Flavoproteine: contin un derivat nucleotidic

ai riboflavinei (vitamina B2):

1.4 Reductaze -flavin adenindinucleotidul (FAD)
-flavin mononucleotidul (FMN)

catalizeazā transferul electronilor la molecule organice:

compu i nitroaromatici
compu i organohalogenati
actiunea enzimelor depinde de disponibilitatea oxigenului:
Ja concentratii mici ale oxigenului, atat flavoproteinele cat ?; hemoproteinele
pot functiona ca reductaze
dacā oxigenul este prezent īn execes, poate functiona ca acceptor de electroni
īn locul moleculei organice
fluxul electronilor spre oxigen conduce la generarea speciilor reactive de
oxigen:
anion radical superoxid 02-
Nitroreductaza
radical hidroxil HO·
compu i nitroaromatici:
reducere la amine Nitropiren Aminopiren

compu i halogenati:
dehalogena re
ex. transformarea p,p'-DDT īn p,p'-DDD DDT DDD 15

Faza 11: conjugarea

• metabolitii activati ai xenobioticelor sunt conjugati cu grupari ionizate sau polare:
• glutationul (GSH), sulfatul, glicina sau acidul glucuronic:

• Grupele din structura xenobioticului la care au loc reactiile de conjugare sunt:

carboxil (-COOH), hidroxil (-OH), amino (-NH2) i sulfhidril (-SH).
• Reactiile sunt catalizate de un grup mare de transferaze cu larga specificitate de
substrat, care, īn combinatie, pot pot metaboliza aproape orice compus hidrofob ce
contine grupe nucleofile sau electrofile.

Enzime care metabolizeazā xenobiotice (faza 11)**

Denumire Localizare principalā Cofactori Substrate

Īn special compu i organici cu grupari OH libere;

Glucuronil Reticulul endoplasmic Acid UDP
unii compu i organici cu grupāri
transferaze ai multor celule animale glucuronic
-SH i -NH2 libere

Sulfotransferaze Fosfoadenin
Citosolul multor celule animale Multi compu i organici cu grupari OH libere
fosfosulfat
Mai ales īn citosolulS-transferaze
Glutation­ multor tipuri de celule animale; uneori i īn reticululMulte
endoplasmic,
Glutation
xenobiotice
redusīn cantitate
electrofile;
micā
unii compu i organici halogenati i numero i epoxizi organi

**Dupā Walker et ai, 2004; Tabelul 5.3 16

 11.1 Glucuronil transferazele

• au localizare membranara, īn special īn reticulul endoplasmic ai ficatului, la vertebrate.

• catalizeaza reactia dintre moleculele organice lipofile (xenobiotice ?i endogene)
avand atomi de hidrogen labili (de obicei, provenind din grupe hidroxil) i acidul
glucuronic, formand glucuronide:

Ac. UDP­
glucuronic

• Acidul glucuronic participa sub forma unui cofactor nucleotidic, acid uridin difosfat
glucuronic, sintetizat īn citosol
• īn acest fel, glucuronil transferaza ?i substratele lipofile asociate ei primesc un
cofactor polar din mediul hidrofil ai citosolului.
• Glucuronidele exista mai ales ca anioni la pH celular (~7.4), iar dupa formare
se deplaseaza īn citosol.
• ProduJii reactiilor de conjugare:
• au masa moleculara mai mare ?i sunt mai putin reactivi decat substratele
• sunt mai polari ?i nu pot difuza prin membrana plasmatica vor trebui transportati
activ.

17

• 11.2 Sulfotransferazele

• exista īn citosolul diferitelor tipuri de celule, īn special hepatice, ?i catalizeaza transferul

grupei sulfat de la fosfoadenina fosfosulfat (PAPS) la substrate endogene ?i xenobiotice care
au grupe hidroxil libere:

(--··· ,)
',, /'

PAPS

• Cofactorul PAPS se formeaza īn citosol.

• Conjugatii cu sulfat rezultati sunt anioni ?i au solubilitate apreciabila īn apa

18
 11.3 Glutation 5-transferazele

• se gasesc īn citosolul multor tipuri de celule, īn special īn ficatul vertebratelor.

• catalizeaza conjugarea glutationului redus cu o varietate de xenobiotice avand
caracter electrofil.

glutation

■ Conjugarea poate avea loc i īn absen1a enzimei, dar foarte lent.

■ Enzima accelereaza reactia, legand glutationul redus īn proximitatea xenobioticului.
■ Conjugarea cu glutation nu depinde de prezenta grupelor hidroxil.
■ Substrate importonte pentru oceste enzime sunt onumiti compu i orgonohologenoti i
insecticidele orgonofosforice.
■ Conjugatii cu glutation astfel formati pot suferi modificari avansate īnainte de excretie.
■ Alte tipuri de reactii de conjugare sunt: metiloreo, ocetiloreo, conjugoreo cu glicina.

19

Faza 111: modificarea avansata s, i

excret,ia
• metabolizarea xenobioticelor ulterioara conjugarii
ex. transformarea conjugatilor cu glutation īn conjugati cu acetilcisteina (acid
mercapturic)
• gruparile y-glutamil i glicina din molecula de glutation sunt īnlaturate de
enzima y-glutamil transpeptidaza {GGT} i dieptidaze
īn etapa finala, restul de cisteina din conjugat este acetilat

acid glutamic

glutation
acetilcisteina

20
 Cai de detoxificare ale fazei 111
produ ii conjugarii i metabolitii lor pat fi excretati din celule '1n faza 111 a metabolismului lor
grupārile anionice actioneaza ca etichete de afinitate pentru numero i transportori
membranari din familia proteinelor de rezistenta multipla la medicamente (MPR-multidrug
resistance protein)
apartin grupului de transportori ABC (ATP-binding cassette)
pat cataliza transportu! ATP-dependent ai unei enorme varietati de anioni hidrofobi
participa la '1ndepartarea produ ilor fazei 1117n mediul extracelular, '1n scopul:
metabolizarii
excretiei

Proteinele ABC

• utilizeaza energia eliberata prin hidroliza ATP pentru a transporta prin membrane diferite substrate
• exporterii/efluxeri au rolul de pompe care scot din celule toxinele ?i medicamentele

https://www.youtube.com/watch?v=0ha0bJZATOA
ABC transporters function
21
https://www.youtube.com/watch?v=LwSKgrdomPM

Metabolismul
benzo[a]pirenului:
un exemplu de
detoxificare a PAH:

• faza 1: doua enzime citocrom P450 microzomale

xenobioticul difuzeaza liber prin membrana plasmatica
devine substrat ai sistemului citocrom P450-+ epoxid
epoxidul este substrat pentru epoxid hidrataza diol
• diolu/ format '1n aceasta reactie poate fi din nou substrat ai oxidazei citocrom P450 diol
epoxid
• diol-epoxidul (derivat ai xenobioticului) este carcinogen $i mutagen
• Faza a 11-a: GST citosolice
catalizeaza conjugarea cu GSH
- conjugatul GST-xenobiotic este prea hidrofil pentru a difuza liber din celula
- trebuie pompat in exterior printr-o ATPaza membranara, de tipul pompei GS-X
• faza a 111-a: excretia unidirectionala a xenobioticului din celula (ca acid mercapturic)
- gruparea hidrofila GSH '1mpiedica redifuzia prin membrana plasmatica. 22
 Stresu! oxidativ i raspunsul antioxidant

Stresul oxidativ = deteriorarea biomoleculelor sub actiunea speciilor reactive

de oxigen (SRO)
peroxidul de hidrogen H202
anionul radica/ superoxid 02-
radica/ul hidroxil HO·
SRO: produ i secundari ai metabolismului aerob:
transportu! de electroni (īn fotosinteza, respiratie)
fagocitoza
cataliza enzimatica, ex. prostaglandin sintaza, guanil ciclaza,
glucozoxidaza

Animatie: catena transportoare de electroni mitocondriala

Animatie: catena transportoare de electroni fotosintetica (īn cloroplaste)

23

Raspunsul antioxidant
• Antioxidanti cu molecule mici
- tocoferol (vitamina E)
vitamina E

- glutation (GSH)
- ascorbat (vitamina C)

vitamina C
• Antioxidanti macromoleculari
- enzime: catalaza, superoxid dismutaza, glutation peroxidaza

Schema detoxificarii enzimatice a anionului radical superoxid

Superoxid dismutaza (SOD): Catalaza (CAT)

M!n+l)+ - SOD + 0- SOD+ 02
Mn+ - 2 H2O2 2 H2O + 02
2
Mn+ - SOD+ 0-2 +2W M(n+l)+ - SOD+ H2O2. Gutation peroxidaza (GPX)
unde M = Cu (n=l); Mn(n=2); Fe (n=2); Ni 2GSH + H2O2 GS-SG + 2H2O 24
(n=2).
 Alte aspecte ale biotransformarii

Activarea
Efect advers prin care
un contaminant devine mai toxic prin biotransformare
un compus inactiv este transformat fntr-altul cu bioactivitate intensa,
negativa
Exemple:
sub actiunea bacteriilor, Hg este biotransformat īn CH3Hg, mai
solubil īn apa
-+cre te toxicitatea Hg asupra vertebratelor
parathionul este oxidat la paraoxon, mai toxic

25

• Chelatarea
• ionii metalici sunt sechestrati de molecule cu structura inelara
a+metalele toxice pot inlocui metale esenļiale in biomolecule; ex.:
• substituirea Fe din hem-proteine

0
• substituirea Mg din clorofila

Clorofila a

Hemul b
https://commons.wikimedia.org
Biodegradarea microbiana /wiki/File:Heme_b.svg

• multe microorganisme pat utiliza xenobioticele ca sursa de carbon

- posibilitatea utilizarii lor īn diminuarea/remedierea poluarii mediului;
• degradarea completa depinde de abilitatea de a intra īn ciclul Krebs (ciclul acizilor
tricarboxilici):
moleculele cu catena liniara sunt relativ u or metabolizabile; ex. alcani, alchene
26
- moleculele aromatice sunt mai greu metabolizabile; ex. PAH, PCB
 Modele toxicocinetice de interactiune a poluantilor organici cu organismele an

■ Īn toxicocinetica:
■ sunt important vitezele proceselor de captare, depozitare, actiune, metabolism i
excretie a substantelor toxice
■ utile pentru dezvoltarea unor modele: descriptive; predictive.
■ Organismu! poate fi divizat īn compartimente care reprezinta organe i tesuturi
particulare:
■ fiecare compartiment contine o cantitate discreta de xenobiotic, supus unor viteze
particulare de transfer i biotransformare.
■ abordare foarte laborioasa; constantele cinetice sunt dificil de determinat pentru fiecare
compartiment ai organismului i fiecare poluant din mediu
■ Īn general, se utilizeaza modele care trateaza organismu! īntreg ca pe un
singur compartiment:
■ organism acvatic: expus la un poluant dizolvat īn apa ambianta
■ organism terestru: expus unui poluant din hrana sa.
■ Daca un organism este expus continuu la un nivel constant ai unui poluant organic,
concentratia poluantului īn organismu! ca īntreg va cre te īn timp:
■ initial, viteza de cre tere a concentratiei tisulare a poluantului va fi mare
■ viteza īncepe apoi sa scada i īn final atinge un platou, atata timp cat concentratia letala
nu a fost atinsa.
27

• Cand concentratia poluantului atinge un platou, se spune ca sistemul se gase te īn

store stationara:
- Viteza cu care poluantul este captat este echilibrata de viteza cu care este pierdut
- Pierderea se poate datora metabolismului sau excretiei directe a poluantului initial
• Daca expunerea la poluant īnceteaza īn acest moment, concentratia tisulara a poluantului va
īncepe sa scada.
• Īn cea mai simpla situatie, īn care cinetica eliminarii poate fi descrisa de o singura
constanta de viteza (modelul cu un singur compartiment):
- viteza scaderii concentratiei poluantului este proportionala cu concentratia sa īn organism
- cinetica de ordinul īntai, descrisa de ecuatia:

unde:
C: concentratia poluantului īn organism
C0: concentratia la momentu! īncetarii expunerii
C1: concentratia la momentu! t
K: constanta de viteza a eliminarii poluantului din organism
-dC/dt: viteza eliminarii poluantului din organism Cinetica absorbtiei i eliminarii unui

► concentratia scade exponential īn timp. poluant. (Walker et ai, 2001, Fig.5.9)

• Timpul de injumatatire biologica (t112):

timpul necesar pentru scaderea la jumatate a concentratiei poluantului īn organism;
poate fi determinat din reprezentarea grafica: ln C vs. timp.
28
Cinetica absorbtiei i eliminarii unui poluant. (dupa Walker et ai, 2004, Fig.5.9)
Cand unui animal i se administraza continuu o substanta chimica, logaritmu! concentratiei acesteia īn
organism (ln c) va cre te īn timp, pana la atingerea unei stari de echilibru. Dupa oprirea administrarii
substantei chimice, logaritmu! concentratiei scade liniar īn timp, daca se aplica o cinetica de ordinul
īntai (ca īntr-un modei cu un singur compartiment).

Īn practica, viteza captarii nu este absolut constanta. De exemplu, daca sursa de xenobiotic este
hrana, este probabil sa existe variatii diurne ale vitezei tiparului de ingestie. Uneori, activitatea
enzimelor care metabolizeaza poluantul se modifica datorita inductiei sau inhibitiei, modificandu
se i viteza de eliminare a xenobioticului. Īn realitate, variatia concentatiei īn timp este de mai
complexa decat situatia simplificata a modelului unicompartiment.
29

Dupā oprirea administrārii, concentratia poluantului īn organism scade exponential īn timp

Timpul de īnjumātatire (t112):

timpul īn care concentratia poluantului (īn organism) scade la jum

Viteza de eliminare a substantei chimice din organism este proporŗionala cu concentratia ei tisularā

Cinetica eliminarii poluantilor organici. (dupa Walker et ai. 2004. Figura 5.10)
30
 Bioconcentrarea i bioacumularea poluantilor

Modele toxicocinetice
■ Descriu i anticipeazā gradul de bioconcentrare i bioacumulare a poluantilor organici
la animale expuse continuu la xenobiotice, in conditii de store stationara:
■ concentratia tisulara reprezinta nivelul maxim anticipat pentru un anumit nivel ai expunerii
■ nu depinde de timp.
■ Factorii de bioconcentrare i bioacumulare determinati inainte de atingerea starii
stationare au semnificatie limitata pentru ca:
■ se aplica doar unor perioade particulare de expunere
■ nu indica concentratia maxima care poate fi atinsa.

■ DEFINITII:
■ factorul de bioconcentrare (FBC)

■ factorul de bioacumulare (FBA)

trebuie determinati cand sistemul este īn stare stationara.

31

Factorii de bioconcentrare
◄------------

■ sunt importanti pentru ecotoxicologia acvatica,

unde mediul ambiant este o sursa majora de
poluanti organici.
Corelatia FBC-Kaw pentru situatiile īn care difuzia prevaleazā in aborbtia i elimi
■ La organismele acvatice:

■ A) cand captarea i eliminarea xenobioticului se realizeaza īn mare parte prin difuzie

pasiva, metabolismu! avand doar un rol minor (difuzie de schimb):
■ La scoicile comestibile (Mytilus edulis) a fost evidentiata o corelatie īntre factorii de
bioconcentrare ai poluantii organici lipofili i valorile lor Kow-
■ in starea stationara, FBC este determinat de partitia poluantului īntre apa i componentele
hidrofobe ale organismului.
■ īn cazul xenobioticelor nepolare, cu lipofilie mare, partitia se deplaseaza mult īn
directia organismului.
► valori mari ale FBC sunt asociate cu valori mari ale K0w (uneori, valorile K0w sunt transformate īn
pK0w prin logaritmare).
■ B) Cand alte surse de captare i eliminare devin mai importante decat difuzia, acest
modei simplu nu mai este aplicabil.
■ la pe ti, valorile FBC pentru anumiti poluanti se gasesc sub valorile anticipate din reprezentarea
log FCB vs log KOW
■ poluantii sunt metabolizati rapid
■ viteza eliminarii lor este mai mare decat ar fi de a teptat numai ca efect ai difuziei pasJye.
 Factorii de bioacumulare
■ Sunt foarte importanti īn ecotoxicologia terestra, unde hrana $i uneori apa ingerata reprezinta
o sursa majora de poluanti organici.
■ Simplificot: atat captarea cat $i eliminarea pot fi atribuite cate unui singur proces, fiecare fiind
guvernat de o constanta de viteza (o?o cum s-o explicot lo cinetico obsorbtiei):
■ īn cazul compu$ilor foarte lipofili, hrono poate fi sursa principala de poluare, īn timp ce
metobolismul poate fi sursa principala de eliminare.
► posibilitatea dezvoltarii unor modele predictive pentru bioacumulare īn storeo
stotionora,
utilizand constantele de viteza ale celor doua procese, atata timp cat metabolismu! este
simplu.
■ Exista un interes major pentru modele predictive care sa permita evaluarea rezonabila a
masurii īn care diferiti poluanti organici pot fi bioconcentrati sau bioacumulati īn diferite
organisme.
■ utile īn procesu! de evaluare a riscului pentru contaminantii chimici
■ sa fie simple $i U$Or de operat
■ sa ia īn considerare rutele majore de captare $i eliminare a poluantilor organici de catre
organismele din diferite habitate.

Rute de absorbtie I Rute de eliminare

Rute de absorbtie ?i eliminare a Tipul de organism
Difuzie Hranā Apā Difuzie Metabolism
poluantilor lipofili. lmportanta lor Acvatic 1

este indicata pe o scala de la + la

Molu$te 1 +++++ (+) +++++ 1
+++++. 1-- --+-+----
Pe$ti cu activitate enzimatica substantialā 1 +++++ -+++ - -+++-+ 1+ +++
(WalkerCH et ai, 2004, tabelul 5.4) Terestru

ex. prādatori++++(+)+++++
33

Poluantii organici īn ecosistemele terestre

• Contaminarea suprafetei terestre are loc īn vecinatatea siturilor industriale sau depozitelor
de de$euri
• Poluantii pot ramane pe sol, pot intra īn lanturile trofice sau pot fi transferati īn aer sau apa.

