GENETICA BACTERIILOR

Procariotele
 Impartirea lumii vii in eucariote si procariote este cea mai
importanta si evidenta separare a viului

 Eucariotele sunt definite ca avand materialul genetic inclus intr-o

structura ce-l separa de citoplasma – membrana nucleara. In plus,
eucariotele poseda si alte structuri separate de citoplasma prin
intermediul membranelor - mitocondrii, lisosomi, reticul
endoplasmatic. Majoritatea organismelor multicelulare sunt
eucariote.

 In contrast, genomul procariotelor nu se gaseste plasat intr-un

compartiment celular separat; genomul este localizat in citoplasma,
uneori intr-o regiune anume, care a primit denumirea de nucleoid.
Procariotele nu contin organite cu membrane; singura lor
membrana este cea care separa mediul intern al celulei de mediul
extern. Imensa majoritate a procariotelor sunt unicelulare.
Cele trei domenii ale viului
 Genetica procariotelor vs. genetica
eucariotelor
 Procariotele sunt haploide si contin un cromosom. Suplimentar,
multe procariote contin si mici molecule ADN circulare, numite
plasmide, care le confera celulelor purtatoare, proprietati utile
pentru supravietuire, cum ar fi de exemplu, rezistenta la
antibiotice.

 Eucariotele sunt in mod uzual diploide, au cromosomi liniari, de

regula, mai multi de 1.

 La eucariote, transcriptia genelor in ARNm are loc in nucleu, iar

translatia ARNm si sinteza proteinelor se desfasoara in citoplasma.
Cele doua procese sunt deci, separate in spatiu si timp.

 La procariote, translatia este cuplata cu transcriptia: translatia,

deci sinteza proteinei, de pe informatia unui ARNm incepe inainte
ca sinteza acelui ARNm sa fie finalizata.
Culturile bacteriene
 In mod surprinzator, nu toate bacteriile cunoscute pot fi
cultivate in laborator.

 Bacteriile necesita seturi foarte specifice de nutrienti, un aport

corect de oxigen si o temperatura in acord cu necesitatile lor
de crestere. Cea mai obisnuita bacterie intestinala, Escherichia
coli (E. coli), creste cu usurinta pe medii continand hidrolizate
de drojdii si produse animale, la 37o C, in atmosfera normala.
Datorita necesitatilor relativ simple de crestere, E. coli a
devenit un organism de laborator favorit, utilizat ca model si in
studiul altor bacterii.
 Bacteriile se pot dezvolta, in general, atat in culturi
lichide, cat si pe mediu solid, cand formeaza
colonii.

 “Bulionul” nutritiv lichid permite o crestere foarte

rapida, pana la o densitate maxima a culturii. Este
o modalitate rapida si ieftina de cultivare a
bacteriilor.

 In mediile solide se adauga aceleasi componente,

dar si agar, pentru solificare. Agarul este o
polizaharida extrasa din alge, pe care majoritatea
bacteriilor o pot metaboliza.

 Scopul cultivarii pe medii solide este de a izola

celule bacteriene individuale, fiecare formand, prin
diviziuni, o colonie. Acesta este procedura standard
pentru obtinerea culturilor pure de bacterii. Prin
cultivare pe mediu solid, fiecare celula dintr-o
anumita colonie este extrem de strans inrudita cu
toate celulele din acea colonie, iar variabilitatea
este extrem de redusa.

 Mediile solide se pot folosi si pentru aprecierea

numarului de celule dintr-o cultura.
Mutante bacteriene
 Cele mai multe mutante bacteriene sunt de natura biochimica.

 Cele mai importante mutante sunt mutantele auxotrofe. Un auxotrof

necesita pentru crestere un anumit nutrient, pe care o tulpina de tip salbatic
(prototrofa) si-l poate prepara singura, utilizand componentele simple ale
mediului. De exemplu, un auxotrof trp, nu-si poate sintetiza triptofanul
necesar cresterii . Pentru a cultiva bacterii trp - , este necesara adaugarea de
triptofan in mediu. Prototrofii sunt trp+; nu necesita suplimentarea
mediului cu acest aminoacid, deoarece il pot sintetiza.

 Chemoauxotrofele sunt mutante care nu pot utiliza un anumit nutrient (de

regula un glucid), pe care prototrofii il utilizeaza ca sursa de hrana. De
exemplu, mutantele lac- nu pot creste pe medii cu lactoza, in timp ce
prototrofii lac+ o pot face.

 Mutantele de rezistenta sunt insensibile (rezistente) la anumiti factori din

mediu: antibiotice, metale grele, infectia cu bacteriofagi, etc. De exemplu,
bacteriile AmpR sunt rezistente la actiunea ampicilinei, antibiotic uzual,
inrudit cu penicilina.

