Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Obiectivele:
1. 2. 3. 4. 5. 6. Tipurile de acizi nucleici, funciile i repartizarea lor n celul. Constituienii acizilor nucleici; bazele azotate, pentozele, acidul fosforic. Nucleozidele i nucleotidele. 3, 5- cAMP Structura primar, secundar i teriar a acizilor dezoxiribonucleici Cromatina. Nucleosomul. Structura acizilor ribonucleici (tRNA, mRNA, rRNA). Denaturarea i hibridizarea acizilor nucleici.
Acizi nucleici
Acizi nucleici sunt polinucleotide, alctuite din mononucleotide, unite prin legturi 3, 5fosfodiesterice. 1. ADN - acidul dezoxiribonucleic; 2. ARN - acidul ribonucleic.
ADN
a. b. Localizarea: 97-99% - concentrat n nucleu 1-3% - situat n mitocondrii. Rolul: pstreaz i transmite informaia genetic de la ADN parental la ADN fiic sau ARN.
ARN
1. 2. 3. Localizarea: 11% - n nucleu 15% -n mitocondrii 50% - n ribosomi 24% - n hialoplasm Deosebim:i: ARN mesager ARN ribozomal ARN de transport ARN cromosomial ARN nuclear
ARN mesager (mARN) constituie 25% din totalul ARNlui. Localizat -n nucleu i citozol. Prezint copia sectorului de ADN i conine informaia despre structura catenei polipeptidice a proteinei. Rolul:Transmite informaia de la ADN spre ribozomi, sediul de sintez a proteinei. ARN ribozomal (rARN) constituie 60% din totalul ARNului. Localizat- n ribozomii citoplasmei. Rolul - formeaz scheletul ribozomilor. Joac un rol auxiliar n procesul de asamblare a proteinelor.
ARN de transport (tARN) constituie 15% din totalul ARN-lui. Localizat: n citoplasm, ribosomi, mitocondrii. Rolul: particip la activarea i transportul AA spre ribozomi i asamblarea lor n polipeptide. ARN cromosomial activarea genelor ADN ARN nuclear formarea scheletelor particulei proteice care transport ARN din nucleu n citoplasm
Structura chimic a AN
La hidroliz AN degradeaz n mononucleotide, care la rndul lor, la hidroliza complet degradeaz n BA, pentoze i acid fosforic. ADN----A; G; C; T+dR+H2PO3 ARN----A; G; C; U+ R+H2PO3
Bazele azotate
a. BA se clasific n : 1. majore: purinice: A, G i pirimidinice: C,T,U 2. minore:purinice (2metil A; 1 metilG) i pirimidinice (5 metil C;5 hidroximetil C) b. Sunt slab solubile n H2O c. Prezint fenomenul de tautomerie (forme lactim-lactam) d. Sunt responsabile de informaia genetic e. BA purinice- au structur plan; cele pirimidinice- aproape plan, puin plat j. Max capacitii de absorbie n ultraviolet este ntre 260-280 nm
Bazele purinice
Bazele pirimidinice
Molecular Biology
Bases
Bicyclic Purines:
Monocyclic pyrimidine:
Structura BA minore
Molecular Biology
Nucleosides
Nucleozidul
const dintr-o BA ( purinic sau oPirimidinic) + sau pentoz (riboza dezoxiriboza) atomul C-1 al pentozei de pentoz: n funcie este unit cu N-9 al purinei sau Ndezoxi i ribonucleozide 1 al pirimidinei - leg. BA purinice +R(dR) --N glicozidic. ozin Unite ntre ele p (adenozin, guanozin legtura N gluco sau dezoxiadenozin,
Nucleozidele
Proprietile: Mai solubile n H2O dect BA Mai stabile n soluii alcaline Uor se hidrolizeaz la nclzire cu acid
NUCLEOTIDE - compui alctuii din nucleozide i rest de acid fosforic Nucleozid mono-; di-; trifosfafat
Rest al
acidului
Nucleozid
ic
Nucleotide - Rolul
1. Element structural al AN 2. Intermediari energetici (ATPpurttorul energiei chimice n organism) 3. Intr n componena Co 4. Servesc ca activatori ai unor molecule (UDP-Gl; CDP-colina) 5. Servesc ca mesageri secunzi intracelulari ai hormonilor (AMPc; GMPc)
Molecular Biology
Nucleotides
A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3-, 5, or ( in ribonucleotides only) the 2position. In the case of 5-position, up to three phosphates may be attached. Phosphate ester bonds
Structura chimic
Structura primar a AN
Reprezint secvena mononucleotidelor n lanul polinucleotidic liniar, legate ntre ele prin legturile 3' - 5' fosfodiesterice Catenele au dou capete: 5 nucleozid tri fosfatul; 3 gr. OH liber
1.
Structura teriar
Reprezint superspiralizarea dublului helix la care particip proteinele histonice i formeaz cromatina Unitatea structural a cromatinei este nucleosomul Nucleosomul este un octamer histonic (2H2A; 2H2b; 2H3; 2H4) nfurat de aproximativ de 2 ori de dublul helix cu o lungime de 146 perechi de nucleotide. ntre 2 nucleosmi se conin poriuni de ADN alctuit din 20-60 perechi de nucleotide asociate cu H1 Lanul polinucleosomic formeaz un superhelix (solenoid), fiecare spir are 10 nucleosomi, d=30nm i pasul de 10nm
DNA
Compactizarea cromatinei
Cromosoma metafazic/
2.
