Metode de Detectie A Plantelor Transgenice

Maria DUCA, Angela LOZAN, Angela PORT,
Aliona GLIJIN, Victor LUPACU

Aspecte metodologice n testarea
plantelor modifcate genetic
Chiinu 2008

Fondul Global Programul Naiunilor Ministerul Ecologiei i Universitatea de Stat
de Mediu Unite pentru Mediu Resurselor Naturale din Moldova
ASPECTE METODOLOGICE N TESTAREA
PLANTELOR MODIFICATE GENETIC
Chiinu - 2008

Chiinu - 2008

Chiinu - 2008

Chiinu - 2008
Universitatea de Stat
din Moldova
Fondul Global
de Mediu
Programul Naiunilor
Unite pentru Mediu
Ministerul Ecologiei i
Resurselor Naturale
CZU 581.151
A 88
Aceast lucrare a fost elaborat i editat n cadrul proiectului UNEP-GEF nr. GFL/2328-
2716-4933 Suport pentru implementarea Cadrului Naional de Biosecuritate n Republica Mol-
dova, implementat de Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale i susinut fnanciar de Fon-
dul Global de Mediu.
Grupul de autori:
Maria DUCA Doctor habilitat n biologie, profesor universitar, membru corespon-
dent al AM, decan al Facultii de Biologie i Pedologie, Universi-
tatea de Stat din Moldova
Angela LOZAN Doctor n biologie, manager de proiect, proiectul UNEP-GEF Su-
port pentru Implementarea Cadrului Naional de Biosecuritate n
Republica Moldova
Angela PORT Doctor n biologie, confereniar universitar, ef de laborator Securi-
tate Biologic, Universitatea de Stat din Moldova
Aliona GLIJIN Doctor n biologie, lector superior, prodecan al Facultii de Biolo-
gie i Pedologie, Universitatea de Stat din Moldova
Victor LUPACU Doctor n biologie, lector, Universitatea de Stat din Moldova
Copyright Maria Duca, Angela Lozan, Angela Port, Aliona Glijin, Victor Lupacu
Copyright Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale
Copyright Universitatea de Stat din Moldova
ISBN 978-9975-78-613-3
Descrierea CIP a Camerei Naionale a Crii
Aspecte metodologice n testarea plantelor modifcate genetic /
Maria DUCA, Angela LOZAN, Angela PORT, Aliona GLIJIN, Victor
LUPACU; Fondul Global de Mediu. Programul Naiunilor Unite pen-
tru Mediu. Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale. Universitatea
de Stat din Moldova Chiinu: .S.FE-P. Tipografa Central, 2008,
168 pag.
ISBN 978-9975-78-613-3
1000 ex.
CUPRINS
Introducere ............................................................................................................................. 4
1. NoIUNI GeNerALe PrIVIND TrANSForMAreA GeNeTIC ..................... 7
1.1. Etape de obinere a OMG ....................................................................................... 8
1.2. Strategii de identifcare, izolare i clonare a genelor de interes .......................... 9
1.3. Transferul genelor la plante .................................................................................... 26
1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor modifcate genetic ................................ 32
1.5. Gene de interes .................................................................................................... 36
2. STANDArDIzAreA I VALIDAreA INTerNAIoNAL .................................... 47
2.1. Culturi agricole modifcate genetic ......................................................................... 48
2.2. Strategii de nregistrare i stocare a informaiei privind PMG n bazele de date ... 51
2.3. Laboratoare acreditate pentru testarea OMG .......................................................... 61
2.4. Norme i legi ce reglementeaz testarea OMG ...................................................... 65
2.5. Metode validate aprobate pentru testarea OMG ..................................................... 66
3. PreLeVAreA I oBINereA ProBeLor PeNTrU ANALIze GeNeTICe .......... 71
3.1. Principii i norme de selectare a materialului experimental pentru testare ............ 72
3.2. Izolarea i purifcarea proteinelor i ADN-ului vegetal .......................................... 73
3.3. Electroforeza proteinelor i a acizilor nucleici ....................................................... 79
3.4. Estimarea coninutului de proteine i de ADN ....................................................... 86
3.5. Exemple de protocoale .......................................................................................... 89
4. DeTeCIA PMG LA NIVeL De exPreSIe FeNoTIPIC
A TrANSGeNeLor ........................................................................................................ 93
4.1. Genele-marker i raportoare utilizate n selecia PMG .......................................... 94
4.2. Biotestul fenotipic al PMG ..................................................................................... 97
4.3. Exemple de protocoale ........................................................................................... 101
5. ANALIzA MoDIFICrILor GeNeTICe LA NIVeL De ProTeINe ................ 103
5.1. Analiza proteinelor prin metoda ELISA ................................................................. 104
5.2. Analiza proteinelor prin testul Lateral Flow Sticks ............................................. 108
5.3. Exemple de protocoale .......................................................................................... 109
6. IDeNTIFICAreA oMG LA NIVeL De ADN ANALIzA CALITATIV .............. 113
6.1. Analiza PCR ............................................................................................................ 114
6.2. Screening-ul general al PMG .................................................................................. 118
7. MeToDe PCr De CUANTIFICAre A PMG ............................................................. 129
7.1. Real-time PCR ........................................................................................................ 130
7.2. RCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR) ................................................................ 133
8. CAPACITI NAIoNALe PeNTrU TeSTAreA PMG ......................................... 139
8.1. Structura i potenialul tehnico-tiinifc al laboratorului Securitate Biologic...... 140
8.2. Detecia PMG la nivel de expresie fenotipic a transgenelor ................................. 144
8.3. Identifcarea unor transgene la nivel de proteine .................................................... 147
8.4. Screening-ul PMG prin PCR .................................................................................. 148
Glosar de termeni ................................................................................................................... 151
Bibliografe.............................................................................................................................. 161
Abrevieri ................................................................................................................................. 168
4
INTroDUCere
n decursul ultimelor decenii, biotehnologia a cunoscut progrese impor-
tante datorit descoperirilor ce in de mecanismul funcionrii acizilor nucleici
(ADN-ului i ARN-ului) i investigaiilor desfurate apoi n domeniul geneticii
moleculare. Relevarea particularitilor materialului genetic la animale, plante
i microorganisme, precum i posibilitatea de modifcare a unitilor lor com-
ponente au lrgit considerabil domeniile aplicrii biotehnologiei, genernd ns
n societate o profund nelinite fa de gradul de securitate i caracterul etic al
unor asemenea cercetri.
Biotehnologia modern include aplicarea tehnicilor de recombinare a acizi-
lor nucleici i a tehnicilor de fuziune celular.in.vitro, nlturnd barierele natu-
rale de reproducere sau recombinare genetic. Astfel, prin metode de inginerie
genetic, metode care reprezint un sistem de tehnici contemporane de manipu-
lare a genomului, a fost posibil inserarea unui spectru larg de gene de interes.
(transgene) n mai mult de 120 de specii de plante care aparin la 35 de familii.
O importan practic deosebit o au numeroasele varieti de plante.mo-
difcate genetic (PMG), rezistente la diferite erbicide (, 1998; Van Eerd i
al., 2003), insecte duntoare (Sharma i al., 2004), boli (Jauhar, 2006), patogeni
fungali (Sahrawat, Becker, Lutticke i al. 2003), bacteriali (Datta, Baisakh, Thet
i al. 2002) i virali (Gonsalves, 2003). Un rol aparte va reveni n viitorul apro-
piat plantelor modifcate genetic, ce conin gene ale rezistenei la stresul abiotic,
inclusiv la secet (Abebe, Guenzi, Martin i al., 2003) i la salinitatea solurilor
(Flowers, 2004), care astzi cauzeaz pn la 50% din pierderile de produc-
ie agricol mondial (Bray, Bailey-Serres i Weretilnyk, 2000). Biofortifcarea
plantelor de cultur prin introducerea genelor implicate n mbuntirea caliti-
lor nutritive ale produselor alimentare, precum coninutul de proteine, vitamine
i minerale este o direcie relativ nou, n continu dezvoltare (Ducreux, Morris,
Hedley i al., 2004).
Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente n magazinele i mar-
keturile Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiionat apariia
unei serii de directive i legi emise de Comunitatea European, menite s supun
unui control strict comercializarea i cultivarea organismelor modifcate genetic
(OMG). Conform cerinelor, produsele alimentare care conin cel puin 0,9 - 1%
OMG trebuie supuse analizelor i etichetrii.
Necesitatea monitorizrii prezenei PMG i cantitii acestora n culturile
agricole i n produsele alimentare derivate din acestea a impus cutarea meto-
5
delor analitice efciente n detectarea, identifcarea i cuantifcarea alogenelor i
a produselor de expresie, care reprezint constituenii genetici de baz. Labora-
toarele UE au elaborat i dezvoltat metode de testare a PMG la nivel de ADN
prin metoda PCR i/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.
n Republica Moldova, cercetrile n domeniul biotehnologiei i problema
biosecuritii sunt la nceput de cale. Pn la momentul de fa nu exist centre
tiinifce n care s-ar obine PMG, ns produsele modifcate genetic pot ajunge
la consumatori prin importul de produse alimentare, fructe, legume etc., iar pe
cmpurile agricole prin procurarea din strintate a materialului semincer.
Pentru reglementarea activitilor de obinere a PMG, testarea lor, eliberarea
n mediul nconjurtor, importul, exportul, transportul acestora etc., Guvernul
Republicii.Moldova.a adoptat.Legea.nr.755-XV.din.21.12.2001.privind.securita-
tea biologic, precum i Legea pentru ratifcarea Protocolului de la Cartagena
privind biosecuritatea la Convenia privind diversitatea biologic nr. 1381-XV
din. 11. octombrie. 2002. Introducerea pe pia a OMG i/sau a produselor re-
zultate din astfel de organisme se face numai n baza autorizaiei eliberate de
Comisia Naional pentru Securitatea Biologic n conformitate cu prevederile
reglementate de lege.
Implementarea i crearea unui sistem naional n domeniul securitii biolo-
gice n Republica Moldova s-a realizat graie proiectelor fnanate de programul
Naiunilor Unite pentru Mediu/Fondul Global pentru Mediu (UNEP/GEF) n
comun acord cu Ministerul Ecologiei i Resurselor Naturale. Pe site-ul ofcial
www.biosafety.md sunt abordate diferite aspecte legate de problema biosecurit-
ii, inclusiv testarea i efectuarea cercetrilor biotehnologice.
n cadrul Universitii de Stat din Moldova, n baza Ordinului comun (nr. 19
din 10.02.2004) al Ministerului Ecologiei i Resurselor Naturale i Ministerului
Educaiei i n baza deciziei Senatului USM (proces-verbal nr. 8 din 27.01.2004)
a fost organizat Laboratorul Securitatea Biologic (LSB), laborator care are
drept scop testarea PMG.
Pe parcursul ultimilor cinci ani n cadrul LSB au fost realizate proiectele nr.
619 (2004)) i nr. 1156 (2006), fnanate de Ministerul Ecologiei i Resurselor
Naturale; COBASE, 001028-001 (2004), fnanat de NSF (SUA), MTFP-04-08
(2005), MTFP-015-05 (2006), prin care au fost procurai reageni specifci pen-
tru testarea PMG i efectuat training-ul privind tehnicile de obinere i testare
a PMG; MERL-1300 (2007-2008) fnanate de CRDF/MRDA (SUA), care au
permis nzestrarea laboratorului cu echipament modern. Actualmente, laborato-
rul servete drept baz de cercetare i de instruire a studenilor, masteranzilor,
doctoranzilor, contribuind la dezvoltarea unor deprinderi practice de lucru, la
nsuirea diferitor metode analitice i tehnici de biologie molecular. Colecti-
vul laboratorului realizeaz activiti de implementare i optimizare a diferitor
metode, bazate pe PCR i ELISA de detecie a PMG, ce vor permite efectuarea
unor analize mult mai ample activiti care au sugerat ideea scrierii acestui
manual.
Lucrarea de fa reprezint un ndrumar practic privind aspecte strategice i
metodologice de testare a PMG i include principalele noiuni, etape i tehnici
referitoare la efectuarea testrii plantelor transgenice i la reglementarea poli-
tico-legal a acestora. Fiind contieni de faptul c n literatura de specialitate
exist mult mai multe tehnici i metode dect cele expuse n acest manual, iar
dinamica progresiv a cercetrilor n domeniu implic o revizuire continu a
acestora, am ncercat s v conducem pas cu pas spre paginile WEB respective,
care sunt accesibile publicului larg.
Cartea este adresat tuturor celor care sunt interesai de problema securitii
biologice i monitoringului PMG, dar poate f cu succes utilizat i de studenii
facultilor de biologie i agronomie, avnd astfel o menire dubl de a contri-
bui la pregtirea cadrelor universitare i de a constitui un suport metodologic
pentru cercettorii din acest domeniu.
Autorii
Capitolul
Metoda biolistic sau bombardare
cu particule
esut vegetal
Microproiectile
cu ADN
Macroproiectil
Plac de
protecie
Microproiectile
Biolistic PDS-1000/He Schema procesului de transformare
Corp
Pompa de propulsare
Meanism de observare
Selecia i regenerarea
transformanilor
Material-int Selecia i regenerarea
Creterea i dezvoltarea nrdcinarea
METODELE TRANSGENEZEI
1.1. Etape de obinere a OMG
1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare
a genelor de interes
1.3. Transferul alogenelor la plante
1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor
modificate genetic
1.5. Gene de interes
CAPITOLUL 1
NOIUNI GENERALE PRIVIND
TRANSFORMAREA GENETIC
Suportul informaional
8
1
1.2. Strategii de identifcare, izolare i
clonare a genelor de interes
1.3. Transferul genelor la plante
1.4. Regenerarea, selecia i testarea
plantelor modifcate genetic
MeToDeLe TrANSGeNezeI
Metoda biolistic sau bombardare
cu particule
esut vegetal
Microproiectile
cu ADN
Macroproiectil
Plac de
protecie
Microproiectile
Biolistic PDS-1000/He Schema procesului de transformare
Corp
Pompa de propulsare
Meanism de observare
Selecia i regenerarea
transformanilor
Material-int Selecia i regenerarea
Creterea i dezvoltarea nrdcinarea
METODELE TRANSGENEZEI
1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare
1.3. Transferul alogenelor la plante
1.4. Regenerarea, selecia i testarea plantelor
modificate genetic
CAPITOLUL 1
Suportul informaional
8
8
Capitolul 1. NoIUNI GeNerALe PrIVIND
TrANSForMAreA GeNeTIC
Ingineria genetic a plantelor reprezint un instrument relativ nou, efcient n
realizarea multiplelor valorifcri de prim importan pentru ameliorarea standar-
dului de via al omenirii. n acelai timp, introducerea n mediu a organismelor
obinute prin tehnicile biotehnologiilor contemporane este un subiect discutabil i
larg mediatizat, generat att de benefciile considerabile pentru societate, ct i de
efectele neprevzute, care pot f evidente dup un timp oarecare.
Abilitatea de a ne orienta i a ne forma o opinie proprie vizavi de introducerea
n agricultur i pe pia a PMG i a produselor derivate este determinat de un anu-
mit nivel de informare i nelegere a acestor probleme, care este inevitabil fr o
descriere a tehnologiilor i instrumentelor de baz utilizate n obinerea plantelor cu
nsuiri noi prin transformare genetic.
1.1. etape de obinere a oMG
Transformarea genetic reprezint modifcarea genomului unui organism prin
tehnicile biotehnologiilor contemporane, care permit introducerea genelor noi, de in-
teres, sau modifcarea expresiei unei/ unor gene prezente deja n celul. Organismele
astfel obinute, sunt denumite organisme modifcate genetic (OMG) sau transgenice.
Evoluarea tehnico-experimental a ingineriei genetice, n special a metodelor
de transfer al genelor peste barierele de sex i la distane taxonomice mari, a per-
mis transgeneza unui numr impuntor de plante cu importan economic: cereale,
leguminoase, specii pomicole sau forestiere etc. Obinerea autorizrii unei varie-
ti modifcate genetic (MG) n conformitate cu reglementrile de rigoare impune
respectarea urmtoarelor cerine: stabilitate n expresia i motenirea transgenelor
n generaiile succesive; segregare mendelian a fenotipului transgenic, reglarea or-
gan-specifc a expresiei alogenelor i exploatarea produsului su n scop agrono-
mic, alimentar, medical, farmaceutic etc. n afara aplicaiilor practice, manipulrile
genetice permit analiza structurii i funciei genelor, oferind posibiliti de a cunoa-
te i a interveni n mecanismele de dezvoltare a plantelor.
Literatura de specialitate nsumeaz o serie de date referitoare la transgeneza
culturilor agricole, relevnd faptul c elaborarea strategiei i selectarea metodei de
transformare depind de interesele economice, de echipamentul accesibil i de anu-
mite particulariti genetice ale speciei (Kaeppler i al., 1992; Van der Graaff i al.,
1996; Sambrook i Russell, 2001).
Obinerea organismelor modifcate genetic include cteva etape, care pot f
rezumate astfel:
I. Identifcarea, izolarea i clonarea genelor de interes.
II. Transferul genelor la plante.
III. regenerarea, selecia i testarea plantelor MG.
9
Aceste etape includ o serie de procese intermediare urmate de verifcri care
decurg ntr-o anumit succesiune (fg. 1.1.).
Figura 1.1. etapele transformrii genetice
http://www.mun.ca/biology/scarr/Gr13-16b.htm
1,2 Identifcarea i izolarea genei de interes, obinerea ADN-ului recombinat (integrarea
transgenei n vector);
3 Transferul genei himere n celula vegetal prin metode directe sau indirecte;
4 Selectarea celulelor modifcate genetic;
5 Regenerarea plantelor din celulele transformate genetic;
6 Reproducerea sexuat/ asexuat a plantelor modifcate genetic.
1.2. Strategii de identifcare, izolare i clonare
Strategia utilizat ntr-un proiect de identifcare, izolare i clonare a secvenelor
nucleotidice utilizate n obinerea ADN-ului recombinat apeleaz la o gam larg de
metode optimizate n funcie de tipul celulei (procariote, eucariote), esutului, orga-
nului, fazei de vegetaie, speciei. Cea mai simpl metod de izolare a fragmentelor
ce conin gena de interes se bazeaz pe utilizarea unor enzime endonucleaze de
restricie implicate n scindarea hidrolitic a legturilor fosfodiesterice din ADN.
Acestea recunosc secvene specifce de 4, 6, 8 nucleotide cu structur de palindrom
(secvene repetate invers), avnd simetrie rotaional de tip doi numite situsuri.i la
nivelul acestora cliveaz ambele catene ale moleculei. n raport cu axul de simetrie,
unele enzime taie ADN-ul asimetric genernd extremiti complementare sau coezi-
L R
R
spc
R
kan
nos
10
ve, altele taie ambele catene n centrul de simetrie al situsului de restricie, rezultnd
fragmente cu capete drepte. Cnd enzimele taie asimetric la distane ntmpltoare,
atunci se obin fragmente cu extremiti monocatenare cu secvene nespecifce:
Enzimele de restricie recunosc secvena de nucleotide specifc, indiferent de
originea ADN-ului. Prin aciunea mai multor restrictaze asupra unui genom, se re-
alizeaz aa-numite hri de restricie, care indic plasarea succesiv a locusurilor
de recunoatere a diferitor enzime. Astfel de hri permit analiza comparativ a unei
i aceleiai regiuni ale ADN-urilor de diferit origine. Dintre restrictazele cel mai
des utilizate n tehnicile ingineriei genetice, pot f menionate: Hae III, Eco RV, Eco
RI, TagI, NotI etc. (Sambrook i Russell, 2001).
Fragmentele de restricie obinute prin digestia enzimatic a ADN-ului au lun-
gime variat n funcie de numrul situsurilor de restricie, i anume ele reprezint
materialul iniial n izolarea, clonarea genelor i n obinerea constructului genetic
utilizat n transformare (fg. 1.2.).
Figura 1.2. Diferite ci de izolare a fragmentelor de ADN utilizat n tehnologia
ADN-ului recombinant
IZOLAREA FRAGMENTELOR DE ADN UTILIZAT N TEHNOLOGIA ADN-ULUI
RECOMBINANT
Sinteza enzimatic a
ADN-ului complementar
ARNm
ADNc
PCR
Revers trancripie
Fragmente de ADN
de interes
Sinteza chimic i
multiplicarea
fragmentelor de ADN
prin tehnologia PCR
Tag-polimeraza
dNTP
ADN
primeri
ADN
Denaturare
Alinierea
primerilor
Elongare
Electroforeza
Izolarea fragmentelor de ADN
prin digestie cu restrictaze
Fragmente de
ADN de interes
Fragmente de ADN
de interes
Figura 1.2. Diferite ci de izolare a fragmentelor de ADN utilizat n tehnologia
ADN-lui recombinant
O alt metod de izolare i multiplicare a genelor inlude reacia de polimerizare n lan
(Polymerase Chain Reaction PCR), prin care are loc amplificarea in vitro a diferitor fragmente de
ADN, utiliznd secvene nucleotidice specifice numite primeri. Existena ADN polimerazelor,
purificate i termostabile (de la Thermus aquaticus Taq-polimeraza i de la Pyrococcus furiosus
12
Secvene de ADN
tiate drept
1.2. Strategii de identificare, izolare i clonare a genelor de interes
Strategia utilizat ntr-un proiect de identificare, izolare i clonare a secvenelor nucleotidice
utilizate n obinerea ADN-ului recombinat apeleaz la o gam larg de metode optimizate n funcie
de tipul celulei (procariote, eucariote), esutului, organului, fazei de vegetaie, speciei. Cea mai
simpl metod de izolare a fragmentelor ce conin gena de interes se bazeaz pe utilizarea unor
enzime endonucleaze de restricie implicate n scindarea hidrolitic a legturilor fosfodiesterice
din ADN. Acestea recunosc secvene specifice de 4, 6, 8 nucleotide cu structur de palindrom
(secvene repetate invers), avnd simetrie rotaional de tip doi, numite situsuri i la nivelul acestora
cliveaz ambele catene ale moleculei. n raport cu axul de simetrie, unele enzime taie ADN-ul
asimetric genernd extremiti complementare sau coezive, altele taie ambele catene n centrul de
simetrie al situsului de restricie, rezultnd fragmente cu capete drepte. Cnd enzimele taie asimetric
la distane ntmpltoare, atunci se obin fragmente cu extremiti monocatenare cu secvene
nespecifice:
5'-GTT AAC-3'
3'-CAA TTG-5'
Secvene ADN
tiate drept
5'-G GATCC-3'
3'-CCTAG G-5'
Secvene ADN
tiate decalat
5'-GACGC(N5) -3'
3'-CTGCG(N10) -5'
Secvene ADN tiate
decalat la distane
diferite
Enzimele de restricie recunosc secvena de nucleotide specific indiferent de originea ADN -
lui. Prin aciunea mai multor restrictaze asupra unui genom se realizeaz aa-numite hri de
restricie care indic plasarea succesiv a locusurilor de recunoatere a diferitor enzime. Astfel de
hri permit analiza comparativ a unei i aceleiai regiuni ale ADN-urilor de diferit origine. Dintre
restrictazele cel mai des utilizate n tehnicile ingineriei genetice pot fi menionate: Hae III, Eco RV,
Eco RI, TagI, NotI etc (Sambrook i Russell, 2001).
Fragmentele de restricie obinute prin digestia enzimatic a ADN-ului au lungime variat n
funcie de numrul situsurilor de restricie, i anume ele reprezint materialul iniial n izolarea,
clonarea genelor i n obinerea constructului genetic utilizat n transformare (fig. 1.2.).
11
Secvene de ADN
tiate decalat
Secvene de ADN
tiate decalat la
distane diferite
11
O alt metod de izolare i multiplicare a genelor include reacia de polimerizare n
lan (Polymerase Chain Reaction PCR), prin care are loc amplifcarea in.vitro a diferitor
fragmente de ADN, utiliznd secvene nucleotidice specifce numite primeri. Existena
ADN polimerazelor, purifcate i termostabile (de la Thermus.aquaticus. Taq-polimera-
za i de la Pyrococcus furiosus Pfu-polimeraza) i a oligonucleotidelor ADN sintetizate
chimic (dNTP) face posibil clonarea unor secvene specifce de ADN in.vitro. Tehnica
PCR permite amplifcarea de miliarde de ori a unui fragment de ADN dintr-o anumit
regiune a genomului doar n cteva ore, n comparaie cu tehnica de clonare standard, cu
ajutorul bncilor de gene, pentru care sunt necesare mai multe zile (vezi cap. 6).
Procesul de izolare i ulterior clonare poate ncepe i prin extragerea ARNm din
esuturi i organe n faza de dezvoltare a plantei, n care gena de interes este expresat,
urmat de sinteza ADNc, prin transcripie invers realizat de revers-transcriptaza.
Fragmentele de ADN izolate prin diferite metode, pot f ataate unor molecule
de ADN capabile de autoreplicare vectori de clonare, astfel obinndu-se ADN
recombinat. Moleculele de ADN recombinat sunt multiplicate prin introducerea vec-
torilor de clonare n celule bacteriene, care se vor nmuli pe medii de cultur adecvate
i vor forma colonii, fcnd posibil obinerea unei mari cantiti a genei de interes.
Aceast colecie de fragmente de ADN constituie o bibliotec de gene (fg. 1.3.).
Figura 1.3. Prezentare schematic a clonrii fragmentelor de
ADN de interes n bacterii
Situsuri de restricie a enzimei
ADN donor
Fragmente restrictate
Vector recombinant
cu inserturile 1 i 2
Transformare
Replicare, amplificare
i dividere celular
Clone ce conin
insertul de ADN nr. 1
Clone celulare
ce conin
fragmentul nr. 2
Genom bacterian
12
n funcie de surs se pot construi 2 tipuri de biblioteci: genomice i ADNc.
Astfel, se poate realiza i izolarea n form pur a unui anumit segment de ADN
dintr-o populaie mare i heterogen de molecule.
Pentru obinerea moleculelor de ADN recombinat se recurge la:
Utilizarea aceleiai enzime de restricie pentru tierea (izolarea) ADN-ului ge-
nomic i a vectorului de clonare. Capetele fragmentelor de ADN astfel obinute vor f
complementare i la amestecarea lor n prezena unei ADN-ligaze se va realiza legarea
covalent a acestora obinndu-se molecule recombinate circulare (fg. 1.4.). Forma-
rea unui plasmid recombinant circular capabil de transformare a bacteriei Escherichia.
coli (E..coli) are loc printr-o reacie intermolecular ntre plasmida liniarizat i frag-
mentele de ADN cu capete coezive complementare vectorului, rezultnd un hibrid
molecular i o a doua reacie intramolecular, prin care capetele coezive ale hibridului
liniar se leag formnd o molecul recombinat circular legat necovalent.

