Canabisul a îmbunătățit

deficiențele motorii și modificările

în moleculele legate de plasticitatea
sinaptică în striatum la șobolanii
tratați cu 6-OHDA. (6 –
hydroxidopamina)

Coordonator: Prof. univ. dr. habil. Student:

Lucian Hrițcu Ciobanu Andrei
CUPRINS:

01 02
Introducere Materiale și metode

03 04
Rezultate Discuții și concluzii
 Introducere
Boala Parkinson (PD) implică deteriorarea căii dopaminergice nigrostriatale,
provocând deficit de dopamină în striatum și generând tulburări motorii precum
tremor, rigiditate și bradikinezie.
Tratamentele actuale sunt limitate, iar cercetarea privind efectele marijuanei în PD
sunt controversate.
Acest studiu se concentrează pe interacțiunile anormale în striatum, inclusiv
internalizarea receptorilor D1 de dopamină și nivelurile reduse de PSD-95 (Discs
Large Homolog 4 sau DLG4) și D1R (receptorul D1 de dopamină) în PD.
Marijuana (canabisul), prin compușii săi principali CBD (cannabidiol) și THC
(Tetrahidrocanabinol), datorită interacțiunii acestora cu neurotransmițători precum
dopamina, glutamatul și serotonina, poate avea potențiale beneficii medicale.
Studiul investighează efectul marijuanei în tulburările motorii induse de 6-OHDA,
analizând nivelurile de PSD-95 și D1R în striatum.
Materiale
și metode

Here is where your presentation begins

 1. Extractul de marijuana

 Frunzele uscate de cannabis au fost măcinate și transformate într-un extract metanolic.

 Acesta a fost obținut prin înmuierea a 100 g de pulbere de marijuana în 1000 mL de

metanol 80%, urmată de filtrare și evaporare.

 Conținutul de tetrahidrocannabinol (THC) a fost cuantificat prin HPLC, iar extractul

uscat a conținut 8,5% Δ9-THC.

 Extractul a fost stocat la -20 °C și utilizat în experimente, fiind administrat intraperitoneal

la o doză de 60 mg/kg de Δ9-THC.
 2. Animalele Șobolanii au fost distribuiți aleatoriu în șase grupuri experimentale,
fiecare conținând 7 șobolani:
(I) Control: nu au suferit nicio intervenție chirurgicală și nu au
primit niciun medicament.
În studiu au fost folosiți șobolani
(II) Vehicul: celor supuși unei intervenții de stereotaxie li s-a
Wistar adulți de sex masculin, cu o
administrat soluție salină cu 0,2% acid ascorbic ca vehicul.
greutate cuprinsă între 250 și
300g. (III) Leziune: cei supuși intervenției chirurgicale de stereotaxie au
primit 6-OHDA (8 μg/3 μl) .
Înainte și în timpul studiului,
animalele: (IV) Leziune + DMSO (dimetilsulfoxid): cei supuși intervenției
chirurgicale de stereotaxie au primit 6-OHDA (8 μg/2 μl) și DMSO
 au fost ținute în cuști de
ca vehicule pentru marijuana.
polipropilenă,
(V) Leziune + Marijuana: cei supuși intervenției chirurgicale de
 câte patru în fiecare cușcă,
stereotaxie au primit atât 6-OHDA, cât și marijuana (60 mg/kg,
 la o temperatură controlată de i.p.).
24 ± 1 °C
(VI) Marijuana: nu au suferit nicio intervenție chirurgicală și au
 ciclu de lumină-întuneric 12 primit doar marijuana (60 mg/kg, i.p.).
ore,
(VII) Leziune + L-dopa (control pozitiv): un grup de șobolani cu
 având acces liber la hrană leziuni induse de 6-OHDA au primit L-dopa (10 mg/kg) împreună
(dieta standard pentru cu benserazidă (6,5 mg/kg) (de două ori pe zi, i.p.). Benserazida a
rozătoare) și apă. fost administrată pentru a preveni decarboxilarea L-dopa în
 3. Designul experimental