3.
4.
ARNr
Structura secundar e prezentat prin sectoare spiralate unite ntre ele cu ajutorul unei catene curbate Structura teriar prezint scheletul ribosomului. Are forma unui bastona sau ghem pe suprafaa cruia sunt nfurate proteinele ribosomului.
Denaturarea i renaturarea
Denaturarea sub aciunea temperaturii, mediului PH, substanelor chimice are loc ruperea legturilor de hidrogen i forelor hidrofobe ce stabilizeaz structura secundar i teriar a DNA. La denaturare DNA i pierde proprietile biologice. Ex. nclzirea DNA-duce la desfacerea spiralei duble n dou catene ( are loc transformarea spiral - ghem). Degradarea unei jumti de structur de ADN are loc la temperatura de topire. ADN bogat n C i G au o t mai nalt dect cele bogate n A i T. La rcirea treptat catenele din nou se reunesc dup principiul complementarittii, formnd spirala dubl nativ. Acest fenomen se numete renaturare (atunci cnd t e mai mic dect cea de topire). La racirea brusc renaturarea nu are loc. Denaturarea i renaturarea acizilor nucieici este nsoit de schimbarea activittii lor optice.
Hibridizarea AN
Pe capacitatea de renaturare a AN este bazat metoda de determinare a gradului de nrudire a AN, care poart denumirea de hibridizare molecular. La baza ei st mperecherea complementar a sectoarelor unicatenare ale AN cu formarea unui heteroduplex Hibridizarea se efectueaz n felul urmtor: 1. AN se denatureaz separat; 2. se incubeaz mpreun ambele tipuri de DNA (ori DNA i RNA). 3. n condiiile unui grad relativ crescut de complementaritate a acestora se formeaz moleculele hibride (DNA-DNA sau DNARNA). Aceste molecule constau din sectoare spiralate i nespiralate. Cu ct gradul de nrudire este mai nalt, cu att hibridizarea este mai complect.
Aceast metod a permis descoperirea particularitilor structurii primare a DNA. S-a stabilit, c n componena DNA a animalelor se afl sectoare cu o succesiune nucleotidic identic, care de multe ori se repet. Hibridizarea decurge foarte repede. Restul DNA este prezentat printr-o succesiune unical a nucleotidelor, care nu se dubleaz.
Obiectivele:
Dogma central a geneticii moleculare. Concepia: o gen - un polipeptid. Replicarea ADN- mecanismul, substratele, matricea, enzimele i factori proteici, etapele biosintezei ADN. Telomeraza. Rolul i structura.. Reparaia ADN. Transcripia sau biosinteza ARN: matricea, substratele, enzimele, mecanismul Trsanscripia invers. Biosinteza ARN pe matrice de ARN Modificrile posttranscripionale (processing) Inhibitorii sintezei acizilor nucleici. Ingeneria genetic i semnificaia ei practic. Sinteza anticorpilor
DN A
RNA
Protein
Replicarea
Replicarea transmiterea informaiei genetice de la ADN parental la ADN fiic. Caracteristicile: 1. Se petrece n nucleu 2. Proces semiconservativ 3. se desfoar n trei etape : iniiere, elongare, terminare 4. prezena praimerului este obligatorie 5. replicarea este cuplat cu desfurarea DNA parental (necesit energie) 6. replicarea decurge n ambele direcii cu aceeai vitez. 7. Pe catena ntrziat se sintetizeaz fragmentele Okazaki. 8. Este bazat pe mpachetarea complementar a BA 9. Catena-fiic este antiparalel cu catena parental dar nu identic dup secvena nucleotidic 10. Fora motrice a procesului este hidroliza pirofosfatului 11. angajeaza simultan intregul cromozom.
2. 3. 4. a. b.
c.
Substrat: dATP, dTTP, dGTP, dCTP; ATP, GTP, CTP, UTP prezena ionilor de Mg, Mn; Zn Sistemul multienzimatic complex: Helicaza-desfacerea dublului helix, treptat, pe poriuni mici. Cele 2 catene rmn separate ca urmare a interveniei proteinelor de stabilizare (SSB). Topoizomerazele I i II nltur supertorsiunile ADN, rezolv problemele topologice aprute n cursul desfacerii lui. (I introduce supertorsiuni negative; II scindeaz o leg. fosfodiesteric pe una din catene i permite celor 2 catene s se roteasc una fa de alta) ARN primaz - sintetizeaz primerul n direcia 5'- 3 .
d. ADN polimeraza ( ADNp I, II, III)- sinteza catenei fiice n direcia 5'3' . ADN p III: aciune polimerazic (5'- 3) - sintetizeaz n direcia 5- 3' lanul polidezoxiribonucleotidic, prelund instrucii de la ADN-matri, - aciune exonucleazic (3'- 5) - ADN pII - rol neclar. ADN pI - posed activitate 5'- 3 exonucleazic, nltur primerul i-l nlocuiete cu fragmente de ADN e. ADN ligaza- unete fragmentele Okazaki de pe catena ntrziat. Catalizeaz formarea unei legturi fosfat diesterice ntre 3'-OH a unui fragment de ADN i extremitatea 5' monofosfat al altuia.
