LUCRARE PRACTICĂ 13

Evaluarea eficacității unui medicament nou în studii experimentale pe animale – alegerea

modelului experimental, definirea loturilor experimentale și a determinărilor necesare
(exemple – cardiovascular, neurologic, metabolic, oncologic).
Evaluarea toxicității.

Aspecte de etică a cercetării

Studiile experimentale se vor realiza după aprobare de către Comisia Instituțională de

Etică, în strictă concordanţă cu reglementările etice internaţionale privind lucrul pe animale de
laborator.
În cursul desfăşurării cercetărilor experimentale efectuate pe animale de laborator vor fi
îndeplinite o serie de criterii etice de studiu:
- manipularea animalelor se va face într-o manieră care să reducă stresul și să prevină lezarea
animalelor de experiență;
- experimentele se vor desfăşura în mod ştiinţific, după protocoale dinainte stabilite, utilizând
modele experimentale acceptate internaţional;
- durata fiecărui experiment se va reduce la minimum posibil şi se va folosi cel mai mic
număr de animale pe lot;
- la finalul experimentului animalele vor fi eutanasiate, prin provocarea unei morţii rapide,
fără suferinţă fizică şi psihică. Aceasta reprezintă o procedură standard şi se va efectua într-o
cameră specială de necropsie, separat de locul unde sunt alte animale.
Eutanasierea se va efectua prin administrarea inhalatorie a unui anestezic general (enfluran),
care induce în câteva secunde starea de inconştienţă. Absenţa semnelor vitale (bătăile
cordului, mişcările respiratorii, reflexele) se va urmări o perioadă de peste 5 minute, iar după
confirmarea morţii (absenţa semnelor vitale) acestea vor fi decapitate. Resturile provenite
după experiment (ţesuturi, reactivi) se vor depozita în containere speciale pentru inactivare
şi distrugere către personalul responsabil pentru aceasta.

Criteriile de alegere a unui model animal

1. Să reproducă întocmai boala sau leziunea aflată în studiu.

2. Să poată fi realizat şi în alte laboratoare (criteriul secundar, cercetările pe porţiuni, folosind
acelaşi model animal, în diferite centre de cercetare, constituie un factor important în
obţinerea și validarea datelor în cercetarea ştiinţifică).
3. Să se folosească specii animale cu înmulțire rapidă (studii genetice).
4. Să fie suficient de mare (prelevări multiple de sânge, biopsii multiple).
5. Animalul să fie uşor accesibil celor mai multe laboratoare (printr-un preț redus şi un cost redus
al îngrijirii).
6. Să fie comod de mânuit, pentru majoritatea cercetătorilor, fără ca acesta să fie un factor
determinant în alegerea unui model.

1
7. Să se poată realiza pe mai multe specii animale, fiecare dintre ele prezentând avantaje pentru
studiul unui anumit aspect al problemei.
8. Să supravieţuiască suficient de mult timp, pentru a permite realizarea în bune condiţii a
experimentului.
9. Alte criterii, în funcție de modelul ales în special, pentru modelele pe mamifere.

Nu există un model ideal pentru studiul unei anumite boli; modelul şi specia de animal se
aleg în funcție de ceea ce este de studiat.

Clasificarea modelelor animale

 Modele induse experimental → la animale sănătoase (de exemplu, diabet indus prin
administrare de alloxan sau streptozotocină, sau hiperlipidemie indusă prin
ovariectomie); anumite boli pot fi studiate numai pe anumite specii de animale (de
exemplu, hiperreactivitatea bronşică la cobai).
 Modele de boală care apar în mod spontan → șobolani care dezvoltă spontan
hipertensiune arterială.
 Modele de tip transgenic → prin manipulare genetică a embrionilor - Tetraciclina - cel
mai utilizat sistem de modelare transgenică, pus la punct în urmă cu 10 ani, aplicat in
vitro (culturi de celule) şi in vivo.
 Modele negative de boală → specii de animale la care nu se dezvoltă boala respectivă (de
exemplu, la iepure nu apare infecție gonococică) – utile pentru studiul mecanismelor
rezistenței la apariţia bolii.
 Modele de boli orfane → descriu modificări funcționale care apar la animale, dar nu au
fost descrise manifestări ale bolii la om (de exemplu, encefalopatia spongiformă bovină).

Modele animale în farmacologie

 Modele animale în farmacodinamie

 Modele pentru ilustrarea efectului primar (peste 100 de modele):

 modele pentru studiul bolilor infecțioase
 modele pentru studiul bolilor inflamatorii
 modele pentru studiul influenţei factorilor de stres
 modele pentru studiul bolilor endocrine
 modele pentru studiul bolilor neurodegenerative

 Modele pentru ilustrarea efectelor secundare.

-se efectuează pe animale sănătoase pentru a identifica modificările produse de
medicamente asupra parametrilor fiziologici (frecvența respirației, frecvența
cardiacă, modificări EKG, funcționarea sistemelor: digestiv, renal, nervos central).
-se folosesc pentru în cursul studiilor pentru descoperirea de noi medicamente
(influența asupra unor răspunsuri fiziologice sau farmacologice, sau interacțiunea cu
alte medicamente atât in vitro, cât și in vivo);
-aceste studii sunt realizate și se focalizează pe investigarea potențialelor efecte
adverse a unei substanțe asupra unor parametri fiziologici, asupra unui organ sau a

2
 mai multor organe, atât la animalul de laborator sănătos, cât și la cel cu diverse stări
patologice induse experimental.

