Biochimie DS

Digitally signed by
Biblioteca UTM
Reason: I attest to the
accuracy and integrity
of this document
UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

FACULTATEA TEHNOOGIE I MANAGEMENT
N INDUSTRIA ALIMENTAR
CATEDRA ENOLOGIE
BIOCHIMIE
ndrumar de laborator
Chiinu
U.T.M.
2007
ndrumarul este destinat studenilor anilor 2(U) i 3(U) a

seciilor de zi i cu frecven redus pentru toate specialitile
tehnologice ale facultii TMIA care studiaz cursul de
"Biochimie".
Elaborare: conf.univ., dr. Liudmila Palamarciuc

conf.univ., dr. Tatiana Vrabie
lector superior Aliona Sclifos
Redactor responsabil: prof.univ., dr. Anatol Blnu
Recenzent: conf.univ., dr.Rodica Sturza
Bun de tipar 23.05.07.

Formatul 60x841/16
Hrtie ofset.
Tipar RISO
Tirajul ex. 200
Coli de tipar 7,25.
Comanda nr. 85
U.T.M., 2004, Chiinu, bd.tefan cel Mare, 168.
Secia Redactare i Editare a U.T.M.
2068, Chiinu, str.Studenilor 9/9
U.T.M., 2007
ORGANIZAREA I METODICA EFECTUARII LUCRRILOR

DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECURITATE
PENTRIU LABORATORUL DE BIOCHIMIE
nainte de a ncepe lucrul n laborator trebuie s fie
cunoscute regulile generale de lucru, regulile tehnicii securitii,
msurile de prentmpinare i prevenire a accidentelor. Studentul
care rspunde materialul nsuit profesorului este notat ntr-un
registru special. Cei care snt nepregtii pentru efectuarea lucrrii
practice nu snt admii.
Regulile generale de efectuare a lucrrilor practice
1. nainte de a ncepe lucrarea practic trebuie s fie nsuit
materialul teoretic la aceast lucrare din ndrumarul metodic.
Materialul nvat se expune profesorului, aceasta fiind ca permis la
efectuarea lucrrii.
2. n procesul lucrrii practice trebuie s fie respectate
consecutivitatea operaiilor recomandate de regulile de securitate i
de indicaia metodic.
3. n timpul lucrului studentul trebuie s fie atent, s pstreze
linitea, s fie punctual.
4. Se interzice ca studentul s lucreze n laborator singur, fr
supravegherea profesorului sau a inginerului.
5. Fiecare student trebuie s lucreze la locul stabilit, s
foloseasc aparatele, vesela chimic, reactivele, care snt pe mas la
lucrarea corespunztoare. Dac lipsete un reactiv sau un vas
chimic trebuie de adresat la profesor sau inginer. Se interzice de a
lua reactive i vase chimice de pe alte mese de laborator.
6. Pe masa de laborator nu trebuie s fie obiecte ce nu au
legtur cu lucrarea practic. Dup terminarea lucrrii, locul de
lucrul din laborator trebuie s fie adus n ordine.
Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie i

regulile de folosire a reactivelor chimice
1. Pe parcursul efecturii experienelor trebuie cu atenie de
folosit vasele chimice, aparatele i reactivele.
2. Se interzice de lucrat cu vase chimice nesplate sau
stricate.
3. Se interzice de lsat fr supraveghere aparatele n
funciune.
4. Toate lucrrile cu substanele toxice sau cu miros iritabil
trebuie s fie efectuate n nia de ventilare.
5. n timpul lucrrilor practice legate de substane inflamabile
(eter, alcool, benzin, benzol, aceton i altele) sau explozive
trebuie de respectat urmtoarele reguli:
substanele date se in ct mai departe de foc i de

aparatele de nclzire;
nu se admite pstrarea lor n vase de sticl subire i

nchise ermetic cu dop;
nu se admite pstrarea reactivelor n cantiti mari pe

masa de laborator;
se interzice de turnat aceti dizolvani aproape de foc

sau de nclzit la foc deschis. Se permite de nclzit numai n baia
de ap cu rcitor de ap invers;
se interzice de turnat reactivele date n chiuvet;
dac au fost vrsate cantiti mari de substane

inflamabile trebuie imediat de nchis toate robinetele de gaz, de
deconectat aparatele electrice, aparatele de nclzit, de deschis toate
ferestrele i de strns soluia vrsat cu crpa.
6. Vasele cu reactive trebuie de astupat cu dopuri respective.
7. Se interzice de lsat soluia n vase fr inscripii.
8. Pentru a cntri probe de produs de natur vegetal trebuie
de folosit cntarul tehnic i nu cel analitic.
9. Se interzice categoric de tras cu ajutorul gurii n pipete
soluii care pot provoca arsuri chimice (acizi i baze alcaline
concentrate, reactivele Fehling, amestecul formolic i altele).
4
10. n laborator nu se mnnc nici nu se bea din vesela

chimic.
11. n laborator se interzice de fumat, de consumat buturi
alcoolice sau droguri.
Primul ajutor n caz de arsuri i intoxicaii
1. Dac arsura provine de la un obiect incandescent sau de la
foc leziunea trebuie tratat cu o soluie de alcool etilic, apoi de uns
cu glicerin sau vaselin. Arsurile grave se trateaz cu soluie de
permanganat de potasiu sau cu vaselin i se adreseaz la medic.
2. Dac pe suprafaa pielii au nimerit stropi de lichid agresiv
ea trebuie splat imediat cu ap din robinet, apoi neutralizat:
acidul cu soluie de sod calcinat de 3 % sau amoniac, iar baza
alcalin cu soluie de acid acetic de 2 %.
3. Dac n ochi au nimerit stropi de acid concentrat, splai
imediat cu ap din robinet, apoi cu soluie de sod calcinat de 3 %,
adreseai-va urgent la medic. Dac au nimerit stropi de baz
alcalin se spal cu ap , apoi cu cantiti mari de soluie de 0,5 %
de acid boric, se adreseaz urgent la medic .
4. Dac ntmpltor au nimerit reactive n organism se
recomand: n caz de baz alcalin de but o cantitate mare de
ap, apoi un pahar cu soluie de 2 % de acid acetic sau citric; n caz
de acid un pahar cu soluie de 2 % de bicarbonat de sodiu.
5. Dac s-a produs lezare cu sticl n primul rnd trebuie de
nlturat cioburile din ran, apoi de dezinfectat cu soluie
alcoolizat de 3 % de iod i de legat cu pansament steril. Dac
scurgerea e mare, mai sus de ran se aplic un garou, apoi se
adreseaz la medic.
6. Dac n laborator izbucnete incendiu, trebuie nchise
imediat robinetele de gaz i de lichidat focarul incendiului cu nisip
sau stingtor de bioxid de carbon. Dac s-a aprins haina stingerea
se face cu o plapum de ln.
Lucrarea de laborator nr. 1

Determinarea azotului total n produse vegetale
(dup metoda Kjeldahl)
Importana analizei
Aceast metod este utilizat pentru determinarea azotului
aminic, amidic, peptidic i a amoniacului liber. n materia vegetal
(cu excepia pomuoarelor i strugurilor) masa principal de
substane azotoase este reprezentat de proteine.
Protidele i proprietile lor
Protidele snt substane formate din aminoacizi, ele au o
importan primordial (grec. protos- primul) pentru organismele
vii. Protidele se gsesc n toate organismele vegetale i animale. n
regnul animal protidele snt substane predominante 65-70 %, n
plante 2-35 % din masa uscat. Necesitatea fiziologic a omului
este de 100 grame pe zi.
Compoziia elementar a proteinelor:
C - 50,6 - 54,5 %;
O - 21,5 - 23,5 %;
N - 15,0 - 17,6 %;
H - 6,5 - 7,3 %;
S - 0,3 - 2,5 %;
Numeroase proteine mai conin n cantiti mici i alte
elemente: P, Fe, Mg, Cu, Mn etc.
Reieind din coninutul azotului N n protein (16 % n
mediu) se poate determina indirect cantitatea de protein brut din
materialul cercetat, utiliznd formula:
Proteina brut = N x 100/16 = N x 6,25
n organismele vii proteinele exercit funciile de cataliz,
structur, transport, aprare, depozitare, recepie i de reglare a
activitii genomului, efectueaz micrile i reprezint o mare
parte de hormoni.
Pentru proteine se deosebesc patru niveluri de organizare
intramolecular: structura primar, secundar, teriar i cuaternar.
6
Proteinele formeaz aceste structuri datorit celor cinci tipuri de

legturi dintre aminoacizi: peptidice, covalente disulfidice, ionice,
de hidrogen i hidrofobe. Proteinele au proprieti amfotere, fiindc
conin grupri acide i bazice. Proteinele uor denatureaz, ca
rezultat i schimb proprietile biologice i fizico-chimice. Sub
aciunea enzimelor, bazelor i acizilor proteinele se descompun
formnd produse intermediare (peptone, polipeptide) i la ultima
faz a hidrolizei aminoacizi.
Clasificarea proteinelor simple i conjugate
Toate proteinele se mpart n dou grupe mari: proteine
simple (proteine), n compoziia crora intr numai resturi de
aminoacizi i proteine conjugate (proteide), care reprezint o
combinaie dintre o protein simpl cu un compus de natur
neproteic, denumit gruparea prostetic.
Proteinele simple
n funcie de solubilitatea i proprietile fizice proteinele
simple se divizeaz n urmtoarele grupe: albumine, globuline,
prolamine, protamine, histone, gluteline, scleroproteine sau
proteinoide.
Albuminele snt proteine solubile n ap. Au masa
molecular relativ mic de la 10 mii pn la 100 mii uniti. Snt
foarte rspndite n natur: ovalbumina din albuul de ou, leucozina
din gru, legumelina din mazre, lactalbumina din lapte, etc.
Globulinele snt proteine insolubile n ap, dar solubile n
soluii de sruri ale metalelor uoare (5-10 % NaCl sau Na2SO4).
Au o mas molecular mare 100 000 1 000 000. Snt foarte
rspndite n natur: lactoglobulina din lapte, miozina din muchi,
legumina din mazre, fasolina din fasole albe etc.
Prolaminele (sau gliadinele) snt proteinele greu solubile n
ap i n alcool absolut, dar solubile n alcool de 60-80 %. Ele
conin mult prolin. Se gsesc mai ales n plante, n seminele
cerealelor: gliadina din boabele de gru i secar, zeina din boabele
de porumb.
Protaminele snt proteine, soluiile crora au un caracter
bazic puternic, snt uor solubile n soluii diluate de acizi, masa
7
molecular este joas (pn la 12 000). Nu conin sulf, se gsesc n

cantiti mari n nucleul celular i sperma petilor: clupeina din
scrumbie, sturina din nisetru.
Histonele proteine nucleare cu un caracter slab bazic,
solubile n soluii diluate de acizi. Intr in componena proteidelor
cromozomilor, eritrocitelor , leucocitelor, celulelor timusului.
Glutelinele snt proteine cu un caracter slab acid, solubile n
baze diluate. Snt bogate n acid glutamic, au proprieti
mucilaginoase, ca i prolaminele se gsesc n semine de cereale
(gluteina din boabele de gru, orizenina din boabele de orez).
Amestecul format din gluteina i gliadina care se izoleaz din fina
de gru poart denumirea de gluten. Proteinele din gluten prin
punile lor -S-S- confer finii de gru proprietatea de a forma cu
apa un aluat elastic, care reine ntr-un mod caracteristic dioxidul
de carbon eliberat n timpul fermentrii, dnd pinii o structur
poroas i un volum corespunztor.
Scleroproteinele proteine insolubile (fibrilare). Conin o
cantitate mare de glicin i cistein. Reprezentanii tipici snt
colagenul din esutul conjunctiv, elastinele din arterii i tendoane ,
cheratinele din pr, coarne, copite, piele, ln, unghii.
Proteine conjugate (proteide)
Proteidele n funcie de gruparea prostetic se clasific n
subgrupe:
1. Fosfoproteidele snt un grup mic de proteine care conin acid
fosforic. Au caracter acid, snt solubile n soluii alcaline, se
conin n lapte (cazeina), n glbenuul de ou (vitelina). Unele
enzime
snt
fosfoproteide:
pepsina,
fosforilaza,
fosfoglucomutaza, fosfotriozoizomeraza etc. n plante
fosfoproteidele au fost identificate n polenul de porumb.
2. Cromoproteidele au o grupare prostetic colorat i n general
snt biocatalizatori ai fotosintezei i ale altor reacii de
oxidoreducere. Ca grupare prostetic pot servi derivai ai
porfirinei (clorofila, hem), izoaloxazinei, carotinei. Clorofila
intr n componena cloroglobinei, hemul mpreun cu globina
8
3.
4.
5.
6.
formeaz hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetic a

flavinproteidelor (dehidrogenazelor aerobe), derivaii carotinei
formeaz rodopsina din retina ochiului.
Glicoproteidele au gruparea prostetic de natur glucidic. n
majoritatea cazurilor, gruparea prostetic este reprezentat de
mucopoliglucide, care prin hidroliz dau manoza, galactoza,
hexozaminele, acizii glucuronic, acetic i sulfuric. Cele mai
importante glicoproteide snt mucinele n secreia mucoaselor
(protejeaz mucoasele tractului gastro-intestinal) i mucoidele
(intr n constituia cartilagiilor, oaselor, tendoanelor i
ligamentelor). Avidina este o glicoproteid din albuul de ou
crud, care inhib activitatea biotinei. n semine i alte organe
vegetale se gsesc glicoproteide care produc aglutinarea
eritrocitelor, ele se numesc lectine. Cantiti mai mari de lectine
se gsesc n leguminoase.
Lipoproteidele au n componena lor lipide: colesterol,
fosfolipide, acilgliceroli. Lipoproteidele au o larg distribuie,
fiind componente structurale ale biomembranelor. n cantiti
mari se gsesc n esutul nervos, plasma sngelui, lapte,
glbenu de ou. Ele ajut la transportul unor substane
liposolubile (vitamine, hormoni, carotinoide, diverse
medicamente).
Metaloproteidele conin un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co
etc.) fixat prin legturi complexe direct de componena
proteic. Gruprile proteinei care fixeaz metalul poart
denumirea de liganzi.
Unele metaloproteide snt enzime (polifenoloxidaza,
alcooldehidrogenaza), altele ndeplinesc funcia de proteine
transportatoare de metal (transferina) i rezerva de metal
(feritina). Ele particip la diverse procese metabolice:
fotosinteza, respiraia, transportul de O2 i electroni.
Nucleoproteidele snt constituite din acid nucleic i protein,
au o mas molecular mare (de la cteva mii pn la sute de
milioane). Cromozomii, ribozomii, viruii snt particule
nucleoproteice.
9
__
Principiul metodei
Produsul vegetal, care conine substane azotoase, se
mineralizeaz prin ardere n acid sulfuric concentrat. Ca catalizator,
n dependen de substan care se arde, se folosete sulfat de cupru
sau peroxid de hidrogen, mercur, permanganat de potasiu, selen
etc.
Pentru a ridica temperatura de fierbere a acidului sulfuric se
folosesc cristale de sulfat de sodiu sau potasiu.
n procesul de mineralizare se formeaz amoniac, care se
unete apoi cu acidul sulfuric, formnd sulfat de amoniu:
__
R __ CH COOH + H2SO4
CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
NH2
Arderea produsului analizat se efectueaz n balonul
Kjeldahl.
Dup mineralizarea total soluia rcit se dozeaz cu o
cantitate mare de hidroxid de sodiu, iar amoniacul eliminat se
distileaz i se reine cu soluie diluat de acid sulfuric. Cantitatea
de acid sulfuric legat se recalculeaz n amoniu, apoi n azot, care
se exprim n procente n raport cu masa produsului analizat.
Pentru a calcula cantitatea de azot n substana proteic
rezultatul se nmulete cu coeficientul corespunztor. Pentru
majoritatea proteinelor se folosete coeficientul 6,25 din
considerarea c cantitatea de azot este n medie 16 %. Pentru
proteinele din cereale coeficientul este egal cu 5,71 din cauz c
cantitatea de azot este n medie 17,5 %.
Aparate, vase i materiale:

aparat pentru ardere;
aparatul Kjeldahl;
2 baloane Kjeldahl;
2 pipete gradate de 5 cm3 i pipeta Mor de 10 cm3;
2 baloane conice de 250 cm3;
cilindru de 10 cm3;
H2SO4 concentrat;
10
sulfat de cupru (cristale), CuSO4;

sulfat de natriu sau potasiu (Na2SO4 sau K2SO4);
soluie de 0,02n H2SO4;
soluie de 0,02n NaOH;
soluie de 33 % NaOH;
indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot i
0,012 g metilen albastru se dizolv n 60 cm3 alcool i cu ap se
aduce pn la 100 cm3.
Ordinea ndeplinirii lucrrii
Aparatul Kjeldahl (fig. 1) este constituit din vaporizator (1),
umplut cu ap distilat cu ajutorul plniei (2). Balonul Kjeldahl (6)
este unit cu vaporizatorul printr-un tub (3) nzestrat cu o plnie (4)
cu clem (5) pentru dozarea soluiei de 33 % NaOH i este unit cu
rcitorul (7) prin captatorul de picturi (8). Alonjul rcitorului (10)
este unit cu un balon conic (de recepie) de 250 cm3 (9).
Figura 1. Aparatul Kjeldahl
11
Metoda determinrii azotului total n produse lichide

n dou baloane Kjeldahl se msoar cu pipeta gradat cte
3
5 cm soluie pentru analiz (vin, suc etc.). Baloanele se nclzesc
la aparatul de ardere i se fierb pn cnd volumul soluiei ajunge la
1-1,5 cm3 (nu se admite prinderea de fund). Apoi n fiecare balon
dup rcire, se dozeaz cu cilindrul 3 cm3 de H2SO 4 concentrat,
aproximativ 50 mg de CuSO4 i 0,5 g de Na2SO4, balonul se
nchide liber cu dop de sticl i se pune la ardere n nia de
ventilare.
Arderea probei se face pn cnd soluia din balon devine
incolor i nu conine resturi carbonizate de substan.
Se pregtete aparatul Kjeldahl pentru distilare. Apa din
vaporizatorul (1) se fierbe. Balonul Kjeldahl (6) cu proba
neutralizat i rcit se unete la aparat. n balonul conic (de
recepie) de 250 cm3 (9) se dozeaz cu pipeta Mor 10 cm3 soluie
0,02n de H2SO4 i balonul se instaleaz sub rcitorul (7) astfel, nct
captul alonjului (10) s fie de 2-3 mm n soluie. n balonul
Kjeldahl prin plnia (4) se dozeaz 15 cm3 de ap distilat, apoi cu
cilindrul soluie 33 % de NaOH din raportul (la fiecare 1 cm3
H2SO4 concentrat luat la ardere se adaug cte 5 cm3 soluie 33 %
de NaOH). Se nchide repede clema (5) la plnia (4) i se ncepe
procesul de distilare a amoniacului, care decurge 15 min.
n ultimele 5 minute alonjul rcitorului nu trebuie s fie n
soluia de acid. Dup distilare alonjul se spal cu o cantitate mic
de ap distilat.
La soluia obinut din balonul conic de 250 cm3 se dozeaz
4-6 picturi de indicator mixt i surplusul de acid se titreaz cu
soluie 0,02 n de NaOH din biuret.
Paralel se pune proba de control, pentru care n balonul
Kjeldahl n loc de vin se ia ap distilat i se repet aceleai
operaii descrise mai sus.
La recalcularea cantitii de azot total se ia n considerare
c 1 cm3 soluie 0,02 n NaOH corespunde la 0,28 mg de azot.
12
Cantitatea de azot (X) n mg/dm3 n produsul analizat se

calculeaz dup formula:
(a-b) * K * 0,28 * 1000

____________________
V
,
unde:
a - cantitatea (cm3) de soluie 0,02 n de NaOH, folosit la
titrarea acidului sulfuric pentru proba de contro,;
b - cantitatea (cm3) de soluie 0,02 n NaOH, folosit la
titrarea acidului sulfuric pentru proba de lucru;
K coeficientul de corecie al bazei;
0,28 cantitatea de azot n mg, care corespunde unui cm3
de soluie 0,02 n NaOH;
V volumul soluiei analizate, cm3.
X=
ntrebri de control:
1. Caracteristica general a proteinelor.
2. Compoziia elementar a proteinelor.
3. Clasificarea proteinelor simple i compuse.
4. Metoda de determinare a azotului total n produse lichide.
5. Regulile tehnicii de securitate ce trebuie respectate n
procesul determinrii azotului total dup metoda Kjeldahl.
13

