EXTRACIA ENZIMELOR

Este evident c pentru a putea nelege n detaliu comportarea unei enzime ntr-un sistem complex n care exist ea n mod obinuit - aa cum sunt organitele celulare (mitocondrii, lizozomi, ribozomi etc.), celule, tesuturi, organe parti sau ntregul organism este necesar s ncercm n primul rnd s-i nelegem proprietile n cel mai simplu sistem posibil. n cele mai multe cazuri, cnd enzima este exocelular, sistemul simplu este constituit dintr-o soluie enzimatic care conine i mici cantiti de ioni, molecule tampon, cofactori, etc. n alte cazuri, ns, cum sunt cele n care enzimele sunt endocelulare, componente a unor organite celulare sau sunt legate de membranele celulare izolarea enzimei este un proces mai complicat, deoarece enzima poate fi inactivat dac n mediu nu exist unii componeni adiionali specifici.

Strategia de alegere a sursei enzimatice

Pentru studierea proprietatilor structurale sau/si biochimice ale unei enzime trebuie aleasa sursa care raspunde cel mai bine cerintelor de izolare cu: activitate catalitic maxim adic enzima prezent sa nu fie degradat sau inactivat ; puritate maxim posibil adic nu trebuie s conin alte enzime sau molecule mari. randament maxim posibil rezultat din procentul de activitate recuperat comparativ cu activitatea extractului original. Incazul in care se doreste si purificarea enzimei acesta este un criteriu definitoriu in alegerea metodei de purificare. Strategia de alegere a unui material biologic pentru extragerea unei enzime utilizabile in diferite scopuri sau pentru studiul ei este necesar s se in cont de o serie de factori cum sunt: abundena enzime; disponibilitatea i preul de cost; localizarea enzimei (preferabil extracelulara); caracterizarea sursei; studii comparative.

In toate etapele de alegere a sursei trebuie sa se aibe in vedere si stabilitatea enzimei si posibilele dificulti n manipularea sursei. 1. Abundena enzimei. Deoarece pentru orice studiu, experimentare sau aplicare este necesar s se obin extracte proteice totale cu concentraii ridicate ale enzimei de interes trebuie alese surse biologice bogate n enzima dorit. Astfel rdcinile de hrean sunt surse extrem de bogate in peroxidaze, muchiul inimiii este bogat n lactatdehidrogenaze, glandele mamare n periada lactaiei sunt o surs bun de acetil CoA carboxilaze i rinichii sunt bogai n hidrolaze. Microorganismele sunt surse de obinere prin procese biotehnologice a enzimelor utilizate n diverse domenii cum sunt agricultura, industria alimentar, industria farmaceutic, pielrie etc. De exemplu un microorganism cunoscut de toat lumea, drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae), care este utilizat n special n panificaie i industria berii, se obine uor n cantiti mari i este foarte bogat n enzime glicolitice. Avantajul utilizrii microorganismelor ca surse de enzime, const n faptul c prin modificri ale mediului de cultur sau modificri genetice se poate crete nivelul de producie a enzimei de interes. Astfel sinteza -D-galactozidazei poate fi indus la E. coli prin creterea bacteriei ntr-un mediu care conine lactoz (substratul enzimei) ca unic surs de carbon. Dezvoltarea tehnicilor de clonare molecular, a ADN-ului recombinant, a determinat apariia unor noi metode de realizare a unor tulpini de microorganisme nalt productoare de enzime. n aceast tehnic, gena care codific o enzim este izolat de la organismul parental i expresat la un nivel ridicat ntr-un organism de cretere convenabil cum sunt E. coli i drojdiile. Prin aceast tehnic o tulpin de E. coli a produs de 100 pn la 200 de ori mai mult glutation reductaz dect tulpina slbatic. Trebuie s subliniem c dei aceste tehnici reprezint posibiliti reale de cretere a capacitii de biosintez a unei enzime pot aprea probleme considerabile la exprimarea unor gene eucariote n celule procariote, astfel nct, n unele cazuri proteinele supra exprimate pot forma agregate insolubile i recuperarea activitii enzimatice din acestea nu a fost totdeauna posibil.