• Exemple de poluanti
• Pesticidele: cei mai importanti poluanti ai solurilor agricole
pot ajunge pe soluri direct sau prin transferul resturilor din plante carora le-au tost aplicate.
sunt aplicate ca spray, granule sau praf.
unele pesticide sunt destul de solubile pentru a se dizolva complet īn apa de pulverizare
majoritatea īnsa sunt putin solubile īn apa
► sunt formulate ca $i:
• concentrate emulsifiabile (dizolvate īntr-un lichid uleios) piciituri suspendate īn apa
• pulberi umectabile (particule fine amestecate cu un diluant inert) particule suspendate īn apa
• Alte substante chimice de origine industriala:
- hidrocarburi, bifenili policlorurati (PCB), .a.
- mai putin toxici decat pesticidele
► probleme de poluare localizate
• Riscuri:
acumulare īn plantele cultivate
contaminarea apei potabile
afectarea organismelor din sol $i fertilitatii solului 34
 So r" e
• sunt asociatii complexe de organisme vii, particule minerale i materie organica.
• Unele componente ale solului au structura coloidala:
- fraqia argiloasa a componentei minerale
- humusul din materia organica.
• coracteristici
- dimensiuni mici: diametru! <0,002 mm
- suprafata mare pe unitatea de volum
• Cand compu ii organici intra 7n sol, sunt distribuiti 7ntre apa din sol, aerul din sol
i suprafetele disponibile ale mineralelor i materiei organice din sol.
• Cand se afla sub forma de -sau asociati cu - porticule sou picaturi, va trece un timp pana
cand moleculele individuale sunt distribuite 7ntre aceste compartimente ale solului.

Distributia poluantilor īn sol

• depinde de proprietatile lor:
• so/ubilitate (valorile K 0wJ
• presiune de vapori
• stabilitate chimica - sunt degradati :
prin hidroliza, oxidare, izomerizare
• fotochimic, daca se gasesc la suprafata
► degradarea conduce la scaderea toxicitatii
uneori, produ?ii degradarii sunt foarte toxici
exemplu: compu ii
organofosforici: malation
35
Soarta poluantilor organiciizomalation
īn sol dupa (Walker CH et ai, fig 5.12)

POLARITATEA i SOLUBILITATEA
Compu ii polari (compu i hidrofili cu valori K0w scazute) tind sa se dizolve 7n
apa i sunt adsorbiti de coloizii din sol doar 7n masura limitata.

- compu?ii organici care exista ca ioni fac exceptie de la aceasta regula

- se asociaza foarte puternic cu siturile de pe coloizii solului care au sarcini de semn contrar.
- erbicidul paraquat (metilvio/ogen; heterociclu redox activ) exista sub forma de cation
- se leaga puternic la siturile īncarcate negatīv ale argilelor minerale
Compu ii cu solubilitate mica 7n apa (K0w mare) tind sa se adsoarba puternic la suprafata argilei i
materiei organice din sol, dar se gasesc doar 7n concentratii foarte mici 7n apa din sol.
PRESIUNEA DE VAPORI
• Compu ii care au presiune de vapori mare tind sa se volatilizeze 7n aerul din sol sau direct de pe
suptafata solului 7n aerul atmosferic.
• Daca intra 7n aerul din sol, pot fi retinuti 7n sol pentru un timp dar 7n cele din urma vor trece 7n
atmosfera.
LEGAREA LA COLOIZII DIN SOL
• restrictioneaza deplasarea poluantilor organici 7n sol i disponibilitatea lor pentru organismele din
sol.
• compu ii cu valori mari ale K0w (compu ii lipofili) aplicati pe sol prezinta o tendinta redusa de a fi
dispersati de apa 7n profilu! solului.
►unele erbicide care actioneaza 'in sol sunt selective:
• toxice door osupra buruienilor core au radacini superficiole
• inoccesibile plontelor cu radacini lo odancimi moi mori.
36
 Eliminarea compu ilor lipofili
• limitarea disponibilitatii pentru organismele din sol restrictioneaza viteza de biotransformare i
toxicitatea compu ilor lipofili.
• compu ii lipofili stabili chimic au de obicei valori mari ale timpului de īnjumatatire īn sol:
■ sunt legati puternic la argila i/sau materia organica
■ sunt metabolizati foarte lent
• exemple de compu?i lipofili care sunt metabolizati foarte lent:
• formele active ale insecticidelor organoclorurate, ca p,p'-DDT
- chiar ?i cand sunt liber disponibili, sunt substrate cu afinitate mica pentru enzimele de detoxificare.

• Eliminarea lor din sol este bifazica

• lmediat dupa aplicare: exista o perioada de
eliminare rapida
► insecticidul nou aplicat, prezent ca particule
sau dizolvat īntr-un solvent uleios, se
volatilizeaza sau este īndepartat de curentul
de aer, ca praf.
► īn acela?i timp, molecule de insecticid se
adsorb la coloizii solului
• perioada de pierdere rapida initiala este
succedata de o scadere lenta,
exponentiala.
► insecticidul adsorbit devine lent disponibil Disparitia pesticidelor organoclorurate din soluri (dupa WalkerCH et ai, Fig. 5.13, 1
pierderii prin evaporare sau metabolism.

p, p'-DDT Lindan
Dieldrin

►valorile timpului de 1njumatatire pentru ace ti compu?i pat ajunge la ani, īn unele cazuri
chiar zeci de ani
► Timpul de īnjumatatire
► depinde de: compus, de tipul de sol ?i de clima.
► Compu?ii cu presiune de vapori mai mare tind sa fie pierduti mai rapid decat cei cu presiune de vapori
mai scazuta.
► Compu?ii care sunt biotransformati rapid tind sa fie pierduti mai rapid decat cei care rezista la
biotransformare.
• Persistenta este favorizata de:
- compozitia solurilor: continutul mare de argila ?i substante organice
- temperaturile scazute
• Temperaturile crescute favorizeaza volatilizarea, degradarea chimica ?i biotransformarea)

Compusul Timpul de eliminare Timpul de eliminare

a 50% (ani) a 95% (ani)
Dieldrin 0,5-4 4-30
,p'-DDT 2,5-5 5-25
Lindan (y-HCH) 1,5 3-10

Persistenta pesticidelor organoclorurate īn soluri (dupa Walker et ai, 2004; Tabelul. 5.5) 38
 Eliminarea compu ilor hidrofili
Compu$ii hidrofili care nu se leaga puternic la argila din sol sau la materia organica se deplaseaza liber īn profilu!
solului, odata cu apa.
► tind sa nu fie foarte persistenti pentru ca organismele din sol īi metabolizeaza relativ rapid.
Compu$ii hidrofili, ca erbicidul 2,4-D $i MCPA $i insecticidul carbofuran, prezinta un tipar caracteristic de
eliminare din sol:
- imediat dupa aplicarea pe sol, eliminarea este relativ lenta
- dupa ofaza de lag, viteza de degradare devine mult mai mare i compusul este eliminat rapid.
► substanta chimica dispare, de regula, īn zile sau saptamani.
Daca imediat se aplica pe solo cantitate suplimentara de compus, i aceasta dispare rapid
► solul s-a „īmbogatit": īn sols-au dezvoltat tulpini de microorganisme care pot metaboliza compusul organic.
► Daca nu se adauga o cantitate suplimentara de compus, aceasta „īmbogatire" se pierde $i solul va reveni la starea
lui initiala.

Carbofuran
MCPA (2,2-Dimetil-2,3- dihidro-1- benzofuran-7-il metillcarbamat)
(Acidul 2-metil-4- clorfenoxiacetic)
2,4D
(Acidul 2, 4- diclorfenoxiacetic)

Fenomenu! de īmbogatire este adesea o problema pentru agricultura;

anumite pesticide Ī$i pierd eficienta daca sunt utilizate prea frecvent (de
exemplu, carbofuranul).

Soarta compu ilor organici īn sol, deplasarea i curbele de eliminare a lor

Disparitia pesticidelor din soluri
(dupa WalkerCH et ai, Fig. 5.13, 1)
pot fi anticipate utilizand modele care īncorporeaza parametri precum K0w
sau presiunea de vapori. 39

Organismele din ecosistemele terestre

• pat capta poluantii din alimentele $i apa ingerate sau direct din aerul, apa sau de
pe suprafetele solide cu care vin īn contact.
• Captarea din apa ambianta nu este o ruta la fel de importanta ca pentru organismele
acvatice, de$i trebuie avut īn vedere ca organismele din sol (ex. ramele) pat capta poluantii īn
acest fel.
• Pentru vertebratele terestre, captarea din hrana $i apa ingerate reprezinta o ruta foarte
importanta, adesea ruta majora. Īn acest caz, trecerea poluantilor organici de-a lungul
lanturilor trofice este un subiect de mare importanta.
• Cand compu$ii au timp lung de īnjumatatire biologica, trecerea lor printr-un lant trofic poate
conduce la biomagnificare la unele dintre nivelurile trofice sau la toate.
• De regula, concentratia cea mai mare a poluantului se va gasi la pradatorii aflati pe nivelul cel
mai īnalt ai piramidei trofice.
• De asemenea, datorita mobilitatii unor specii animale (mai ales pasari), poluantii pat fi
transportati la distante mari de punctul īn care au fost initial eliberati, de ex. īntre continente
la pasarile migratoare
• la pradatorii tere$tri a fost adesea raportata prezenta unor cantitati relativ mari de poluanti
lipofili : insecticidele organoclorurate PCB $i metilmercurul.

40
 TRANSFERUL DE-A LUNGUL LANTURILOR TROFICE TERESTRE

• lnsecticidele organoclorurate persistente au fost determinate la organisme aflate la

diferite niveluri trofice ale ecosistemelor terestre
• Ca i īn mediul marin, se evidentiaza o tendinta generala ascendenta de deplasare īn
lanturile trodifice a unor compu i ca p,p'-DDE (metabolit ai p,p'-DDT) i dieldrin.
• exista īnsa riscul supersimplificarii situatiei complexe existente pe teren īn momentu! īn
care sunt variatii ample, temporale i spatiale de expunere la acest componente.
- De exemplu, īn anumite zone pasarile granivore au captat doze letale de dieldrin (ex. zonele agricole),
unde s-au putut hrani cu seminte care fusesera tratate cu acest insecticid; īn zonele īnvecinate, unde
chimicalele nu fusesera folosite, expunerea acelora i specii a fost zero.
• biomagnificarea nu are loc, īn mod necesar, la fiecare veriga a lantului trofic, chiar i
pentru compu ii foarte persistenti.
- Semintele tratate ar putea contine resturi de dieldrin de 100 µg g-1, dar pasarile sau
mamiferele granivore nu pot, īn mod normai, sa acumuleze asemenea concentratii īn tesuturile
lor pentru ca otravirea letala cu dieldrin are loc la niveluri cu mult mai joase decat acesta.
- Unele specii tind sa se hraneasca selectiv: pot avea tendinta de a selecta prada cu concentratia
tisulara cea mai mare, respectiv indivizi care prezinta simptome subletale de otravire.
►Sunt expuse la cele mai īnalte concentratii, existente īn indivizii supravietuitori ai acelei specii, nu la
concentratiile medii ale poluantului respectiv īn tesuturile speciilor prada

41

• O problema importanta o reprezinta tendinta ca pradatorii sa bioacumuleze poluanti

persistenti cu valori mari ale timpului de īnjumatatire, atunci cand sunt expu i la acestea o
lunga perioada de timp.
• daca se atinge o stare stationara, pasarile de prada expuse la compu i ca dieldrin ori p,p'-
DDE pat realiza factori de bioacumulare de 5-15 ori mai mari īn raport cu prada lor.
►pāsārile prādātoare sunt considerate bioacumulatori deosebit de eficienti ai xenobioticelor
lipofile pentru ca au sistemele de detoxificare oxidativa slab dezvoltate.

• rn rezumat:
• S-a demonstrat ca anumiti poluanti lipofili persistenti se transfera de-a lungul lanturilor
trofice terestre, uneori atingand cele mai mari concentratii la pradatorii de pe cel mai īnalt
nivel trofic.
• O problema majora o reprezinta anumite pesticide utilizate pentru tratamentul semintelor
(ex. aldrin, dieldrin, metilmercur), īn cazul carora concentratia la prima veriga a lantului trofic
este deja īnalta iar speciile granivore pat acumula rapid doze letale daca se hranesc cu
semintele tratate.
• Persistenta majoritatii acestor compu i se datoreaza combinatiei dintre lipofilia īnalta (valori
mari ale K0w) i rezistenta la detoxificarea metabolica (īn special la specii de tipul pradatorilor
specializati, care oricum sunt deficienti īn enzime de detoxificare).
• Compu ii lipofili u or metabolizabili tind sa nu persiste īn organismele animalelor terestre.
Daca au efecte toxice, acestea par sa fie acute: de durata scurta i limitate la speciile
expuse imediat la ele i din arealul pe care au fost eliberate.

42
 Poluantii organici ,n ecosisteme/e acvatice
• Saarta paluantilar arganici care intra 7n ecosistemele acvatice depinde de proprietatile lar
fizice (ln special lipafilia, presiunea de vapari) $i de stabilitatea lar chimica.
• compu ii lipsiti de stabilitate, de exemplu, compu$ii care tind sa se fie hidralizati, ridica putine
probleme ca paluanti acvatici, cu exceptia cazurilar cand produ$ii hidrolizei lar sunt taxici.
• compu ii volatili tind sa nu persiste 7n ecosistemele acvatice.
• polaritatea este impartanta 7n determinarea distributiei $i persistentei:
campu$ii hidrafili tind sa se dizalve 7n apa $i sa se distribuie 7n apele de suprafata.
campu$ii lipafili
• tind sa se asacieze cu materia particulata, mai ales cu sedimentele.
• uneari sunt dizalvati 7n filmele de petrol de la suprafata
apei POLUANTI ĪN SEDIMENTE
• sedimentele raurilar, lacurilar $i marilar sunt (ca $i salurile) asaciatii de particule anarganice $i
arganice $i arganisme vii.
• Paluantii arganici pat fi adsarbiti de particulele din sedimente, limitandu-se mabilitatea $i
dispanibilitatea lar la arganismele care traiesc pe fundul apei.
► este incerta masura 7n care paluantii pat fi captati direct de animale din starea adsarbita sau
daca trebuie mai 7ntai sa se deplaseze 7n mediul apas pentru de a deveni dispanibili.
• Grodu/ i'n care un poluant adsorbit poate fi captat direct vdepinde de :
•proprietatile paluantului
•caracteristicile suprafetei de care este legat $i taria legaturii
•speciile care 71 capteaza
43
•temperatura, pH $i cantinutul de axigen 7n apa ambianta.

• Continutul de oxigen
• impartant pentru determinarea naturii $i vitezei transformarilar chimice $i biachimice.
• pe masura ce cantinutul 7n axigen scade, va exista a tendinta ca transformarile axidative sa fie
7nlacuite de transformari reductive
• Sedimentele pat diferi marcant sub aspectul continutului de axigen.
- pe fundul marilor adanci, conditiile sunt anaerobe
- īn apele curgatoare putin adanci $i cu viteza mare, nivelul oxigenului este relativ īnalt.
- zonele de flux/reflux, de-a lungul tarmurilor marii, sunt supuse fluctuatiilor continutului de oxigen,
īn acord cu mi$carile apei

TRANSFERUL DE-A LUNGUL LANTURILOR TROFICE ACVATICE

• Se aplica acelea$i consideratii generale ca $i 7n cazul lanturilar trofice terestre

• exceptie: difuzia de schimb dintre arganisme $i apa ambianta este un factar care complica
situatia 7n ecosistemele acvatice.
► este mai dificila interperetarea unar date experimentale.
• ,Beziduurile de compu$i arganaclarurati persistenti $i p,p'-DDE (metabalit ai p,p'-DDT) au tost
masurate 7n probe provenind de la arganisme aflate diferite niveluri trofice 7n ecosistemele marine
► prezinta o buna corelatie pozitiva īntre logaritmu! concentratiei reziduurilor $i nivelul trofic ai
organismelor la care au fost determinate:
■ concentratiile cele mai mici sunt īn plante: alge brune, nivelul trofic 1
■ cancentratiile cele mai mari: la vertebratele pradatoare de la nivelele trofice 4 i 5;
► se pare ca biomagnificarea are loc la fiecare veriga a lantului trofic
44
• Poluantii organici persistenti: insecticidele organoclorurate, bifenilii policlorurati (PBB) ?
i dibenzodioxinele policlorurate (PCDD):
se acumuleaza la niveluri relativ īnalte la pradatorii aflati īn varful lanturilor trofice
acvatice
mamiferele marine, ca focile ?i cetaceele bioacumuleaza ace?ti compu?i ?i īl trec
progeniturilor lor prin lapte.
ca ?i pasarile marine, mamiferele marine de prada au sistem monoxigenazic de
detoxificare slab dezvoltat, favorizand bioacumularea poluantilor
rezultate similare au fost obtinute īn ecosistemele de apa dulce, unde au fost gasite
niveluri relativ īnalte ale poluantilor organici persistenti la pasarile de prada ?i mamifere

• Poluantii lipofili care au timp de injumātātire relativ scāzut (ex. hidrocarburi aromatice
policiclice, PAH)
nu prezinta aceea?i tendinta de deplasare ?i biomagnificare īn lanturile trofice.
unele nevertebrate de la nivelurile trofice joase (ex. scoica Mytilus edulis)
bioconcentraza ?i/sau bioacumuleaza aceste substante pentru ca prezinta o
abilitate scazuta de a le metaboliza.
pe?tii, pasarile ?i mamiferele le metabolizeaza rapid prin actiunea monoxigenazei,
► exista o tendinta scazuta ca toxicele respective sa ajunga la nivelurile trofice superioare
?i sa se bioacumuleze acolo.
♦ de?i ace?ti compu?i nu ridica problema biomagnificarii, trebuie subliniat ca unele PAH
?i alti compu?i u?or degradabilisunt supu?i activarii metabolice.