Determinarea poteniometric a derivailor formolici
ai aminoacizilor
Importana analizei
aminoacizii snt elemente structurale ale moleculei
proteice, adic monomerii proteinelor. Totodat aminoacizii liberi
ndeplinesc funcii vitale n organisme. Aminoacizii i amidele lor
se ntlnesc, de regul, n cantiti mici n stare liber n materia
prim de origine vegetal sau animal i n produsele prelucrrii
lor. Dar se gsesc i n cantiti mari. De exemplu, n mustul din
struguri, n sucuri i vinuri aminoacizii constituie mai mult de
jumtate din substanele azotoase.
n organism i la prelucrarea materiei prime alimentare din
aminoacizi se formeaz un ir de substane, care determin gustul,
culoarea i mirosul produselor. Melaninele, melanoidinele, uleiurile
de basamac . a. se obin din aminoacizilor
Proprietile chimice ale aminoacizilor
Aminoacizii snt derivai ai acizilor carbonici, n
molecula crora atomul de hidrogen de lng atomul carbonic
este nlocuit cu gruparea aminic (-NH2). Avnd proprieti
amfotere (reacia 1), aminoacizii pot s reacioneze ca amine
(reaciile 2-4) i ca acizi carbonici (reaciile 5-6):
1)
R
CH
COOH
CH
COO-
NH3 +
NH2
Datorit gruprii aminice aminoacizii intr n reacia
specific cu acidul azotos, pot s reacioneze cu acizii minerali, cu
aldehidele i glucidele reductoare. De exemplu:
14
2)
RCHCOOH + HNO2 RCHCOOH + N2 + H2O
|
|
NH2
OH
n rezultatul ultimii reacii se elimin azotul i se formeaz
hidroxiacidul. Aceast reacie st la baza determinrii cantitative a
aminoacizilor dup metoda Van Slyke (se ia n considerare
cantitatea de azot eliminat).
3) Cu HCl se formeaz o sare complex:
R CH - COOH + HCl [ RCHCOOH ] Cl
|
|
+
NH 2
NH 3
4) n urma interaciunii aminoacizilor cu aldehide (de exemplu cu
glucide) se formeaz baze Schiff:
RCHCOOH + O=CHR RCHCOOH + H2O
|
aldehida
|
NH2
N=CHR baza Schiff
Din baze Schiff pot fi formate melanoidine (substane de
culoare ntunecat).
Grupa carboxilic a aminoacizilor reacioneaz cu baze
(reacia 5) i alcooli (reacia 6), formnd respectiv sruri i esteri:
5) RCHCOOH + NaOH RCHCOONa + H2O

|
|
NH2
NH2
15
6) RCHCOOH + HOC2H5 RCHCOOC2H5 + H2O

|
|
NH2
NH2
n rezultatul ultimii reacii aminoacizii din stare solid se

transform n esteri lichizi, amestecul crora se poate separa prin
distilarea fracionat cu vid.
Toi aminoacizii reacioneaz cu ninhidrina, formnd n
mediul acid produse incolore, iar n mediul neutru sau bazic
produse colorate albastru intens.
n mediul acid aminoacidul este degradat pn la aldehid,
iar ninhidrina se reduce pn la ceto-alcool:
CO
OH
+R
C
OH
CO
CH
COOH
H+
CO
OH CH
NH2
CO
OH
+R
C
OH
CO
CO
COOH
OH
CO
CO
__
C =N CH
CO
NH2
__
+ R CHO+ NH 3 + CO 2
CO
__
+ R CHO+ 3H2O + CO 2
Reacia cu ninhidrin are o mare importan pentru

recunoaterea i dozarea aminoacizilor.
aminoacizii prin nclzire lent pierd dou molecule de
ap i se transform n substan ciclic dicetopiperazin. De
exemplu, din dou molecule de glicocol se formeaz 2,5
dicetopiperazina:
16
COOH
NH2
CH2
CH2
NH2
COOH
H2C
-2 H2O
NH
C=O
O=C
NH
CH2
Prin nclzirea rapid a unui amestec de aminoacizi se

elimin n molecule de ap din gruparea carboxilic a unui
aminoacid i gruparea aminic a altui aminoacid i se formeaz
peptide (sau polipeptide):
CH
COOH + HNH
CH
COOH
-H
H2N
R1
H2N
CH
R
CO
NH
CH
R1
COOH
dipeptid
Legtura ce se formeaz ntre doi aminoacizi (sau n
molecule de aminoacizi) se numete legtur peptidic (-CO-NH-).
Aminoacizii, care se conin n materia prim alimentar, pot
fi supui proceselor biochimice de dezaminare oxidativ i n
continuare decarboxilrii i hidrolizei. Aceste reacii au loc la
diferite operaii tehnologice n prezena oxigenului, peroxizilor,
chinonelor i altor oxidani. n rezultat se formeaz aldehide, care
dau deseori produselor finale o arom specific.
Dezaminrea aminoacizilor are loc n mai multe etape cu
formare de iminoacid (prin dehidrogenare), care apoi prin hidroliz
trece ntr-un cetoacid i amoniac. Iar cetoacidul prin decarboxilare
trece n aldehid. Respectiv, prin decarboxilarea iminoacidului
rezult o aldimin, care prin hidroliz se transform n aldehid i
amoniac:
17
CH
- 2 H+
COOH
NH2
iminoacid
COOH
NH
-C
COOH
NH
H2
- CO2
CHO
aldehida
+ H2O
- NH3
CH
NH
Principiul metodei
Aminoacizii uor reacioneaz cu un exces
formaldehid formnd baze Schiff (sau derivai formolici):
R
CH
de
COOH
NH 2 + O = CH2
CH
COOH
+ H2 O
N=CH 2
Prin aceasta aminogrupele i pierd proprietile bazice, iar

grupele carboxilice libere se titreaz cu baz (NaOH), formnd
sruri:
R
CH
COOH
NaOH
CH
COONa
H2 O
N = C H2
N = C H2
Se consider convenional, c numrul grupelor carboxilice

titrate snt echivalente cu numrul grupelor aminice legate de
formaldehid (ceea ce e corect pentru aminoacizii
monocarboxilici).
Pentru a introduce corecia la aminoacizii dicarboxilici
(acidul glutamic, asparagic i alii), soluia se neutralizeaz n
prealabil cu baz pn la pH = 6,8.
18
Totodat se titreaz i acizii organici (tartric, acetic, malic,

citric etc.), care se conin n vinuri i sucuri.
poteniometru, pH-673 M sau pH-150 MA;
agitator magnetic ;
pahar de 100 cm3;
biuret de 25 cm3;
cilindru de 25 cm3;
pipet Mor de 10 cm3;
soluie 0,1n NaOH;
amestec formolic (20 cm3 formalin 40 % + 1 cm3
fenolftalein, se titreaz cu soluie 0,2 n NaOH pn la pH = 6,8);
probe de materie prim (vin, suc).
Pentru titrare se folosete poteniometrul cu doi electrozi de
sticl i calomel. nainte de a ncepe lucrarea pHmetrul se
nclzete 30 minute. Electrozii se spal bine cu ap distilat i se
usuc cu hrtie de filtru.
Biureta se umple cu soluie 0,1n de NaOH. n pahar se
dozeaz 10 cm3 soluie pentru analiz (vin sau suc) i se adaug ap
distilat 10 cm3. Se introduc electrozii i se titreaz pn la pH 6,8.
Titrarea se efectueaz n felul urmtor:
1. Se determin pH-ul soluiei analizate.
2. Se cupleaz agitatorul magnetic.
3. Proba analizat se titreaz cu soluie 0,1n de NaOH cu
viteza de 5-7 picturi pe secund concomitent urmrind indicaia de
pe ecranul pHmetrului.
4. Cnd indicaia pH-metrului ajunge la 6,8 titrarea se
stopeaz. n acelai pahar se adaug 10 cm3 de amestec formolic cu
ajutorul cilindrului gradat.
19
5. Biureta se aduce la zero cu baz (volumul de NaOH

care s-a consumat la titrarea soluiei analizate pn la pH ul 6,8 nu
se ia n calcul).
6. Coninutul paharului se titreaz cu baz pn la pH 9,1
Titrarea se repet de 3-4 ori. Diferena volumelor la titrare
nu trebuie s depeasc 0,1 cm3.
Pentru determinarea cantitii de azot aminic se ia n
considerare numai volumul (n cm3) de baz, care s-a consumat la
titrarea soluiei de lucru dup ce a fost adugat amestecul formolic.
1 cm3 de soluie 0,1n NaOH corespunde la 1,4 mg de azot
aminic.
Se calculeaz coninutul de azot aminic n mg/dm3 de
soluie analizat dup formul:
V 1,4 K 1000
,
N=
Vp
unde
Vvolumul NaOH n cm3;
Kcoeficientul de corecie al bazei;
Vpvolumul probei n cm3 ;
ntrebri de control
1. Descriei nsemntatea analizei i principiul metodei.

2. Scriei i explicai reaciile caracteristice gruparii
aminice.
3. Scriei i explicai nsemntatea reaciilor, caracteristice
pentru gruparea carboxilic.
4. Prezentai reaciile aminoacizilor cu ninhidrina.
5. Explicai prin reacii modul de formare a legturii
peptidice intre aminoacizi n diferite condiii termice.
6. Prezentai schema formrii aldehidelor din aminoacizi.
20
Lucrarea de laborator nr. 3.

Determinarea amoniacului dup metoda Conwei i Bairn
Importana analizei
n toate plantele, n materia prim i produsele alimentare se
conin n cantiti mari diferite substane azotoase. La ele se refer
proteinele, polipeptidele, aminoacizii, amidele, vitaminele grupei
B, ureea i amoniacul.
Pentru biosinteza compuilor cu azot plantele i
microorganismele pot folosi azotul anorganic. Omul i animalele n
cazul proceselor similare folosesc numai azot organic.
Azotul necesar plantelor se gsete n natur sub form
nitric sau amoniacal.
Azotul nitric (NO3-) din sol este direct asimilabil de ctre
plante. n celulele plantelor azotul nitric este redus la azotul nitros
(NO2-) i apoi la azot amoniacal (NH3 sau NH4+).
Azotul nitric din sol provine fie din ngrmintele chimice
administrate n sol, sau se formeaz prin oxidarea amoniacului de
ctre microorganisme specifice (nitrificatoare).
Azotul amoniacal este asimilat direct de ctre plante. n
organismul vegetal azotul amoniacal particip direct sau indirect
sub form de compui (sruri de amoniu ale acizilor organici,
amidele acizilor asparagic i glutamic) la biosinteza aminoacizilor.
Azotul amoniacal din sol provine din ngrminte chimice sau din
resturile substanelor organice n curs de degradare. Procesul se
numete amonificare. Azotul organic provenit din substanele
organice aflate n sol nu este direct asimilabil. Sub aciunea
bacteriilor de putrefacie, azotul organic este transformat n
procesul de amonificare n azot amoniacal asimilabil.
Azotul atmosferic nu este asimilabil pentru plante direct, dar
prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot, care triesc n
nodozitile de pe rdcinile leguminoaselor. Transformarea
azotului atmosferic n azot amoniacal este un proces de reducere
enzimatic.
21
Amoniacul n organismul vegetal se formeaz ca rezultat al

proceselor de dezaminare suferite de aminoacizi i de ali compui
cu azot i servete n primul rnd la biosinteza de noi aminoacizi i
compui cu azot. Excesul de amoniac, fiind toxic pentru celule este
fixat de plant sub form de sruri de amoniu ale acizilor organici,
amide ale aminoacizilor dicarboxilici i ca uree. Toi aceti
compui constituie rezervele de azot ale plantei.
Plantele bogate n acizi organici liberi, numite plante acide
(mcri, revent, begonia etc.) au capacitatea deosebit de a fixa
amoniacul sub form de sruri de amoniu (oxalat de amoniu, malat
de amoniu, citrat de amoniu, fumarat de amoniu etc.).
Cea mai important cale de detoxicare a amoniacului n
celulele plantelor este fixarea sub form de amide, ndeosebi ale
acizilor aspartic (asparagina) i glutamic (glutamina). Asparagina i
glutamina au fost identificate nu numai n plantele superioare, ci i
n ciuperci, drojdii, bacterii, precum i n organismele animale.
Formarea asparaginei i glutaminei este un proces care
decurge cu consum de ATP:
ATP
ADP
HOOC - CH - (CH2) - CO - O - P +
2
HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

NH2
+ NH3
acid glutamic
NH2
acid fosfoglutamic
(forma activa)
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4

NH2
glutamina
Amoniacul fixat sub form de amide (asparagin i

glutamin) nu este toxic, poate fi eliberat prin hidroliza enzimatic
pentru a fi utilizat n biosinteza compuilor cu azot sau n
meninerea echilibrului acido-bazic din plant:
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2
NH2
glutamina
+ H2O
- NH3
HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

NH2
22
acid glutamic
Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub form de uree

este un proces ntlnit n regnul animal i uneori n cel vegetal,
numit ciclul ureogenetic sau ornitinic.
Dup cum susin savanii V.I. Nilov i I. M. Scurihin
cantitile mari de amoniac duc la scderea calitii i anume
gustului vinului, sucului, compotului. De aceie determinarea
amoniacului are o nsemntate teoretic i practic.
Principiul metodei
Cnd la soluia analizat, care conine sruri de amoniu, se
adaug baz, se elimin amoniac, care cantitativ se reine cu soluie
de 0,02 n H2SO4 luat n exces. Titrnd cu hidroxid de sodiu
excesul de acid, care n-a reacionat cu amoniacul, se poate calcula
cantitatea de acid necesar pentru a neutraliza amoniacul.
Bazele puternice, odat cu descompunerea srurilor de
amoniu, parial hidrolizeaz i amidele, care se conin n obiectele
analizate:
R CO NH2 + KOH R COOK + NH3
Amoniacul format n acest caz poate falsifica rezultatele
analizei.
De aceea pentru a evita hidroliza amidelor, n loc de baz la
soluia analizat se dozeaz soluie saturat de K2CO3, care n
procesul hidrolizei formeaz un mediu bazic relativ slab.
Chimismul procesului:
K2CO3 + H2O = KHCO3 + KOH

NH4Cl + KOH = KCl + NH3 + H2O
2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
H2SO4 exces+ NaOH = Na2SO4 + H2O
23

4 ceti Conwei;
2 pipete Mor de 5 cm3 i o pipet gradat de 5 cm3;
4 baloane conice de 100 cm3;
soluie saturat de carbonat de potasiu (K2CO3);
soluie de 0,02 n H2SO4;
soluie de 0,02n NaOH;
indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot i
0,012 g metilen albastru se dizolv n 60 cm3 alcool i cu ap se
aduce pn la 100 cm3.
Se dozeaz 5 cm3 soluie 0,02n H2SO4 n camera intern (1)

a cetii Conwei (fig.1). n camera extern (2) se dozeaz 5 cm3
soluie analizat (vin, suc etc.). Ceaca Conwei se nchide aproape
la 9/10 cu o plac de sticl lefuit. Prin gaura deschis cu ajutorul
pipetei gradate se dozeaz n camera extern 3 cm3 soluie saturat
de K2CO3. Ceaca se nchide cu placa i prin cltinri atente,
uoare se amestec soluia analizat cu K2CO3. Se pune n
termostat i se ine 1 or la temperatura 50-55 oC.
Fig.1.Ceaca Conwei
Dup ce se scoate din termostat, ceaca Conwei se deschide
i soluia din camera intern se transfer cantitativ n balonul conic
de 100 cm3 cu ap distilat ( 10 cm3). Soluia se titreaz cu soluie
de 0,02n NaOH n prezena indicatorului mixt pn la schimbarea
culorii din violet n verde.
24
Experiena se repet n 2 ceti Conwei. Paralel se face proba

de control, unde n loc de soluie analizat se folosete ap distilat.
Cantitatea de azot amoniacal (mg/dm3) n soluia analizat
se calculeaz dup formula:
X=
(Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000
unde:
V control volumul soluiei de 0,02n NaOH, folosit la
titrarea probei de control, cm3;
V lucru - volumul soluiei de 0,02n NaOH, folosit la titrarea
probei de lucru, cm3;
K coeficientul de corecie al bazei;
0,28 cantitatea de azot n mg, care corespunde unui cm3
de soluie 0,02n NaOH;
V volumul probei analizate, cm3.
ntrebri de control:
1. Numii substanele azotoase din organisme vii.
2. Ce forme de azot pot utiliza plantele i animalele ?
3. Descriei transformrile azotului nitric n plante.
4. Cum se numete procesul oxidrii amoniacului pna la
nitrai ?
5. Dai definiia amonificrii.
6. Descriei asimilarea azotului atmosferic ?
7. Prin ce procese se produce amoniacul n organism ?
8. Cum se fixeaz excesul de amoniac n plante ?
9. Scriei reaciile formrii i descompunerii amidelor n
plante.
10. Descriei principiul metodei determinrii amoniacului.
11. Regulile tehnicii de securitate la determinarea
amoniacului.
25

Determinarea proteinelor n vin dup metoda Lowry
Unele din caracteristicile importante ale proteinelor snt:

capacitatea de a precipita din soluii i capacitatea de adsorbie.
Din soluii proteinele pot precipita reversibil sau ireversibil.
Precipitaia reversibil are loc cnd se adaug urmtoarele
reactive:
soluii concentrate de sruri neutri ale metalelor alcaline
(sulfat de amoniu, sulfat de natriu, clorur de natriu, etc.);
soluii apoase concentrate de alcool: metilic, etilic,
propilic;
soluii concentrate apoase de aceton.
n urma dozrii acestor substane, care concureaz cu
proteinele pentru ap, nveliul apos din jurul moleculelor de
protein ncepe s se descompun i moleculele sub influena
forelor de coeziune molecular formeaz agregate mari; soluia se
tulbur i apare un precipitat floculos, care se aeaz pe fundul
vasului. Precipitatul format la fundul vasului dispare cnd soluia
este diluat cu ap.
Alcoolul i acetona n soliii diluate formeaz precipitate
proteice reversibile, iar dac au o concentraie mare formeaz
precipitate ireversibile.
Srurile alcaline se comport diferit fa de proteine. n
soluii diluate mresc solubilitatea proteinelor, iar n soliii
concentrate determin precipitarea lor reversibil. Cauza
precipitrii proteinelor este hidratarea ionilor cu ap extras din
macromolecula proteic. Neavnd ap suficient proteinele
precipit, floculeaz, sau se coaguleaz.
Prin precipitarea ireversibil proteinele sufer modificri
fizico-chimice adnci i se produce denaturarea structurii lor
moleculare.
26
Precipitaia ireversibil are loc, cnd proteinele formeaz

precipitate insolubile, care nu se dizolv la nlturarea factorului
precipitant.
Denaturarea este modificarea structurii spaiale a
moleculei proteice ce duce la micorarea solubilitii, pierderea
activitii biologice. Denaturarea poate fi reversibil i ireversibil.
Denaturarea proteinelor are loc sub aciunea unor ageni
denaturani care pot fi de natur fizic sau chimic. Factorii fizici
snt: nclzirea, creterea presiunii, congelarea, radiaiile ionizante,
ultrasunetele etc. Agenii chimici: ureea, srurile metalelor grele
(mercur, argint, cupru, plumb, bismut, stibiu), solvenii organici,
acidul tricloracetic, compuii coloidali (acid wolframic, tanin), pH
mai mic de 4 i mai mare de 10, detergeni.
Denaturarea este foarte important n panificaie, prepararea
prafului de ou, lapte, conservare. Proteoliza proteinelor denaturate
este mai rapid, deci i asimilarea lor este mai rapid.
Alt proprietate caracteristic a proteinelor este capacitatea
de adsorbie pe argila de bentonit sau silicagel, rini sintetice,
gelatin, crbune. Fenomenul de adsorbie (reinere la suprafa)
are loc la suprafaa de contact dintre faza dispers i mediul
dispergent i const n fixarea substanelor (proteinelor) ce se
gsesc n soluie de ctre partuculele coloidale.
Adsorbia are un rol important n vinificaie i conservare.
Se aplic acest proces la limpezirea mustului nainte de fermentaie,
sucurilor i vinurilor.
Principiul metodei
Metoda Lowry este una din cele mai sensibile metode de
determinare a proteinelor. Este bazat pe dou reacii concomitente
- biuretic i Folin. Ultima este caracteristic pentru aminoacizii
triptofan, tirozina, cisteina, care reduc Reactivul Folin (amestec de
i
acizi
dodecawolframofosforic
H3PW12O40
dodecamolibdofosforic H3PMo12O40) pn la oxizi (W8O23,
Mo8O23) de culoare albastr. Din cauza formrii complecilor
moleculelor proteice cu cupru coloraia cu reactivul Folin devine
mult mai intens dect numai datorit aminoacizilor sus-numite.
27
Deoarece n reacie intr i ali aminoacizi, intensitatea culorii este

direct proporional cu cantitatea de proteine n soluia analizat i
se determin cu ajutorul fotoelectrocolorimetrului la lungimea de
und 650 nm.
centrifuga de laborator;
fotoelectrocolorimetru KFK-2;
acid tricloracetic de 80 %;
reactivul "A" conine 20 g de NaOH, 100g de
Na2CO3, 2g de sare Seignette, 0.5 g de CuSO4 x 5 H2O. Fiecare
component se dizolv aparte n ap distilat, se amestec n balon
cu cot de 1 dm3, volumul soluiei se aduce la cot;
reactivul "B"reactivul Folin diluat (la 0,5 cm3 de
reactiv Folin 1 n se adaug 4 cm3 ap distilat);
soluie 1 n de NaOH;
reactivul Folin100 g wolframat de sodiu i 25 g
molibdat de sodiu se dizolv n 700 cm3 ap, se adaug 50 cm3 acid
ortofosforic 85 % i 100 cm3 acid clorhidric concentrat, se dizolv
i se fierbe cu rcitor invers timp de 10 ore, apoi se adaug 150
grame sulfat de litiu, 50 cm3 ap distilat i 3-5 picturi de brom i
iari soluia se fierbe 15 minute fr rcitor sub nia de ventilare
pentru a nltura excesul de brom. Apoi soluia se rcete pna la
temperatura de camer i se aduce cu ap la volumul de 1 dm3, se
filtreaz i se pstreaz ntr-un balon ntunecat cu dop rodat.
nainte de a ncepe lucrarea soluia se dilueaz n aa fel, ca
s corespund acidului 1 n. Concentraia soluiei se controleaz
prin titrarea reactivului Folin diluat de 10 ori cu soluie 0,1 n
hidroxid de sodiu dup fenolftalein;
patru eprubete i cilindru de 5-10 cm3;
pipete de 1-2 cm3 i de 5 cm3;
baie de ap;
termometru.
28

ntr-o eprubet cu 10 cm3 de vin se dozeaz 1 cm3 acid
tricloracetic. Soluia se pune n frigorifer pe douzeci i patru ore.
Apoi soluia se centrifugheaz 1 or la 5000 ture/minut i se
decanteaz.
n eprubet cu precipitat se dozeaz 1 cm3 soluie 1n NaOH
i dup 30 minute se adaug 1 cm3 H2O. Din proba obinut, n alt
eprubet, se ia 1 cm3 soluie i se dozeaz 1 cm3 reactiv "A" i
dup 10 minute se adaug 4 cm3 reactiv "B".
Paralel cu proba de analiz se pregtete proba de
comparaie, constituit din: 1 cm3 H2O + 1 cm3 NaOH + 2 cm3
reactivul"A" + 8 cm3 reactivul "B".
Eprubetele cu probele de analiz i comparaie se plaseaz
n baia de ap la temperatura 55 oC pe 5 minute i dup rcire
rapid se msoar intensitatea culorii. Probele se colorimetreaz
folosind filtru de lumin 8 (rou) cu lungimea de und =650
nm, cuva cu lungimea 10 mm.
Coninutul proteinelor se calculeaz dup formula:
X = Do x 2 x 250 =Do x 50
V
unde:
X cantitatea de proteine n soluia analizat, mg/dm3;
Do densitatea optic a soluiei analizate;
2 volumul bazei i soluiei analizate, n cm3;
250 coeficient de recalculare;
V volumul vinului luat pentru analiz, n cm3.
ntrebri de control