Figura 1.4. Formarea unei plasmide recombinate circulare atunci cnd se
utilizeaz aceeai restrictaz pentru ADN-ul exogen i pentru vector
Ataarea la fragmentele de ADN cu capete drepte (obinute atunci cnd sunt
utilizate anumite enzime de restricie, sau cnd este clonat ADNc) a unei secvene
linker (de legtur) sau a unor secvene homopolimere poliA/poliC la nivelul unei
singure catene. n acelai fel se modifc i ADN-ul vectorului, ns prin ataarea unei
secvene de nudeotide complementare poliT/poliG. Secvenele linker sunt secvene
de sintez, mici, de 8-16 nucleotide, autocomplementare, care conin situsuri de recu-
noatere pentru enzime de restricie necesare unei clonri ulterioare (fg. 1.5.).
Vectorii utilizai n tehnologia ADN-ului recombinat trebuie s corespund ur-
mtoarelor cerine:
5 '
P
5 '
P
G
G
C T T A A
A A T T C
G
A A T T C
C T T A A G
EcoRI
vector insert
vector insert
reacie intermolecular
reacie intramolecular
3 '
O H
3 '
O H
5 '
P
5 '
P
5 '
O H
5 '
P
3 '
O H
3 '
O H
3 '
O H
5 '
P
capete 5` terminale
v
ecto
r
insert
s fe izolat i purifcat cu uurin;
s poat f introdus ntr-o celul-gazd;
s posede o origine a replicrii (ori) i astfel s se poat multiplica n celula-gazd;
s posede un marker genetic stabil, care s permit identifcarea i izolarea celulelor care
conin vectori;
s conin mai multe situsuri de restricie pentru o gam variat de enzime asociate ntr-
un polilinker (situsuri multiple pentru restrictaze) pentru inseria fragmentelor de ADN.
13
n calitate de vectori cel mai des se utilizeaz plasmidele bacteriei E..coli, de-
rivai ai bacteriofagilor i M13, cosmide, cromozomi artifciali de drojdie etc.
Varietatea de vectori este determinat de dimensiunea fragmentelor strine de ADN
care pot f inserate.
Plasmidele (uniti genetice extracromozomale) reprezint molecule de ADN
dublu catenare, circulare, capabile de replicare independent, care se ntlnesc prac-
tic la toate speciile de bacterii. Macromolecula de ADN are dimensiuni de 100-200
kb i constituie 1-3% din cantitatea total de material genetic bacterian (cromozom
circular alctuit dintr-o molecul de ADN dublu catenar). Prezena lor nu este obli-
gatorie, ele pot f dobndite sau pierdute fr a afecta viabilitatea celulelor purt-
toare. Plasmidele sunt dependente de celula-gazd, cu excepia autoreplicrii i a
controlului numrului de copii per celul. Cu ct este mai mare plasmidul, cu att
mai mic este numrul de copii per celul. Plasmidele posed o regiune notat ori,
format din cteva sute de perechi de nucleotide, unde este iniiat replicarea i ali
determinani genetici (secvene de inserie, gene de reglare, structurale etc.). Genele
structurale atribuie caracteristici fenotipice noii celule-gazde: rezisten la antibio-
tice, metale grele, UV, sintez de antibiotice, toxine, producerea de bacteriocine i
enzime de restricie etc.
n natur, transferul plasmidelor ntre diferite celule-gazd are loc printr-un
proces similar cu conjugarea bacteriilor. n laborator, plasmidele sunt transferate n
Figura 1.5. Clonarea prin adugarea unei secvene linker la ADN-ul
de interes cu capete drepte (Sambrook i Russell, 2001)
C C
G GCT T A A G GC
G AA T T C G
C C
G GCT T A
A A T T C G
G C C
G
A G C C
G AA T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
G
C
C
G G G
C C C
G
G
C
G
C
G
C A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C
G
C
G GG
G
C
G
C
G
5 '
P
5 '
OH
5 '
P
5 '
OH
5 '
P
3 '
OH
C
G
C G
C G T T A A
5 '
P
5 '
OH
Linkerul EcoRI
Digestia cu EcoRI
Capetele drepte ale ADN-int
Adugarea lincherilor la ADN-int
utiliznd o concentraie mare de ADN-ligaz T4
Includerea ADN-int n plasmidul
restrictat cu ajutorul enzimei EcoRI
ADN-int

vector
14
bacterii printr-un proces artifcial numit transformare care include incubarea plas-
midelor cu bacterii competente (permeabilitate tranzitorie pentru ADN-ul exogen).
Astfel, bacteria-gazd capt un nou caracter fenotipic, de exemplu, rezistena la un
anumit antibiotic, particularitate important n selectarea bacteriilor transformate.
Pentru ca plasmida s fe utilizat n calitate de vector, ea trebuie s fe de di-
mensiuni mici, replicarea s se afe sub un control redus din partea cromozomului
bacterian i s conin situsuri unice pentru una sau mai multe enzime de restricie,
afate n regiuni neeseniale pentru replicare. Situsurile de inserie a ADN-ului pot
f n cadrul genelor care codifc markeri. n acest caz, va avea loc inactivarea genei
respective oferind o posibilitate de selecie. De obicei, se recurge la astfel de inserii n
plasmidele care manifest rezisten la dou tipuri de antibiotice (fg.1.6.). Un exem-
plu de acest fel l reprezint utilizarea plasmidei cu genele rezistenei la ampicilin i
tetraciclin n scopul clonrii. Pentru nceput, se realizeaz clivarea ADN-plasmidial
cu restrictazele Hind.III.i Bam.II n situsurile corespunztoare afate la nivelul genei
rezistenei la tetraciclin i izolarea fragmentului mare al ADN-ului plasmidic (rezul-
tat al digestiei enzimatice) prin electroforez. Acesta, find incubat cu ADN exogen
restricionat tot cu aceste enzime, n prezena unei ligaze se combin cu fragmentul
ADN de interes datorit extremitilor coezive complementare vectorului.
Figura 1.6. Prezentare schematic a clonrii fragmentelor ntr-un situs
de inserare la nivelul unei gene, care determin rezistena la tetraciclin n
plasmida-vector ( i al., 1984)
Notaii: Amp
r
rezisten la ampicilin; Tet
r
rezisten la tetraciclin; HindIII i BamII enzime
de restricie, respectiv find notate i fragmentele clivate.
Amp
r
Amp
r
Amp
H
H
H B B H
H
B
B
B
r
Amp
r
Amp
r
Amp
r
Hind III Hind III
Bom HI + Hind III Bom HI + Hind III
Bom HI + Hind III
Bom HI
Tet
Ter
r
r
15
Recombinantul circular obinut este utilizat n transformarea E. coli, transfor-
mnd-o ntr-o su bacterian rezistent la ampicilin. Deoarece capetele mono-
catenare, numite conform enzimelor care le cliveaz, nu sunt complementare unul
altuia, fragmentul mare care reprezint ADN-ul vectorului nu se poate circulariza,
manifestnd astfel o capacitate de transformare foarte joas. De aceea, selecia clo-
nelor pe baza rezistenei la ampicilin va arta c majoritatea celulelor bacteriene
conin plasmida recombinat. n funcie de fragmentul exogen i localizarea situsu-
rilor se pot obine combinaii variate.
Pentru a majora numrul de situsuri de inserie, n plasmide se introduc anumi-
te segmente de ADN, care conin mai multe situsuri aranjate succesiv pentru o gam
larg de restrictaze (fg. 1.7.).
Figura 1.7. Schema unei plasmide care conine polilinker,
plink322, derivat de la plasmidul pBr322 ( i al., 1984)
Amp
r
marker selectiv; situsuri unice:
ClaI, HindIII, XbaI, Bg III, BamHI.)
Pe baza plasmidelor naturale care se ntlnesc la bacterii se obin plasmide ar-
tifciale, care se utilizeaz n clonarea genelor, n formarea bibliotecilor genomice i
n transformarea genetic. Cel mai utilizat vector plasmidial derivat de la plasmide
naturale este pBR322 plasmid cu control slab al replicrii care conine genele
rezistenei la ampicilin i tetraciclin i cteva situsuri de restricie. O alt plasmi-
d din acest grup este pBR325 (codifc rezistena la cloramfenicol, ampicilin i
tetraciclin). De la aceast plasmid au fost derivate alte plasmide cu caracteristici
mbuntite. De exemplu, pAT153, care a fost obinut n urma deleiei regiunii
implicate n controlul numrului de copii/celul. Aceasta se replic formnd de 3
EcoR
I C
lo
I
H
in
d

I
I
I

X
b
o
I

P
s
i
I

B
o
m
H
I

c
o
R
I
Ava I
Bal I
2.0
1.0
3.0
4.0
GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTCTAGAGATCTTCCATACCTACC
AGTTCTCCGCCTGCAGCAATGGCAACGTTGCCCGGATCCGGTCGCGCGAATTC
EcoRI
Hinc II/Sol I
Psi I
A
m
p
r
O
r
i
Pvu I
Hind II
Pst I Bam HI Eco RI
Cla I Hind III
Xba I
Bg III
BamHI
16
ori mai multe copii per celul n comparaie cu plasmida de la care a derivat. Ali
vectori derivai artifcial de la plasmide naturale utilizai n tehnologia ADN-ului
recombinat sunt cele din grupa pHV, pUC, pACYC etc. (Vlaic, 1997; Moldoveanu
i al., 2000).
Vectorii de clonare derivai din plasmidele bacteriene nu tolereaz secvene
de ADN mai mari de 6-8 kb, deoarece viteza lor de multiplicare i efciena lor de
transformare scade pe msur ce dimensiunile inseriilor cresc. Pentru clonarea
fragmentelor de ADN mai mari de 10 kb au fost construii vectori derivai din
fagul .
Bacteriofagul este un fag lizogen cu genomul sub forma unei molecule de
ADN dublu catenar, de aproximativ 47500 pb i include cel puin 30 gene. nain-
te de integrare n cromozomul bacterian (E..coli), genomul fagic se circularizeaz
prin mperecherea bazelor de la nivelul extremitilor monocatenare complemen-
tare, numite extremiti coezive, sau situsuri cos (12 nucleotide). Moleculele de
ADN circulare se integreaz n situsuri specifce n cromozomul bacterian printr-un
crossingover, rezultnd un profag liniar, inert genetic, pn cnd, n anumite condi-
ii, se separ i iniiaz ciclul litic. Sutele de copii ADN fagic nou rezultat n urma
replicrii formeaz lanuri (concatameri) prin intermediul situsurilor cos. Enzimele
de asamblare taie acest concatamer, deoarece recunosc cele dou situsuri cos, afate
la o distan de aproximativ 45 kb unul de altul, n uniti care se asambleaz n fagi.
Astfel, pentru maturarea fagului, ADN-ul cromozomal trebuie s fe de aproximativ
45 kb i s posede situsurile cos.(Raicu, 1997).
Construcia vectorilor derivai de la fagul s-a bazat pe o serie de particulariti:
regiunea central nu este necesar pentru replicare, ceea ce a fcut posibil
eliminarea i nlocuirea acesteia cu fragmentul de ADN care trebuie clonat;
prezena unor situsuri de restricie pentru o serie de restrictaze importante n
clonare.
Astfel, de la fagul de tip slbatic au fost construite mai multe tipuri de vectori:
Utilizarea vectorilor derivai de la fagul prezint avantajul ncorporrii unui seg-
ment mare de ADN strin, iar infecia bacteriilor i selecia clonelor recombinate sunt
uor de realizat.
de inserie ( gt i ZAP), care posed un singur situs de restricie la nivelul
cruia se taie i se insereaz ADN-ul strin, i permit inserarea fragmentelor
de 6-7 kb;
de nlocuire, care posed dou situsuri de restricie, ce fancheaz fragmen-
tul central, care este nlocuit cu ADN strin, i permit inserarea fragmentelor
de 9-22 kb. Vectorii din noua generaie posed situsuri de clonare multiple,
care fancheaz fragmentul central ce poate f nlocuit: EMBL, DASH,
Charon 34, 35 etc. (fg. 1.8.).
17
Figura 1.8. Prezentare schematic a clonrii genelor de interes n
vectorul fagic EMBL3A cu secvene polilinker
(Sambrook i Russell, 2001)
Pentru clonarea unor fragmente de ADN ale cror dimensiuni variaz ntre 32
i 47 kb au fost construii vectori numii cosmide hibrizi derivai din fagul (si-
tusurile cos) i plasmide (originea replicrii, o gen de rezisten la un antibiotic i
situs unic pentru o enzim de restricie). Pentru clonare, ADN-ul genomic este dige-
rat parial cu o enzim de restricie, care genereaz fragmente cu extremiti coezive
complementare vectorului (liniarizat cu aceeai enzim de restricie). Fragmentele
de ADN, lungi de 32-47 kb, sunt izolate i ataate la vector. Rezult concatameri,
care conin fragmente de ADN genomic i ADN aparinnd vectorului, n tandem.
Un extract de fag, care conine -terminaza determin tierea acestor fragmente re-
combinate de ADN ce pot f asamblate n particule virale i introduse prin infecie n
E..coli, unde sunt replicate n bacterie ca plasmide rezistente la antibiotice.
Captul stng
Captul stng
Captul stng
Captul stng
Captul drept
ADN genomic
Secvene
parial
digerate cu Sau3AI
Fragmente de restricie
de diferite dimensiuni
In vitro
mpachetarea
ADN-ului
recombinant
n particula viral
Capete coezive Sau3AI,
compatibile cu capetele
coezive BamH1
Captul drept
Captul drept
Captul drept
Digestie cu
BamH1 i EcoRI
S
a
l

I
S
a
l

I
B
a
m

H
I
B
a
m

H
I
E
c
o

R
I
Eco RI
Captul coeziv
Bam HI
insert
de 15-20 Kb
Legarea fragmentelor
cu ajutorul ligazei T4
15-20 Kb insert
Polilinker
Precipitarea fragmentelor de
poliliker prin centrifugare
difereniat
Polilinker
ADN intercalat
ntre situsurile
de restricie
E
c
o

