străin, infecţii urinare
Infecţii nosocomiale, rezistenţa la meticilină (oxacilină)

1. Minidefinitie

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi condiţionat patogeni, cu

dispoziţie
caracteristică "în ciorchine", care pot fi implicaţi în infecţii invazive purulente
şi/sau de
tip toxinoze/toxiinfecţii, uşoare sau de gravitate medie până la severă,
ameninţătoare de
viaţă

II. Încadrare taxonomică şi clasificare

Manual Bergey 2004:

Domeniu: Bacteria
Phylum: B XIII, Firmicutes
Clasa: III, Bacilli
Ordin: Bacillales
Familie: VIII Staphylococacceae
Genul Staphylococcus - este compus până în prezent din 40 de specii, dintre care 20
au
putut fi izolate de la om.

Stafilococii sunt apropiaţi filogenetic de streptococi, enterococi,

lactobacili ŞI Genul
Bacillus.
III. Habitat

Stafilococii fac parte dintre bacteriile ubiquitare (prezente peste tot În

mediul
Înconjurător).
Colonizează vestibulul nazal şi mucoasele organelor cavitare cu comunicare
la
exterior (colon, vagin) şi contaminează frecvent tegumentul, preferând
zonele cu
umiditate ridicată (axile, perineu, plici interdigitale etc.)

IV. Implicare în patologia umană:

Staphylococcus aureus poate fi implicat în infecţii invazive cu caracter

purulent,
În toxinoze (afecţiuni cauzate de toxine bacteriene) şi toxiinfecţii (afecţiuni
mixte de tip
invaziv şi toxic).
Infecţii invazive:
• Infecţii superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor (inclusiv
anexele pielii - foliculită, furuncul, carbuncul, panariţiu,
hidrosadenită etc.)
Abcese profunde
• Osteomielite
• Infecţii ale organelor interne
Infecţii generalizate, sistemice etc.
Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:
• Toxinoze şi/sau toxiinfecţii alimentare
• Necroliza toxică epidermică
• Sindromul de şoc toxic
• Enterocolita postantibiotice

Stafilococii coagulază negativi (SCN) fac parte din microflora tegumentară

normală, exercitând în condiţii normale un rol protector (vezi curs VII).
Nu dispun de factori de patogenitate suficienţi pentru a putea depaşi
bariera
cutanată intactă, dar pot pătrunde în organism ca urmare a unor intervenţii
invazive
constând în introducerea de catetere, implante, proteze vasculare etc. De
obicei,
colonizează mai întâi cateterele sau dispozitivele protetice, de unde ulterior pot
disemina
şi cauza infecţii generalizate şi/sau determinări infecţioase la nivelul
endocardului,
seroaselor etc. Speciile de stafilococi coagulază-negativi cel mai frecvent
implicate În
astfel de infecţii sunt: S. epidermidis, S. capitis, S. lugdunensis, S.
haemolyticus, S.
warneri etc.
O categorie aparte de infecţii cauzate de stafilococii coagulază-
negativi sunt
infecţiile urinare cu S. saprophyticus

2
-----------------------------------------------------------------------------------
------~--------------~

Fig. 1 - Principalele localizări

ale manifestărilor infecţioase şi/sau toxice
determinate de stafilococi

,_+ ~sinusltis
bons, carbun.:::Ies---"""\.

fur uneI es ------,~, ,.,--

""iI_---+---hlcmatogilnolis spread

endocar d! ti s

emilsjs-----+----+1r---=-~"
""'* 1mpetlgo

~H--+--- diarr hea

toxicshock syndrome

s catded ski FI syndrom

ost eomyet itls --------'-~

_---t----uticystitl s

Aspecte clinice particulare în infecţiile,

toxinozele şi/sau toxiinfecţiile cauzate de
stafilococi şi toxinele stafilococice

Afecţiuni cauzate de Staphylococcus aureus

Infecţii purulente localizate sau generalizate:

• .Impetigo: infecţie superficială la nivelul feţei şi
membrelor, care afectează mai
ales copilul mic. Se manifestă prin apariţia de
macule, vezicule, pustule, cruste pe
fond eritematos. În 20% din cazuri este
posibilă asocierea S.aureus cu
streptococul de grup A.
• Foliculită: infecţie piogenă la nivelul foliculului
pilos
• Orgelet - infecţie piogenă afectând un folicul pilos
la nivelul pleoapelor
(denumire populară ulcior sau urcior)
• Furuncul: extinderea infecţiei foliculului pilos
la glandele sebacee, colecţie
apreciabilă de puroi, Însoţită de ţesuturi
necrozate, durere
Carbuncul (Fig. 2): rezultat al extinderii
infecţiei la mai multe glande
pilosebacee şi la nivelul ţesuturilor
subcutanate profunde, cu necroză la
nivelul tegumentelor şi ţesurilor subiacente.
Denumirea de "carbuncul" sau
"furuncul antracoid" provine de la culoarea neagră
a ţesuturilor necrozate, care se
aseamană cu cea a leziunilor produse de Bacillus
anthracis la nivel cutanat,
antraxul cutanat, cunoscut sub denumirea populară
de "cărbune", .xlalac" sau
"bubă neagră". În cazul S. aureus, necroăa cutanată
se datorează producerii de
leucocidină Panton Valentine sau "toxina
dermonecrotică". Pacienţii cu infecţii

3
 cauzate de tulpini producătoare de toxină dermonecrotică prezintă risc de
infecţii
pulmonare necrotizante, mai ales în cazul în care dezvoltă în paralel infecţii
virale
respiratorii (mai ales cu virus gripal).

Fig. 2 - Carbuncul

• Hidrosadenita: infecţie a glandelor sudoripare cu localizare la nivel axilar,

perineal, sau În zonele genitale
Celulita: infecţie a hipodermului, cu tendiţă la extindere prin contiguitate
(din aproape În aproape, ca o pată de ulei), care apare în special la pacienţi
cu
deficienţe imunitare sau la care se asociază un factor traumatic local.
Celulita care evoluează la nivelul feţei (Fig. 3), mai ales cu localizare
deasupra
buzei superioare, constituie o urgenţă medicală, ca urmare a faptului ca se poate
extinde la nivelul sinusurilor cavemoase. Se evită orice traumatism
local şi se
instituie rapid tratamentul cu antibiotice de elecţie (oxacilina, cu efectuarea
recoltării
şi antibiogramei înainte de începerea tratamentului, pentru a depista
eventualele
tulpini rezistente la meticilină şi a schimba antibioticul În caz de rezistenţă la
meticilină).

Fig. 3 - Celulita cu localizare la nivelul feţei

• Mastita: infecţie a glandei mamare; apare la 1-3% din femeile care alăptează şi
se manifestă ca un nodul eritematos, cu formarea unui abces canalicular

4
 Infecţii ale plăgilor: pot apare post traumatic sau post chirurgical; se
manifestă
prin edem şi eritem local, durere şi acumulare de puroi
• Bacteriemia şi endocardita: sunt dobândite în proporţie de cel puţin 50% în
mediul spitalicesc, după proceduri chirurgicale, utilizare de catetere
intravenoase
care devin contaminate etc.; se asociază frecvent cu diseminare septică
secundară,
de obicei la nivelul endocardului şi apariţia endocarditelor acute, infecţii
severe,
cu o mortalitate de aproximativ 50%.
• Pneumonia şi empiemul pulmonar sunt întâlnite mai ales la vârstele extreme
• Osteomielita şi artrita septică: rezultat al diseminării septice secundare unor
infecţii stafilococice cu alte localizări, sau postraumatic; localizarea este
diferită
la copii, unde afectează mai ales metafizele oaselor lungi şi la adulţi, unde
localizarea este mai frecventă la nivel vertebral
• Artrite septice după infiltraţii intra -articulare

Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:

• Toxinozele şi/sau toxiinfecţiile alimentare cu S. aureus apar după consumul de

alimente contaminate cu stafilococi producători de enterotoxine
stafilococice
(carne de porc În saramură, şuncă, salate de cartofi, Îngheţate) sau/şi numai
după
ingerarea unui aliment prelucrat termic, în care au rămas numai enterotoxinele
stafilococice, care sunt termorezistente; acest tip de
toxinoze/toxiinfecţii apar mai
frecvent în sezonul cald (iulie-august), ca rezultat al contaminării
produsului
alimentar de către purtători şi/sau indivizi cu infecţii purulente. Alimentul
contaminat nu are aspectul sau gustul alterat. Incubaţia este de 1-8 ore,
debutul
este brusc, evoluţia rapidă, 12-24 de ore, caracterizată prin: diaree apoasă,
greţuri,
vărsături, dureri abdominale, cefalee. Este un toxinoză/toxiinfecţie
spontan
autolimitată, care dispare odată cu eliminarea toxinei. Cazurile sunt de obicei
uşoare sau cel mult de gravitate mediu, dar pot apărea şi cazuri grave, la
pacienţi
aflaţi la vârste extreme (sugari, persoane de vârsta a treia), care prezintă
instabilitate hemodinamică şi hidroelectrolitică
• Dermatita exfoliativă (sindromul pielii opărite stafilococice, maladia Ritter
sau
impetigo bulos stafilococic) - este o toxiinfecţie care apare de obicei la nou-
născut şi se manifestă cu eritem perioral, care în decurs de 2 zile cuprinde
întreg
corpul. Se formează vezicule cu lichid clar, fără microorganisme şi leucocite,
ca
urmare a clivajului straturi lor intraepidermice. Are loc descuamarea
epiteliului,
iar refacere epiteliului are loc în 7-10 zile, când apar anticorpii protectori
• Sindromul de şoc toxic stafilococic a fost descris ca urmare a unor evenimente
care au avut loc în 1978 şi a fost atribuit eliberării unei toxine care a
primit
denumirea de Toxina Sindromului de Şoc Toxic - 1 (TSST-l). Se manifestă prin
febră, hipotensiune, eritem scarlatiniform. Evoluţia poate fi fatală sau se
termină
 cu descuamarea epitelului şi vindecare. TSST-l stimulează macrofagele, care vor
elibera cantităţi mari de mediatori chimiei, cauză a sindromului şocului toxic.
Este superantigen, adica determină activarea limfocitară
policlonală (nu
monoc1onaIă, aăa cum fac antigenel obişnuite)
Episodul din 1978 a apărut la femei tinere, care au utilizat tampoane
intravaginale. Toxina se absoarbe şi stimulează macrofagele
care secretă

5
 interleukină-I, prostaglandine şi TNF-a (vezi cursuri imunologie). Aceste
citokine
sunt reponsabile de manifestările clinice.
• În cazul infecţiilor nosocomiale (apărute în unităţi de îngrijire), dar mai
recent şi
în cazul infecţiilor care evoluează În afara unităţilor de
Îngrijire (infecţii
comunitare), sunt de temut infecţiile cu S.aureus rezistent
la meticilină
(SAMRJengl. MRSA). Transmiterea se face mai ales prin contact
direct, prin
intermediul purtătorilor sănătoşi de germeni (portaj nazal, prin mâini
contaminate,
etc). Localizările pot fi: cutanată, respiratorie, renală, digestivă,
osoasă, articulară,
generalizată etc.

Stafilococii coagulaza-negativi (SCN)

Endocardita - se poate instala pe valvele cardiace lezate prin

malformaţii
cardiace, reumatism articular acut etc., dar mai ales pe valve
artificiale.
Stafilococul coagulază negativ este introdus în organism în timpul
tehnicilor de
chirurgie cardiovasculară. Debutul este lent, la aproximativ
1 an de la
intervenţia chirurgicală, la nivelul suturii valvei de ţesutul
cardiac; se
însoţeşte de formarea de abcese cardiace şi separarea valvelor la nivelul
liniilor de
sutură, cu tulburări de dinamică cardiacă. Prognosticul este rezervat.
Infecţii ale materialelor de implant: în funcţie de unitatea de
îngrijire, o cincime
până la peste 50% din infecţiile secundare implanturilor de dispozitive,
catetere,
şunturi, tuburi de dren sunt cauzate de SCN, mai frecvent S. schleiferi şi
S.lugdunensis). Capsula polizaharidică a SCN asigură ataşarea la
nivelul
dispozitivelor protetice, protejându-i astfel de acţiunea antibioticelor
şi a celulelor
fagocitare
Infecţii ale tractului urinar sunt mai frecvent diagnosticate la femeile
de vârstă
fertilă. Infecţia urinară cu S. saprophyticus se poate instala ca urmare a
colonizării
pe cale ascendentă, de la nivelul intestinului sau al tractului genital,
putând
recunoaşte deci şi un mecanism de transmitere pe cale sexuală.
Alte infecţii: abcese cerebrale, meningite, infecţii vasculare,
peritonite, septicemii
etc. Majoritatea au caracter nosocomial şi pot fi produse de speciile de
SCN mai
sus menţionate.

v. Microbiologie - principalele caractere cu implicaţii În patogeneza

şi
 diagnosticul microbiologic

Stafilococii se definesc prin caracterelele lor morfotinctoriale, de

cultivabil itate,
metabolice şi enzimatice, rezistenţa la agenţii fizici, chimiei şi biologici.