2. Compoziia elementar i clasificarea proteinelor.
3. Proprietile caracteristice ale proteinelor.
4. Metodica determinrii proteinelor dup Louri.
5. Regulile tehnicii de securitate n procesul ndeplinirii
lucrrii.
29

Reaciile de culoare a proteinelor
S-a stabilit c proteinele datorit aminoacizilor formeaz

circa 30 reacii de culoare caracteristice. Cele mai importante snt:
biuretic, xantoproteic, Millon, Louri, Adamkiewics,
sulfhidrilic etc.
Snt i reacii incolore care se realizeaz prin hidroliza
proteinelor cu acizi, baze sau enzime. Prin hidroliza proteinelor
rezult produi mai simpli i n ultima faz aminoacizi.
Hidroliza acid este mai frecvent utilizat. n acest caz
soluia proteic se fierbe n fiole ermetic nchise 10-12 ore cu
soluie 10 % de acid clorhidric sau soluie 20 % de H2SO4.
Proteinele se descompun pn la aminoacizi, dar dispare complet
triptofanul.
Hidroliza alcalin se realizeaz cu hidroxizi alcalini timp
de 10-12 ore cu soluie 10 % de NaOH sau Ba(OH)2. Metoda are
avantajul c nu se distruge triptofanul, ns se descompun ali trei
aminoacizi: arginina, citrulina, histidina.
Din punct de vedere biologic mai importante snt procesele
de hidroliz enzimatic.
Hidroliza enzimatic se realizeaz prin intermediul
enzimelor la temperatura 20-40 oC i la pH ul aproape de neutru.
n acest caz nu se distruge nici un aminoacid. Hidroliza enzimatic
are loc n tubul digestiv al organismului animal, uman, n celula
vegetal a fructelor, legumelor, n struguri i vinuri. De exemplu, la
prelucrarea strugurilor hidroliza enzimatic are lor dup schema:
Proteine albumoze peptone polipeptide
oligopeptideaminoacizi.
lapte degresat sau soluie 0,5 g cazein n 100 cm3 baz de
1 %;
30
soluie de albu de ou, (albuul unui ou se separ de

glbenu, se amestec cu 0,5 dm3 ap distilat i se agit minuios);
soluie 1 % de gelatin;
soluie 1 % de CuSO4;
soluie 10 % de NaOH;
soluie 30 % de NaOH sau 20 % de NH4OH;
acid azotic concentrat de HNO3;
acid acetic glacial de CH3 COOH;
acid sulfuric concentrat de H2SO4;
reactivul Millon: la 40 g mercur se dozeaz sub nia de
ventilaie 50 cm3 acid azotic concentrat (=1,42), se las pe 30
minute la temperatura de camer, apoi se nclzete n baia de ap
pn mercurul se dizolv complet. Soluia obinut se dilueaz cu
dou volume de ap (aproximativ pn la 160 180 cm3 ), dup
depunere se decanteaz de sediment;
5 % soluie de Pb(CH3COO)2.
Reacia biuretic. Aceast reacie este caracteristic

pentru toate proteinele, polipeptidele care conin grupa peptidic
( CO NH ). Dar reacia biuretic se poate obine i cu o serie de
compui, care nu au nimic comun cu proteinele, de exemplu, cu
biuretul NH2-CO-NH-CO-NH2, sau oxamida NH2-CO-CO-NH2,
etc.
n urma tratrii soluiei de proteine cu soluie de baz
alcalin (NaOH) i ctorva picturi de soluie diluat de sulfat de
cupru (CuSO4), proteinele obin o culoare violet datorit faptului
c cuprul formeaz substane complexe cu grupele (-CO-NH-).
Chimismul reaciei:
CuSO4
Cu (OH)2 + Na2SO4
+ 2 NaOH
31
R
CH
CO
NH
NH
OC
...
CH
CH
CO
OH OH
...
NH
CH
NH
CO
HC
R2
R3
un sector din catena

polipeptidic
R
...
CH
C-OH
-2 H 2 O
HO HO
N
N
CH
R2
R1
CH
O
Cu
...
Cu
HO
CH
R3
R1
...
...
R1
HO
HC
R3
CH
C-OH
CH
R2
complex biuretic

n trei eprubete se administreaz: n prima 0,5 cm3 soluie
de cazein sau lapte degresat; n a doua 0,5 cm3 soluie albu de
ou; n a treia - 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se
dozeaz cte 0,5 cm3 soluie 10 % NaOH i cte 5 picturi soluie
1% CuSO4. Eprubetele se agit. Apare culoarea violet.
Se face concluzia despre natura chimic a substanelor
analizate.
Reacia xantoproteic. Aminoacizii aromatici la
fierbere cu HNO3 concentrat se supun nitrrii. Ca rezultat soluia
capt o culoare galben care trece n oranj la adugarea bazei.
Acidul azotic nitreaz nucleul benzenic al aminoacizilor
ciclici: tirozin, fenilalanin, formnd nitrocompui de culoare
galben. De exemplu, radicalul tirozinei din componena proteinei
n prezen HNO3 se transform n nitrotirozin galben, care n
mediul bazic d culoare oranj (forma chinoidic).
Chimismul reaciei:
32
...
HN
CH
...
...
CH2
HN
CH
...
...
CH
C0 ...
CH2
CH2
+ HO
HN
NO2
+ NH4+ + H2O
+ NH4OH
O
N
N
OH
Radicalul tirozinei
OH
Radicalul nitrotirozinei
Radicalul n forma
chinoidic

ou; n a treia 0,5 cm3 soluie gelatin. n fiecare eprubet se
dozeaz cte 5-6 picturi HNO3 concentrat i eprubetele se
nclzesc (orientndu-le n direcie opus de la sine sau de la
persoanele, care lucreaz n laborator). n urma fierberii, coninutul
eprubetelor se coloreaz n galben. Dup rcire n eprubete se
adaug 10 picturi soluie 30 % de NaOH (sau soluie 20 % de
NH4OH), culoarea soluiilor devine oranj. Se face concluzia despre
compoziia aminoacidic a proteinelor analizate
Reacia Millon. Reacia este caracteristic aminoacizilor
care au radicalul fenolic, de exemplu, tirozina. Reactivul Millon la
cald d cu tirozina o coloraie roie. Adic, la nclzirea proteinei
cu o soluie azotat mercuric i n prezena acidului azotic concentrat
cu puin acid azotos se formeaz un precipitat rou crmiziu,
datorit formrii nitrocompuilor tirozinei n forma chinoidic.
dozeaz cte 5-7 picturi reactiv Millon, eprubetele se nclzesc
atent, ndreptndu-le n direcie opus. Peste un timp se observ
apariia unei coloraii roietice i apariia precipitatului crmiziu.
33
Dup schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele n care

este prezent tirozina. Chimismul reaciei:
O
. .._
HN
CH
CH
C
2
+ 2 H O _- -_ N O
OH
...
+ H g 2( N O
)2
O
HN
CH
CH
O
...
...
CH
CH
= N
HN
...
O
O
_ _
_ _
_ _H
_ _
g _ _H g
O_ _ N =
N O
Reacia sulfhidrilic. La nclzirea soluiilor proteice

cu baze n prezena srurilor de Pb se formeaz culoarea neagrcafenie n urma reaciei cu aminoacidul cisteina:
CH2
SH
CH2 OH
+2NaOH
+Na2S +H2O
HOOC CH NH2
HOOC CH NH2
Cu plumb sulfura de sodiu formeaz un sediment PbS.
Na2S + (CH3COO)2Pb
PbS + 2 CH3COONa
Intensitatea culorii depinde de cantitatea cisteinei n
proteina i concentraia proteinei n soluie.
dozeaz cte 5 picturi de 30 % NaOH i 1 pictur de 5 %
Pb(CH3COO)2. La nclzirea ndelungat lichidul devine cafeniu i
se formeaz sedimentul negru de PbS.
Reacia Adamkiewics. Soluiile de triptofan sau
proteine, care conin resturi de triptofan fiind tratate cu acid
34
glioxilic (n form de impuriti n acidul acetic glacial) n prezena

acidului sulfuric concentrat formeaz la nivelul zonei de contact un
inel violaceu.
O
O
...
HN
CH C
...
...
HN
CH C
O
...
CH2
CH2
H
O
HN
+ H2SO4
- H2O
HN
CH C
...
HN
CH C ...
CH2
CH2
CH
HN
HN
CH
C
...
O
...
O HN
HO
HO
Intensitatea culorii depinde de cantitatea de triptofan.

Triptofanul n cantiti mai mici se gsete n lapte, carne, ou. n
cantiti mai mari se conine n icre negre i roii de pete.
dozeaz cte 5 cm3 acid acetic concentrat, puin se nclzete, apoi
atent (pe peretele eprubetei) se adaug 1 cm3 acid sulfuric
concentrat. Se noteaz n care eprubete la nivelul zonei de contact
dintre lichide apare inelul rou-violet, care se extinde treptat n
ambele pri. Dup intensitatea culorii se face concluzia despre
proteinele n care este prezent triptofanul.
ntrebri de control:

2. Caracteristica reaciei biuretice.
3. Caracteristica reaciei xantoproteice.
4. Caracteristica reaciei Millon.
5. Caracteristica reaciei Adamkiewics.
6. Descrierea metodelor de hidroliz a proteinelor.
35

Determinarea formei reduse a glutationului
(n levuri sau germenii cerealelor)
Glutationul este o tripeptid format din trei resturi de
aminoacizi: acidul glutamic, cistein, glicocolul (glicina):
HS
CH 2
NH 2 - CH - CH 2 - CH 2 - CO - NH - CH - CO - NH - CH 2 -COOH
COOH
Glutationul este foarte rspndit n natur, se conine n

aproape toate celulele vii n cantiti mici. n cantitate mare a fost
gsit n germenii grului pn la 0,45 % din masa uscat, n levurile
vechi, struguri. El prezint o substan solid, alb, solubil n ap
i alcool. Din soluia alcoolic cristalizeaz sub form de prisme.
Glutationul are 2 grupe carboxilice libere, deci are un
caracter pronunat acid (pH= 2,83).
Datorit gruprii sulfhidrilice (-SH) glutationul are
proprieti reductoare puternice. Poate fi n dou forme: redus (G
- SH) i oxidat ( G-S-S-G). Aceste forme trec uor una n alta
dup urmtoarea reacie:
G - SH + HS - G
-2 H+
+ 2 H+
G -S-S-G
Transformrile de oxidare i reducere snt reversibile i n

organismele vii snt catalizate de enzime specifice, anume de
glutationreductaz n prezena acidului dehidroascorbic (acceptor
de hidrogen).
Multe enzime proteolitice de natur vegetal, care au n
centrul activ gruparea SH (enzime tiolice) snt activate de
glutationul redus. Ca rezultat se hidrolizeaz proteinele de rezerv
(gluten) din fin i aluatului se las, nu ine volumul. Aciunea de
activare a glutationului se datoreaz faptului, c el este un
reductor puternic i se oxideaz uor.
36
Forma redus de glutation se acumuleaz n cantiti mai

mari la ncolirea cerealelor i n procesul de nvechire a levurilor,
i deci este un factor, care diminueaz puternic calitatea acestor
produse vegetale. De exemplu, la a patra zi de germinare cantitatea
de glutation redus n orz crete de 2,5 ori.
n panificaie pentru a preveni distrugerea glutenului,
glutationul redus se oxideaz cu acidul dehidroascorbic (vitamina
C oxidat).
Glutationul redus protejeaz oxidarea acidului ascorbic i al
adrenalinei.
Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe oxidarea gruprii SH a glutationului

redus cu iod. Pentru a primi soluii stabile de iod se folosete KIO3
i titrarea se petrece n prezen de KI n mediul acid:
KIO3 + 5 KI + 2 H3PO4
2 K3PO4 + 3 H2O + 3 I2
Iodul oxideaz glutationul redus conform ecuaiei:
2G-SH + I2
G-S-S-G
+ 2HI
Titrarea se termin cnd apare culoarea albastr a

amidonului, ce indic prezena iodului i dispariia glutationului n
forma redus.
materie prim pentru analiz: levuri de panificaie sau de
vin, germeni de cereale, crupe, cereale.
soluie de 5 % acid meta-fosforic;
soluie de 1,5 % KI (se pregtete nainte de determinare);
soluie de 1 % amidon cu adaos de NaCl;
soluie de 0,001 n KIO3 (potasiu iodat);
mojar cu pistil;
balon cotat de 50 cm3;
baloane conice de 100 cm3;
microbiuret sau biureta de 10 cm3;
37
pipete: 1, 5, 10 cm3;
plnie de sticl;
hrtie de filtru pliat.
Proba produsului analizat (2 g) se transfer n mojar i se
mrunete cu pistilul cu nisip de cuar n prezena a 5 cm3 soluie
de 5 % acid meta-fosforic. Apoi, masa mrunit cantitativ se
transfer n balonul cotat de 50 cm3, se aduce pn la cot cu ap
distilat. Dup 5 min de macerare coninutul balonului se agit 2-3
min i se filtreaz prin hrtie de filtru pliat.
Pentru determinarea coninutului de glutation n balonul
conic de 100 cm3 se administreaz 5 cm3 de filtrat, 1 cm3 soluie de
1,5 % KI i 5 picturi de soluie de 1% amidon dup care se titreaz
din microbiuret cu soluie de 0,001 n KIO3 pn la apariia culorii
albastre.
Coninutul glutationului se exprim n mg-% la masa
uscat a materialului analizat dup formula :
A*0,307*C*100*1000
, mg -%,
X=
P*b*1000
unde:
X cantitatea glutationului n mg-%;
0,307 coeficientul de recalculare a glutationului, care
arat c 1cm3 soluia de 0,001 n KIO3 este echivalent cu 0,307 mg
de glutation redus;
P masa levurilor, grame;
C volumul finit al suspensiei de levuri, cm3;
A cantitatea de soluie de 0,001 n KIO3, care a fost
folosit la titrare, cm3;
b volumul filtratului luat la titrare;
100 recalcularea la 100 g de produs;
1000 recalcularea g n mg.
ntrebri de control
1. Descriei structura glutationului i proprietile lui.
2. Pe ce se bazeaz principiul metodei de determinare a
formei reduse a glutationului ?
38
3. Ce mportan practic are analiza glutationului redus ?

4. Ce enzime snt activate de glutationul redus, care este
mecanismul acestei activri ?
39

Determinarea activitii invertazei n vinuri, sucuri
Enzimele snt catalizatori biologici specifici de natur
proteic, care se sintetizeaz n celulele organismelor vegetale i
animale. Datorit enzimelor toate organismele vii pot realiza un
numr enorm de diverse procese chimice legate de metabolismul
substanelor.
Enzimele se mpart n dou grupe: enzime
monocomponente (proteine), care snt constituite din aminoacizi i
enzime bicomponente (proteide), constituite dintr-o component
proteic (apoenzim) i o molecul de natur neproteic (cofactor).
Deseori cofactorul prezint derivaii vitaminelor hidrosolubile.
Din enzimele monocomponente fac parte multe hidrolazele,
iar din enzimele bicomponente --oxidoreductazele, transferazele,
liazele, izomerazele i ligazele.
Cnd gruparea prostetic se leag de apoenzim prin legturi
slabe, uor disociabile, atunci cofactorul se numete coenzim.
n cazul cnd gruparea prostetic se leag de apoenzim prin
legturi covalente, nedisociabile, atunci cofactorul se numete
gruparea prostetic.
Substana asupra creia acioneaz enzima se numete
substrat. n cele mai multe cazuri legtura dintre substrat i enzim
se face prin intermediul centrelor active(regiunea enzimei, care
direct realizeaz cataliza).
Uniti de msur ale activitii enzimelor.
Activitatea enzimelor se determin prin: msurarea gradului
de transformare a substratului, msurarea concentraiei produsului
de reacie sau msurare a cineticii de reacii, urmrite ntr-un
anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate.
Activitatea enzimelor se exprim cantitativ n unitile
propuse de Comisia de Enzime (CE) i anume:
40
Unitatea de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea

de enzim care catalizeaz transformarea a 1mol substrat /min., n
condiii standard (t 0 = 25 0C, pH i concentraie de substrat
optime). Aceast unitate de msur este recomandat de CE din
1961 i folosit pn n prezent. Dar CE recomand trecerea la
unitatea Katal.
Katalul (Kat) reprezint cantitatea de enzim care
catalizeaz transformarea a 1 mol substrat secund n condiii
standard.
n practic se folosete microkatalul (Kat = 106Kat),
nanokatalul (nKat =109 Kat), picokatalul (pKat=1012 Kat).
Pentru enzimele solide (praf) se folosete activitatea
specific reprezint numrul de uniti enzimatice /mg protein
(respectiv Kat/mg protein i Kat/kg protein), sau reprezint
numrul de Katali care corespund la 1 kg de enzim.
Pentru enzime n stare cristalin cu masa molecular
cunoscut se folosete activitatea enzimatic molar (numr de
transfer) reprezint numrul de molecule de substrat transformate
de ctre o molecul de enzim timp de 1 min sau 1s (Kat/mol
enzim), sau reprezint numrul de katali care revin unui mol de
enzim.
Metodele principale de separare i purificare a enzimelor.
Enzimele se conin n stare dizolvat n plasma tuturor
esuturilor vegetale, animale i a microorganismelor (bacterii,
drojdii, mucegaiuri).
Prelucrarea materiei prime de origine vegetal, animal sau
microbian este n linii generale aceia-i: omogenizare, extracie,
concentrare, fracionare i uscare. Preparatele enzimatice parial
purificate pot fi n form lichid, semilichid sau uscat.
Enzimele din esuturi se extrag uor cu ajutorul apei,
soluiilor de sruri, acizi i baze slabe. Un dizolvant bun pentru
majoritatea enzimelor l constituie soluia apoas de glicerol.
Dac enzimele snt strns legate cu elementele structurale
ale celulei, atunci pentru distrugerea esuturilor se folosesc: nisipul
41
de cuar sau sticl, dezintegrarea prin macerare, autoliza i n