 Modele de hipertensiune arterială indusă experimental

Aceste modele permit aprecierea influenței substanțelor de testat asupra modificărilor

presiunii sanguine, la animale cu hipertensiune indusă experimental în laborator, în comparație
cu martorul (ser fiziologic) și cu martorul pozitiv (o substanță cu efecte antihipertensive
cunoscute pe modelul experimental respectiv).
Determinarea presiunii arteriale se poate face prin metode invazive (prin cateterism
arterial) sau neinvazive (fotopletismografie, piezopletismografie și sfigmomanometrie).

Figură. Determinarea presiunii arteriale prin metodă invazivă (prin canularea venei femurale)

Figură. Determinarea presiunii arteriale prin metodă neinvazivă

Se efectuează pe următoarele tipuri de animale: șobolani, câini, pisici, iepuri, oi.

Modelele animale de hipertensiune arterială (HTA) pot fi clasificate în funcție de

etiologie (secundară, esențială).

 Modele animale de HTA secundară

Bolile renale, inclusiv stenoza arterială renală (RAS), sunt cauzele majore ale
hipertensiunii arteriale secundare. Ca și modele experimentale de HTA se folosesc:
- modelul 2K-1C (o arteră renală este pensată, pentru a reduce cronic perfuzia renală, iar
celălalt rinichi rămâne intact);

3
 - modelul 1K-1C (un rinichi este îndepărtat, iar la celălalt se realizează pensarea arterei
renale);
În ambele modele, prima fază a HTA se caracterizează printr-o creștere rapidă a reninei
plasmatice ca răspuns la presiunea arterială renală scăzută și ca urmare a creșterii
consecutive a angiotensinei II în circulație. Cu toate acestea, mecanismele fazei cronice
a HTA diferă între cele două modele. În modelul 2K-1C, HTA este menținută prin
activarea continuă a sistemului renină angiotensină aldosteron (SRAA), deoarece
diureza sub presiune a rinichiului normal controlateral previne hipervolemia. În schimb,
retenția de volum de către rinichiul stenotic unic al animalului 1K-1C șuntează secreția
de renină, oferind un model de hipertensiune arterială dependentă de volum, cu nivel
scăzut de renină. Cu toate acestea, ambele modele dezvoltă, în timp, hipertrofie
cardiovasculară.
- modelul 2K-2C (ambii rinichi intacți, dar cu arterele renale pensate).

Alte modele au fost concepute pentru a investiga mecanismele fiziopatologice ale HTA:
- hipertensiune renală parenchimatoasă (prin nefrectomie subtotală, ce are ca rezultat
producerea de leziuni glomerulare, tubulare și interstițiale, pierderea nefronilor și
dezvoltarea hipertensiunii arteriale. Acest model poate fi combinat cu introducerea
excesului de sare în dietă, pentru a crește severitatea și viteza de debut a HTA,
- ischemie renală prin microembolizare, ceea ce conduce la apariția de nefrosclerozei și a
HTA.
- fibroză perinefretică indusă prin învelirea rinichiului în celofan, imitând fibroza care
apare după transplantul renal.

 Modele animale de HTA esențială

 modele farmacologice de HTA

- HTA indusă experimental prin administrare de acetat de deoxicorticosteron (DOCA) și
de sare la șobolani cu nefrectomie unilaterală – model, care imită efectele HTA induse
de mineralocorticoizi și glucocorticoizi;
- HTA indusă prin administrarea unui inhibitor de oxid nitric sintază (NOS) – N-nitro-L-
arginină metil ester (L-NAME);
- HTA produsă prin activarea SRAA (prin administrarea de angiotensină II);
- HTA produsă prin administrarea de endotelină (intraperitoneal, timp de 7 zile);
- HTA produsă prin administrare de Ciclosporină A (subcutanat, timp de 6 săptămâni).

 Modele de HTA ce utilizează factori de mediu, precum: stresul (de contenție, oscilații
luminoase, zgomot), temperatura extremă (în special frigul), sau dieta cu exces de sare,
zahăr și colesterol, pentru a induce hipertensiune.

 Modele genetice de HTA în care se folosesc animale modificate genetic:

- șobolani hipertensivi spontan (SHRs);
- șobolani Dalh sensibili la sare;
- șobolani congenici (la care un segment de cromozomi definit este introdus în altul prin
legare inversă);
- șobolani consomici (la care întreg cromozomul este transferat);

4
 - șobolani cu mutații genetice (la care s-a transferat o genă pentru renină mutantă de la
șoarece, sau de la om, fapt care se asociază de creșterea nivelurilor de angiotensină 2 și
de hipertensiune arterială).
- șoareci knockout – cu modificări ale unor gene (cu erori, deleții, supraexpresii sau
mutațiile subtile), de exemplu a genelor pentru NOS endotelială, pentru peptidul
natriuretic atrial.