 Mutatiile auxotrofe si chemoauxotrofe sunt de regula recesive, in timp ce

mutatiile de rezistenta sunt, de obicei, dominante.
Replica Plating
 O cale obisnuita de a depista mutante bacteriene este pe calea producerii
de replici ale coloniilor bacteriene , pe placi Petri continand mediu cu diferite
compozitii. Metoda poarta denumirea de replica plating.

 De exemplu, daca suntem in cautarea de mutante trp-, deci auxotrofe, vom

cultiva bacteriile pe o placa cu mediu continand triptofan si vom face replica
plating pe o placa ce nu contine triptofan. Coloniile care nu vor creste, sunt
coloniile auxotrofe.

 Bacteriile sunt deci initial distribuite pe mediul permisiv, care va permite atat
auxotrofilor cat si prototrofilor sa se dezvolte (in cazul de fata, placa va
contine triptofan). Dupa un timp necesar aparitiei coloniilor, se preseaza o
piesa acoperita cu catifea sterila, pe suprafata primei placi si, respectand
exact pozitia, se atinge cu catifeaua, suprafata unui mediu restrictiv (fara
triptofan) dintr-o a doua placa Petri. Catifeaua va transfera cateva celule din
fiecare colonie, intr-o pozitie identica primei placi.

 Coloniile care vor creste pe mediu restrictiv vor fi cele prototrofe, in timp ce
coloniile care nu vor mai creste vor fi probabil cele trp-, care se dezvolta doar
in conditiile in care mediul este suplimentat cu triptofan.
Operonul:
Reglajul expresiei genelor la bacterii
Controlul expresiei genelor
Stim ca:
… Celulele bacteriene efectueaza un numar enorm de
reactii chimice catalizate de catre enzime;
Si
….. Celulele bacteriene raspund extrem de rapid
schimbarilor de mediu (de exemplu, la aparitia unei
noi surse de carbon)
Deci
…. controlul productiei de enzime este EXTREM de
important si trebuie sa fie foarte eficient
 Reglajul enzimatic
Activitatea enzimatica poate fi reglata prin inhibitia de tip
feedback a cantitatii de enzime sintetizate
DAR producerea de enzime inseamna consum de energie, iar o
bacterie nu produce TOATE enzimele sale, TOT TIMPUL *
DECI este normal ca atunci cand nu este nevoie de o anumita
enzima, sinteza sa sa fie oprita
Astfel, numeroase gene ai caror produsi (enzime) sunt implicati
in metabolismul lactozei sau a producerii de aminoacizi, sunt
exprimate doar atunci cand respectiva activitate enzimatica
este necesara.

* Circa 60-80% dintre genele unei bacterii nu sunt reglate si au o expresie

continua, la un nivel scazut, expresie constitutiva
Reglajul expresiei genelor

Enzime constitutive – fara

reglaj

activitate indusa

activitate represata
Procesul de transcriptie joaca un rol esential in
abilitatea bacteriilor de a se adapta la
schimbarile de mediu.

Nivelul de expresie a anumitor proteine este

deci controlat la nivel de transcriptie (sinteza
ARNm).
Represia
 Inhibarea expresiei genice
 cel mai frecvent este raspunsul
la un exces de produs final, care
determina blocarea sintezei
enzimei respective
 Este mediata de proteine
reglatoare numite represori
 Acestia blocheaza ARN
polimeraza sa initieze transcriptia
 Genele de tip represibil se
transcriu pana in momentul in
care sunt represate
 Inductia
 Provoaca declansarea transcriptiei unei gene
 O substanta care induce transcriptia unei gene
se numeste inductor, iar acest rol il joaca
frecvent, chiar substratul
 Enzimele sintetizate in prezenta unor inductori
se numesc enzime inductibile
 Examplu: genele ai caror produsi sunt necesari
pentru metabolizarea lactozei
 Genele inductibile nu se transcriu pana nu sunt
induse
Operonul

ARNm

promotor operator
proteine

 La bacterii, numeroase gene sunt plasate alaturat si

au aceeasi orientare
 Genele unui operon sunt trascrise sub forma unui
singur transcript ARN, care va fi translat in mai
multe proteine
 Mecanismul de reglaj controleaza practic transcriptia
ARNm al operonului in intregime
 Termenul “operon” nu include doar genele
structurale ci si secventele reglatoare care
controleaza transcriptia
 Promotor – situsul la care se cupleaza ARN
polimeraza
 Operator – situsul la care se cupleaza proteina cu
functie reglatoare

promotor operator ARNm

Operoni si reglaj

 Circa 27% dintre genele de la E. coli sunt

grupate in operoni
 Numeroase gene grupate in operoni sunt
reglate
 genele a caror expresie este necesara pentru
utilizarea lactozei sunt controlate de prezenta
lactozei
 genele ai caror produsi sunt necesari in patogeneza
sunt frecvent controlate de temperatura sau de un
factor fiziologic
 Doua exemple de reglaj al
operonilor