2. Disponibilitatea sursei si pretul de cost. Sursa biologic trebuie s fie accesibil atat din punct de vedere geografic cat i economic. n acest sens nu se recomand utilizarea unor surse scumpe, ca de exmplu muchiul de homar, sau a unor surse care se gsesc n regiuni, locuri ndeprtate, exotice, ale globului (specii bioluminiscente). esuturile umane sunt surse greu de procurat n multe ri si in cele mai multe cazuri cad sub incidenta unor legi protective fata de etica de obtinere a acestora. n multe situaii sursele clasice pentru anumite enzime au fost nlocuite de surse alternative: De exemplu creierul porcului de guinea, sursa clasic pentru extracia i purificarea histamin-metiltransferazei, poate fi nlocuit cu rinichiul de porc, surs mai ieftin i mai accesibil; n studiul structurii subunitare a ceruloplasminei umane, o problem a fost sensibilitatea mare a acestei proteine la atacul enzimelor proteolitice. Cnd s-a descoperit c ceruloplasmina uman este aproape similar cu cea porcin, studiile au fost orientate spre aceast surs n care proteina se gsete n cantiti mult mai mari i este mai stabil la atacul enzimelor proteolitice; Enzimele pectolitice necesare obtinerii sucurilor limpezi din fructe sau legume se obtin cu ajutorul microorganismelor. Obtinerea lor din fructe le-ar ridica pretul foarte mult ceea ce ar duce la indisponibilitatea lor pentru industria de sucuri. Sursele animale sau microbiene tradiionale pentru anumite enzime pot fi nlocuite la ora actual de microorganisme obinute prin inginerie genetic sau de culturi de celule eucariote. Proteinele de origine eucariot, produse prin clonare i expresare n bacterii de tipul E. coli, pot fi localizate n citoplasm sau pot fi secretate prin membrana celular. n al doilea caz, ele se pot acumula n interiorul spaiului periplasmatic, sau pot fi secretate n mediul de cultur. O enzim care se acumuleaz n interiorul spaiului periplasmatic poate fi i ea secretat n mediul de cultur prin schimbarea condiiilor de cretere. Aceast metod conduce la obinerea unui grad avansat de purificare pentru enzimele secretate, pentru c, majoritatea proteinelor biosintetizate rmn n interiorul celulelor. n alegrea sursei de izolare i purificare a unei enzime trebuie s se fac un compromis ntre abundena i accesibilitatea acesteia.

3. Localizarea unei enzime, intracelular sau extracelulara, este esenial de cunoscut pentru a se putea stabili cea mai convenabil metod de extracie. Astfel dac o enzim are o singur localizare n celul (cum sunt de exemplu succinat dehidrogenaza i alte enzime din ciclul acizilor tricarboxilici care se gsesc exclusiv n mitocondrii) se poate utiliza pentru purificare i studiu un omogenat obinut din ntregul esut. n cazul unor enzime similare ca functionalitate si structura, localizate n mai multe formaiuni intracelulare, este necesar o fracionare subcelular nainte de a ncepe purificarea enzimei de interes. Astfel, n cazul purificrii adenozintrifosfatazei mitocondriale, enzim implicat n transportul H+, este necesar obinerea unui preparat mitocondrial cu puritate rezonabil, pentru a se evita contaminarea cu alte adenozintrifosfataze implicate de exemplu n transportul Na+ i K+ prin membrana celular. Fracionarea subcelular se realizeaz prin procese de centrifugare, deoarece organitele celulare sedimenteaz la diferite valori ale forelor centrifugale 4. Caracterizarea sursei. Sursa aleas trebuie s fie perfect caracterizat. Cnd sursa aleas este vegetal, este necesar cunoaterea genului, speciei i varietii acesteia. Adeseori este necesara si cunoasterea zonei, climei in care s-a dezvoltat sursa vegetala precum si perioada de recoltare. n cazul microorganismelor este necesar utilizarea unei tulpini bine caracterizate, crescut pe medii de cultur cu compoziie bine determinat. Pentru surse animale, este necesar prelevarea de esuturi sau organe de la animale normale, avnd acelai sex, aceiai greutate i vrst, care au fost supuse unui regim alimentar identic. n cazul surselor animale este necesar cunoaterea aproximativ a compoziiei sursei pentru a nltura unele interferene care pot aprea pe parcursul extraciei i purificrii. De exemplu, ficatul conine o cantitate mare de glicogen care interfer n multe dozri. Pentru a limita aceste interferene, animalele de laborator trebuie supuse unui regim de inaniie nainte de sacrificare. Partea endocrin a pancreasului este bogat n lipide care interfer n extracia enzimelor. Pentru a limita acest neajuns se recomand ndeprtarea mecanic a acesti pri a pancreasului nainte de extracia enzimelor. 5. Studii comparative. 4

Unele enzime au fost studiate in unele specii sau in diferite tesuturi ale unor specii. In asemenea cazuri este de mare importanta sa se studieze enzimele respective si in diferite alte specii sau tesuturi in vederea evaluarii evolutiei enzimei, proprietatile ei comparativ cu altele similare, structura primara, tertiara, diferitele izoenzime etc.