45

Bibliografie
Walker CH, Hopkin SP, Sibly RM, Peaka/1 DB (2004) Princip/es of ecotoxicology, 2nd Ed, CRC Press,
Taylor & Francis Group
• https://en.wikipedia.org/wiki/Soret_peak
• https://en.wikipedia.org/wiki/Porphyrin
• Camilla Baj-Rossi, Giovanni De Micheli and Sandra Carrara (July 18th 2011). P450-Based Nano-Bio
Sensors for Personalized Medicine, Biosensors - Emerging Materials and Applications, Pier Andrea
Serra, lntechOpen, DO1: 10.5772/16328.
B. A. Pandian, R. Sathishraj, M. Djanaguiraman, P.V. Vara Prasad, M. Jugulam, Role of Cytochrome
P450 Enzymes in Plant Stress Response. Antioxidants 2020, 9(5),
454; https://doi.org/10.3390/antiox9050454 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

46
CURS 6
□ Efecte protectoare vs. neprotectoare
ECOTOXICOLOGIE □ Mecanisme moleculare ale toxicitatii
AL
o Efecte fiziologice ale poluantilor
POLUANTILOR o Biomarkeri

□ ajun i īn organismele vii, poluantii pat produce doua tipuri de efecte (Braspunsuri):
□ cu rol de protectie a organismului īmpotriva toxicitatii substantelor chimice respective
□ fara rol protector
□ Mecanismele de protectie functioneaza prin scaderea concentratiei poluantului liber īn celula
(metabolism, depozitare, excretie)
► interoctiunile cu componentele celu/ore sunt limitote

Exemple de efecte protectoore i neprotectoore (tuturor le sunt osociote costuri energetice)

1.Rāspunsuri protectoare

Scaderea concentratiei celulare a poluantului liber

■ interactiunile cu componentele celulare sunt 1mpiedicote sau limitote prin:
metabolizarea poluantului
► poluantii organici determina adesea inductio enzimelor care le pat metaboliza
ex. carcinogenii sau insecticidele organofosforice
induc enzimele sistemul monoxigenazic (Cyt P450)
sinteza unor proteine care leaga poluantul

► depozitare sau excretie

ex. metalele induc sinteza de metalotioneine
inductia sintezei transportorilor ABC (ATP-binding cassette)
acest mecanism sta la baza rezistentei la anumite medicamente
Repararea deteriorarilor produse de poluanti
agresiune chimica, oc termic eliberarea proteinelor de stres
deteriorarea ADN activarea mecanismelor de reparare a ADN
stres oxidativ inductia sintezei de antioxidanti
sunt mecanisme homeostatice de readucere a sistemelor celulare la starea de
functionare normala, dupa deteriorarile produse de substantele toxice

2
 Monoxigenazele citocrom P450
sunt induse de prezenta substantelor toxice
cre$te viteza de formare a:
metabolitilor hidrosolubili
conjugatilor cu toxicitate scazuta 2-Acetilaminofluoren
Aflatoxina B1
excreŗie rapida
metabolismu! xenobioticelor conduce la:
detoxificare, de obicei
rar, dar important: formarea unor metaboliti activi
Dibenzo[a,h]antracen
Ex. carcinogeni chimici activati sub actiunea monoxigenazelor CYP:
arene polinucleare: benzo(a)piren (BaP), dibenzo[a,h]antracen
aflatoxina (micotoxina produsa de mucegaiuri din genul Aspergillus; 8,9-epoxidul se
leaga la ADN)
2-acetilaminotiuorenN( -hidroxiacetilaminofluorenacetoxiaceti1aminofluoren)
pot provoca mai multe deteriorari celulare decat compusul initial.

Metalotioneinele (MT)
■ Sunt proteine cu continut mare de Cys, Mr=S00-14000 Da
■ dimeri, oligomeri;
■ potlega:Cd,Zn, Hg,Cu,As,Ag
Cisteina
■ legarea este cooperativa
■ -+sechestreaza metalele toxice Modei molecular ai unei metalotioneine 3

Proteinele de oc termic

Hsp (Heat shock proteins)

cre$terea concentratiei lor este asociata cu:
$OCul termic
alte forme de stres
denumite in functie de masa lor moleculara (kDa)
Hsp60,Hsp70, Hsp90
housekeeping" Bmenaj (celular)
monitorizeaza proteinele celulare
dirijeaza proteinele deteriorate/inutile spre proteoliza
proteazomul (poliproteaza)-'recyc/e bin' celular

,,chaperones"Bghizi (moleculari)
asista (re)plierea proteinelor
denaturate
nascente

Hsp70-animatie:
https://www.stressmarq.com/support/research-tools/hsp70-resource-guide/?v=3e8d115eb4b3
4
 11. Raspunsuri neprotectoare

nu sunt corelate cu vreo functie protectoare

variatii ale activitatii:
enzimelor
receptorilor
intermediarilor reactivi
deteriorari ale ADN

īn multe cazuri:
nu produc deteriorari evidente ale organismului
par sa nu fie corelate cu toxicitatea
le sunt asociate anumite costuri energetice

1n alte cazuri:
au consecinte grave
la nivel celular
asupra 1ntregului organism
efecte adverse asupra sanatatii, uneori letale
modificarile biochimice au loc lo situsul de octiune ai unor biomolecule
reprezinta boza moleculora o toxicitatii

Cai de activare ; detoxificare a substantelor chimice

DETOXIFICARE

Sistemul monoxigenazic

Substanta chimicā initialā CANCER

REPEA ADN

Starea initialā
'
6
 Specificitatea raspunsu/ui bio/ogic
■ Modificārile provocate de poluantii care intrā īntr-un organism pot fi:
■ specifice pentru un tip particular de substanta chimica
■ nespecifice

Raspunsurile la un anumit poluant pat fi:

specifice anumitor grupuri de organisme
comune unui numar foarte mare de organisme
gradul de induqie a monoxigenazelor, ca raspuns la un anumit poluant, prezinta o mare variabilitate
de le o specie la alta
Ex: barbituraļii deprima activitatea sistemului nervos
produc efecte de la sedare la anestezie
pot produce raspunsuri marcante la mamifere Acid barbituric
nu produc efecte la pe ti sau unele pasari 7

Mecanisme moleculare ale toxicitatii:

importanta cunoa terii lor
Pentru medicina umana:
dezvoltarea antidoturilor 1'mpotriva efectelor adverse ale poluantilor
dezvoltarea unor analize care pat fi utilizate pentru a demonstra ; masura efectele
deteriorante ale substantelor chimice
Ex. formele active ale unor insecticide organofosforice (OP) inhiba
acetilcolinesteraza

Pentru dezvoltarea de noi biocide

daca situsul de actiune ai unui pesticīd este cunoscut, se poate elabora un modei structural
pat fi identificate alte molecule care:
se potrivesc 1'n acela i situs
interactioneaza cu acesta
moleculele care corespund modelului pot fi apoi sintetizate $i testate ca noi biocide

Complementaritatea structuralā-(animatii):
Cum functioneaza enzimele:

lnteractiuni receptor-ligand:

8
lnteractiuni moleculare implicate īn efectul toxic
care nu conduc Ja formarea legaturilor covalente
ex. legarea reversibi/6 a unei molecule la situsul specific ai unei macromolecule celulare
► toxicitate
tinta poate fi:
situsul receptor ai unui mesager chimic
pufferfish
ex. receptoru! pentru acetilcolina sau GABA
un por transmembranar care permite trecerea anumitor ioni
ex. blocarea canalelor de Na+ de catre tetrodotoxina (o neurotoxina produsa de
Tetraodontiforme)

■ interactiuni prin legaturi covalente

■ Ex. modificarea covalenta a unor aminoacizi din situsul catalitic ai enzimelor

acetilcolina

ACE
9

Formarea aductilor ADN

daunomicina i adriamicina se intercaleaza īn dublul helix ADN, la situsuri specifice d(CpG)

distorsionarea helixuluiīmpiedica interactiunea cu enzime implicate īn replicare i
transcriptie (helicaza, topoizomeraza, polimeraze)
► inhibarea diviziunii celulare

Aduct format prin legarea intercatenara a cisplatinei [Pt(NH3)i] la AD

(agent antitumoral)

Complex daunomicina-ADN
10
 EXEMPLE /4 MECANISME MOLECULARE ale TOXICITATII
'
COMPU I GENOTOXICI
agenti care produc modificari ale ADN
►existenta unei relatii cauzale īntre genotoxicitate i cancer:
cand celulele avand ADN deteriorat se divid, se pat forma celule mutante
unele dintre acestea sunt celule tumorale:
urmeaza tipar de cre tere necoordonat
migreaza īn organism, producand metastaze īn alte locatii.

Exemple:
unele hidrocarburi aromatice policiclice (PAH)
benzo[a] piren i dibenzantracen
acetaminofluoren
aflatoxina
clorura de vinil
nu compusul initial interactioneaza cu ADN
sub actiunea uneia sau mai multor forme de monoxigenaze:
metaboliti foarte reactivi, cu viata scurta, care se pat lega la ADN

11

Metabolizarea benzo(a)pirenului

Benzo(e)piren

Avand caracter lipofil, (B(a)P) difuzeaza liber prin membrana celulara, devenind substrat ai enzimelor CYP.
Reaqiile fazei I sunt catalizate de enzime citocrom P450 microzomale.
Īntr-o prima reactie a fazei I de metabolizare, B(a)P este oxidat la epoxid; este reprezentat doar 7,8
epoxidul, dar se formeaza i produsul 9,10.
Sub actiunea unei hidrolaze, epoxidul se transforma īn diol care poate fi din nou substrat ai enzimelor CYP.
A doua reactie de oxidare conduce la un diol epoxid, cancerigen $i mutagen.
Īn scenariul pozitiv, cand acest produs se formeaza īn cantitati mici, este conjugat cu glutation sub actiunea
unei glutation-5-transferaze citosolice (faza 11). Fiind prea hidrofil pentru a difuza liber din celula,
conjugatul GS-xenobiotic trebuie pompat īn exterior de o ATPaza membranara.
Īn faza III are loc excretia unidirectionala a xenobioticului din celula (ca acid mercapturic)
 • Metabolismu! benzo(a)pirenului i formarea unui aduct cu guanina

PAH* se gāsesc īn fum i

petrol brut
Sunt prezente īn: regiunile urbane, cu
trafic intens
locaļiiile marine cu platforme petroliere

*PAH-Polycyclic aromatic
hydrocarbonsBarene polinucleare

13

• legarea benzo(a)pirenului la guanina din ADN distorsioneaza dublul helix

• replicarea catenei ADN va fi incorecta
• aductul poate fi īndepartat de sistemele de reparare a ADN
• Ex. excizia nucleotidelor

lnteractiunea diol epoxidului, metabolit ai benzo(a)pirenului, cu ADN formarea unui aduct ADN
benzpiren. (adaptare dupa http://www.mun.ca/biology/scarr/benzo(a)pyrene.htm)

Animatii: repararea ADN

14
Compu i neurotoxici
sistemul nervos este foarte sensibil la efectele toxice ale substantelor chimice
exista un mare numar de neurotoxine
naturale
tetrodotoxina (de la pe tele pufaitor)
toxina botulinica (din bacteria anaeroba Clostridium botulinum)
atropina (din matraguna Atropo bello-donno)
insecticide
nicotina (din tutunul salbatic Nicotiono tobocum)
piretrina (din capitulele florale de crizantema, Chrysonthemum sp.)
sintetice
patru mari grupuri de insecticide care actioneaza asupra SN:
organocloruri, organofosfati, carbamati, piretroide.

perturba transmiterea normala a impulsului nervos

de-a lungul nervilor
prin sinapse (jonqiunile dintre nervi sau dintre terminatiile nervoase i celulele
musculare ori glandulare)
Meconisme de ocŗiune:
compu i care aqioneaza direct asupra receptori/ar sau porilor din membrana neuronilor
compu i care inhiba:
anumite canale ionice (pentru Na+, c1-) care traverseaza membrana
acetilcolinesteraza (ACE) din sinapse. 15

Mecanismul 1: interactiunea cu canalele ionice

Trecerea unui potential de aqiune de-a lungul nervului depinde de fluxul de No+ ; K+ prin
membranele neuronilor
īn timpul trecerii normale a unui potential de actiune, canalele de Na+ se deschid
pentru scurt timp, permitand occesul unui flux de No+ i'n celula
canalele se īnchid apoi, pentru a opri fluxul Na+
insecticidele piretroide, piretrinele naturale i DDT:
interactioneaza cu canalele de Na+, perturbandu-le functia
► īntarzierea īnchiderii canalelor
► prelungirea fluxului ionilor Na+ prin membrana
► perturbarea propagarii normale a potentialului de actiune
► descarcari spontane, necontrolate i repetitive de-a lungul nervilor
ca raspuns la un stimul unic, sunt generate mai multe potentiale de aqiune īn loc de
unul singur
► contractii necontrolate ale mu chilor
► epuizare energetica a organismului
16
 Piretroide, piretrinele naturale i DDT

interactiunea acestor compu i hidrofobi,

insolubili īn apa cu canalele de Na+ este
reversibila
nu pare sa implice formarea legaturilor
covalente
se dizolva mai īntai īn lipidele
membranei neuronale
apoi interactioneaza cu anumite
situsuri din canalul de Na+
transmembranar

Canal de Na+ actionat de voltaj

17

lnsecticidul y-HCH (lindan) i picrotoxina - antagoni ti ai GABA

GABA

Fructe de
y-HCH
Anamirta cocculus

receptoru! GABA (acid y-aminobutiric)

functioneaza ca un canal pentru ct- īn
membrana neuronala
actioneaza ca antagoni!}ti GABA:
insecticidele cu structura de ciclodiene
clorurate
metabolitii lor activi (ex. dieldrin, endrin,
heptaclor epoxid)
prin legare la receptor, reduc fluxul ionilor ci
la vertebrate, actioneaza asupra
receptorilor GABA din creier
► convulsii Situri sensibile ale unui receptor GABA

18
 Mecanismul 2

actiunea asupra receptorilor pentru acetilcolina

localizati īn membranele post-sinaptice
nicotina -mimetic partial (agonist) ai acetilcolinei
situs: receptorii „nicotinici" ai acetilcolinei Acid carbamic
atropina
situs: receptorii „muscarinici" ai acetilcolinei
receptorii nicotinici i muscarinici se deosebesc prin:
structura
raspuns la substante chimice toxice
localizare īn sistemul nervos; la vertebrate:
Ac. ortofosforic Carbaryl
receptorii nicotinici i organfosfati
la niveluljonctiunii neuromusculare
īn multe sinapse ale ganglionilor autonomi Animatii; inhibitia acetilcolinesterazei
receptorii muscarinici Aceticolinesteraza i efectul inhibitor ai insecticidelor
https://www.youtube.com/watch?v=-gIqZ8lxctE
īn sinapsele de la extremitatile nervilor Mecanismul de aqiune ai insecticidelor
parasimpatici organofosforice https://www.youtube.com/watch?
īn membranele mu chilor netezi i glandelor v=jfGKbbZStw Mecanismul de actiune ai
insecticidelor carbamice
https://www.youtube.com/watch?v=APtcx3 B3fA
Animation 3.4: Agonists and Antagonists - Sinauer Associates

19

lnhibitorii ACE
• unul dintre cele mai toxice grupuri de substante, atat pentru vertebrate cat i pentru nevertebrate:
organofosfati
unii au fost obtinuti ca substante toxice de lupta
multi altii au fost dezvoltati ca insecticide
carbamati cu actiune insecticidā

Mecanismul de actiune ai acetilcolinei

■ Acetilcolina (AC): mesager chimic
■ Este eliberata la capatul neuronului colinergic
■ cand un impuls ajunge la capatul unui nerv:
■ AC transporta semnalul prin spatiul sinaptic
■ spre un receptor de pe membrana post-sinaptica:
■ neuron
■ celula musculara
■ celula glandulara
■ cand acetilcolina interaqioneaza cu receptoru! sau:
■ este generat un semnal pe membrana post-sinapticā
■ impulsu! (mesajul) este transmis mai departe
■ !!!! pentru un control neuronal eficient, este esential ca semnalul sa se termine rapid
■ Acetilcolin esteraza (ACE)
■ catalizeaza hidroliza acetilcolinei eliberate īn spatiul sinaptic
20
 Functionarea normala a ACE
■ presupune īndepartarea rapida a AC din
spatiul sinaptic, sub actiunea acetilcolinesterazei
(ACE)
Mecanismul inhibarii ACE
anticolinesterazicele:
reduc sau fmpiedica scindarea acetilcolinei
acetilcolina se acumuleaza īn sinapsa:
„supra-stimularea" receptorului
generare continua de semnale
blocarea sistemului de semnalizare

Legarea unui compus organofosforic la acetlcolin

paraoxon

Otravurile mitocondriale

Mitocondriile
Catena transportoare de electroni
au rol vital īn conversia energiei sinteza ATP
mitocondriala
sunt prezente la toate eucariotele
unele dintre cele mai periculoase biocide neselective
actioneaza asupra sistemelor mitocondriale
Ex. agentii care decupleaza fosforilarea
oxidativa: 2,4-dinitrofenolul
prin membrana interna mitocondriala exista, īn mod
normai, un gradient de protoni (gradient
electrochimic)
exces de protoni la exteriorul membranei interne
deficit īn interior
mentinerea acestui gradient depinde de faptul ca
membrana mitocondriala este impermeabila la
protoni
forta matrice a sintezei mitocondriale a ATP este
energia stocata īn gradientu! de protoni
transmembranar.