R
I
Eco RI
18
Cosmidele sunt primii vectori, care au fost utilizai n analiza genomurilor com-
plexe. Ali vectori cu capacitate nalt utilizai n clonare sunt: cromozomi artifciali
de drojdie sau YAC (Yeast Artifcial Chromosome), care permit inserarea fragmen-
telor de ADN de 250-400 kb, cromozomi artifciali bacterieni BAC (Bacterial
Artifcial Chromosome), care pot insera segmente de nucleotide de 120-300 kb.
Astfel, fragmentele de ADN de interes izolate prin diverse metode i clonate n
bacterii sau cell free reprezint materialul genetic, care poate f utilizat n construcia
unor gene himere funcionale ce urmeaz a f introduse n plante prin transformare ge-
netic. Aceste gene sunt secvene hibride alctuite din promotorul unei gene, regiunea
codifcatoare a unei alte gene i secvena de terminare de la o a treia gen.
Cunoaterea exact a secvenei de nucleotide, a principalelor pri ale genei:
promotorul (5), cu rol de reglare n transcripie i expresie (activator, represor, sec-
vene implicate n expresia esut-specifc sau inductibil); secvena codifcatoare
cu codonul ATG, pentru iniierea translaiei; regiunea terminal (3), n care se
af semnalele ce marcheaz sfritul translaiei, transcripiei i poliadenilrii, face
posibil separarea n componente distincte cu recombinarea ulterioar a acestora n
scopul obinerii genelor himere de interes. De exemplu, dac o gen cunoscut
este expresat la un nivel foarte ridicat (se af sub controlul unui promotor puternic,
care permite formarea frecvent a complexului de iniiere a transcripiei) n orga-
nismul de origine, promotorul poate f ataat la orice alt gen pentru a-i asigura
acesteia o rat de transcripie nalt.
Secvena codifcatoare este aleas n funcie de scopul cercetrii. Pentru
nceput, ea este identifcat, izolat i secveniat. Exist gene ai cror produi
ARNm sau proteine sunt cunoscui i foarte multe gene despre care nu se
cunosc dect modul de transmitere i fenotipul. Pentru ambele categorii, ntr-o
anumit etap, se utilizeaz o variant a tehnicii de hibridare in.situ hibridarea
coloniilor. Procedeul permite detectarea prezenei oricrei gene pentru care exist
o sond de ADN sau ARN marcat radioactiv sau chimic. Coloniile bacteriene
sunt transferate de pe mediul solid pe fltru de nitroceluloz printr-o uoar ap-
sare pe suprafaa culturii. O parte din colonii rmne pe mediu i constituie placa
de referin. Prile care ader, numite
replici, vor f, dup denaturarea ADN-
ului, incubate cu sonda. Dup nltura-
rea surplusului de sond, locul de pe
replic n care sonda s-a ataat pe baz
de complementaritate va f identifcat
prin autoradiografe (fg. 1.9.).
Modul n care se obine sonda un
segment de ADN sau ARN marcat, uti-
lizat pentru a realiza selecia n banc a
coloniilor, care conin secvene omoloage
depinde de informaiile disponibile re-
feritoare la gena care trebuie s fe izolat
(Raicu, 1997).
Figura 1.9. Izolarea genelor
prin tehnica hibridrii in situ
Membrana
Proba radioactiv
Coloniile selectate
Hibridizare
Expoziia sub razele X
19
n multe cazuri, proteina de interes este identifcat, purifcat i secveniat
(cel puin 30 aminoacizi). Pe baza codului genetic, utilizndu-se anumite soft-uri
de translaie, se deduce secvena nucleotidelor. Se sintetizeaz artifcial oligonu-
cleotide, marcate radioactiv sau chimic, cu care se sondeaz bibliotecile genomi-
ce transferate (replicile). Pentru confrmarea faptului c celulele care urmeaz a f
transformate vor sintetiza proteina codifcat de gena clonat se apeleaz la vectori
de expresie n care se insereaz ADNc, adiacent unui promotor pentru a asigura sin-
teza proteinei date n cantitate mare n bacterii. Identifcarea n bncile de expresie
se face cu anticorpi obinui pentru proteina respectiv. Poziia anticorpului legat de
protein pe fltru este evideniat dup incubarea cu un al doilea anticorp marcat.
Proteina sintetizat este astfel din nou caracterizat, confrmndu-se faptul c a fost
clonat gena de interes.
Pentru foarte multe gene, proteina codifcat nu este cunoscut, sau nu poate f
purifcat n cantiti sufciente pentru a determina secvena aminoacizilor ori pre-
pararea anticorpilor. n acest caz, pentru elucidarea funciei unei gene se poate uti-
liza strategia ARN antisens. Construciile antisens se realizeaz prin clonarea unui
ADNc provenit de la gena de interes, ataat unui promotor foarte puternic, ampla-
sat ntr-o orientare care face posibil transcrierea ARN-ului de pe catena opus (an-
tisens) celei de pe care are loc transcripia ARNm natural. Mecanismul interaciunii
ARNm-endogen cu ARN antisens codifcat de transgen nu este bine cunoscut. Se
consider c n celul s-ar forma un duplex ntre cele dou tipuri de ARN, care este
rapid degradat i, ca urmare, se blocheaz sau se reduce sinteza proteinei respective.
Prin strategia antisens se creeaz mutaii specifce (fg. 1.10.).
Acest mecanism de represie, descoperit pentru prima dat la bacterii, exist i la
animale. ARN antisens sunt defnii ca transcripi de mici dimensiuni, difuzibili, fr
capacitate de codifcare, care se ataeaz prin mperecherea bazelor de o regiune com-
Secvena de ADN a genei native
Transcripie
ARNm
ARN duplex
Translaie
ARNm
ARNm naitiv
ARN antisens
Proteina (enzima)
Degradarea ARN-ului
de interferen (ARNi)
Secvena de ADN a genei antisens
5
5
A T T G G C
3
3
3 5
A A G T C C
A A T G C C
3 5
5 3
A G G T T C
5 3
A G G U U C
5
5
3
3
A G G U U C
A A G U C C
A A G U C C
Figura 1. 10. Inhibarea expresiei unor gene de interes
prin strategia antisens
20
plementar specifc a unui ARN-int, actionnd ca un represor al funciei normale
i ca un inhibitor de nalt specifcitate al expresiei genei. La plante ns nu a fost nc
demonstrat existena unui asemenea mecanism natural de reglare (Raicu, 1997).
Plantele transgenice obinute cu construcia antisens au fost folosite pentru a
identifca funciile mai multor gene. n transgenez se recurge foarte des la aceast
strategie pentru a modula expresia unor gene de interes agricol. Un exemplu de
acest fel l reprezint modifcarea expresiei genelor implicate n ntrzierea coacerii
fructului de tomate apelndu-se la patru modaliti:
inhibarea activitii poligalacturonazei (PG);
inhibarea activitii acid-aminociclopropan-1-carboxilic (ACC) sintazei;
inhibarea activitii ACC oxidazei;
intensifcarea activitii ACC dezaminazei.
Plantele de tomate transformate cu gene antisens pentru poligalacturonaza
enzima, care determin degradarea peretelui celular n fructele coapte au produs
tomate cu durat mai ndelungat de pstrare. n plus, aceleai fructe au prezentat
i caracteristici importante pentru industrializare, i rezisten la o serie de patogeni
care atac dup recoltare.
Pectinesteraza (PE), o alt enzim care metabolizeaz peretele celular, i po-
ligalacturonaza nu sunt factori majori asociai cu nmuierea fructelor. ns fructele
plantelor care conin PE antisens prezint o viscozitate sporit a sucului, care ameli-
oreaz extractul i crete valoarea pentru prelucrarea sub form de paste i sosuri.
Biosinteza etilenei n plante implic conversia S-adenosil metioninei n acid-
aminociclopropan-1-carboxilic (ACC), catalizat de ACC-sintetaz i transforma-
rea ACC n etilen de ctre ACC-oxidaz. Fructele care conin ACC-oxidaz anti-
sens au un fenotip al coacerii modifcat. Acumularea licopenului, cu rol n nroirea
fructului copt, a fost redus. De asemenea, au fost reduse i fenomenele de zbrcire
asociate cu supracoacerea. Unele dintre aceste modifcri fenotipice au valori co-
merciale determinate de posibiliti de transportare la distane mari.
Strategia de design a constructului genetic ce urmeaz a f transferat la plante
prin transformare genetic este elaborat n funcie de interesele economice. Pentru
genele de importan agronomic se utilizeaz frecvent ADNc. n vederea obinerii
unui nivel de expresie sufcient de nalt, n unele situaii se impune modifcarea sec-
venei nucleotidelor genei fr modifcarea secvenei de aminoacizi. Deoarece codul
genetic este universal, secvenele codifcatoare de origine procariot sau de origine
animal pot f uor exprimate n plante.
Modul de expresie al genelor este reglat de promotor, care poate f constitutiv
(tab. 1.1.), asigurnd exprimarea genei n toate esuturile plantei, tisular-specifc,
ceea ce determin expresia ntr-un anumit tip de esut/organ, sau expresia inductibi-
l prin rnire, stres termic ori atacul unor patogeni (Raicu, 1997).
21
Tabelul 1.1.
Gene cu expresie tisular-specifc i inductibile
Gena Planta
Gazda
transgenic
Factorul inductibil i
localizare
inductorul organ/esut
RbcS
RbcS
RbcS
Cab
Cab
ST-LS1
Patatina
Leghemoglobina
p-Fazeolina
Lectina
Glutenine
Hordeina
Zeina
Mazre
Mazre
Mazre
Mazre
Gru
Cartof
Cartof
Soia
Fasole
Soia
Gru
Orz
Porumb
Tutun
Tutun
Petunia
Tutun
Tutun
Tutun
Cartof
Lotus
Tutun
Tutun
Tutun
Tutun
Tutun
Lumin
Lumin
Verde
Verde
Verde
Verde
Tubercul
Nodul
Semine
Semine
Semine
Semine
Semine
Promotorii genelor himere utilizate n transgenez la plante pot proveni chiar
de la speciile aceluiai grup, de exemplu, pentru monocotiledonate: de la alcool
dehidrogenaza din porumb Adh-1, sau de la actina din orez Act-1, care posed un
intron n secvena-lider, sau de la specii i organisme diferite, aa cum este promo-
torul 35S de la virusul ftopatogen Caulifower Mosaic Virus (CaMV) sau deriva-
ii acestuia (Wilminkand, 1993)..Majoritatea plantelor transgenice conin o copie
sau mai multe ale promotorului 35S CaMV (P-35S), graie faptului c este un
promotor puternic i constitutiv (cu expresie n toate esuturile). n acelai timp,
s-a constatat c activitatea acestui promotor nu este tot att de nalt i la plantele
monocotiledonate, ceea ce a i determinat utilizarea promotorilor de la speciile
aceleiai grupe. De aceea, n transformarea genetic a plantelor sunt utilizai mai
muli promotori n conformitate cu planta-recipient i cu scopul de cercetare sau
agroindustrial (tab. 1.2.).
Conform unui raport de analiz a PMG aprobate (Genetically Modifed [GM]
Crops: molecular and regulatory details, 2003) prezentat de Centrul pentru biose-
curitate i durabilitate din Elveia (Centre for biosafety and sustainability BATS)
secvenele promotorului 35S CaMV (fg. 1.11.) sunt prezente n majoritatea plante-
lor transgenice (http://www.bats.ch/bats/en/index.php)..
22
Tabelul 1.2.
exemple de promotori utilizai n obinerea PMG
Promotorul Abrevierea
organismul
donor
Gazda
transgenic
Promotor derivat de la Caulifower
Mosaic.Virus
P-35s
Caulifower
Mosaic.Virus.
porumb, bumbac,
rapi, papaia,
cartof, tomate
Promotor ALS1 prezent n tutun P-AlS
Nicotiana
tabacum
bumbac
Promotor derivat de la gena kinazei
calciu-dependent (CDPK) expresat
exclusiv n polen
P-PCDK Zea.mays. cereale
Promotorul genei cu expresie inductibil
determinat de etilen
P-e8
Lycoperiscon.
esculentum.
tomate
Promotor derivat de la Figwort.Mosaic.
Virus (FMV)
P-FMV
Figworth.Mosaic.
Virus.
tomate, bumbac,
rapi
Promotor RuBisCo SSU (ribulozo-1,5-
bisfosfat carboxilaza, subunitatea mic
1A) de la Helianthus.annuus
P-HelSsu
Helianthus.
annuus.
tutun
Regiunea promotor a genei mannopin
sintaza a pTiA6
P-mas
Agrobacterium
tumefaciens
tomate
Regiunea promotor a genei nopalin
sintaza
P-nos
Agrobacterium
tumefaciens
tomate
Promotorul fosfoenolpiruvat carboxilazei,
(PEPC) specifc esuturilor verzi
P-PePC Zea.mays. cereale
Promotorul ribulozei-1,5-bisfosfat
carboxilaza, subunitatea mic 1A
P-SsuAra
Arabidopsis
thaliana.
cicoare, rapi,
cartof
Regiunea promotor a genei anter-
specifc TA29
P-TA29
Nicotiana
tabacum.
cicoare, cereale,
rapi
Figura 1.11. rezultatele analizei a 66 culturi transgenice aprobate privind
promotorii inserai http://www.bats.ch/bats/en/index.php
Not: Numrul de varieti MG exprimat n % care conin inserii genetice cu promotorii respectivi; grupa
P-35s include i derivaii P-35s, P-E35s i dP-35s.
41%
16%
8%
6%
7%
4%
18%
P-35S
de origine bacterian
P-nos
P-FMV
P-Ssu
P-TA29
ali promotori
23
O alt secven de reglare n sinteza i expresia genelor terminatorul re-
prezint o secven de nucleotide inversate, plasat la sfritul unitii transcripio-
nale. Cea mai rspndit secven-terminator este NOS (T-nos), izolat de la gena
nopalinsintasa a Agrobacterium tumefaciens, find constatat n 37 culturi MG,
http://www.bats.ch/bats/en/index.php (fg.1.12.). Unele secvene-terminator utiliza-
te n transgenez sunt prezentate n tabelul 1.3.
Tabelul 1.3.
Secvene-terminator utilizate n transgenez
Secvena-terminator Abrevierea
organismul
donor
oraganismul
receptor
Regiunea 3 non-translabil a genei
ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza,
subunitatea mic E9
T-E9 Pisum sativum
bumbac, rapi,
cartof, tomate
Regiunea de poliadenilare a genei
mannopin sintaza pTiA6
T-mas
Agrobacterium
tumefaciens
tomate
nopalin sintaza
T-nos
Agrobacterium
tumefaciens
cicoare, cereale,
bumbac, rapi,
cartof, soia, tutun
Secvena-terminator a genei octopin
sintaza
T-ocs
Agrobacterium
tumefaciens
cicoare, rapi,
tomate
ribulozo-1,5-bisfosfat carboxilaza,
subunitatea mic
T-SSU Glycine.max. soia
Regiunea de poliadenilare a genei
pTiA6
T-tml
Agrobacterium
tumefaciens
bumbac, rapi,
tomate
Regiunea 3 a genei transcriptului
ADN 7
T-Tr7
Agrobacterium
tumefaciens
cicoare, cereale,
rapi
Figura 1.12. Secvenele terminator utilizate cel mai des n transgenez
http://www.bats.ch/bats/en/index.php
Not: Numrul de varieti exprimat n % care conin inseri genetici cu terminatorii respectivi.
32%
19%
14%
10%
4%
3%
18%
T-nos
de origine bacterian
T-35s
T-E9
T-ocs
T-tml
ali terminatori
24
Alte secvene care pot f prezente n inserii genetice sunt secvenele de desti-
naie ce provin de la gene codifcatoare de proteine, cu localizare celular bine cu-
noscut. De exemplu, secvena peptidei-tranzit utilizat pentru destinaia cloroplast
provine de la gena subunitii mici a enzimei Rubisco.
Astfel, inseriile cu ADN recombinat efectuate n scop de transformare gene-
tic a plantelor includ trei componente de baz: promotorul, gena de interes i
terminatorul. n linii generale, combinaia promotor-gen-terminator reprezint o
caset a genei de interes (fg. 1.13. a). Constructul genetic poate conine dou sau
mai multe casete ale alogenei (fg. 1.13. b) i suplimentar alte elemente cu rol de
control i facilitare a activitii genelor strine.
Figura 1.13. Schema insertului genetic (construct genetic)
a) Un insert cu componentele de baz necesare integrrii i expresiei
alogenei (P: promotor, T: terminator).
b) Insert genetic cu dou casete ale genei.
Cunoaterea elementelor insertului genetic este esenial n detecia, identifca-
rea i cuantifcarea materialului transformat genetic. Dosarele de notifcare a PMG
naintate pentru autorizare n scopul introducerii pe pia includ astfel de informaii.
De exemplu, linia de porumb GA21, Roundup Ready (toleran la glifosat ingre-
dient activ al erbicidului Roundup Ready), a fost obinut n urma transferului unui
fragment de restricie NotI cu lungimea de 3,4 kb de la plasmida pDPG434 prin
metoda biolistic (fg. 1.14.).
Vectorul plasmidial pDPG434 conine caseta cu gena EPSPS modifcat prin
mutagenez de la porumb. Produsul de expresie a acestei gene reprezint o enzim
insensibil la glifosat, conferind astfel toleran fa de acest compus. Alte secvene
coninute n vector sunt gena-marker selectabil bla. (codifc rezistena la ampi-
cilin n bacterii i permite selecia bacteriilor care conin plasmide), o origine a
replicrii (ori) necesar pentru replicarea plasmidei n E..coli.i o secven parial
lacZ (fg. l.14.).
Gena P T
P1 Gena 1 T1 P2 Gena 2 T2
Caset genetic
Caseta 1 Caseta 2
a
b
25
Figura 1.14. Harta plasmidului
P
DPG434
(Compania Monsanto, dosar de notifcare, 1998)
Fragmentul de restricie NotI utilizat pentru transformarea liniei de porumb GA21
Roundup Ready conine o caset de expresie cu gena EPSPS modifcat care include:
promotorul r-act - (1,37 kb) i intronul de la gena actinei de la orez; gena - 5-enolpiruvil
i kimat-3-fosfat sintaza de la Zea.mays - mEPSPS (1,34 kb) fuzionat cu o secven N-
terminal a peptidei tranzit n cloroplast derivat de la genele RuBisCo de la Helianthus.
annuus.i Zea.mays pentru a direciona proteina mEPSPS spre cloroplast, unde are loc
sinteza acizilor aromatici; secvena N-terminal a peptidei tranzit n cloroplast (CTP)
derivat de la secvenele CTP de la Helianthus.annuus i genele RuBisCo (sssu CTP and
mssu CTP) de la Zea.mays OTP (0,37 kb) si NOS 3 secvena de terminare provenit
de la plasmida Ti din Agrobacterium (fg. 1.14. i 1.15.).
Nos
IacZ
bla
ColE1
r-act
pDPG434
6128 bp
OTP
mssu(CTP)
mEPSP
Notl 6122
AfIII 5977
AfIII 5712
BgIII 4557
Pstl 4545
Sacl 4138
EcoRI 4128
Pstl 4128
BgIII 3990
BgIII 3848
Sacl 3622
EcoRI 3114
HindIII 5862
Xbal 5857
sssu(CTP)
SacI 2679
NotI 2692
Xbal 2699
Sphl 2729
Pstl 2735
Fragment de ADN-T
(NotI fragment) utilizat n
transformarea genetic
26
Figura 1.15. Harta liniar a fragmentului de restricie
NotI a constructului pDPG434
(Compania Monsanto, US-Patent-N: 6,040,497)
http://www.bats.ch/bats/en/index.php
Informaii privind secvenele de reglare utilizate n obinerea PMG, originea
acestora i culturile care le conin sunt accesibile n bncile internaionale de date
privind OMG (AGBIOS, COMPASS etc.).
1.3. Transferul genelor la plante
Transferul genelor n celulele plantelor se realizeaz printr-o gam variat de
metode care dup modul de realizare se divid n dou grupe: indirecte, mediate de
bacterii i virusuri, i directe, care fac apel la o serie de procedee fzice i chimice.
Tehnicile de transfer mediate de Agrobacterium i cele de transfer direct, n-
cepnd de la primele succese ale aplicrii acestora nregistrate n anii 1983 la unele
specii de tutun, au evoluat n paralel, ns pn n prezent, cel mai larg utilizat ra-
mne a f sistemul biologic determinat de simplitatea n realizare i de efcien la
multe specii de plante. n condiii naturale, Agrobacterium infecteaz doar speciile
erbacee dicotiledonate, ceea ce limiteaz utilizarea acestor bacterii n transforma-
rea genetic a speciilor monocotiledonate. Totui, conform unor cercetri, limitrile
impuse de gazdele naturale sunt esenial diminuate prin optimizarea condiiilor de
cultur a materialului surs i procedurii de cocultivare a esutului-int cu aceste
microorganisme (Ishida i al., 1996).
Transformarea mediat de Agrobacterium. Bacteriile din acest gen, Agro-
bacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes (familia Rhizobiaceae) sunt.lo-
calizate n sol i.infecteaz plantele dicotiledonate susceptibile la nivelul leziunilor
de divers natur, determinnd apariia unor tumori la nivelul coletului i, respectiv,
a unor rdcini froase.
Agrobacteriile conin n copii unice megaplasmidele Ti (tumor inducing) i Ri
(root inducing) cu dimensiuni mai mari de 200 kb. O regiune din ADN-ul plasmidic
ADN-T (transferred) este transferat i integrat stabil n genomul plantei. Anu-
me aceast regiune conine un set de gene cu caracter tumoral. Aciunea oncogen
P-ract
Promotor:
Gena:
Terminator:
OTP mEPSPS T-nos
27
este cauzat de introducerea n celula-gazd a informaiei necesare pentru sinteza
constitutiv a auxinelor i citochininelor prin ci metabolice complet diferite de
cele folosite de plant (Van Haaren i al., 1988; Van der Graaff, i al., 1996). Astfel,
sinteza n exces a acestor doi hormoni determin diviziunea necontrolat a celulelor
determinnd formarea tumorilor. La inducerea tumorilor particip:
regiunea ADN-T, care include genele responsabile de sinteza unor amino-
acizi mai puin obinuii, numii opine i folosii ca surs de azot i carbon de ctre
bacterie i genele care codifc enzimele implicate n sinteza auxinelor i citochi-
ninelor. Aceast regiune este fancat de dou fragmente a cte 25 pb n lungime,
reprezentnd repetri directe, care acioneaz ca elemente semnal cis n transferul
ADN-T.
regiunea vir (virulen) cu dimensiunea de 30 kb, plasat n afara regiunii
ADN-T, conine cel puin 22 gene, organizate n 6 operoane: vir A, vir B, vir D i.
