Tehnologia vitaminei B12

Catalina Elena

Studenta: Cobilita
Grupa 2302 B

Tehnologia vitaminei B12

Vitaminele sunt substane fiziologic active necesare organismului n cantiti foarte mici. Carena lor
genereaz avitaminoz, boal ce se manifest prin tulburri caracteristice.
Vitaminele acioneaz n organism n calitate de coenzime drept reactani a unor procese chimice ale
metabolismului. Ele nu pot fi sintetizate de organismul animal ci numai de plante i de anumite
microorganisme.
Vitaminele se clasific n funcie de solubilitate n dou grupe:
o Vitamine liposolubile: vitaminele A, D, E, K.
o Vitamine hidrosolubile: vitaminele complexului B, vitamina C.
Vitaminele hidrosolubile obinute prin biosintez sunt: vitamina B2 i B12, iar procedee mixte de sintez i
biosintez sunt aplicate la obinerea vitaminei C.
Avantajele economice oferite de biosintez fac ca aceasta s fie tot mai mult utilizat pentru obinerea
vitaminelor hidrosolubile.
Un mare numr de vitamine din grupa B sunt sintetizate de microorganisme i sunt factori eseniali de
cretere ai acestora. Acestea se pot acumula endo i exocelular. Determinarea lor n biomas i n lichidul de
cultur, la dezvoltarea microorganismului Propionibacterium technicum pe un mediu sintetic suplimentat cu
tiamina i acid pantotenic, indic valori apreciabile (tabelul 7).
Vitamina B12 (Cianocobalamina)
Cobalaminele sau cobamidele sunt vitamine din complexul B cunoscute sub denumirea de vitamina B 12.
Ele au structura asemntoare hemoglobinei, format dintr-un macrociclu porfirinic centrat pe un atom de
cobalt, de care se leag o grupare de tip adenozinic i o grupare cian pentru cianocobalamin sau hidroxi pentru
hidroxicobalamin. Ciancobalamina i hidroxicobalamina sunt cele dou forme stabile folosite ca medicament.
Vitamina B12 a fost izolat n stare pur n 1948 de Folkers Smith i Parker din ficat i de Rickes din
culturile diferitelor tulpini.
Este o substan cristalin de culoare roie, puin solubil n ap, etanol i insolubil n general n toi
solvenii nepolari: benzen, eter, etc.
Structura vitaminei B12 a fost stabilit printr-un efort comun al cercettorilor din domeniul chimiei
organice i analizei fizico-chimice. Un aport deosebit l-a adus difracia cu raze X efectuat de CrowfootHodgkin n 1955.
Vitamina B12 deriv de la un sistem macrociclic numit corin care conine patru atomi de azot inclui n
cele patru nuclee pirolice (notate A,B,C,D).
Derivaii acestui sistem macrociclic se numesc corinoide. Ele sunt derivai ai unui acid heptacarboxilic
numit acid cobirinic.

H2C H2C
HOOC
HOOC H2C

HOOC
HOOC

H3C
H3C
H
H2C

H2C

H
H2C

CH3 CH3

H
A
N

CH3

COOH

CH2

CH2

COOH

H
H

Co 2
N
N

CH3

CH2

CH3
CH3
CH2 CH2 COOH

Acid cobirinic

n vitamina B12 ase din carboxilii acidului cobirinic sunt amidificai ca grupe CONH 2, iar al aptelea
este amidificat cu grupa -NH2 din D(-) 1-amino-2-propanol. Grupa OH din acest alcool este esterificat cu

acidul fosforic care se leag i de N-glicozida 5,6-dimetil-benzimidazolului. Al doilea atom de azot al inelului
imidazolic este coordinat de ionul de Co3+, tricovalent, cu un numr de coordinaie ase. Ionul de Co 3+ din
centrul ciclului corinic se leag de o grupare -CN, de un atom de azot din nucleul pirolic (nucleul D), iar a treia
sarcin este satisfcut de restul de ester fosforic din poriunea nucleotidic I a moleculei.

