Sunteți pe pagina 1din 3

Enzime imobilizate

Imobilizarea unei enzime (sau a

multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii :

unui sistem

-să fie insolubil în apă ;

-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de acţiune ;

şi

enzimelor

libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele :

creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca

activitate catalitică. Această stabilitate este în legătură cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecinţă asupra variaţiilor de conformaţie a enzimei (se diminuează aceste variaţii). Imobilizarea conduce şi la creştere a concentraţiei locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant;

se

de

temperatură

-

asigure

acţiunea

enzimei

la

un

pH

optime, apropiate de cele ale

poate

lucra

în

flux

continuu

din

punct

vedere al catalizei enzimatice, dar şi din punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;

tratează

în cursul catalizei enzimatice;

se poate modula micromediul în care acţionează

enzima imobilizată (concentraţie substrat, încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile);

refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi

cantitate de enzimă se poate transforma o cantitate

mai mare de substrat;

se

continuu, putându-se automatiza procesul, ceea ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;

are

controlul riguros al vitezei fluxului de substrat şi al concentraţiei acestuia;

se poate stopa reacţia enzimatică la momentul

produsul

dorit

transformat;

costurile globale de producţie sunt mai mici în

lucru, prin

sau

enzima

nu pătrunde

în

substratul

ce

se

poate

loc

o

lucra

în

sistem

a

semicontinuu

de

creştere

vitezei

şi

se

evită

trecerea

enzimei

în

comparaţie cu procedeele în care se folosesc enzime libere;

se

enzime care nu sunt trecute în

liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Există şi dezavantaje, cum ar fi:

costuri privind imobilizarea;

pot

folosi şi

pierderi ale activităţii enzimatice,

o investiţie iniţială în utilaje mai mare,

un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi o supraveghere mai atentă;

utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.

În cazul enzimelor imobilizate se observă un comportament cinetic diferit faţă de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare a imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor conformaţionale ale enzimei după imobilizare. O astfel de modificare apare în primul rând în cazul legării covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influenţa mediului, în cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale acide

La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se poate vorbi de :

cantitatea

- randament

de

fixare

care

reprezintă

efectivă

de

enzimă

imobilizată

în

raport

cu

cantitatea

de

enzimă

introdusă

în

procesul

de

imobilizare :

enzimă fixată pe suport =  · 100 enzimă utilizată

- randament de activitate care reprezintă activitatea reziduală a enzimei imobilizate:

Activitatea (E 0 ) după fixare  · 100 Activitatea (E’ 0 ) înainte de fixare

Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la folosirea enzimelor imobilizate

Aceşti factori se referă la :

- eficienţa economică a imobilizării determinate de :

costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare ;

- activitatea enzimei imobilizate care este influenţată de : tehnica de imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a produsului (lor) de transformare ;

- caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;

activă

- stabilitatea

care un timp cât mai îndelungat ;

enzimei

trebuie

menţinută

- contaminarea

microbiologică

a

sistemului

enzimă/suport

în

timpul

utilizării reactorului

respectiv.

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor Metode de imobilizare a enzimelor a) Metode fizice

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor

Metode de imobilizare a enzimelor

a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul legăturilor slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni proteină – proteină, legături ionice).

Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi :

- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoză modificată, polistiren modificat, răşini schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex, carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;

- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă

(bentonită, montmonirolită etc.), ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice cu TiCl 4 ). Adsorbţia se realizează prin contactul dintre o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi va fi influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei,

temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în care suportul este menţinut sub forma unui pat. Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin ataşarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.

Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa şi volumul suportului, mărimea particulelor, raportul dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.

Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie

Avantaje Simplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva minute, enzima care rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare).

Absenţa

reacţiilor

chimice (numai

dacă

nu

se

formează punţi metalice).

 

Posibilitatea

de

regenerare

a

complexului

enzimă/suport.

 

Dezavantaje

Stabilizare slabă. Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul de substrat, variaţie lejeră de pH, forţa ionică, temperatură

 

-prin includere într-un suport, în care caz se pot include şi microorganisme. Includerea poate fi făcută în gel, microincapsulare, includere în fibre.

2

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

 

Avantaje

 

Reacţiile

de

polimerizare

sau

gelificare

sunt

bine

cunoscute Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt limitate (enzima este inclusă în geluri naturale) Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la amestec de enzime) Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile. Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin reticularea suportului după imobilizare

Dezavantaje Anumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi sau radicalici Se pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă) Riscul de evadare al enzimei prin micropori Proprietăţile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfăcătoare

b) Metode chimice de imobilizare, în care caz imobilizarea se face prin intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii chimice. Se poate realiza imobilizarea şi prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv şi legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi intermoleculară a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncţional.

La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi făcută : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie să se ţină seama de gruparea funcţională care poate reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizico- chimice ale suportului. Adesea este necesar să se creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe suport; prin coreticulare utilizând agenţi bi- sau polifuncţionali. Cel mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.

Suporturi de imobilizare comerciale

Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt :

derivaţi, alginaţi,

- polizaharide : agaroză, celuloză carageenani, dextrani ;

şi

-

poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;

-

polistiren (bile şi tuburi) ;

-

silicea şi sticla poroasă.

-

1.2.6. Condiţiile de inocuitate pe care trebuie să le îndeplinească preparatele enzimatice

Număr total de germeni (NTG), maximum 5.10 4 /g ;

Coliformi, maximum 30/g ;

Escherichia coli absent/ 25 g ;

Salmonella absent/ 25 g ;

Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;

Aflatoxina B 1 , ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T – 2 (zearalenona) în cazul preparatelor de origine microbiană – absente ;

Metale grele :

-arseniu

3 mg/Kg ;

-plumb

10 mg/Kg ;

-alte metale grele

40 mg/Kg (exprimată la Pb).

Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături covalente

 

Avantaje

Stabilitate

mărită

datorită

faptului

legăturile

covalente sunt cele mai puternice dintre toate legăturile menţionate anterior Varietatea mare a suporturilor : sticlă, silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc. Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecţia situsului activ).

Dezavantaje Trebuie realizate reacţii chimice, adesea complexe Etapa de activare a suportului este lungă Randamentul de fixare este 100% Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate) Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil Investiţia (costul) este importantă