vir.G eseniale pentru excizia i transferul ADN-T i vir C i.E.pentru sporirea ef-
cienei de transfer. Transferul ADN-T este mediat de aciunea cooperant a genelor
din aceast regiune i a unor gene de pe cromozomul bacterian responsabile pentru
ataarea celulelor bacteriene la plante.
Deoarece genele transferate n plant se af sub controlul unui promotor cu
secvene de reglare de tip eucariot, se expreseaz n celul, modifcndu-i fenotipul.
Analiza transferului mediat de aceste bacterii a pus n eviden trei factori eseniali,
care au permis utilizarea n practic a acestui mijloc de transformare prin construirea
unor factori i sisteme bacteriene:
Elaborarea unui sistem Agrobacterium ca vector pentru gene a impus eli-
minarea oncogenelor din ADN-T pentru a obine celule transformate capabile s
regenereze plante normale i nu proliferarea lor. Aceast eliminare face ns im-
posibil selecia celulelor transformate capabile s creasc n absena hormonilor.
n scopul seleciei genelor transformate au fost construite gene himere cu secvene
ce confer rezisten la un antibiotic (de ex., kanamicin) ataat unui promotor
adecvat (de ex., promotorul genei nopalin-sintazei [nos] sau promotorul genei VI
de la virusul mozaicului conopidei (Wang, 1984, 1990; Waters i Guiney, 1993).
Au fost construii numeroi vectori nononcogeni cu diferite caracteristici, cla-
sifcai n dou categorii: cis i trans. Vectorii cis conin att extremitile n lungime
de 25 de pb, ct i regiunea vir, pe acelai replicon. Vectorii trans sunt formai din
doi repliconi, unul purtnd extremitile i ADN-ul exogen ce va f transferat n
Apariia tumorilor este rezultatul transformrii genetice a celulelor vegetale prin inte-
grarea n genom a ADN-T i al expresiei genelor din aceast regiune.
Genele ADN-T sunt transcrise numai n celulele vegetale i nu au nici un rol n pro-
cesul de transfer.
ADN-ul exogen inserat ntre cele dou capete ale ADN-T poate f transferat n celu-
lele vegetale.
28
celula vegetal, iar cellalt (plasmida ajuttoare) posednd funcia vir, care este pla-
sat n poziia trans.(sistem vector binar). Avantajul vectorilor trans const n faptul
c sunt mai mici dect plasmidele Ti i Ri, astfel find mai adecvai unei manipulri
genetice. n cazul ambelor tipuri de vectori, genele strine sunt inserate n ADN-T,
clonate mai nti n E..coli i apoi transferate n Agrobacterium prin conjugare ori
electroporare.
Plasmidul pCambia 1300 (fg. 1.16.) prezint un exemplu de vector utilizat
n transformarea genetic ce include promotorul 35S, secvenele marginale de 25
kb derivate de la ADN-T, situsuri unice de restricie i grupate n polilinkeri, gena
raportoare Lac-Z-alfa, gena marker NPT pentru selecionarea celulelor i plantelor
transformate.
Figura 1.16. Schema plasmidului pCambia 1300
Metodologia folosit n mod curent pentru agroinfecie const n cocultiva-
rea bacteriei cu fragmente de esut vegetal (frunze, rdcini, hipocotili, peioluri,
cotiledoane etc.) i cultivarea in.vitro.pe medii de inducere a regenerrii, adiionate
cu antibiotic pentru eliminarea bacteriei.
La plante, vectorii virali sunt utilizai mai puin dect la bacterii i mamifere.
n special, virusurile sunt utilizate ca vector pentru transferul genelor, n vederea
elucidrii unor probleme teoretice, expresia genelor fr variaii determinate de lo-
calizarea pe cromozom: caracterizarea expresiei genelor n esuturi difereniate fr
s fe necesar cultivarea in.vitro.(Raicu, 1997).
Capacitatea virusurilor de a se rspndi n ntreaga plant asigur niveluri foar-
te ridicate de expresie a transgenelor. Aceast nsuire a vectorilor virali este exploa-
Sac II (6317)
Ecg 0109I (5904)
PpuMI (5905)
Bsp HI 5863
Blp I (5713)
SspII (5367)
Ppu 10I (5325)
pBR322 ori
pBR322 bom
Bsi 11071
Bsg I 3795
Ecg NI 3705
pSV1
Bsp DI, Cla 1
(3742)
Nhe I (3392)
Bsi WI
Psp
14061
(2317)
pVS1 sta
Bsg BI
(1716)
Sph I (389)
Captul T drept
Lac Z alfa
Site-ul unde a fost introdus gena Basta
Aat II (7875)
Bsi XI
(8716)
Promotorul 35 S CaMV
Rst II (7487)
Gena marker NPT
Captul T stng
NOS terminator
pCAMBIA 1300
8958 pb
Kas I (4177)
Nat I (4178)
Ehe I (4179)
Fig. 1.16. Prezentarea schematic a plasmidului pCAMBIA 1300
29
tat pentru a produce proteine virale n plante. Au fost construii vectori virali por-
nindu-se de la virusul mozaicului tutunului, virusul X al cartofului i virusul piticirii
tomatelor. Vectorii virali artifciali nu produc simptomele bolii, dar se rspndesc
sistemic i conin o gen strin. Se consider c pe viitor transferul prin intermediul
virusurilor derivate va f aplicat pe scar larg.
Metodele de transfer direct al genelor se realizeaz prin procedee fzice, elec-
trice i chimice. n ce privete transferul genelor, n comparaie cu sistemul biologic,
acestea nu sunt dependente de genotip, ns efeciena lor variaz n funcie de tipul
celulei-int, de capacitatea lor de regenerare, ntruct majoritatea transformrilor se
efectueaz pe celule cultivate in.vitro.
Cele mai simple metode de transfer direct ar putea consta n aplicarea exo-
gen a materialului genetic urmat de ptrunderea acestuia n celule i respectiv
n nucleu. Exist unele lucrri efectuate n anii 80 ai secolului trecut, care indic
asupra unui transfer de ADN prin aplicare exogen conjugat cu polinizarea. Prin
funcia sa de a transmite ADN-ul, polenul a generat un interes continuu n transfor-
marea mediat de gametoft (De Wet i al., 1986), ns n lipsa unor gene markeri
i a tehnicii moleculare de analiz adecvat a fost difcil de a atesta transformarea
genetic, ntruct markerii genetici clasici puteau f interpretai drept un rezultat al
contaminrii polenului i nu al transformrii. Totui cercetrile de acest fel au conti-
nuat prin obinerea n anii 1986-88 a speciilor de porumb, orez i gru transformate
genetic prin polenizare cu polen i extract de ADN strin. n aceste experimente
ADN-ul plasmidial incluznd gena nptII. inserat a fost aplicat asupra forilor n
perioada polenizrii. Fenomenul de transformare a fost confrmat prin screening la
rezistena fa de antibiotic i analize Southern blot. Autorii au explicat datele obi-
nute prin ptrunderea ADN-ului plasmidial mpreun cu tubul polinic n germinare
spre ovule, sugerndu-se c acestea n faza de fecundare sunt sensibile i pot permi-
te ncorporarea ADN-ului strin (Luo i Wu, 1988; Picard i al., 1988). Simplitatea
n efectuare, lipsa unui echipament special i costisitor a determinat continuarea
acestor experiene i n anii90 ai secolului trecut de ctre ali cercettori (Langridge
i al., 1992; Zeng i al., 1994), care au demonstrat succesul transferului de gene me-
diat de tubul polinic. Cu toate acestea, nu exist dovezi sufciente care ar demonstra
c prin aceast metod se poate asigura o integrare i o transmitere n descenden
a genelor inserate.
Transferul genelor n protoplati (celule lipsite de perete celular) reprezint
prima metod de transfer direct al ADN-ului n plante a crei efcien a fost demons-
trat (Krens i al., 1982). Tehnicile utilizate se bazeaz pe proprietile ADN-ului
de a traversa membrana plasmatic i pe totipotenialitatea protoplatilor. Primele
cercetri care au indicat asupra unei transformri stabile a protoplatilor s-au ba-
zat pe permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice pentru ADN-ul strin cu
polietilenglicol.(PEG, solubil n ap, greutatea molecular variaz ntre 200-15000
daltoni) cu formula chimic:
HOH
2
C-(CH
2
-O-CH
2
)
n
-CH
2
OH
30
n general, se utilizeaz polimeri cu greuti moleculare de aproximativ 1500-
6000 daltoni, cu o capacitate ridicat de adiie a ionilor de calciu n mediul de cul-
tur. Polietilenglicolul aplicat n concentraii de 25-40% i la o agitare circular
continu, timp de 30 minute, provoac, la nceput, deshidratarea i aglutinarea pro-
toplatilor cu formarea de puni de hidrogen cu radicalii pozitivi ai proteinelor, fosfoli-
pidelor i glucidelor, proces stimulat de concentraii ridicate de ioni de Ca
++
i valori
superioare ale pH-lui.
Deoarece PEG prezint un anumit grad de toxicitate, iar n unele cazuri determin
formarea celulelor multinucleate, prin fuziuni ale mai multor protoplati, ca o metod
alternativ de transfer al ADN-ului n protoplati a fost propus electroporarea. O con-
centraie mare de ADN plasmidial care conine gena clonat este adugat la o suspensie
de protoplati cruia i se aplic un oc electric de 200-600 V/cm timp de 30-100 milise-
cunde. Ca rezultat, n membranele plasmatice se formeaz pori care permit ptrunderea
ADN-ului exogen n citoplasm (Milic, 1999; Sambrook i Russell, 2001).
Efciena transformrii prin aceste procedee este infuenat de o serie de parametri:
greutatea molecular i concentraia PEG, tensiunea, tipul i durata impulsului electric,
dimensiunile i confguraia plasmidei (superrsucit sau liniarizat), starea fziologic
i stadiul din ciclul celular n care se af protoplatii-recipient, protocolul de regenerare
pentru fecare specie de interes. Al doilea dezavantaj al transferului de gene n proto-
plati este probabilitatea mare de a integra mai multe copii ale transgenei.
Microinjecia este o metod fzic direct de introducere a ADN-ului n nucle-
ul celulei vegetale, sub control optic, aplicat cu succes pentru prima dat n a doua
jumtate a anilor90 ai secolului trecut la tutun i lucern (Crossway i al., 1986).
Este una dintre cele mai laborioase i complexe metode. Prezena peretelui celular
reprezint nu numai o barier fzic, prezentnd difculti n penetrarea peretelui de
ctre microcapilare, ci i o vizibilitate redus a nucleului. Prezena vacuolei mari,
de asemenea, reprezint o problem, deoarece exist riscul distrugerii tonoplastului
n procesul penetrrii spre nucleu. Exist i o serie de avantaje: permite controlul
numrului moleculelor transferate, face posibil cotransferul de ADN, ARN, protei-
ne sau chiar mitocondrii. Transferul moleculelor poate f efectuat n celule izolate,
structuri multicelulare cu mare competen pentru regenerarea plantelor.
Transferul direct al ADN-ului plasmidial cu fbre de carbid-silicon reprezin-
t o metod relativ nou, primele succese find nregistrate n anii 90 ai secolului
trecut la porumb (Kaeppler i al., 1992). Aceast metod ofer o alternativ micro-
injeciei, find extrem de simpl i ieftin pentru producerea plantelor transgenice
fertile. Tuburile Eppendorff cu suspensii de agregate celulare sunt iniial inversate
i apoi vortexate mpreun cu ADN-ul plasmidial i fbrele ncrcate negativ ntr-un
mediu hipertonic cu un coninut de sorbitol 0,25 M i manitol 0,25 M. Ca urmare a
coliziunilor ntre agregatele celulare i fbrele ascuite ca nite ace, peretele celular
este penetrat i ADN-ul ptrunde n citoplasm. Principalii factori care pot afecta
transferul sunt modalitatea i intensitatea agitrii. Pn n prezent metoda a fost
folosit cu succes la porumb i tutun.
31
Un dezavantaj al acestei metode este determinat de tipul de esut-int utilizat.
Pn n prezent s-a reuit utilizarea doar a suspensiilor cu agregate celulare mici cu
perete celular subire. O alt cauz care limiteaz aceast metod o reprezint faptul
c fbrele de carbid-silicon pot f cancerigene din cauza proprietilor similare cu
fbrele de azbest.
Transferul direct al genelor prin metoda biolistic, elaborat n 1987 (Sanford
i al., 1987), se consider a f un progres esenial n manipularea genetic, ntruct
realizeaz transferul genelor n plantele pentru care nu sunt efciente transferul me-
diat de Agrobacterium sau metodele bazate pe protoplati. Principiul acestei metode
constituie utilizarea microproiectilelor lansate cu vitez mare pentru introducerea
ADN-ului n celulele vii.
ADN-ul este precipitat cu clorur de calciu la suprafaa unor particule de aur
sau tungsten, cu diametrul mai mic de 1 micron. Particulele sunt amplasate ntr-un
glon din plastic (macroproiectil), introdus n eava unui dispozitiv special construit
n acest scop. esutul vegetal int este plasat n apropierea unui mic orifciu de la
captul evii. Macroproiectilul este propulsat spre esut cu ajutorul unei ncrc-
turi explozive i cnd se izbete de placa de protecie, particulele pe care le poart
trec prin orifciu i lovesc celulele. eava pistolului i camera cu esutul trebuie s
fe vidate. n caz contrar, rezistena aerului reduce viteza macroproiectilului. Dup
bombardare, celulele sunt transferate n cultur pentru regenerarea plantelor.
Spre deosebire de mecanismele de bombardare cu macroproiectile, o alt varian-
tmicrointirea genereaz mai nti aerosoli printr-un scurt oc de presiune, dup
care accelereaz picturile, conform legii lui Bernoulli ntr-un capilar foarte ngust.
Prin intermediul acestui sistem, 80% din totalul particulelor ajung ntr-o regiune cu
diametrul de numai 150 microni: meristemul. Aceast metod balistic ameliorat este
folosit pentru transformarea inforescenei i meristemelor forale (Raicu, 1997).
Principalii factori limitativi sunt: masa i materiile prime ale particulelor care tre-
buie s reprezinte metale inerte din punct de vedere chimic, natura, forma i concentraia
ADN-ului. Pentru nvelirea particulelor metalice cu ADN, se poate recurge la aditivi
(spermidina, clorura de calciu). Ali parametri cu inciden asupra fziologiei esutului
sunt: condiiile de temperatur, fotoperioada i umiditatea n care sunt meninute plan-
tele-donor, explantele i esuturile transformate. Avantajele acestei tehnici constau n
transformarea esuturilor organizate potenial regenerabile, permit transferul unor gene
strine n germoplasma-elit, tehnica putnd f aplicat teoretic la orice specie.
Alte tehnici de transfer direct al genelor fac apel la: microfascicule laser, lipo-
somi, sonicare, macroinjecie etc. Aceast gam de tehnici de transfer care difer
prin complexitatea tehnic i efcien se af n dezvoltare, n cutarea noilor meto-
de cu condiii tehnice simple, reproductibile n diverse laboratoare fr un echipa-
ment specializat i costisitor.
La momentul actual, conform datelor nregistrate n bazele de date (AGBIOS i
COMPASS) privind PMG aprobate, majoritatea plantelor au fost obinute prin transferul
genelor indirect mediat de Agrobacterium i direct prin metoda biolistic.
32
1.4. regenerarea, selecia i testarea plantelor modifcate genetic
Regenerarea, selecia i testarea PMG reprezint componente eseniale ale unui
protocol de transformare. Datorit totipotenei caracteristice organismului vegetal,
celulele transformate pot regenera prin cultura in.vitro.plante transgenice, care find
supuse unor etape intermediare de selecie sunt cultivate n cmp pentru o testare a
stabilitii expresiei transgenei n condiii naturale.
Sistemele de cultur in.vitro includ att cultura explantelor care i pstreaz
integritatea: embrioni zigotici, meristeme, ct i a celor pentru care condiiile in.
vitro determin o dediferiniere celular mai mult sau mai puin pronunat. De-
diferenierea este procesul prin care celulele unui organ pierd capacitatea de a-i
regla dezvoltarea, devenind apte de a se divide cu formarea unei mase de celule
parenchimatice numit calus (Raicu, 1997). n calitate de explante pentru inducerea
calusului pot f folosite diferite pri ale organelor plantei. Excizia explantului indu-
ce un rspuns de rnire la nivelul seciunilor care, cultivate n prezena hormonilor
din mediu, formeaz calus. Prin modifcarea raportului de substane reglatoare de
cretere n mediul de cultivare este indus organogeneza, asigurat de meristemele
care apar n calusurile cultivate in.vitro..Prin organogenez se formeaz lstari care,
transferai pe un mediu lipsit de hormoni sau cu un coninut sczut de auxin, vor
nrdcina. Plantele, astfel obinute, vor f transferate n ser i, ulterior, n cmp.
Lstarii pot f indui s se formeze i direct pe explantele difereniate: frunze,
tulpini, hipocotile, inforescene, rdcini. n acest caz, ei i au originea n zone r-
mase n stare meristematic sau pot rezulta din diferenierea anumitor celule.
Obinerea plantelor din celule cultivate in.vitro.se poate realiza prin regenerare
att direct, ct i indirect prin calus urmat de organogenez (fg. 1.17.).
Dei etapa de regenerare de.novo prin calus nu este o cerin obligatorie pentru
a genera plante transgenice, aceasta reprezint o etap de baz n majoritatea proto-
coalelor de transformare. Procedura de regenerare trebuie s corespund anumitor
condiii. De exemplu, n cazul transformrii mediate de Agrobacterium, pentru a f
accesibile bacteriei, celulelor care urmeaz s fe regenerate li se aplic diferite for-
me de rnire, iar acestea trebuie s fe competente pentru a primi i integra ADN-T
(Sangwan i al., 1992; Ishida i al., 1996).
Regenerarea plantelor poate f infuenat negativ de concentraii nalte ale bac-
teriei i perioada lung de cocultivare factori eseniali n efciena transformrii.
De aceea, este necesar de a gsi un echilibru ntre frecvena de transformare i vi-
abilitatea esutului. S-a constatat c modul n care materialul vegetal este cultivat
nainte i dup infectare cu bacterii, i n special prezena n mediu a hormonilor,
reglatorilor de cretere i a diferitor substane: antioxidani sau antibiotice pot infu-
ena profund att competena pentru transformare, ct i capacitatea de regenerare
(Joersbo i Okkels, 1996; Perl i al., 1996; Nauerby i al., 1997).
Frecvena regenerrii variaz i este infuenat de genotip i de metoda de
transfer. Depirea acestor difculti este posibil prin elaborarea unor metode de
transformare direct a unor structuri cu potenial natural de regenerare, cum sunt
embrionii i meristemele. Dezvoltarea transformanilor din. astfel de explani este
33
asociat cu un numr mai mic de manipulri ale tehnicii culturii in.vitro. De aseme-
nea, se consider c plantele obinute din cultura meristemelor apicale sau auxiliare
nu prezint variaia somaclonal. Cu ct este mai redus gradul de organizare a esu-
tului i cu ct este mai lung timpul petrecut n aceast stare, cu att este mai mare
amplitudinea fenomenului de variaie somaclonal (variabilitate genetic generat
n timpul culturii de esuturi).
Figura 1.17. regenerarea plantelor prin organogenez direct (1) i indirect (2)
(Raicu, 1997)
Not: A explante: fragmente de organe,.esuturi, celule izolate (polen, protoplati); B este indus for-
marea mugurilor direct din celulele explantului pe un mediu de cultur adecvat; C dezvoltarea lstari-
lor din muguri pe acelai mediu sau pe un mediu de alungire; D celulele explantului iniial sunt induse
s se divid, dediferenieze cu formarea calusului primar; E calusul este subcultivat pe un mediu de
cretere; F este indus organogeneza prin transferul calusului pe un mediu de regenerare; G lstari.
Indiferent de metoda de transfer utilizat, frecvena de integrare a genelor n
genomul celulei este redus. Din aceast cauz, genei de interes, i este asociat o
gen-marker, care permite selecia celulelor vegetale transformate. Cele mai folosite
gene-marker selectabile confer rezisten la un antiobiotic sau un erbicid. Produsul
unei asemenea gene este de obicei o enzim, care inactiveaz o substan toxic i
astfel permite celulelor transformate s supravieuiasc pe un mediu de cultur adi-
ionat cu antibioticul sau erbicidul respectiv i s regenereze.
Alegerea agentului de selecie n concentraie i durat optim de aplicare este
important att pentru un nivel nalt de selectare a celulelor transformate, ct i
pentru o regenerare calitativ. Exist o varietate mare de gene-marker (tab. 1.4.),
care favorizeaz optimizarea factorilor cu inciden n transformare (Wilminkand
i Dons, 1993).
A
B
C
G
E
F
1 2
34
Tabelul 1.4.
Gene-marker utilizate n transformarea genetic a plantelor
(Wilmink i Dons, 1993)
Agentul de
selecie/
substratul
Gena-
marker
Produsul de
expresie
efectul
Principiul
mecanismului de
rezisten
Antibiotice
Kanamicina
C418
Higromicin
aphA2
aphA2
hpt=aphIV
APH(3)II
(NPTII)
APH(3)II
(NPTII)
APH(4)
Sinteza
proteinelor
Fosforilarea agentului
selectiv
erbicide
Basta, PPT
Glifosat
Sulfoniluree
Bromoxinil
Atrazin
bar, pat
aroA,Epsps
csr1-1
bxn
psbA
PAT
EPSPS
ALS
Nitrilasa
Qb
Sinteza
aminoacizilor
Fotosintez