H2N
II

H2N

H3C
H3C
H
OC H2C

OC

H2C

CH3 CH
3

OC H2C H2C
H2N OC H2C

CH2

A4 L
B 8
N 9
N
21
22
10
Co 23
24
N
N
19
11
C 12
18 D16
2

H
H2C

CH2

17

15

CH3

NH

14

13

CH3

CONH2
CH2

CONH2

H
H
CH3
CH3
CH2 CH2 CONH2

CH2
H3C
I

CH
O O
P
O
O

N
2

OH

4'
5'

4
7

CH3
5
6

CH3

2'

3'

HOCH2

1'

L=CN, vitamina B12(cianocobalamina)

L=OH, hidroxicobalamina

Deci molecula vitaminei B12 este format din dou poriuni: I partea nucleotidic coninnd restul 5,6dimetil-benzimidazol, riboz i acid fosforic i poriunea II ce conine sistemul macrociclic i ionul de cobalt.
Sursele principale de vitamin B12 sunt:
o endogene - vitamina B12 se sintetizeaz de ctre bacteriile intestinale ale rumegtoarelor;
o exogene - prin aport alimentar de proteine animale. Vitamina B 12 se gsete n ficatul animalelor, n
nmolul activ al staiilor de epurare i n culturi microbiene.
Din ficatul animalelor separarea se face prin tratare cu cianur alcalin sau acid clorhidric, dup care
concentratul este supus aciunii fermenilor digestivi sau a pepsinei i adsorbie pe crbune activ. De pe crbune
vitamina B12 se elueaz cu alcooli alifatici i din soluia alcoolic se extrage cu solveni organici, se reextrage
cu ap i se purific prin cromatografie.
Utilizarea nmolului activ de la staiile de epurare a apelor reziduale este o surs pentru obinerea
vitaminei B12 furajere.
Culturile microbiene constituie principala surs economic de obinere la scar industrial a vitaminei B12.
Din produsele naturale au fost izolate mai multe substane cu structur puin diferit de cea a
cianocobalaminei.
Astfel, n locul 5,6-dimetilbenzimidazolului, factorul A conine un rest de 2-metiladenin, provitamina B 12
conine un rest de adenin, factorul G un rest de -hipoxantin, factorul H un rest de 2-metilhipoxantin.
Factorul B nu are 5,6-dimetilbenzimidazol, n factorul V1a (sau acidul cobirinic) apare doar macrociclul
substituit, dar ca acid liber n poziia 17, factorul WR este un complex al vitaminei cu o protein.
Din seria analogilor de semisintez amintim B 12r - conine cobalt bivalent; B12s - are cobalt monovalent (se
obine prin reducerea vitaminei B12 n mediu acid sau bazic); aquacobalamina-conine n locul grupei CN o
molecul H2O; hidroxicobalamina - conine n locul grupei CN o grupare OH. Aquacobalamina se obine din
surse naturale n absena ionilor CN, de asemenea se obine prin reducerea sau fotoliza vitaminei B 12 (B12a are
drept ligand central apa, B12b - grupa hidroxil, B12 c- ionul nitrit,etc.).

Cunoaterea mecanismului de biosintez a vitaminei B12 prezint o importan foarte mare pentru
stabilirea condiiilor optime de realizare a procesului de fermentaie. n mecanismul de biosintez a vitaminei
B12 se disting dou etape fundamentale:
a. formarea ciclului corinic;
b. ncorporarea restului nucleotidic.
Procesul simplificat al mecanismului de biosintez este prezentat n schema 28.
Vitamina B12 este produsul de metabolizare al unor actinomicete: Streptomyces grizeus, S. olivaceus, S.
aureofaciens sau a unor bacterii: Bacillus megaterium, Propionibacterium freudenreichii, P. shermani,
P.technicum.
HOOC-CH2-CH2-O-S-Enz.
succinil coenzima A

