Enzime imobilizate Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncional) nseamn legarea sau fixarea acesteia de un suport

care trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii : -s fie insolubil n ap ; -s asigure pstrarea proprietilor catalitice enzimelor, respectiv specificitatea de aciune ; ale

pierderi ale activitii enzimatice, o investiie iniial n utilaje mai mare,

un proces mai complex din punct de vedere tehnic i o supraveghere mai atent; utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate. n cazul enzimelor imobilizate se observ un comportament cinetic diferit fa de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatic scade ca urmare a imobilizrii. Acest lucru se datoreaz schimbrilor conformaionale ale enzimei dup imobilizare. O astfel de modificare apare n primul rnd n cazul legrii covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influena mediului, n cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, gruprile funcionale acide La imobilizare, n funcie de enzim i catalizator se poate vorbi de : - randament de fixare care reprezint cantitatea efectiv de enzim imobilizat n raport cu cantitatea de enzim introdus n procesul de imobilizare : enzim fixat pe suport = 100 enzim utilizat - randament de activitate care reprezint activitatea rezidual a enzimei imobilizate: Activitatea (E0) dup fixare 100 Activitatea (E0) nainte de fixare Factorii critici care trebuie luai n consideraie la folosirea enzimelor imobilizate Aceti factori se refer la : - eficiena economic a imobilizrii determinate de : costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare ; - activitatea enzimei imobilizate care este influenat de : tehnica de imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzim i a produsului (lor) de transformare ; - caracteristicile substratului ce trebuie transformat ; - stabilitatea enzimei care trebuie meninut activ un timp ct mai ndelungat ; - contaminarea microbiologic a enzim/suport n timpul utilizrii respectiv. sistemului reactorului

-s asigure aciunea enzimei la un pH i temperatur optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate). Avantajele imobilizrii enzimelor sunt urmtoarele : creterea stabilitii enzimei, ca protein i ca activitate catalitic. Aceast stabilitate este n legtur cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecin asupra variaiilor de conformaie a enzimei (se diminueaz aceste variaii). Imobilizarea conduce i la cretere a concentraiei locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant; se poate lucra n flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar i din punct de vedere al reglrii automate a parametrilor de lucru; enzima nu ptrunde n substratul ce se trateaz n cursul catalizei enzimatice; se poate modula micromediul n care acioneaz enzima imobilizat (concentraie substrat, ncrcarea suportului cu enzim, gruprile hidrofile); refolosirea treptat a enzimei, deci cu aceeai cantitate de enzim se poate transforma o cantitate mai mare de substrat; se poate lucra n sistem semicontinuu sau continuu, putndu-se automatiza procesul, ceea ce asigur un control riguros al parametrilor de lucru; are loc o cretere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat i al concentraiei acestuia; se poate stopa reacia enzimatic la momentul dorit i se evit trecerea enzimei n produsul transformat; costurile globale de producie sunt mai mici n comparaie cu procedeele n care se folosesc enzime libere; se pot folosi i enzime care nu sunt trecute n liste GRAS (Generally Reconized as Safe); Exist i dezavantaje, cum ar fi: costuri privind imobilizarea;