Caractere morfotinctoriale:
Forma: coci rotunzi, dimensiuni: 0,5 - I urn
• Tinctorialitate: gram pozitivi
• Dispozitie: caracteristica, grupaţi în grămezi de forma ciorchinelui de
strugure
(staphile, gr. = strugure); în prelevate pot exista extra, dar şi
intracelular

6
 Sunt nesporulaţi, pot prezenta capsulă, mai ales În cazul tulpinilor
foarte virulente,
recent izolate din Iezi uni purulente şi/sau infecţii sistemice

Caractere de cultivabilitate: sunt nepretentioşi nutritiv, cresc pe

medii nutritive
simple.
Adaosul de sânge În mediile nutritive simple se realizează mai mult În
scop
diferenţial, pentru a facilita diagnosticul de specie, ştiut fiind că tulpinile de
S. aureus
sunt mai frecvent producătoare de hemolizine.
Pot supravieţui şi se pot multiplica În medii cu concentraţii ridicate de
NaCI,
proprietate denumită halotoleranţă. Această proprietate este utilizată pentru
prepararea
mediilor selective cu ajutorul cărora se realizează separarea stafilococilor din
amestecuri
cu alte bacterii nehalotolerante (ex. majoritatea bacteriilor enterice din
materiile fecale,
alte prelevate contaminate etc.)

Tip metabolic: stafilococii au un metabolism HETEROTROF, putând

creşte numai În
prezenţa substanţelor organice), facultativ anaerob. Fermentează glucoza fără
producere
de gaz. S. aureus fermentează manita şi în anaerobioză, spre deosebire de SCN,
dintre
care unele specii nu utilizează manita, ira altele o utilizează doar în aerobioză.
Sunt catalază pozitivi, oxidază negativi

Rezistenta la agenti fizici, chimiei si biologiei

Stafilococii sunt relativ rezistenţi la agenţi fizici, cum sunt frigul,

uscăciunea,
variaţii de pH.
Sunt sensibili la dezinfectante din grupa derivaţilor halogenaţi (ex.
povidon-
iodine, cloramină) şi la derivaţi de amoniu cuaternar.
Natural sensibili la majoritatea antibioticelor, cu excepţia
polimixinelor (colistin)
quinolonelor de generaţia Întâi (acid nalidixic), la care prezintă rezistenţă
naturală. În
ultimele decenii, mai ales În spitale s-au selectat clone rezistente la meticilină,
atât de S.
aureus, cît şi de SCN. În România, tulpini le de S. aureus rezistente la Meticilină
sunt
frecvent rezistente şi la alte antibiotice (polirezistenţă la antibiotice).
Unele tulpini sunt sensibile la bacteriofagi, ceea ce permite
tipizarea
bacteriofagică (lizotipia), de mai mică valoare În cazul tulpinilor rezistente,
care sunt
frecvent netipabile prin lizotipie sau sunt sensibile la majoritatea
bacteriofagilor din setul
internaţional, ceea ce nu permite Încadrarea lor În grupe fagice distincte,
pentru
d iferenţi ere. .

VI. Factori de patogenitate (Fig. 4)

 • S. aureus:
Factori structurali (endocelulari):
(1) proteine şi/sau mucopolizaharide de suprafaţă - promovează
colonizarea tesuturilor gazdei (ex. acidul teichoic, care se
ataşează la
fibronectină; coagulaza legată care se ataşează la fibrinogen
etc.) şi/sau
inhibă fagocitoza şi accesul antibioticelor (capsula)

7
 (2) pigmenţi carotenoizi localizaţi la nivelul peretelui cellular-
supravieţuirea în fagocite - S aureus, pigment galben cu moleculă
polinesaturată - reduce radicalii toxici de oxigen

Factori solubili (exocelulari):