Mecanismul replicrii
3 etape: iniierea, elongarea, terminarea Originea replicrii este reprezentat de o secven specific de nucleotide secvena ori. Replisoma (complex proteic) recunoate punctul de origine. Iniierea parcurge dou etape: a. Formarea furcii de replicaie- ataarea replisomului la punctul de origine al replicrii i sub aciunea helicazelor are loc desfacerea duplexului parental pe anumite poriuni replicatori (la scindarea leg. de H dintre BA - se utilizeaz min 2 mol. de ATP). La desfacerea duplexului parental apar regiuni superhelicoidale, care se regleaz cu ajutorul girazei (topoizomerazei). Topoizomeraza efectueaz rupturi monocatenare apoi sudeaz legtura fosfodiesteric i favorizeaz relaxarea structurii DNA
b. Sinteza primerului - sub aciunea primazei se sintetizeaz o poriune mic de ARN n direcia 5'- 3'. Primerul este format din 5-10 ribonucleotide. Cruparea 3OH e un iniiator al sintezei de ADN.
Elongarea
ADN polimeraza III unindu-se la captul 3' OH al primerului ncepe sinteza ADN fiic. Reacia decurge prin atacul nucleofil al grupei 3' OH al primerului asupra unui dRNTP complementar catenei de ADN matri. Se formeaz legtura fosfodiesteric i se elibereaz PP; hidroliza PP determin polimerizarea propriu zis. Elongarea decurge n direcia 5' 3, i parcurge cu aceeai vitez pe ambele catene Catena de baz se va sintetiza continuu, iar cea ntrziat - discontinuu: va fi format din fragmente Okazaki (dimensiuni de 1000 2000 nucleotide la procariote i 150-200 la eucariote). ADN polimeraza I exclude primerii i sintetizeaz complementar ADN. Fragmentele snt unite cu enzima ADN ligaza (necesit ATP la eucariote i NAD la procariote).
Terminarea
Terminarea replicrii are loc atunci, cnd cele dou bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune opus regiunii "ori". Proteinele speciale semnalizeaz oprirea repilcrii prevenind aciunea helicazelor.
Replicarea la eucariote
Particulariti: ADN polimerazele: - implicat n replicarea ADN nuclear- responsabil de sinteza catenei ntrziat sinteza primerilor rspunde de sinteza catenei lider. Ea manifest aciune exonucleazic implicat n reparaia ADN - implicat n replicarea ADN mitocondrial, aciune exonucleazic Bifurcaia replicii este de 3000 baze pe minut comparativ cu 16.000 la procariote Pe o molecul de ADN exist mai multe origini de replicare (3X104 -
3X105
separate prin perechi de baze). n aceste origini multiple de replicare se organizeaz bifurcaii- ce se deplaseaz biderecional pe cromosomul eucariot n curs de replicare. Fragmentele Okazaki 150-200 nucleotide
Telomer Telomeraza
Replicarea capetelor 5 ale catenelor este incomplet (teoria lui Olovnicov, 1971), deoarece dup nlturarea primerului ultimului fragment Okazaki, ADN p I nu e e capabil s completeze aceste goluri. Astfel la fiecare replicare, capetele ADN se scurteaz. Aceasta nu afecteaz informaia genetic deoarece catenele conin fragmente repetitive neinformative telomere. Telomerele sunt replicate de o E specific telomeraza Telomeraza - reprezint o ribonucleoproteid: ARN i protein Subunitatea proteic TRT (telomeraze revers transcriptase) posed activitate catalitic
Telomeraza fiind o revertaz (ADN polimeraza ARN dependent) folosete ca matri propria coenzim un fragment de ARN. I etap are loc asocierea telomerazei la captul 3 al catenei lider din regiunea telomeric- TTAGGG II E extinde catena, utiliznd ca matri ARN telomeric (se repet) III Catena complementar a ADN telomeric e sintetizat dup principiul catenei ntrziate de ADNp
translocarea
GGGTTAGGGTTAG 5 AUCCCAAUC
Structura i funcia RNA telomerazice. Structura primar: la majoritatea RNA telomerice, regiunea matricial se afl la deprtarea de 50 nucleotide de la captul 5, i are urmtoarea succesiune de nucleotide 5CUAACCCUA-3. Structura secundar e compus din 4 bucle i un fragment unicatenar, ce conine matria pentru sinteza DNA telomerice.
Inhibitorii telomerazei
oligonucleotidele modificate, complementare regiunii matrice a RNA telomerazice. Aa nucleotide specific se fixeaz de matria RNA telo a omului, inhibnd activitatea telomerazic in vitro. In vivo apare problema transportului inhibitorilor prin membrana celular i micarea dirijat n nucleul celular. Ca inhibitori au fost testai i inhibitorii reverstranscriptazelor azidotimidina, didezoxiguanozina.
La om telomeraza e activ numai n celulele embrionale, n epiteliul intestinului, spermatozoizi i celule canceroase.