acetilarea agentului de
selecie
modifcarea/
amplifcarea enzimei-
int
degradarea agentului
de selecie
modifcarea enzimei-
int
Ali ageni de selecie
Metotrexat

2,4-D
Dhfr
tfdA
DHFR
DPAM
Sinteza
nucleotidelor
Metabolismul
auxinelor
modifcarea enzimei-
int
degradarea agentului
de selecie
Cea mai des utilizat transgen n calitate de marker de selecie este gena neo-
micin fosfotransferazei aminoglicozidice (3) de tip II (nptII), derivat de la trans-
posonul Tn5 al E. coli, care mai este denumit i gena rezistenei la kanamicin.
Aceast gen confer rezisten fa de antibioticele aminoglicozide. Gena nptII
poate f pus sub controlul elementelor reglatoare de origine bacterian, astfel nu va
f expresat n plante sau poate f controlat de un promotor eucariot care va deter-
mina expresia ei n planta-receptor.
O alt categorie de gene care permit analiza efcienei transformrii genetice
sunt genele raportoare (3epea i Poao, 2000). Expresia acestor gene nu se re-
fect asupra metabolismului sau rezistenei plantelor transgenice n condiii norma-
le sau selective. Scopul utilizrii lor const n identifcarea cu uurin a produselor
lor de expresie (enzime, care pot f detectate cu substraturi cromogene, fuorigene,
care emit fotoni sau radioactive) pentru a concluziona despre prezena i expresia
genelor de interes (vezi cap. 4).
35
Domeniul de utilizare a genelor raportoare este mult mai larg dect transge-
neza. Un aspect al utilizrii lor este cel de a analiza expresia temporal-spaial a
genelor n general, proprie organismului dat, sau a transgenei. n funcie de scopul
cercetrii, secvena codifcatoare a genelor raportoare pot nlocui anumite secvene
n construct. De exemplu, ataarea genei la regiunea promotor permite de a cer-
ceta rolul acestuia n expresia genei respective la nivel de transcripie. nlocuirea
secvenei codifcatoare a genei de interes cu cea a genei raportoare cu pstrarea
regiunilor care codifc secvena de la captul 5` netranslabil al ARNm permite de
a aprecia rolul acestei succesiuni nucleotidice n procesul transportului ARNm din
nucleu n citoplasm i iniierea translrii. Prin combinarea secvenelor codifca-
toare ale genei de interes i raportoare se poate determina, n unele cazuri direct,
cantitatea proteinei active n celule, interaciunea cu alte proteine, polipeptide, acizi
nucleici, membrane etc.
n ultimii ani au fost propuse o serie de gene utilizate n monitorizarea celule-
lor vegetale transformate genetic: genele octopinsintetazei OCS, nopalinsintetazei
NOS, cloramfenicol acetiltransferazei CAT, -galactozidazei LacZ, -glucoro-
nidazei GUS, luciferazei LUC, proteinei fuorescente verzi GFP (Sambrook i
Russell, 2001).
Apelarea la genele raportoare este n funcie de avantajele i limitrile acesto-
ra. Nu exist gene cu utilizare universal, de aceea selectarea unui marker adecvat
se ncepe cu informaia cunoscut. De exemplu, metodele enzimatice de elucidare
a activitii proteinelor raportoare GUS, LUC i CAT sunt mai sensibile dect de-
tectarea fuorescent a GFP, iar stabilitatea nalt a proteinelor GFP, GUS i CAT
in.vivo nu permite de a elucida pe baza lor modifcrile rapide n expresia genelor.
Pentru acest scop este mai efcient LUC, ntruct timpul de degradare a proteinei n
celulele vii este de 2-3 ore (3epea i Poao, 2000).
n primii ani ai practicii de transformare genetic a plantelor, s-a apelat la gena
-glucoronidazei, ns din cauza interveniei distructive a celulelor utilizarea aces-
teia n testarea transgenelor este limitat (vezi cap. 4). n calitate de markeri vizuali
alternativi s-a recurs la luceferaz i la genele antocianinelor, n special n trans-
formarea gramineelor. Dar i n acest caz, simplitatea n vizualizare la microscop
a acumulrilor de pigmeni antociani este contrastat de faptul c acetia afecteaz
dezvoltarea celulelor transformate. ns utilizarea pe larg a luciferazei, care nu ma-
nifest activitate toxic asupra celulelor, este limitat de echipamentul costisitor
pentru vizualizarea produselor reaciei enzimatice.
Proteinele GFP sunt unele din cele mai recent utilizate n calitate de markeri
n transformarea genetic. Acetia permit detecia vizual nedistructiv a celulelor
transgenice prin microscopie fuorescent. Sistemul dat este independent de genotip
i de esutul analizat i prezint un nivel jos de toxicitate.
Reieind din avantajele i dezavantajele fecrui sistem reporter, se consider
c cel mai des utilizate n tennologia ADN-recombinant sunt genele GUS i GFP, i
mai puin LUC i CAT (vezi cap. 4)..
36
Diferite strategii aplicate n scop de selecie (antibiotice, erbicide, gene rapor-
toare) vizeaz asigurarea celulelor cu un component fnal, esenial pentru regene-
rare. De exemplu, benziladenina glucoronidul inactiv este convertit n citochini-
na benziadenina activ n celulele care expreseaz gena gus (Joersbo i Okkels,
1996). Un alt sistem este bazat pe expresia unei gene isopentiltransferaza (ipt), care
determin producerea unui precursor al citochininei (Ebinuma i al., 1997). Aceast
strategie determin producerea unui fenotip transgenic aberant, ns problema n
cauz a fost nlturat prin clonarea genei ipt ntr-un element transpozabil, fcnd
posibil eliminarea genei prin selecia transgenei.
Ultima verifcare a plantelor transgenice n cazul speciilor de interes economic
se face n teste de cmp. Aceste teste au drept scop determinarea stabilitii genetice
a caracterului transferat i evaluarea altor nsuiri cu inciden asupra produciei i
calitii. Pentru tehnologia de transfer al genelor, cea mai important confrmare a
reuitei transformrii const n acceptarea produselor plantelor astfel manipulate de
ctre fermieri i consumatori.
Obiectivele transformrii genetice a plantelor evolueaz odat cu cerinele so-
cietii. Dac n primii ani de utilizare a tehnicilor ADN-ului recombinant erau im-
plicate doar centre tiinifce a cror activitate de cercetare era axat preponderent pe
efcientizarea metodelor de transfer al alogenelor i obinerea PMG cu un caracter
de valoare, acum exist laboratoare comerciale care produc sute de linii transgenice,
cu gene de importan agroindustrial. Realizrile ingineriei genetice vegetale i
gsesc, din ce n ce mai mult, implementare n diverse domenii ale vieii contem-
porane find stimulate de imposibilitatea rezolvrii unor imperative ale timpului,
cum ar f ameliorarea capacitii i calitii produciei, rezistena plantelor la diferii
patogeni i factori abiotici, conservarea biodiversitii, poluarea chimic a mediului
ambiant, farmaceutic, proflaxia i tratamentul multor maladii etc.
Transformarea genetic este pe larg exploatat n obinerea plantelor cu rezis-
ten fa de insecte obiectiv prioritar al biotehnologiilor agricole, determinat de
pierderile enorme de recolt cauzate de insecte i de costul insecticidelor chimice
folosite n agricultur. Ameliorarea rezistenei genetice la insecte a fost posibil
prin utilizarea unor gene codifcatoare de proteine insecticide, care pot f de origine
vegetal, animal sau microbian.
n prezent, cel mai frecvent se recurge la utilizarea genelor plasmidiale ale unei
bacterii din sol Bacillus.thuringiensis..n condiii de stres, aceste bacterii formeaz
endospori pentru care sintetizeaz din abunden o serie de proteine specifce. Surplu-
sul este depozitat sub forma unui corp proteic paracristalin cry.(de la crystal). Fi-
ind ingerate de insectele sensibile, aceste proteine formeaz un complex cu receptorii
specifci din membrana epiteliului intestinal cauznd moartea ei. Efectele letale sunt
limitate la insectele sensibile, ceea ce face ca toxina respectiv s fe n avantaj fa
de insecticidele chimice care distrug un numr mare de insecte inclusiv neduntoare.
37
Dezavantajul insecticidelor biologice pe baz de Bacillus.thuringiensis.este determi-
nat de costul ridicat i de faptul ca acestea sunt rapid descompuse n condiii de cmp.
Transgeneza reprezint o soluie efcient prin introducerea genelor care codifc toxi-
na bacterian n plante. Au fost identifcate peste 1000 de toxine diferite, fecare avnd
un spectru specifc de insecte sensibile. Vertebratele, printre care i omul, nu posed
receptori pentru proteinele Bt (Bacillus thuringiensis).
Genele Bt active mpotriva unor Lepidoptere.(cry1, cry2, cry b i.cry.Q), gn-
dacului de Colorado i altor coleoptere cry 3 au fost transferate la un numr mare
de specii mono- i dicotiledonate cultivate. Expresia genei Bt n PMG determin
sinteza unei protoxine inactive n lungime de 1200 aminoacizi care, dup ingerarea
ei de ctre larvele sensibile, este scindat ntr-un fragment activ de 68 kDa ce lea-
g receptorii celulelor intestinale, blocndu-le funcionarea. Toxinele Bt sunt foarte
specifce i acioneaz chiar i n doze foarte mici (Raicu, 1997).
Primele plante cu rezisten mediat de proteina Bt au fost tutunul i tomatele
MG obinute n 1986 i 1987. La momentul actual, dintre speciile de plante MG
aprobate la nivel internaional, porumbul include cele mai multe linii cu transgene,
care confer rezisten fa de insecte. n baza de date AGBIOS sunt nregistrate gene-
le care codifc proteine insecticide prezente n liniile MG autorizate (tab. 1.5.).
Tabelul 1.5.
Gene utilizate n transformarea genetic n scopul
obinerii rezistenei fa de insecte
Nr. de
varieti
Gene de interes Sursa de gene
7 Cry1Ab Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (Btk)
3 Cry1Ac Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (Btk)
4 cry1F Bacillus.thuringiensis.var..aizawai
2 cry2Ab Bacillus.thuringiensis
4 cry34Ab1 Bacillus thuringiensis s. PS149B1
3 cry35Ab1 Bacillus thuringiensis s. PS149B1
4 cry3A Bacillus.thuringiensis.subsp..Tenebrionis
2 cry3Bb1 Bacillus.thuringiensis.subsp..kumamotoensis
1 cry9c Bacillus.thuringiensis.subsp..Tolworthi
1 Inhibitor al proteazelor Solanum.tuberosum
1 VIP3A Bacillus thuringiensis s. AB88
O alt grup de proteine insecticide ns de origine vegetal sunt: lectinele (im-
plicate n fenomene de recunoatere celular), inhibitorii amilazei i inhibitorii pro-
teazelor (prezente n seminele leguminoaselor i cerealelor) care, atunci cnd sunt
ingerate n doze mari, inhib creterea i dezvoltarea insectelor, ns cu o rat a morta-
litii mai redus comparativ cu proteinele Bt. Medierea rezistenei de ctre inihibitorii
proteazelor de origine vegetal (proteine mici, 5 - 25 kDa) este determinat de faptul
c cea mai mare parte din insectele ftofage utilizeaz proteazele pentru a digera prote-
inele ingerate. Inhibitorii proteazelor acioneaz ca analogi ai substratului, formnd cu
proteazele complexe necovalente, stabile. Primele plante transgenice care sintetizau
38
un inhibitor al proteazelor cu serin au fost obinute n 1987. Aceast strategie a fost
testat la mai multe specii de plante pentru protecia mpotriva lepidopterelor.
Tuberculii de cartof conin un grup de glicoproteine numite palatine, cu greuta-
te molecular de 40 kDa (cca 40% din totalul proteinelor de rezerv). Palatinele sunt
considerate substane de protecie contra insectelor i a unor microorganisme care
conin lipaze, active n degradarea lipidelor, cu eliberare de acizi grai. Transferul
genelor acestor proteine la tutun i tomate n anul 1987 a determinat creterea capa-
citii de rezisten la atacul larvelor de Manduca.sexta (omida cu corn), cu o mare
sensibilitate la endotoxine. Se consider c exist peste 50 toxine diferite pentru
larvele de Lepidoptere (Milic, 1999).
n laboratoarele academice i industriale se fac eforturi imense pentru a desco-
peri noi proteine insecticide, ns rezultatele testelor de cmp au evideniat niveluri
de rezisten cu valoare comercial doar n cazul utilizrii transgenelor derivate de
la Bacillus.thuringiensis.
Principala problem legat de utilizarea proteinei Bt const n posibila apariie
a unor insecte rezistente la aceast toxin. Dezvoltarea rezistenei fa de insecte la
PMG se asociaz cu un control integrat al populaiilor de duntori. Strategiile pe
termen scurt presupun expresia la un nivel foarte nalt a genelor Bt, cultivarea unor
plante-gazd sensibile, n paralel cu cele transgenice, ca refugiu pentru duntori,
practici agronomice care reduc expunerea insectelor la aciunea toxinei Bt etc. Se
prevede c strategiile pe termen lung vor exploata genele multiple care codifc pro-
teine insecticide cu ci unice de aciune.
Ameliorarea rezistenei genetice la insecte ofer o serie de benefcii care constau n:
Viitorul biotehnologiilor agricole care vizeaz combaterea duntorilor i m-
rirea rezistenei la boli pare a f promitor. Primele cercetri au fost orientate spre
diminuarea efectelor negative ale virusurilor asupra produciilor vegetale. Reieind
din faptul c recunoaterea i neutralizarea patogenului sunt mediate de anticorpi, s-a
estimat c expresia n plantele transgenice a genelor care codifc anticorpi ar putea
s confere niveluri ridicate de rezisten la patogeni specifci. ntr-o plant transgeni-
c capacitatea unui anticorp de a conferi rezisten fa de un patogen depinde exclu-
siv de posibilitatea lui de a interfera cu funcionarea unor proteine virale, legndu-se
de situsurile lor antigene. Au fost obinute plante transgenice de tutun care exprimau
anticorpi monoclonali ce conineau numai domeniile necesare pentru recunoaterea
i legarea antigenei proteina viral. Liniile transgenice inoculate cu o suspensie
reducerea polurii chimice a solului;
protejarea entomofaunei;
eliminarea reziduurilor de insecticide din ap i alimente;
ameliorarea calitii produciei;
sporirea recoltei de pe aceleai suprafee de teren arabil, nu se extind suprafeele
agricole n detrimentul pdurilor, ceea ce contribuie la protejarea solului m-
potriva eroziunii.
39
viral de o mie de ori mai concentrat dect minimul necesar pentru inducerea unei
infecii sistemice au prezentat simptome cu 5 pn la 14 zile mai trziu dect plan-
tele-martor. Aceast tehnologie, deocamdat puin exploatat, va pune la dispoziia
ingineriei genetice o gam nelimitat de anticorpi specifci (Milic, 1999).
O alt strategie n crearea rezistenei la virusuri se bazeaz pe blocarea ARN-
ului virotic prin proteine de nveli, respectiv secvene de ARN-antiviral. Prin trans-
formarea genetic a plantelor cu gene responsabile de sinteza proteinelor de nveli
a unui virus planta produce astfel de proteine ca form de aprare contra virusului
respectiv. n acest mod se asigur o protecie fa de diveri ageni patogeni. De
exemplu, s-a reuit combaterea virusului nervurilor galbene la sfecl i a virusului
mozaicului tutunului (Milic, 1999; Sala i al., 2003).
Baza de date internaional AGBIOS include PMG cu trei tipuri de gene de
interes, care determin rezistena la infecii virale (tab. 1.6.).
Tabelul 1.6.
Gene utilizate n transformarea genetic n scopul obinerii
rezistenei fa de infecii virale
Gene de interes Sursa de gene
Helicaz
Virusul rsucirii frunzelor la cartof orf 2
(Potato leafroll luteovirus (PLRV) orf 2)
replicaz
(ArN dependent de ArN polimeraza)
Virusul rsucirii frunzelor la cartof orf 1
(Potato leafroll luteovirus (PLRV) orf 1)
Proteine de nveli virale
Virusul mozaicului la castravei
(Cucumber mosaic cucumovirus)
Proteine ale capsidei virale
Virusul petelor inelare la papaia
(Papaya ringspot potyvirus (PRSV))
Virusul Y la cartof
(Potato potyvirus Y (PVY))
Virusul mozaicului la pepenele verde
(Watermelon mosaic potyvirus 2)
Virusul mozaicului galben la dovlecei
(Zucchini yellow mosaic potyvirus)
Foarte puin se tie despre impactul cultivrii PMG cu transgene de origine
viral asupra mediului. Riscurile poteniale ale acestor transgene ar putea f deter-
minate de posibiliti de evoluie a populaiilor virale, favoriznd apariia unor vari-
ante rezistente. Se presupune c aceste riscuri ar putea f determinate n special de:
recombinarea ntre genomul ARN al unui virus i transcriptul ARN derivat dintr-o
gen viral, schimbarea modului de transmitere a virusului de ctre insectele-vector,
datorit ncapsidrii genomurilor ARN ale unor virusuri infectante de ctre protei-
nele codifcate de o transgen (heteroncapsidare).
n ce privete combaterea bacteriilor i mai ales a ciupercilor ftopatogene,
cercetrile sunt mai avansate. Plantele sintetizeaz proteine capabile s inhibe cre-
terea fungilor in.vitro..Expresia constitutiv sau indus a genelor corespunztoare n
plantele transgenice poate determina rezistena la atacul ciupercilor. Cele mai cunos-
40
cute proteine antifungice sunt chitinazele i -1,3-glucanazele enzime implicate
n hidroliza chitinei i -1,3-glucanului din pereii celulelor fungale, astfel inhibnd
creterea lor. Au fost descrise patru clase de endochitinaze i trei clase majore de -
1,3-glucanaze prezente la tutun. Aceste hidrolaze acioneaz sinergic, manifestnd
o activitate foarte puternic de inhibare a creterii multor fungi. Utilizarea genelor
care codifc diferite clase ale acestor enzime n transgenez s-a dovedit a f efcient
la unele varieti de tutun transgenice care sintetizeaz o chitinaz bacterian sau
vegetal i la tomate, la care coexpresia acestor gene a determinat niveluri sporite
de rezisten la Fusarium.(Milic, 1999; Raicu, 1997).
Prin evaluarea altor proteine corelate cu patogeneza (PR = Pathogenesis Rela-
ted Proteins), de exemplu, a osmotinei (PR5 protein vacuolar indus de stresul
salin, descoperit la tutun), s-a reuit. supraexpresia acesteia n plantele de cartof,
determinnd o ntrziere semnifcativ a dezvoltrii leziunilor produse de Phytoph-
thora infestans. Tot la plante s-a descoperit o familie de peptide mici antifungice,
numite defensine. Unele dintre aceste tipuri de peptide, izolate din seminele mai
multor specii (Raphanus sativus, Amaranthus caudatus, Mirabilis jatapa, Urtica
dioica, Triticum i Hordeum), manifest in.vitro.o activitate antifungic fa de un
spectru larg de patogeni. O gen de la ridiche, care codifc proteina II (R
S
-AFP2),
a.fost exprimat n plantele de tutun transgenice inducnd un anumit nivel de rezis-
ten fa de Alternaria longipes.
Fitoalexinele, compui cu greutate molecular mic, par s aib un rol im-
portant n rezistena plantelor la patogeni. Mutantele de Arabidopsis thaliana, care.
au o capacitate redus de a sintetiza ftoalexine prezint leziuni mai mari n urma
infeciilor fungice. Expresia genei stilben-sintetazei de la via-de-vie n plantele de
tutun a determinat producerea unei noi ftoalexine (resveratrol) i o rezisten mrit
la infecia cu Botrytis.cinerea..
O alt strategie se bazeaz pe variate tipuri de oxigen activ, inclusiv peroxidul
de hidrogen (H
2
O
2
) cu rol important n rspunsul de aprare al plantei i la infeciile
patogenilor. Plantele transgenice de cartof care exprim o gen de origine fungic
pentru glucozo - oxidaz, ce genereaz H
2
O
2
, aveau niveluri crescute ale rezistenei
fa de unii patogeni fungici i bacterieni: Erwinia carotovora, Verticillium, Phyto-
phthora infestans. Prin urmare, generarea diferitor tipuri de oxigen activ n plantele
transgenice pare s determine o rezisten la un spectru foarte larg de boli.
Primele ncercri de a obine plante rezistente la patogenii bacterieni au apelat
la peptidele magainine sau cecropine, care s-au dovedit a f cu activitate antibacte-
rian redus in.vitro..Mult mai efcient a fost lizozimul de la bacteriofagul T4, care,
exprimat n tuberculii plantelor transgenice de cartof, a mrit rezistena la Erwinia.
carotovora ssp. Atroseptica (Raicu 1997).. O alt ncercare de ameliorare a rezis-
tenei la bacterii a inclus toxinele nespecifce pentru gazd care sunt determinani
majori ai virulenei patogenilor bacterieni. Manipularea rezistenei plantelor de tu-
tun la un patogen bacterian P. syringae pv. tabaci a fost realizat cu succes prin
intermediul unei gene, care codifc o enzim ce inactiveaz toxina: gena pentru
acetil-transferaza tabtoxin specifc..
41
Dei exist rezultate promitoare n acest domeniu, puine sunt speciile trans-
genice ce ar manifesta un nivel de rezisten cu valoare agronomic.
Posibiliti nalte de valorifcare a transgenezei n sectorul agricol prezint ge-
nele pentru rezisten la erbicide. Erbicidele, similar celorlalte pesticide, reprezint
factori indispensabili obinerii unei recolte nalte. Aceste substane chimice ar trebui
s acioneze selectiv, afectnd doar buruienile, nu i cultura n care sunt aplicate. n
consecin, cele mai multe dintre ele sunt adaptate anumitor culturi. n acelai timp
utilizarea lor neraional poate avea efecte grave asupra biocenozei prin acumularea
lor persistent n lanul trofc datorit biodegradibilitii joase a multora dintre ele.
Orientarea modern n activitatea de combatere a buruienilor din culturi vizea-
z dou direcii: creterea dozelor de erbicide n scopul eradicrii sigure a buruie-
nilor n paralel cu sporirea potenialului de rezisten a plantelor cultivate fa de
erbicidul administrat.
Prin ingineria genetic se ncearc extinderea gamei culturilor n care pot f
folosite erbicide totale (cu efecte minime asupra mediului i cu costuri de producie
reduse) i fexibilizarea aplicrii tratamentelor, n condiiile eliminrii restriciilor
impuse de sensibilitatea speciilor cultivate. n acest scop se recurge la:
creterea nivelului enzimei-int pentru un anumit erbicid;
expresia unei transgene derivate de la bacterii, sau plante a crui produs de
expresie nu este afectat de compusul activ;
introducerea n plantele cultivate a unui sistem de degradare a erbicidului.
Principalele erbicide asupra crora s-au efectuat cercetri pentru mrirea re-
zistenei culturilor agricole la doze mai ridicate sunt erbicidele ikimice (glifosatul
comercializat sub numele Roundup). Aceste chimicale sunt sistemice totale i au ca
int o enzim din calea metabolic de sintez a aminoacizilor aromatici eseniali
5-enolpiruvil ikimat-3-fosfat-sintaz (EPSPS), localizat n cloroplast. n consecin-
, blocarea sintezei triptofanului cu rol de precursor n sinteza acidului indolilacetic
conduce la carene accentuate n auxine naturale i la ncetarea creterii plantelor.
Gena pentru EPSPS a fost clonat i introdus n genom prin transformare
genetic. Expresia acesteia a determinat sporirea de 20 de ori a nivelului activitii
enzimei fa de plantele netransgenice.
Acetolactat-sintetaza (ALS) este enzima-int pentru sulfoniluree i imidazoli-
none, care catalizeaz prima etap din biosinteza aminoacizilor cu caten ramifcat:
valin, leucin i izoleucin. Gena als.izolat i clonat de la liniile mutante de tutun
rezistente, care conineau o enzim insensibil la aceste erbicide, find transferat,
s-au obinut plante transgenice tolerante la compuii respectivi.
O larg aplicaie au i transgenele care codifc sinteza unor enzime ce degra-
deaz substanele active. De exemplu, fosfnotricinul (PPT), un inhibitor al gluta-
min-sintetazei, este inactivat de o acetiltransferaz codifcat de gena bar clonat
de la Streptomyces.hygroscopicus..Plantele la care a fost transferat aceast gen au
devenit rezistente la fosfnotricin. Bromoxinilul este un alt erbicid nitrilic degradat
efcient de unele bacterii din sol - Klebsiella.ozaenae.care.folosete bromoxinilul ca