(3) producere de catalază - supravieţuire în fagocite prin

reducerea
radicalilor toxici de oxigen (ex. apa oxigenată);
(4) producere de coagulază - se îmbracă într-un strat de fibrină care
îl
apără la nivel circulator de atacul fagocitelor şi antibioticelor; când
ajunge
în ţesuturi, fibrinolizina descompune fibrina şi eliberează
stafilococul,
pentru a-şi putea relua multiplicarea
(5) invazine - promovează pătrunderea bacteriilor în ţesuturi:
leucocidina
(citolitică), hialuronidaze (promovează invazia bacteriană prin
hidroliza matricei conjunctive tisulare); lipase - tropism spre glanda
sebacee şi pentru ţesuturile grăsoase etc.
(6) toxine cu activitate citolitică (Ieziuni ale membranei celulare
eucariote)
- hemolizine ( a - hemoliză clară, J3- hemoliză incompletă de tip cald-
rece, 0, y ), leucotoxine, leucocidine - inclusiv leucocidina Panton
Valentine;
(7) exotoxine care lezeaza tesuturile gazdei sau provoaca simptome de
boala (enterotoxine stafilococice A-G, TSST-l, epidermolizina sau
toxina
epidermolitică etc.)
(8) Se consideră, de asemenea că rezistenţa la antibiotioce intrinsecă sau
dobandită constituie un factor de patogenitate suplimentar.

Fig. 4 - Factori de patogenitate la S. aureus

y;.. IgG

ml cro- P,""'~~,
capsute , . ')., .

cellwal~'

InVi!lsi ns:
hya! ur ont das e
staphylysl n
,1eukocl di n
,leukoto:1d n
<coagul ase
staphyl old nase

8
VII. Patogenie

Manifestarea infecţiilor stafilococice invazive şi/sau a

toxinozelor/toxiinfecţiilor
( stafilococice presupune derularea mai multor etape:
a. Colonizarea tegumentelor şi mucoaselor, prin acţiunea
proteinelor şi
polizaharidelor cu rol de adezine. Bacteriile care posedă capsulă
şi/sau alte
structuri mucopolizaharidice de suprafaţă pot contribui la
realizarea biofilmelor,
structuri matriceale în interiorul cărora bacteriile se pot integra,
evitând şi în acest
fel acţiunea factorilor imunitari celulari şi/sau umorali, precum şi
a antibioticelor
b. Invazia şi procesul infecţios - proces în care intervin invazinele
(hialuronidaza,
leucocidine, leucotoxine, coagulaza, stafilokinaza, lipazele etc.)
este
caracteristică afecţiunilor stafilococice de tip invaziv
c. Acţiunea toxinelor - se manifestă specific pentru fiecare dintre
toxinele
enumerate:
- acţiune citotoxică pentru hemolizine, leucocidina Panton Valentine;
- activitate de serin-proteaze în cazul toxinelor exfoliative, cu
acţiune asupra
desmozomilor care constituie structurile de legătură la nivel intercelular;
- infiltrat leucocitar la nivelul stomacului şi jejunului şi
stimularea mediatorilor
chim ici de la nivelul mastocitelor, cu reacţie inflamatorie şi senzaţie de
greaţă în
cazul enterotoxinelor;
- activarea limfocitară policlonală specifică pentru toate
toxinele care au
caracterul de "superantigene": enterotoxine, toxina exfoliativă
- stimularea eliberării de citokine, având ca rezultat creşterea
permeabilităţii
vasculare sau efect citolitic, la concentraţii înalte, precum şi efecte
sistemice mergând
pânaă la şoc toxic, în cazul TSST-l

VIII. Raspunsul imun

• Principalul mecanism: fagocitoza

• Anticorpi neutralizanti antitoxici
Opsonizare anticorp dependenta

Mecanismele de evitare a raspunsului imun:

- Aderenţa de epiteliul mucoasei prin existenţa interrelaţiei
receptori - adezine
(acizi teichoici, alte adezine) inpiedică mecanismele de curăţire a
mucoaselor
- Capsula, microcapsula, proteina A interferă cu fagocitoza
- Biofilmul de la suprafata materialelor străine introduse în organism
jenează
fagocitoza
- Carotenoizii, catalaza constituie mecanismele de rezistenţă
intrafagocitară: prin
neutralizarea speciilor reactive de oxigen, care constituie mecanismele
primare de
bactericidie intrafagocitara la nivelul fagolizozomului
- Leucocidinele, hemolizinele etc. reduc eficienţa răspunsului
antifagocitar

