II.

STUDIUL CINETICII REACIILOR ENZIMATICE

II.1. Principii generale de determinare a activitii enzimelor
Orice lucrare practic de enzimologie trebuie s nceap cu aprofundarea metodelor de determinare a activitii enzimei respective i stabilirea condiiilor
care s asigure viteza maxim de reacie. Spre deosebire de majoritatea celorlali
compui biochimici, cantitatea unei enzime nu poate fi msurat, cu unele excepii,
n valori absolute, adic n mg sau moli de enzim. De aceea, cantitatea unei enzime se estimeaz indirect, n funcie de activitatea ei sau, altfel spus, n funcie de
viteza reaciei catalizat de enzima respectiv.
Activitatea catalitic a enzimelor se poate evalua n mod diferit: fie dup viteza de acumulare a produilor reaciei enzimatice date, fie dup viteza de
epuizare (diminuare) a substratelor i cofactorilor ntr-un interval de timp dat.
Se recomand ca activitatea catalitic a enzimelor s se determine n
funcie de viteza iniial de reacie deoarece n acest interval de timp exist un exces de substrat, iar produii de reacie nu s-au acumulat nc n cantiti prea mari.
Mai exact, este de dorit ca determinarea activitii enzimelor s se efectueze n
condiiile n care cantitatea de substrat transformat s nu depeasc 20% din cea
iniial.

D. C. Cojocaru Enzimologie practic

12

_____________________________________________________________________________________________________

S-a constatat experimental c n aceste condiii exist o dependen liniar (de tipul y = ax sau y = ax + b) ntre cantitatea de substrat transformat i
timpul de incubare.
Pentru determinarea activitii enzimelor se pot utiliza, n funcie de
tipul reaciei catalizate, metodele colorimetrice, spectrofotometrice, fluorimetrice,
manometrice, conductimetrice, vscozimetrice, cromatografice, electroforetice etc.
n laboratoarele clinice, de cercetare sau industriale cu profil de biochimie se utilizeaz cel mai adesea metodele colorimetrice i spectrofotometrice de analiz.
Metodele colorimetrice se bazeaz pe msurarea intensitii culorii substanei ce se formeaz prin interaciunea substratului sau a produsului de reacie cu
un reactiv specific care se adaug n prob dup stoparea reaciei enzimatice.
La baza metodelor spectrofotometrice de analiz se afl absorbia luminii n domenii determinate ale spectrului, de ctre substratele sau produii de
reacie, uneori de ctre cofactorii enzimelor bicomponente. Spectrele acestor
substane pot avea maximele de absorbie la o lungime de und determinat, att n
domeniul ultraviolet ct i n cel vizibil sau infrarou.
Pentru eliminarea factorilor de eroare, la determinarea activitii unei
enzime este necesar s se efectueze, pe lng proba propriu-zis (proba de cercetat
sau proba cu enzim activ) i un martor n care enzima se inactiveaz n prealabil
prin fierbere sau prin modificarea puternic a pH-ului. Acest martor este absolut
necesar deoarece, n unele cazuri, pot avea loc modificri spontane ale substratului,
necorelate direct cu activitatea catalitic a enzimei. Exprimarea activitii enzimelor, indiferent de metoda folosit la determinarea acesteia, se poate face n mai
multe moduri:
- unitatea internaional a activitii enzimatice se definete ca fiind
cantitatea de enzim ce poate modifica un micromol de substrat ntr-un minut n
condiii standard de reacie.

D. C. Cojocaru Enzimologie practic

13

_____________________________________________________________________________________________________

- activitatea specific este egal cu masa enzimei exprimat n miligrame ce poate transforma un micromol de substrat ntr-un minut n condiii standard i se exprim n micromol/min mg protein. n acelai timp, activitatea specific este i o msur a puritii enzimei, ea crete n timpul purificrii i devine
maxim i constant atunci cnd enzima este n stare pur.
- activitatea molar sau molecular, numit i numr de turnover, reprezint numrul de molecule de substrat transformate ntr-un minut de ctre o singur molecul de enzim, cnd acesta reprezint factorul limitant al vitezei. Activitatea molecular a unei enzime cu un singur centru activ poate fi calculat din valoarea Vmax i din masa sa molecular.
O nou unitate de activitate enzimatic recomandat de Comisia de
Enzimologie este katal-ul (prescurtat kat), definit ca fiind acea cantitate de enzim ce transform un mol de substrat ntr-o secund n condiii standard de reacie. n funcie de viteza de reacie, se pot folosi multiplii i submultiplii ( de exemplu microkatali, nanokatali etc.).
Dei metodele de determinare a activitii catalitice difer foarte mult
de la o enzim la alta, exist unele principii comune i unele manevre experimentale ce se respect n toate cazurile. Astfel, pentru determinarea practic a activitii
oricrei enzime se va realiza ntotdeauna o prob de analizat i un martor n care
mediul de reacie are, n final, aceeai compoziie. Singura diferen const n faptul c n prob enzima acioneaz asupra substratului transformndu-l, iar n martor,
printr-o modalitate sau alta, se face n aa fel nct enzima s nu acioneze asupra
substratului.
Deoarece viteza de reacie se raporteaz ntotdeauna la unitatea de timp
este necesar ca procesul catalitic s se desfoare ntr-un interval de timp bine determinat. Pentru aceasta se cronometreaz timpul de reacie din momentul n care
enzima intr n contact cu substratul, iar stoparea reaciei se face de regul prin
modificarea brusc a pH-ului mediului de incubare.

D. C. Cojocaru Enzimologie practic

14

_____________________________________________________________________________________________________

n unele metode colorimetrice de analiz reactivul de culoare folosit

pentru dozarea produsului de reacie sau a substratului rmas netransformat poate
fi, n acelai timp i un factor ce stopeaz procesul biocatalitic (de exemplu, soluia
de dinitrofenilhidrazin folosit ca reactiv de culoare n determinarea activitii
aminotransferazelor).
Unii factori de mediu (temperatura, pH-ul, presiunea osmotic etc.),
manifest o puternic influen asupra vitezei reaciilor enzimatice. Din aceast
cauz, n mediul de incubare trebuie s se realizeze condiiile optime de reacie,
condiii care s se apropie ct mai mult de condiiile naturale n care enzima respectiv acioneaz in vivo. Pe de alt parte, viteza unei reacii enzimatice se modific
n funcie de concentraia enzimei, concentraia substratului, natura i concentraia
soluiei tampon etc.

II.1.1. Influena concentraiei enzimei asupra vitezei de reacie

Viteza reaciei enzimatice depinde, nainte de toate, de natura enzimei
(care poate fi caracterizat printr-o activitate crescut sau sczut). Cnd substratul
i efectorii se afl n exces, viteza iniial a reaciei enzimatice este proporional
cu concentraia enzimei:

v = k [ E]
unde:
v - viteza reaciei enzimatice;
k - constanta de vitez;
[E]- concentraia enzimei.
Reprezentarea grafic a dependenei dintre viteza de reacie i concentraia enzimei n sistemul de axe rectangulare se prezint sub forma unei drepte
pentru concentraii mici de enzim.