- referat BIOCHIMIE -

Introducere
Aminoacizii sunt uniti constituente ale proteinelor. Dintre toi aminoacizii existeni n natur, o clas special o constituie cea a -aminoacizilor, ntlnii i sub titulatura de aminoacizi naturali. n mod curent, aminoacizii sunt prescurtai printr-un simbol din trei litere, dar au fost adoptate i simboluri dintr-o singur liter pentru a facilita compararea secvenelor de aminoacizi ale proteinelor omoloage. (tabel 1) Tabel 1. Simbolurile aminoacizilor
Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Aminoacid Alanin Arginin Asparagin Acid aspartic Cistein Glutamin Acid glutamic Glicin Histidin Izoleucin Leucin Lizin Metionin Fenilalanin Prolin Serin Treonin Triptofan Tirozin Valin *Asn i/sau Asp *Gln i/sau Glu Simbol trei litere Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Asx Glx cu Simbol cu o liter A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z

S-au propus numeroase moduri de clasificare a aminoacizilor bazate pe particularitile structurale ale radicalilor -aminoacizilor. Cea mai semnificativ din acest punct de vedere este clasificarea pe baza polaritii radicalilor R. Astfel ntlnim patru clase principale de -aminoacizi: 1) Aminoacizi cu radicali nepolari (hidrofobi) (tabelul 2)

n tabelul 2 se prezint formulele structurale i conformaiile spaiale a opt aminoacizi cu radicali nepolari, mpreun cu simbolurile lor. Aceast familie include cinci aminoacizi cu radicali R alifatici (alanina, leucina, izoleucina, valina i prolina), doi amino-acizi cu ciclu aromatic (fenilalanina i triptofanul) i un aminoacid cu sulf (metionina). Aminoacizii din aceast clas sunt mai puin solubili n ap dect aminoacizii cu radicali R polari. Componentul cel mai slab hidrofob al acestei clase este alanina, care este astfel aproape de grania dintre aminoacizii nepolari i cei cu radicali polari nencrcai. Prolina difer de toi ceilali aminoacizi standard, fiind de fapt un -iminoacid; poate fi privit i ca un -aminoacid n care radicalul R este un substituent n gruparea amino. 2) Aminoacizi cu radicali polari nencrcai (tabelul 3) Aceti aminoacizi sunt relativ mai solubili n ap dect cei cu radicali R nepolari. Radicalii lor conin grupri funcionale polare neutre (nencrcate) care pot forma legturi de hidrogen cu apa. Polaritatea serinei, treoninei i tirozinei. este datorat gruprilor lor hidroxil, cea a asparaginei i glutaminei gruprilor amid i cea a cisteinei gruprii ei sulfhidril (SH). Glicina, aminoacidul aflat la limita demarcaiei acestei grupe, este clasificat uneori ca un aminoacid nepolar, dar radicalul ei, un singur atom de hidrogen, este prea mic ca s poat influena gradul ridicat de polaritate al gruprilor a-amino i -carboxil. Asparagina i glutamina sunt amidele acidului aspartic i acidului glutamic. ntruct aceti aminoacizi sunt uor hidrolizai de acizi sau baze la acid aspartic, respectiv glutamic, simbolurile folosite pentru a desemna aceste perechi de aminoacizi nrudii, cnd cantitile de amid format nu sunt cunoscute, sunt Asx i Glx. Cisteina i tirozina au cei mai polari substitueni ai acestei clase de aminoacizi, i anume gruprile tiol i, respectiv, hidroxilul fenolic. Aceste grupri tind s piard protoni prin ionizare, mult mai rapid dect radicalii R ai altor aminoacizi din aceast clas, dei ei sunt doar slab ionizai la pH 7,0. Cisteina se ntlnete deseori n protein n forma sa oxidat cistina, n care gruprile tiol din dou molecule de cistein au fost oxidate la o grupare disulfuric, prin care se formeaz o legtur covalent ntre ele. Structura cisteinei este dat n tabelul 3. 3

3) Aminoacizi cu radicali ncrcai pozitiv (bazici) (tabelul 4) Toi aminoacizii bazici n care radicalii R prezint sarcini net pozitive la pH 7,0 au ase atomi de carbon. Aceast clas de aminoacizi se compune din: lizin, care prezint o grupare amino ncrcat pozitiv n poziia din lanul su alifatic; arginin, care prezint gruparea guanidin ncrcat pozitiv i histidin, care conine gruparea imidazol slab bazic. Prin proprietile sale, histidina este situat la limita de demarcaie a acestei clase de aminoacizi. La pH 6,0 aproximativ 50% din moleculele de histidin posed un radical R protonat, ncrcat pozitiv, dar la pH 1,0 mai puin de 10% din molecule au sarcin pozitiv. Histidina este singurul aminoacid al crui radical R are pK' aproape de 7,0. 4) Aminoacizi cu radicali ncrcai negativ (acizi) (tabelul 5) Cei doi membri ai acestei clase sunt acidul aspartic i acidul glutamic, fiecare cu o a doua grup carboxil complet ionizat i astfel ncrcat negativ ntre pH 6,0 i pH 7,0.