Numrul telomerilor determin durata vieii fiecrei celule i condiioneaz reducerea critic a numrului lor, induce moartea programat a celulei deci pierderea motivelor telomerice este cauza imbtrnirii (telomera conine mii de motive TTAGGG). lungimea telomerei este marcherul biologic al mbtrnirii.
Reparaia ADN
Erorile n timpul replicrii sunt reduse la minimum datorit DNA polimerazei ce posed funcie endonucleazic Tipuri de deteriorri: Formarea de bree Modificarea BA Pierderea de BA Formarea dimerilor de pirimidin sub aciunea razelor ultraviolete
1. 2. 3. 4.
Reparaia ADN
Incizia dimerului sub aciunea endonucleazelor Peticirea sub aciunea ADN polimerazei I Excizia fragmentului lezat sub aciunea exonucleazei Sudarea sub aciunea ADN ligazei
Transcripia
biosinteza ARN pe matri de ADN Particulariti: Matri - DNA dublu helicoidal (prezena catenei anticodogene de ADN) (catena+), Substrat - ribonucleozidtrifosfai (ATP, GTP, CTP, UTP) Sinteza are loc n direcia 53 Este asimetric copierea catenei necodifictoare Este incomplet are loc copierea doar a unei poriuni de ADN (transcripton: promotor, operator, GS, terminator) Fora motrice a procesului e hidroliza PP Enzima - ARN polimeraza
ARN polimeraza
1. 2. este o holoenzim la procariote - este oligomer din 5 protomeri (2, , 1 i sigma ). subunitile centre catalitice; - fixeaz substratul; 1 se leag de ADN, - are rol n recunoaterea secvenelor matriei numit promotor, unde ader enzima la eucariote: 1. RNApI sintetizeaza RNA ribozomal (28S si 18S) 2. RNApII sintetizeaza RNAm 3. RNApIII sintetizeaza RNAt, RNAr 5S i molecule mai mici 3. Nu necesit prezena primerului 4. Nu posed funcie nucleazic, doar polimerazic 5. ADN polimeraza conine Zn2+ i necesit prezena n mediu a ionilir de Mg2+, Mn2+
Etapele transcripiei
Sinteza decurge n 3 etape: iniierea, elongarea, terminarea. Iniierea ncepe n anumite secvene de ADN numite promotor (P 40 nucleotide). Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoatere (depistat cu ajutorul sigmei) i locusul de legare lax a ARN polimerazei. Locusul de recunoatere e situat la o distan de 25 nucleotide de locusul de legare i 10 nucleotide de la punctul de iniiere (+1) Toi P bacterieni au 2 secvene consens situate pe catena codifictoare: Caseta Pribnow (-10) 5 TATAAT 3 responsabil de iniierea denaturrii locale a ADN Caseta -35 5 TTGACA 3 - la care are loc asocierea primar a ARN polimerazei subunitatea recunoate caseta -35 i se leag la ea. E. alunec de-a lungul ADN i n jurul casetei -10 (Pribnow) deschide dublul helix formnd complexul deschis de iniiere ARN p catalizeaz formarea primei leg. fosfodiesterice ntre nucleotidul +1 i +2 - disociaz, iar E-cor continu sinteza.
Fig. 5.4
Etapele transcripiei
Sinteza decurge n 3 etape: iniierea, elongarea, terminarea.
Iniierea ncepe n anumite secvene de ADN numite promotor (P 40 nucleotide). ARN polimeraza recunoate cu ajutorul sigma Toi P bacterieni au 2 secvene consens situate pe catena codifictoare: 1. Caseta Pribnow 5 TATAAT 3 2. Caseta 35 5 TTGACA 3 P la eucariote: 1. GC casete GGGCG 2. CAAT casete CCAAT 3. Caseta Hogness TATAT/AT Primele 2 sunt responsabile de frecvena transcripiei (cnd ncepe), a 3 - implicat n iniiere semnal (unde). Toate sunt responsabile de exacitatea iniierii Pe P deosebim 2 locusuri: de recunoatere (depistat cu ajutorul sigmei) i locusul de legare lax a ARN polimerazei. Locusul de recunoatere e situat la o distan de 25 nucleotide de locusul de legare i 10 nucleotide de la punctul de iniiere (+1)
Sigma subunitatea gsete punctul de iniiere i: 1. Activeaz identificarea secvenelor de RNA polimeraz 2. Ia parte la desfacerea dublului helix de ADN 3. Ia parte la formarea primei legturi fosfosiesterice Astfel complexul de iniiere este format, sigma subunitatea e disociat de la holoenzim i ia parte la iniierea unui alt ciclu de transcriere.