 Operonul lac
 Codifica enzime inductibile implicate in preluarea si
utilizarea lactozei

 Operonul arg
 Codifica enzime anabolice represibile implicate in
productia aminoacidului arginina
 Controlul transcriptional

 Exista doua mecanisme de control care regleaza

transcriptia ARNm si implicit, sinteza proteinelor
corespunzatoare

 Inductia – declansarea expresiei genice

 Represia – anularea expresiei genice

Operonul lac
 Contine trei gene structurale
 lacZ: codifica β-galactozidaza: hidrolizeaza lactoza la glucoza si
galactoza
 lacY: o permeaza implicata in transportul lactozei
 lacA: o transacetilaza cu funtie necunoscuta
 Gena reglatoare lacI
 Proteina LacI este un represor al operonului lac
 Un promotor la nivelul caruia se cupleaza ARN polimeraza, in
vederea transcrierii operonului
 Un situs operator la nivelul caruia se cupleaza proteina
represor LacI in vederea blocarii transcriptiei
Structura operonului Lac
 In absenta lactozei
 Represorul se leaga la operator, impiedicand
cuplarea ARN polimerazei si deci, transcriptia
 In prezenta lactozei
 Operonul Lac este
un operon inductibil
 Lactoza actioneaza
ca inductor
 Lactoza induce
expresia enzimatica
prin cuplarea cu
represorul LacI,
care va fi astfel
impiedicat sa se
cupleze cu situsul
operator,
permitand astfel
transcriptia
Operonul arg

 Este un operon represibil: genele se transcriu

pana ce transcriptia lor este blocata (represata)

 Contine trei gene structurale argC, B, and H, care

codifica trei enzime implicate in calea de
biosinteza a argininei
 In absenta argininei
 Operonul arg
este transcris,
cu producerea
enzimelor
necesare
biosintezei
argininei
 In prezenta argininei

 Arginina
actioneaza ca un
corepresor si
blocheaza
propria sa
biosinteza
 Este un proces
similar inhibitiei
de feedback
 Producerea a numeroase proteine bacteriene este controlata
pe baza reglajului trascriptional

 Genele inrudite functional sunt aranjate sub forma de

operoni si sunt supuse unui reglaj coordonat
 Operonii pot fi:
 Indusi sa functioneze de catre prezenta substratului
 Represati de prezenta produsului final

 Mecanismele de transcriptie pot fi mult complicate de

prezenta la nivelul ADN-ului a secventelor activator si/sau
atenuator.
MUTATII
Variabilitatea genetica
 Numeroasele diferente dintre microorganisme sunt
rezultatul mutatiilor si recombinarii genetice,
urmate de selectie

 Mutatia: este o modificare a secventei de baze

azotate a ADN-ului

 Mutatiiile pot fi benefice, neutre sau nocive

 Mutatiile sunt schimbari la nivelul genotipului care

se pot sau nu exprima fenotipic
 Tipuri de mutatii

 Substitutii de baze azotate

 este cel mai comun tip de mutatie
 o singura baza azotata este inlocuita de o alta
 Mutatiile frame shift
 una sau mai multe baze azotate sunt inserate sau
sufera o deletie, la nivelul ADN
 rezultatul este o modificare a cadrului de citire al
codonilor
Diferite tipuri de
mutatii punctiforme
Consecintele substitutiilor de
baze
 Mutatii silentioase: modificarea de baze azotate nu
produc modificarea secventei de aminoacizi de la
nivelul proteinei translate

 Mutatiile silentioase nu au efect asupra fenotipului

 Este rezultatul faptului ca exista mai multi codoni care

codifica aceeasi aminoacizi
 Ex., AGU si AGC codifica serina
 Mutatii cu sens gresit: schimbarea de baze provoaca
modificarea aminoacidului translat
  Substitutia de aminoacid provocata de o mutatie
cu sens gresit poate sa aiba efect asupra
functionarii proteinei, SAU
 poate aboli activitatea unei proteine, ori poate
altera functia acestia, de o maniera care sa se
regaseasca la nivelul fenotipului
Examplu: anemia cu celule in forma de secera (sickle cell
anemia) la om este provocata de o mutatie cu sens gresit
a unei gene pentru globina. Ca rezultat, forma hematiilor
se modifica, iar acest lucru altereaza capacitatea lor de
deplasare de-a lungul capilarelor.
 Mutatiile nonsens: schimbarea bazei azotate
provoaca aparitia unui codon stop, in locul unuia
codificator
 Ca rezultat se sintetizeaza o proteina mai scurta, de
obicei, nefunctionala.
Consecintele mutatiilor frameshift
 Mutatiile frameshift : aditia sau deletia uneia sau mai
multor baze azotate
 apar codoni gresiti, prin modificarea cadrului de citire
 Se transleaza secvente modificate si nefunctionale de
aminoacizi.
Tipuri de mutatii in functie
de modul de producere
 Mutatii spontane
 apar in absenta unui agent cauzator
 apar datorita erorilor ocazionale aparute in timpul
replicarii ADN