Tabel 2. -aminoacizi cu radical R nepolar

Denumire -aminoacid

Simboluri
Ala A

Structur
OH CH3 NH2

Alanin

OH

CH3 CH3 NH2

Valin

Val V
O

OH

Leucin

Leu L
O NH2 OH

CH3 CH3

CH3 CH3 NH2 OH

Izoleucin

Ile I
O

Prolin

Pro P
O

H N

OH

Fenilalanin

Phe F

O NH2 OH

Triptofan

Trp W

O NH2 N H

OH

Metionin

Met M
O NH2

CH3

Tabel 3. -aminoacizi cu radical R nencrcat

Denumire -aminoacid

Simboluri
Gly G

Structur
OH O NH2

Glicin

OH

Serin

Ser S
O NH2 OH CH3 OH NH2 OH OH

Treonin

Thr T
O

Cistein

Cys C
O NH2 OH SH

Tirozin

Tyr Y

O NH2 OH OH

Asparagin

Asn N
O NH2 OH O

NH2

NH2 O NH2

Glutamin

Gln Q
O

Tabel 4. -aminoacizi bazici (ncrcai pozitiv la pH 6,0)

Denumire -aminoacid

Simboluri
OH

Structur
NH2 NH2

Lizin

Lys K
O

OH

NH2 NH NH2 OH NH

Arginin

Arg R
O

Histidin

His H

O NH2

H N N

Tabel 5. -aminoacizi acizi (ncrcai negativ la pH 6,0)

Denumire -aminoacid

Simboluri
Asp D
O

Structur
OH OH NH2 OH O OH O NH2

Acid aspartic

Acid glutamic

Glu E
O

Proprietile acido-bazice ale aminoacizilor

Cunoaterea proprietilor acido-bazice ale aminoacizilor este foarte important pentru nelegerea i analizarea proprietilor proteinelor. Mai mult, o mare parte din tiina separrii, identificrii i dozrii diferiilor aminoacizi i determinrii secvenei lor n proteine este bazat pe comportarea lor acido-bazic.

n primul rnd, s considerm speciile ionice comune ale aminoacizilor. n stare cristalin, aminoacizii au puncte de topire sau de descompunere ridicate, de obicei peste 200C. Ei sunt mult mai solubili n ap dect n solveni nepolari. Aceste proprieti sunt exact cele pe care ne ateptm s le ntlnim, considernd c reeaua molecular a aminoacidului n stare cristalin este stabilizat prin fore electrostatice de atracie ntre grupri cu sarcini opuse ca n cazul reelelor cristaline ale srurilor cu puncte de topire ridicate, ca de exemplu clorura de sodiu. Dac aminoacizii ar cristaliza ntr-o form neionic, ei ar fi stabilizai de forele van der Waals, mult mai slabe, i ar avea puncte de topire joase. Aceste consideraii, ct i multe alte dovezi au dus la concluzia c aminoacizii se gsesc n soluii apoase neutre i cristalizeaz din aceste soluii mai degrab ca ioni dipolari sau amfioni, dect ca molecule nedisociate. Existena aminoacizilor ca ioni dipolari n soluii apoase neutre este indicat i de constantele dielectrice ridicate i momentele de dipol mari, care reflect prezena att a sarcinilor negative cit i a celor pozitive n aceeai molecul. Cnd un aminoacid amfionic cristalin, de exemplu alanina, este dizolvat n ap, el poate aciona att ca un acid (donor de proton) ct i ca o baz (acceptor de proton): - ca un acid: H3N+CH(CH3)COO H+ + H2NCH(CH3)COO - ca o baz: H+ + H3N+CH(CH3)COO H3N+CH(CH3)COOH Substanele cu astfel de proprieti sunt amfotere (n greac amphi nseamn ambii") i sunt numite amfolii, forma prescurtat de la electrolii amfoteri". Comportarea acido-bazic a amfoliilor este cel mai simplu formulat n termenii teoriei acido-bazice Brnsted-Lowry. Un -aminoacid simplu monoaminomonocarboxilic ca alanina este considerat a fi un acid dibazic n form complet protonat, care poate dona doi protoni n timpul titrrii sale complete cu o baz.1Desfurarea unei asemenea titrri cu NaOH, care decurge n dou trepte, Fig. Curba de titrare a alaninei. poate fi reprezentat n ecuaiile urmtoare, ce indic fiecare specie ionic R = gruparea metil. implicat: H3N+CHRCOOH + HO H3N+CHRCOO + H2O H3N+CHRCOO + HO H3N+CHRCOO + H2O