42
surs de azot, deoarece conine enzima nitrilaza, care l convertete n acid 3,5-di-
bromo-4-hidroxibenzoic. Gena care codifc aceast enzim a fost utilizat cu suc-
ces pentru a obine plante rezistente la acest erbicid.
n rile care au aprobat introducerea n cultur i comer a PMG, majoritatea
plantelor conin transgene, care determin rezistena la erbicide. Conform bazei de
date AGBIOS, 20 de varieti conin transgenele EPSPS (toleran la glifosat), 31
de varieti fosfnotricinNacetiltransferaza PAT toleran la glufosinatul de
amoniu (tab. 1.7. i fg. 1.18.).
Tabelul 1.7.
Gene utilizate n transformarea genetic cu scopul
de a obine rezisten la erbicide
Gena de interes Abreviere Sursa de gene
rezisten la
erbicidul:
5-enolpiruvilikimat-3-
fosfat sintaza
EPSPS Agrobacterium tumefaciens CP4;
Zea.mays Glifosat
Acetolactat sintaza ALS Himer obinut din 2 gene AHAS
(S4-Hr4);
Linia de Arabidopsis thaliana tolerant
la clorsulfuron;
Nicotiana tabacum tolerant
la clorsulfuron
Sulfonil uree
Nitrilaza Nitrilaza Klebsiella.pneumoniae.s..ozanae Bromoxinil
i ioxinil
FosfnotricinN
acetiltransferaza
PAT Streptomyces.hygroscopicus
Streptomyces.viridochromogenes
Glufosinat de
amoniu
34%
5%
7%
54%
EPSPS
ALS
Nitrilaza
PAT
Figura 1.18. Numrul de varieti (%) care conin gene utilizate n obinerea PMG
rezistente la erbicide aprobate la nivel internaional (AGBIoS)
Un alt scop al transgenezei const n obinerea unor plante cu compoziie bio-
chimic i dezvoltare modifcat. Androsterilitatea citoplasmatic este folosit pe
43
scar larg n obinerea seminelor hibride, deoarece elimin necesitatea castrrii
manuale a genitorului matern. ns pentru multe specii cu nsuiri agronomice de
valoare nu se cunosc bazele moleculare i fziologo-biochimice ale acestui fenomen.
De asemenea, pentru ca liniile consangvine astfel obinute s poat f multiplicate,
trebuie s se dispun i de gene restauratoare ale fertilitii. La mai multe plante
cultivate, printre care i Brassica napus, surs major de ulei vegetal, a fost introdus
un sistem, manipulat genetic, de androsterilitate i restaurare a fertilitii.
Sterilitatea este determinat de o ribonucleaz numit barnaza, produs de
bacteria Bacillus amyloliquefaciens. Regiunea de codifcare a genei bacteriene ata-
at unui promotor TA 29, care are o expresie esut specifc n tapetum care n-
conjoar sacii polinici din antere, find transferat a determinat androsterilitatea ca
urmare a distrugerii celulelor tapetumului din cauza degradrii ARN-ului de ctre
barnaza. Pentru restaurarea fertilitii, se utilizeaz o alt protein, numit barstar,
produs tot de Bacillus amyloliquefaciens. Barstar este o protein intracelular, care
inactiveaz barnaza, formnd un complex stabil enzimatic inactiv n citoplasm,
protejnd astfel celulele bacteriene de propria lor toxin. Plantele transformate cu
o gen artifcial TA 29- barstar sunt fertile. Ele produc barstar n tapetum, dato-
rit specifcitii de esut a promotorului TA29 i atunci cnd plantele androsterile
TA29-barnaza sunt ncruciate cu genitorii masculi care posed TA29-barstar, rezul-
t hibrizi F
1
fertili.
Calitatea i cantitatea substanelor de rezerv (uleiuri, proteine, hidrai de car-
bon) sunt caracteristici individuale ale familiei genului i chiar ale speciei care tind
s fe relativ constante. Variabilitatea natural sau indus artifcial furnizeaz numai
forme cu un set complet sau incomplet de gene responsabile pentru formarea com-
puilor de rezerv. Nu este posibil adugarea de noi gene la cele deja existente n
plantele cultivate prin metodele clasice de ameliorare. Transferul genelor ntre spe-
cii ndeprtate genetic n scopul creterii performanelor lor agronomice este posibil
numai prin inginerie genetic.
Cultura plantelor oleaginoase prezint un interes deosebit ca obiectiv al trans-
formrii genetice determinat de producia acestor specii, care poate f valorifcat
nu numai ca aliment, ci i n industrie. Prin transferul unor gene strine, de la alte
organisme au fost obinute varieti proiectate (designer crops) pentru producerea
de uleiuri superioare industriale. Elaborarea acestei tehnologii este deja avansat la
rapi singura specie oleaginoas important pentru care exist tehnici efciente de
transformare genetic. La aceast specie, n afara celor dou varieti naturale exis-
tente, una cu coninut ridicat n acid erucic, alta bogat n acid oleic, au fost produse
trei noi designer crops cu coninut ridicat n acid stearic (n proporie de 25-30%,
un ingredient major al margarinelor i substituent al untului de cacao), acid lauric
(cu 25%) i acidul petroselinic..Interesate de acest acid sunt industriile detergenilor
i maselor plastice. Gena implicat n sinteza acidului petroselinic a fost izolat de
la Coriandrum sativum. Se intenioneaz, de asemenea, crearea unei noi varieti de
rapi, care s conin cear jojoba, utilizat n industria farmaceutic, n produce-
44
rea de cosmetice i ca lubrifant. Aceast cear lichid se gsete n uleiul coninut
de seminele unui arbust din deertul nord-american, Jojoba simmondsia chinensis
(Raicu, 1997).
Se af n teste de cmp plante transgenice de rapi, care conin acid -linoleic,
folosit ca agent terapeutic analgezic ntr-o serie de boli. Gena care codifc enzima
implicat a fost izolat de la cteva specii de cianobacterii, iar transferul ei la rapi
a dus la.acumularea acidului -linoleic n semine. Se estimeaz c n urmtorii 5-10
ani vor f elaborate tehnici de transformare efciente i pentru celelalte specii oleagi-
noase: foarea-soarelui, soia i inul pentru semine.
O alt grup de constitueni biochimici cu importan comercial o reprezint
proteinele de rezerv, n special cele bogate n aminoacizi eseniali. De exemplu,
orezul este defcitar n cistein, metionin i lizin, orzul i sorgul sunt srace n
treonin i lizin, porumbul n lizin i triptofan, iar legumele n aminoacizi
cu sulf. Pentru ameliorarea valorii nutritive a proteinelor de rezerv se realizeaz
izolarea i transferul unor gene pentru proteinele de rezerv, modifcarea secvenei
nucleotidice prin inserarea codonilor suplimentari pentru aminoacizii defcitari. O
alt strategie presupune modifcarea expresiei genelor astfel nct proteinele care au
un coninut mai bogat de aminoacizi defcitari s fe sintetizate preferenial. ntruct
n sinteza multor aminoacizi intervin enzime-cheie reglate feedback, pot f identif-
cate gene mutante care codifc enzime insensibile la acest gen de control i astfel
se realizeaz stimularea sintezei aminoacidului respectiv. Prin intermediul acestei
strategii, se ncearc ameliorarea coninutului de lizin la orez, utilizndu-se o gen
de la Escherichia coli, care.codifc o enzim mai puin sensibil la retroinhibiie.
Actualmente, n practica biotehnologiilor agricole exist cinci varieti cu
compoziia biochimic modifcat, nou cu androsterilitate/ restaurare a fertilitii
indus, dou cu culoarea forilor modifcat i apte cu o durat mai mare de
coacere (tab. 1.8.).
De tehnologia ADN-ului recombinant benefciaz i industria farmaceutic.
Mai multe laboratoare ncearc s sintetizeze, cu ajutorul plantelor, molecule bioac-
tive, care pn nu demult erau obinute doar prin intermediul microorganismelor i
celulelor animale. Sistemele microbiene i animale au numeroase dezavantaje lega-
te de costul de producere nalt i securitate, ceea ce a i stimulat utilizarea PMG n
calitate de instrumente n obinerea moleculelor farmaceutice: antigene, anticorpi,
factori de cretere, enzime, vitamine, receptorii colinergici, colagen, lactoferina
uman, hemoglobina etc. (Miele, 1997; Fischer i Emans, 2000; Giddings i al.,
2000; Twyman i al., 2003).
45
Tabelul 1.8.
Transgene implicate n modifcarea dezvoltrii
i compoziiei biochimice a plantelor
Caracterul Genele de interes Sursa de gene Nr. de varieti
Compoziie modifcat a constituenilor biochimici
Aminoacizi
coninut nalt n lizin
cordapA, codifc enzima
dihidrodipicolinat sintaza (cDHDPS)
Corynebacterium
glutamicum
1
Acizi grai
coninut nalt al acidului
lauric i miristic
coninut nalt al acidului
oleic
Genele codifcatoare ale:
tioesterazei
dehidrogenazei acizilor grai- delta
(12)
Umbellularia
californica
Glycine.max
1
2
Coninut redus de
nicotin
Gena nicotinat-nucleotid
pirofosforilazei
Nicotiana
tabacum
1
Dezvoltare modifcat
Androsterilitate/
restaurarea fertilitii
androsterilitate
restaurarea feritilitii
androsterilitate
Genele: ribonucleazei barnaza.
Barstar
Adenin metilazei ADN
Bacillus.
amyloliquefaciens
Escherichia coli
8
1
Culoare modifcat Gena favonoid 3p, 5p hidroxilazei Petunia hybrida,
sp..Viola
2
Creterea duratei de
coacere
Genele:
sintazei acidului 1-amino-ciclopropan
-1-carboxilic
deaminazei acidului 1-amino-
ciclopropan-1-carboxilic (ACCd)
sintazei acidului 1-aminociclopropan-
1-carboxillic (ACC)
poligalacturonazei (PG)
hidrolazei S-adenozilmetioninei
Dianthus
caryophyllus.L.
Pseudomonas
chlororaphis
Lycopersicon.
esculentum
Lycopersicon.
esculentum
E..coli.
bacteriofagul T3
1
1
2
2
1
Perspectivele utilizrii plantelor-biofabrici sunt determinate de un ir de bene-
fcii precum:
producia de materie vegetal este relativ uor de obinut i ieftin;
vaccinurile obinute pot f pstrate la temperatura mediului ambiant, n
ambalajul lor natural (fructe, rizomi, tuberculi);
riscurile contaminrilor virale sau bacteriene asociate utilizrii vaccinuri-
lor produse pornind de la esuturi umane sau animale sunt eliminate;
obinerea moleculelor funcionale, crora le-a fost mbogit coninutul de
substane specifce utile pentru sntatea consumatorului (vitamine .a.)
sau pentru anumite utilizri cu caracter industrial (fbre etc.).
Un exemplu concret de rezolvare a unei probleme sociale prin intermediul PMG
l reprezint defciena n vitamina A, caracteristic pentru mai mult de 124 milioane de
copii din ntreaga lume. Printr-un aport de vitamina A n diet s-ar preveni anual moartea
a 1,3 - 2,5 milioane de copii mici de vrst precolar (Mayne, 1996; Grusak, 1999).
Compuii vitaminei A sunt reprezentai de ctre retinol, care deriv din -ca-
roten (provitamina A) sintetizat de microorganisme i plante (Cunningham i Gantt
E, 1998). Pentru o nutriie echilibrat n vitamina A, este necesar de consumat zilnic
alimente cu un aport de 1000 echivaleni retinol, ceea ce este egal cu 6 mg de -
carotena. Acest fapt, a impulsionat elaborarea diferitor strategii de sporire a coni-
nutului de -caroten n plante (Guiliano i al., 2000). Pn n prezent sunt obinute
plante transgenice de orez cu bobul galben, care conine n semine vitamina A i
fer (30% din populaia globului este afectat de defcitul de fer) ca urmare a modi-
fcrii genetice, ceea ce este important pentru rile cu populaia srac, malnutrit.
Orezul galben sintetizeaz -carotenul nu numai n esuturile verzi, ci i n semine,
deoarece n genomul su sunt incluse mai multe gene, care codifc enzimele-cheie
ale biosintezei acestui pigment (ftoen sintaza, ftoen desaturaza, caroten disaturaza,
licopen -ciclaza). Prin transformare genetic s-a reuit majorarea coninutului de
-caroten pn la 200 g la 100 g material (Sandmann, 2001). n aceeai specie de
orez a fost introdus i o gen izolat de la soia, care codifc feritina o protein
ce stocheaz i transport ferul. Funcionarea acestei gene puse sub controlul unui
promotor smn specifc a fcut s creasc de trei ori nivelul ferului n bobul
de orez. Date recente au demonstrat utilizarea tehnicii de inginerie genetic i n sin-
teza ameliorat a altor vitamine: C acidul ascorbic i H biotina (Patton D, 1997;
Jain i Nessler, 2000; Alban i al., 2000; Conklin, 2001).
Printre ali compui farmaceutici activi produi n plante transgenice se enum-
r (Kapusta i al., 1999; Stoger i al., 2000 ):
antigene (decarboxilaza acidului glutamic, enterotoxina de la E..coli);
anticorpi (anticorpul monoclonal lgG (Guy S 13), Herpes. simplex MAB,
monocatena FV);
factori de cretere (granulocite macrofage, factorul de cretere epidermal
uman);
enzime;
ali compui cu rol terapeutic (receptorii colinergici, colagen, lactoferina
uman, hemoglobina, proteina uman C).
Capitolul
SOCIETATEA NTRE RISCURILE I BENEFICIILE
BIOTEHNOLOGIILOR
2.1. Culturi agricole modificate genetic
2.2. Strategii de nregistrare i stocare a
informaiei privind PMG n bazele de date
2.3. Laboratoare acreditate n testarea OMG
2.4. Norme i legi ce reglementeaz analiza
OMG
2.5. Metode validate aprobate pentru testarea
OMG
CAPITOLUL 2
STANDARDIZAREA I
VALIDAREA INTERNAIONAL
Structura sondajului: Structura sondajului:
Beneficii
i riscuri
ale
Biotehnologiilor
Direcii:
Beneficii
i riscuri
ale
Biotehnologiilor
Direcii:
Nivelul de
cunoatere
Aspecte:
Nivelul de
cunoatere
Aspecte:
Nivelul
atitudinilor
Aspecte:
Nivelul
atitudinilor
Aspecte:
Argumente
Pro i
Contra
Argumente
Pro i
Contra
Biotehnologii
Biotehnologii
Inginerie
genic
Inginerie
genic
Clonare
Clonare
Organisme
modificate
genetic
Organisme
modificate
genetic Acceptare
Acceptare
Implicare
Implicare
1. Noiuni
2. Exemple
3. Scop
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
LIMPS
USM
Acceptare
parial
Atitudine
moderat
Entuziasm
%
54
SOCIETATEA NTRE RISCURILE I BENEFICIILE
BIOTEHNOLOGIILOR
2.1. Culturi agricole modificate genetic
informaiei privind PMG n bazele de date
2.3. Laboratoare acreditate n testarea OMG
2.4. Norme i legi ce reglementeaz analiza
OMG
OMG
CAPITOLUL 2
STANDARDIZAREA I
Structura sondajului: Structura sondajului:
Beneficii
i riscuri
ale
Biotehnologiilor
Direcii:
Beneficii
i riscuri
ale
Biotehnologiilor
Direcii:
Nivelul de
cunoatere
Aspecte:
Nivelul de
cunoatere
Aspecte:
Nivelul
atitudinilor
Aspecte:
Nivelul
atitudinilor
Aspecte:
Argumente
Pro i
Contra
Argumente
Pro i
Contra
Biotehnologii
Biotehnologii
Inginerie
genic
Inginerie
genic
Clonare
Clonare
Organisme
modificate
genetic
Organisme
modificate
genetic Acceptare Acceptare Implicare Implicare
1. Noiuni
2. Exemple
3. Scop
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
LIMPS
USM
Acceptare
parial
Atitudine
moderat
Entuziasm
%
54
STANDARDIZAREA I
2.1. Culturi agricole modifcate genetic
informaiei privind PMG n bazele de
date
2.3. Laboratoare acreditate pentru testarea
OMG
2.4. Norme i legi ce reglementeaz testarea
OMG
OMG
SoCIeTATeA NTre rISCUrILe I BeNeFICIILe
BIoTeHNoLoGIILor
2
Acceptarea Biotehnologiilor n
societatea noastr
48
Capitolul 2. STANDArDIzAreA I VALIDAreA
INTerNAIoNAL
Comercializarea culturilor modifcate genetic poate avea un impact profund asu-
pra societii din punctul de vedere att al securitii alimentare, coninutului i valorii
nutriionale fa de cele obinute prin agricultura tradiional, ct i al implicaiilor
economice. ntruct n reeaua de marketuri din lume exist din ce n ce mai multe va-
rieti cu caractere modifcate, monitorizarea materialului transgen, chiar i n cele mai
mici cantiti, i identifcarea varietilor modifcate genetic vor deveni un imperativ
important n determinarea puritii seminelor, privind lipsa transgenelor n culturile
agricole, nainte de a f comercializate. O monitorizare efcient a utilizrii culturilor
biotehnologice afate astzi n ascensiune, a securitii eliberrii acestora n mediu
este favorizat de accesibilitatea i de transparena sistemelor informaionale privind
transformarea genetic, n special secvenele nucleotidice ale alogenelor. Accesul la
materialele de referin certifcate i la datele moleculare a PMG poate contribui la o
cooperare mai strns a structurilor implicate n activiti cu culturile biotehnologice,
ncepnd de la productori, ageni economici, experi n domeniu etc.
Tehnicile de testare a OMG sunt continuu perfecionate n scopul mbuntirii
sensibilitii, reproductibilitii i duratei de analiz, ns aceste performane pot
f puternic diminuate de procedura de prelevare i preparare a probelor. De aceea,
pornind de la potenialul impact socio-economic al PMG, este important ca deter-
minrile analitice ale prezenei/ absenei OMG n alimente i produse agricole s fe
efectuate conform tehnologiilor i standardelor validate la nivel internaional.
2.1. Culturi agricole modifcate genetic
Serviciul Internaional pentru Achiziionarea Aplicaiilor Agricole Biotehnolo-
gice (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications ISA-
AA, www.isaaa.org.) public informaii privind culturile agricole modifcate ge-
netic i suprafeele cultivate cu acestea, ncepnd din anii 1996, cnd s-au realizat
primele comercializri ale PMG (n prezent mai des sunt denumite semnturi bio-
tehnologice). Conform Declaraiei Nr. 35 2006, a unsprezecea n seriile anuale, n
anul 2006, considerat primul an al decadei a doua de comercializare (2006 - 2015),
suprafaa global a semnturilor biotehnologice a continuat s se extind. n acest
an 22 de ri (11 ri n curs de dezvoltare i 11 ri industriale) au plantat PMG pe
102 mln ha, cu 12 mln ha mai mult comparativ cu suprafaa cultivat cu aceste cul-
turi n 2005. Este de remarcat faptul c suprafeele cultivate cu PMG n primii zece
ani de comercializare au crescut pe scar mondial mai mult de 60 ori, reprezentnd
cea mai rapid dezvoltare a tehnologiilor agricole. n anul 2006, similar primilor
10 ani de comercializare a culturilor MG, SUA rmne a f lider incontestabil dup
suprafaa ocupat cu semnturi biotehnologice (54,6 mln ha, ceea ce reprezint
53% din suprafaa total a culturilor biotehnologice), urmate de Argentina, Brazi-
lia, Canada, India i China. Alte 16 ri care cultiv PMG sunt enumerate n ordine
49
descresctoare a suprafeelor: Paraguay, Africa de Sud, Uruguay, Filipine, Australia,
Romnia, Mexic, Spania, Columbia, Frana, Iran, Honduras, Republica Ceh, Por-
tugalia, Germania i Slovacia (fg. 2.1.).
Figura 2.1. rile n care este autorizat cultivarea
plantelor modifcate genetic (mln ha)
n prima decad a comercializrii PMG, raportul dintre suprafaa mondial cul-
tivat cu plante transgenice i cea cultivat de rile cu economia slab dezvoltat
indic o cretere n fecare an. Mai mult de o ptrime din suprafa mondial de
semnturi biotehnologice n anul 2006 este cultivat n rile n curs de dezvoltare,
nregistrndu-se o cretere cu 21% n comparaie cu statele industriale, n care su-
prafeele s-au majorat doar cu 9% (fg. 2.2.).
Figura 2.2. Suprafaa cultivat cu PMG de rile cu economie
slab dezvoltat i de rile industriale
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
ri cu economie
slab dezvoltat
ri industriale suprafaa total
2005
2006
m
i
l
.
h
a
mln.ha
MG, SUA rmn a fi lider incontestabil dup suprafaa ocupat cu semnturi biotehnologice (54,6 mln
ha, ceea ce reprezint 53% din suprafaa total a culturilor biotehnologice), urmate de Argentina, Brazilia,
Canada, India i China. Alte 16 ri care cultiv PMG sunt enumerate n ordine descresctoare a
suprafeelor: Paraguay, Africa de Sud, Uruguay, Filipine, Australia, Romnia, Mexic, Spania, Columbia,
Frana, Iran, Honduras, Republica Ceh, Portugalia, Germania i Slovacia (fig. 2.1.).
22 DE RI AU APROBAT CULTIVAREA PLANTELOR
MODIFICATE GENETIC (total - 102 mln ha, 2006)
6 ri cu cele mai mari
suprafee cultivate cu
PMG, mln ha
SUA
Filipine
0,2
Uruguay
0,4
Africa de
Sud, 1,4
Paraguay
2,0
Australia
0,2
Romnia
0,1
Mexic
0,1
Columbia
<0,1
Iran
<0,1
Portugalia
<0,1
54,6
Argentina
11,5
6,1
Brazilia
India
Canada
China 3,5
3,8
<0,1
Spania
18,0
R. Ceh
Frana
Portugalia
Germania
Slovacia
0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
6 ri din UE (1/4 din 25
de ri) mln ha
Figura 2.1. rile n care este autorizat cultivarea plantelor modificate genetic
In prima decad a comercializrii PMG raportul dintre suprafaa mondial cultivat cu plante
transgenice i cea cultivat de rile cu economia slab dezvoltat indic o cretere n fiecare an. Mai mult
de o ptrime din suprafa mondial de semnturi biotehnologice n anul 2006 este cultivat n rile n
curs de dezvoltare, nregistrndu-se o cretere de 21% n comparaie cu statele industriale unde suprafeele
s-au majorat doar cu 9% (fig. 2.2.).
56
50
Tendina continu de cultivare i utilizare a PMG de ctre cele cinci ri n curs
de dezvoltare de baz: China, India, Argentina, Brazilia i Africa de Sud, care repre-
zint partea de sud a trei continente (Asia, America de Sud i Africa) infueneaz
deciziile de viitor n ce privete acceptarea i dezvoltarea pe scar mondial a cul-
turilor biotehnologice. Se consider c acest ritm considerabil de extindere a PMG
reprezint doar unul din scopurile programului Millennium Development Goal de
a micora nivelul de srcie pe glob cu 50% pn n anul 2015.
n prima decad de cultivare a PMG, rezistena la erbicide a fost caracteristica
principal, urmat de rezistena la insecte i de rezistena combinat la erbicide i la
insecte. n anul 2006, culturile rezistente la erbicide (soia, porumbul, rapia i bum-
bacul) ocupau 68% din cele 102,0 mln ha cu plante transgenice, culturile Bt 19%,
iar varietile cu caractere combinate 13% (fg. 2.3. C). Acestea din urm repre-
zint aa-numitul grup caracteristic, care crete cel mai repede, find nregistrat n
anii 20052006 o cretere cu 30%, fa de 10% pentru rezistena la erbicide i 17%
pentru rezistena la insecte. Primul produs combinat (2-3 gene) a fost porumbul,
care a aprut prima dat n anul 2005 n SUA.
Soia transgenic continu s predomine n grupul celor patru culturi MG, care
ocup cele mai mari suparfee, find cultivat pe 58,6 mln ha (57% din suprafaa
mondial a PMG), urmat de porumb 25,2 mln ha, bumbac 13,4 mln ha i rapi
4,8 mln ha (fg. 2.3. A i B).
Figura 2.3. Principalele culturi biotehnologice, ISAAA, 2006
A Principalele state care cultiv PMG
B, C Ponderea culturilor MG
Figura 2.3. Principalele culturi biotehnologice, ISAAA, 2006
n anul 2006, pe piaa din SUA a aprut o nou cultur biotehnologic rezistent la erbicidele
Roundup Ready lucerna. Este prima plant multianual modificat genetic care din primul an de
cultivare a ocupat 5% din toat suprafaa ocupat cu lucern. O alt cultur rezistent la erbicide aprut
n anul 2006 este bumbacul RR Flex. De asemenea, tot n acest an n China a fost recomandt pentru
cultivare papaia rezistent la virusuri care a fost obinut n laboratoarele naionale ale acestei ri.
Se estimeaz c n viitorul apropiat majorarea autorizat a suprafeelor ocupate cu PMG cu
caractere combinate n rile industriale, considerate hectare caracteristice de semnturi biotehnologice,
va continua proporional cu introducerea de particulariti noi, combinate astfel nct s fie obinut o
valoare superoar n conformitate cu cerinele diferite ale consumatorilor i productorilor, care solicit
alimente i furaje mai nutritive i sntoase la preuri acceptabile.
De asemenea, se consider c ritmul de expansiune a suprafeelor ocupate cu PMG, observat n
prima decad a comercializrii, de la anul 1996 pn la 2005, va continua i probabil va fi depit n cea
de a dou decad de la 2006 la 2015. n aceste condiii, respectarea unei administrri responsabile n
57%
25%
13%
5%
rapi
soia
bumbac
porumb
13
19
68
0
20
40
60
80
Culturi cu caractere combinate
Culturi Bt
Culturi rezistente la erbicide
%
SUA
soia, porumb, bumbac, rapi,
dovlecei, papaia, lucern
Canada
soia, porumb, rapi,