 Sub anestezie cu ketamină și xilazină (80 și 10 mg/kg, i.p., respectiv), șobolanii au fost fixați într-un
cadru stereotaxic în poziție plană, cu bara incisivului poziționată la 3,3 mm sub linia interaurală.
 O canulă ghid (22-gauge, oțel inoxidabil) a fost implantată și fixată chiar deasupra (la 1 mm) SNc
(substantia nigra compacta) drepte.
 La animalele cu leziuni, 8 mg de 6-OHDA au fost dizolvați în 3 mL de soluție salină cu 0,2% acid
ascorbic și injectați treptat în SNc dreaptă cu o viteză de 1 μL/min.
 Șobolanilor din grupul vehicul li s-a efectuat aceeași procedură, dar li s-au administrat 2 μL de
vehicul (soluție salină cu 0,2% acid ascorbic) în SNc.
 Animalelor li s-a permis să se recupereze de la anestezie și apoi au fost plasate în cuști individuale.

 După o săptămână, în perioada de recuperare, marijuana a fost dizolvată în DMSO și injectată

intraperitoneal timp de 26 de zile consecutive.
 Șobolanilor din grupul Leziune + DMSO li s-a administrat 6-OHDA ca neurotoxină și DMSO ca
vehicul pentru marijuana.
4. Evaluările comportamentale

Au fost efectuate la o oră după ultima injecție de marijuana

(33 de zile după intervenție chirurgicală).
Testele comportamentale motorii au inclus:
 testul la bârna de echilibru,
 testul barei,
 testul traversării bârnei,
 testul rotarod.
Toate testele au fost efectuate de aceeași persoană, la
aceeași oră a zilei (între 9 dimineața și 2 după-amiaza), cu
un interval de 30 de minute între experimente.
 5. Rotatiile induse de apomorfină
Șoarecii au fost testați pentru comportamentul rotational în urma injectării
de apomorfină la diferite intervale, inclusiv la 1 lună după injecția cu
marijuana. Rotațiile contralaterale și ipsilaterale au fost înregistrate și
calculate pentru a evalua impactul substanței asupra comportamentului
motor.
6. Testul rotarod cu accelerare și testul pe bârna de echilibru
Aparatul rotarod a fost utilizat pentru testarea abilităților motorii ale șoarecilor la viteze progresiv crescânde.

După o perioadă de adaptare la aparat, au fost supuși unui

protocol de accelerare pe rotorod, iar timpul până la căderea lor a
fost înregistrat.

De asemenea, testul pe
bârna de echilibru a evaluat
coordonarea pe o grindă
orizontală, măsurând timpul
petrecut pe aceasta.

https://qpsneuro.com/in-vivo-services/behavioral-tests/
Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Rotarod_performance_test motor-ability-tests/beam-walk-test
/
 7. Testul de traversare a bârnei
A evaluat coordonarea motorie și echilibrul șoarecilor pe o bârnă
îngustă (2,5 × 100 cm).
• au fost eliberați să traverseze bârna de la lumină intensă către o
cutie goală plasată la capătul opus al bârnei.
• timpul de traversare a bârnei și timpul în care picioarele din spate
au fost plasate complet în cutia țintă au fost înregistrați.
• dacă un animal nu a reușit să completeze traversarea bârnei, https://
testul s-a încheiat la 2 minute (timpul de întrerupere). www.viennabiocenter.org/vbcf/preclinical-phenotyp
ng/behavioral-tests-and-equipment
/
8. Testul barei
 A constat în plasarea membrelor anterioare ale șoarecilor pe o bară (9 mm în
diametru), fixată la o înălțime de 9 cm de la suprafață.
 Durata menținerii acestei poziții a fost determinată ca intensitate a
catalepsiei.
 Punctul final al catalepsiei a fost considerat atunci când se efectuau mișcări
exploratorii ale capului sau deplasarea uneia sau ambelor membre
anterioare.
 Timpul de întrerupere al testului a fost de 120 de secunde, iar testul s-a
https://mindthegraph.com/illustrations/horizontal-bar-test-mice
repetat de trei ori, cu intervale de 10 minute, calculându-se media latentei.
9. Analiza prin Western blot pentru proteine
10. Analizele statistice
sinaptice

 Țesutul cerebral, mai precis striatul drept, a fost  Au fost efectuate cu ajutorul
omogenizat și supus unor pași succesivi de software-ului IBM SPSS Statistics
centrifugare pentru a obține fracțiuni de sinaptosome. 22.