 Modele animale de boli neurologice

 Modele de boală Alzheimer

Aceste modele permit aprecierea influenței substanțelor de testat asupra manifestărilor

clinice (tulburări comportamentale, modificări cognitive), la animale cu boală Alzheimer indusă
experimental în laborator, în comparație cu martorul (ser fiziologic) și cu martorul pozitiv (o
substanță cu efecte farmacodinamice cunoscute de ameliorare a perturbărilor cognitiv-
comportamentale pe modelul experimental respectiv).
Perturbările cognitiv-comportamentale pot fi observate și evaluate cu o serie de teste
comportamentale precum: testul de condiționarea contextuală a fricii, testul radial arm maze,
testul înotului (Morris water maze)

Figură. Testul de condiționare contextuală a fricii Figură. Testul radial arm maze

Figură. Morris water maze (testul înotului)

5
 Modelele experimentale de boală Alzheimer sunt esențiale pentru a înțelege mai bine
patogeneza și pentru a evalua potențialul abordărilor terapeutice noi. Cele mai utilizate modele
de animale experimentale sunt șoarecii transgenici care supraexprimă genele umane asociate cu
boala Alzheimer familială, ceea ce are ca rezultat formarea plăcilor amiloide.
- pe șoareci PD-APP – care dezvoltă precoce boală Alzheimer sunt șoareci transgenici
care poartă o singură mutație genică și care supraexprimă în creier proteina
precursoare pentru amiloidul uman mutant (V717F.). Aceste animale dezvoltă
numeroase manifestări ale bolii Alzheimer, inclusiv plăci amiloide (similare cu cele
de la om), dar și deficiențe cognitive.
- șoareci amiloid-β (1-42) cu mutație reprezentată de producerea unei variante de
amiloid-β, numită amiloid-β (1-42), care este cu doi aminoacizi mai lungă decât
forma obișnuită și se agregă mai ușor, animale care prezintă boală Alzheimer
moștenită.

 Modele de boală Parkinson

Aceste modele permit aprecierea influenței substanțelor de testat asupra manifestărilor

clinice (activitatea locomotorie, akinezie, bradikinezie, echilibru, coordonare), la animale cu
boală Parkinson indusă experimental în laborator, în comparație cu martorul (ser fiziologic) și cu
martorul pozitiv (o substanță cu efecte farmacodinamice cunoscute de ameliorare a tulburărilor
motorii pe modelul experimental respectiv).
Perturbările motorii pot fi observate și evaluate cu o serie de teste comportamentale, cele
mai multe dintre ele implicând măsurarea mișcării, prinderii sau a rezistenței labelor din față.
Testele de comportament la rozătoare includ testul open-field pentru o investigarea
generală a activității locomotorii, testul mersului, pentru evaluarea akineziei și testul stâlpului
pentru măsurarea bradikineziei. Forța este măsurată prin teste de rezistență la prindere și teste de
coordonare. Este dificil să măsoare direct rigiditatea rozătoarelor, dar testul rota-rod are în
vedere investigarea mai multor factori precum echilibrul, rezistența și coordonarea.

Figură. Testul Open-field Figură. Testul mersului (Stepping test)

6
 Figură. Testul stâlpului Figură. Testul rota-rod (testul tijei turnante)

Mai multe modele de boală Parkinson se bazează pe degenerarea neuronilor

dopaminergici indusă de administrarea locală sau sistemică de neurotoxine, dar se utilizează și
modele genetice.

 Modele neurotoxice
- administrarea acută de neurotoxină 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridină
(MPTP) la șoareci – produce neurodegenerare rapidă și puternică, cu deficit motor
sever.
- 6-hidroxidopamina (6-OHDA) produce leziuni neurodegenerative rapide și
puternice, dependente de locul de injectare în creier (pars compacta a substanței
negre, corpul striat), cu deficit motor asimetric sever.

 Modele genetice
- pe rozătoare și non-primate cu modificări genetice, caracterizate prin prezența de
fibre preformate de α-sinucleină (proteină din creier cu rol în restrângerea
mobilității veziculelor sinaptice, și, reducerea reciclării veziculelor sinaptice și a
eliberării de neurotransmițători), care sunt abundente și formează agregate în creier.
Animalele prezintă neurodegenerare dopaminergică moderală, deficitul motor fiind
observat doar la șoareci.
- pe șoareci cu mutații ale genei UCH-L1 (ubiquitină carboxi-terminal hidrolază L1),
care prezintă neurodegenerare dopaminergică și deficit motor moderat.

 Modele experimentale de diabet

În cercetarea experimentală pe animale de laborator se utilizează modele specifice de

diabet de tip 1 și tip 2.
În plus, se folosesc și modele de regenerare a celulelor beta și este luată în considerare
utilizarea modelelor care presupun folosirea de animale de laborator knock-out și transgenice în
cercetarea diabetului.
 Modele de diabet zaharat de tip 1
7
 Principala caracteristică a diabetului de tip 1 este o distrugere autoimună a celulelor beta
pancreatice, ceea ce duce la lipsa producției de insulină. La modelele animale, această deficiență
în producția de insulină este obținută printr-o varietate de mecanisme diferite, de la ablația
chimică a celulelor beta, la modele pe rozătoarele care dezvoltă spontan diabet autoimun.

 diabet indus chimic prin utilizare de:

- doze mari de streptozotocină - model simplu de hiperglicemie;
- doze mari de alloxan - model simplu de hiperglicemie;
- doze mici de streptozotocină administrate repetat – model de insulită indusă;

 diabet indus prin mecanism autoimun spontan (ce produce distrugerea celulelor beta
pancreatice):
- pe șoareci diabetici non-obezi - specie de șoareci care dezvoltă diabet de tip 1, ca
urmare a insulitei (infiltrat leucocitar al insulelor pancreatice);
- pe șobolani BB (BioBeeding) - tulpină consangvinizată de șobolan care dezvoltă
spontan diabet autoimun de tip 1;
- pe șobolani LEW.1AR1/-iddm - tulpină congenică de șobolan Lewis, cu o mutație
spontană și cu un haplotip MHC (complex major de histocompatibilitate) definit, care
dezvoltă spontan diabet de tip 1;

 diabet indus genetic (ce produce distrugerea celulelor beta pancreatice ca urmare a
stresului la nivelul reticulului endoplasmatic);
- pe șoareci AKITA - șoareci heterozigoti pentru mutația spontană AKITA, care
prezintă hiperglicemie;

 diabet indus viral (cu distrugerea celulelor beta prin infecție virală) cu:
- virus Coxsackie B;
- virus encefalomiocarditic;
- virus șobolan Kilham;
- virus coriomeningitei limfocitare.

 Modele de diabet zaharat de tip 2

Diabetul de tip 2 se caracterizează prin rezistența la insulină și incapacitatea celulelor

beta de a compensa suficient. Prin urmare, modelele animale de diabet de tip 2 vor include
modele de rezistență la insulină și / sau modele de insuficiență a celulelor beta. În multe dintre
modelele de diabet de tip 2 utilizate, animalele sunt obeze, reflectând condiția umană în care
obezitatea este strâns legată de dezvoltarea diabetului de tip 2.

 ce utilizează animale obeze monogenice (ca model de hiperglicemie indusă de

obezitate):
- șoareci Lepob/ob – șoareci mutanți care mănâncă excesiv din cauza mutațiilor din gena
responsabilă pentru producția de leptină și prezintă obezitate severă.
- șoareci modificați genetic Leprdb/db – cu obezitate, hiperglicemie și intoleranță la
glucoză,
8
 - șobolani ZDF – specia Zucker diabetic gras (ZDF) - cu o mutație în gena care
codifică receptorul de leptină, și care dezvoltă obezitate și rezistență la insulină la
vârstă tânără, și hiperglicemie progresivă la vârstă adultă.

 ce utilizează animale obeze poligenice (ca model de hiperglicemie indusă de obezitate):

- șoareci KK – care prezintă intoleranță la glucoză și rezistență la insulină, dar au
obezitate redusă;
- șobolani OLETF – au incapacitate de a limita dimensiunea prânzurilor, au obezitate
medie și dezvoltă tardiv hiperglicemie;
- șoareci NZO – dezvoltă obezitate severă, rezistență la insulină și hiperglicemie;
- șoareci TALLYHO - dezvoltă hiperglicemie, hiperinsulinemie, hiperlipidemie,
obezitate moderată și mărirea insulelor Langerhans;
- șoareci NONcNZO10/LtJ congenici recombinanți - nu sunt hiperfagici, dezvoltă
obezitate viscerală, hiperglicemie cu debut la maturitate, dislipidemie, steatoză
hepatică moderată și atrofie a insulelor pancreatice; nu prezintă hipercorticism și nu
au tulburări evidente de termorelare.

 obezitate indusă experimental (ca model de hiperglicemie indusă de obezitate)

- pe șoareci și șobolani cu dietă excesiv grasă;

 ce utilizează animale ne-obeze (ca model de hiperglicemie indusă de funcția / masa

insuficientă a celulelor beta)
- șobolani Goto-Kakizaki (GK) – subspecie de șobolan poligenic non-obez, care
dezvoltă diabet zaharat de tip 2 la începutul vieții;

 bazate pe inducerea genetică a disfuncției celulelor beta pancreatice, ce utilizează:

- șoareci transgenici cu polipeptid amiloid insular uman (ce prezintă depuneri de
amiloid la nivel insular);
- șoareci AKITA – ce prezintă distrugeri ale celulelor beta pancreatice ca urmare a
stresului la nivelul reticulului endoplasmatic.