Figura prezint curba de titrare difazic a alaninei, care poate fi comparat cu curbele de titrare ale acizilor slabi. Valorile pK' ale celor dou etape de ionizare ale alaninei sunt destul de distanate pentru a rezulta dou trepte net separate. Fiecare treapt prezint un punct de echivalen, unde modificarea pHului cnd se adaug cantiti crescute de HO este minim. Valorile pK' aparente pentru cele dou trepte de disociere pot. fi determinate din punctele de echivalen ale fiecrei trepte; ele sunt pK1 = 2,34 i pK2 = 9,69. La pH 2,34, punctul de echivalen al primei trepte, donorul de protoni (H3N+CHRCOOH) i acceptorul de protoni (H3N+CHRCOO) se gsesc n concentraii echimolare. La pH 9,69, speciile (H3N+CHRCOO) i (H2NCHRCOO) se gsesc n concentraii echimolare. Fiecare dintre cele dou trepte ale curbei pot fi bine aproximate matematic prin ecuaia Henderson-Hasselbach; aceasta nseamn c se pot calcula raporturile speciilor ionice ale aminoacidului la orice pH, dac se cunosc valorile pentru pK1 i p K 2. La pH 6,02 exist un punct de inflexiune ntre cele dou trepte ale curbei de titrare a alaninei. La acest pH, molecula nu prezint sarcin electric net i nu migreaz n cmp electric. Acesta este pH-ul izoelectric (simbolizat prin pHi) care reprezint media aritmetic a lui pK1 i p K 2, adic pHi = 1/2 (pK1 + p K 2). Aceste relaii sunt destul de exacte pentru majoritatea scopurilor. Totui, o cantitate mic din forma nencrcat (H3N+CHRCOOH) este prezent n echilibru cu forma. ncrcat.

Toi acizii monoaminomonocarboxilici prezint n esen aceeai comportare. Tabelul 6. Valorile pK pentru gruprile ionizate ale unor aminoacizi la 25C

Aminoacid
Glicin Alanin Leucin Serin Treonin Glutamin Acid aspartic Acid glutamic Histidin Cistein Tirozin Lizin Arginin

pK1 -COOH
2,34 2,34 2,36 2,21 2,63 2,17 2,09 2,19 1,82 1,71 2,20 2,18 2,17

pK2 -NH3+
9,60 9,69 9,60 9,15 10,43 9,13 9,82 9,67 9,17 8,33 9,11 8,95 9,04

pKR radical R

3,86 4,25 6,00 10,78 10,07 10,53 12,48

n tabelul 6 sunt date valorile pK' pentru gruprile ionizate ale unor aminoacizi. Din aceste date rezult urmtoarele observaii generale: 1. Gruparea carboxil din poziia a acizilor monoaminomonocarboxilici este un acid mai puternic dect gruparea carboxil a acizilor alifatici corespunztori, ca de pild acidul acetic (pK' = 4,76). Aciditatea crescut a acestei grupri se datorete gruprii amoniu din poziia i sarcinii sale pozitive, care produce un puternic efect de cmp, crescnd astfel tendina hidrogenului carboxilic de a disocia ca proton. 2. Gruparea -amino a acizilor monoaminomonocarboxilici este un acid mai tare (sau o baz mai slab) dect gruparea amino a aminelor alifatice corespunztoare. 3. Toi aminoacizii monoaminomonocarboxilici cu radicali R nencrcai au valori pK1 i valori pK2 aproape identice. 4. Nici unul dintre aminoacizii monoaminomonocarboxilici nu are capacitate de tamponare semnificativ n jurul pH-ului fiziologic, ntre pH 6,0 i pH 8,0. Ei prezint ntr-adevr capacitate de tamponare la pH-uri apropiate de valorile pK', i anume ntre pH 1,3 3,3 i 8,6 10,6. Singurul aminoacid cu putere de tamponare semnificativ ntre pH 6 i 8 este histidina. 5. Gruparea -carboxil a acidului aspartic i gruparea -carboxil a acidului glutamic, dei complet ionizate la pH 7,0, au valori pK' considerabil mai mari dect valorile pK' 10