9
 r

IX. Elemente de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Stafilococii sunt microorganisme ubiquitare. SCN nu lipsesc de

la nivlul
tegumentelor, iar Saureus colonizează cel puţin tranzitoriu zonele
tegumentare sau
mucoase umede.
Atât Saureus cât şi SCN pot fi izolaţi din orofaringe, tract gastro-
intestinal,
urogenital.
Colonizarea nou-născutului cu Saureus începe la nivelul bontului
ombilical,
suprafeţelor tegumentare, ariei perineale.
Din totalul indivizilor, se consideră că 15 - 25% din adulţii sănătoşi
sunt purtători
nazofaringieni persistenţi, 50% purtători intermitenţi şi un procent de
15 - 25% nu
vor fi niciodată purtători, în relaţie cu particularităţile
receptorilor celulari care
constituie marca proprie a fiecărui individ. Portajul de scurtă durata este
frecvent
nazofaringian. La pacienţii îndelung spitalizaţi, personal medical etc.,
portajul poate
ajunge la 40-70, până la 90%. Portajul este tegumentar sau nazofaringian şi
poate fi
responsabil pentru apariţia infecţiilor nosocomiale.
Stafilococii pot fi implicaţi Însă şi în etiologia infecţiilor
extraspitaliceşti
(comunitare). Se consideră că tulpinile cu tropism pulmonar
şi capacitate
dermonecrotică, producătoare de leucocidină Panton Valentineîţi au
oroginea în
comunitate, dar pot fi introduse şi îăn spital, unde se propagă după
mecanismele
infecţiilor nosocomiale.
Posibilitati de profilaxie si/sau tratament:
Vaccin experimental bivalent anti S aureus - conferă imunitate
de aprox.
40 zile pacienţilor hemodializati - compus din polizaharide
capsulare de
S aureus tip 5 si 8
Ser hiperimun - nu se mai utilizează
Incercări de antagonizare a factorilor de colonizare

X. Diagnosticul de laborator

Recoltarea şi transportul probelor

În diagnosticul infecţii lor/toxiinfecţii lor putem fi confruntaţi cu

orice tip de probă:
secreţie purulentă, LCR, saâge, exsudat nasofaringian, biopsie din leziuni
cutanate, lichid
articular, secreţie conjunctivală, spută etc.
Pentru recoltare se ţine seama de precauţiile generale, dintre care cele
mai
importante sunt: recoltarea înaintea începerii terapiei cu antibiotice, respectarea
regulilor
de antisepsie, reprezentativitatea probei etc.
Transportul trebuie realizat cât mai rapid sau cu asigurarea mediului de
tranport,
în cazurile în care se anticipează prelungirea timpului de transport. Transportul
la distanţă
trebuie Tacut cu respectarea regulilor internaţionale, respectiv
împacheterea triplă:
recipient primar, recipient secundar din material incasabil şi nedeformabil
şi înveliş
terţi ar, din carton, marcat cu simbolul caracteristic pentru "pericol biologic".

10
 Examenul direct

Examenul macroscopic ajută la selectarea porţiunilor reprezentative,

purulente,
sanguinolente etc. Aspectul caracteristic este acela de secreţie sau lichid
purulent, cu
tentă galbenă.
Examenul bacterioscopic se face după colorare cu coloratia adecvată
scopului
urmărit: Gram pentru bacterii, albastru metilen sau May-Grunwald-Giemsa
pentru
observarea celulelor inflamatorii, a relaţiei lor cu bacterii le, respectiv
detaliilor de
tinctorialitate celulară.
Citologia cantitativă (numărătoarea celulelor) şi calitativă furnizează
informaţii
privind reacţia inflamatorie şi fagocitară, relaţia bacteriilor cu celulele
fagocitare etc

Izolarea

Pentru izolarea stafilococilor din produse normal sterile (sânge, LCR

etc.) se
utilizează medii nutritive simple, însămânţate şi incubate timp de 24-48 h, la 36 ±
lOC;
adaosul de sânge înlesneşte observarea caracterelor hemolitice.
În cazul prelevatelor cu floră mixtă )materii fecale, alimente contaminte
etc.) se
utilizează medii selective, ca de exemplu agarul hiperclorurat tip Chapman