H2N-CH2-COOH
glicina

- Enz.-SH

HOOC-CH2-CH2-CO-CH-COOH
|
NH2
acid alfa-amino-beta-ceto-adipic

- CO2

HOOC-CH2-CH2-CO-CH2-NH2
acid delta-amino-levulinic

HOOC-CH2-CH2-C=O
|
CH2-NH2
acid delta-amino-levulinic

CH2-CH2-COOH
|
O = C-CH2-NH2

HOOC-H2C-H2CNH

CH2 NH2

Porfobilinogen

acid delta-amino-levulinic

cianicobalamina

CH2 COOH

factorul B

acid cobirinic

Schema 28
Tehnologia obinerii vitaminei B12
Fabricarea industrial a vitaminei B12 prin biosintez cuprinde urmtoarele faze: sterilizarea aerului i
mediului de cultur, fermentaia, separarea, purificarea i cristalizarea vitaminei B12.
Se utilizeaz n practic S olivaceus, P. shermanii, P. freudenreichii i P. technicum. Procesul de biosintez
este influenat de temperatur, pH, compoziia mediului de cultur, gradul de aerare, precursori i modul de
sterilizare a mediului de cultur.
Se utilizeaz un mediu de cultur bogat n aminoacizi eseniali, sruri de cobalt, dimetilbenzimidazol,
zaharuri. Biosinteza are loc la 30oC, n condiii de aerare minim i la pH 6,8-7 i dureaz aproximativ 70-120
de ore, pn la epuizarea surselor de carbon.
Se lucreaz cu glucoz sau zaharoz (sursa de carbon i energie), extract de porumb sau fin de soia n
cantiti mari (sursa de azot), autolizat de drojdii sau hidrolizat de cazein. Creterea biomasei este stimulat de
biotin i de anumii aminoacizi: glicin, serin, valin, acid aspartic. Introducerea clorurii de cobalt se face de
la nceputul procesului, iar benzimidazolul se introduce dup 50-60 de ore.
n faza de inocul i prefermentare are loc creterea biomasei i formarea acidului aminolevulinic. n
absena ionilor Co2+ se formeaz n mediul de cultur porfirine, iar la concentraii suficiente de Co 2+, acidul
aminolevulinic nu mai trece n mediu, ci se transform n acid cobirinic n interiorul celulelor.
Cobalamina este coninut n biomas. Dup coagularea termic, cu electrolit sau bazic, se filtreaz
amestecul de fermentaie i se obine un prim concentrat din biomas. n biomasa uscat de P. shermanii,
concentraia vitaminei ajunge la 1500 /g n condiiile fermentrii aerobe i 2500 /g n fermentaii anaerobe.
Biomasa filtrat se trateaz la 90-95oC cu acid azotos, cnd se pune n libertate aquacobalamina i
hidroxicobalamina din complecii proteici ce le conin.
Vitamina eliberat se transform, sub aciunea acidului azotos obinut n vasul 1 dintr-o soluie de azotit
de sodiu 0,5% i acid clorhidric adugat din dozatorul 2, n nitrozocobalamin, mai stabil. Se filtreaz pe un

filtru pres 3, se spal pe filtru cu ap cald (85-95oC). Dup reunirea filtratului cu apa de splare se salefiaz n
vasul 4 cu NaCl i se filtreaz din nou, apoi se trimite la extracie (figura 25).
Pentru izolarea vitaminei B12 se folosete cel mai mult metoda extraciei selective. Din faza apoas se
extrage aqua i hidroxicobalamina cu un amestec butanol:fenol = 1:1. Extractul organic ce conine vitamina B 12
se trateaz cu ap (raport 20:1) cnd vitamina se reextrage din solvent n ap. Soluia apoas obinut dup
separarea fazelor, se trateaz cu NaCN la pH 7,5-8 cnd are loc obinerea ciancobalaminei care se supune
purificrii.
Purificarea const n extracie cu solvent organic i cromatografiere. Se extrage cu amestec de crezol-CCl 4
din soluia rezultat de la cianurare, apoi se adaug un amestec de butanol-CCl 4 pentru modificarea polaritii
extractului i se reextrage cu ap distilat. Se obine un concentrat de peste 10.000 /ml. Acesta se concentreaz
sub vid, cnd cristalizeaz amestecul de vitamine brute, sau se aplic o cromatografie preparativ pe coloane de
Al2O3 parial activat, silicagel activat. Eluarea se face cu aceton, amestec aceton-fenol sau aceton-ap.
La rece cristalizeaz ciancobalamina. O purificare suplimentar se poate face prin recristalizare din ap
deionizat. Concentrarea succesiv de la 25 /ml la sfritul biosintezei la 5.000-10.000 /ml dup
cromatografie, face ca o bun parte din operaii s se execute la nivel de laborator. arjele industriale de
vitamina B12 sunt de 5-50 g.
Izolarea i purificarea vitaminei B12 este ilustrat n urmtoarea schem a operaiilor :

HCl
2
masa bacteriana
NaNO2

apa

4
NaCl

spre
extractie
Figura 25. Extracia n ap a vitaminei B12 din masa bacterian
1-reactor, 2-dozator HCl, 3-filtru pres, 4-vas de salefiere
Vitamina B12 este un factor indispensabil creterii organismelor tinere i un medicament foarte bun n
tratamentul anemiei pernicioase.
Este esenial pentru replicarea ADN-ului. Ea intervine n creterea i maturarea celular, fenomen
evident mai ales la nivelul hematiilor i a altor celule cu proliferare intens.
Avitaminoza B12 se manifest prin anemie megaloblastic i prin leziuni neurologice caracteristice.