2.4.

Enzime imobilizate Principiul general al procedeelor de imobilizare a enzimelor const n legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem multienzimatic de suportul insolubil n ap, n condiiile pstrrii proprietilor catalitice, respectiv specificitatea de aciune i posibilitatea de a aciona la pH i temperatur asemntoare enzimelor libere (neimobilizate). Suporturile sau matricile utilizate n imobilizarea enzimelor pot fi de natur anorganic: silicea coloidal, caolinita, particule sau perle de sticl cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu, oxid de titan, etc.), i de natur organic: celuloza i derivaii acesteia, agaroz, amidon, dextran, colagen, polimeri obinui prin polimerizarea unor monomeri de tipul acrilamid, acid metacrilic .a., rini formaldehidice etc. In funcie de natura legturilor care se stabilesc ntre enzime i suportul de imobilizare, procedeul sau metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legturilor fizice ca de exemplu, interaciuni electrostatice, formarea de legaturi ionice, formarea de legturi de hidrogen, interaciuni protein-protein etc., difereniindu-se n acest sens (Figura 5): - adsorbia pe suporturi insolubile n ap (crbune, clei, rini schimbtoare de ioni, celuloz, sticl etc); - includerea n structuri macromoleculare (aceast incluziune se realizeaz prin polimerizarea unor materiale ca poliacrilamid n silicagel, amidon, n prezena moleculelor de enzim, astfel nct se formeaz o matrice de polimer n care sunt incluse moleculele de enzim i n care att substratul ct i produsul poate s difuzeze); - microncapsulare n membrane semipermeabile; - imobilizarea n celule de ultrafiltrare.

Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor se refer la cele care conduc la formarea de legturi covalente sau parial covalente, ntre gruprile funcionale, care ns nu sunt eseniale pentru manifestarea activitii catalitice (nu sunt implicate n situsul catalitic al enzimei), i un suport activat chimic, insolubil n ap. In cadrul acestor procedee se pot evidenia (fig. 6): - legarea covalent a enzimelor de suporturi insolubile, care posed grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice; - copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv i legarea ncruciat (cross-linking) sau reticulare intra- i intermolecular a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncional. 1

La imobilizarea enzimelor trebuie s se aib n vedere urmtoarele: conformaia spaial a moleculelor de enzim n sistemul imobilizat este diferit de cea a mediului natural din care s-a extras enzim. Pe de alt parte, structura tridimensional a moleculei de enzim este distorsionat de legturile sale cu suportul; micromediul moleculei de enzim imobilizat este diferit de cel al enzimei aflate n soluie, afectndu-se viteza de difuzie a substratului i a produilor de reacie. Inhibiia de substrat i de produs poate, de asemenea juca un rol important; procesul de transport al substanelor este un proces pasiv, n comparaie cu situaia enzimei din celula vie, iar aceasta va avea desigur influen i asupra vitezei de reacie. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoac schimbri n comportamentul acestora i n cinetica reaciilor: se mrete stabilitatea enzimei (stabilitatea enzimei att n stare static ct i n stare dinamic fiind influenat de procedeul de imobilizare, msura acestei stabiliti fiind 1/2 din durata de via a enzimei); se schimb afinitatea enzimei fa de substrat, aceasta fiind influenat de durata lor de contact care, la rndul ei, este determinat de viteza fluxului sau viteza de agitare a substra tului n contact cu sistemul suportenzim, de viteza de difuzie a substratului la enzim imobilizat; se modific caracterul catalizei prin trecere de la cataliza omogen la cea eterogen. La folosirea enzimelor imobilizate poate avea loc o variaie a pH-ului optim iar randamentul n produsul de transformare este micorat. De exemplu, prin folosirea amiloglucozidazei n soluie, plecnd de la o suspensie de amidon cu 33% s.u., se ajunge la un randament de transformare n glucoza de 95,5 96%, n timp ce la folosirea amiloglucozidazei imobilizate, randamentul este de 9293%. In orice caz, preparatele de enzime imobilizate, fa de cele libere sau solubile, prezint o serie de avantaje printre care se amintesc urmtoarele: - refolosirea repetat a enzimei, cu aceeai cantitate de enzim putndu-se transforma cantiti mai mari de substrat; - se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, cu automatizarea procesului, ceea ce asigur un control precis al parametrilor de lucru; - are loc o cretere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentraiei acestuia; - se poate stopa reacia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enz imei n produsul transformat; - costurile globale de producie sunt mai mici n comparaie cu procedeele de folosire .a enzimelor libere; - se pot utiliza i enzime care nu sunt trecute pe lista GRAS (Generally Recognised as Safe). Factorii critici ce trebuie luai n considerare la folosirea enzimelor imobilizate sunt urmtorii: - eficiena economic a imobilizrii este determinat de costul enzimei, suportului i metoda de imobilizare; - activitatea enzimei imobilizat care este n funcie de tehnica de imo bilizare, caracteristicile materialului de suport, viteza de difuzie a substratului la enzim i a produsului de transformare; - caracteristicile substratului ce trebuie transformat; - stabilitatea enzimei care trebuie meninut un timp ct mai ndelungat; - contaminarea microbiologic a sistemului enzim-suport n timpul utilizrii reactorului respectiv.