22
 Agenti decuplanti

lonofori
transporta protoni prin membrana mitocondriala (ln sens invers transportului normai)
►distrug gradientu/ transmembranar de protoni
►decupleaza pomparea protonilor de sinteza ATP
► disiparea sub forma de caldura a energiei asociate cu gradientu! W
► īncetarea sintezei ATP
Inhibitori ai fosforilarii oxidative
■ Alte otravuri mitocondriale
■ ex. insecticidul noturat rotenona i ionii cN-
■ inhiba operarea catenei transportoare de electroni
■ interactioneaza cu componente ale sistemelor transportoare de electroni
► formarea gradientului de protoni este īmpiedicata

23

24
 Antagoni ti ai vitaminei K
Vitamina K

vitamīna K joaca un rol esential īn sinteza proteinelor de coagulare a sangelui, la nivelul

ficatului
sufera o serie de modificari ciclice (ciclul vitaminei K) prin care proteinele coagularii
sunt carboxilate
dupa carboxilare, proteinele de coagulare sunt eliberate īn fluxul sangvin
participa la procesu! de coagulare care are loc la lezarea unui vas de
sange
warfarina i compu ii īnruditi:
se aseamana structural cu vitamīna K
intra īn competitie cu aceasta pentru situsurile de legare, chiar la concentratii scazute
► inhibarea ciclului vitaminei K
► sinteza incompleta a proteinelor coagularii
► hemoragii Warfarina
7n cantitati mici- medicament antitrombotic
reduce riscul atacurilor de cord ?i cerebrale
1n cantitati mari-otrava (rodenticid)
provoca hemoragii masive ?i moarte

https://www.youtube.com/watch?v=nBnlwB667XY 25

lnhibitia ATPazelor

ATPazele (adenozin trifosfataze)

o familie de enzime (Na+, K+ -ATPaza, Ca2+-AīPaza, etc.)
implicate 1n transportu! ionilor
rol tn osmoreglare.
au fost investigate efectele anumitor compu i organoclorurati asupra activitatii lor
La piisiiri:
glanda salinā
permite pasarilor marine sa-?i mentina echilibrul sarurilor
functionarea sa depinde de ATPaze
oviductul
este un alt organ dependent de ATPaze
DDE- metabolit persistent ai DDT
inhibā Ca2+-AīPaza implicatā in transportu! calciului
► subtierea cojii oualor la pasari intoxicate cu DOT

-HCI
DDT DDE
26
 Perturbatori endocrini

compu i naturali sau de sinteza

modifica functionarea corecta hormonilor:
mimetism (imitare)
intensificarea actiunii hormonilor
inhibarea actiunii hormonilor
afectarea structurala a receptorului hormona!
afectarea sintezei hormonului

Bisfenol o (BFA)-utilizat la fabricarea recipientelor din

plastic de uz alimentar i a jucariilor pentru copii

27

Posibile mecanisme de actiune ale perturbatorilor endocrini

1. lnhibarea interactiunii dintre hormoni
i receptori
o substanta chimica poate modifica 4. Modificarea functiei prin interactiunea
legarea unui hormon la receptoru! sau
cu hormonu/
sunt afectate functiile celulare īn care este
interactiunea cu hormonu!
implicat hormonu!
alterarea mesajului hormona! i a functiei
2. Functionarea cafals hormon (mimarea celulare
actiunii hormonului)
5. Anomalii i deficiente datorate
se leaga la situsul receptor
sintezei defectuoase a hormonului
perturba functiile celulare
afectarea sintezei hormonilor steroizi
3. Afectarea dezvoltarii $i functiei receptori/ar
anomalii i deficiente
supresia sau activarea dezvoltarii celulelor
receptoare
modificarea activitatii hormonale normale

28
 Hormoni tiroidieni i antagoni ti

3,3A4'-tetraclorbifenil 4'-0H-3,3',4,5'
Triiodtironina T3 {3,3',4,4'-TCB) tetraclorbifhenil (TCBOH)
Tiroxina T4

Hormonii tiroidieni (T3, T4)

au efecte marcante asupra proceselor metabolice din numeroase tesuturi
TIROXINA (3,3,5,5-tetraiodtironina sau T4)
se leaga la proteina transtiretina (TTR), parte dintr-un complex de proteine
transportoare din sange
cealalta parte a complexului este o proteina la care se leaga retinalul (vitamina
A) complexul transtiretina-tiroxina
se ata eaza la proteina de legare a retinalului (RBP)
■ Antagoni ti ai tiroxinei
■ Unii metaboliti hidroxilati ai bifenilului policlorurat 3,3,'-4,4'-TCB
■ se formeaza sub aqiunea unei forme a citocromului P450 (lAl)
■ intra īn competitie eficient cu tiroxina pentru situsul sau de legare din TTR
■ se leaga foarte puternic la receptor
► tiroxina este īnlocuita i se pierde din sange;
Transtiretina
► complexul retinolului se scindeaza i retinolul se pierde din sange
► nivelurile retinolului $i tiroxinei scad 29

Hormoni steroidieni • MECANISME DE A(TIUNE $1 EFECTE

• steroizi cu rol hormona!:

- īn cantitati mici, influenteza marcant Steran • Genomice
biochimia i fiziologia organismelor • hormonii liberi trec prin membrana celulara,
- sunt liganzi pentru receptori specifici deoarece sunt solubili īn grasimi.
• TIPURI: • īn citoplasma, steroidul poate suferi sau nu
• corticosteroizi (produ i īn cortexul o modificare mediata de enzime, ca:
suprarenal) reducerea, hidroxilarea, aromatizarea.
- glucocorticoizi • apoi, steroidul se leaga de un receptor specific
- mineralocorticoizi • = receptor nuclear ( o metaloproteina de
• steroizi sexuali (de obicei, produ i īn dimensiuni mari).
gonade sau placenta). • La legarea steroizilor, multe tipuri de receptori
androgeni steroizi dimerizeaza: doua subunitati ale
estrogeni receptorilor se unesc pentru a forma o unitate
progestogeni functionala de legare a ADN-ului care poate
• derivati ai vitaminei D (au unele dintre intra īn nucleul celular.
caracteristicile hormonilor tipici). • ajuns īn nucleu, complexul ligand steroid
receptor se leaga de secvente specifice de ADN
i induce transcrierea genei vizate
Non-genomice
• includ orice mecanism care nu are un efect asupra genomului
• de i diverse, aceste mecanisme sunt mediate de un anumit tip de receptori pentru hormoni steroizi
localizat īn membrana plasmatica.
• afecteaza: Canalele ionice, transportorii, receptorii cuplati la proteina G (GPCR) i fluiditatea mem <ranei
 Estrogeni i androgeni

• perturbatorii functiilor endocrine sunt cunoscuti de mult timp

- aspect recent i controversat din perspectiva studiilor de mediu
• substanta chimica estrogenica = o substanta care poate imita estrogenii prin legare
la receptoru! pentru estrogeni
MECANISME DE ACTIUNE
legarea la receptoru! pentru estrogeni (estrogen mimetic)
stimularea transcriptiei anumitor gene
inductia proceselor controlate de estrogeni
actiunea antiestrogenica
legarea puternica la receptoru! pentru estrogen
blocarea efectelor estrogenilor endogeni
masculinizarea organismului

31

Biosinteza hormonilor sexuali

□ porne te de la colesterol:

afectarea biosintezei hormonilor sexuali are efecte asupra exprimarii fenotipice a sexului genetic (ex. hermafroditism)

32
 • Un numar considerabil de substante chimice de sinteza au efect estrogen:
unele insecticide organoclorurate uzuale, tributilSn, ftalatii i nonilfenolii.
Activitatea estrogenica a acestor compu i variaza īn limite largi.
• de ex., izomerii o,p' ai DDT i DDE sunt mult mai activi decat izopmerii p,p'.
• exista i multi estrogeni naturali.
peste 300 de plante apartinand la mai mult de 16 familii diferite contin substante cu
activitate estrogenica: izoflavonoide i cumestani
rn fungi: lactonele acidului resorcilic (ac. difidroxibenzoic)
• lnteresul pentu perturbatorii endocrini a dus la dezvoltatea unor tehnici de screening rapid, ca:
transcriptia unei gene raportor care raspunde la estrogeni īntr-o celula transfectata
producerea vitelogeninei īntr-o cultura de hepatocite de pastrav curcubeu i īn celule
recombinante de drojdie, continand gena receptorului uman pentru estrogen.
Vitellogenina (VTG), fosfolipoglicoproteina serica, precursorul galbenu$ului de ou, este un biomarker
pentru estrogenii din mediu; sta la baza unui biotest pentru detectarea expunerii la estrogeni la pe$ti
/orice vertebrat ovipar.

Recent: au fost obtinute plante transgenice indicatoare ale perturbatorilor endocrini : linii de
Arabidopsis care sintetizeaza antociani (detectabili vizual) īn prezenta bisfenolului a (BPA) sau
dihidrotestosteronului (DHT), la conc.>1-10 ppm. Pentru ca plantele se coloreaza īn rO$U tara alte
proceduri experimentale, utilizarea acestor teste nu presupune o pregatire $tiintifica de specialitate.

33

Detectarea vitelogeninei-
test de tip ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

• Kitul „ELISA Carp Vg"

functioneaza pe principiul ELISA sandwich
folosind anticorpi anti-Vg de crap $i titreaza
vitelogenina serica la crap.
Vitelogenina (Vg) este o glicolipoproteina
precursoare a galbenu$ului de ou,
detectabila serul femelelor īn
apropierea ovulatiei.
īn mod normai, Vg nu este detectabila īn
serul sangvin la masculi, dar devine
detectabia dupa tratatamentul acestora cu
17 -estradiol.

Kitul utilizeaza anticorpii anti-Vg specifici crapului, atat ca anticorpi

de captura a Vg, cat $i ca anticorpi secundari, īn format sandwich
ELISA.
Īn timpul testului, Vg de crap din probe este captata de anticorpii
imobilizati pe suprafata godeurilor de pe microplaca $i reaqioneaza
simultan cu anticorpul marcat cu peroxidaza de hrean (HRP).
Cuantificarea Vg de crap īn probe se poate face prin masurarea
activitatii peroxidazice a complexului, care variaza exponential cu
cantitatea de Vg din proba.

https://www.youtube.com/watch?v=CWkrQrqOyxQ - ELISA-principiu
 Mecanisme de perturbare a functiei endocrine

• substanta chimica mimeaza actiunea hormonului real la situsul receptor

► ,,hormoni artificiali": declan eaza reactii provocate de hormonu! real dar la sexul opus/gre it.
• inductia vitelogeninei la pe tii masculi
• vitelogenina este o proteina sintetizata in ficatul pe tilor femela i transportata la oocite pentru a
forma galbenu ul oului.
• inductia sintezei vitelogeninei are loc sub control estrogenic
- niveluri crescute ale vitelogeninei au fost detectate la pe$tii expu$i la reziduuri rezultate din tratamentul
de?eurilor menajere
- īn lagunele īn care se deversau aceste reziduuri au fost identificati pe?ti hermafroditi
• masculinizarea gasteropodelor femele
• poluantii cu activitate androgenica pat provoca masculinizarea gasteropodelor femele (imposex)
• la o specie de mele (Nucella lapillus) s-a demonstrat ca fenomenu! de imposex este initiat de
tributi/Sn in concentratii foarte mici.

• substanta chimica blocheaza situsul receptor ai hormonului.

- hormonu! nu poate reactiona cu receptoru!
- actiunea normala a hormonului este inhibata
• Exemplu: mecanismul de actiune ai tetraclordibenzodioxinei (TCDD)
- antiestrogenic cand estrogenul este prezent sau īn concentratie mare 2,3,7,8-
tetraclordibenzo[b,e][1,4]dioxina
- estrogenic atunci cand estrogenul este absent

35

lnteractiunea unor metale grele cu gruparile -SH din proteine

ionii Hg2+ i Cd2+ sunt toxici pentru multe animale

cauza: abilitatea de a se lega la gruparile tiol (-SH), impiedicand functionarea lor
normala in proteine, gruparile -SH au roluri importante
formarea puntilor disulfurice modificarea conformatiei proteinelor
este dificil de stabilit situsul actiunii toxice:
ce grupari sulfhidril?
din care proteine?
compu ii organomercurici
sunt mai lipofili decat mercurul anorganic
au distributie diferita in organisme
tind sa se deplaseze in tesuturile grase
traverseaza membranele, inclusiv bariera hematoencefalica
toxicitatea compu lor organomercurici se exprima la nivelul creierului
toxicitatea mercurului anorganic se exprima in tesuturile periferice

36
 Toxicitatea la plante
Toxicitatea asupra fotosintezei

• Anumite erbicide care au toxicitate scazuta la vertebrate sau insecte actioneaza ca otravuri
asupra fotosistemelor plantelor.
• Din aceasta categorie fac parte compu ii de tip uree substituita i triazinele (poluanti organici
persistenti).
- īntrerup fluxul electronilor prin fotosisteme, responsabil pentru reactiile dependente de
lumina ale fotosintezei, respectiv scindarea apei i eliberarea oxigenului molecular.
• Mecanism de actiune:
• Inhibitori ai fotosistemului 11
• situl actiunii: Proteina D-1 de legare a chinonei din catena transportoare de electroni fotosintetica

Triazine cu actiune erbicida

37

Erbicide reglatoare ale cre terii plantelor

• erbicidele fenoxialcanoice: MCPA, 2,4-D, CMPP i 2,4-DB 2,4-D
• au proprietati de reglatori ai cre terii plantelor
• 2,4-D actioneaza prin mimarea actiunii auxinei (hormon de cre tere a vegetal) avand
ca rezultat cre terea necontrolata i, īn cele din urma, moartea plantelor sensibile.
• este absorbit prin frunze i este translocat la meristemele plantei.
►Cre tere necontrolata, provocand curbarea tulpinii, ofilirea frunzelor i īn final moarte a
plantelor (defoliant).
■ 2,4-D se aplica de obicei ca sare de amoniu, dar exista i forme esterice mai eficiente.
- aceste erbicide au toxicitate foarte scazuta asupra vertebratelor i insectelor care, se
poate presupune, nu au receptori pentru reglarea cre terii similari celor de la plante
- toxicitatea lor la animale este corelata mai ales cu contaminarea 2,4-D cu dioxine

prin tehnici de inginerie genetica, au fost obtinute soiuri de porumb i soia rezistente la 2,4-D i glyphosate (N-(fosfonometil)glicina
Īn 2014, 90.7 millioane de hectare cu soia MG au fost plantate la nivel mondial,
Glyphosate

reprezentand
Riscul 82% suprafata
substituirii/adaugarii totala chimica
la poluarea cultivataacu soia. genetice: raspandirea
poluarii
genelor modificate la formele de viata salbatica
38
 Bibliografie

Walker, C. H., Principles of Ecotoxicology 2nd Ed., 2004, Taylor & Francis, London, UK
Kim DG, Bahmani R, Ko JH, Hwang S. A Convenient Plant-Based Detection System to Monitor Androgenic
Compound in the Environment. Plants (Basel). 2019;8(8):266. Published 2019 Aug 5.
doi:10.3390/plants8080266
Kim D, Bahmani R, Ko JH, Hwang S. Development of bisphenol A (BPA)-sensing indicator Arabidopsis
thaliana which synthesizes anthocyanin in response to BPA in leaves. Ecotoxicol Environ Saf. 2019 Apr
15;170:627-634. doi: 10.1016/j.ecoenv.2018.12.029. Epub 2018 Dec 19. PMID: 30579163
http://www.mun.ca/bio/ogy/scarr/benzo( a)pyrene.htm

https:/ / commons.wikimedia.org/wiki/File:(%E2%80%93 )-Aflatoxin_B1_StructuraI_Formulae_V.l.svg

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Acetylaminofluorene.png
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Dibenz_a_h_anthracene.png
https://www.cancerquest.org/cancer-biology/mutation
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tetrodotoxin.svg

39

Efecte fiziologice ale poluantilor

• Fiziologia studiaza procesele $i functiile organismului ca īntreg sau ale unor parti din organism.
• Tn contex fiziologic, studiul ecotoxicologic se ocupa cu descrierea efectelor deteriorante ale
poluantilor asupra fiziologiei normale.
• Poluantii afecteaza procesele fiziologice la nivel celular, de organ $i organism īntreg.
• Gama de efecte este foarte diversa, de la efecte asupra metabolismului celular pana la alterarea
comportamentul individual.
• Magnitudinea acestor efecte este influentata marcant de faptul ca, de cele mai multe ori, īn
mediu nu actioneaza un singur poluant, ei mai multi.
• Poluantii pot deteriora direct organismele individuale, cu consecinte letale, sau interferand cu
procesele de achizitie $i captare a resurselor, scazand astfel rata productiei.
• Efectul asupra populatiei este apoi cre$terea ratei mortalitatii la cel putin o clasa de varsta.
Alternativ, pot avea loc deteriorari sau efecte asupra unor sisteme i aparate: de reproducere, de
achizitie $i captare a resurselor.
• Cand capacitatea de captare a resurselor scade, au loc scaderi consecutive ale ratei natalitatii
$i/Sau cre$terii somatice (rata de productie) iar acestea scad rata de cre$tere a populatiei.
Organismele pot evita sau limita deteriorarile prin utilizarea mecanismelor de detoxificare (ex.
inductia monooxigenazelor) sau repararea (ex. mecanisme de reparare a ADN).
• Mecanismele de detoxificare sunt consumatoare de resurse, inclusiv energie, $i, īn consecinta,
aceste resurse nu vor mai fi disponibile pentru productie. Astfel, este probabil ca productivitatea
sa scada atunci cand are loc detoxificarea. Atat deteriorarea cat $i detoxificarea organismelor pot
conduce la scaderea productiei īntr-un mediu poluat.
 Efecte la nivel celular
• Cand un poluant intra īntr-o celula, poate declan$a anumite raspunsuri biochimice care au
evoluat pentru a metaboliza sbstanta chimica sau pentru a o depozita īntr-un compartiment
celular, īmpiedicand interferenta ei cu reactii biochimice esentiale din celula.

Efectele la nivel de organ

• Cand poluantii sunt ingerati de un organism sau trec in sange prin epiteliul respirator ori
prin suprafata externa a corpului, ei pot fi compartimentalizati in anumite organe din corp.
• Compatimentalizarea poate avea loc accidental sau deliberat; :
• izotopii radioactivi ai elementelor esentiale se vor deplasa spre acelea i locatii tisulare ca
i izotopii neradiaoctivi corespunzatori.
• de exemplu, iodul radioactiv se acumuleaza īn glanda tiroida a mamiferelor i poate
cauza cancer tiroidian.
• Cadmiul se acumuleaza īn ficatul i rinichii mamiferelor.
• Simptom ai otravirii cu cadmiu: proteinuria - rezultat ai deteriorarii celulelor renale, atunci
cand cadmiul depa e te o concentratie critica, acest concept fiind foarte important īn
ecotoxicologie.

Efecte asupra organismului ca īntreg

• Efectele poluantilor asupra īntregului organism pat fi abordate sub trei directii principale:
neurofiziologice, comportamentale $i reproductive.
• Aceste efecte sunt adesea corelate: modificarile neurologice afecteaza comportamentul,
cele comportamentale afecteaza reproducerea $i a$a mai departe.

Biomarkeri
• Biomonitorizare: masurarea raspunsurilor biologice aparute ca urmare a actiunii toxice
a unor substante la nivel celular, individual, populational sau ai comunitatii.
• Studiile ecotoxicologice au menirea de a stabili o legatura īntre concentratia
substantelor chimice īn mediu i raspunsul obtinut īn organismu! viu.
• Aceste raspunsuri specijice ale organismelor pot fi folosite ca indicatori ai expunerii la
o anumita substanta chimica $i contribuie la evaluarea starii de sanatate a
ecosistemului

• Biomarkeri: raspunsuri biologice la niveluri inferioare de organizare (biochimice,

fiziologice, histologice, morfologice sau comportamentale) care ofera dovezi ale expunerii
organismelor la factorii de stres i sunt utilizati la indicarea timpurie a problemelor de
sanatate ale organismului.