aparate speciale omogenizatoare etc.
Impuritile (molecule cu masa molecular mic) din
soluiile obinute se nltur prin dializ, electrodializ,
precipitarea enzimelor cu alcool, aceton, sruri.
Dup extracie soluiile enzimatice se purific i se
concentreaz prin metodele de cromatografie i electroforez.
Rolul invertazei
n natur snt mult rspndite enzimele care catalizeaz

hidroliza legturilor glicozidice din glicozide, oligoglucide i
poliglucide. Aceste enzime au denumirea general de
carbohidraze.
Se disting enzime care hidrolizeaz numai poliglucidele
(poliazele) i enzime care hidrolizeaz oligoglucidele (glicozidaze).
Enzima -fructofuranozidaza se refer la carbohidraze
(glicozidaze). Aceast enzim catalizeaz inversia sau hidroliza
zaharozei i de aceea se numete invertaza sau zaharaz.
Invertaza acioneaz asupra legturii -fructo-furanozidice
din moleculele zaharozei, rafinozei etc., i desprinde de la ele restul
de -D-fructofuranoz.
Zaharoza este o dizaharid din cele mai rspndite dintre
oligozaharide. Se gsete aproape n toate plantele, n cantiti mai
mari se gsete n sucul florilor alturi de monozaharide, apoi n
sfecl, n trestia de zahr i n cocenii tineri de porumb.
Sub influena acizilor sau a invertazei zaharoza se
hidrolizeaz formnd un amestec de monoglucide (D-glucoza i Dfructoza):
42
CH2OH
H
OH
H
OH
CH2OH
H
H
OH
CH2OH
O
H
OH
OH
Aciunea invertazei
Zaharoza (sustratul invertazei) are proprieti optic active,

este dextrogir (rotaia specific + 66,5o). Dup hidroliz soluia
rezultat devine levogir []D20 = -20o, deoarece fructoza este
pronunat levogir []D20= -93o n comparaie cu glucoza care este
dextrogir []D20 = +52,5o. Aceast hidroliz se numete inversie
sau invertire, inversiune, iar amestecul echimolar de glucoz i
fructoz are denumirea de zahr invertit (mierea de albine).
Invertaza e mult rspndit n plante, n drojdii, ciuperci i
bacterii, n struguri, suc i vin. mpreun cu enzima maltaza (care
se conine n drojdia de bere) invertaza are o mare nsemntate
pentru industria alimentar. Aceste enzime se folosesc n industria
panificaiei i fermentaiei: ele catalizeaz hidroliza zaharozei i
maltozei i prin aceasta pregtesc materia prim de fermentaie.
Invertaza este foarte rezistent la aciunea SO2, este sensibil la
etanol i activitatea ei variaz foarte mult cu temperatura. Tratarea
mustului i vinului cu bentonita (fixeaz proteinele) diminueaz
activitatea invertazei. La prelucrarea strugurilor numai o treime din
invertaz trece n must, cea mai mare parte rmne fixat pe
componentele solide ale botinei i n burb. Strugurii au potenial
invertazic ridicat: 1 cm3 must nedeburbat cu pH 3,5 la temperatura
30 oC are n mediu 200 uniti. Datorit potenialului invertazic
ridicat al mustului zaharoza adugat n el (aptalizarea) este
complect hidrolizat n cteva ore.
Drojdiile cu o activitate mic de inversie nu pot fi utilizate
n industria panificaiei i fermentaiei. De aceea studierea
activitii acestor enzime are o nsemntate practic.
43
Principiul metodei
Activitatea invertazei se determin dup cantitatea de zahr
invertit care s-a format la hidroliza unei anumite cantiti de
zaharoz sub aciunea invertazei la to = 25 oC timp de 24 ore.
Cantitatea de zahr invertit se determin dup metoda Bertrand.
4 baloane conice 100 cm3;
4 baloane cotate 100 i 200 cm3 ;
4 cilindre de 50 cm3;
plnie ott nr.3;
2 baloane Bunzen de 500 cm3;
pipete 5 i 10 cm3;
soluie de zaharoz 10 %;
soluie-tampon acetic cu pH = 4,7 (la 50 cm3 soluie 1N
de NaOH se adaug 96,8 cm3 soluie 1 N de CH3 COOH i volumul
amestecului se aduce cu ap distilat pn la cota 500 cm3). n
soluia tampon acetic se adaug 1-2 cm3 toluol pentru reducerea
creterii microorganismelor n probele de materie prim (vin, suc);
reactivul Fehling I: se dizolv 40 g CuSO4 x 5 H2O ntr-un
dm3ap de distilat;
reactivul Fehling II: se dizolv ntr-un dm3 ap de distilat
200g sare de Seignette (tatrat dublu de sodiu i potasiu) i 150 g de
NaOH;
soluie feric amoniacal (86g sulfat feric amoniacal se
dizolv n 500 cm3 ap, la soluie se adaug 108 cm3 acid sulfuric
concentrat cu densitatea 1,84 i volumul amestecului se aduce cu
ap distilat pn la un dm3). nainte de ntrebuinare soluia feric
amoniacal se oxideaz cu cteva picturi de 0,1N KMnO4 pn la
culoarea slab roz;
soluie 0,05N KMnO4, care se pstreaz n sticle brune la
ntuneric;
probe de materie prim (vin, suc).
44

Pregtirea probelor pentru inversia zaharozei
Probe de 10 cm3 vin sau suc se dozeaz n dou baloane
conice de 100 cm3. Coninutul primului balon (proba de control) se
fierbe timp de 3 minute pentru inactivarea enzimei. Apoi n ambele
baloane se dozeaz cte 5 cm3 soluie 10 % zaharoz, 10 cm3
soluie-tampon acetic cu toluol. Baloanele se nchid strns cu
dopuri i se las pentru 24 ore la temperatura 25 oC n termostat.
Dup expirarea termenului proba de lucru (cu excepia probei de
control) se fierbe 3 minute pentru inactivarea enzimei.
Diluarea probelor
Coninutul ambelor baloane se transfer cantitativ n dou
baloane cu cot de 200 cm3 i se aduc cu ap distilat pn la cot,
se amestec minuios. Din fiecare balon se iau cu pipeta probe de
10 cm3, care se transfer n baloane conice de 100 cm3 i se
determin n ele zahrul rezidual dup metoda Bertrand.
Pentru aceasta la fiecare prob se adaug cu cilindru cte 10
3
cm soluie Fehling I i II. Probele se nclzesc i se fierb 3 minute.
La nclzirea soluie Fehling I i II cu zahrul invertit (zaharuri
reductoare) se depune Cu2O (protoxid de cupru) rou crmiziu
i au loc urmtoarele reacii:
CuSO4 + 2 NaOH Cu(OH)2 + Na2SO4
COOK
CHOH
CHOH
COOK
+
CHO
Cu (OH)2
CHO
COONa
COONa
complex cuprotartric
45
Cu +
2 H2O
CH= O
HCOH
HOCH
COOH
COOK
+ 2
HCOH
HCOH
CHO
CHO
COOK
HCOH
HCOH
HOCH + Cu2O
Cu + 2 H2O
+2
HCOH
HCOH
COONa
COONa
HCOH
CH2OH
CH2OH
Deoarece reactivul Fehling II este un reactiv alcalin, n

prezena lui fructoza se poate transforma ntr-o aldoz (glucoz sau
manoz), care reacioneaz cu soluia Fehling:
H
CH 2 OH
C OH
CH= O
C=O
C OH
CH(OH)
HOCH
HOCH
HOCH
HCOH
HCOH
HCOH
HCOH
HCOH
HCOH
CH 2 OH
CH 2 OH
CH 2 OH
Fructoza
Forma enolic
Aldoza
Pentru determinarea cantitii Cu2O trebuie de ndeplinit
urmtoarele procese.
Coninutul primei probe (de control) dup rcire pn la 50
o
60 C se transfer n plnia ott, (care are un strat de 0,5 cm de
asbest celuloz), unit cu balonul Bunzen. Balonul Bunzen se
unete cu pompa de ap. Soluia se filtreaz prin plnia ott i se
spal de 5-6 ori cu ap fierbinte distilat pn cnd soluia devine
incolor.
Precipitatul de Cu2O din plnia ott i din balonul conic
(unde a fost proba) tot timpul trebuie s fie meninut sub un strat
de ap pentru a nu permite oxidarea Cu2O n contact cu aerul.
46
Imediat dup ultima splare n vasul conic (unde a fost

proba) se adaug 10 cm3 soluie feric amoniacal (cu cilindrul)
pentru dizolvarea sedimentului de Cu2O i se agit pn cnd
dispare precipitatul rou crmiziu de pe pereii balonului conic.
ntre timp plnia ott se monteaz pe un alt balon Bunzen curat, iar
pompa de ap se deconecteaz.
Soluia feric - amoniacal din balonul conic se toarn peste
precipitatul din plnia ott i se amestec cu o baghet de sticl
pn la dizolvarea complet a precipitatului de Cu2O. Apoi balonul
Bunzen se unete cu pompa de ap i amestecul obinut se filtreaz.
Balonul conic (unde a fost soluia feric - amoniacal) se spal de
5-6 ori cu ap distilat fierbinte i se filtreaz prin plnia ott pn
cnd picturile de filtrat din balonul Bunzen au reacie neutr
(dispare reacia acid a soluiei, pH se determin prin intermediul
indicatorului universal de hrtie). Are loc reacia de dizolvare a
sedimentului de Cu2O n soluia de sulfat feric Fe2(SO)3:
Cu2O + Fe2(SO4)3 +H2SO42CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O
Sulfatul feros format (FeSO4) se titreaz cu KMnO4 :
10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 5 Fe2(SO4)3 +
+2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O.
Filtratul limpede cu nuane verzui se titreaz cu soluie 0,05
n de KMnO4 direct n balonul Bunzen pn cnd soluia se coloreaz
n roz i la o pictur n exces de KMnO4 coloraia persist un
minut. Volumul soluiei 0,05N KMnO4 consumat la titrarea probei
se fixeaz.
Analogic se trateaz i se filtreaz proba de lucru.
Pentru a obine rezultate comparabile este necesar n
probele diluate de vin de repetat determinarea zahrului prin
metoda Bertran de 2-3 ori (n proba de lucru i control). n
corespundere cu reaciile scrise mai sus 1 cm3 soluie 0,05 n
permanganat de potasiu echivaleaz cu 3,18 mg cupru. Cantitatea
de zahr invertit n mg se determin dup tabelul Bertrand (tab.1),
care indic ce cantitate de zahr invertit corespunde la anumite
cantiti de cupru.
47
Tabelul 1. Calculul coninutului de zahr invertit n mg dup
Bertrand.
Zahr
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Cu
20,6
22,6
24,6
26,5
28,50
30,50
32.5
34.5
36.4
38.4
40.4
42.3
44.2
46.1
48.0
49.8
51.7
53.6
55.5
57.4
59.3
61.1
63.0
Zahr
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
Cu
64.8
66.7
68.5
70.3
72.2
74.0
75.9
77.7
79.5
81.2
83.0
84.8
86.5
88.3
90.1
91.9
93.6
95.4
97.1
98.8
100.6
102.3
104.0
Zahr
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
48
Cu
Zahr
Cu
105.7
79
143.7
107.4
109.2
110.9
112.6
114.3
115.9
117.6
119.2
120.9
122.6
124.2
125.9
127.5
129.2
130.8
132.4
134.0
135.6
137.2
138.9
140.5
142.1
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
145.3
146.9
148.5
150.0
151.6
153.2
154.8
156.4
157.9
159.5
161.1
162.6
164.2
165.7
167.3
168.8
170.3
171.9
173.4
175.0
176.5
Calculul activitii enzimei invertaza

Activitatea invertazei sau zaharazei (Az) se exprim n
uniti de activitate enzimatic ntr-un dm3 vin sau suc.
Pentru aceasta cantitatea de zahr invertit gsit dup
tabelul Bertrand (Z) se recalculeaz la coninutul lui n volumul
balonului cu cot (200 cm3) i se nmulete cu 0,95 (coeficientul
de recalculare a zahrului invertit n zaharoz), i se determin
cantitatea zaharozei (mg), care s-a supus hidrolizei. Activitatea
invertazei se determin dup formula:
As =
P 1000 1000
342 t v
unde:
P masa de zaharoz care a fost hidrolizat [mg];
P = Plucru-Pcontrol = (Zlucru Zcontrol) x 0,95 x 20
342 masa molecular a zaharozei;
t durata inversiei [min];
v volumul de vin [cm3].
1000 - transformarea mg n micrograme ;
1000 - recalcularea la 1 dm3.
ntrebri de control:
1. Numii unitile de msur ale enzimelor.

2. Descriei structura i proprietile chimice ale zaharozei
i zahrului invertit.
3. Descriei metodele de separare i purificare a enzimelor.
4. Descriei enzima invertaza.
5. Metoda determinrii invertazei.
49

Determinarea activitii enzimei polifenoloxidaza
Pn n prezent au fost studiate mai mult de 3000 enzime
diferite.
Enzimele se clasific dup tipul reaciilor pe care le
catalizeaz i dup substraturile asupra crora acioneaz.
Denumirea enzimelor este alctuit din trei pri. Prima
parte indic denumirea substratului asupra cruia acioneaz
enzima, a doua parte indic natura reaciei catalizate i a treia parte
sufixul
aza.
De
exemplu,
polifenoloxidaza,
piruvatdecarboxilaza, etc. Se deosebesc numai enzimele din clasa 3
hidrolazele, care snt formate din denumirea substratului unit cu
sufixul aza. De exemplu amilaza, zaharaza, ureaza. Odat cu
denumirile raionale se pstreaz i denumiri mai vechi: pepsina,
tripsina, papaina, etc.
Dup tipul reaciei catalizate enzimele se clasific n
urmtoarele 6 clase:
1. Oxidoreductazele sau enzimele, care catalizeaz reaciile
de oxidoreducere (cu transfer de hidrogen sau de electroni sau prin
combinarea unui substrat cu oxigenul molecular).
2. Transferazele snt enzimele, care catalizeaz reacii de
transfer ale unor atomi sau grupri de atomi (-NH2, - CH3, CH2OH, - O-PO3-H2 etc.) de pe un substrat donator pe un alt
substrat acceptor.
3. Hidrolazele snt enzime, care catalizeaz scindarea
hidrolitic a legturilor esterice, glicozidice, peptidice, amidice etc.
dup urmtorul mecanism:
R1 R2 + HOH R1 OH + R2 - H
4. Liazele catalizeaz reaciile de scindare nehidrolitic a
legturilor chimice. Se elimin molecule de CO2, H2O, NH3 etc. i
des se formeaz legturi duble. Liazele Catalizeaz i reaciile
inverse.
5. Izomerazele snt enzimele care catalizeaz diverse reacii
de izomerizare sau de rearanjri intramoleculare.
50
6. Ligazele sau sintetazele snt enzime care catalizeaz

reaciile de formare a legturilor chimice ntre dou molecule cu
ajutorul energiei cedate de substanele macroergice (ATP, GTP,
etc.)
Fiecare enzim are codul de patru cifre, stabilit de Comisia
de Enzimologie a Uniunii Internaionale de Biochimie (1961).
Prima cifr indic clasa la care aparine enzima. ase clase
de enzime se formeaz n funcie de tipul general al reaciilor
catalizate. A doua cifr indic subclasa, referitor la natura chimic
a gruprilor la substrat, a treia cifr reflect o subdiviziune din
aceeai subclas, iar a patra enzima concret (numrul de ordine
al enzimei respective n subdiviziunea din interiorul subclasei).
De exemplu, enzima dehidrogenaza alcoolului (codul
1.1.1.1) este o oxidoreductaz (clasa 1), acioneaz asupra grupei
CHOH a donatorului de hidrogen (subclasa 1), piridinnucleotidele
(NAD+ i NADP+) servesc ca acceptor de hidrogen (subsubclasa 1)
i enzima este prima (a patra cifr-1) din aceast ultim diviziune.
Importana analizei
Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscut i sub
denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent,
oxigen oxidoreductaza enzima din grupa oxidazelor clasei
oxidoreductazelor, care transport electronii direct la oxigen.
Polifenoloxidaza este rspndit n plante, gsindu-se n cantitate
mai mare n special n ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai
i de tutun, boabe de cafea i n diferite fructe: mere, piersici,
caise, banane, n struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o mas
molecular de 34000, reprezint o protein, ce conine cupru (0,26
%). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor n difenoli
(activitatea crezolic) i a o-difenolilor n o-chinone (activitatea
catecholazic):
51
__
Activitatea catecolazica
__
R
+ 1/2 O2
Activitatea crezolica
__
R
+ 1/2 O
OH
OH
monofenol
OH
o-difenol
O
chinona
PFO oxideaz substanele tanante (taninurile). Prin aciunea

ei se explic brunificarea legumelor i fructelor la uscare.
PFO are un rol important la respiraia plantelor. Dup teoria
lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinon are un rol nsemnat n
calitate de verig intermediar la oxidarea diferitelor substane
organice n procesul respiraiei plantelor.
Participarea PFO n acest proces poate fi redat prin schema
urmtoare:
Compus redus
o-chinona
R
H2O
O
O
OH
OH
Compus oxidat
+ 1/2 O2
o-difenol
Aadar o cantitate mic de polifenol i chinon respectiv

poate de multe ori s fie supus variabil oxidrii i reducerii.
Sistema PFO, polifenolilor i chinonilor respectivi, poate
oxida acidul ascorbic n materia prim alimentar. Aceast situaie
se ia n considerare la prelucrarea fructelor, legumelor i
strugurilor, care conin acid ascorbic.
Materia prim vegetal (fructe proaspete tiate, legume i
struguri) n contact cu oxigenul din aer se mbruneaz din cauza
52
polimerizrii oxidative a chinonelor formate din mono- i difenoli.

Pentru inactivarea PFO i prevenirea formrii chinonelor se
folosete tratamentul termic (de exemplu, blanarea fructelor) sau
chimic cu SO2 sau cu K2S2O5 etc.
Principiul metodei
Metoda determinrii polifenoloxidazei se bazeaz pe
proprietatea ei de a oxida pirocatehina n orto-chinon. Ortochinona oxideaz acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rmas n
mediu de reacie se determin cantitativ prin metoda de titrare cu
0,02 n soluie de iod.
o-chinona
H2O
Acidul ascorbic
O
O
Acidul dehidroascorbic
OH
OH
+ 1/2 O2
pirocatehina
Prin
aceast
metod
se
determin
activitatea
polifenoloxidazei numai n primele 2 minute de aciune asupra
substratului.
patru baloane conice de 100 cm3;

mojar cu pistil;
plnie din sticl;
balon cotat de 50 cm3;
pipete Mor 5 cm3, 10 cm3;
patru pipete gradate 2 i 5 cm3;
53
soluie de substrat: se dizolv 100 mg acid ascorbic n 100

cm3 ap distilat;
soluie 0,02 n pirocatechin, (2,2 g n 1 dm3);
soluie 10 % acid fosforic (orto sau meta) ;
soluie 0,02 n soluie de iod;
soluie 1 % amidon;
amestec tampon (aparte se dizolv 11, 867 g de Na2HPO4
x 2 H2O ntr-un dm3 ap distilat i 9,078 g de KH2PO4 ntr-un dm3
ap distilat) Amestecnd volume egale de soluie obinem
amestecul tampon cu pH-6,8) ;
materie vegetal (mere, cartofi, struguri);
cntar tehnic.
Pentru a obine extractul de enzime din materia prim

vegetal de cntrit 5 g de produs cu balana tehnic (precizia de
0,01 g). De transferat proba n mojarul de porelan i de mrunit cu
pistilul. Extracia enzimelor se efectueaz cu cantiti mici de ap
distilat. Coninutul mojarului se transfer cantitativ ntr-o plnie cu
filtru din materie instalat ntr-un balon cotat de 50 cm3. Coninutul
balonului se aduce pn la cota 50 cm3 cu ap i se agit.
n patru baloane conice se dozeaz cte 5 cm3 de filtrat i
cte 10 cm3 de H2O. Dou baloane se nclzesc pn la fierbere i se
fierb 2 minute pentru inactivarea enzimei (probele de control), apoi
se rcesc. Probele (de control i lucru) se aduc la temperatura 25oC.
n fiecare balon se adaug cte 5 cm3 soluie-tampon (cu pH-ul 6,8),
cte 2 cm3 soluie pirocatehin, cte 5 cm3 soluie acid ascorbic i
baloanele se omogenizeaz timp de 2 minute. n fiecare balon se
adaug cte 1 cm3 soluie 10 % acid fosforic i se titreaz cu 0,02 n
soluie de iod n prezena 1 cm3 soluie 1 % amidon. Se noteaz
volumul de iod consumat la titrare.
Deoarece 1 cm3 soluie de 0,02 n iod este echivalent la
1,76 mg sau 10 mol de acid ascorbic, activitatea PFO ce
54
corespunde unui gram de produs, exprimat n uniti de

activitatea enzimatic se calculeaz dup formula:
(Vc-Vl) x 10 x 10
APFO =
= (Vc-Vl) x 10
5x2
,
unde:
Vc volumul soluiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluie de control;
Vl volumul soluiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluie de lucru;
10 numrul de mol de acid ascorbic;
10 gradul de diluare a probei;
5 volumul filtratului, cm3 ;
2 - durata aciunii enzimei, minute.
ntrebri de control:
1. Nomenclatura i clasificarea enzimelor.