Metode de extracie
Exist numeroase metode de extracie a enzimelor extracelulare (medii n care acestea se afl in afara celulelor) ct i endocelulare (enzimele se afla in interiorul celulelor). In ultimul caz sunt necesare metode speciale de spargere a celulelor. Alegerea metodei de extracie este dependent de natura esutului, organismului sau mediului utilizat ca surs enzimatic. Astfel unele materiale biologice permit obinerea de soluii clare sau aproape clare de proteine, enzime, prin simple procedee de filtrare sau centrifugare deoarece enzimele sunt, n aceste cazuri, libere n solventul (in majoritatea cazurilor apa) materialului biologic respectiv. n aceast categorie putem aminti ca exemple urmtoarele: urina, laptele, serul sanguin, sucul unor fructe, veninul de arpe, mediile extracelulare rezultate dup cultivarea microorganismelor sau a celulelor animale sau vegetale. Alegerea unei astfel de surse prezint avantajul c materialul de la care se pornete procedeul de extracie conine un numr relativ mic de componente, iar proteinele extracelulare sunt relativ stabile. Unele dintre aceste surse, cum este urina sau supernatantele culturilor de celule, datorita dilutiei existente, trebuie supuse unor operaii de concentrare nainte de nceperea purificrii efective. n cazul unor surse este, ns, necesar extracia proteinei cu o anumit activitate enzimatic dintr-un esut sau dintr-un anumit tip de celul. n aceste cazuri, alturi de proteina de interes sunt eliberate un numr mare de alte molecule contaminante, printre care i enzime proteolitice, enzime care fac destul de dificil purificarea proteinei de interes. Astfel, extracia i purificarea unei proteine particulare dintr-o surs solid implic cel mai adesea un compromis ntre gradul de recuperare (randament) i puritatea acesteia (factor de purificare). Dezintegrarea celulelor sau esuturilor i eliberarea coninutului acestora n mediul de extracie se poate realiza printr-o serie de metode specifice. n anumite cazuri se prefer sau 5

este necesara dezintegrarea esuturilor i prepararea unor populaii omogene de celule intacte nainte de ruperea membranelor celulare. Alegerea metodei de dezintegrare depinde de sursa si de tipul de esut sau organ utilizat ca surs de izolare a enzimei. n urma dezintegrrii celulare se obin omogenate celulare care conin componentele celulare suspendate n mediul de extracie. Principalele metode utilizate pentru dezintegrarea celulelor sunt : Metoda Principiul de baz Metode blnde Liza celular Ruperea osmotic a membranei celulare Digestia enzimatic Ruperea pereilor celulari; eliberarea coninutului celular n mediu. Omogenizator Potter- Celulele sunt dezintegrate ntr-un spaiu ngust existent ntre pistil i pereii de sticl; membranele Elvehjem celulare sunt rupte datorit forelor care apar; Metode moderate Omogenizator cu cuite Membranele sunt tiate cu ajutorul unor lame care se rotesc (Warning blendor) Mojarare n prezen de Membranele sunt ndeprtate prin aciunea abraziv a particulelor de nisip sau alumin nisip, alumin sau perle de sticl Presare (French press) Decompresiune exploziv Mcinare cu bile (bead mill) Ultrasonicare Metode severe Celulele sunt forate s treac prin orificii mici la presiuni foarte mari astfel incat forele de rupere afecteaz integritatea membranelor Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune mare, ceea ce determin ruperea membranelor i eliberarea coninutului celular Vibraiile rapide realizate cu ajutorul perlelor de sticl conduc la ndeprtarea pereilor celulari

Tratarea suspensiilor celulare cu frecvene sonice determin ruperea membranelor nghe-dezghe repetat Ruperea legturilor de hidrogen i a celor hidrofobe realizate ntre enzime i alte componente precum si a membranelor ca urmare a inghetarii apei. Se recomand pe ct posibil utilizarea unor metode de dezintegrare blnde, care s nu afecteze enzima de interes i s nu determine eliberarea enzimelor degradative din organite celulare de tipul vacuolelor sau/si a lizozomilor.