Elongarea i Terminarea
Elongarea - alunecarea ARN polimerazei pe matra de ADN sinteza transcriptului (50 nucleotide pe secund) . RNAp nu controleaz catena sintetizat erorile sunt mai multe fa de replicare. Pe msur naintrii ARNp are loc desprinderea ARN de la ADN i refacerea dublului helix Terminarea RNAp recunoate secvenele nucleotidice specifice de pe ADN, ce conin un numr mare de G, C . Proteina - se asociaz la E i se mic mpreun cu ea, ns la identificarea semnalelor de terminare coboar de pe matri i ncetinete aciunea E,producnd transcriptul cu folosirea energiei ATP
Transcripia la eucariote
1. RNA p alctuit din 9-11 subuniti 2. Folosesc mai multe tipuri de ARN p: a. ARN polimeraza I ARNr (18S, 28S, 5,8S; 45S) n nucleoli; b. ARN polimeraza II ARNm; c. ARN polimeraza III ARNt i ARNr (5S) d. ARN polimeraza IV (mitocondrial)- toate tipurile de ARN mitocondrial P la eucariote: GC casete GGGCG (-90) CAAT casete 5-GGCCAATCT -3 (-75) Caseta Hogness TATAT/AT (-35) Primele 2 sunt responsabile de frecvena transcripiei (cnd ncepe), a 3 - - implicat n iniiere semnal (unde). Toate sunt responsabile de exacitatea iniierii Secvenele alctuite din 10-20 nucleotide enhancers i silencers cresc i scad respectiv V transcrierii; pot fi situate la distane mari de gena transcris.
Procesingul
Toi precursorii de ARN n nucleu trec etapa de maturizare posttranscripional. Pe parcursul procesingului - pre-ARN se transform n ARN matur. Procesingul nclude: 1. Modificarea fragmentelor terminale 5 i 3 ale ARN: a. Cap-area: la captul 5 -este adiionat guanozina metilat (5- 5 trifosfat - protejarea mARN de atacul 5-exonucleazelor i pentru recunoaterea de ctre ribosomi ca semnal de iniiere); b. la captul 3 se adaug o secven mare de poli A (200 A coad). Ea servete la exportul moleculelor de ARN din nucleu n citoplasm.
Fig. 5.11
2.Splisingul - excizia intronilor i sudarea exonilor. Aa numitul splising are loc n nucleul celulei. a.ARN nuclear (ARN U) identific secvenele de baze la jonciunea intron exon, b. se fixeaz complementar la ele, bucleaz intronul, astfel apropiind capetele exonilor. c. Are loc scindarea legturilor fosfodiesterice dintre exoni i introni, capetele exonilor sunt juxtapuse, apoi sudate de RNA ligazele
Fig. 5.13
Transcripia invers
sinteza ADN pe catena de ARN Matria ARN Substrat dRNTP:dATP, dGTP, dCTP, TTP Enzima revers transcriptaza Caracteristic viruilor oncogeni Mecanismul: a. Revers transcriptaza sintetizeaz pe ARN viral catena de ADNhibrid: ADN_ARN b. Scindarea ARN viral de o nucleaz c. Autoreplicarea ADN cu formarea unui duplex de ADN
Obiectivele:
Codul genetic. Proprietile. Ribozomii - sediul sintezei proteinelor, structura lor. Procesul de translare (sinteza proteinelor). Modificrile posttranslaionare ale proteinelor. Reglarea biosintezei proteinelor. Inducia i represia enzimelor. Inhibitorii sintezei proteice. Polimorfismul proteinelor (variantele hemoglobinei, enzimelor, grupelor sanguine). Bolile ereditare i diagnosticul lor biochimic.
Codul genetic
Informaia genetic referitor la biosinteza proteinelor se transmite cu ajutorul codului genetic - dicionar ce traduce secvena nucleotidelor din ADN n succesiunea AA din lanul polipeptidic.
Este triplet -64 codoni: 3 nonsens:UAG; UGA; UAA; 61 codific AA corespunztori - este degenerat - unui AA poate s-i corespunda mai muli codoni (Ex. Arg, Leu, Ser - codificate de 6 codoni; Met- i Trp un codon). Codonii unui aminoacid sint sinonime. Specificitatea codonului e determinat de primele dou litere. Degenerarea se refer la nivelul nucleotidului 3 din codon sau 1 din anticodon care oscileaza. - nu este ambiguu- acelai triplet nu semnific 2 AA diferii - Are o structur liniar (colinear) o concordan liniar ntre gen i proteina codifictoare - Nu se suprapune (excepie- viruii)
1. 2. 3. 4. 5. 6.
Este universal toate veuitoarele utilizeaz acelai mecanism de traducere (abatere prezint codul genetic al mitocondriilor); nu are virgule, semne de punctuatie - ce ar indica nceputul i sfritul fiecarui codon. AUG - este codonul de initiere UAG, UAA,UGA - codoni stop (non sens) Toi codonii cu U (n pozitia 2) codifica AA hidrofobi codonii cu A n pozitia -2 codific AA polari Uracilul n poziia 1 prezint codonul nonsens dac n anticodon n directia (5'->3') prima baz nucleotidic e: a) Citozina sau Adenina, el va citi un singur codon; b) Uracilul sau Guanina el va citi 2 codoni; c) inozina - respectiv va citi 3 codoni
Ribozomii
Reprezint sediul de traducere a ARNm i sinteza proteinelor. Structura- complexe ribonucleoproteice i sunt formai din dou subuniti de mrime inegal (mare i mic) Structura ribozomilor procariotici: subunitatea 30 S conine ARNr 16S i 21 proteine. subunitatea 50S ARN r 5S, 23S i 31 proteine. Sinteza ARNr i formarea subunitilor are loc n citoplasm. Structura ribosomilor eucariotici: subunitatea 40S ARNr 18S i 33 proteine. subunitatea 60S ARN r 5S, 5,8S, 28S i 49 proteine. ARNr se formeaz n nucleol. Ribozomul va avea constanta de sedimentare 70S la procariote si 80S la eucariote. S este coeficientul de sedimentare Svedberg, care depinde de forma, densitatea i dimensiunea particulelor.