2. Caracteristica enzimei PFO.
3. Este posibil oxidarea acidului ascorbic cu PFO n lipsa
polifenolilor?
4. Pe ce se bazeaz metoda determinrii activitii PFO?
5. Chimismul determinrii activitii PFO.
55

Determinarea activitii enzimei lacaza
Lacaza (oxigenreductaza E.C. 1.10.3.1.) este o enzim de
origine fungic secretat de mucegaiul Botrytis cinerea, care n
unele condiii infecteaz struguri. Lacaza ca i polifenoloxidaza
este o cuproproteid dar are un spectru de aciune mult mai larg,
oxidnd orto- i para-difenolii, antociane i acidul ascorbic din must
i vin. Oxidarea direct a antocianelor este cauza principal a
degradrii rapide a culorii vinurilor roii (casarea oxidazic).
Tratarea mustului i vinului cu bentonit i SO2 puin reduce
activitatea lacazei.
Determinarea lacazei n bobie, struguri i vinuri,
cunoaterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestei enzime
(temperatura optim, pH-ul optim, constantele, inhibitorii, etc.)
permit de a aciona asupra proceselor de vinificaie. Lacaza
denatureaz n 10 minute prin nclzirea mustului, vinului la
temperatura 45 oC. Temperatura de 75 oC inactiveaz lacaza
complet.
Metodele de determinare a lacazei
Snt utilizate dou tipuri de metode:

metode colorimetrice, utiliznd substraturi sensibile, care
formeaz dup oxidare compui colorai, determinai prin
spectrofotometrie;
metode polarografice, utiliznd electrozi specifici de
oxigen pentru determinarea cantitativ a oxigenului consumat din
mediu pe parcursul oxidrii unui substrat specific de ctre enzim.
56
Determinarea colorimetric a activitii lacazei

Principiul metodei
Siringaldazina (4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehid azin)

este substratul specific utilizat care prezint o form redus
fenolic, incolor sau pn la galben pal, care dup oxidare cu O2
formeaz o chinon, care se condenseaz formnd un compus
colorat rou violet, apariia crui-a poate fi urmrit la
spectrofotometru la =530 nm (coeficientul de extincie molar =
65000). Chimismul reaciei:
H3COHO-
- OCH3
- HC=N - N=CH -
H3CO -
-OH
-2H+,-2e-
- OCH3
Forma redusa fenolica (incolora pina la galben pal)
- OCH3
H3COO=
=HC-N=N-CH=
H3CO-
=O
- OCH3
Forma oxidata chinonica (rosu-violet)
Exprimarea rezultatelor
O unitate de activitate a lacazei corespunde cantitii

enzimei care catalizeaz
oxidarea unui nanomol (10-9) de
siringaldazina n minut n condiiile de reacie (temperatura 20 oC,
pH=5, 1cm3 prob prealabil diluat pentru 3 cm3 de amestec
reactiv, =530 nm; cuva = 1 cm, = 65000).
57
Not: metodele colorimetrice necesit de a lucra cu soluii

destul de limpezi i incolore la start. Ele pot fi rezervate pentru
lucrul n soluii pure (pentru determinarea pH-lui optim, Km i
Vm) sau n cazul mustului din struguri, pentru determinri n must
decolorat.
Determinarea activitii lacazei n soluii pure

Determinrile pH-ului optim i constantelor cinetice (Km i
Vm) necesit utilizarea unei enzime deja purificate.
Deci, studiul pH-ului optim va fi efectuat cu Lacaza din
Pyricularia oryz (disponibil n comer) i nu din Botrytis
cinerea.
PH-ul optim:
Msurrile snt efectuate la 20 o C (temperatur ambiant)
ntr-o soluie apoas de lacaz pur (EC.1.10.3.2.), determinrile la
=650 nm.
ntr-o cuv de sticl (1 cm3) curat i uscat se introduc
succesiv:
1,4 cm3 soluie-tampon citrat - fosfat 0,1 M;
0,6 cm3 soluie siringaldazin de 60 mg/l.
Se agit printr-o returnare pentru omogenizare (de a evita
contactul amestecului cu degetele, utiliznd parafilm pentru a
nchide cuva).
Cuva se instaleaz n spectrofotometru, capacul se las n
jos i se regleaz la indicaia 0 (zero). Se programeaz 15 minute
la cronometru.
Din soluia analizat de lacaz se ia cu exactitate 1 cm3.
Foarte rapid acest volum se introduce n cuva de msurat, (fr a o
scoate din spectrofotometru), n acelai moment se deschide
cronometrul (timpul zero). Amestecul reacionat se agit prin
returnare (scotnd cuva din spectrofotometru i utiliznd parafilm
pentru a nchide cuva) i apoi cuva se reinstaleaz rapid n aparat.
Capacul se las jos.
58
Not: valoarea extinciei trebuie s fie deja diferit de

indicaia zero iniial.
De notat pentru fiecare prob variaia extinciei n fiecare
minut, timp de 8 minute (dup ce aparatul a fost reglat la "zero" n
timpul zero)
Determinrile se efectueaz cu fiecare din soluiile tampon
propuse: tampon citrat fosfat 0,1 M, pH-3; 4; 5; 6 i 7.
Rezultate
1.Cinetica
Trasa-i pe aceiai foaie de hrtie milimetric curbele
reprezentative a cineticii de oxidare a siringaldazinei: Extincia =
= f (timpul) pentru diferite valori a pH-lui n soluiile tampon
analizate. (Se va lua ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10
minute).
2. Vitezele iniiale
Determinai
pantele
curbelor,
exprimate
n
extincie/minut. Aceste pante corespund vitezelor iniiale de

oxidare enzimatic.
Trasa-i curba Extincie /minut = f (pH).
Analizai aceast curb. La ce concluzii ai ajuns?
Not: toate rezultatele experimentate i calculele trebuie s
fie prezentate n form de tabel.
Determinare activitii lacazei n must i struguri

Alte tipuri de polifenoloxidaze se gsesc n struguri sntoi
(n particular tirozinaza), aceast determinare implic utilizarea
unui substrat specific de Lacaz.
n cazul determinrii colorimetrice:
De asemenea este obligatoriu de a elimina n prealabil (fr
a denatura enzima) compuii fenolici din mediu (taninuri,
antociani) din cauza rolului de inhibitor la oxidarea siringaldazinei.
59
Aceast eliminare se va face prin tratarea mustului cu o rin

absorbant : polivinilpolipirolidon (PVPP).
a) Eliminarea compuilor fenolici:
ntr-un balon conic Erlenmeyer de 50 cm3 care conine 0,8 g
PVPP, se dozeaz 10 cm3 suc (limpezit la necesitate) sau must, se
agit energic (aproximativ 1 minut) i se las n contact 10 minute,
se filtreaz cu vid (filtrul Millipore), recupernd filtratul (care
trebuie s fie decolorat) ntr-un tub prevzut pentru acest scop.
Aadar, se obine prima prob de suc decolorat, care va fi
diluat, la necesitate, pentru determinarea activitii.
b) Determinarea activitii Lacazei:
Msurrile se vor efectua la spectrofotometru Spectronic 20,
temperatura 20 oC i =530 nm. ntr-o cuv de 1 cm, curat i
uscat, se dozeaz:
92,8 cm3 soluie-tampon acetat pH=5,0;
91,2 cm3 soluie de substrat (siringaldazin de 60 mg/l).
Soluia se agit prin returnare pentru omogenizare (fr a pune
degetele n contact cu amestecul, utiliznd o bucic de pelicul
mic de pelicul de film pentru a nchide cuva).
Cuva se instaleaz n spectrofotometru, se las n jos
capacul i se regleaz la indicaia 0. Se programeaz 15 minute la
cronometru.
Din proba analizat (suc decolorat, prealabil diluat) se ia cu
exactitate 2 cm3.
Acest volum se dozeaz foarte rapid n cuva (fr a scoate
cuva din spectrofotometru),n acelai moment se deschide
cronometrul(timpul zero).Amestecul reactiv se agit rin returnare
(scond cuva din spectrofotometru i utiliznd parafilm pentru a
nchide cuva) i apoi cuva se reinstaleaz rapid n aparat. Capacul
se las jos.
60
Not: valoarea extinciei trebuie s fie deja mai mare de

0, care este valoarea iniial. Se noteaz valoarea extinciei n
timp (8 minute).
c) Rezultate:
1. Cinetica
Trage-i Pe aceia-i foaie de hrtie milimetric curbele
reprezentative a cineticii oxidrii siringaldazinei:
Extincia = f (timpul) pentru diferite probe examinate. (De
luat ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute).
2. Vitezele iniiale
De
determinat
pantele
curbelor,
exprimate
n
extincie/minut. Aceste pante corespund la vitezele iniiale de
oxidare enzimatic.
Transforma-i aceste rezultate n uniti de activitate
considernd c, n condiiile de msurri utilizate, o soluie de 1
mole de siringaldazin pe litru (1M) reprezint o extincie de
0,065 ( = 65000, l = 1 cm). (P.M. siringaldazin = 360)
3. Comparai activitile Lacazei pentru diferite probe
analizate. Ce a-i putea spune despre gradul de contaminare cu
Botrytis cinerea.?
Determinarea polarografic a activitii lacazei

Principiul metodei
Cu ajutorul unui electrod specific la oxigen (electrodul lui

CLARC), se msoar consumul de O2 a unei probe n prezena unui
reactiv, ce conine un substrat fenolic specific lacazei (cu excepia
siringaldazinei, de exemplu: hidroxichinona sau altul), asociat cu
un ihibitor specific tirozinazei.
61
n rezultat, dac lacaza se conine numai n boabele

contaminate de Botrytis cinerea, boabele strugurilor sntoi conin
n mod normal o alt fenoloxidaz: tirozinaza (EC 1.10.3.1.),
capabil de a oxida un numr mare de compui monofenolici i
orto-difenolici i care trebuie, deci, s fie inhibai n timpul
msurrii activitii numai a lacazei.
Electrodul polarografic
Cnd se aplic o diferen de potenial negativ de 0,6-0,8 V

ntre un electrod inert (aur sau platin) i un electrod de referin
(de calomel ori Ag/AgCl) ntr-o soluie neutr de KCl, oxigenul
dizolvat este redus la suprafaa catodului. Curentul calibrat n
raport cu oxigenul dizolvat este nregistrat. Acest curent este
proporional presiunii pariale a oxigenului dizolvat (presiunea
oxigenului).
Cnd catodul, anodul i electrolitul snt separai de mediu
printr-o membran plastic, permeabil pentru gaze, dar
impermeabil pentru majoritatea ionilor, rezistena esenial la
transferul de mas se datoreaz n special membranei, ceea ce
permite msurarea presiunii oxigenului n diverse lichide.
Reacia la catod: O2 + 2 H2O + 2 e H2O2 + 2 OH
62
H2O2 + 2 e 2 OH
Reacia la anod: Ag + Cl- AgCl + e

Reacia sumar:
4Ag + O2 + 2 H2O + 4Cl 4AgCl + 4OH
Fiindc O2 este rapid consumat la catod, se poate de
considerat, c presiunea O2 (Po2) asupra membranei este nul, deci,
fora responsabil de difuzie a O2 prin aceast membran este
proporional cu Po2 n exteriorul membranei. Dac Po2 crete, se e
difuzeaz mai mult O2 prin membran i un curent mai mare
traverseaz detectorul; o presiune Po2 mai joas va corespunde la
un curent mai slab.
Exprimarea rezultatelor
O unitate de activitate a lacazei corespunde cantitii de
enzim care catalizeaz consumul a 100 g de oxigen ntr-o minut
la 1 litru must, n condiiile experienei (temperatura 35 oC; pH= 5;
4 cm3 prob prealabil diluat pentru 20 cm3 amestec reactiv saturat
cu oxigen).
ntrebri de control:
1. Caracteristica lacazei.
2. Explicai metoda colorimetric a activitii lacazei.
3. Explicai metoda polarografic a activitii lacazei.
4. Cum se determin lacaza n soluii pure i must de
struguri?
5. Tehnica securitii la determinarea lacazei.
63

Determinarea activitii catalazei
dup A. Bah i A.Oparin
Oxidoreductazele dup mecanismul de aciune se clasific
n trei grupe:
Dehidrogenaze anaerobe i aerobe, care snt enzime
transportoare de hidrogen;
Citocromi, care snt enzime transportoare de electroni;
Oxidaze, enzime care catalizeaz reaciile de oxidare a
substratului cu oxigenul molecular sau cu oxigenul peroxidic.
Oxidazele se mpart n trei subgrupe:
Oxigenaze
Hidroxilaze
Oxidaze transportoare de electroni.

Oxigenazele catalizeaz reaciile de combinare a
substratului cu oxigenul molecular (cu ambii atomi din molecul):
AO2
AOOH; sau A + O2
AH + O2
Hidroxilazele enzime care oxideaz substratul cu
formarea concomitent a apei. Un atom din oxigenul molecular
particip la oxidarea substratului, iar alt atom la formarea apei:
A + SO + H2O
AH2 + S + O2
unde: AH2 donator de hidrogen;
S substrat;
A donator liber;
SO substrat oxidat.
Oxidazele transportoare de electroni conin n molecula sa
ioni metalici i catalizeaz reacia de oxidare a substratului cu
ajutorul oxigenului atomic. Oxidazele se mpart n dou subgrupe:
64
Cupruoxidaze, enzime care conin cupru, din ele fac parte

fenoloxidazele, polifenoloxidazele, ascorbatoxidaza, tirozinaza etc.;
Feroxidaze, enzime care conin fier, din ele fac parte
peroxidazele i catalazele.
Peroxidazele, snt enzime cu structura heteroproteidic,
adic heminproteide, ce conin Fe3+. Ele descompun peroxidul de
hidrogen (H2O2) numai n prezena unui acceptor de oxigen sau a
unui donator de hidrogen:
H2O2 + A
AO + H2O;
H2O2 + AH2
2 H2O + A
Ele snt larg rspndite n regnul vegetal (mai ales n
rdcinile de hrean) i mai puin n cel animal (lapte, saliv, ficat,
leucocite).
Peroxidazele snt active n struguri n perioada maturrii
lor. Temperatura de peste 70 oC i dozele ridicate de SO2
inactiveaz sau distrug peroxidazele din must i vin.
Catalazele snt heminproteide, ce conin Fe3+. Se gsesc n
toate celulele vegetale, dar pot fi secretate i de microorganisme, n
special de bacteriile acetice. La animale se conin mai mult n snge
i ficat.
Catalaza (E.C. 1.11.1.6.) are proprietatea de a descompune
peroxidul de hidrogen (apa oxigenat) n ap i oxigen molecular.
Peroxidul de hidrogen poate fi i donator de oxigen:
H2O2
2 H2O2
catalaza
catalaza
H2O + 1/2 O2
2 H 2O + O 2
Catalaza se inhibeaz de cianuri, hidrogenul sulfurat i

fluoruri.
65
Apa oxigenat se formeaz la etapa final de oxidare

biologic, cnd dehidrogenazele aerobe (flavinice) transmit
hidrogenul direct oxigenului atmosferic. Apa oxigenat (H2O2) este
toxic pentru celulele vii. Descompunnd apa oxigenat, catalaza
protejeaz celulele de intoxicaii.
Catalaza este foarte sensibil i i pierde activitatea la
nclzire.
Preparatele enzimatice de catalaz, obinute din ficat de
bovine sau prin sinteza microbian, se utilizeaz n industria
alimentar pentru distrugerea H2O2 rmase n urma conservrii
laptelui, pasteurizrii oulor.
Principiul metodei
Determinarea activitii catalazei se bazeaz pe evidena
apei oxigenate, descompuse de enzim timp de 30 minute, prin
titrarea peroxidului cu permanganat de potasiu 0,1 N:
5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4
5 O2 + 2 KHSO4 + 2MnSO4 + 8 H2O
Diferena volumelor de soluie 0,1N KMnO4 (cm3) a probei

de control i probei de lucru, indic cantitatea apei oxigenate
descompuse de enzim.
a) Pentru probe solide
baloane conice 100 cm3 i 250cm3 ;

cilindru de 100 cm3;
mojar cu pistil;
pipete 5, 10 i 20 cm3;
biuret 25 cm3;
soluie 1 % ap oxigenat;
soluie 0,1N KMnO4;
66
soluie 10 % H2SO4;
probe de produs (fin, cereale, mal).
5 g de produs se infuz timp de 1,5 ore cu 100 cm3 ap

distilat la temperatura camerei n balon conic de 250 cm3.
Suspensia obinut se filtreaz prin hrtie de filtru pliat.
Pentru determinare se iau dou probe cte 20 cm3 de filtrat
limpede. Coninutul probei de control se fierbe timp de 5 minute
pentru inactivarea enzimei. n ambele probe se dozeaz cte 20 cm3
ap distilat i 3 cm3 soluie 1 % peroxid de hidrogen i se las
pentru 30 minute la temperatura de camer. Aciunea enzimei este
stopat prin administrarea a 3 cm3 soluie 10 % de H2SO4, iar
restul de peroxid de hidrogen se titreaz cu soluie 0,1 n de
KMnO4.
Diferena volumelor de soluie 0,1n de KMnO4 (cm3) a
probei de control i probei de lucru, indic activitatea enzimei.
Activitatea catalazei poate fi exprimat n mg peroxid de hidrogen
sau cm3 soluie 0,1 n KMnO4 la 1g produs analizat. 1 cm3 soluie
0,1n KMnO4 corespunde 1,7 mg peroxid de hidrogen.
Activitatea catalazei (Ac) n mg H2O2/g x 30 min se
determin dup formula:
Ac =
(a-b) x 1,7 x 5
n
unde:
a volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
control, cm3;
b - volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
lucru, cm3;
5 recalcularea la volumul extractului
1,7 mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4;
n- masa probei, g.
67
b) pentru probe lichide

soluie 1 % de ap oxigenat, prealabil neutralizat cu
soluie 0,1n NaOH;
soluie 0,05 n de KMnO4;
soluie 10 % de H2SO4;
probe de produs (vin, suc).
n 4 baloane conice cu dop rodat de 100 cm3 se adaug cte

10 cm de vin sec. Dou probe ( de control) se fierb 5 minute cu
rcitor invers pentru inactivarea enzimei. n dou probe de lucru i
n cele de control se adaug cte 10 cm3 de ap distilat i cte 3
cm3 soluie 1% de H2O2, preventiv neutralizat cu soluie 0,1n
NaOH i se las n repaus 30 minute la temperatura camerei. Apoi
n toate probele se adaug cte 5 cm3 soluie 10 % H2SO4, se agit
bine i se titreaz cu soluie 0,05 n KMnO4. Titrarea continu pn
cnd apare culoare roz stabil 5 secunde.
Activitatea catalazei se exprim prin cantitatea de peroxid,
descompus de enzim timp de 30 minute, care se conine n 1 cm3
de vin.
3
Activitatea catalazei se determin dup formula:
Ac =
(a-b) x 0,85
n
unde:
a volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de control, cm3;
b - volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de lucru, cm3;
0,85 mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4;
n - volumul vinului analizat, cm3.
68
ntrebri de control:
1. Caracteristica oxidoreductazelor, oxidazelor.