Identificarea se realizează în scopul managementului cazului

clinic individual,
dar şi în scop epidemiologic, pentru confirmarea cazului şi furnizarea de
informaţii
microbiologice cu valoare epidemiologică.
Pentru confirmarea cazului este necesară identificare până la
nivel de gen şi
specie, prin: aspectul microscopic, caracterele de cultură (vezi descriere
anterioară),
caractere biochimice şi enzimatice.
Diagnosticul de gen în cazul cocilor Gram pozitivi facultativ anaerobi
constă în
diferenţierea între Staphylococcus şi Streptococcus pe baza capacităţii de
producere a
catalazei (Staphylococcus este pozitiv).
Diagnosticul diferenţial de specie constă în :
- diferenţierea Între S. aureus de SCN cu ajutorul testelor pentru:
coagulază,
termonuclează, eventual evideţiera prezenţei proteinei A şi/sau a unor
polizaharide
capsulare specifice (reactivi de diagnostic rapid)
- diferenţierea speciilor de SCN Între ele - În cazul secţiilor de
chirurgie cardio-
vasculară sau În care se fac protezări etc.; sau în infecţii urinare. Se poate face
cu ajutorul
kit-urilor sau galeriilor multitest
În scop epidemiologic poate fi necesară evidenţierea
unor markeri
microbiologiei care să diferenţieze tulpinile din aceeasţi speeie,
pentru a putea
evidenţia sursa şi calea de transmitere.
Diferenţierea intraspecifica: se face prin metode de tipizare cu
sunt: tipizara
bacteriofagică (Iizotipie), tipizare moleculară

La examenul microscopic se evidenţiază coci gram pozitivi, cu diametrul de

0,5-
1,5 um , dispuşi în grămezi, imobili, nesporulati, de regulă necapsulaţi. În
prelevate,
stafilococii pot fi evidenţiaţi şi izolaţi sau în grupuri de mici dimensiuni, cu
defecte de
colorabilitate, mai ales în produse provenite de la pacienţi deja trataţi cu
antibiotice.

II
Fig. 5. Frotiu colorat C4 albastru de metilen din cultură pură coci dispuşi în
grămezi

,
~@

'1."
,.
'1Si

Fig. 6. Imagine obţinută prin microscopie electronică de baleiaj - coci în

ciorchine de
struguri

Caractere de cultivare: se dezvoltă atât în aerobioză, cât ŞI In

anaerobioză
(facultativ anaerobi), sunt mezofili (se dezvoltă între 10-42°C, cu dezvoltare
optimă la
37°C). Cresc pe medii uzuale (agar nutritiv cu sau fără adaos de sânge) şi/sau pe
medii
selective hiperclorurate de tip Chapman. Formează colonii rotunde, convexe,
frecvent
pigmentate galben auriu la S. aureus, care produc frecvent o hemoliză completă sau
incompleta pe geloză sânge (Fig. 7, 7 bis). Stafilococii sunt capabili să crească
pe medii
suplimentate cu 10% NaCI. Pe acest mediu, S. aureus utilizează manita (virarea
culorii
roz a mediului la galben), în timp ce numai unii SCN utilizează manita (Fig. 8).

12
Fig. 7. S. aureus Ca) şi S. epidermidis - aspectul coloniilor pe agar nutritiv
simplu cu
adaos de sânge

a. b.

Fig. 7 bis - S. aureus: culturi pe agar nutritiv simplu cu adaos de sânge şi frotiu
colorat
Gram

13
--------------------------------------------------------------,

Fig. 8 - Mediu selectiv si diferential hiperclorurat cu manitol-

izolare din produse
contaminate cu germeni Gram negativi. S. aureus apare sub forma
coloniilor de culoare
galbenă şi îngălbeneşte mediul

Testul catalazei, utilizat pentru diferenţierea

stafilococilor de streptococi se
efectuează punând în contact o cultura pe mediu fără sânge cu apă
oxigenată 3%. Reacţia
pozitivă constă în apariţia efervescenţei, prin eliberarea oxigenului
(Fig. 9).