• Bioindicatori: raspunsuri biologice pe termen lung $i la un nivel superior de organizare

(indivizi, populatii, comunitati) la factorii de stress, cu relevanta ecologica mai mare decat
biomarkerii.
• Studiile privind biomarkerii biochimici sunt efectuate, de regula, cu organisme expuse la
anumite substante toxice, i'n conditii de laborator controlate.
• Studiile de laborator pat ajuta la stabilirea unei relatii cauza-efect, aplicabila pentru a estima
efectele contaminantilor specifici mediului evaluat.
 Tipuri de biomarkeri
• cea mai utilizata clasificare: 3 categorii de biomarkeri:
• Biomarkeri de expunere
Exemple: sinteza metalotioneinelor, inhibarea acetilcolinesterazei, proteinele de oc
termic, .a.
numiti i biomarkeri ai dozei interne
indica expunerea organismului la substante chimice dar nu ofera informatii asupra
efectelor adverse pe care acestea le genereaza.
masoara cantitatea de xenobiotic exogen sau metaboliti specifici ai acestuia īn celule,
tesuturi sau fluidele organismului.
• Biomarkeri de efect (toxic)
- numiti i biomarkeri ai dozei biologice
- demonstreaza un efect advers asupra organismului īnsa nu au specificitate de substanta.
• Biomarkeri ai susceptibilitātii
numiti i biomarkeri ai raspunsului biologic
indicatori ai caracteristicilor naturale ale unui organism care īl fac mai sensibil
la efectele expunerii la o substanta chimica.

Specificitatea biomarkerilor

• variaza de la strict specifici la nespecifici

• ambele categorii sunt importante pentru evaluarea riscului pentru mediu
• Exemplu de biomarker specific: inhibarea enzimei acetilcolinesteraza (ACE)
- catalizeaza hidroliza acetilcolinei, un neurotransmiļator
• lnhibitorii acetilcolinesterazei:
carbamaļii, compu ii organofosforici, sarurile cuaternare i terļiare de
amoniu
au rol important īn manipularea farmacologica a activitaļii enzimei.
aplicabilitate īn diagnosticarea/tratamentul diferitelor boli (Alzheimer,
glaucom, ca antidot īn supradozarea anticolinergica)
• Exemplu de biomarker nespecific: inducļia monooxigenazei
cauzata o mare varietate de produse chimice
deseori, un indicator sensibil ai prezentei poluantilor.
de i ofera putine informatii cu privire la cauza particulara, este un indiciu util
ca organismele sunt afectate de poluanti.
 Utilitatea biomarkerilor

• pentru a provoca un efect detectabil, poluantii trebuie sa fie prezenti

la un nivel destul de īnalt
• īn acest sens, biomarkerul este util pentru a initia studii suplimentare
• pentru a anticipa ?i sustine costurile unei actiuni de remediere, este
util ca nivelul modificarii raspunsului biologic masurat sa poata fi
corelat cu efectele adverse pe care le provoaca.
• Īn unele cazuri, este posibila definirea unui nivel critic ai
modificarii raspunsului biologic; de exemplu:
- s-a observat la o diversitate de specii ca subtierea cojii oualor la 16-18%
din populatie este asociata cu declinul acesteia.
- alteori, o astfel de relatie nu este dara, ceea ce nu invalideaza utilitatea acelui
biomarker.
• Īn alte cazuri, cum ar fi inductia metalotioneinei,:
- schimbarea fiziologica este un mecanism de protectie
- cunoa terea gradului de inductie a sa este utila pentru a evalua riscul la nivel
individual

Biomarkeri utilizati īn studiile de risc pentru mediu

 • DIABLO (direct /AP binding protein with low pl) sau: SMAC (second mitochondria-derived
activator of caspases); IAP- inhibitor of apoptosis proteins Omologul Diablo (DIABLO) este o
proteīna mitocondriala, codificata la om de gena DIABLO (proteīna directa de legare IAP cu pl
scazut), de pe cromozomul 12. DIABLO este, de asemenea, denumit ai doilea activator ai
caspazelor derivat din mitocondrie (SMAC).
• Aceasta proteina leaga inhibitoru! proteinelor apoptozei (IAP), eliberand astfel caspazele pentru a
activa apoptoza. Datorita functiei sale proapoptotice, SMAC este implicat īntr-un spectru larg
de tu mori, iar molecule mici (~1 nm) care mimeaza activitatea SMAC au fost dezvoltate pentru
a
cre te eficienta tratamentele actuale pentru cancer.
• Necroza vs. Apoptoza-animatie: https://www.youtube.com/watch?v=zFrBwGfOQs0
• Micronucleu - nucleu de dimensiuni mici care se formeaza ori de cate ori un cromozom sau un
fragment de cromozom nu este īncorporatīntr-unul din nucelii fii, īn timpul diviziunii celulare. De
obicei, semnaleaza evenimente genotoxice i instabilitate cromozomiala.
• Micronucleii sunt frecvent observati īn celulele canceroase i pot indica evenimente de deteriorare
genomica, ce pot cre te riscul maladiilor de dezvoltare sau degenerative. Au fost dezvoltate multe
teste pentru micronuclei pentru a evalua prezenta i frecventa acestor structuri īn celulele expuse
anumitor substance chimice sau supuse unor conditii stresante.

Testul pentru micronuclei este recunoscut ca fiind unul dintre cele

mai de succes 9i de īncredere teste pentru agentii cancerigeni
genotoxici ( carcinogenii care actioneazā provocand deteriorāri
genetice) 9i este recomandat de ghidul OECD (Organisation for
Economic Co-operation and Development) pentru testarea
substantelor chimice

Micronuclei (B, C) and nuclear abnormalities (A, D) in peripheral

blood erythrocytes of penguins Pygoscelis papua.
Autor: Faustus1983:
https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus_test

• Bibliografie-biomarkeri
• Walker, C. H., Principles of Ecotoxicology 2nd Ed., 2004, Taylor & Francis, London, UK
• De Khaled Abdel-Halim Y. Biomarkers in Ecotoxicological Research Trails. J Forensic Sci Toxicol.
2018; 1(1): 1005.
• https://en.wikipedia.org/wiki/Diablo_homolog
• https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus
• https://en.wikipedia.org/wiki/Micronucleus_test

Coronavirus- videoclipuri
https://www.youtube.com/watch?v=37B1zyRSlrk SARS Cov2 lifecycle
https://www.youtube.com/watch?v=-E_Okc_Fp3w replicare SARS Cov; farmmacologie

https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4 RT-PCR test for coronavirus

https://www.youtube.com/watch?v=g1Tw0a_eyl4 ciclul de viata _PDB

48
 CURS 7 ECOTOXICOLOGIE Testarea toxicitat,ii
Principii generale
• De importanta centrala i'n toxicologie i ecotoxicologie: relatia dintre cantitatea de substanta chimica
la care un organism este expus i natura i intensitatea efectelor nocive (toxice) produse.
• Relatia doza-raspuns furnizeaza baza pentru evaluarea pericolului i riscului reprezentat
de substantele toxice din mediu.
• efectul depinde de doza
• Paracelsus (1493-1541) :,,Toate substantele sunt otravuri; nu exista niciuna care sanu fie otrava.
Doza corecta diferentiaza o otrava de un remediu" -sau, cu alte cuvinte, ,,doza face otrava".
► nicio substanta chimica nu este toxica daca doza este īndeajuns de mica
► toate substantele chimice sunt toxice daca doza este destul de mare (chiar substantele īn
aparenta netoxice, ca sarea i zaharul, pat fi toxice la animale īn doze mari).
• Masurarea toxicitatii se poate realiza urmarind diferite efecte H puncte finale
• toxicitatea letala: determinarea dozei letale a substantelor chimice a tost mult utilizata īn trecut;
• īn prezent, exista o tendinta īn cre tere de a minimiza testarea toxicitatii letale la animale vertebrate
i a utiliza indicatori mai sofisticati.
• efectele biochimice, fiziologice, reproductive sau comportamentale pat sa ofere informatii cantitative
privind toxicitatea
Īn atara de testele de toxicitate care implica utilizarea animalelor vii, sunt i alte moduri de evaluare a proprietatilor toxice ale
De exemplu, testul de mutagenicitate la bacterii (ex. testu/ Ames) ajuta la identificarea substantelor care pat functiona ca m

• Testul Ames utilizeaza mai multe tulpini ale bacteriei Salmonella typhimurium care poarta mutatii īn
genele implicate īn sinteza histidinei. Aceste tulpini sunt mutante auxotrofe, adica necesita histidina pentru
cre?tere dar nu o pot produce. Metoda testeaza capacitatea unei substantei de a produce mutatii care
readuc bacteria la o stare „prototrofica", astfel īncat sa poata cre?te pe un mediu fara histidina.
• Tulpinile utilizate īn test sunt special construite pentru a detecta mutatii ale cadrului de citire (de exemplu
tulpinile TA-1537 ?i TA-1538) sau mutatii punctiforme (de exemplu tulpina TA-1531) īn genele necesare
sintetizarii histidinei, astfel īncat sa poata fi identificati mutageni care actioneaza prin diferite mecanisme.
Unii compu?i sunt destul de specifici, provocand reversii īn doar una sau doua tulpini.
• Tulpinile testate au, de asemenea, mutatii īn genele responsabile de sinteza lipopolizaharidelor, facand
peretele celular bacterian mai permeabil, precum i īn sistemul de reparare (a ADN) prin excizie, pentru a
face testul mai sensibil.
• Organismele superioare, cum ar fi mamiferele, au procese metabolice prin care o substanta care nu este
mutagena ar putea fi transforma īntr-una mutagena sau invers. Prin urmare, pentru a testa mai eficient
mutagenitatea unui compus chimic īn raport cu organismele superioare, se pot adauga enzime hepatice de
?obolan, īn īncercarea de a reproduce efectul proceselor metabolice asupra compusului testat prin testul
Ames. Extractul de ficat de ?obolan este adaugat optional, pentru a simula efectul metabolismului, deoarece
unii compu i, cum ar fi benzo [a] pirenul, nu sunt ei īn?i?i mutageni, dar produ?ii lor metabolici sunt.

Bacteriile sunt distribuite pe o un mediu continand o

cantitate mica de histidina. Aceasta cantitate mica de
histidina din mediul de cre?tere permite bacteriilor sa
creasca pentru o durata initiala scurta ?i sa aiba
posibilitatea de a suferi mutatii.
Cand histidina este epuizata, vor supravietui doar
bacteriile care au suferit mutatii prin care ?i-au
redobandit capacitatea de a- i produce propria
histidina. Placa este incubata timp de 48 de ore.
Mutagenitatea unei substante este proportionala cu
numarul de colonii observate.

https://en.wikipedia.org/wiki/ Ames_test
 Terminologie
• Pentru un test avand ca punct final moartea, DL50 reprezinta concentratia letala mediana (care
produce efect la jumatate din populatia testata)
• Alti parametri/indicatori ai toxicitaW
• NOED (no observed effect dose)-doza cea mai mare la care nu se observa niciun efect toxic
• NOEC (no observed effect concentration)-concentratia cea mai mare la care nu se observa niciun efect
toxic
• LOED (/owest observed effect dose)-doza cea mai mica la care se observa un efect toxic)
• LOEC (/owest observed effect concentration)-concentratia cea mai mica la care se observa un
efect toxic
• Daca se efectueaza un test in care punctul final este un raspuns advers altul decat moartea, atunci
se determina CE50 sau DE50 (concentratia sau doza care produce efectul advers la 50% din
populatie).
• Valorile NOED (NOEC) pat fi determinate doar in situatii in care o doza sau o concentratie mai mare
a produs un efect, in acela i test de toxicitate (indiferent de punctul final ai testului).

Toxicitatea letala dupa 96 ore de expunere, īntr-un test de toxicitate acvatica. NOEC poat
Dupa Walker, 2004, fig 6.1

Relatiile dintre structura i toxicitatea substantelor chimice

• Studiile cantitative structura-activitate (QSAR: quantitative structure-activity relationships):
• au devenit mai utile pe masura ce mecanismele moleculare ale toxicitatii au fost elucidate;
• pat conduce la īntelegerea caracteristicilor moleculare care fac ca o substanta chimica
sa produca interactiuni adverse cu macromolecule celulare
► identificarea moleculelor toxice.

• Eficienta captarii unei substante toxice -?; grodu/ de toxicitate difera fn functie de ruta
• La selectarea rutei de administrare a substantelor toxice in testele de toxicitate, trebuie avute in
vedere rutele majore de captare in natura.
■ La animale terestre: se obi nuie te aplicarea unei doze unice, oral sau to pie (ex. aplicata
pe piele sau cuticula) sau prin injectare in tesuturile sau fluidele corpului.
■ La animalele din sol: se poate efectua expunerea la o concentratie constanta a
substantei chimice in hrana, aer sau sol.
■ La organismele acvatice, predomina captarea directa din apa sau hrana, iar testarea
toxicitatii consta de obicei expunerea continua la concentratii definite in locul administrarii
unei doze unice.
• Īntre grupurile de organisme i intre specii pat exista diferente foarte mari sub aspectul
susceptibilitatii la actiunea toxica a substantelor;
• pat fi, de asemenea, diferente foarte mari intre subspecii/ tulpini ale aceleia i specii; de
exemplu, in cazul insectelor care au devenit rezistente la insecticide.
 Toxicitatea selectiva
• Raportu! toxicitatii selective (RTS; SER, selective toxicity ratio) se exprima īn termeni ai dozei
letale mediane (DML) astfel:

• De ex., la evaluarea sigurantei pesticidelor pentru mediu, se ia īn considerare

raportu! selectivitatii īntre organismele utile i daunatori
• Selectivitatea substantelor chimice face i mai dificila extrapolarea datelor de toxicitate de la o
specie la alta.
► din ratiuni practice, este posibila efectuarea testelor de toxicitate doar pe un numar limitat
de
specii.
► testele de toxicitate se efectueaza foarte rar asupra acelor specii care sunt considerate a fi la
risc pe teren
► cand autoritatile de reglementare iau decizii cu privire la eliberarea substantelor chimice īn
mediu, deciziile lor se bazeaza pe datele testelor de toxicitate obtinute cu specii surogat,
care pat fi foarte diferite de speciile de pe teren sub aspectul susceptibilitatii la anumite
substante chimice.
• Īntelegerea mecanismelor responsabile pentru toxicitate faciliteaza comparatiile īntre specii i
poate ajuta la dezvoltarea modele/ar predictive de toxicitate la specii individuale.
• Datele obtinute prin studii in vitro pat contribui la aceste modele:
► de ex. constantele vitezelor metabolice pat fi utilizate pentru modele care estimeaza
concentratiile tisulare i timpul de Īnjumatatire ai substantelor organice.
• Testele cu specii multiple reprezinta o abordare mai sofisticata a testarii ecotoxicitatii decat
cele cu o singura specie; de exemplu, teste utilizand un sistem simplu pradator-prada;
• rezultatele sunt dificil de corelat cu conditiile de pe teren.

Determinarea toxicitatii amestecurilor

• Majoritatea testelor de toxicitate se efectueaza cu un singur compus.
• astfel de teste reprezinta o parte necesara a evaluarii riscului de mediu, īn
cazul pesticidelor i a unei game largi de substante chimice industriale.
• uneori testele se efectueaza cu probe de substante relativ pure.
• Materialele testate contin adesea cantitati apreciabile din alti compu i.
• Īn cazul pesticidelor, de exemplu, produsul tehnic utilizat īn formulari poate contine
cantitati apreciabile de produ i secundari ai procesului de fabricatie.
• unde exemplu de trista celebritate este Agentul Orange, erbicid i defoliant contaminat cu
dioxina
• formularile comercializate contin cantitati apreciabile de aditivi: solventi purtatori, emulsifianti
i stabilizatori care pat influenta raspunsul toxic.
• Īn evaluarea riscului de mediu, daca se dore te o evaluare obiectiva a impactului toxic, trebuie
efectuate teste cu produsul eliberat i'n realitate i'n mediu.
• de i toxicitatea este de obicei aditiva, exista posibilitatea potentierii toxicitatii cand
animalele sau plantele sunt expuse la amestecuri;
• toxicitatea amestecurilor poate depa i cu mult suma toxicitatilor componentelor sale
chimice.
• Testele efectuate cu probe din mediu (de ex. apa, sediment, sol i aer) pat masura
toxicitatea amestecurilor.
• Daca acestea sunt īnsotite de analize chimice, toxicitatea masurata poate fi uneori comparata
cu toxicitatea anticipata pe baza reziduurilor de substante detectate
► se calculeaza toxicitatile substantelor chimice individuale determinate prin analīze i sunt apoi
subsumate pentru a face predictii privind toxicitatea īntregului amestec
 Deseori, toxicitatea masurata difera marcant de cea predictionata.
CAUZE POSIBILE:
efectele de potentiere sau antagonism ale substantelor din amestec;
ignorarea prezentei unor molecule toxice;

biodisponibilitatea.
corelarea analizei chimice cu toxicitatea este relativ U$Oara cand numai un numar mic de substante prezinta toxicitate

Testarea toxicitatii cu organisme terestre

• poate parea mai simpla decat in cazul organismelor acvatice, intrucat ia in considerare
o singura ruta de expunere, cea intestinala.
• de$i a$a stau lucrurile cu testele pe $0areci $i $Obolani, nu la fel se intampla $i in cazul
testelor cu nevertebrate, la care $i ruta de expunere prin mediul extern (aer, sol) este
importanta.
• Principalele teste toxicologice cu relevanta pentru mediu se efectueaza cu:
• animale nevertebrate (colembola, rame, albine) i vertebrate
• plante

• Cand rezultatele testelor de toxicitate utilizand soluri de laborator sunt comparate cu cele pe
soluri naturale, aduse de pe teren, se observa ca substantele chimice sunt mult mai
biodisponibile pentru organismele din sol in mediile artificiale.
• Ratele de acumulare tind sa tie relativ mari in soluri cu pH scazut $i continut scazut de materie
organica, in timp ce solurile artificiale au un contint mai scazut de materie organica decat multe
soluri naturale, iar argila utilizata are o capacitate de schimb cationic relativ scazuta.

• De aceea, in termeni ai protectiei mediului, testele contin un factor de siguranta intrinsec, aspect
care trebuie avut in vedere cand rezultatele testelor de laborator sunt extrapolate la conditiile de
pe teren.