2. Explicai de ce catalazele se refer la oxidaze.
3. Importana catalazelor i peroxidazelor pentru
organismele vii.
4. Descriei metodele de determinare a catalazei n produse
solide i lichide.
69

Determinarea prii de mas a amidonului
n prezent toate polizaharidele convenional se mpart n

dou grupe: oligoglucide (oligozide) i polizaharide superioare
(poliozide sau poliglucide).
Din oligozide fac parte ozidele cu o mas molecular relativ
mic, care conin 10-20 resturi de monoze. Poliozidele snt
substane macromoleculare cu un numr mare de resturi de monoze
(de la cteva zeci pn la cteva mii), i alte substane, care, nu fac
parte din glucide, numite agliconi. Cele mai importante din ele snt
poliozidele vegetale: amidonul, celuloza, hemicelulozele, inulina,
substanele pectice etc., i poliozidele de origine animal:
glicogenul i aa-numitele mucopoliglucidele (acizii hialuronic,
condroitinsulfuric, heparina i altele).
Importana analizei:
Un rol important ca substan de rezerv n plante l are

amidonul, la fel i glicogenul - att pentru om ct i pentru animale.
Amidonul reprezint o poliglucid de rezerv cu formula
(C6H10O5)n, care se depoziteaz sub form de granule (de la 2 pn
la 150 m) n tuberculi, semine, frunze, rdcini i chiar n prile
lemnoase ale plantelor. Granulele de amidon la diferite specii se
deosebesc dup dimensiuni, form, componena chimic i
proprieti, ce servete ca metoda determinrii provenienei fainei.
Amidonul este un praf, insolubil n ap rece, alcool i eter. n ap
cald se umfl formnd geluri.
Amidonul este constituit din 3 % substane minerale, acizi
grai i 97 % amiloz, amilopectin.
Amiloza este o poliglucid liniar care conine 200 1000
resturi de D glucopiranoz, unite prin legturi glicozidice de
tipul 1,4 n lan liniar (masa molecular variaz pn la 30.000
70
1000.000 uniti). Caracteristica amilozei i amilopectinei este

prezentat n tabelul 1.
Caracteristica amilozei i amilopectinei. Tabelul 1.
Structura
chimic
Forma
moleculei
Reacia cu
I2
Masa
molecular
Solubilitate
a
Stabilitatea
soluiilor
Amiloza
Polimer al D
Glp format prin
legtura (14)
Neramificat
Culoarea albastr
Amilopectina
Polimer al D Glp
format prin legtura
(14) i (16)
Ramificaia la fiecare 20
de resturi
Culoarea albastruviolet
100 900 de mii
Pn la 20*106
Solubil n apa cald,

formeaz soluii cu
viscozitatea relativ
joas, nu se gelific
Instabile
Se dizolv la temperaturi
nalte, formeaz soluii
cu viscozitate nalt, se
gelific.
Stabile
Structura macromoleculei de amiloz:
71
Structura macromoleculei de amilopectin:
Amiloza n ap cald formeaz o dispersie coloidal (dar nu

formeaz geluri). Amiloza se coloreaz cu iodul n albastru.
Molecula amilopectinei este puternic ramificat. Este
alctuit din 600 6000 resturi de D glucopiranoz, legate
ntre ele prin legturi 1,4 i dup 25-30 resturi de glucoz apare
o ramificare cu legtura glucozidic de tipul 1,6. Masa
molecular a amilopectinei este cuprins ntre 100 000 i 1 000 000
uniti sau zeci de milioane uniti. De exemplu, n componena
amidonului de cartofi se conin fracii de amilopectin cu masa
molecular mai mare de 70 mln. uniti. Amilopectina nu se
dizolv n ap rece. Cu iodul se coloreaz n albastru-violet. n ap
cald formeaz un sistem dispers stabil cu viscozitate mare
(cleister).
Principalele tipuri de materie prim care conin amidonul
snt cartofii, cerealele i produsele de prelucrare a lor (crupele,
fina). Coninutul amidonului n cartofi n mediu constituie 17,5 %
(sau 70-80 % din masa uscat), n seminele cerealelor 40-80 %
din masa uscat.
Amidonul uor hidrolizeaz n prezena acizilor minerali
(chiar diluai), pn la glucoz:
72
+ n H2O
(C6H10O5)n
dextrine
Acid
mineral
nC6H12O6
Acid
mineral
Hidroliza amidonului este catalizat i de enzimele - i amilaze, care se conin n mal i n saliv. Produsul final al acestei
hidrolize enzimatice este maltoza:
amilaze
amidon
amilaze
dextrine
maltoza
Amidonul la 96,1 97,7 % este format din polizaharide, care

la hidroliza acid formeaz glucoza. De aceea metodele existente
de determinare cantitativ a amidonului se bazeaz pe proprietile
glucozei de reducere, activitatea optic etc.
Din cele mai rspndite metode de determinare a amidonului
pot fi numite: polarimetrice, colorimetrice, chimice, gravimetrice.
n industria fermentativ de producere a amidonului i
melasei, n alte ramuri ale industriei alimentare snt rspndite
metodele polarimetrice (metodele Evers, Lintner, Arhipovici).
Metoda Evers este metoda standard de baz pentru
determinarea amidonului la aprecierea calitii cerealelor i
produselor de prelucrare a lor. Pentru determinarea coninutului de
amidon n materia prim vegetal prin aceast metod este necesar
n prealabil de transferat amidonul n stare solubil i de hidrolizat
pn la glucoz, ce se realizeaz prin tratarea produsului analizat cu
acid clorhidric sau cu clorur de calciu. Pentru a nltura
substanele nsoitoare (care mpiedic determinarea), ndeosebi
proteinele, i pentru a limpezi hidrolizatul, soluia este tratat cu
unul din reactive precipitante, care pot fi: acidul
dodecawolframofosforic, acidul picric, molibdatul de amoniu,
reactivul Karrez (un amestec de soluii ale srurilor ferocianurii (II)
73
de potasiu i sulfatului de zinc). Soluia transparent se

polarimetreaz.
zaharimetru universal C-3;
cntar tehnic;
baia de ap;
2 baloane cu cot de 50 cm3;
baloane conice de 250 cm3;
cilindre de 25 cm3;
pipete de 2, 5, 10, 25 cm3;
plnie din sticl;
filtru de hrtie;
soluie 0,31n de HCl (sau soluie cu concentraia 1,124%);
soluie 25 % HCl;
reactivul Karrez I: (15g [K4Fe (CN)6]3 X 3 H2O cu
eroarea 0,01 g, se dizolv n balon cotat 100 cm3 i se aduce cu
ap distilat pn la cot);
reactivul Karrez II: (30g ZnSO4 X 7 H2O cu eroarea
0,01 g, se dizolv n balon cotat 100 cm3 i se aduce cu ap distilat
pn la cot).
Reactivul Karrez I i II pot fi nlocuite cu soluie 2,5 %
molibdat de amoniu sau soluie 4 % de acid
dodecavolframofosforic;
produse pentru analiz: fin, crupe i cereale mcinate.
Proba de lucru. ntr-un balon cotat uscat de 50 cm3 se
dozeaz cu cilindru 15 cm3 soluie 0,31 n de HCl. Cu ajutorul
plniei se administreaz agitnd permanent 2,5 g de produs analizat
(fin, crupe, etc). Plnia i gtul balonului se cltesc cu 10 cm3
soluie 0,31 n de HCl.
Coninutul balonului se menine 3 minute n baia de ap la
temperatura fierberii, agitnd permanent. Apoi nclzirea n baia de
ap se prelungete 12 minute. Balonul se scoate din baia de ap i
repede se rcete sub robinet pn la ot = 20 oC.
74
Pentru a precipita proteinele i a limpezi soluia n balon se

adaug cu cilindrul reactivul precipitant: cte 1 cm3 soluie Karrez
I i II. Dup 5 minute coninutul balonului se aduce cu ap distilat
pn la cota 50 cm3. Soluia se agit i se filtreaz prin hrtie de
filtru pliat ntr-un balon conic uscat. Primele porii de filtrat (pn
la 5-10 cm3) nu se folosesc. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determin unghiul
de rotaie a planului de polarizare la zaharimetru C-3.
Concomitent se pregtete proba de control pentru a
introduce corecie la substanele solubile n ap optic active care,
nu precipit cu reactivul precipitant i se gsesc n soluie (n
special glucidele).
Pentru proba de control se cntrete 5 g de produs, care se
transfer n balonul cotat de 50 cm3, se adaug 30 cm3 ap distilat
i se agit timp de 15 minute. Plnia i gtul balonului se cltesc cu
10 cm3 ap distilat i soluia se decoloreaz cu reactivul
precipitant Karrez I i II ca n proba de lucru. Timp de 5 minute
coninutul balonului se agit i se aduce cu ap distilat pn la cota
50 cm3, se filtreaz. Se msoar cu cilindrul 25 cm3 de filtrat
limpede, se transfer ntr-un balon cotat de 50 ml i se adaug
1 cm3 soluie 25 % HCl, se menine 15 minute n baia de ap la
fierbere, apoi se rcete sub robinet pn la ot = 20 oC i se aduce
pn la cot cu ap distilat. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC, se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determin unghiul
de rotaie a planului de polarizare la zaharimetru C-3.
Coninutul amidonului se calculeaz dup formula:
( ) 100 100 50
,
C = l 20 c
[ ]D m l (100 W )
unde:
C partea de mas a amidonului (%) n substane uscate;
l mrimea unghiului de rotaie a planului de polarizare
obinut de substanele optic active n experiena de baz, n grade a
zaharimetrului ;
75
c mrimea unghiului de rotaie a planului de polarizare

obinut de substanele solubile n ap optic active (nu de amidon) n
proba de control, n grade a zaharimetrului;
(l - c) mrimea unghiului de rotaie a planului de
polarizare obinut de proba de amidon dizolvat, n grade a
zaharimetrului;
m masa (2,5 g) produsului analizat, g;
l lungimea tubului de polarizare, dm;
[] D20 capacitatea de rotaie spicific a amidonului din
produsul analizat, n grade;
W coninutul de mas a umiditii n produsul analizat, %.
De obicei pentru a calcula coninutul de mas a amidonului
se utilizeaz tabelul 1, unde snt date mrimile capacitii de rotaie
specific [] D20 pentru diverse produse ce conin amidon i
coeficientul Evers (F, egal cu 1000/[]D20), pentru diverse produse
ce conin amidon.
Capacitatea de rotaie specific [] D20 pentru diverse
produse ce conin amidon. Tabelul 1.
Amidon
[] D20
F
Orez
176,7
5,66
Gru
177,5
5,64
Porumb
177,5
5,64
Cartofi
181,2
5,50
ntrebri de control:
Structura i proprietile amilozei.
Structura i proprietile amilopectinei.
Hidroliza amidonului.
Metodele principale de determinare a amidonului n
produse vegetale.
5. Care este principiul de determinare a amidonului n
metodele polarimetrice ?
6. Ce reprezint coeficientul Evers ?
1.
2.
3.
4.
76

Determinarea fotocolorimetric a vitaminei C
Vitamina C sau acidul ascorbic este cea mai rspndit

vitamin n regnul vegetal i poate fi sintetizat de toate animalele
excepie fiind omul, primatele i cobaiul.
Insuficiena n hran a vitaminei C duce la oboseal, dureri
de dini. Lipsa n organism este determinat de apariia scorbutului.
Boala se manifest prin inflamarea i sngerarea gingiilor,
insuficien cardiac i apariia de hematoame.
Necesitatea zilnic pentru om este de 50-100 mg.
Coninutul vitaminei C este mai mare n fructe i frunze, n cantiti
mai mici se conin n rdcini i n cantiti minime de tot n
organismele animale (tab.1).
Coninutul de acid ascorbic
n produse vegetale (mg -% sau mg/100 g de produs) Tabelul 1
Produsul
vegetal
Coninutul de Produsul
Coninutul de
acid ascorbic
vegetal
acid ascorbic
Coacz
100-400
Ardei verde
100-400
neagr
Ptrunjel
150
Lmi
40
Mrar
100-150
Mere
3-17
Varz alb
30-50
Viine
15
Mcri
40-60
Struguri
3-12
Mceul de
2000-4500
Cartofi
20-30
nord
Ceap verde 30
Nuci verzi
3000
Tomate
20-25
Ctin alb
100-400
Cetin
de
Mazre
150-200
25
brad i pin
verde
Acidul ascorbic particip activ n procesele de oxidare i
reducere care au loc n celula vie. Acesta se datoreaz sistemului
77
(acid ascorbic - acid dehidroascorbic) care are rol de reglare a

potenialului redox din celule, contribuind la transportul
hidrogenului. Prin oxidare lent vitamina C se transform n acid
dehidroascorbic:
O=C
O=C
-2 H
HO - C
HO - C
O=C
+ 2 H+
O=C
HC
HC
HO - C - H
HO - C - H
CH 2 O H
CH 2 O H
acid L-ascorbicacid L-dehidroascorbic

n plantele crucifere (varz, ridiche de iarn, ridiche de lun
etc.) alturi de acidul ascorbic liber se conine forma (complexul)
asociat, numit a s c o r b i n o g e n.
Structura lui poate fi redat prin formulele urmtoare:
O
C
O
HC
CH
C-OH
- CH 2 - C
O
HC
NH
HO - C - H
CH 2OH
78
O
C
O
CH2 - C
CH
HC
C-O H
O
H C
NH
HO - C - H
CH 2 O H
Aceast substan n prezena acidului clorhidric uor se

hidrolizeaz
formnd acidul ascorbic liber. Hidroliza
ascorbinogenului are loc n tubul digestiv.
Proprietile chimice ale acidului ascorbic
Vitamina C aparine acizilor dei n structura sa lipsete

gruparea carboxilic COOH. Vitamina C este lactona unui acid
hexonic i caracterul acid se datoreaz grupei OH enolice de la
C3. De aceea cu baze diluate acidul ascorbic formeaz sruri.
C
C - OH
C - OH
C
C
NaOH
O +
O
C - O Na
HC
HC
HO - C - H
HO - C - H
H2O
CH2OH
CH2OH
Ascorbinat de sodiu
Acidul
ascorbic
uor
reduce
iodul,
diclorfenolindofenolul i ali oxidani.
79
2,6
C - OH
C - OH
I2
HC
HC
HO - C - H
HO - C - H
CH2OH
2 HI
CH2OH
n prezena oxidanilor mai puternici, ndeosebi n mediul

neutru i bazic, acidul ascorbic trece ireversibil n acid oxalic i
treonic:
O
C - OH
C - OH
COOH
C
C
HC
HC
HO - C - H
HO - C - H
CH2OH
H2O
COOH
acidul oxalic
COOH
H2O
COOH
H-C-OH
H-C-OH
HO - C - H
HO - C - H
CH2OH
CH2OH
acidul 2,3-diceto-L-gulonic
CH2OH
acidul treonic
Vitamina C este foarte instabil, se distruge n mediul

neutru i bazic la temperatura 20 oC, este mai stabil n mediul
acid. Coninutul n acid ascorbic scade mult la conservare i
fierberea alimentelor. Uor se distruge n prezena luminii i
oxigenului, cationilor metalelor grele i mai repede n prezena
enzimelor din clasa oxidoreductazelor (ascorbatoxidazei,
polifenoloxidazei). Coninutul n acid ascorbic se micoreaz mult
n procesul pstrrii materiei prime alimentare.
Principiul metodei
Acidul ascorbic se extrage din materialul analizat cu acid
oxalic. Dup filtrarea extractului (cu pH-ul 3-4) se titreaz cu
soluie de 0,001n 2,6-diclorfenolindofenol. Ultimul este un oxidant
80
selectiv i reacioneaz cu acidul ascorbic, dar nu reacioneaz

asupra zahrului i a altor substane reductoare.
Cl
Cl
ONa
Cl
2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu (albastru)
OH + Na
Cl
2,6-diclorfenolindofenol (rou)
O C
Cl
O
OH
C - OH
O
C - OH
HC
Cl
HO - C - H
CH2OH
C
C
Cl
O
HO
HC
NH
Cl
HO - C - H
substanta incolora
CH 2OH

fotocolorimetru, KFK-2;
cntar tehnic;
mojar cu pistil;
trei baloane cotate de 100 cm3;
ase eprubete;
pipete de 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 cm3;
plnie din sticl;
filtru din materie,
81
OH
soluie de acid oxalic de 1 %;

soluie de 0,001n de sare de sodiu 2,6diclorfenolindofenol;
cristale de acid ascorbic;
produse pentru analiz: mere, struguri, mcri, mrar,
ceap verde, varz, cartofi etc.
Pregtirea soluiei de 2,6 - diclorfenolindofenol
Reactivul (sau indicatorul) se pregtete cu soluie-tampon
fosfat cu pH= 6,9 7,0 deoarece n soluia apoas el se distruge.
Pentru tampon se pregtesc urmtoarele soluii: KH2PO4 9,078 g
n 1 dm3 de ap distilat i NaHPO4 x 2 H2O 11,867 g n 1 dm3 de
ap distilat. Fiecare soluie se pstreaz aparte. nainte de
ntrebuinare soluiile se amestec: 2 volume soluie KH2PO4 i 3
volume soluie NaHPO4.
0,26 g de reactiv 2,6- diclorfenolindofenol se transfer n
balonul cotat de 1 dm3, se adaug 700 cm3 ap distilat, amestecul
se aduce pn la cot cu soluie-tampon pH= 6,9 7,0. Soluia de
2,6 diclorfenolindofenol se pstreaz la ntuneric nu mai mult de
7 zile. Titrul soluiei se controleaz zilnic cu soluie 0,01 n tiosulfat
de sodiu. Determinarea titrului se bazeaz pe proprietatea 2,6diclorfenolindofenolului de a oxida cantitativ iodidul n iod.
Determinarea titrului 2,6- diclorfenolindofenolului
n patru baloane conice de 50 cm3 se dozeaz:
n primele dou (probe de lucru) cte 10 cm3 soluie
indicator, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) i 1 cm3 soluie 10 % KI;
n cele de control n loc de indicator se adaug 10 cm3 ap
distilat, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) i 1 cm3 soluie 10 % KI.
Soluia din baloane se agit i iodul, eliberat la oxidarea KI,
se titreaz n prezena soluiei 1 % amidon cu 0,01n de tiosulfat.
Cantitatea de acid ascorbic care corespunde la 10 cm3 de 2,6diclorfenolindofenol se determin prin nmulirea volumului
soluiei de tiosulfat, care a mers la titrare cu coeficientul 0,88.
(V lucru - V control) * 0,88
T=
10
82

Analiza produselor lichide
40-50 cm3 de suc sau must se dozeaz n balon cotat de 100cm3

i se aduce pn la cot cu soluie de 5 % acid acetic. Amestecul se
agit i cu pipeta se transfer 30-40 cm3 ntr-un balon cotat de 50
cm3 n care se adaug 0,5 g CaCO3 praf (n cantiti mici pentru a
evita spumegarea). Dup dizolvarea CaCO3 se dozeaz 5-10 cm3
soluie acid de 5 % de acetat de plumb. Amestecul se aduce pn
la cot cu soluie de 5 % acid acetic. Soluia se amestec i se
filtreaz sau se centrifugheaz. Ulterior se msoar cu pipeta (n
dependen de coninutul acidului ascorbic) 10-20 cm3 de filtrat i
se titreaz din microbiuret cu soluie 0,001 n 2,6diclorfenolindofenol pn la apariia culorii slab roze, care se
menine timp de 30-60 secunde. Se fixeaz volumul de 2,6diclorfenolindofenol consumat la titrare i se adaug 2 picturi (de
control) 2,6- diclorfenolindofenol i dac apare culoare roz
intensiv se consider c titrarea a fost efectuat corect. Se repet
titrarea la probe de 2-3 ori.
Coninutul acidului ascorbic se calculeaz dup formula:
100
100
50
=V x T x
x
x
V1 x D
V3
V2
unde:
a coninutul de acid ascorbic n mg-%;
V - volumul soluiei de 2,6-diclorfenolindofenol consumat
la titrare;
T - cantitatea de acid ascorbic n mg, care corespunde la 1
cm3 de 2,6-diclorfenolindofenol;
V1 volumul de suc sau must luat pentru analiz, n cm3;
V2 volumul probei luat la titrare n cm3;
V3 volumul probei luat pentru titrarea cu acetat de plumb,
n cm3;
D densitatea optic a sucului sau a mustului analizat.
83
Analiza produselor solide (prin metoda fotocolorimetric)
Proba produsului analizat (10 g) se transfer n mojar i se

mrunete cu pistilul n prezena acidului oxalic de 1 %. Apoi,
cantitativ se transfer n balonul cotat de 100 cm3 , se aduce pn la
cot cu acid oxalic i se agit. Coninutul balonului se filtreaz prin
filtrul de materie ntr-un balon conic. n filtratul obinut se adaug
6 cm3 2,6diclorfenolindofenol. n continuare, se determin
extincia D1: soluia obinut se transfer n cuv (cu lungimea de
1 cm), se fotocolorimetreaz la lungimea de und =540 nm
(contra apei distilate). La determinarea extinciei D2: n cuva cu
soluie analizat se adaug cteva cristale de acid ascorbic (culoarea
2,6-diclorfenolindofenolului dispare) soluia se agit i iari se
fotocolorimetreaz.
Pentru a introduce o corecie la schimbarea intensitii
culorii la pstrarea soluiei de 2,6-diclorfenolindofenol, se msoar
extincia amestecului (Do), format din 10 cm3 de 2,6diclorfenolindofenol, 6 cm3 de soluie de 1 % de acid oxalic.
Ulterior se msoar extincia (D) soluiei proaspt pregtite de 2,6diclorfenolindofenol, din care se scade extincia (Do).
Densitatea optic a soluiei analizate se determin dup
formula:
Dx = D1 + (D - Do) - D2
Corecia (D-Do) se include n calcul atunci cnd calibrarea i

determinarea D1 i D2 nu se face n aceeai zi.
Dup graficul de calibrare se determin concentraia de acid
ascorbic (Cx) care corespunde Dx.
Graficul de calibrare
Substrat ascorbic: se dizolv 100 mg acid ascorbic n
balon cotat de 100 cm3 i se aduce pn la cot cu soluie 1 % acid
oxalic.
Pentru a construi graficul de calibrare se dilueaz substratul
ascorbic: 10 cm3 soluie de substrat ascorbic se transfer n balon
84
cotat de 100 cm3 i se aduce la cot cu soluie de 1 % acid oxalic

(concentraia soluiei diluate de substrat ascorbic este 100
mkg/cm3).
n ase cilindre se administreaz de la 1 cm3 pn la 6 cm3
de soluie diluat de substrat ascorbic, (ce va corespunde
concentraiilor 16,6; 33,2; 50,0; 100 mkg/cm3) apoi se dozeaz
10cm3 soluie proaspt pregtit de 2,6-diclorfenolindofenol.
Volumul la fiecare cilindru se aduce pn la 16 cm3 cu soluie de
acid oxalic de 1 %.
Exemplu:
C, mkg/cm3
D
16.6
1.3
33.2
1.2
50
1
66.6
0.8
83.2
0.7
100
0.6
Determinarea concentraiei de vitamina C

D
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
C, mkg/cm3
Recalcularea n mg-% (mg de vitamina C n 100 g de produs

alimentar):
K =
C * 100 * 100
a * 1000
85
K coninutul de vitamina C n mg-%,

a masa probei;
1000- recalcularea n mg.
ntrebri de control:
1. Care snt proprietile fiziologice ale acidului ascorbic ?