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor Metode de imobilizare a enzimelor a) Metode fizice, la care enzima se leag de un suport prin intermediul legturilor slabe sau relativ puternice (legturi Van der Waals, legturi de hidrogen, interaciuni protein protein, legturi ionice). Imobilizarea n cadrul metodelor fizice poate fi : - prin adsorbie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoz modificat, polistiren modificat, rini schimbtoare de ioni (DEAE celuloz, DEAE Sephadex, carboximetil-celuloz, Amberlit, Dowex 50 etc.) ; - prin adsorbie pe suporturi minerale : alumin, argil (bentonit, montmonirolit etc.), ceramic, hidroxiapatit, sticl poroas sau silice poroas, titanit (puni metalice cu TiCl4). Adsorbia se realizeaz prin contactul dintre o soluie apoas de enzim cu suportul solid i va fi influenat de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionic, calitatea enzimei, temperatura i durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluia de enzim i suport ntr-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluiei de enzim ntr -o coloan n care suportul este meninut sub forma unui pat. Adsorbia enzimei de suport poate fi mbuntit prin ataarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanuri cu grupri hidrofile. Adsorbia este influenat de raportul dintre suprafaa i volumul suportului, mrimea par ticulelor, raportul dintre gruprile hidrofile i hidrofobe. Avantajele i dezavantajele imobilizrii prin adsorbie Avantaje Simplicitate n execuie (incubarea enzimei cu suportul, agitare cteva minute, enzima care rmne n soluie fiind eliminat prin splare). Absena reaciilor chimice (numai dac nu se formeaz puni metalice). Posibilitatea de regenerare a complexului enzim/suport. Dezavantaje Stabilizare slab. Riscul de desorbie a enzimei de ctre : fluxul de substrat, variaie lejer de pH, fora ionic, temperatur -prin includere ntr-un suport, n care caz se pot include i microorganisme. Includerea poate fi fcut n gel, microincapsulare, includere n fibre.

2
Avantajele i dezavantajele imobilizrii enzimelor prin incluziune Avantaje Reaciile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute Reaciile chimice dintre suport i enzim sunt limitate (enzima este inclus n geluri naturale) Se poate aplica la toate enzimele (chiar i la amestec de enzime) Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile. Riscul de evadare a enzimei este redus prin reticularea suportului dup imobilizare Dezavantaje Anumite polimerizri necesit ageni denaturani sau radicalici Se pun probleme de transfer de mas (inaccesibilitatea unor substraturi la enzim) Riscul de evadare al enzimei prin micropori Proprietile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfctoare b) Metode chimice de imobilizare, n care caz imobilizarea se face prin intermediul legturilor covalente de suporturi insolubile, care posed grupri reactive sau care pot fi activate prin diferite reacii chimice. Se poate realiza imobilizarea i prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv i legarea ncruciat (Cross-linking) sau reticular intra i intermolecular a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncional. La legarea prin legturi covalente, imobilizarea poate fi fcut : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie s se in seama de gruparea funcional care poate reaciona cu protein-enzima i de caracteristicile fizicochimice ale suportului. Adesea este necesar s se creeze, pe cale chimic, funcii reactive pe suport; prin coreticulare utiliznd ageni bi- sau polifuncionali. Cel mai mult utilizat pentru reticulare este glutaraldehida. Suporturi de imobilizare comerciale Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt : - polizaharide : agaroz, celuloz i derivai, alginai, carageenani, dextrani ; - poliacrilamide utilizate sub form de bile ; - polistiren (bile i tuburi) ; - silicea i sticla poroas. 1.2.6. Condiiile de inocuitate pe care t rebuie s le ndeplineasc preparatele enzimatice Numr total de germeni (NTG), maximum 5.10 4/g ; Coliformi, maximum 30/g ; Escherichia coli absent/ 25 g ; Salmonella absent/ 25 g ; Activitate antibiotic de origine microbian absent ; Aflatoxina B1, ochratoxin A, sterigmatocistin, toxina T 2 (zearalenona) n cazul preparatelor de origine microbian absente ; Metale grele : -arseniu -plumb -alte metale grele 3 mg/Kg ; 10 mg/Kg ; 40 mg/Kg (exprimat la Pb).

Avantajele i dezavantajele legrii enzimelor de suport prin legturi covalente Avantaje Stabilitate mrit datorit faptului c legturile covalente sunt cele mai puternice dintre toate legturile menionate anterior Varietatea mare a suporturilor : sticl, silice, ceramic, celuloz, polimeri sintetici etc. Posibilitatea de a efectua imobilizarea n prezena unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecia situsului activ). Dezavantaje Trebuie realizate reacii chimice, adesea complexe Etapa de activare a suportului este lung Randamentul de fixare este 100% Exist riscul modificrii chimice a enzimei (pierdere de activitate) Este necesar ca enzima s fie purificat n prealabil Investiia (costul) este important