 Aceste fracțiuni au fost apoi suspendate într-un  Datele au fost exprimate ca medie
tampon RIPA și supuse ulterior electroforezei SDS- ± S.E.M.
PAGE pentru separarea proteinelor.  Valorile blotting au fost exprimate
 După transferul proteinelor pe membrane PVDF, ca raport între proteinele testate și
acestea au fost tratate cu anticorpi specifici pentru β-actin per eșantion.
PSD-95 și D1, urmate de detecția complexelor  Media diferitelor grupuri a fost
anticorp-antigen cu ajutorul unui sistem ECL. comparată prin analiza ANOVA,
 Analiza intensității benzilor de blotting a fost realizată urmată de testul Tukey.
cu ajutorul software-ului de analiză.  Valoarea P < 0,05 a fost
 β-actina a fost utilizată ca și control de încărcare. considerată semnificativă din punct
de vedere statistic.
 Rezultatele au fost prezentate ca raport între
proteinele testate și β-actin pentru fiecare eșantion.
 Rezultate

1 2 3 4 5
1. Marijuana a redus rotațiile contralaterale
la șobolanii cu leziuni induse de 6-OHDA: - Înainte de intervenție,
niciun grup nu a prezentat
rotații la apomorfină.
- Șobolanii cu 6-OHDA au
avut rotații semnificative,
reduse de marijuana.
- Fără diferențe între
grupurile leziune + marijuana
și leziune + L-dopa.
- După 26 de zile, marijuana
a redus semnificativ rotațiile
comparativ cu leziunea.
- Nu au fost diferențe
Efectul marijuana și al L-dopa asupra rotațiilor contralaterale induse de apomorfină. semnificative între grupul
*** = p<0.001 control și vehicul marijuana și control în rotații.
### = p<0.001cu grupul cu leziune în aceeași săptămână
 2. Marijuana a îmbunătățit performanța
motorie la șobolanii injectați cu 6-OHDA:

• A redus timpul până la cădere în testul pe rotarod în comparație

cu grupurile netratate și lesionate + DMSO.
• A îmbunătățit performanța pe bârdă în comparație cu grupurile
netratate și lesionate + DMSO.
• Animalele din grupurile de control, vehicul și marijuana au reușit
să se mențină în echilibru pe bârna de echilibru, în timp ce
animalele tratate cu 6-OHDA au avut un timp semnificativ mai
scurt pe bârnă în comparație cu grupurile de control.
• Grupul leziune + marijuana a reușit să stea mai mult pe bârnă
decât animalele din grupurile leziune și leziune + DMSO; totuși,
această îmbunătățire a fost semnificativ mai scurtă decât în
grupul de control.
• Fără diferențe semnificative față de grupul cu leziuni + L-dopa.

Efectul marijuana și al L-dopa asupra (A) timpului de

cădere în performanța pe rotarod și (B) timpului de
echilibrare în testul de echilibru
3. Marijuana a îmbunătățit testul de traversare a bârnei la șobolanii injectați cu 6-
- Timpul necesar pentru traversarea bârneiOHDA:
a fost semnificativ redus în grupul cu
leziuni + marijuana comparativ cu grupul cu leziuni.
- Îmbunătățire semnificativă față de grupurile cu leziuni și leziuni + DMSO.
- Performanță semnificativ mai bună decât grupul cu leziuni.
- Fără diferențe semnificative față de grupul cu leziuni + L-dopa în ceea ce privește
timpul de traversare și timpul de staționare pe bârnă.