Teste cu vertebrate
• Toxicitatea substantelor chimice asupra mamiferelor, pasarilor $i altor vertebrate
este masurata de obicei ca doza letala medie (LD50).
• Proceedeele de acest fel sunt descrise in detaliu in multe teste standard (OECD Guidelines
for Testing Chemicals).
• Īn testele de toxicitate de rutina, se administreaza oral o singura doza, pentru a obtine o
estimare a LD50 orale acute.
• Īn acest scop, grupurilor de animale li se administreaza anumite doze din substantele
chimice testate, pe un domeniu ai valorilor centrat pe o estimare grosiera a LD50, obtinuta
dintr-o serie de teste preliminare.
• Procentu! de animale care mor in fiecare grup, intr-un interval fix de timp consecutiv dozarii,
este apoi reprezentat in functie de logaritmu! dozei (mg kg-1).
• Substantele chimice pat fi injectate in sange, mu$chi sauin cavitatea peritoneala, sau pat fi
alicate direct pe piele (LD50 dermica). Uneori se administreaza continuu in hrana sau in apa
pe o durata de timp satbilita. Īn acest caz, toxicitatea se exprima ca $i concentratie letala
medie in hrana sau apa pe o durata de timp data, de ex. LC50_orala pentru 5 zile.
• La pasari, se efectueaza adesea teste de toxicitate reproductiva. Scopul/punctul finalpoate
fi: eclozabilitatea oualor, grosimea cojii oualor, toxicitatea embrionara, viabilitatea puilor
(www.oecd-ilibrary.org).
• Prin aceste teste de toxicitate este posibila stabilirea valorilor pentru doza/concentratia la
care nu se observa niciun efect (NOED; NOEC).
• Īn prezent, se manifesta tendinta de renuntare la testele de determinare a LD50 din
considerente etice.
 Teste cu plante
• Au fost dezvoltate o gama larga de metode de evaluare a toxicitatii substantelor chimice
asupra plantelor.
• Cele mai importante s-au concentrat asupra testarii toxicitatii metalelor la plante.
• Principiile de baza ale acestor teste sunt aplicabile i altor substante chimice, ca i īn testele
care se evalueaza efectele ploii acide i poluantilor gazo i.
• Plantele care īn mod natural contin o concentratie foarte mare de metale se numesc metalofite
• Unele metalofite sunt capabile sa creasca natural pe soluri contaminate cu metale.
• Altele, nemetalofite, au dezvoltat soiuri genetic distincte care sunt rezistente la metale i sunt
capabile sa creasca mult mai bine īn situatii contaminate decat plantele nerezistente ale aceleia
i specii.
• Plantele rezistente pot cre te, de asemenea, cu mai mult succes īn conditiile sarace īn
nutrienti care exista adesea īn de eurile miniere acide.
• A existat un interes considerabil de a utiliza plante tolerante pentru a revegeta siturile miniere
vechi.
• Gradul de toleranta la metale este masurat prin compararea raspunsului cu cel ai
plantelor tolerante (din siturile contaminate) i se exprima ca procent de performanta a
plantelor netolerante (colectate de pe suprafetele necontaminate).
• Princialii parametri masurati sunt: supravietuirea rasadurilor (plantelor tinere), biomasa,
cre terea tulpinii i radacinii.
• Supravietuire plantelor tinere reprezinta numarul de plante care supravietuiesc din seminte dupa
o perioada specificata de timp.
• este o masura mai buna decat simpla evaluare a germinarii.
• multe plante sensibile vor germina cu succes īn soluri contaminate cu metale dar ulterior
vor e ua sa creasca i vor prezenta atrofie caracteristica.

• Ratele de producere a substantei uscate $i productia de biomasa la plantele rezistente

sunt, de obicei, mai scazute decat la corespondentele lor nerezistente cand sunt crescute
pe soluri necontaminate.
• Aceasta diminuare se datoreaza cheltuielilor energetice cu mecanismele de toleranta la
metale, cum ar fi compartimentalizarea intracelulara a metalelor. la cre$terea pe
soluri sau solutii de nutrienti contaminate, cre$terea plantelor rezistente o depa$e$te pe
cea a plantelor nerezistente.
• Alte modalitati de a masura aceste diferente sunt lungimea tulpinii i a radacinii.
• lungimea tulpinii poate fi comparata la plantele crescute pe soluri
• masurarea diferentelor privind lungimea radacinii este mult mai simpla la plantele
crescute pe solutii de nutrienti īn containere transparente.
• monitorizarea regulata a lungimii radacinii se poate realiza tara a deranja plantele
• permite controlul strict ai compozitiei mediului lichid.
• Efectele deteriorante asupra plantelor ale poluantilor gazo$i, ca ozonul pot fi detectate
prin metode suplimentare celor prezentate deja.
• Īngalbenirea frunzelor (cloroza) este o trasatura caracteristica a stresului.
• Gradul de cloroza poate fi masurat prin numarul de frunze afectate sau sau prin
determinarea suprafetei frunzei care prezinta coloratia galbena
• Diferite vaietati ale aceleia i specii pot prezenta diferite grade de cloroza la aceea i concentratie
a substantei chimice i pot fi utile pentru monitorizarea biologica a poluarii.
 Testarea toxicitatii cu organisme acvatice
• Principii: similare celor descrise pentru organismele terestre
• aspectele particulare: vizeaza rutele de captare a substantelor toxice.
• Rute de captare directa a substantelor toxice:
• din apa : prin branhii la pe$ti $i prin pielea permeabila la amfibieni
• din hrana, la trecerea ei prin sistemul digestiv.
• lmportanta relativa a rutelor de captare difera de la un organism la altul
• $i de la O substanta chimica la alta, depinzand $i de conditiile de mediu. CL50 pe durata expunerii la xenobiotice
2004
Testele de absorbtie directa din apa (dupa Walker CH,
69
,Fig. - -)

• Aceasta categorie prevaleaza in cazul organismelor acvatice (la pe$ti, Daphnia, Gammarus).
• Vizeaza absorbtia directa a substantelor chimice din apa, aflate in solutie sau in suspensie.
• Pentru a determina valorile CL50, organismele sunt expuse la diferite concentratii de substante
chimice; captarea concomitenta prin hrana nu poate fi ignorata.
• 0 problema a acestor teste: dificultatea mentinerii constante a concentatiei substantei toxice, care
poate diminua din cauze ca: absorbtia $i metabolizarea de catre organismele test, volatilizarea $i
degradarea.
• Exista sisteme statice, semistatice saucu flux continuu de administrare a substantelor toxice.
• Cand durata expunerii este sufucient de lunga, in tesuturile organismelor expuse se va atinge o
concentratie stationara.
Efectele toxice depind de concentratia substantei īn tesuturile unde sunt localizate situsuri de aqiune ale acesteia.
• Concetratiile tisulare depind, la randul lor, de concentratia substantei toxice īn apa $i de durata expunerii.
• Crescand timpul de expunere, CL50 va scadea pana cand este atinsa valoarea prag a concentratiei letale medii
Store stationarii: cre$terea duratei de expunere nu va mai determina cre$terea mortalitatii (conc. tisulare)

Stabilirea domeniului de concentratie pentru efecturea testelor

• La realizarea testelor cu organisme acvatice, pentru a obtine o estimare grosiera a toxicitatii
sunt necesare teste preliminare de determinare a domeniului de concentratie
• Īn testele preliminare, grupuri mici de organisme test (2-3 indivizi /grup) sunt expuse la o
gama larga de concetratii ale substantei chimice testate, pe o scala logaritmica.
• Rezultatele obtinute pot fi folosite pentru a planificaun test de toxicitate complet, in care un
numar mai mare de animale test sunt expuse la un domeniu mai ingust ai concentratiilor, centrat
pe estimarea CL50.
• La diferite intervale de timp, se inregistreaza procentu! de mortalitate in fiecare grup test, iar
datele obtinute pot fi utilizate pentru a determina dependenta CL50 de durata expunerii:
• Cond expunerea ore loc Ja o concentratie fixa, se reprezinta procentu! de supravietuire ai probei
la diferite durate de expunere; se repeta pentru fiecare concentratie $i se obtin valorile duratei
medii de supravietuire (timp mediu de raspuns)

■ Cond expunerea se realizeaza pentru un timp fix,

procentu! de mortalitate poate fi corelat cu
concentratia la care are loc expunerea;
► se poate calcula concentratia letala medie
pentru fiecare timp de expunere
• Timpul mediu de supravietuire $i concentratia
medie letala pot fi corelate cu durata expunerii
► se pot calcula valori ale CL50 particularizate
pentru anumite durate de expunere.

Determinarea LC50 (dupa Walker CH, 2004, Figura 6.10

 Testarea toxicitatii sedimentelor

• Sedimentele reprezinta o sursa importanta de poluanti pentru organismele acvatice.

• Poluantii organici lipofili i unele metale sunt puternic retinute de sedimente, īn care au
timpi de īnjumatatire mari.
• Toxicitatea substantelor chimice asociate cu sedimentele este dificil de evaluat pentru
ca nu se poate ticu certitudine cat anume din īntreaga cantitate de substanta este
disponibila organismelor vii.
• Moleculele adsorbite puternic care exista īn concentratii scazute īn apa pat fi absorbite
direct de animalele acvatice la trecerea particulelor de sediment prin tractul alimentar sau
prin suprafetele respiratorii.
• Perfectionarea testelor de toxicitate a sedimentelor este un obiectiv de interes curent.

• Efectul Ietai ai xenobioticelor nu este totdeauna punctul final ai testelor de toxicitate.

• Concentratia medie efectiva (CE50) poate fi determinata pentru o diversitate de puncte finale
neletale.
• Efectul toxic ai unei substante chimice depinde marcant de durata expunerii,
• doua aspecte importante trebuie luate ,n considerare Ja elaborarea testelor:
• (i) care trebuie sa tie durata unui test de toxicitate
• (ii) ce durate ale perioadei de expunere trebuie alese pentru a estima CE50 sau CL50.
• aceste variabile trebuie alese īn functie de:
• substanta testata
• organismu! expus
• scopul testului.

• De exemplu:
• cand se dore te o clasificare/ierarhizare a unui grup de substante īn raport cu efectul lor toxic:
• durata testelor va fi scurta (de ex., LC50 la 48 h pentru Daphnia i LC50 la 96 h).
• cand datele de toxicitate sunt necesare pentru a evalua calitatea apei:
• sunt necesare perioade de expunere mai lungi, pana la stabilirea unei concentratii
medii prag.
► Valorile obtinute īn testele de toxicitate acvatica sunt influentate, pe langa proprietatile
intrinseci ale organismului test i substantei testate, de biodisponibilitatea sa.

• Toxicitatea acvatica se determina cu organisme reprezentand cele trei niveluri trofice:

• alge sau plante H„producatori primari"
• nevertebrate (de exemplu, crustacee precum Daphnia spp.), H „consumatori primari /
producatori secundari"
• vertebrate (de obicei pe ti), H „consumatori secundari"

ttp oe .or emica estin ec gui e in rt etesting emi

s cals.htm#Test_Guidelines
 Ghiduri OECD de testare a substantelor chimice
http://www.oecd.org/ chemicalsafety/testing/oecdguideIinesforthetesti ngofchemicals.htm#Test_Guide!ine

• reprezinta un instrument de evaluare a efectelor potentiale ale substantelor chimice asupra

sanatatii umane $i a mediului.
• Structurate 7n cinci sectiuni:
• 1. Proprietati fizico-chimice;
• 2. Efecte asupra sistemelor biotice;
• 3. Soarta $i comportarea 7n mediu;
• 4. Efecte asupra sanatatii
• 5. Alte instructiunide testare.
• Acceptate la nivel international ca metode standard pentru testarea sigurantei, acestea sunt
utilizate de profesioni$tii din industrie, mediul academic $i guvernamental implicat 7n testarea
$i evaluarea substantelor chimice (produse chimice industriale, pesticide, produse de 7ngrijire
personala etc.).
• Aceste ghiduri sunt continuu extinse $i actualizate, pentru a se asigura ca reflecta $tiinta $i
tehnicile de ultima generatie pentru a satisface nevoile de reglementare ale tarilor membre.
• Liniile directoare sunt elaborate cu asistenta expertilor de la agentiile de reglementare, mediul
academic, industria, organizatiile de protectie a mediului $i de bunastare a animalelor.
• Orientarile OECD privind testarea sunt acoperite de Sistemul OCDE de acceptare reciproca
a datelor (MAD- Mutual Acceptance of Data ).
• Īn cadrul acestui sistem, rezultatele testelor de laborator legate de siguranta substantelor
chimice, generate īn conformitate cu Orientarile OECD privind testarea $i principiile OECD de
bune practici de laborator (OECD Test Guidelines and OECD Princip/es of Good Laboratory
Practices ), sunt acceptate īn toate tarile OCDE $i tarile aderente 7n scopul evaluarii sigurantei
$i a altor utilizari legate de protectia sanatatii umane $i a mediului.

Exemple de teste OECD standardizate

TESTUL NR. 201 Test de inhibare a cre$terii la alge $i cianobacterii.

• Algele: producatorii primari īn ecosistemele de apa dulce i marine; aflate la baza lantului trofic acvatic.
• Organismele erbivore depind direct de alge ca nutritie dar i consumatorii de ordin superior sunt afectati.
► Necesitatea evaluarii posibilelor efecte toxice asupra cre terii algelor pentru: produsele de protectie a

plantelor,
biocide, substante chimice industriale $i medicamente de uz uman $i veterinar care pot ajunge īn mediul acvatic.

• Algele sunt foarte sensibile la xenobiotice

• Scopul testului: determinarea efectelor unei substante chimice asupra unei polpulatii de alge aflate īn cre
tere exponentiala, īntr-un mediu īmbogatit cu nutrienti, timp de 72 sau 96 h.
• Densitatea celulelor se determina printr-o metoda directa de masurare (numarare la microscop) sau indirect
(ex. spectrofotometric).
• Factorii experimentali controlati sunt: densitatea celu/ara initia/6, temperatura, pH-ul, calitatea $i
intensitatea lumninii.
• De obicei, se calculeaza o valoare CE50 i NOEC pe baza inhibitiei cre terii.
• Valoarea CE50 reprezinta concentratia substantei test care produce o reducere cu 50% a parametrului evaluat.
• Specia test utilizata cel mai frecvent este cocoidul verde de apa curgatoare Selenastrum capricornutum, dar
au fost utilizate i cel putin 10 alte specii.
► variatia interspecifica a raspunsului la substantele chimice este semnificativa iar validarea pe teren a majoritatii
rezultatelor obtinute īn laborator lipse te
► Sunt necesare teste simultane pe specii multiple, pentru a evalua toxicitatile relative ai diferitelor

substante
chimice la diferite specii
 TESTUL NR. 202: Test de imobilizare acuta cu Daphnia magna
• este testul acvatic de baza ai OECD pentru substante toxice, medicamente $i alti poluanti.
• Daphnia magna este un mic crustaceu planctonic (lungimea adultului 1,5-5,0 mm). Este utilizata īn mod obi$nuit īn
testarea toxicitatii acvatice, deoarece este U$Or $i economic de crescut īn laborator: are dimensiuni mici, ciclu de
viata scurt, fecunditate ridicata $i reproducere partenogenetica-asexuata; se hrane$te cu microalge: Chlorella sau
Scenedesmus.
• Testul utilizeaza dafnii cu varsta mai mica de 24 de ore la īnceputul testului. Acestea sunt expuse la substanta de
testat pe un interval de concentratii (cel putin cinci concentratii) timp de 48 de ore.
• La fiecare concentratie testata $i pentru controale, se utilizeaza cel putin 20 de organisme, de preferinta īmpartite
īn patru grupe a cate cinci indivizi fiecare. Sunt furnizati cel putin 2 ml de solutie de testare pentru fiecare animal
(adica un volum de 10 ml pentru cinci dafnizi pe vas de testare). Concentratia maxima testata : 100 mg/ L.
• lmobilizarea dafniilor este īnregistrata la 24 de ore $i 48 de ore $i comparata cu valorile de control.
Rezultatele sunt analizate pentru a calcula CE50 dupa 24 $i 48h.
• Raportu! de studiu trebuie sa includa pe langa datele de imobilizare a dafniilor, $i: concentratia de oxigen dizolvat,
pH-ul, concentratia substantei testate la īnceputul $i la sfar$itul testului.

TESTUL NR. 203. Test de toxicitate acuta la pe ti

• Pe$tii sunt expu$i substantei de testat pentru o perioada de 96 de ore.
• Mortalitatea se īnregistreaza la 24, 48, 72 $i 96 de ore $i se calculeaza concentratiile care ucid 50% din pe$ti
(CL50), acolo unde este posibil.
• Cel putin $apte pe$ti trebuie utilizati la fiecare concentratie de testare $i la controale.
Substanta testata trebuie administrata la cel putin cinci concentratii īntr-o serie geometrica cu un factor care
sa nu depa?easca 2,2; testul limita corespunde unei doze de 100 mg/ L.
Acest studiu include observatiile pe$tilor cel putin dupa 24, 48, 72 $i 96 de ore.
• Mortalitatea cumulata (% )pentru fiecare perioada de expunere este reprezentata grafic īn functie de
logaritmu! concentratiei iar DL50 sau CL50 se estimeaza din curba concentratie-raspuns
• Se pot utiliza una sau mai multe specii, alegerea fiind la latitudinea laboratorului de testare (Brachydanio
rerio (zebrafishJ, Pimepha/es promedas, Cyprinus carpio, Oryzias /atipes, Poeci/ia reicu/a, Leponis mactochirus,
Oncorhynchus mykiss)

TESTUL nr. 237. Test de toxicitate larvara la albine (Apis mellifera)

• Test de toxicitate acuta pentru puietul de albine, īn conditii de laborator; expunere unica
• Metoda vizeaza determinarea dozei letale la 72 ore de expunere (72-h LD50) dupa expunerea unica a larvelor la
o substanta chimica testata.
• Īn ziua 1 (Zl) a studiului, larvele sincronizate īn primul stadiu sunt luate din fagurii a trei colonii (36 larve īn
total, pe grup) $i plasate individual īn placi cu 48 de cavitati, unde sunt hranite cu o cantitate standardizata de
hrana artificiala.
• Īn ziua 4 (Z4) a testului, o singura doza de substanta chimica testata este administrata larvelor īn hrana.
Fiecarui grup de treizeci $i $ase de larve i se administreaza o doza data dintr-un interval de cinci doze
crescatoare.
• īn Z5, Z6 $i Z7 ale testului este īnregistrata mortalitatea
• Se calculeaza LD50 la 72 de ore pentru larve (mortalitate cumulativa la Z7).