2. n care produse se gsete vitamina C n cantiti mai
mari ?
3. Scriei structura i proprietile chimice ale acidului
ascorbic.
4. Principiul metodei de determinare a acidului ascorbic.
5. Descriei metoda determinrii acidului ascorbic n
produse lichide i tari.
6. Argumentai formula de calcul a acidului ascorbic prin
dou metode.
7. Regulile tehnicii de securitate la determinarea acidului
ascorbic.
86

Metoda cromatografic de determinare a carotinelor
nsemntatea analizei
Rolul biochimic al vitaminei A:

intr n componena membranelor plasmatice, micoreaz
permeabilitatea la factori patogeni, prin aceasta protejeaz celulele
epiteliale;
particip n recepia luminii, fiind n componena
purpurului vizual - rodopsinei;
particip la fotosintez, n reglarea fosforilrii oxidative,
ciclului acizilor tricarboxilici, biosintezei mucopoliglucidelor;
Insuficiena vitaminei A duce la ncetarea creterii copiilor,
se micoreaz rezistena la infecii. Apare boala orbul ginilor
(hemeralopia) scderea vederii n amurg ori noaptea.
Lipsa vitaminei A n hran provoac boala xeroftalmie
(grec. xeros uscat, ophtalmos - ochi) din cauza inflamrii corneei
i cheratinizrii epiteliului canalelor lacrimogene, ceea ce duce la
nchiderea lor. Aceasta boal se ntlnete mai des la copii.
Necesitatea zilnic n vitamina A pentru un om matur
constituie 1,5 2 mg, iar n carotine 3 5 mg.
Vitaminele grupei A se gsesc exclusiv n produse animale.
n cantiti mai mari n untura i ficatul de pete. De exemplu n
bibanul marin 5 mg-%; n paltus 8 mg-%; n ficatul de vite
1,5 2 mg-%.
n cantiti mai mici se gsesc n lapte, unt, glbenu de ou,
etc.
n natur se ntlnesc vitamina A1 i A2. Vitamina A1
(retinol) reprezint un alcool, ce are n molecul ciclul iononic,
o caten lateral din 2 resturi izoprenice i gruparea terminal
CH2 OH n poziia trans, conine 5 duble legturi conjugate.
87
Vitamina A2 (dehidroretinol) se ntlnete mai mult n

ficatul petilor de ap dulce. Are n plus o legtur dubl n
poziiile 2-3 ale ciclului iononic.
Structura chimic a vitaminei A1 C20H30O.
__
__
CH=CH
__
C = CH
CH3
__
CH =CH
__
__
CH3
CH3
__
H3C
C = CH
__
CH2OH
CH3
Structura chimic a vitaminei A2 C20H28O.
__
__
CH3
CH=CH
__
C = CH
CH3
__
CH =CH
__
__
CH3
__
H3C
C = CH
__
CH2OH
CH3
Provitaminele sau carotine se conin n produse vegetale i

plante, snt hidrocarburi cu structura C40H56, substane cristaline de
culoare oranj. Se conin n: morcov 5 15 mg-%, verdea 3
10 mg-%, mai puin n frunze i struguri verzi, caise, piersici,
pepene galben, bostan, iar n roii se conine licopina. n vinuri
lipsete, dar poate fi n cantiti mici n vinurile aromatizate.
Din carotine se cunosc trei izomeri: , , , care se
deosebesc prin caracterul i numrul de cicluri: carotina este
mai activ, deoarece conine dou cicluri iononice; carotina
conine un ciclu iononic i altul iononic; carotina
conine numai un ciclu iononic.
n organismul omului i animalelor carotinele se transform
n vitamina A. Din carotina prin hidroliza enzimatic n
organismul animal se formeaz 2 molecule de vitamina A1. Iar din
i carotine se obine numai cte o molecul de vitamina A1.
88
carotina
+ HO
CH 3
__
(C H=C H
__ CH
__
C = CH) 2
__
__
H 3C
CH 3
CH = C H __ (CH= C
+ H
__
__
CH 3
__
H3C
__
CH 3
C H=C H) 2
H 3 C __
OH
CH 3
H 3C
__
__
(CH=CH
__
C = CH) 2
__
__
CH 2 OH
CH 3
CH 3
carotina
CH3
__
(CH=CH
__
C = CH)2
__
__
CH3
CH3
__
H3C
H3C
CH3
__
CH = CH__ (CH= C CH=CH)2
H3C __
__ CH
carotina
CH3
(CH=CH
__
C = CH)2
__
H3C
CH3
__
__
__
CH3
CH3
__
H3C
__
__
__
HC
CH = CH (CH= C CH=CH)2
H3C __
CH3
licopina
H3C
CH3
CH3
H3C
__
CH3
__
__
__
__
__
__
HC
CH __ (CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2
__
CH3
C
H3C __
CH3
Vitamina A i carotinele uor se descompun, se oxideaz cu

oxigenul din aer din cauza prezenei legturilor duble n molecula
lor. De aceea nu se poate de pstrat mult timp morcovul i verdeaa
tiate mrunt.
89
Carotenoidele se folosesc ca colorani naturali netoxici n

industria alimentar, farmaceutic, medicin, cosmetic i ca adaos
n hrana animalelor de ferm pentru intensificarea coloritului unor
produse alimentare (glbenuul de ou, grsimea corpului psrilor).
Principiul metodei de determinare a carotinelor
Se bazeaz pe extragerea lor cu solveni organici
corespunztori din plante (fructe) mrunite i prin separarea
ulterioar a impuritilor cu ajutorul cromatografiei de adsorbie
urmat de fotocolorimetrare.
n practica de laborator se folosete pe larg metoda
cromatografic de separare a carotinelor dup M. S. vet,
modificat de I.K. Murri.
fotocolorimetru KFK - 2;
coloana cromatografic tub de sticl cu lungimea 30 cm
cu diametrul inferior 1 cm;
balon Bunzen, uscat;
pompa cu vid;
mojar cu pistil;
baloane cotate 50, 100 cm3, uscate;
adsorbent Al2O3 (praf) sau carbonat acid de magneziu
activat;
Na2SO4 calcinat;
probe de materie prim (legume colorate, fructe, plante
verzi);
hrtie de filtru;
solvent organic: eter de petrol sau pentan, hexan, heptan,
etc.
NOT: Solvenii organici snt inflamabili. Respectai
regulile de securitate !
90

Metoda cromatografic
Proba de material vegetal 1 g (pn la 5 g n dependen de
umiditate) se mrunete n mojarul de porelan cu pistilul, dar nu
mai mult de 30 minute, pentru a evita oxidarea carotenilor. Pentru
deshidratarea probei n mojar se adaug periodic cristale de Na2SO4
calcinat pn cnd se obine o mas uscat, fin. Masa obinut se
las n mojar pe 20 30 minute. n partea ngust a coloanei
cromatografice se pune un tampon de vat cu grosimea 1 de cm.
Apoi coloana se umple cu Al2O3 (praf) pn la nlimea 5-10 m, n
dependen de cantitatea carotinelor i compoziia pigmenilor
adsorbii. Pe suprafaa stratului adsorbant se aeaz hrtie de filtru.
Proba de analizat mrunit se transfer cantitativ n coloana
cromatografic. Coloana cromatografic se unete cu balonul
Bunzen (fig.1).
n coloan se toarn solvent organic pn cnd
coninutul ei devine umed Balonul Bunzen se unete la
pompa cu vid sau la pompa de ap. Proba de analizat se
spal cu solvent (1-2 picturi pe secund), pn cnd
culoare galben a picturilor dispare. Este necesar ca
adsorbantul s fie acoperit tot timpul cu solvent organic,
deoarece carotenii uor se oxideaz n curentul de aer care
trece prin coloan.
Coninutul balonului Bunzen se transfer n balonul
cotat de 50 sau 100 cm3 i se aduce pn la cot cu solvent.
Coninutul de carotene din soluia obinut se determin
prin metoda fotocolorimetric.
La aparatul KFK 2, la lungimea de und =540 nm (filtrul
de lumin verde), dac soluia este colorat intensiv galben oranj
i la lungimea de und = 490 nm (filtrul de lumin albastruverde), dac soluia este colorat n galben pai. Pentru
determinarea extinciei se folosesc cuve din sticl cu lungimea de
5 cm (care se acopere cu cpcel de sticl).
Ca soluie de comparaie va servi soluia incolor de solvent
organic. Cuvele se cltesc cu solvent, se usuc cu hrtie de filtru.
91
Dup finalizarea lucrrii solventul i soluiile se toarn n baloane

corespunztoare. Solvenii organici se interzice s fie turnai n
lavoar !
Reglarea aparatului KFK 2
Aparatul KFK-2 (fig.2) este alctuit din :
1. Microampermetrul cu dou scri ; scara de sus gradat n
% T, iar scara de jos n uniti ale extinciei (absorbiei) D.
2. Locaul cuvelor.
3. Suportul (prghia) pentru permutarea cuvelor.
4. Comutatorul filtrelor de lumin.
5. Manete pentru reglarea sensibilitii : scara neagr pentru fotoelementul F4 ; scara roie - pentru fotodioda FD7K.
6. Maneta pentru reglarea grosier i fin a acului
galvanometrului la diviziunea 100 %T.
Fig.2. Aparatul KFK-2

Aparatul se conecteaz la reeaua electric i se las 15-20
minute pentru a se nclzi. n acest timp lcaul cuvelor trebuie s
fie deschis. La ridicarea capacului aparatului placa metalic nchide
calea fluxului luminos ctre fotoelemente. Rotind maneta din
92
partea stng a comutatorului se regleaz lungimea de und

necesar.
Cuva cu solvent pur (proba de comparaie) se pune n
suportul pentru cuve (n partea din stnga), iar cuva cu soluia de
analizat n partea dreapt a suportului i capacul aparatului se
nchide.
n prealabil se regleaz scara aparatului la zero cu ajutorul
manetei din partea dreapt (reglarea grosier i fin a acului
galvanometrului la diviziunea 100 % T sau la diviziunea 0 pe
scara extinciei D).
Schimbnd poziia suportului de sub capacul aparatului
permutai cuvele n fluxul luminos i notai valoarea extinciei pe
scara de jos a galvanometrului.
Repetai msurrile de 3 ori i notai valoarea medie a
rezultatului.
Graficul de calibrare
Cantitatea de carotine se determin cu ajutorul graficului de
calibrare, construit n coordonatele: extincie concentraie. Pe
baza rezultatului obinut din graficul de calibrare se calculeaz
cantitatea de carotin mg n 100 g de prob vegetal.
Pentru a construi graficul de calibrare se utilizeaz soluia
standard de K2Cr2O7 (bicromat de potasiu). 300 mg K2Cr2O7 uscat
i recristalizat (de trei ori) se dizolv n ap distilat n balonul cu
cot 1dm3. 1 cm3 de aa soluie dup culoare corespunde la 0,00208
mg (2,08 g) de carotin.
n 10 baloane cu cot de 100 cm3 se introduce o anumit
cantitate de soluie K2Cr2O7 conform tabelului1. Soluiile se aduc
pn la cot cu ap distilat, se agit i se determin extincia
fiecrei soluii.
n baza rezultatelor obinute se completeaz tabelul1 i se
construiete graficul de calibrare n coordonatele: extincie (D)
concentraie (C) n g. Ca soluie de comparaie va servi apa
distilat.
93
Volumul K2Cr2O7 i concentraiile carotinei. Tabelul 1.

10 15
20 25 30 50
75
100
V
ml 2 5
K2Cr2O7
4 10 21 31
42 52 73 104 156 208
C g
D
Coninutul carotinelor (X) n mg-% se calculeaz dup

formula urmtoare:
C * 100
X=
m * 1000 ,
unde mmasa probei n g
ntrebri de control:
1. Rolul biochimic al vitaminelor grupei A i carotinelor.

2. Structura vitaminelor A1, A2, i a carotinelor.
3. Descriei principiul de separare a carotinelor prin metoda
cromatografic.
4. Cum se determin extincia soluiilor colorate la aparatul
KFK 2 ?
5.Cum se pregtesc soluiile pentru graficul de calibrare a
carotinelor ?
94

Determinarea indicilor de calitate a lipidelor
Lipidele reprezint o categorie de substane solubile n
solveni organici (cloroform, acetona, benzen, eter etilic), dar
insolubile n ap i sruri minerale.
Din punct de vedere chimic lipidele snt substane foarte
heterogene, caracterizate n general prin structura hidrofob
apolar. Lipidele au un rol plastic i energetic, particip la formarea
membranei celulare, la permeabilitatea celular i la vehicularea
diferitelor substane organice. Lipidele au funciile de termoizolare,
termogenez, aprare de leziuni mecanice, hidroizolare.
Organismul uman necesit pe zi 70-145 grame de lipide.
Schema general a clasificrii lipidelor poate fi redat
astfel:
Gliceride
Simple
Steride
Lipide (esteri ai
acizilor grai)
Ceride
Glicerolipide
Complexe
Sfingolipide
Monoterpene C10
Diterpene C20
Lipide (pe baza

izoprenei)
Politerpene C500 C25000
95
Acizii grai
Majoritatea acizilor grai separai din grsimile naturale snt

acizi monocarboxilici cu catena normal, care conin un numr par
de atomi de carbon.
Acizii grai cu catena saturat corespund urmtoarei
formule generale:
CH3(CH2)n COOH, n=230
n = 10, C12 acidul lauric (unt de laur);
n = 14, C16 acidul palmitic (majoritatea grsimilor);
n = 16, C18 acidul stearic (majoritatea grsimilor);
n = 18, C20 acidul arahic (ulei de arahide);
Acizii grai lineari nesaturai snt acizii monocarboxilici
care conin n molecula lor una sau mai multe legturi duble.
Structura acizilor grai nesaturai poate fi codificat prin cifre. De
exemplu codul 18.19 nseamn c n structura acidului oleic intr
18 atomi de carbon, este o singur legtur dubla lng C9.
12.1 9 acidul lauroleic (lapte de capr);
16.1 9 acidul palmitoleic (grsimi animale);
18.2 9, 12 acidul linoleic (n majoritatea lipidelor);
18.3 9, 12, 15 acidul linolenic (ulei de in);
18.4 5, 8, 11, 14 acidul arachidonic (lipide complexe).
Ultimii trei acizi grai constituie vitamina F, care stimuleaz
procesele de cretere la mamifere, previne dermatitele i
acumularea colesterolului n snge.
Gliceride
Gliceridele snt esteri ai acizilor grai cu glicerolul
(propantriolul).
Denumirea gliceridelor se formeaz innd seama de acizii
grai din structura lor i de poziia acestora.
CH2OCO(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3
CH OCO(CH2)14CH3
CH3OCO(CH2)16CH3
Oleopalmitostearina
96
Gliceridele de consisten lichid (uleiurile vegetale) conin

acizi grai nesaturai. Grsimile unde predomin acizii grai
saturai snt solide. Grsimile lichide se transform n solide prin
hidrogenizarea la locul legturilor duble (prepararea margarinei).
Snt mai muli indici care caracterizeaz calitatea
grsimilor. De exemplu, indicele de saponificare (Is) reflect
cantitatea legturilor esterice n molecula gliceridului i masa
molecular a acizilor grai. Indicii de saponificare al unor grsimi
alimentare snt urmtorii: unt de vaca 220 240, ulei de floarea
soarelui 186 198 (mg de KOH necesar pentru saponificarea 1 g
de grsime). Indicele de iod reflect cantitatea legturilor duble n
gliceride i se exprim n g de iod fixate de 100 g grsime. Ulei de
floarea soarelui are indicele de iod 114 135, de soia 114 140.
La aciunea luminii, la contactul cu oxigenul i cu vaporii
de ap grsimile snt supuse transformrilor degradative, cunoscute
sub denumirea de rncezire. Rincezirea poate fi hidrolitic i
oxidativ. n urma rncezirii hidrolitice se acumuleaz acizii grai
liberi, care au un miros i gust neplcut. Reaciile de oxidare duc la
formarea
a) cetonelor i b) peroxizilor, aldehidelor, aldoacizilor.
Acumularea produselor de oxidare duce la pierderea

proprietilor organoleptice i scderea valorii nutritive a
grsimilor.
Oxidarea grsimilor poate fi prevenit prin introducerea
antioxidanilor (tocoferoli, hidrochinona, derivai ai acidului galic
etc.).
97
1. Determinarea indicelui de aciditate
Indicele de aciditate se exprim n mg de KOH necesare

pentru neutralizarea acizilor grai liberi, care se conin n 100 g de
lipide.
Cantitate de acizi grai liberi n grsime nu este stabil,
fiindc depinde de tehnologia obinerii, duratei i condiiilor
pstrrii i de ali factori. Caracterizeaz prospeimea grsimilor i
se mrete cu durata pstrrii.
Determinarea se bazeaz pe neutralizarea acizilor grai
liberi n proba de grsime cu soluii alcoolice de NaOH sau KOH.
soluia saturat de NaCl;
dou baloane conice de 150- 200 cm3;
biureta de 50 cm3;
baia de ap;
1% fenolftaleina, soluie alcoolic;
0,1 n soluie alcoolic de NaOH sau KOH (4,5 g de
NaOH sau 6 g de KOH mrunim, transferm n balon, adugm
60-70 cm3 96 % alcool etilic rectificat, nchidem balonul cu dop i
lsm pe 24 ore. Soluia de hidroxid o separm de sediment prin
filtrare (prin vat de sticl sau asbest), dilum cu apa distilat pn
la concentraia necesar;
amestecul neutru de alcool i eter (1:2 raportul
volumelor).
(pentru grsimi de culoarea deschis)
n baloanele conice de 150-200 cm3 introducem 3-5 g de

grsimi analizate cu eroarea 0,01 g, adugm 50 cm3 de amestec
neutralizat de etanol i eter etilic, agitm coninutul. Dac grsimea
nu se dizolv, balonul l nclzim la baia de ap, agitnd permanent.
Rcim balonul pn la 15-20 0C, adugm 3-5 picturi de 1 %
98
soluie alcoolic de fenolftalein i agitnd permanent titrm proba

cu 0,1 n soluie alcoolic de NaOH sau KOH pn la apariia culorii
slab roz, care nu dispare timp de 30 sec.
Indicele de aciditate (mg/g grsime) se calculeaz dup
formula :
V K 5,61
Ia = b
m
unde:
Vb volumul (cm3) soluiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor grai;
K coeficientul de corecie a soluiilor bazice;
5,61 cantitatea de KOH (mg) n cm3 soluie de 0,1 n ;
m masa probei, g.
(pentru grsimi de culoare nchis)
n aceasta metod nu se utilizeaz solvent pentru grsime.
Pentru separarea fazelor se introduce soluia saturat de NaCl. La
titrare se utilizeaz 1% fenolftaleina. Dup ce toi acizii liberi se
neutralizeaz, surplusul de baz trece n soluia de NaCl i l
coloreaz n roz. NaCl inhib hidroliza grsimilor i nu permite
formarea emulsiilor stabile la titrare.
ntr-un balon de 200 cm3 introducem 10 g de grsime
(cntrite cu eroarea 0,01 g), adugm cu cilindru 50-60 cm3 soluie
saturat de NaCl i 0,5 cm3 de 1 % soluie alcoolic de
fenolftalein. Balonul l nchidem cu dop, agitm, apoi o titrm cu
0,1 n KOH. La titrarea agitm fiecare dat dup adugarea 4-5
picturi de KOH pn nu dispare culoarea stratului de jos a soluiei.
n procesul de titrare coloraia trebuie s se schimbe lent, de aceea
la finisarea titrrii agitarea o facem mai des. Titrarea se termin,
cnd n stratul de jos a srii va aprea culoarea roz stabil, care nu
dispare timp de 30 sec.
Indicele de aciditate (mg/g grsime) se calcul dup formula :
99
Ia =
Vb K 5,61
,
m
Unde:
Vb volumul (cm3) soluiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor grai
K coeficientul de corecie a soluiilor bazice
5,61 cantitatea de KOH (mg) n cm3 soluie de 0,1 n
m masa probei, g
Limitele normelor admisibile de indicele de aciditate
pentru unele uleiuri i grsimi (mg/g grsime):
Ulei de floarea soarelui
rafinat 0,4
nerafinat calitatea superioar 1,5
nerafinat calitatea I 2,25
Ulei de soia
rafinat 0,3
hidratat calitatea I 1,0
Ulei de porumb
rafinat 0,3
nerafinat 5,0
Grsimi alimentare topite:
calitatea superioar1,3
calitatea I2,2
2. Determinarea indicelui de saponificare
Indicele de saponificare Is se exprim n mg de KOH pentru
saponificarea gliceridelor i neutralizarea acizilor grai liberi ntrun gram de grsime.
Valoarea Is depinde de masa molecular a acizilor grai din
componena lipidelor. Cu ct masa molecular e mai mare, cu att
valoarea Is este mai mic. Is este mai mare la lipide cu indicele de
100
aciditate mai mare. Is la mono- i digliceride e mai mic de ct la