Uruguay
soia, porumb,

Australia bumbac
Iran orez
Argentina
Africa de Sud
soia, porumb, bumbac
Brazilia, Mexic
soia, bumbac
India, China,
Columbia
bumbac
Paraguay,
Romnia
soia
A
B
C
Portugalia, Germania, Slovacia,
Frana, R. Ceh, Honduras
porumb
58
51
n anul 2006, pe piaa din SUA a aprut o nou cultur biotehnologic rezis-
tent la erbicidul Roundup Ready lucerna. Este prima plant multianual mo-
difcat genetic, care din primul an de cultivare a ocupat 5% din toat suprafaa
ocupat cu lucern. O alt cultur rezistent la erbicide, aprut n anul 2006, este
bumbacul RR Flex. De asemenea, tot n acest an, n China a fost recomandat
pentru cultivare papaia rezistent la virusuri, care a fost obinut n laboratoarele
naionale ale acestei ri.
Se estimeaz c n viitorul apropiat majorarea autorizat a suprafeelor ocupate
cu PMG cu caractere combinate n rile industriale, considerate hectare carac-
teristice de semnturi biotehnologice, va continua proporional cu introducerea
de particulariti noi, combinate astfel nct s fe obinut o valoare superioar n
conformitate cu cerinele diferite ale consumatorilor i productorilor, care solicit
alimente i furaje mai nutritive i sntoase la preuri acceptabile.
De asemenea, se consider c ritmul de expansiune a suprafeelor ocupate cu
PMG, observat n prima decad a comercializrii, de la anul 1996 pn la 2005, va
continua i probabil va f depit n cea de a dou decad de la 2006 la 2015. n
aceste condiii, respectarea unei administrri responsabile n conformitate cu legis-
laia n domeniu trebuie s fe continuat, mai ales n rile de sud unde, conform
estimrilor fcute de grupul de lucru ISAAA, expansiunea suprafeelor cultivate cu
PMG se va realiza rapid.
n anul 2007, suprafaa culturilor MG a continuat s creasc (cu 12% sau 12,3
mln ha), constituind astfel 114,3 mln ha. Odat cu majorarea suprafeelor culturilor
biotehnologice, a crescut i numrul de ri care au cultivat OMG. Asfel, n 2007
OMG au fost cultivate de 23 de ri, dintre care 12 state sunt n curs de dezvoltare.
Dei ncepnd cu data de 1 ianuarie 2007, Romnia a renunat la cultivarea comerci-
al a soiei modifcate genetic, a autorizat ns pentru cultivare porumbul transgenic,
suprafaa cruia n anul 2007 a constituit 0,05 mln ha. n 2007 s cultive OMG au
nceput Chile i Polonia, ultima cultivnd porumb Bt. Tot n aceast perioad, a fost
nregistrat un numr record de fermieri (peste 50 mln), care au acceptat cultivarea
culturilor biotehnologice. Principalele culturi MG rmn a f porumbul, soia i bum-
bacul (www.isaaa.org ). Conform ISAAA, viitorul culturilor MG va f n ascensiune,
ntre 2006-2015 prognozndu-se dublarea suprafeelor i a numrului de state care
le vor cultiva.
2.2. Strategii de nregistrare i stocare a informaiei privind
PMG n bazele de date
Exist mai multe baze de date i site-uri on-line (ISAAA, OECD Biotechno-
logy Product, AGBIOS, bch.biodiv.org.etc.), care conin informaii privind plantele
modifcate genetic, cadrul de legi i documente legislative utilizate n reglementarea
PMG, evenimente noi privind activitile legate de PMG etc. ns nu toate bazele
de date ofer o informaie deplin privind planta modifcat genetic, caracteristica
molecular a constructului genetic, raportul de evaluare a securitii introducerii n
mediu a varietii MG fe n agricultur, alimentaie sau ca furaj. Transparena infor-
52
maional este necesar, deoarece nu toate varietile modifcate genetic sunt nre-
gistrate la nivel internaional. Aceast situaie creeaz probleme pentru autoritile
de inspectare n ceea ce privete sigurana c materialul modifcat genetic neautori-
zat nu ptrunde pe pia, fe ca constitueni ai furajului i produselor alimentare, fe
ca impuriti n reeaua alimentar. Prin urmare, trebuie s fm capabili s distingem
organismele modifcate genetic de cele nemodifcate genetic i de a determina dac
materialul transgen este autorizat.
Testele utilizate n detecia, identifcarea i cuantifcarea materialului modifcat
genetic se selecteaz n funcie de informaia existent. O informaie mai mult sau
mai puin detaliat privind alogenele inserate este oferit de site-ul USDA/APHIS
(http://www.aphis.usda.gov/). De asemenea, o prezentare general a OMG i a sta-
tutului de aprobare poate f gsit n baza de date OECD Biotechnology Product
(http://www.olis.oecd.org/bioprod.nsf). i Canadian AGBIOS (http://www.agbios.
com/dbase.php). Cu toate acestea, nu pentru toate varietile sunt specifcate sec-
venele inseriilor genetice, ceea ce este difcil de determinat. Unul din motivele
lipsei de transparen se consider a f faptul c secvenele reprezint proprietatea
companiei care a produs varietatea modifcat genetic i de aceea informaia privind
secvenele nu este disponibil n mod obinuit.
Analiza PMG se realizeaz prin identifcarea secvenei de nucleotide inserate,
a produilor expresiei transgenei, a expresiei fenotipice a caracterului nou, a marke-
rilor-screening etc.
n testarea OMG pot exista dou situaii (fg. 2.4.).
Figura 2.4. Principiu de selectare a testelor de analiz a materialului MG
Conform bazei de date AGBIOS, sunt n total 122 de varieti de plante, ob-
inute prin tehnici ale biotehnologiei contemporane, care sunt autorizate de ctre
diferite ri i organizaii internaionale, precum Organizaia pentru Cooperare Eco-
nomic i Dezvoltare (Organization for Economic Cooperation and Development
OECD) (tab. 2.1.).
PRINCIPIU DE SELECTARE A TESTELOR
PRIVIND OMG
Se cunoate informaia
despre secvenele
inserate
Se utilizeaz teste specifice calitative/
cantitative de analiz a OMG
Nu se cunoate
informaia despre
secvenele inserate
Se determin prezena/ lipsa OMG
prin PCR cu primerii-screening (35S
CaMV, NOS, nptII)
Se identific prin PCR, cu utilizarea
primerilor arbitrari n combinaie cu
primerii-screening
Figura 2.4. Principiu de selectare a testelor de analiz a materialului MG
Conform bazei de date AGBIOS (http://www.agbios.com/dbase.php), sunt n total 122 de varieti
de plante obinute prin tehnici ale biotehnologiei contemporane care sunt autorizate de ctre diferite ri i
organzaii internaionale precum Organizaia pentru Cooperare Economic i Dezvoltare (Organization for
Economic Cooperation and Development - OECD) (tab. 2.1.).
Tabelul 2.1.
Varieti obinute prin tehnicile biotehnologiilor moderne conform bazei de date AGBIOS
Specia Varietatea Productorul Caracterul
Agrostis
stolonjera
ASR368 Scotts Seeds Toleran la glifosat
Beta vulgaris GTSB77; H7-1; T120-7 Novartis Seeds; Monsanto Toleran la glifosat
Brassica napus
23-18-17, 23-198; 45A37, 46A40; 46A12,
46A16; GT200; GT73, RT73, HCN10,
HCN92, MS1, RF1 =>PGS1, MS1, RF2
=>PGS2, MS8xRF3, NS738, NS1471,
NS1473, OXY-235 PHY14, PHY35,
PHY36; T45 (HCN28)
Pioneer Hi-Bred International
Inc., Aventis CropScience;
Bayer CropScience.
Coninut nalt de acid
oleic i linoleic,
toleran la glifosat
androsterilitate,
toleran la bromoxinil
Brassica rapa HCR-1; ZSR500/502
Bayer CropScience;
Monsanto
Toleran la
glufosinatul de amoniu
Carica papay 55-1/63-1 Cornell University Rezisten la virus
Chichorium
inthybus
RM3-3, RM3-4, RM3-6, Bejo Zaden BV
Androsterilitate,
rezisten PPT
Cucumis melo A, B Agritope Inc.
Supresia sintezei
etilenei
Cucurbito pepo CZW-3, ZW20
Asgrow (USA), Seminis
Vegetable Inc., Upjohn
(USA)
Rezisten la virusuri
(CMV, ZYMV, WMV)
Dianthus
caryophyllus
4, 11, 15, 16, 66; 959A, 988A, 1226A,
1351A, 1363A, 1400A
Florigene Pty Ltd.
Toleran la
sulfoniluree, culoare
modificat, sinescen
60
53
Tabelul 2.1.
Varieti obinute prin tehnicile biotehnologiilor moderne
(conform bazei de date AGBIoS)
Specia Varietatea Productorul Caracterul
Agrostis
stolonjera
ASR 368 Scotts Seeds Toleran la glifosat
Beta vulgaris GTSB77; H7-1; T120-7 Novartis Seeds;
Monsanto
Toleran la glifosat
Brassica
napus
23-18-17, 23-198; 45A37, 46A40;
46A12, 46A16; GT200; GT73,
RT73, HCN10, HCN92, MS1,
RF1 =>PGS1, MS1, RF2 =>PGS2,
MS8xRF3, NS738, NS1471,
NS1473, OXY-235 PHY14,
PHY35, PHY36; T45 (HCN28)
Pioneer Hi-Bred
International Inc.,
Aventis CropScience;
Bayer CropScience.
Coninut nalt de
acid oleic i linoleic,
toleran la glifosat,
androsterilitate,
toleran la bromoxinil
Brassica rapa HCR-1; ZSR500/502 Bayer CropScience;
Monsanto
Toleran la
glufosinatul de amoniu
Carica papay 55-1/63-1 Cornell University Rezisten la virus
Chichorium
inthybus
RM3-3, RM3-4, RM3-6, Bejo Zaden BV Androsterilitate,
rezisten PPT
Cucumis melo A, B Agritope Inc. Supresia sintezei
etilenei
Cucurbito
pepo
CZW-3, ZW20 Asgrow (USA),
Seminis Vegetable Inc.,
Upjohn (USA)
Rezisten la virusuri
(CMV, ZYMV, WMV)
Dianthus
caryophyllus
4, 11, 15, 16, 66; 959A, 988A,
1226A, 1351A, 1363A, 1400A
Florigene Pty Ltd. Toleran la
sulfoniluree, culoare
modifcat, sinescen
ntrziat
Glycine
max L.
A2704-12, A2704-21, 5547-35,
A5547-127; G94-1, G94-19,
G168, GTS 40-3-2; GU262;
MON89788; OT96-15; W62,
W98
Aventis CropScience,
Bayer CropScience,
DuPont Canada
Agricultural products,
Monsanto, Agriculture
& Agri-Food Canada
Toleran la
glufosinatul de
amoniu i glifosat,
coninut nalt de acid
oleic
Gossypium
hirsutum
15985, 19-51A, 281-24-236,
3006-210-23; 31807/31808,
BXN; COT102, COT102, DAS-
2123-5 x DAS-24236-5,
DAS-2123-5 x DAS-24236-5
x MON-1445-2, MON-
531-6 x MON-1445-
2, MON-15985-7xMON-
1445-2; MON1445/1698
MON15985xMON88913;
MON531/757/1076, MON88913
Compania Monsanto,
DuPont Canada
Agricultural Products,
DOW AgroSciences
LLC, Calgene Inc.,
Syngenta Seeds, Inc.,
Pioneer Hi-Bred
International Inc.,
Bayer CropScience;
Rezisten la insecte,
resisten la insecte
i.toleran la
bromoxinil, toleran
la glufosinatul de
amoniu, toleran la
glifosat
Linum
usitatissimum
FP967 University of
Saskatchewan, Crop
Dev. Centre
Metabolism modifcat
Lycopersicon
esculentum
1345-4, 351 N, 5345, 8338, B,
Da, F, FLAVR SAVR
DNA Plant Technology
Corporation, Agritope
Inc., Monsanto, Zeneca
Seeds, Calgene Inc.
Coacere ntrziat,
rezisten la
lepidoptere,
caracteristici
agrotehnice
mbuntite
54
Medicago
sativa
J101, J163 Monsanto and Forage
Genetics International
Toleran la glifosat
Nicotiana
tabacum
C/F/93/08-02; Vector 21-41 Socit Nationale
dExploitation des
Tabacs et Allumettes;
Vector Tobacco Inc.
Coninut redus de
nicotin
Oryza sativa CL121, CL141, CFX51;
IMINTA-1, IMINTA-4;
LLRICE06, LLRICE62;
LLRICE601; PWC16
BASF Inc., Aventis
CropScience; Bayer
CropScience
Toleran la
imidazolin, toleran
la glufosinatul de
amoniu
Solanum
tuberosum L.
ATBT04-6, ATBT04-27,
ATBT04-30, ATBT04-31,
SPBT02-5, SPBT02-7; BT6,
BT10, BT12, BT16, BT17, BT18
Monsanto Rezisten la gndacul
de Colorado
Triticum
aestivum
MON71800 Monsanto Toleran la glifosat
Zea mays
176; 676, 678, 680; ACS-
ZM3-2 x MON-81-
6, B16 (DLL25); BT11
X4334CBR, X4734CBR), CBH-
351, DAS-06275-8; DAS-59122-
7; DAS-59122-7 x NK603,
DAS-157-1 x MON-
63-6, DBT418; GA21;
LY038; MIR604; MON80100;
MON802; MON809; MON810;
MON832; MS6; NK603; T14,
T25; TC1507
Syngenta Seeds, Inc.,
Pioneer Hi-Bred,
International Inc.,
Bayer CropScience,
Dekalb Genetics
Corporation, DOW
AgroSciences LLC,
Monsanto
Rezisten la insecte,
androsterilitate
i toleran la
glufosinatul de
amoniu, modifcarea
coninutului n
aminoacizi