 Mutatii induse
 Sunt provocate de mutageni, cum sunt
substantele chimice, radiatiile etc.
 Mutagenii chimici
 Exemplu: acidul nitros modifica structura adeninei, astfel incat
aceasta va forma pereche cu citozina, in loc de timina
 Exemplu: bromura de etidiu se insera intre bazele
azotate, provocand mutatii frameshift

 Exemplu: analogii nucleotidici pot substitui o

baza azotata dar au alte proprietati de
imperechere complementara. Unii dintre acestia
sunt folositi in terapii antivirale si anti-tumorale
ca inhibitori de sinteza a ADN
Radiatiile
 Radiatiile ionizante: razele X si razele gamma produc formarea de ioni
care reactioneaza cu nucleotidele (provoaca schimbari de baze) si cu
scheletul glucido-fosforic (provoaca rupturi ale cromosomilor).

 Radiatiile UV induc formarea de legaturi covalente intre timine plasate

alaturat pe aceeasi catena, cu aparitia de dimeri de timina care blocheaza
replicarea
 Repararea ADN
 Atat eucariotele cat si
procariotele au capacitatea de
a-si repara ADN-ul
 ADN fotoliaza recunoaste si
repara dimerii de timina
utilizand energia luminii
(fotoreactivare)
 In general, sistemul de reparatie
prin excizie elimina bazele
azotate incorect adaugate,
bresele produse fiind inchise cu
ajutorul ADN Pol I si ligazei
Frecventa mutatiilor

 Rata de mutatie este reprezentata de

probabilitatea ca o gena sa sufere o mutatie/
ciclu de diviziune al celulei
 rata de mutatie spontana la E.coli = 1 la 109
baze replicate sau 1 la 106 gene replicate
 Mutagenii cresc rata de mutatiede 10-1000x,
pana la niveluri de 1 din 103 gene replicate
Importanta medicala a
mutatiilor la bacterii
 Bacteriile pot suferi mutatii la forme mai virulente

 Pot suferi mutatii care sa le confere rezistenta la antibiotice,

sau, bacteriilor deja rezistente sa le sporeasca rezistenta la
antibiotice. Acest fenomen este foarte important in mediile
spitalicesti si in fermele de animale, fenomenul fiind
determinat de expunerea constanta la presiunea selectiva
exercitata de catre antibiotice

 Odata achizitionate, caracteristicile de virulenta sporita si

rezistenta la antibiotice pot fi transferate de la o bacterie la
alta.
 Identificarea mutantelor la
bacterii
 Data fiind rata de mutatie, este evident ca intr-o
populatie bacteriana foarte mare, doar cateva celule
vor fi mutante
 Detectia mutantilor poate fi facuta pe doua cai:
 Selectie pozitiva (directa), in care celulele mutante se
dezvolta sau au aspect diferit
 ex., mutantele de rezistenta la penicilina pot fi identificate prin
expunerea la antibiotic. Celulele mutante, rezistente, se vor
dezvolta, in timp ce celulele de tip salbatic, nu.
 Selectia negativa (indirecta), in care detectia mutantilor se
face pe baza incapacitatii lor de a se dezvolta.
 ex., mutantele in biosinteza histidinei nu pot creste in absenta
histidinei in mediu, in timp ce celulele normale o pot face.
Selectie negativa prin replica
plating
Testul Ames pentru detectia carcinogenilor
chimici
 Bazele testului Ames
 utilizeaza tulpini de Salmonella his- (necesita histidina)
 mutagenii pot provoca reversia (mutatie inapoi) mutatiei,
permitand mutantilor sa cresca pe medii nesuplimentate
cu histidina
 Circa 90% dintre substantele identificate ca
mutagene de testul Ames, au fost confirmate ca
avand efect carcinogen la animale
 In general, cu cat potentialul mutagenic al unei
substante este mai mare, cu atat este mai mare si
capacitatea sa carcinogena
 In prezenta
carcinogenului,
mutantele his-
Salmonella pot
suferi reversia la
tipul salbatic his+