trigliceride. Dup Is n producere se calculeaz cantitatea de baz,
necesar pentru saponificarea grsimilor, de exemplu, la rafinarea
uleiurilorla etapa neutralizrii.
2 baloane de 250-300 cm3 cu tif;
rcitor de aer;
biureta 25 cm3;
baia de ap;
0,5 n soluie alcoolic de KOH;
0,5 n soluie de HCl;
1 % soluie de fenolftalein.
ntr-un balon de 250-300 cm3 cu tif se introduce 2-3 g (cu

precizia 0,0002 g), de grsime analizat prealabil bine amestecat
i filtrat din biuret, se adaug 25cm3 de 0,5n soluie alcoolic de
KOH i balonul se unete prin tif cu rcitorul de aer. Colba se
menine o or ntr-o baie de ap la 100 oC (la fierbere), periodic
coninutul se agit i nu se admite evaporarea alcoolului. E necesar
ca nivelul soluiei n balon s fie mai jos dect nivelul apei n baie.
Concomitent n aceleai condiii se face proba de control prin
meninerea balonului cu 25 cm3 de 0,5 n soluie alcoolic de KOH .
Soluia din balon dup terminarea saponificrii trebuie s fie
transparent, fr picturi de grsime.
Apoi coninut ambelor baloane se titreaz cu 0,5 n soluie
de KOH n prezena indicatorului (1 % soluie alcoolic de
fenolftalein pentru grsimi de culoare deschis i timolftalein,
pentru grsimi de culoare nchis) pn la dispariia culorii.
Soluia de lucru se titreaz fierbinte, puin rcit.
101
Indicele de saponificare Is (mg KOH/g ) se calculeaz dup

formula:
I = 28,05 (a-b) K
s
P
Unde:
28,05 titru 0,5g soluie de KOH, mg/cm3;
a cantitate de 0,5n soluie de HCl pentru titrarea KOH n
proba de control, cm3;
b - cantitate de 0,5n soluie de HCl pentru titrarea KOH n
proba de lucru, cm3;
K coeficientul de corecie de 0,5n soluie HCl;
P masa grsimii, g.
Devierile admisibile la probele paralele nu trebuie s fie mai
mari de 0,1mg KOH/g.
Limitele normelor admisibile de indicele de saponificare
pentru unele uleiuri i grsimi (mg/g grsime):
Ulei de floare soarelui 188-194

Ulei de soia 192-194
Ulei de cocos 242-269
Ulei de msline 185-200
Ulei de bumbac 191-200
Unt de vac 220-245
Unt de cacao 192-196
Grsime topit de vit 193-200
3. Determinarea indicelui de iod
Indicele de iod reflect cantitatea legturilor duble n

gliceride i se exprim n g de iod fixate de 100 g grsime. La
legturile duble acizii grai uor se oxideaz, ce determin
procesele de rncezire i uscare a grsimilor. Indicele de iod se
102
utileaz la calculul cantitii de hirogen pentru hidrogenizarea

lipidelor. Determinarea cantitii legturilor duble sau indicelui de
iod este bazat pe fixarea unei molecule de halogen (iod, clor,
brom) de o legtur dubl n condiii cnd halogenul nu substituie
hidrogenul. Reacia are loc dup urmtoare schem:
CH2
O- CO- (CH2)7- CH = CH- (CH2)7- CH3
CH
O - CO- R1
CH2
O - CO- R1
+ I2
I
CH2
O- CO- (CH2)7- CH - CH- (CH2)7- CH3
CH
O - CO- R1
CH2
O - CO- R2
unde R1 i R2 snt radicalii acizilor grai saturai.

Pentru determinarea indicelui de iod n industrie este
convenabil metoda lui Margoes. Aceast metod dup precizia
rezultatelor cedeaz metodelor standard, dar este mai rapid,
necesit mai puine reactive complicate i toxice, nu se cere
calificarea nalt a personalului.
Metoda este bazat pe reacia acidului gras nesaturat cu
acidul hipoiodos, care se formeaz n rezultatul interaciunii iodului
cu ap:
I2 +H2OHOI + HI
Reacia acidului gras cu acidul hipoiodos trece n modul
urmtor:
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + HOI
CH3(CH2)7CHOH CHI - (CH2)7COOH
Restul de iod se titreaz cu tiosulfat de sodiu.
sticl de ceas;
pharul chimic;
baie de ap;
103

ceaca Petri;
cilindru de 200 cm3;
biureta 25 cm3;
etanol 96 %;
soluia alcoolic de iod (25 g de iod cristalin n dm3

de 96 % etanol);
0,1 n tiosulfat de sodiu Na2S2O3;
1 % soluie de amidon.
Pe o sticl de ceas, prealabil cntrit cu eroarea 0, 0002 g,
se introduc 3-5 picturi de grsime analizat i se cntrete, sticla
cu grsime se plaseaz ntr-un pahar chimic i se adaug 100 de
volume de 96 % etanol: E de dorit ca masa grsimii s fie ntre 0,20,3 g, atunci cantitatea de alcool adugata va fi 20-30cm3.Pentru
dizolvarea mai bun amestecul nclzete n baia de apa la
temperatura 45-50o C, permanent agitnd coninutul pharului pn
la dispariia picturilor de grsime. Pharul trebuie s fie acoperit
cu ceaca Petri, apoi n phar din biuret se adaug 20 cm3 de
soluie alcoolic de iod i cu cilindrul 200 cm3 de ap distilat. La
adugarea apei amestecul permanent se agit cu bagheta de sticl,
apoi pharul se acoper i se las pe 5 minute, dup ce surplusul de
iod se titreaz cu 0,1n soluie de Na2S2O3 n prezena soluiei de
amidon, de 1%.
Paralel, n aceleai condiii, se face proba de control (fr
grsime).
Indicele de iod (g de iod la 100 g de grsime) se calculeaz
dup formul :
(a-b) x K x 100 x 0,01269
Indicele de iod =
P
unde a cantitatea de 0,1 n soluie de Na2S2O3 pentru
titrarea probei de control, cm3;
b cantitatea de 0,1 n soluie de Na2S2O3 pentru titrarea
probei de lucru, cm3;
K coeficientul de corecie a 0,1 n soluie Na2S2O3;
104
0,011269 cantitatea de iod, care corespunde 1 cm3 0,1 n

soluie Na2S2O3, g;
P masa grsimii, g.
105

Determinarea substanelor aromatice n pine i alte produse de
panificaie
Mirosul este un indice organoleptic important al calitii

pinii. Aroma pinei ntr-o mare msur caracterizeaz calitatea i
prospeimea ei. Cea mai intensiv este aroma pinii calde, la rcire
i pstrare aroma suficient scade.
n formarea aromei pinii particip aproape 300 de substane
care reprezint alcooli, fenoli, aldehide, cetone, acizi, lactone,
compui cu sulf, esteri, amine. Toate acestea substane se afl n
pine n cantiti foarte mici.
Complexul substanelor aromatice se formeaz la toate
etapele pregtirii aluatului. n procesul formrii aluatului crete
coninutul alcoolilor , acizilor organici, esterilor, substanelor
carbonilice. Important este prezena n aluat nainte de coacere a
glucidelor reductoare i produilor hidrolizei proteinelor
peptidelor i aminoacizilor. Finalizarea proceselor formrii aromei
are loc anume la coacere, cnd se formeaz melanoidinele cu un
miros specific i alte substane aromatice.
Determinarea aromei pinii este prevzut de standarde ntrun ir de indice de apreciere organoleptic a calitii produselor de
panificaie.
Substanele carbonilice cantitativ prezint aproape o treime
din toate substanele aromei pinii.
Coninutul substanelor carbonilice n miezul pinii de
secar i de gru-secar 6,8 - 28,9 cm3 0,1 n soluie de iod la 100g
substanelor uscate, n miezul pinii de gru 5,4 28. n coaja
pinii de secar i de gru-secar 43,6-162,7, n coaja pinii de
gru 20,4-108,2 cm3 0,1 n soluie de iod la 100g substanelor
uscate.
106
Principiul metodei
Metoda se bazeaz pe interaciunea substanelor carbonilice
cu bisulfit de sodiu NaHSO3. Determinarea constituie din
urmtoarele etape:
reacia formrii compuilor bisulfitcarbonilici;
eliminarea surplusului de NaHSO3;
scindarea compuilor bisulfitcarbonilici;
determinarea cantitativ a NaHSO3 eliminat, care este
echivalent cu coninutul substanelor carbonilici.
Coninutul substanelor carbonilice se exprim n cm3 0,1 n
soluie de iod pentru titrarea bisulfitului de sodiu, legat cu
substanele carbonilice din 100 g de pine uscat.
0,15 % soluie de NaHSO3 (0,75 g de NaHSO3
nehidratat se dizolv n 400 cm3 de ap, se aciduleaz cu 2 n acid
acetic n prezena 3-5 picturi de indicator metilrot pn la culoarea
roz, apoi volumul se aduce pn la 500 cm3);
soluie-tampon pH -8,3 (30 g de acid boric i 5 g de
NaOH se dizolv n 1000 cm3 de ap distilat).
Proba de pine cu masa de 10 g (eroarea 0,01 g) se
mrunete n mojar cu soluia 0,15 % de NaHSO3. Suspensia se
transfer cantitativ n balonul cotat de 100 cm3, se aduce pn la
cot cu soluia de bisulfit de sodiu, se agit 10 min, se las pentru
decantare 10 min i se filtreaz ntr-un balon uscat.
ntr-un balon conic de 150 cm3 introduc cu pipeta 10 cm3 de
filtrat, la analiza soluiilor intens colorate se ia 10 cm3 de filtrat i
10 cm3 de ap distilat. Surplusul de bisulfit de sodiu se titreaz cu
0,1 n soluie de iod n prezena indicatorului (1 cm3 de 0,1 % soluie
de amidon) pn la culoarea violet-albastr slab. Dac a fost
adugat mai mult iod, el se titreaz cu 0,01 n soluie de tiosulfat de
sodiu Na2S2O3.
107
Pentru scindarea compuilor bisulfitcarbonilici se utilizeaz

soluie-tampon, care permite de a aduce pH mediului pn la 8,3.
Titrarea bisulfitului de sodiu eliminat se face n dou etape:
Titrarea de orientare
Titrarea principal
Titrarea de orientare. n balonul conic dup ndeprtarea
excesului de bisulfit de sodiu se adaug 15 cm3 de soluie-tampon
i n acelai moment ncep titrarea din microbiuret a bisulfitului
eliminat cu 0,01 n soluie de iod pn la apariia culorii violetalbastr, care nu dispare 15 s. Se noteaz volumul titratului.
Titrarea principal. n balonul conic dup ndeprtarea
excesului de bisulfit de sodiu se adaug 90 % de volum soluie de
0,01 n iod, care s-a utilizat pentru titrarea de orientare, apoi 15 cm3
de soluie-tampon i termin titrarea cu 0,01 n soluie de iod.
Coninutului substanelor carbonilice se calculeaz dup
urmtoare formul:
,
unde :
X coninutul substanelor carbonilice n cm3/100 g;
K - coeficientul de corecie a soluiei de iod;
V - volumul de 0,01 n soluie de iod pentru titrarea
principal a 10 cm3 de filtrat, cm3;
10 coeficientul de recalculare la 0,1 n soluie de iod;
W % de umiditate n pine.
108
PRELUCRAREA STATISTIC
A DATELOR EXPERIMENTALE
Pentru prelucrarea statistic a datelor experimentale se

ndeplinesc urmtoarele calcule:
se efectueaz un numr dat de determinri paralele

(n)
se determin valoarea medie
se gsete devierea (abaterea)
se calculeaz devierea standard:
se determin devierea standard relativ:

Sr = S/x
se calculeaz dispersia:
2
V=S
se determin limita de certitudine a mediei
x , sau x S t
Toate rezultatele prelucrrii statistice se introduc n tab.1.
Tabelul 1. Rezultatele finale ale prelucrrii statistice.
n
x
S
Sr
V
x
Calcularea indicilor statistice

Valoarea medie. Dac n rezultatul dozrilor directe nu se
cunosc erori grave i sistematice, se obine un numr destul de
mare de msurri i rezultate, valoarea cea mai probabil a
109
parametrului, care se determin trebuie luat ca media aritmetic,

obinut dint-un ir de msurri. Ea se noteaz prin simbolul x:
x = (x1 + x2 + x3 + ... + xn)/n = x/n ,
Unde n este numrul de msurri.
Devierea (abaterea). Este diferena dintre variant i
valoarea medie. Ea se noteaz prin litera "d":
d = (xi-x).
Devierea "d" se caracterizeaz prin: d = 0
Devierea standard. Msurrile separate sau rezultatele
analizei snt dispersate fa de valoarea medie. Pentru caracteristica
statistic a acestei dispersri se folosete devierea standard:
d2
S=
k
unde k este numrul gradelor de libertate, egal cu n-1
Devierea standard relativ. Sr este egal cu devierea
standard, mprii la valoarea medie
Sr = S/x
Dispersia. Devierea standard la ptrat se numete dispersie
V= S2. Cu ct e mai mic dispersia cu att e mai mic mprtierea
datelor i e mai corect analiza.
S=
d2
n(n 1)
Limita de certitudine a mediei - . ntruct determinarea

valorii reale a parametrului msurat este imposibil, ne mrginim
cu determinarea limitelor n care ea se include x .
. se calculeaz dup formul :

. = S t , unde t este parametru
Stiudent pentru
probabilitatea =0,95.
Dac d > 2S, atunci acest rezultat se exclude din rndul
variantei, supuse prelucrrii statistice la probabilitatea admis.
110
BIBLIOGRAFIE
1. .. . .;
: 1981.
2. .. .-.; :
1986.
3. . . .. .;
: 1986.
4. Kucerenco N.E., Babeniuk Iu.D. . a. Biochimie. - Chiinu;
Universitas: 1993.
5. G. Neamu Biochimie alimentar. Bucureti: Editura Cere:
1997.
6. R. Segal R. Biochimia. Galai; Universitatea "Dunre de
Jos": 1992.
7.
. ..
-.; : 1991.
8. ., ., .
.-.; :
1975.
111
CONINUTUL
ORGANIZAREA I METODICA EFECTUARII LUCRRILOR DE
LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECIRITATE PENTRU
LABORATORUL DE BIOCHIMIE.............................. ..3
Lucrarea 1. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL N PRODUSE
VEGETALE(DUP METODA KJELDAHL)..........................................6
Lucrarea 2. DETERMINAREA POTENIOMETRIC A
DERIVAILOR FORMOLICI A AMINOACIZILOR......................14
Lucrarea 3. DETERMINAREA AMONIACULUI DUP METODA
CONWEI I BAIRN................................................................................21
Lucrarea 4. DETERMINAREA PROTEINELOR N VIN DUP
METODA LOURI....................................................................................26
Lucrarea 5. REACIILE DE CULOARE A
PROTEINELOR.......................................................................................30
Lucrarea 6. DETERMINAREA FORMEI REDUSE A
GLUTATIONULUI (N LEVURI SAU GERMENII
CEREALELOR)......................................................................................36
Lucrarea 7. DETERMINAREA ACTIVITII INVERTAZEI N
VINURI, SUCURI..................................................................................40
Lucrarea 8. DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMEI
POLIIFENOLOXIDAZA.........................................................................50
Lucrarea 9. DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMEI
LACAZA..................................................................................................56
Lucrarea 10. DETERMINAREA ACTIVITII CATALAZEI
DUP A. BAH I A.OPARIN.................................................................64
Lucrarea 11. DETERMINAREA PRII DE MAS A
AMIDONULUI........................................................................................70
Lucrarea 12. DETERMINAREA FOTOCOLORIMETRIC A
VITAMINEI C.........................................................................................77
Lucrarea 13. METODA CROMATOGRAFIC DE
DETERMINARE A CAROTENILOR ..................................................87
Lucrarea 14. DETERMINAREA INDICILOR DE CALITATE A
LIPIDELOR.............................................................................................95
Lucrarea 15. DETERMINAREA SUBSTANELOR AROMATICE
N PINE I ALTE PRODUSE DE
PANIFICAIE.......................................................................................106
PRELUCRAREA STATISTIC A DATELOR
EXPERIMENTALE.............................................................................109
112
UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI
BIOCHIMIE
ndrumar de laborator
Chiinu
2007
113

Biochimie DS

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biochimie DS

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Digitally signed by

UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

ndrumarul este destinat studenilor anilor 2(U) i 3(U) a

Elaborare: conf.univ., dr. Liudmila Palamarciuc

Bun de tipar 23.05.07.

ORGANIZAREA I METODICA EFECTUARII LUCRRILOR

Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie i

substanele date se in ct mai departe de foc i de

nu se admite pstrarea lor n vase de sticl subire i

nu se admite pstrarea reactivelor n cantiti mari pe

se interzice de turnat aceti dizolvani aproape de foc

se interzice de turnat reactivele date n chiuvet;

dac au fost vrsate cantiti mari de substane

10. n laborator nu se mnnc nici nu se bea din vesela

Lucrarea de laborator nr. 1

Proteinele formeaz aceste structuri datorit celor cinci tipuri de

molecular este joas (pn la 12 000). Nu conin sulf, se gsesc n

formeaz hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetic a

Aparate, vase i materiale:

sulfat de cupru (cristale), CuSO4;

Figura 1. Aparatul Kjeldahl

Metoda determinrii azotului total n produse lichide

Cantitatea de azot (X) n mg/dm3 n produsul analizat se

(a-b) * K * 0,28 * 1000

Lucrarea de laborator nr. 2

5) RCHCOOH + NaOH RCHCOONa + H2O

6) RCHCOOH + HOC2H5 RCHCOOC2H5 + H2O

n rezultatul ultimii reacii aminoacizii din stare solid se

Reacia cu ninhidrin are o mare importan pentru

Prin nclzirea rapid a unui amestec de aminoacizi se

Prin aceasta aminogrupele i pierd proprietile bazice, iar

Se consider convenional, c numrul grupelor carboxilice

Totodat se titreaz i acizii organici (tartric, acetic, malic,

5. Biureta se aduce la zero cu baz (volumul de NaOH

1. Descriei nsemntatea analizei i principiul metodei.

Lucrarea de laborator nr. 3.

Amoniacul n organismul vegetal se formeaz ca rezultat al

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4

Amoniacul fixat sub form de amide (asparagin i

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH

Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub form de uree

K2CO3 + H2O = KHCO3 + KOH

Aparate, vase i materiale:

Se dozeaz 5 cm3 soluie 0,02n H2SO4 n camera intern (1)

Experiena se repet n 2 ceti Conwei. Paralel se face proba

(Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000

Lucrarea de laborator nr. 4

Unele din caracteristicile importante ale proteinelor snt:

Precipitaia ireversibil are loc, cnd proteinele formeaz

Deoarece n reacie intr i ali aminoacizi, intensitatea culorii este

Ordinea ndeplinirii lucrrii

1. Caracteristica general a proteinelor.

Lucrarea de laborator nr. 5

S-a stabilit c proteinele datorit aminoacizilor formeaz

soluie de albu de ou, (albuul unui ou se separ de

Reacia biuretic. Aceast reacie este caracteristic

un sector din catena

Ordinea ndeplinirii lucrrii

Ordinea ndeplinirii lucrrii

Dup schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele n care

Reacia sulfhidrilic. La nclzirea soluiilor proteice

Cu plumb sulfura de sodiu formeaz un sediment PbS.

glioxilic (n form de impuriti n acidul acetic glacial) n prezena