 Modele experimentale de carcinogeneza cutanată

Date din literatură evidenţiază faptul că, experimental, radiațiile ultraviolete de tip B
(UVB) au efecte mutagenice, iar expunerea cronică la aceste radiaţii, poate cauza cancer cutanat
non-melanom, la animale de laborator. La animale, dar şi la om, tumorile non-melanom prezintă
leziuni caracteristice datorate unor mutaţii la nivelul unei gene cu funcţie de supresie tumorală -
p53.
La şoareci s-a demonstrat faptul că expunerea experimental la UVB induce, dependent de
lungimea de undă a acestora, apariţia de carcinoame cu celule scuamoase.
În ceea ce priveşte melanomul malign, situaţia este neclară, iar efectele ţintite ale
ultravioletelor (UV) în inducerea carcinogenezei de acest tip, în funcţie de lungimea de undă a
radiaţiilor, nu au fost încă pe deplin demonstrate.
Acestă lipsă de date, se datorează în parte numărului foarte redus de modele
experimentale de producere a melanomului malign, care să demonstreze rolul iradierii din
domeniul ultraviolet în iniţierea apariţiei unor astfel de tumori.
9
 În etiopatogenia melanomului se incriminează interacţiuni între modificări genetice şi
influenţa mediului, factorul genetic având un rol semnificaţiv.
Multe din ipotezele semnificative privind etiologia şi mecanismele melanogenezei au
avut ca puncte de plecare studiile epidemiologice, investigaţiile moleculare ale neoplaziei umane
şi experimentale pe modelele animale cunoscute la vremea respectivă.
Criteriile pe care trebuie să le îndeplinească un model experimental de melanom cu
etiologie UV:
- să fie produs de iradiere UV;
- să prezinte modificări patogenice moleculare şi histopatologice similare melanomului
uman;
- să prezinte accesibilitate la manipularea genetică şi imunologică.

 Model experimental de melanom la cobai şi la hamster Syrian

- inducerea melanomului se realizează prin iradiere UV, după administrare prealabilă a
agentului chimic carcinogenetic, dimetilbenzantracen (DMBA), deoarece ambele specii
de animale nu dezvoltă neoplazia doar prin simplă iradiere;
- tumorile metastazează, iar în cazul cobailor se constată similitudini histopatologice cu
melanomul uman.

 Model experimental de melanom la șoarece

La şoareci este foarte dificil de a se induce melanoame, care sunt tipice dermale, şi nu
prezintă similitudini histopatologice cu cele umane. Din păcate, spre deosebire de melanocitele
umane, la rozătoarele adulte, în mod obişnuit melanocitele sunt ataşate de foliculii piloşi, cu
excepţia regiunilor relativ lipsite de păr, precum urechile şi coada, unde ele sunt localizate
epidermic.

Pielea şoarecilor nou-născuţi, spre deosebire de cea a şoarecilor adulţi are melanocitele
localizate la joncţiunea derm / epiderm, la fel ca şi în foliculul pilos. Cu toate acestea
melanocitele de la şoarece sunt foarte rezistente la melanomul indus doar prin simpla iradiere
UV.
Anterior au fost propuse modele experimentale de inducere a melanomului la şoareci
utilizând agenţi carcinogenetici singuri sau în combinaţie cu iradiere UV.

Model de melanom indus la şoareci cu deficienţă Ink4a/arf după administrarea

dedimetilbenzantracen (DMBA).

Model de melanom indus la şoareci transgenici ce superexprimă antigenul SV40, sub

controlul promoterului pentru tirozinază, care are drept ţintă melanocitele.
- antigenul SV40 T perturbă multiple semnale celulare, în particular inactivând
ambele căi patogenice p53 şi pRb;
- se produc rapid melanoame în special la nivel ocular;
- animalele cu exprimare redusă a transgenei, dezvoltă neoplazia după iradiere UV
neonatală;
Model genetic de melanom spontan la şoarece hibrid cu Ras activat şi cu deleţie a
ambelor Ink4a ⁄ arf;
10
 Model genetic de melanom la şoarece cu exprimare ectopică a receptorului pentru
tirozin kinază – cu inducerea unor tumor melanocitice multifocale, după iradiere UV.

Model de melanom indus UV la şoareci nou-născuţi transgenici pentru factorul de

creştere a hepatocitelor (HGF) / factorul de împrăştiere (SF).
- melanoamele metastazează şi prezintă similitudine cu cele umane;

 Modele animale în farmacocinetică

 se efectuează pe animale sănătoase pentru a studia absorbția, transportul, distribuția,

metabolizarea și eliminarea medicamentelor.
 în trecut aceste investigații au fost larg folosite în cursul procesului de descoperire a
noi medicamente, însă în prezent, datorită dezvoltării tehnicilor in vitro, precum și a
modelării farmacocinetice/farmacodinamice aceste studii s-au restrâns foarte mult.
 cu toate acestea modelele animale în farmacocinetică sunt integrate puternic în cadrul
procesului de evaluare a siguranței medicamentelor noi, în scopul descrierii expunerii
la diverși agenți (studii de toxicocinetică).
 ca și animale folosite în aceste studii menționăm:
- șoareci și șobolani, pentru teste de toxicitate acută;
- șobolani, cobai, câini, primate non-umane pentru teste de toxicitate subcronică;
- șoareci, șobolani, cobai, iepuri, primate non-umane pentru teste de teratogenitate;
- șobolani pentru teste de reproducție.

Pentru fiecare model în parte se vor folosi loturi formate din același număr de animale,
repartizate astfel: un lot martor (ce va primi ser fiziologic), un lot martor pozitiv (ce va primi o
substanță martor pozitiv, cu efecte cunoscute pe modelul experimental respectiv) și lotul sau
loturile ce vor primi substanța, respectiv substanțele de testat.