Mai muli ribozomi pot citi simultan acela ARN mesager pe care il parcurg in acela sens. Se constituie astfel un poliribozom, structur ce permite accelerarea sintezei proteice.
Translaia
1. 2. 3.
4. 5. 6.
Translaia sau biosinteza proteinelor propriu zis. Bazele moleculare ale translaiei: m-RNA ca matri genetic, programul creia determin succesiunea AA n protein; aminoacil tRNA; ribozomii ca maini moleculare pentru unirea succesiv a AA n catena polipeptidic conform programului mRNA; GTP ca surs de energie; factorii proteici care vin n ajutor n diferite etape ale asamblrii proteinei n ribozomi; unii ioni ca cofactori (Mg 2+, K+).
Etapele
se realizeaza in 5 etape: Activarea AA. Iniierea lanului polipeptidic. Elongarea lanului polipeptidic. Terminarea lanului polipeptidic si eliberarea acestuia. Prelucrri post traducere ale proteinei sintetizate.
Activarea AA
1. 2. 3. 4.
a. b. c. d.
are loc n citozol Sunt necesare: AA (procariote Nformil-Met; la eucariote Met) ARNt ATP, Mg, K E aminoacil ARNt sintetaza (exist nu mai puin de 20 indentificate 32 de tipuri de ARNt): Posed 4 centre: pentru AA, ATP, ARNt, H2O Specificitatea E e determinat de structura ARNt Fidelitatea e asigurat de capacitatea de autocontrol Conine grupri libere sulfhidrilice
Activarea AA
Se desfoar n dou etape: ATP PPi
1. NH2-CH-COOH
I
NH2-CH-CO O-AMP
I
R Aminoacil Adenilat
Aminoiacil ARNt sintetaza
I
2. NH2-CH-CO O-AMP+ARNt
I
I etap - AA reacioneaz cu ATP rezultnd aminoacil-AMP. PP eliberat este hidrolizat i in acest fel reacia ireversibil. II etap - complexul cedeaz AA moleculei de ARNt, specific acelui AA
Activarea AA
Parcurge n 2 etape:
Activarea AA
Esena procesului de activare este fixarea AA la ARNt propriu acestui AA, n zona acceptorie la 3' CCA OH (sau 2' OH) al ribozei restului adenilic
Enzima poate recunoaste daca un AA gresit s-a fixat pe ARNt, situatie in care il elimina si il inlocuieste cu AA corespunzator deoarece prezinta si un locus hidrolitic.
Activarea AA
Activarea AA consum 2 legturi macroergice ARNt pe calea difuziunii simple transfer AA adiionat la el - la ribozomi, unde are loc asamblarea proteinei din AA.
Iniierea
1. 2. 3. 4. 5.
Necesar: ARNm (AUG) Ribosomul cu subunitile disociate ARNt f-met (Met) GTP, Mg IF1, IF2, IF3 Scopul: formarea complexului de iniiere
FI2 30S
FI3 A
P 50S FI1
Elongarea
1. 2. 3. 4. 1. 2. 3. Necesar: ARNm cu urmtorul codon ARNt cu urmtorul AA GTP FE: Tu, Ts, G Elongarea translaiei include trei etape: Legarea aminoacil ARNt; Transpeptidarea- formarea legturii peptidice, Translocarea (deplasarea ARNm cu un codon).
1. Adaptarea (legarea)AA
are loc dup principiul codonanticodon n centrul A a. Aminoacil-ARNt se fixeaz cu Tu+GTP adiioneaz la complexul de iniiere. b. AA se fixeaz n centrul A. Simultan are loc hidroliza GTP n GDP i P Tu-GDP+GTP-Ts------Tu-GTP
2. Transpeptidarea
este formarea legturii peptidice ntre doi aminoacizi. AA din centrul P sub aciunea peptidiltransferazei trece n centrul A. Se formeaz dipeptida n centrul P rmne ARNt liber
3. Translocarea
deplasarea ARNm cu un triplet n direcia 5- 3' . Dipeptida din centrul A trece n centrul P sub aciunea factorului G (translocazei) i GTP ARNt din P prsete ribosomul
Decurge n 3 etape :1 fixarea noului Aminoacil ARNt complexul: aminoacil-ARNt, factorul de elongare T (FE-T) i GTP. se fixeaz pe situsul A, dup ce are loc hidroliza GTP la GDP care se elibereaz mpreun cu FE-T. 2. formarea legturii peptidice. Enzima peptidil-transferaza catalizeaz formarea legturii peptidice ntre doi AA din situsul A i P.Peptida rmne ataat de RNAt de pe situsul A. translocaia ribozomul se deplaseaz la urmtorul codon de pe ARNm i peptidilARNt trece de pe situsul A pe P aceast etap necesit factorul de elongare G (FE-G) i GTP (necesar pentru realizarea modificrilor conformaionale care deplaseaz ribozomul).