ale gruprilor -carboxil i aproape egale cu cele ale acizilor carboxilici simpli, de exemplu acidul acetic. 6. Gruparea tiol sau sulfhidril (SH) a cisternei i gruparea p-hidroxil a tirozinei sunt doar foarte slab acide. La pH 7,0, cea dinti este ionizat n proporie de aproximativ 8%, iar cea de-a doua n proporie de 0,01%. 7. Gruparea -amino a lizinei i gruparea guanidin a argininei sunt puternic bazice; aceste grupri cedeaz protoni numai la valori foarte ridicate ale pH-ului. La pH 7,0, aceti aminoacizi prezint o sarcin net pozitiv. Curbele de titrare ale aminoacizilor cu radicali R ionizabili, de exemplu histidina, lizina, acidul glutamic, snt mult mai complexe, ele fiind o combinaie ntre curba care corespunde disocierii radicalului R i curbele corespunztoare gruprilor amino i carboxil din poziia . Formaldehida, n exces, se combin uor cu gruprile amino libere, neprotonate ale aminoacizilor, rezultnd derivai metilol. n aceast reacie, aminoacidul izoelectric pierde un proton de la gruparea +NH3 a amfionului: H3N+CHRCOO H2NCHRCOO + H+ H2NCHRCOO + 2HCHO (HOCH2)2NCHRCOO Protonul astfel eliberat poate fi titrat direct cu NaOH pn la pH 8, punctul de viraj al fenolftaleinei. Titrarea aminoacizilor sau amestecurilor de aminoacizi n prezena unui exces de formaldehid (titrare cu formol) este o metod analitic util n urmrirea formrii aminoacizilor liberi n timpul hidrolizei proteinelor de ctre enzimele proteolitice.

Reacii chimice ale aminoacizilor

Reaciile caracteristice ale aminoacizilor sunt cele ale gruprilor funcionale, i anume: gruprile carboxil, gruprile -amino i gruprile funcionale prezente n lanurile laterale. Cunoaterea acestor reacii este folositoare n numeroase aspecte importante ale chimiei proteinelor: 1) identificarea i analiza aminoacizilor n hidrolizatele proteice; 2) identificarea secvenei de aminoacizi n moleculele proteice; 3) identificarea resturilor de aminoacizi specifice proteinelor native, care sunt eseniale pentru funcia lor biologic;

11

4) modificarea chimic a resturilor de aminoacizi din molecula proteic pentru a produce schimbri n activitatea lor biologic sau n alte proprieti; 5) sinteza chimic a polipeptidelor. Reaciile gruprilor carboxil Gruprile carboxil ale aminoacizilor dau reacii binecunoscute conducnd la formarea de amide, esteri i halogenuri acide. Esterificarea aminoacizilor cu etanol sau alcool benzilic este deseori folosit pentru protejarea gruprii carboxil a aminoacizilor n sinteza chimic a peptidelor. O alt reacie a gruprii carboxil foarte important n studiul secvenei aminoacizilor este reacia de reducere n mediu anhidru, cu un agent puternic reductor, borohidrura de litiu, formndu-se alcoolul primar corespunztor:
COOH H2 N R H LiBH 4 CH2 OH H 2N R H

Reaciile gruprilor amino Gruparea -amino a aminoacizilor poate fi acilat prin tratare cu halogenuri acide sau anhidride; aceast reacie este utilizat curent pentru a bloca sau proteja gruparea -amino n sinteza chimic a peptidelor. Un agent mult utilizat n acest scop este clorocarbonatul de benzil, care conduce la formarea derivatului benziloxicarbonil al aminoacidului, numit i derivat carbobenzoxi:
H R NH2 COOH + O Cl O - HCl H R COOH NH O O

Cnd acilarea este realizat n condiii blnde, integritatea stereochimic a atomului de carbon a se pstreaz; n condiii drastice, la cald, poate aprea racemizarea. O reacie a gruprii -amino foarte larg folosit, reacia cu ninhidrin, poate fi utilizat pentru dozarea unor cantiti foarte mici de aminoacizi. Prin nclzire, un -aminoacid reacioneaz cu dou molecule de ninhidrin i rezult un produs intens colorat:

12

HO O HO H R NH2 COOH + O OH O - RCHO - CO2 O HO H O

OH O

O - 2H2 O O N

Aminoacizii i peptidele cu grupri -amino libere dau cu ninhidrina o coloraie albastru-violet, n timp ce prolina i hidroxiprolina, n care gruparea -amino este substituit, formeaz derivai cu o culoare galben caracteristic. Gruprile -amino ale aminoacizilor reacioneaz reversibil cu aldehidele i formeaz compui numii baze Schiff:
COOH H R NH2 + RCHO + H 2O - H2 O COOH H R N CHR

Se pare c bazele Schiff sunt compui intermediari ntr-un numr de reacii enzimatice care implic interacia enzimei cu gruprile amino sau carboxil ale substratului. O alt reacie important a gruprii amino este reacia cu cianatul, din care se formeaz derivai carbamil:
COOH H R NH2 + CNO +H
+

COOH H R NH O

NH2

Aceast reacie a fost folosit pentru a modifica proprietile hemoglobinei S patologice (ntlnit n anemia falciform cu hematii n form de secer), n sensul creterii asemnrii ei cu hemoglobina normal. n afar de aceste reacii ale gruprii amino, multe altele sunt deosebit de utile n marcarea restului de aminoacid de la acel capt al lanului polipeptidic la care gruparea amino este liber sau necombinat, i anume, captul amino-terminal. Reaciile radicalilor R Aminoacizii dau i reacii calitative de culoare, tipice pentru anumite funciuni prezente n radicalii lor, de exemplu gruparea tiol a cisteinei, hidroxilul fenolic al 13

tirozinei i gruparea guanidin a argininei. Dei aceste reacii de culoare sunt folositoare uneori pentru colorarea spoturilor sau pentru identificri calitative, aminoacizii sunt identificai mai precis i msurai n concentraii foarte mici cu ajutorul metodelor cromatografice. Totui, unele grupri funcionale din catenele laterale ale aminoacizilor joac roluri importante n activitatea biologic a proteinelor, printre ele numrndu-se gruparea tiol sau sulfhidril a cisteinei. Aceast grupare nalt reactiv este susceptibil de a fi oxidat la disulfur de oxigenul atmosferic n prezena srurilor de fier, sau de ali ageni oxidani blnzi. Produsul de oxidare este cistina:
COOH H NH2 SH + H HS COOH NH2 - H2 H COOH NH2 H S S COOH NH2

Legtura disulfuric formeaz o punte covalent ntre dou resturi de cistein. O alt reacie caracteristic i important a gruprii tiol a cisteinei este reacia cu metale grele ca Hg2+ i Ag+, care formeaz mercaptani:
COOH H NH2 SH + Ag
+

COOH -H
+

NH2 S Ag

Gruprile tiol ale resturilor cisteinei i cistinei din peptide i proteine pot fi msurate printr-o reacie cantitativ, cu reactivul Ellman, n care se formeaz un produs care poate fi msurat colorimetric:

14

COOH H NH2 + O 2 N SH

COOH

COOH NO 2

S S

COOH H NH2 S S

COOH NO 2 + O2 N

COOH

SH

Aceste grupri tiol ale resturilor specifice de cistein, n anumite molecule enzimatice, joac un rol important n activitatea lor catalitic; modificarea unor asemenea grupri tiol prin reacii ca cele descrise mai sus, deseori, inactiveaz enzima. Cistina, forma oxidat a cisteinei joac un rol special n structura proteic, ntruct gruparea ei disulfuric servete ca o punte de legtur covalent ntre dou lanuri polipeptidice sau ntre dou puncte ale aceluiai lan. Puntea disulfuric poate fi desfcut prin aciunea agenilor reductori, de exemplu mercaptoetanolul, care transform cistina n dou molecule de cistein:
COOH NH2 H S S COOH NH2 + 2 HS OH SH 2H COOH NH2 + S S HO OH

Cistina poate fi oxidat i de ageni ca acidul performic, rezultnd dou molecule de acid cisteic. Att gruprile sulfhidril ct i cele disulfurice sunt distruse n soluii puternic alcaline, cu formarea unor produi de reacie.

Bibliografie
1. Lehninger, A..L., Biochimie, Ed. Tehnic, Bucureti

15

2. C. D. Neniescu Tratat Elementar de Chimie Organic, vol. II, Ed. Tehnic, Bucureti, 1958 3. L. Brs Chimia Compuilor Organici (curs an III, sem. I), cap. Aminoacizi 4. V. unel Chimia Compuilor Organici (curs an III, sem. II), cap. Aminoacizi

16