 Metode alternative de cercetare în farmacologie

Factorii care determină înlocuirea metodelor clasice în cercetarea farmacologică prin

metode alternative sunt reprezentați de:
 durata lundă de timp (10-15 ani) între descoperirea unei molecule noi şi punerea sa pe
piață.
 necesitatea detectării precoce a unor eventuale efecte adverse sau toxice şi a eliminării
rapide a substanțelor nocive.
 necesitatea reducerii cheltuielilor, eliminând de la început substanţe fără şansă de a deveni
medicament.
 testarea unui număr limitat de produse pe an, prin tehnicile in vivo,
 necesitatea reducerii numărului de animale de laborator (probleme de etică şi de economie).
Condiţiile ce trebuie îndeplinite de un sistem de testare farmacologică in vitro depind de
sistemul de testare in vivo pe care acesta îl va înlocui.
Stadiile de dezvoltare pentru realizarea unor teste farmacologice in vitro sunt:
11
1. Perioada cercetărilor de bază:
 caracterizarea culturii de celule, țesut, organ;
 studii ale cineticii/toxicocineticii şi farmacodinamiei/ toxicodinamiei;
 identificarea rezultatelor.

2. Perioada de validare a testelor:

 standardizarea protocolului testului;
 testarea cu martori cunoscuți, pozitivi şi negativi;
 testarea diferitelor clase de substanțe chimice;
 reproductibilitatea şi validarea testului.

3. Perioada evoluţiei secundare a testului:

 evaluarea în cadrul laboratorului şi între laboratoare;
 restandardizarea protocoalelor şi reactivilor;
 adoptarea testului de către industria de medicamente.

Ca și metode alternative de studiu se folosesc:

 Tehnici ameliorate de evaluare statistică

 Modele matematice
 Folosirea tehnicilor in vivo numai pentru analizele finale, de fineţe ale unui compus
 Sisteme de culturi celulare in vitro:
 populații celulare primare intacte (celulele îşi menţin organizarea vitală şi
caracteristicile celulare diferenţiate);
 culturi de linii celulare stabile (care furnizează un sistem ce permite cea mai bună
reproductibilitate a creşterii şi caracteristicilor biochimice, dar care diferă de izolatele
proaspete celulare prin anumite proprietăți biologice).
 Culturi de țesut
 Fragmente de organ

Metoda ideală destudiu în farmacologie este reprezentată de realizarea unei baterii de

screening in vitro şi in vivo pentru testările farmacologice.

Avantajele metodelor alternative de cercetare în farmacologie sunt:

 Preselecția substanțelor cercetate, reducând numărul animalelor utilizate pentru testările
toxicologice, în faza iniţială a screeningului.
 Detectarea precoce a celor mai eficiente substanțe şi care prezintă cât mai puține efecte
adverse.
 Eliminarea substanțelor care nu vor avea şansa de a deveni medicament, din faza iniţială
a cercetărilor, ceea ce determină reducerea considerabilă a cheltuielilor.

Limitele metodelor alternative de cercetare în farmacologie sunt:

 Existența unor domenii de studii în farmacologie care impun folosirea experimentelor pe
animalul de laborator întreg.

12
  Valoarea predicțiilor bazate pe cercetările efectuate prin metodele alternative trebuie
demonstrată prin teste efectuate pe animale întregi.
 Metoda ideală de testare a toxicităţii, a studiilor de farmacodinamie şi a studiilor de
farmacocinetică ar trebui să cuprindă o baterie de teste in vitro şi in vivo.

Testarea toxicității acute

Toxicitatea acută reflectă efectele nocive care se manifestă la 24 ore, 48 ore, 72 ore şi 14
zile, după administrarea unei doze unice de substanţă.
Indicatorii cei mai utilizaţi pentru aprecierea toxicităţii acute sunt:
- doza letală 50 (DL50) – este doza unică, calculată statistic, la care mor 50% din
animalele supuse experienţei (se exprimă în mg/kg);
- concentraţia letală 50 (CL50) – reprezintă concentraţia unei substanţe, calculată statistic,
care, după administrare o anumită perioadă de timp, determină moartea a 50% din
animale;
- doza maximă tolerabilă (DMT) – este doza maximă de substanţă care produce semne de
intoxicaţie, fără a afecta supravieţuirea; această doză se calculează prin metoda
secvenţială; iniţial se administrează animalelor o primă doză, care n-ar trebui să
determine decât simptome minime de intoxicaţie; după supravegherea atentă şi
aşteptarea unui timp suficient, se administrează doze crescătoare, până când se
înregistrează simptome evidente de toxicitate, dar supravieţuirea nu este afectată.

Este cunoscut faptul că normativele Asociaţiei pentru Administrarea Alimentelor şi

Medicamentelor (Food and Drug Administration – FDA) din Statele Unite reglementează
protocoalele pentru testarea substanţelor pe animale de laborator, stabileşte substanţele chimice
admise pentru administrare.
Totodată, este precizat faptul că toxicitatea unei substanţe se apreciază în raport de doza
letală medie (DL50), care apreciază cantitatea minimă estimativă de substanță (de testat) care
produce moartea a cel puţin 50% din animalele de experienţă, după administrare unică.