Fig. 9. Diagnostic diferenţial Staphylococcus # Streptococcus

utilizând testul catalazei
(Genul Staphylococcus este catalază pozitiv)

Pentru diferenţierea S. aureus de SCN putem utiliza în

concluzie urmatoarele
caractere:

- caracterele culturale
• colonii pigmentate galben-auriu la S. aureus,
spre deosebire de S.
epidermidis şi S. saprophyticus care
prezintă pigment alb
S. aureus produce pe agar sânge mai
frecvent o hemoliză clară sau
o hemoliză incompletă
- producerea de coagulază liberă de către S. aureus - enzimă care
are proprietatea de
a coagula plasma oxalatată prin activarea
protrombinei (Fig. 10). Restul
stafilococilor sunt denumiţi SCN

14
 - S. aureus produce dezoxiribonuclează termostabilă, care rămâne
activă pnn
fierberea supernatantului de cultură (Fig. 11 şi 12).
- prezenţa proteinei A în structura peretelui celular - cu ajutorului
reactivului rapid
(Fig. 13)

Fig. 10 - Testul coagulazei pozitiv (sus) şi negativ (jos)

Fig. 11 - Testul termonucleazei - metoda cu HCl- clarificarea mediului cu acizi

nucleici în vecinătatea culturii pozitive pentru dezoxiribonuclează prin
solubilizarea
acizi lor nucleici depolimerizaţi în acid clorhidric

Medtoda cu H CI

15
 Fig. 12. Testul termonucleazei - metoda Lachica, cu albastru de bromtimol (ABT)
-
schimbarea culorii complexelor acizi nucleici - ABT, de la albastru la roz,
ca
urmare a modificării structurii spaţiale după digestia acizilor nucleici

În Fig. 13 este reprezentată metoda rapidă de identificare a S. aureus

prin
aglutinare cu latex sensibil izat cu imunoglobuline (reacţionează cu Proteina A
din
peretele S. aureus), fibrinogen (reacţionează cu coagulaza legată din peretele S.
aureus)
şi anticorpi monoclonaJi anti antigene capsulare de S. aureus

Fig. 13. Metoda rapidă de identificare aS. aureus

Pentru diferenţierea SCN Între ei, utilizăm kit-uri sau galerii de

microteste (ex.
API 20 (Fig. 14) sau API ID 32 STAPH.

16
Fig. 14. Identificarea SCN cu ajutorul galeriei API 20

Dintre metodele de tiprzare, lizotipia poate oferi

informaţii utile pentru
diferenţierea în focar (Fig. 15).

Fig. 15. Lizotipia utilizată pentru diferenţierea tulpini lor într-un focar de
infecţii
stafilococice

Există metode de tipizare moleculară potrivite pentru diferenţierea în

focar, sau
pentru urmărirea evoluţiei tulpini lor la o scară mai largă temporospaţială.
Testarea de rutină a sensibilităţii la antibiotice se face prin metoda disc
difuziei.
Principalele mecanisme de rezistenţă la stafilococi sunt:
- elaborarea de beta-Iactamaze - codificate plasmidic, inhibate de
inhibitorii de [3-
lactamaze ca: acid c1avulanic (augmentin= amoxicilină cu acid clavulanic),
sulbactam,
care pot inactiva aceste beta-Iactamaze
Tulpinile MRSA posedă gena mecA. Cele de provenienţă nosocomială
în
Romania sunt de obicei multirezistente.

17
Tulpinile MRSA din comunitate sunt mai sensibile la alte antibiotice.
Rezistenţa prin apariţia unei noi proteine de legare a penicilinei, cu ajinitate
joasă
pentru beta-lactamine (tulpini meticilino-rezistente MRSA sau Meti-R),
apariţia unei PBP adiţionale şi se manifestă faţă de toate beta-
lactaminele
(peniciline, cefalosporine, carbapeneme). Singurele antibiotice active
faţă
de aceste tulpini sunt glicopeptidele (vancomicina). Dar şi faţă de
acestea
au apărut tulpini rezistente. Antibiograma este deci obligatorie.
Testarea sensibilitatii la oxacilina - screening difuzimetric cu disc de cefoxitin,
însoţit
de al doilea test: evidenţierea PLP2a sau PCR pentru gena mecA
Test D pentru detectarea rezistentei inductibile la MLSb (Macrolide, Lincozamide,
Streptogramine b): discuri Eritromicina si Clindamicina la o distanta de 10 mm:
Eritro R si turtirea zonei de sensibilitate Ia Clindamicina (antagonism) - Fig.
16.

Fig. 16. Testul D pentru rezistenţă inductibilă la macrolide, lincosamide,

streptogramine

18