Elongarea
FE-G 30S
50S
A
FE-T
E-PT FE-T
Terminarea
are loc cnd sunt ntlnii codonii UAA, UGA, UAG i factorii proteici de terminare: R1, R2, S. Nici un tRNA nu se poate lega cu codonii de terminare. Factorii de terminare: elibereaz lanul polipeptidic Elimin ARNt din centrul P Disocierea ribosomului n subunitile respective
La formarea unei legturi peptidice se consum patru legturi macroergice: 2 n etapa de activare a AA (ATP) i 2 n elongare: legare i translocare - GTP.
Prelucrrile posttraducere
1. 2. 3. 4. 5. Modificarea captului N- i C-terminal; captul N se acetileaz; ndeprtarea secvenei semnalizante cu ajutorul unei peptidaze; modificarea unor AA: hidroxilarea enzimatic a Pro, Lyz obinerea hidroxiprolinei, hidroxilizinei . Metilarea (Lyz n muchi) Carboxilarea Glu - -carboxil-glutamatului (protrombin) oxidarea reziduuriilor de Cis - cistinei; iodurarea reziduurilor de Tir ale tireoglobulinei. ataarea unor gr. funcionale: fosfat, glicozil, metalelor pentru formarea fosfoproteinelor,glicoproteinelor, metaloproteinelor .a. Formarea punilor disulfurice Proteina se autoasambleaz formnd conformaia nativ structura tridimensional
1. Mitomicina mpiedica separarea catenelor de ADN 2. Acid nalidixic inhiba ADN giraza
la nivelul transcriptiei:
Teoria lac-operonului
Schema reglrii biosintezei proteinei la procariote a fost descris n 1961 de ctre Jacob i Monod - poart denumirea de teoria lac-operonului . Modelul e bazat pe studiul reglrii mtabolismului lactozei n Escheria coli. Exprimarea GS (conin informaia cu privire la biosinteza E impicate n utilizarea lactozei:-galactozidaza, permeaza i transacetilaza 1,2,3) e controlat de un fragment de ADN denumit gen reglatoare (GR) codific represorul (R). R se leag de un fragment de ADN denumit operator (O). Legarea R la O blocheaz accesul ARN polimerazei la promotor avnd ca rezultat suprimarea transcrierii GS.
Ce se ntmpl dac bacteria dispune simultan de glucoz i lactoz? Bacteria nu consum energie pentru sinteza lacoperonului, atta timp ct dispune de glucoz. Bacteria crete pe seama glucozei - i numai atunci cnd c% acesteea devine minim ncepe s utilizeze lactoza. Metabolizarea simultan a glucozei i lactozei sunt excluse. Cum se comut activitatea bacteriei pe utilizarea lactozei cnd c% glucozei scade?
n lipsa glucozei se mrete c% AMPc ce reprezint semnalul foamei la bacterii. Ca urmare, AMPc se leag de o protein receptoare specific (proteina activatoare a genei catabolice CAP) - formeaz complex (CAP- AMPc), apt s se lege de promotor (p-locus) Acest proces favorizeaz ptrunderea ARNp n locusul de reglare. Dac lactoza este prezent n mediu, operatorul este liber i ARNp efectueaz transcrierea genelor lac. CAP dispune de 2 centre: pentru AMPc i pentru ADN
Ilustrarea mecanismului de reglare a sintezei proteinei prin represie Teoria operonului explic i represia prin produs final al biosintezei E Ex: sinteza His: la c% mari de His (corepresor) se leag de R, modificndu-i conformaia activndu-l n rezultat favorizeaz legarea R la O. His produs final, CoR- sisteaz transcrierea genelor ce codific E implicate n propria sa sintez
REZUMM:
GR controleaz exprimarea anumitor GS prin intermediul unei proteine R Ra suprim sinteza de ARNm, deci de proteine; R inactivat permite transcrierea GS i sinteza proteinei E inductibile Ra nu are loc transcrierea. Cnd n mediul apare I R se inactiveaz are loc sinteza ARNm- proteinei E represibile R este inactiv are loc transcripia i translaia. Cnd n mediu se acumuleaz produsul final al cii anabolice (CoR)- R se activeaz, formarea complexului R-CoR i sistarea transcripiei i translaiei.