Stabilirea DL50 la animale de laborator este deosebit de utilă pentru aprecierea gradului
de toxicitate acută a unei substanţe nou testate.
Determinarea DL50 reprezintă cel mai simplu tip de test de toxicitate al unei substanţe, şi
prezintă o serie de limite:
- acest parametru apreciază doar mortalitatea şi nu şi toxicitatea subletală;
- DL50 prezintă variaţii largi între specii şi nu poate fi extrapolată în siguranţă la om;
- se măsoară doar toxicitatea acută , produsă de o singură doză de substanţă şi nu
toxicitatea de lungă durată;
- nu poate măsura reacţile idiosincrazice (ce apar la doze foarte mici), care sunt
considerate a fi mult mai relevante în practică decât toxicitatea la doze mari;
- se constată variaţii cronobiologice majore (raport 1-8 în funcţie de ora administrării şi
de substanţă).

Substanţa nou studiată este administrată pe diverse căi, iar efectele toxice trebuie corelate
cu creşterea dozelor. Studierea toxicităţii acute reprezintă metoda prin care se apreciază
potenţialul toxic al unei substanţe, în raport de corelaţia doză – răspuns.

13
 În esenţă, determinarea DL50 permite transformarea unei valori numerice într-un
indicator comparativ al efectului toxic imediat, pentru o anumită substanţă, la o specie de animal.
Pentru testare, se folosesc cel puţin 3 – 4 niveluri de doze, spaţiate la intervale valorice
mici, cu un interval corespunzător pentru efectele toxice, respectiv, efectul letal. Datele trebuie
să fie suficiente pentru a produce o curbă doză – răspuns pe baza căreia va fi estimată DL50.

a. b.
Figură. Curba doză-răspuns pentru determinarea DL50
(a. în funcţie de procentul de mortalitate; b. în funcţie de numărul de animale moarte)

Calcularea DL50 oferă o relaţie doză – răspuns pentru standardizarea preparatelor

biologice în conformitate cu potenţialul letal, în urma administrării la animal.
Se procedează, de asemenea, la determinarea intervalului dozelor letale DL 0 şi DL100
(unde DL0 reprezintă doza cea mai mare care nu produce moartea nici unui animal, DL100 este
cea mai mică doză care produce moartea tuturor animalelor).
Date din literatură evidenţiază faptul că administrarea unei substanţe poate să producă, la
animalul de experienţă, două tipuri de efecte:
- gradate (atunci când efectul obţinut este direct proporţional cu doza administrată);
- efecte unice, calitative (care se exprimă procentual şi se determină pe loturi de animale).

Pentru determinarea DL50 se pot utiliza următoarele metode:

- metoda up and down sau sus-jos;
- metoda aritmetică Karber;
- metoda grafică;
- modelul probitului.

Metoda aritmetică Karber folosită pentru determinarea DL50 are avantajul că numărul
de animale sacrificate este minim, iar intervalul de toxicitate apreciat este mic. În cadrul acestei
metode, pentru investigarea toxicităţii acute a unei substanţe, se administrează, prin tatonare,
doze crescătoare secvenţial, în proporţie geometrică (logaritmul dozei cu serii aritmetrice).
Pentru testare, se folosesc loturi cu un număr egal de animale fiecare. Răspunsul obţinut după
administrarea diferitelor doze va fi exprimat în relaţie cu doza, sub forma unei curbe cu aspect
Gaussian.
Calcularea DL50 prin metoda aritmetică Karber se realizează aplicând următoarea
formulă de calcul:
DL50 = DL100 - ∑(axb) / n,

14
 unde: a = diferenţa dintre două doze succesive de substanţă administrate;
b = media numărului de animale moarte din două loturi succesive;
n = numărul de animale dintr-un lot;
DL100 = doza letală 100 (reprezentând cantitatea de substanţă care produce
moartea tuturor animalelor de experienţă supuse testării, cărora li s-a administrat
substanţa).

Dezavantajul acestei metode este acela că, pentru determinarea DL50, este necesar un
număr mare de animale pentru studiu.

Tabel. Exemplu de calcul a DL50 prin metoda Karber

Lot Doza Diferenţa între doze Număr de Mortalitatea Produsul
(mg/kg) (mg/kg) = a animale moarte medie = b axb
1 360 - 8 - -
2 320 40 6 7 280
3 300 20 4 5 100
4 260 40 2 3 120
5 230 30 1 1,5 45
6 140 50 0 0,5 35
∑(axb) 580
n=8
Calcule: DL50 = 360 – (580/8) = 287,5 mg/kg corp.

Gradul de toxicitate al substanţei se poate estima în raport de scalele de toxicitate

existente (ca, de exemplu, scala WHO/IPCS – 2002 sau cea propusă de Voicu VA, în 1997):

Tabel. Scara toxicităţii după Voicu VA (1997)

supertoxice sub 5 mg/kg
extrem de toxice 5-50 mg/kg
foarte toxice 50-500 mg/kg
moderat toxice 500-5000 mg/kg
cu toxicitate redusă 5000-15000 mg/kg
practic netoxice peste 15000 mg/kg

Evaluarea toxicităţii acute in vivo se face după administrarea substanței de testat pe cel
puțin două căi (de exemplu: oral, intraperitoneal), a unei singure doze la cel puțin două specii de
animale (de exemplu: şoarece, şobolan).
Se recomandă utilizarea a cel puțin două specii de animale de laborator pentru mărirea
gradului de semnificaţie biologică a rezultatelor obţinute. În mod frecvent ca animale: şoareci şi
şobolani deoarece sunt relativ ieftine, prezintă mai puţine variaţii inter-specii, sunt uşor
accesibile, mai uşor de manipulat.
Animalelor care primesc substanțele de testat sunt observate pe parcursul perioadei de
studiu, prin evaluarea următoarelor aspecte:
- aspectul general (în comparaţie cu animalele martor),
- debutul, intensitatea şi durata efectelor toxice,

15
 - modificări în comportamentul, activitatea, respiraţia, apetitul, aportul de lichide sau
retenţia alimentară,
- monitorizarea greutăţii corporale, aportului alimentar, consumul de apă, turgescenţa
pielii sau blănii.