Efectul marijuana și al L-dopa asupra (A) timpului de traversare a bârnei și (B)

timpului staționare pe bârnă în testul de traversare a bârnei
4. Marijuana a îmbunătățit performanța în testul la bară la șobolanii injectați cu 6-OHDA:

- Compararea între grupurile de control și vehicul nu a arătat diferențe semnificative în timpul pe bara
de susținere (P > 0.05).
- Grupurile de control, vehicul și marijuana nu au
prezentat semne de catalepsie.
- Timpul pe bara de susținere la animalele tratate
cu marijuana a fost semnificativ mai scăzut decât
la cele din grupurile de control și vehicul (P <
0.05).
- 6-OHDA a indus o creștere semnificativă a
timpului de catalepsie în grupurile cu leziuni,
leziuni + DMSO și leziuni + marijuana (P <
0.001).
- Tratamentul cu marijuana a redus semnificativ
timpul de catalepsie în grupul cu leziuni + Efectul marijuanei și al L-dopa asupra
marijuana comparativ cu grupul cu leziuni (P timpului de catalepsie în testul pe bară
<.,001).
- Rezultatele comparării între grupul cu leziuni + marijuana și grupul cu leziuni + L-dopa au arătat o
îmbunătățire semnificativă în reducerea timpului de catalepsie în grupul cu leziuni + L-dopa.
 5. Marijuana a îmbunătățit nivelul de
proteine PSD-95 și D1R în striatum:
- Deoarece nu au existat diferențe semnificative între grupurile
de control și vehicul, precum și între grupurile de leziuni și
leziuni + DMSO în teste comportamentale, grupurile leziuni +
DMSO și vehicul nu au fost incluse în analiza moleculară.
- Rezultatele au arătat că 6-OHDA a redus semnificativ
nivelurile de PSD-95 și D1R în grupurile care au consumat 6-
OHDA în comparație cu animalele de control (P < 0,001)
- Marijuana a îmbunătățit semnificativ nivelurile de PSD-95 și
D1R în grupul cu leziuni + marijuana comparativ cu animalele
cu leziuni.
- De asemenea, marijuana a crescut semnificativ nivelul de D1R
la șobolanii tratați cu marijuana în comparație cu animalele de
control (P < 0,05).
- În mod surprinzător, rezultatele au arătat că nu au existat
diferențe semnificative în nivelul de PSD-95 și D1R între
grupurile de leziuni + marijuana și leziuni + L-dopa (P > 0.05).
Efectul marijuana și al L-dopa asupra (A)
receptorului D1 și (B) PSD-95 în striatum
 Discuții și concluzii
În prezentul studiu, s-a observat o
 Degenerarea căii nigrostriatale a cauzat disfuncții motorii la creștere a comportamentelor
pacienții cu Parkinson. În acest studiu, injectarea unilaterală intra- exploratorii, cum ar fi reducerea
SNc cu 6-OHDA a condus la tulburări motorii (creșterea rotației timpului pe bară și performanța la
contralaterale, catalepsia și timpul de înghețare, precum și rotarod în grupul tratat cu marijuana.
reducerea echilibrului motor și a coordonării motorii) la șobolani.

 Câteva studii sugerează că receptoarele de  Nivelurile de proteine PSD-95 și D1R au fost reduse
cannabinoid sunt responsabile pentru semnificativ în grupurile injectate cu 6-OHDA, iar
majoritatea efectelor comportamentale ale tratamentul cu marijuana a îmbunătățit aceste niveluri
medicamentelor cannabimimetice. în grupul cu leziuni + marijuana. Se sugerează că
Administrarea de agonizanți ai receptorilor de marijuana a afectat activitatea căilor de ieșire striatale
cannabinoidi îmbunătățește deficiențele motorii și, astfel, a contribuit la acțiunile sale terapeutice.
în modelele animale cu Parkinson, posibil prin
mecanisme non-dopaminergice.

 În concluzie, consumul de
 Unele studii clinice au demonstrat că tratamentul cu marijuana a dus la o îmbunătățire
marijuana medicală este asociat cu o scădere a a nivelurilor de PSD-95 și D1R și
tulburărilor motorii la pacienții cu Parkinson. Acest a ameliorat tulburările motorii
studiu a arătat că tratamentul cu marijuana a redus induse de 6-OHDA la șobolani.
tulburările motorii la șobolanii cu leziuni provocate de 6-
OHDA.
 Vă mulțumesc!

CREDITS: This presentation template was created by Slidesgo, including icons by

Bibliografie:
Flaticon and infographics & images by Freepik
Komeili, G., Haghparast, E., & Sheibani, V. (2021). Marijuana improved motor
impairments and changes in synaptic plasticity-related molecules in the
striatum in 6-OHDA-treated rats. Behavioural Brain Research, 410, 113342.