TESTUL Nr. 207. Test de toxicitate acuta la rame (Eisenia fetida)

• Testu/ initial de screening (testul de contact cu hartia de filtru) implica expunerea ramelor la substantele testate
pe hartie de filtru umeda, pentru a identifica substantele chimice potential toxice pentru ramele din sol.
• se realizeaza cinci sau mai multe niveluri de expunere, īn progresie geometrica, $i minim zece replicari (cu
cate un vierme pe flacon) pentru fiecare tratament.
• testele se fac la īntuneric, timp de 48 de ore.
• Testu/ cu sol artificial ofera date de toxicitate mai reprezentative pentru expunerea ramelor la substante
chimice īn mediul natural
• ramele sunt mentinute īn probe de sol artificila cu compozitie precis definita
• sunt aplicate cinci concentratii ale substantei testate, īntr-o serie geometrica,.
• trebuie folosita o concentratie care nu are efect Ietai $i una la care mortalitatea este totala.
• se recomanda patru replici pentru fiecare tratament.
• mortalitatea este evaluata la 7 $i 14 zile dupa aplicare.
Eisenia fetida apartine increngaturii Annelida, subancrengat. 0/igochaeto. Organismele testate provin dintr-o cultura interna, de
laborator, de sincronizata reproductiv.

Testul cu sol artificial ofera date de toxicitate mai reprezentative pentru expunerea naturala a ramelor la substante chimice. Aceasta
implica pastrarea ramelor īn probe dintr-un sol artificial precis definit.
 TESTUL nr. 208 Test de cre tere la plantele terestre
• Testele de fitotoxicitate terestra sunt utile īn evaluarea efectelor adverse ale unor substante chimice specifice ca
parte a evaluarii riscului ecologic.
• Aceste teste toxicologice evalueaza raspunsurile uneia sau mai multor specii de plante la substanta chimica
testata
• Semintele sunt puse īn contact cu solul tratat cu substanta testata iar efectele sunt monitorizate la 14, 21 de zile
dupa aparitia a 50% a rasadurilor din grupul martor.
• Obiectivele urmarite sunt: evaluarea vizuala a aparitiei rasadurilor, masuratorile de biomasa, īnaltimea lastarilor i
efectele nocive vizibile asupra diferitelor parti ale plantei.
• Testul poate fi efectuat pentru a determina curba doza-raspuns sau la o singura concentratie / viteza ca test
limita, īn conformitate cu scopul studiului.
• O analiza statistica adecvata este utilizata pentru a obŗine concentraŗia efectiva ECx sau rata efectiva de aplicare
ERx pentru parametrii cei mai sensibili de interes.
• īn acest test pot fi calculate, de asemenea, concentratia fara efect observat (NOEC) $i cea mai mica concentratie cu
efect observat (LOEC)
TESTUL nr. 231. Testu! metamorfozei la amfibieni
• Testul descrie o analiza a metamorfozei amfibienilor destinata examinarii substantelor care pot interfera cu
funqionarea normala a axei hipotalamus-hipofiza-tiroida.
• a fost validat cu specia Xenopus laevis (broasca africana cu gheare), recomandata pentru utilizare īn Ghidul OECD
• se utilizeaza trei concentratii chimice ale substantei testate $i controalele necesare, inclusiv un control pentru
,,purtator", daca este necesar.
• Testul īncepe cu mormoloci īn stadiul de dezvoltare 51 pe scara Nieuwkoop $i Faber ?i se extinde pe o durata de
21 de zile.
• Cate patru vase de testare replicate sunt utilizate pentru fiecare nivel de tratament ?i control.
• Dupa 7 zile de expunere, se preleveaza un subset de mormoloci din fiecare nivel de tratament pentru masurarea
lungimii membrului posterior.
• La sfar?itul perioadei de expunere de 21 de zile, stadiul de dezvoltare, lungimea corpului ?i a membrelor
posterioare sunt masurate la toti mormolocii rama$i
• Un subset de mormoloci de la fiecare nivel de tratament este fixat (īntregul corp sau disecat)
pentru histopatologia glandei tiroide.

Evaluarea riscului pentru mediu

Etapele evaluarii riscului
1. formularea problemei- definirea scopul evaluarii: Ce trebuie protejat de pericol? Care sunt efectele adverse posibile?
2. caracterizarea pericolului: examinarea pericolelor potentiale ?i a gravitatatii lor
3. caracterizarea expunerii: se iau considerare posibilitatea (nivelul) expunerii la pericol, $i probabilitatea ca acel rausa
apara.
4. caracterizarea riscului: datele privind gravitatea $i probabilitatea pericolului sunt combinate/corelate pentru a
estima nivelul de risc.
īn unele cazuri, evaluarea riscului pentru mediu include ?i masuri de atenuare a riscurilor.
astfel de masuri au scopul de a reduce riscul identificat la un nivel acceptabil sau la un nivel lipsit de īngrijorare.

Datele de toxicitate obtinute prin diferite procedeele de testare sunt utilizate pentru a evaluarea pericolului $i a riscului
• A evalua riscul īnseamna a compara toxicitatea unui compus, exprimata sub forma unei concentratii (EC 50, LC50 sau
NOEC), cu expunerea anticipata a unui organism la aceea$i substanŗa chimica, exprimata īn acelea$i unitati
(concentratia īn apa, hrana sau sol la care organismu! este expus).
• La evaluarea pericolului, datele obtinute dintr-un test de toxicitate pot fi utilizate pentru a obtine un grafic care sa
exprime frecventa unui efect toxic (ex. mortalitatea) īn funqie de doza.
►estimarea NOEC ?i EC50
►
comparea cu o concentratie prezumtiva mare din mediu pentru a decide daca exista un pericol.
►
daca toxicitatea este foarte scazuta, atunci compusul nu este considerat periculos.
• La evaluarea riscului, se efectueaza calcule suplimentare pentru a obtine valori ale concentratiei prezumtive īn
mediu (the predicted environmental concentration, PEC) $i concentraŗia prezumtive care nu produce niciun efect
(the predicted environmental no effect concentration, PNEC).
►
Calculele se bazeaza pe viteze/e de eliberare i factorii de dilutie a substantelor chimice īn mediu.
►
Daca o substanta chimica este folosita īntr-un proces industrial, este masurat sau calculat nivelul acesteia īn
efluentului industrial.
►
Valoarea obŗinuta este apoi īmpartita la dilutia care are loc īn apele care primesc efluentul (rau sau lac),
obtinandu-se valoarea PEC.
►
PNEC poate fi estimata īmpartind LC50 sau EC50 pentru cea mai sensibila specie testata īn laborator la un factor
arbitrar de siguranta (de obicei, 1000).
►
Daca valoarea este mai mica de 1, riscul este scazut. Daca este 1 sau mai mult, riscul este substantial.
 Testarea toxicitatii pe teren
• Cand procedeele uzuale de evaluare a riscului genereaza incertitudini privind siguranta unei
substante chimice, pot fi necesare teste suplimentare īnainte ca o decizie finala sa fie luata
privind permiterea eliberarii īn mediu a sbstantei.
• Īn cazul pesticidelor, testele pe teren sunt uneori recomandate:
• pesticidul poate fi aplicat īn doza i conditiile īn care este cel mai probabil sa produca efect
(,,scenariul cazului celui mai grav")
• se pot efectua diverse masurari, īn functie de substanta chimica, metoda de
aplicare, habitatul, clima i sistemul agricol:
• cautarea animalelor i pasarilor moarte,
• estimarea numarului populatiei i succesul reproductiv
• masurarea reziduurilor īn sol, recolte i animale
• analiza unor biomarkeri (inhibarea colinesterazei, subtierea cojii de ou, la pasari).
• Experimentele pe tern sunt costisitoare i dificil de realizat
• Un interes īn cre tere 71 prezinta mezocosmosurile
• sisteme mici i controlate atent care ofera o anumita simulare a conditiilor din mediul natural.
• un exemplu de mesocosmos: mla tinile experimentale
• se formeaza mla tini de dimensiuni standard
• se colonizeaza cu plante, insecte i vertebrate.
• se testeaza efectul substantelor chimice asupra comunitatilor din mla tina
• Reprezinta „calea de mijloc" īntre testele de laborator i testele pe tern la scala completa.
• Avantaj: permit replicarea testului, de regula imposibila pentru testele complete pe teren
(http://www.oecd.org/fr/securitechimique/essais/32612239.pdf).

• Multe studii pe tern nu implica eliberarea controlata a substantelor chimice, ei dimpotriva,

investigarea unei probleme ,n desf6$urare.
• Este īnca posibil un oarecare grad de control experimental; de exemplu, depunerea
unor organisme necontaminate de-a lungul unui gradient de poluare. Resturile de
chimicale detectate prin analize pot fi corelate cu raspunsurile biomarkerilor pe care se
tie ca le produc, i, la randul lor, aceste raspunsuri pot fi corelate cu modificarile
populationale.
• Modificarile la nivelul populatiilor i comunitatilor cauzate de substante chimice pot fi
identificate prin analiza structurala a comunitatilor
• Dezvoltarea rezistentei la substante chimice poate implica modificari genetice care pot fi
masurate i corelate cu cauza lor originara.
• Microcosmosuri $i mesocosmosuri. Īn laborator sau pe teren, pot fi instituite, populatii i
comunitati modei care simuleaza dar nu reproduc exact 'lumea reala'. Acestea pot fi
utilizate pentru a desfa ura experimente cu replicari adecvate i pot demonstra efetele
substantelor chimice asupra proceselor ecologice precum ciclurile carbonului i azotului.
Problema majora este interpretarea datelor rezutate din acestea i corelarea lor cu 'lumea
reala'.
• Modele teoretice. Datele provenind din studiile cu biomarkeri, studiile pe teren i
microcosmosuri/mesocosmosuri pot fi īncorporate īn modele matematice care au scopul
de a prevedea efectele substantelor chimice asupra populatiilor sau la niveluri
superioare. Aceasta abordare se afla īnca īntr-un stadiu incipient de dezvoltare.
 Metode alternative de testare a ecotoxicitatii
• Īn ultimii ani, a crescut opozitia fata de utilizarea animalelor prin proceduri de testare care le
provoaca suferinta. Īn particular, testele de toxicitate asupra vertebratelor care utilizeaza
letalitatea ca punct final au fost intens criticate . Aceste obiectii au fost ridicate atat privind
testele de evaluare a riscului la om cat ?i testele de ecotoxicitate. Dincolo de considerentele
etice, a existat ?i o atitudine critica puternica privind practicile existente īn testarea ecotoxicitatii
sub aspectul fundamentarii ?tiintifice.
• Organizatiile implicate activ īn cautarea de metode alternative includ Fondul pentru Īnlocuirea
Animalelor īn Experimentele Medicale (Fund for the Replacement on Animals in Medical
Experiments, FRAME) ?i Centru European pentru Validarea Metodelor Alternative (European
Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM).
• Testele standard de toxicitate au valoarea limitata īn estimarea riscului pentru mediu. Din
perspectiva ecotoxicologica, este importanta evaluarea efectelor poluantilor asupra populatiei,
comunitatii ?i ecosistemului. Estimari ale probabilitatii ca anumiti indivizi sa sufere efecte toxice
nu spune nimic despre aceasta. Dezvoltarea metodelor alternative de testarea a ecotoicitatii ar
putea servi doua scopuri: īmbunatatirea calitatii ?tiintei ?i reducerea suferintei cauzate
animalelor.
• Procedeele alternative de testare pot fi divizate īn doua mari categorii:
• metode alternative de estimare a toxicitatii asupra vertebratelor;
• metode i strategii alternative care utilizeaza puncte finale cu mai mare relevanta
ecologica.
• Prima categorie ridica mai direct problema imediata a īnlocuirii testelor care provoaca suferinta
animalelor vertebrate, iar cea de-a doua vizeaza problemele pe termen lung de dezvoltare a
unei abordari diferite ?i mai ecologice a evaluarii riscului de mediu.
• Daca sunt dezvoltate cu succes strategii ?i teste care sa utilizeze puncte finale mai ecologice, ar fi
o buna oportunitate ca resursele limitate sa fie redirectionate de la practicile curente de testare
catre altele, care ofera omai buna evaluare a riscului pentru mediu.

Metode alternative de testare a toxicitaŗii la vertebrate

• Teste de toxicitate cu vertebrate vii.
• Īn prezent, se considera ca este important sa se continue cu unele teste asupra vertebratelor vii
din cauza inceritudinilor īn estimarea toxicitatii la vertebrate prin alte mijloace.
• Chiar ?i īn aceasta situatie, se pot face demersuri de reduce suferinta animalelor. Scopurile majore
ale FRAME, ECVAM ?i altor organiatii similare sunt īnlocuirea, reducerea ?i perfectionarea testarii
toxicitatii la animale. Īn cazul procedurilor de testare care lucreaza cu puncte finale letale, aceste
deziderate pot fi īndeplinite, īn parte, prin reducerea numarul animalelor utilizate aplidnd, de
exemplu, ,,procedeul dozei fixe".
• Pe termen lung, prezinta interes mai mare utilizarea altor puncte finale, incluzand raspunsuri ale
unor biomarkeri din tesuturi, ca sangele, care pot fi obtinute prin prelevare nedistructiva de probe.
• Raspunsurile biomarkerilor pot oferi avertismente timpurii privind functionarea unui mecanism toxic,
īnainte de instalarea unor simptome ale intoxicarii. Īn prezent, aceasta abordare este fezabilā doar
pentru un numar limitat de substante chimice ai caror mod de actiune este bine īnteles.
• Aceastā abordare este aplicabilā pe scarā mai largā, pe māsurā ce se vor cunoa?te mai multe despre
modul de actiune ai substantelor chimice.
• Teste de toxicitate cu nevertebrate.
• Uneori s-au fācut corelatii īntre toxicitatea unui grup de substante chimice la vertebrate ?i toxicitatea
lor la o specie de nevertebrate; de ex. toxicitatea la pe?ti este uneori corelatā cu toxicitatea la
Daphnia.
• Astfel de corelatii sunt posibile atunci cand existā un mod de actiune similar la vertebraate
?i nevertebrate.
• Toxicitatea depinde īnsā de factori toxicocinetici (ex. metabolism) care diferā marcant de la
vertebrate la alte grupuri, iar toxicitatea reala, exprimatā ca LD50 sau LC50 poate varia marcant de la
vertebrate la nevertebrate, chiar ?i atunci cand se iau īn considerare compu?i care au mod de
actiune similar.
• Pentru o gamā larga de xenobiotice care diferā prin modul de actiune, testele cu specii de
nevertebrate nu sunt concludente pentru toxicitatea la vertebrate
• Teste utilizand sisteme celulare
• Celulele vertebratelor, de exemplu, hepatocitele de mamifere, pe ti sau pasari, sunt adesea utilizate pentru a
masura toxicitatea.
• Uneori, acestea contin gene raportor ce mediaza un raspuns caracteristic expunerii la xenobiotice care opereaza
printr-un anumit mecanism toxic
• Exemplu: utilizarea hepatocitelor de ?oarece modificate genetic care emit lumina atunci cand dioxine sau BPC
planari interactioneaza cu receptoru! Ah (Aryl hydrocarbon) (sistemul CALUX)
• Astfel de sisteme pot fi foarte utile īn procedurile de screening (sortare) pentru a evidentia prezenta
unor substante chimice care opereaza printr-un mecanism toxic particular.
• Elenu dau īnsa o estimare de veridica a dozei medii letale care poate fi obtinuta printr-un test de toxicitate uzual.

• Modele predictive
• Cele mai binecunoscute exemple sunt relatiife cantitative structura-activitate (quantitative structure-activity
relationships, QSARs), care au fost utilizate pentru a prevedea toxicitatea pe baza proprietatilor fizico-chimice ale
poluantilor mediului.
• Īn stadiul actual de dezvoltare, QSAR nu poate fi considerata o alternativa de lucru la testele de toxicitate, de i
ofera informatii utile, iar īn viitor est probabil sa dobandeasca valoare predictiva mai mare, pe masura ce
tehnologia se īmbunatate te.
• 0 abordare mai promitatoare, pe termen lung, poate fi īncorporarea in vitro a datelor obtinute din sisteme
celulare īn modele mai sofisticate care iau īn considerare parametri toxicocinetici. 0 asemenea abordare va
conduce la obtinerea unor predictii mai bune privind toxicitatea medicamentelor ?i a altor substante chimice
din mediu utilizand date obtinute din sisteme umane in vitro. Teoretic, ar putea ajuta la rezolvarea unei
probleme importante, anume efectuarea comparatiilor interspecifice la evaluarea toxicitatii; aceasta problema
este mai dificila īn ecotoxicologie decat īn toxicologia umana. Multe specii care nu sunt disponibile testelor de
toxicitate normale pot fi studiate in vitro; factori practici, etici i economici limiteaza numarul i diversitatea
speciilor care pot fi utilizate pentru testarea toxicitatii.