Animalele de experienţă sunt urmărite în ceea ce priveşte comportamentul, semnele

vitale, notându-se apariţia eventualelor modificări sugestive unei stări toxice, la următoarele
momente de timp, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 14 zile, după administrarea substanţelor:
- modificări de comportament (mers, poziţia pleoapelor, starea de sedare sau agitaţie);
- diminuarea capacităţii de explorare a mediului, tendinţă de imobilitate;
- gruparea animalelor şi retragerea acestora în colţurile cuştii;
- eventuala dispariţie a semnelor de toxicitate la 3 ore după administrarea substanţelor;
- refuzul hranei;
- somnolenţă:
- moartea animalelor după convulsii, apnee.

Suplimentar se efectuează examenul necropsic minuţios şi examenul histopatologic, la

toate animalele moarte sau sacrificate. Prelevarea pieselor se execută după sacrificarea
animalelor. Fixarea fragmentelor de organ se face utilizând formol 10%, și se realizează probe,
colorate cu hematoxilină-eozină sau van Gieson, pentru a fi examinate în microscopie
electronică.

Calcularea acestor dozelor DL50 și DE50 se face prin tatonare, constând în administrarea
unor doze diferite de substanţă la mai multe loturi de animale, la care se urmăreşte fie efectul
farmacodinamic, fie letalitatea. Calculele se realizează cu ajutorul formulelor sau prin
reprezentare grafică.
Raportul DL50/DE50 este numit indice terapeutic (IT) sau factor relativ de securitate.
Indicele terapeutic oferă informaţii privind limitele de siguranţă în administrarea unei
substanţe, prin direcţionarea atenţiei spre importanţa relaţiei între dozele eficace şi cele toxice.
Nu este un ghid de apreciere a siguranţei de folosire a unei substanţe în clinică, deoarece prezintă
o serie de limite de care trebuie să se tină seama :
- DL50 nu e un marker de toxicitate , deoarece se bazează pe mortalitatea animalelelor;
- DE50 nu se defineşte în mod obişnuit, ea fiind variabilă în funcţie de efectul urmărit (de
exemplu: analgezicele, trebuie date în doze diferite în funcţie de natura şi severitatea
durerii; de exemplu: DE50 de aspirină pentru ameliorarea unei cefalei de intensitate
medie, este mult mai mică decât cea necesară în afecţiuni reumatismale);
- nu are semnificaţie în reacţiile idiosincrazice;

Când valoarea acestui raport depăşeşte cifra 10, substanţa studiată poate fi utilizată în
terapeutică, în doze medii, fără pericol. La un IT sub 10, substanţa se va administra numai dacă
are efecte farmacodinamice nete şi nu sunt alte preparate mai puţin toxice.
În acest caz administrarea cere o prudenţă sporită. Raportul respectiv îşi menţine valoarea
numai în cazul în care curbele, după care se stabilesc DE50 şi DL50, sunt paralele.

16
 Figură. Reprezentarea grafică a indicelui terapeutic.

Dacă indicele terapeutic are valoare foarte mică (sub 3), substanţa este foarte activă şi
doar în foarte puţine cazuri va fi studiată în continuare, în special atunci când nu există altă
substanţă cu aceleaşi efecte farmacodinamice, care să fie mai puţin toxică.

 Testarea biocompatibilității in vivo a substanțelor de testat

Evaluarea biocompatibilității in vivo a substanțelor de testat se va face în comparație cu un

lot martor de animale (care va primi ser fiziologic).
La 24 ore şi la 14 zile după administrarea substanţelor de testat, animalele se anesteziază
cu eter etilic şi se recoltează sânge din plexul retroorbital sau din vena laterală a cozii, pentru
determinarea:

 profilului hematologic
- hemoleucogramei,

 activităţii enzimelor hepatice

- a alaninaminotransferazei (ALAT) - denumită şi transaminaza glutampiruvică
(TGP),
- a aspartat aminotransferazei (ASAT) - denumită şi transaminaza glutamică
oxalacetică (TGO),
- a lactat-dehidrogenazei (LDH),

 unor parametri biochimici:

- bilirubină
- uree
- creatinină

 nivelului unor parametric imunitari:

 pentru șoarece
- capacitatea opsonică a serului,
17
- capacitatea fagocitară şi bactericidă a macrofagelor peritoneale.
 pentru șobolan
- activitatea complementului seric
- capacitatea de fagocitoză a polimorfonuclearelor din sângele periferic (Testul
NBT - „NITRO BLUE TETRAZOLIUM“).

18