Ingineria genetic
tiinta, preocupat de crearea noilor fenotipuri prin transplantarea genei unui organism n genomul altuia n scop de a lichida defectele ereditare ale genomului, adic tratarea afectiunilor ereditare (gena ntrodus nu gureaz n patrimoniul ereditar al genomului -gazd) Se obtin molecule hibride (himerice) n linii marl procedura include etapele: 1. Cptarea genei 2. Cptarea ADN-ului recombinat 3.Clonarea ADN-ului recombinat Cptarea genei:Stiind structura primar a proteinei n laborator se poate obline gena respectiv (se oblin gene pn la 250 codoane)mai greu e obtinerea genei din genomul celulei (genele se despart prin introni)- mai uor e cptarea genelor din virusuri cu enzima revertaza.
gena necesar se ntroduce n celul pentru a se integra cu genomul acestuia. Pentru aceastan vitro gena se unete cu ADN-vector(plasmide ce conin ADN inelar (cteva gene). De regul se folosete E Coli, ce contine un cromozom i plasmide, ce plutesc n citozol (plasmida este de 1000 ori mai mica dect cromozomul). Plasmidele se replica independent de replicarea materialului genetic. Unele plasmide se pot include n cromozom i apoi din nou s-l prseasc. Plasmidele pot trece dintr-o celul n alta n procesul deconjugare. Plasmidele se separ din E.Coli i li se nltur o parte de ADN inelar cu ajutorulenzimelor restrictaze, care recunosc i taiediferite sectoare. Folosind restrictaze diferite se poate de tiat ADN n locusurile necesare. Inrezultat se formeaz capete lipicioase (sectoaremonocatenare, capabile de a uni nucleotide complimentare. La fel se procedeaz i cu gena,care trebuie ntrodus (se formeaz capete lipicioase complimentare capetelor plasmidei). Dac se amestec gena i plasmida ele se vor uni cu capetele lipicioase. Enzima ligaza va uni capetele i se va cpta molecula ADN inelara, care contine gena menit pentru transplantare.
3.Clonarea
ADN-ului recombinat- obtinerea cantitilor dorite de protein codificat de gena eucariot ntrodus n plasmid. Dac n cultura E.Coli se ntroduc plasmide recombinate, se formeaz bacterii recombinate. In celul plasmidele se replic. Bacteriile nmulindu-se formeaz celule, care conin aceste plasmide. Acum din masa bacterian se poate de capatat cantitti sufuciente de ADN recombine
Ranadamentul sintezei bacteriene este impresionabil: Ex- 100 celule E.Coli produc prin clonare 5 mg somatostatin (cantitate, ce se obine prin prelucrarea a 100 tone de creier de bovine). Prin tehnica ingineriei genetice s-au obtinut cantiti mari de insulin (Humulun), Interferon, vaccine. Diversitatea formelor n Iimita uneia i aceai specie se datorete mutaiilor i ntr-o msura mai mare recombinrii genetice.
Mutaiile.
Modificrile genomului organismului, care se pstreaz i se transmit prin ereditate se transmit apoi de la o generaie la alta. Modificrile pot interesa o pereche de baze (mutatii punctiforme) sau un grup de baze pe una sau pe ambele catene ale unei molecule de DNA.
Mutatiile punctiforme: pot decurge prin: l. substitutie (misens mutatii, unde deosebim 2 tipuri): a. Tranzitie - o BA purinic este nlocuit tot cu una purinc, una pirimidinic -tot cu una pirimidinic. b.Transversie - o pereche de baze purinice este nlocuit cu una pirimidinic sau invers. 2. Inserie - acest mecanism const n ntroducerea unei perechi de baze suplimentare n catena de DNA. 3. Deleia const n excluderea unei perechi de baze n aa mod ca ea nu mai poate f complementar i la replicare apare "golul" n ambele catene. Unele modificri n secventa nucleotidic pot duce la formarea codonului sinonim i succesiunea aminoacizilor nu se va schimba (mutatii benigne). La afectarea segmentelor mari de gen apar mutatii ntinse. In dependent de consecinele modificrilor deosebim mutaie benign, neutr, nociv. Agenii mutageni pot provoca mutaiile spontane ct i mutaiile induse.
Anticorpii sunt
Secvena de AA n poriunea variabil este diferit pentru fiecare anticorp. Lanurile sunt unite ntre ele prin legturi disulfidice. Genele ce corespund poriunilor V" i C ale unui anumit tip de lan uor sunt foarte apropiate n ADN al imunocitelor care produc acest tip de lan uor, dar se gsesc departe una de alta n ADN al celulelor ce produc alte tipuride anticorpi. De aici reiese, c n imunocit se selecteaz un anumit segment de ADN, ce codific poriunea variabil a unui anumit lant uor, care se transfer prin transpoziie n vecintatea secvenei codificatoare a poriunii constante a lantului uor. Deci ADN ce codific sectoarele V" ale lanurilor H" i "L" const din cteva gene de tip diferit care-i pot schimba locurile proprii i asocia cu formarea imenselor combinaii.
Sinteza Anticorpilor
Fiecare dintre milioanele de anticorpi produi leag unul dintre milioanele de antigene posibile. Este greu de crezut c organismul are n patrimoniul su genetic cte o gen pentru fiecare anticorp pe care-l produce ntruct aceasta ar presupune o supradimensionare a genomului eucariot.
Gradul de diversificare n obinerea lanurilor H" i L" este crescut prin faptul c o poriune variabil este rezultatul asamblrii a 3 regiuni. Deci ADN ce determin poriunea variabil a anticorpului este constituit din: 1. Poriunea variabil (V) constituit din - 400 de gene. 2. Poriunea de diversitate (D) ce cuprinde -12 gene 3. Portiunea de articulare sau jonciune (J) - 4 gene Asamblarea acestor gene n diferite combinaii permite construirea a 20000 de sectoare V - fapt ce asigur extrema varietate a anticorpilor.