Metode alternative ; strategii care utilizeaza puncte finale mai ecologice

• ,,Studii pe teren" este o un termen foarte larg care cuprinde de la o gama larga de
tipuri de monitorizare la testele pe teren cu pesticide.
• Teoretic, studiul efecelor substantelor chimice asupra indivizilor, populatiilor i
comunitatilor pe teren se refera direct la īntrebarile fundametale ale ecotoxicologiei.
• Problema cea mai dificila privind studiile pe teren este oportunitatea foarte limitata de a
controla variabile ca: temperatura, precipitatiile, deplasarile maselor de apa ; aer,
migratia animalelor, toate acestea putand influenta efectele substantelor chimice asupra
mediului.
• Controlul acestor parametri se poate face īn foarte mica masura īn testele pe teren
unde, de exemplu, pesticidele sunt aplicate īntr-o maniera controlata iar efectele sunt
monitorizate, facandu-se o comparatie cu suprafete/terenuri (de) control.
• Utilizarea biomarkerilor pentru a masura raspunsurile la o substanta chimica īn organisme
individuale poate oferi o legatura cauza/6 īntre expunerea la osubstanta chimica i o
modificare la nivel populational (ex. declinul populatiei, declinul succesului reproductiv sau
cre terea ratei mortalitatii).
• Este, de asemenea, posibila aducerea īn laborator a materialului contaminat, (de
exemplu, sol de pe teren), i expunerea animalelorīn conditii mult mai controlate.
 Monitorizarea biologica in situ
Biodisponibilitatea poluantilor este influentata de numero i factori.
este foarte dificil sa se prevada cu precizie masura īn care reziduurile chimice sunt asimilate de animale
i plante i efectele biologice ale acestora, pe teren.
multi cercetatori au folosit monitorizarea biologica in situ pentru a obtine astfel de informatii.
au fost adoptate patru abordari principale:

• (1) evaluarea prezentei sau absentei taxonilor din siturile curate !?i contaminate (,,efecte comunitare").
• (11) concentratiile de poluanti sunt masurate īn organisme colectate de pe camp;
► posibilitatea implementarii pe teren a speciilor „santinela" pentru a monitoriza disponibilitatea poluantilor
• de exemplu, midia Mytilus edulis, ca parte a programului global de „supraveghere a midiei".
• (111) cuantificarea efectele substantelor chimice asupra organismelor
• include o gama larga de parametri biochimici i fiziologici care intra īn categoria generica de „biomarkeri".
• unul dintre cele mai reu ite teste cu biomarkeri este masurarea „imposex" la melcul marin pradator
Nucella lapillus.
• acest fenomen este cauzat de tributilstaniu (TBS), care a fost utilizat pe scara larga ca vopsea
protectoare (Īmpotriva depunerilor organice acvatice), pentru barci.
• TBT impune caracteristici masculine femelelor, ducand la o reducere a performantei reproductive i
la disparitia locala a populatiilor de Nucella īn cele mai contaminate locuri.
• (IV) aparitia/ evolutia rezistentei genetice.
• este evidenta mai ales la insecte unde, de exemplu, tulpinile rezistente de tantari pot tolera concentratii
de insecticide organofosforice de peste 200 de ori mai mari decat cele care vor elimina populatiile
nerezistente (sensibile).
• selectia naturala a favorizat acele mutatii capabile sa produca cantitati mai mari de esteraze nespecifice
cu functie de detoxifiere, ca raspuns la actiunea toxica a insecticidelor

• Pentru a fi utilizate cu success la monitorizarea biologica in situ, organismele -

biomonitori trebuie sa satisfaca 5 criterii (,,the 5 Rs: relevant, reliaole, robust,
responsive, reproducible")
(Walker, 2004, Cap 11)

Nucella lapillus
 Un cadru pentru testarea toxicitatii īn secolul 21:

Zhen-guang Yan, Xin Zheng *, Fu Gao, Jun-tao Fan, Shu-ping Wang and Li-xin Yang.Viewpoint: A Framework
for Ecotoxicity Testing in the 21st Century: Ecotox21. Applied Sciences 2019, 9, 428. Figura 1 Un cadru pentru
testarea ecotoxicitaļii īn secolul XXI (traducere)

Un cadru pentru testarea toxicitatii īn secolul 21:

■ cunoa$terea mecanismelor de actiune a substantelor toxice la nivel celular
■ posibilitatea de extrapolare a rezultatelor la niveluri superioare de organizare biologica

1. ldentificarea speciilor sensibile prin analiza datelor de toxicitate individualā deja publicate
• raspunsurile biologice variaza īn functie de substanta chimica/specie
• fiecare specie poate prezenta o mare susceptibilitate la anumite substante
► formarea perechilor specie sensibila-substanta
2. Speciile pentru care existā linii celulare stabilite ($oareci, $Obolani, insecte $i pe$ti)
• sunt selectate pentru teste de mare viteza/randament
• testarea ecotoxicitatii $i evaluarea riscurilor se realizeaza īn conformitate cu testele
standardizate acceptate
• pentru speciile tara linii celulare disponibile, se verifica posibilitatea de cultivare artificiala.
4. Embrioni din specii care pot fi cultivate artificial (crustacee, crabi $i creveti)
• permit efectuarea unor teste de toxicitate cu viteza/randament mediu
4. Pentru taxoni sensibili care nu pot fi cultivati artificial
• pot fi combinate metodologii experimentale $i computationale (toxicologia moleculara,
biologia sistemelor $i bioinformatica)
• extrapolarea rezultatelor ecotoxicologice $i conceperea unor strategii de testare
mai eficiente

Zhen-guang Yan, Xin Zheng *, Fu Gao, Jun-tao Fan, Shu-ping Wang and Li-xin Yang.Viewpoint: A Framework for
Ecotoxicity Testing in the 21st Century: Ecotox21. Applied Sciences 2019, 9, 428. Figure 1 Un cadru pentru testarea
ecotoxicitatii īn secolul XXI (traducere)
 Directive de reglementare privind substantele chimice toxice
īn Uniunea Europeana
• Agenļia Europeanā pentru Produse Chimice (ECHA-furopea Chemical Agency; Helsinki, Finlanda) este
forta motrice īn randul autoritatilor de reglementare pentru implementarea legislatiei UE privind substantele
chimice, pentru protectia sanatatii umane ?i a mediului, precum ?i pentru inovatie ?i competitivitate īn
industria chimica.
• ECHA ajuta companiile sa respecte legislatia de mediu, promoveaza utilizarea īn conditii de siguranta a
substantelor chimice, ofera informatii despre substantele chimice toxice ?i abordeaza problemele poluantilor
chimici emergenti (noi) sau contaminantilor.
• Noua legislatie UE privind produsele chimice se aplica tuturor sectoarelor industriale care se ocupa de
substante chimice ?i de-a lungul īntregului lant de aprovizionare. Aceasta responsabilizeaza companiile
(producatori, importatori ?i distribuitori) privind siguranta substantelor chimice pe care le introduc pe piata.
[https://echa.europa.eu/ documents/10162/13632/information_requirements_r7b_en.pdf].
• Cele mai importante reglementari adoptate pentru protejarea sanatatii umane i a mediului sunt:
Īnregistrarea, evaluarea i autorizarea substantelor chimice (REACH, nr. 1907/2006) este un regulament ai
Uniunii Europene, adoptat pentru a īmbunatati protectia sanatatii umane ?i a mediului īmpotriva riscurilor pe
care le pot prezenta substantele chimice, sporind, īn acela?i timp, competitivitatea industria chimica a UE
[http://echa.europa.eu/regulations/reach].
• Clasificare, etichetare i ambalare (CLP, nr. 1272/2008 privind clasificarea, etichetarea ?i ambalarea
substantelor $i amestecurilor): Regulamentul CLP asigura faptul ca pericolele prezentate de substantele
chimice sunt comunicate īn mod clar lucratorilor ?i consumatorilor din Uniunea Europeana, prin clasificarea ?i
etichetarea produse chimice.
• Regulamentul privind produsele biocide [BPR, nr. 528/2012) se refera la introducerea pe piata i
utilizarea produselor biocide pentru a proteja oamenii, animalele, materialele sau produsele īmpotriva
organismelor daunatoare, prin actiunea substantelor active continute īn produsul biocīd.

• Regulamentul privind consimtāmantul informat anterior (PIC, nr. 649/2012) administreaza importu! ?i
exportul anumitor substante chimice periculoase ?i impune obligatii companiilor care doresc sa exporte
aceste substante chimice īn tari din atara UE. Acesta pune īn aplicare, īn cadrul Uniunii Europene,
Conventia de la Rotterdam privind procedura de consimtamant prealabil informat pentru anumite
substante chimice ?i pesticide periculoase din comertul international.

Alternative la testarea toxicitatii pe animale īn UE

• Testele de toxicitate ?i carcinogenitate la animale fac parte integranta din identificarea pericolelor pentru
mediu ?i evaluarea riscurilor produselor chimice industriale, produselor de protectie a plantelor, biocidelor,
aditivilor pentru hrana animalelor $i farmaceutici īn Uniunea Europeana $i īn alte tari industrializate.
• Testele pe animale sunt utilizate pentru a monitoriza poluarea mediului, a efluentilor $i a apelor de
suprafata $i pentru a evalua starea apelor europene sub auspiciile Directivei-cadru privind apa.
• Testele pe animale au ridicat preocupari etice īn multe tari īn ultimul deceniu īn ceea ce prive?te
evaluarea riscurilor de mediu (pe$ti, amfibieni $i pasari $i mamifere).
• Multe cadre de reglementare din SUA $i din alte tari īncurajeaza utilizarea unor abordari alternative, ca
metodologia QSAR (relatii cantitative structura - activitate) care utilizeaza date din studii de toxicitate
existente (baze de date) si metode computationale pentru comparatii.
• Utilizarea metodelor experimentale alternative de testare a toxicitatii a tost limitata pana īn prezent din
cauza lipsei consensului cu privire la domeniile de aplicabilitate a lor, validarea internationala $i
acceptarea reglementata, inclusiv a liniilor directoare de testare OECD corespunzatoare.
• Alternative la metodele de testare pe animale au tost implementate īn cadrul juridic european: REACH ?i
Regulamentul privind produsele cosmetice (de ex., teste de coroziune $i iritarea pielii).
• Laboratorul de referinta ai UE pentru alternative la testarea pe animale (EURL-ECVAM) a tost īnfiintat īn
2011 $i este gazduit de Centrul Comun de Cercetare, lnstitutul pentru Sanatate $i Protectia
Consumatorilor (IHCP) situat īn lspra, ltalia.
 l l
Perfectionarea testelor
Modele de analiza a rezultatelor pozitive in vitro pozitive
la testul Ames Proiectoreo odecvota
o testelor de monitorizore

Determinarea numarului optim de teste

ldentificarea unor teste noi sau suplimentare Oportunitati de reducere:
integrarea punctelor finale
īntr-un singur studiu / animal
Noi metode in silico de
Baza de date predictie a toxicitatii in vivo
generala
consolidata

Cosmetice
Acceptarea reglementata a
noi ingrediente cosmetice
fara testare in vivo
Biocide
Reducerea numarului de teste Reducerea necesitatii de teste
in vivo Fara teste de carcinogenitate in vivo
īn caz de genotoxicitate

Preocupari privind limitarea teselor efectuate pe animale

EURL- EU Reference Laboratory for alternatives to animal testing; ECVAM
European Centre for the Validation of Alternative Methods https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam

Glosar de termeni
• data mining (engl)-extragerea de cuno tinte din date; este un proces de analiza a unor cantitati mari de date i de extragere
a informatiilor relevante din acestea folosind metode matematice i statistice.
fn domeniul Jtiintific, desemneaza extragerea informatiilor din volume mari de date, generate de experimente moderne.
Dota mining a fost descrisa ca "extragerea netriviala a informatiilor implicite, anterior necunoscute i potential utile din date",
i ca " tiinta extragerii informatiilor utile din volume de date mari sau din baze de date".
https://en.wikipedia.org/wiki/Data_mining
• un farmacofor este o descriere abstractii a caracteristicilor moleculare care sunt necesare pentru recunoa terea molecularii
a unui ligand de catre o macromolecula biologicii. IUPAC define te un farmacofor ca fiind „un ansamblu de caracteristici sterice
Ji electronice care este necesar pentru a asigura interactiunile supramoleculare optime cu o tintei biologica specifica ?i pentru a
declan?a {sau a bloca) raspunsul sau biologic https://en.wikipedia.org/wiki/Pharmacophore

• metodele in silico includ: baze de date, relatii cantitative structura-activitate, farmacofori, modele de omologie i alte abordari
de modelare moleculara, data mining, instrumente de analiza i prelucrare computerizatii a datelor.

Bibliografie
• Wa/ker CH, Hopkin SP, Sibly RM, Peaka/1 08 {2004} Princip/es of ecotoxico/ogy, 2nd Ed, CRC Press, Taylor & Francis Group;
• Athanasios Valvanidis, Ecotoxicity Test Methods and Ecological Risk Assessment.Aquatic and Terrestrial Ecotoxicology
Tests under the Guidlines of lnternational Organisations. Science Advances on Environmental Chemistry, Toxicology
and Ecotoxicology, 15, 2015.
• Zhen-guang Yan, Xin Zheng *, Fu Gao, Jun-tao Fan, Shu-ping Wang and Li-xin Yang.Viewpoint: A Framework for
Ecotoxicity Testing in the 21st Century: Ecotox21. Applied Sciences 2019, 9, 428. (Fig.1 Un cadru pentru testarea
ecotoxicitaŗii īn secolul XXI)
• Agentia Europeana pentru Produse Chimice (ECHA). Īndrumari privind cerintele de informare i evaluarea sigurantei
chimice. Capitolul R.7b. Īndrumari specifice punctului final. ECHA -14-G-05-EN, publicaŗii ECHA, Helsinki, Finlanda,
noiembrie 2014. https://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7b_en.pdf].

• https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam
• http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm#Test_Guidelines
https://www.niva.no/en/research/ecotoxicology_and_risk_assessment
 Efectele poluantilor asupra populatiilor i comunitatilor
Efecte asupra unei populatii (specii)

Cand poluantii intra īntr-un ecosistem, speciile din interior pot fi afectate īn mai multe moduri:
(i) unele specii pot scadea numeric pana la zero = extinctie loca/ČI.
(ii) unele specii var scadea pana la un nivel >zero iar populatia poate persista la acest nivel
daca poluarea persista (poluare cronica).
(iii) initial, populatia cre te numeric; daca poluarea este cronica, īn interiorul populatiei poate aparea
rezistenta, permitand īn final cre terea sa numerica pana la atingerea unui nou echilibru.
Daca poluarea este tranzitorie, populatia se poate recupera īn cele din urma, prin:
(iv) cre tere pana la nivelul anterior poluarii
(v) revenire prin imigrare-recolonizare daca poluarea a determinat extinctia polpulatiei.
Īn aceste ultime doua cazuri, populatia nu revine īn mod necesar la nivelul initial.

Raspunsuri posibile la poluanti, sub aspectul

dimensiunilor populatiei
(Walker etal, 2004, Fig 12.1, tradusa)

• Efectul unui poluant asupra unei populatii este evaluat ca efect asupra ratei de cre?tere a populatiei.
• rata de cre?tere se calculeaza din experimente īn care este urmarit ciclul de viata ai organismelor
la diferite concentratii ale poluantului.
• Īn general:
• la cre?terea concentratiei poluantului are loc scaderea ratei natalitatii ?i cre?terea ratei mortalitatii.
• atat scaderea ratei natalitatii cat ?i cre?terea ratei mortalitatii conduc la scaderea ratei de cre?
tere a populatiei.
► cre?terea concentratiei unui poluant conduce la scaderea ratei de cre?tere a populatiei.
• Experimente de felul acesta au fost de obicei desfa?urate la densitati scazute ale populatiei.
• Īn absenta factorilor de stres, populatiile aflate la niveluri scazute ale densitatii populatiei sunt
supuse cre?terii exponentiale daca rata de cre?tere per capita este constanta.
• Populatiile nu se pot īnsa extinde la infinit, pentru ca epuizeaza resursele disponibile.
• Daca aceasta īncepe sa se īntample, rata de cre?terea populatiei īncepe sa scada pana cand, la densitati
foarte mari ale populatiei, rata de cre?tere devine negativa( Hscaderea populatiei).
• Īntre acestea, exista o densitate de echilibru (a populatiei) pentru care rata de cre?tere este zero =
capacitatea de sustinere a mediului īn care populatia cre?te.
• IMPORTANT: evaluarea efectelor comune ale poluantilor ?i densitatii populatiei asupra cre?terii
populatiei.
► obiectivul cercetarilor: evaluarea efectele poluantilor asupra capacitatii de sustinere (a mediului).

Curba de cre tere sigmoidala care rezulta din ecuatia

logistica (din chenar).
K -capacitatea de sustinere a mediului.
dN/dt-cre terea populatiei pe unitatea de timp, r0-rata de
cre tere a populatiei cand densitatea populatiei este
mica; N-marimea populatiei;
(Walker etal, 2004, Fig 12.7, tradusa)
 lnteractiunile dintre specii

• 7n context ecotoxicologic, studiul populatiilor individuale este dificil, iar descifrarea interactiunilor dintre
specii mare$te suplimentar aceasta dificultate.
• rata de cre$tere a unei populatii nu depinde doar de densitatea populatiei vizate, ei $i de
densitatile altor specii.
• stabilirea acestor dependente pe teren este foarte costisitoare; de aceea, studiile detaliate se
limiteaza la sisteme simple, de laborator, ori modele matematice.
• Pe baza unor aspecte generale referitoare la interactiunile dintre specii, acestea pot fi clasificate 7n
trei categorii:
• 1. Competitie (concurenta)
• rata de cre$tere a populatiei fiecarei specii scade cu atat mai mult cu cat exista mai multe specii.
• speciile intra 7n competitie pentru resurse (hrana, spatiu, situri de reproducere)
• cu cat numarul competitorilor este mai mare, cu atat scade succesul mediu ai fiecaruia.
• 2. Mutualism
• rata de cre$tere populatiei fiecarei specii cre$te cu atat mai mult cu cat sunt mai multe specii.
• 7n conditii de mutualism, speciile implicate se ajuta reciproc; mutualismul este opus concurentei.
• 3. Pradator-prada
• rata de cre$tere a populatiei din specia A cre$te cu cat sunt mai multe specii B, dar rata de
cre$tere a specie B scade cu cat sunt mai multe specii A.
• astfel de asimetrii se observa $i 7n relatiile gazda-prazit $i planta-erbivor, care pot fi tratate 7n
categoria prada-pradator.

Schimbari in comunitati i ecosisteme

• Studiul ecotoxicologic urmare$te manifestarea efectelor nocive ale poluarii asupra comunitatilor
de organisme $i proceselor ecologice.
• disparitia speciilor sensibile nu conduce doar scaderea biodiversitatii, ei $i la 7ntreruperea
unor procese ecologice esentiale.
► necesitatea monitorizarii pe termen lung, pentru a recunoa$te cand ecosistemele se
7ndeparteaza
de starea lor normala.

• cea mai importanta $i dificila sarcina pentru ecotoxicologie este de a se asigura ca structura
; functia ecosistemelor sunt pastrate.
• relatiile dintre raspunsurile (biochimice $i fiziologice) la poluanti sunt evaluate la nivel individual,
populational $Ī ai comunitatii
• pe masura ce cre$te importanta unei schimbari, cre$te $i dificultatea de a o masura $i de a o
raporta la o cauza specifica.

Exemple de biomarkeri care au fost utilizati 7n studii populationale:

1. Subtierea cojii oualor indusa de DDE la pasarile rapitoare $i piscivore;
2. E$ecul reproductiv ai pasarilor piscivore ( efectele amestecurilor complexe de compu$i
polihalogenati);
3. lnsuficienta reproductiva a molu$telor cauzata de tributil staniu;
4. Efectele programelor de pulverizare cu pesticide a padurilor, pentru a controla viermii de molid
(Choristoneura fumiferana), asupra populatiilor de pasari cantatoare.

Bibliografie: Walker CH, Hopkin SP, Sibly RM, Peaka/1 DB {2004) Princip/es of ecotoxicology, 2nd Ed, CRC Press, Taylor & Francis Group