Prin intermediul acestei bnci de date se pot obine informaii referitoare la
varietatea modifcat genetic, compania productoare, ara i anul cnd a fost apro-
bat, domeniul de utilizare, securitatea introducerii acesteia n mediu, caracteristica
modifcrii genetice, ns fr a prezenta secvena nucleotidic a alogenelor pentru
a utiliza teste specifce de identifcare a transgenelor (fg. 2.5.).
Dosarul de notifcare a unei varieti modifcate genetic, naintat spre aprobare
de ctre instituiile abilitate, privind eliberarea deliberat n mediu a OMG, trebuie
s conin toat informaia necesar, inclusiv tehnicile de detecie i identifcare a
plantelor MG. Suplimentar, se cer informaii privind modifcarea genetic n scopul
elaborrii unor registre, care pot f utilizate n detecia i identifcarea produselor
OMG pentru a facilita controlul acestora. Astfel, informaia despre OMG aprobate
devine accesibil din dosarele de notifcare i este inclus ulterior ntr-o baz de date,
unde se stocheaz datele despre cele mai relevante secvene genetice a PMG. Co-
misia European n cadrul Centrului de Cercetare Comun (European Commissions
Joint Research Centers JRC) i Institutul Federal German pentru sntate i Pro-
tecia Consumatorilor (BGVV) dispun de aceast baz de date.
55
Medicago sativa
event
Company Description
J101, J163 Monsanto
Company and
Forage Genetics
International
Glyphosate herbicide tolerant alfalfa (lucerne) produced by
inserting a gene encoding the enzyme 5-enolypyruvylshikimate-
3-phosphate synthase (EPSPS) from the CP4 strain of
Agrobacterium tumefaciens.
MoN-11-8, MoN-163-7 (J101, J163)
Host organism / Variety Medicago.sativa (Alfalfa)
Trait Glyphosate herbicide tolerance.
Trait Introduction Method Agrobacterium tumefaciens-mediated plant
transformation.
Proposed Use Production of forage (herbage) for livestock
feed. This material will not be grown outside
the normal production areas for alfalfa.
Company Information Monsanto and Forage Genetics International
Summary of Introduced Genetic elements
Code Name Type Promoter, other Terminator Copies Form
CP4
epsps
5-enolpyruvylshikimate-
3-phosphate
synthase (Agrobacterium
tumefaciens CP4)
HT enhanced Figwort Mosaic Virus
(FMV) 35S; petunia HSP 70 5
untranslated leader sequence
chloroplast transit peptide from
A. thaliana EPSPS gene (CTP2)
P. sativum (pea)
ribulose-1,5-
bisphosphate
carboxylase small
subunit E9 gene
1 functional Native
Characteristics of Medicago sativa (Alfalfa)
Donor Organism Characteristics
Latin Name Gene Pathogenicity
Agrobacterium
tumefaciens strain CP4
CP4 EPSPS A. tumefaciens is a common soil bacterium that is responsible
for causing crown gall disease in susceptible plants. There have
been no reports of adverse affects on humans or animals.
Center of origin reproduction Toxins Allergenicity
Asia Minor,
Transcaucasia,
Turkmenistan, and
Iran
Outcrossing, insect-pollinated (bees).
Hybridizes with members of the M..sativa
complex; limited hybridization with M..
glomerata. Seed dormancy variable, depending
on amount of hard seed.
Saponins, such as
medicagenic acid,
which cause bloat in
ruminants; coumestrol
and coumestan,
phytoestrogens, which
can cause reproductive
problems in livestock.
No known
endogenous
allergens
Characteristics of the Modifcation environmental Safety Considerations
Summary of regulatory Approvals Food and/or Feed Safety Considerations
Country environment Food and/or Feed Food Feed Marketing
Australia 2006
Canada 2005 2005 2005
Japan 2006 2005 2006
Mexico 2005
Philippines 2006 2006
United
States
2004
Figura 2.5. Un exemplu de prezentare schematic a informaiei privind
varietatea modifcat genetic n baza de date AGBIoS
http://www.agbios.com/dbase.php
Conform informaiei din baza de date COMPASS (http://www.gmo-compass.
org/eng/gmo/db/), optzeci i opt de varieti MG sunt aprobate sau au fost naintate
dosare spre aprobare de ctre UE pentru utilizare n alimentaie i furaj. De aseme-
56
nea, este stocat i informaia privind produsele alimentare i furajele care conin
material modifcat genetic aprobat de UE. Spre deosebire de baza de date AGBIOS,
aceast baz include secvenele-primeri specifce, care permite identifcarea variet-
ii modifcate genetic aprobate (fg. 2.6.).
MAIZE Event Trait Scope Company
MON863 Monsanto Insect resistance
Valid authorisation, ID-Number: MON-863-5; MON-863-5 x MON-81-6
A
p
p
l
i
c
a
t
i
o
n

Presented in,
Date, Legislation
Germany 2002,
The application was submitted according to directive 2001/18 (Import and feed), and
according the Novel Food regulation (258/97).
Scope of notification Import in the EU; Grain as feed, food; Summary of application
National authority
A
s
s
e
s
s
m
e
n
t

First examination by the responsible authority in Germany. Assessment Report
Scientific report of the EFSA for the safety assessment on April 2nd, 2004.
EFSA opinion Conclusion: MON863 is safe as conventional maize. Brief description;
EFSA: Scientific Opinion (258/97); EFSA: Scientific Opinion (2001/18) ,
Import and feed Import and use as feed (after 2001/18) were approved by decision of the EU
commission on August 8th, 2005. Commission Decision
Status The commission has presented a proposal for a decision to approve food from
MON863. Proposal for a decision
D
e
c
i
s
i
o
n
Food
Conditions or
Use as food were approved by decision of the EU commission on January 13th, 2006.
Labelling and traceability: According to legal regulations. Post-market monitoring: Not
appropriate.
Method of detection; the full method reports will be made available after authorisation
process has been completed.
Community Reference Laboratory for GM Food and Feed
07/08/2015 for feed; 12/01/2016 for food
restrictions
Autorisation
Expiration date
Status of dossiers, CRL validation processes, Detection methods validated in support to
notifications submitted under Directive 2001/18/EC;
Click here to access to the detection methods submitted under Art 47 of Regulation EC 1829/2003
Event Unique
identifier
Applicant Status/Progress Reports Validated Method
Validation report
Published on: 16/02/2005
Validated method
Mon863
Maize
MON-00863-5 Monsanto Validation
completed
EUROPEAN COMMISSION , DIRECTORATE GENERAL JRC,
COMMUNITY REFERENCE LABORATORY FOR GM FOOD AND FEED
Event-specific method for the quantitation of maize line MON 863 using real-time PCR
Method development: Monsanto Biotechnology Regulatory Sciences (only for the PCR part)
Method validation: Joint Research Centre European Commission Biotechnology & GMOs Unit
4.3. Primers and Probes
Name Oligonucleotide DNA Sequence (5 to 3)
GMO target sequence
MON863 F/MON863 R
MON863 probe
GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC/TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT
6-FAM- TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA- TAMRA
Reference gene target sequence
Adh1 F/Adh1 R
Adh1 probe
CCAGCCTCATGGCCAAAG/CCTTCTTGGCGGCTTATCTG
6-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-TAMRA
Figura 2.6. Un exemplu de prezentare a informaiei privind
varietatea modifcat genetic n baza de date CoMPASS
http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/
57
O alt relevant baz de date privind OMG este portalul BCH (The Biosafety
Clearing-House), care reprezint un mecanism al activitii Protocolului de la Car-
tagena privind Biosecuritatea. Pe site-ul ofcial al BCH (www.http://bch.cbd.int/),
accesibil n ase limbi, sunt refectate aspectele tiinifce, legale i informaionale
legate de securitatea biologic i OMG (fg. 2.7). BCH este o parte component a
UNEP (United Nations Environment Programme, http://www.unep.org/ ), care are
menirea de a promova la nivel global relaiile de parteneriat i de informare inter-
naionale n diferite domenii ecologice i de mediu, inclusiv cea a biosecuritii
(http://www.unep.org/biosafety/ ). Pe pagina BCH este prezent informaia despre
registrul OMG, registrul transgenelor i elementelor transgenice (promotori, termi-
natori, gene marker), incluse n OMG, sistemul automatizat de cutare a liniilor de
OMG i codurile unice de identifcare a fecrie varieti de OMG n parte (fg. 2.8.).
De asemenea, pe site este prezentat lista rilor care sunt membri ai BCH i toat
informaia adiacent, inclusiv Republica Moldova.
Cu scopul implementrii prevederilor Protocolului de la Cartagena, Programul
Naiunilor Unite pentru Mediu (UNEP) i Fondul Global de Mediu (GEF) acord asis-
ten tehnic Guvernului Republicii Moldova n vederea consolidrii eforturilor ntru
crearea unui sistem naional de securitate biologic. Ca parte component a Proiectu-
lui UNEP-GEF Dezvoltarea Cadrului Naional de Biosecuritate n Republica Mol-
dova, care face parte din Proiectul Global pentru dezvoltarea cadrelor naionale de
biosecuritate n mai mult de 100 de ri i cu menirea de a contribui la implementarea
Protocolului de la Cartagena la nivel naional, a fost elaborat i implementat proiec-
Figura 2.7. Pagina principal WeB a portalului BCH www.http://bch.cbd.int/
x Cadrul instituional conine informaii despre autoritatea naional, instituiile-partenere,
comisia naional, punctul focal, oficiul Biosecuritate, precum i informaii ce in de
parteneriatul internaional.
x Cadrul legislativ conine informaii ce in de aspectele legislative: politici i strategii,
legislaia naional, acte normative, tratate i legislaie internaionale.
x Cadrul normativ conine informaii referitoare la decizii i rapoarte, proceduri
operaionale, Registrul Naional de OMG, notificri.
x Informaii utile conine link-uri ctre Capaciti instituionale, Testare OMG, Cercetri
biotehnologice, Publicaii, Resurse publice, Evenimente, Referine utile i Galerie Foto.
x Baza de date OMG - pentru gestionarea Organismelor Modificate Genetic, n Republica
Moldova a fost elaborat un modul separat. Modulul dat are ca scop asigurarea posibilitilor
de cutare a OMG dup anumite categorii, precum i afiarea tuturor OMG nregistrate n
Republica Moldova.
Informaia din cadrul portalului este prezentat n trei limbi: romn, englez i rus.
Deasemenea, portalul i registrul OMG ofer informaii ntr-o manier organizat i totodat, sunt
accesibile fr nici o restricie, fiind oferite gratuit publicului larg.
58
tul UNEP-GEF Dezvoltarea Capacitilor pentru Participarea Efectiv la Mecanis-
mul de Schimb de Informaii pentru Biosecuritate (2005-2006). Acest proiect a avut
scopul de a implementa Mecanismul Schimbului de Informaie pentru Biosecuritate
(MSIB), stabilit prin Protocolul de la Cartagena, n Republica Moldova (fg. 2.9.).
x General Information Unique Identification - MON-82-7
Record information and status
Record ID 14786
Status
Published
Date of creation 2006-06-05 19:39 GMT (kirsty.mclean@biodiv.org)
Date of last update 2006-06-21 18:59 GMT (kirsty.mclean@biodiv.org)
Owner kirsty.mclean@biodiv.org
Developer / Company / Applicant
Contacts
Monsanto
Url: Monsanto Homepage
(Record #14925)
LMO Identity
Name and identity of the living modified organism YieldGard Maize
Unique identification of the living modified organism MON-82-7
Recipient organism or parental organisms
Zea mays - Maize, Corn
(Record #246)
LMO information
Transformation event MON802
x Techniques used for modification Biolistic methods
Gene inserts
cry1A(b) - Lepidoptera resistance
Donor organism: Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
(Record #14985)
cp4 epsps - Glyphosate tolerance
Donor organism: Agrobacterium tumefaciens strain CP4
(Record #14979)
gox - Glyphosate tolerance
Donor organism: Ochrobactrum anthropi
(Record #14998)
nptII - Kanamycin resistance
Donor organism: Escherichia coli
(Record #15001)
Figura 2.8. Un exemplu de prezentare a informaiei privind
varietatea modifcat genetic n baza de date BCH
59
Figura 2.7. Niveluri de reglementare a politicii biosecuritii
60
MSIB a fost stabilit ca un mecanism internaional pentru informarea tuturor Pr-
ilor Protocolului despre utilizarea casnic i plasarea pe pia a OMG-rilor, despre
micarea transfrontalier pentru uzul direct ca hran sau furaj, sau pentru prelucrare;
pentru facilitarea schimbului tiinifc, tehnic, ecologic i legal al informaiei i expe-
rienei cu privire la OMG i pentru promovarea i facilitarea contientizrii, educaiei
i participrii publicului cu privire la transfer, pstrare i utilizare a OMG-rilor.
ntru susinerea acestor eforturi, a fost elaborat Portalul de biosecuritate n
Republica Moldova (www.biosafety.md). Pe aceast pagin, se poate accesa toat
informaia privind promovarea politicii de biosecuritate n Republica Moldova, pro-
blema OMG i testarea acestora, registrul organismelor transgenice etc. La proiec-
tarea i crearea portalului naional al biosecuritii n Republica Moldova s-a inut
cont de un ir de factori, printre care:
recomandrile portalului www.bch.biodiv.org;
accesibilitatea i performana constrngerilor software alese;
portabilitatea pe diferite sisteme de operare sau navigatoare Internet etc.
n acest sens, strategia care a fost implementat pentru procedurile de admi-
nistrare a structurii i coninutului portalului const n utilizarea la maximum a pa-
ginilor interactive prin intermediul crora se asigur crearea dinamic a structurii
locaiei i administrarea facil a coninutului. Informaia din cadrul portalului nai-
onal de biosecuritate este structurat pe categorii. Categoriile sunt prezentate prin
intermediul unui meniu arborescent afat n partea stng a portalului. Principalele
categorii sunt:
Biosecuritatea conine informaii generale privind Biosecuritatea. Prin
aceast categorie, utilizatorul poate obine informaii despre Convenia privind Bio-
securitatea, Cadrul naional, Comisia naional i Legea privind Biosecuritatea.
Managementul informaional conine informaii despre Portalul central,
Reeaua Naional BCH, Registrul experi, precum i informaii despre instruirea
on-line. De asemenea, aici se pot obine informaiile introduse de principalele insti-
tuii-partenere.
Cadrul instituional conine informaii despre autoritatea naional, insti-
tuiile-partenere, comisia naional, punctul focal, ofciul Biosecuritate, precum i
informaii ce in de parteneriatul internaional.
Cadrul legislativ conine informaii ce in de aspectele legislative: politici
i strategii, legislaia naional, acte normative, tratate i legislaie internaionale.
Cadrul normativ conine informaii referitoare la decizii i rapoarte, proce-
duri operaionale, Registrul Naional de OMG, notifcri.
Informaii utile conine link-uri ctre Capaciti instituionale, Testare
OMG, Cercetri biotehnologice, Publicaii, Resurse publice, Evenimente, Referine
utile i Galerie Foto.
Baza de date OMG pentru gestionarea Organismelor Modifcate Genetic,
n Republica Moldova a fost elaborat un modul separat. Modulul dat are ca scop asi-
gurarea posibilitilor de cutare a OMG dup anumite categorii, precum i afarea
tuturor OMG nregistrate n Republica Moldova.
61
Informaia din cadrul portalului este prezentat n trei limbi: romn, englez i
rus. De asemenea, portalul i registrul OMG ofer informaii ntr-o manier organiza-
t i, totodat, sunt accesibile fr nici o restricie, find oferite gratuit publicului larg.
2.3. Laboratoare acreditate pentru testarea oMG
n ultimii ani au fost elaborate i aprobate la nivel internaional i local un numr
mare de legi i directive privind reglementarea activitilor de obinere, transport,
comercializare i analiz a OMG. Att marile companii biotehnologice, autoritile
abilitate n monitorizarea i controlul produselor biotehnologice, ct i consumatorii
au avut i continu sa aib unele divergene legate de aspectul analitic al acestor re-
glementri. Din aceste considerente, n decembrie 2002 la Bruxelles a fost inaugura-
t Reeaua European a Laboratoarelor de Analiz a OMG (The European Network
of GMO Laboratories ENGL), care reprezint o platform unic de activitate a
experilor din UE n scopul dezvoltrii, armonizrii i standardizrii mijloacelor i
metodelor pentru prelevarea probelor, detecia, identifcarea i cuantifcarea OMG
i a produselor derivate din acestea ntr-o gam larg de matrici, incluznd semine,
alimente, furaj i probe din mediu. Aceast reea de laboratoare la momentul actual
include peste 100 laboratoare, care reprezint cele 27 de state membre UE, inclusiv
Norvegia. De asemenea, la ntrunirile acestei organizaii particip i ali membri din
rile candidate la UE n calitate de observatori independeni. Acetia sunt delegai
de autoritile naionale abilitate n domeniul activitilor cu OMG. Site-ul ofcial al
ENGL http://engl.jrc.it/designated.htm. ofer informaii privind laboratoarele care
fac parte din aceast reea.
Responsabilitatea pentru organizarea i managementul acestei reele de labo-
ratoare revine diviziunii (Unitii) de biotehnologie i OMG (Biotechnology and
GMOs) a JRC (Joint Research Centre) n cadrul Institutului pentru Sntate i Pro-
tecia Consumatorului (Institute for Health and Consumer Protection). Scopul de
baz n activitatea comisiei const, pe de o parte, n dezvoltarea unei comuniti
biotehnologice europene competitive bazat pe un cadru legislativ sever i pe ncu-
rajarea transparenei i a comunicrii cu publicul, pe de alt parte.
Principalele activiti ale acestui grup de laboratoare autorizate n analiza OMG sunt:
elaborarea metodelor, optimizarea i ulterior validarea internaional a
acestora;
propunerea unor strategii pentru prelevarea probelor ntr-o gam larg de
matrici, incluznd semine, alimente, furaj i probe din mediu pentru anali-
za celor mai mici cantiti de material MG;
elaborarea materialelor de referin adecvate utilizate n calitate de control
n testele analitice. Schimb de informaii privind datele experimentale cu
structurile implicate n activitile de control.
Din 2004, Centrul de Cercetare Comun (JRC) n colaborare cu ENGL asigur
suportul informaional i material pentru Laboratorul de Referin Comunitar pentru
62
Figura 2.10. Prezentare general a procedurii standard pentru detecia,
identifcarea i cuantifcarea OMG
Proba de cercetat
extragerea ADN-ului
I. Detecia oMG
(screening)
Negativ Pozitiv
II. Identifcarea oMG
(test pentru oMG aprobate)
Pozitiv Negativ
Lipsa oMG
oMG neautorizate
III. Cuantifcarea oMG
(analiza individual a ingredientelor)
Mai mult de 0,9% Mai puin de 0,9%
etichetarea oMG Neetichetarea OMG
Alimente i Furaj MG (Community Reference Laboratory for GM Food and Feed)
n activitile ce in de validarea metodelor analitice de cuantifcare a OMG care
sunt aprobate spre comercializare.
Exist un numr mare de laboratoare, care ofer servicii de analiz a OMG,
cele mai recunoscute find: Genetic ID (SUA), Eurofns/ GeneScan (Frana), SGS/
Inst. Fresenius i CONGEN (Germania) etc.
Conform tehnicilor de testare, aprobate la nivel internaional, testarea OMG
include trei etape de analiz (fg. 2.10.):
63
Conform Reglementrii (EC) Nr. 1830/2003, produsul conine OMG sau produse
rezultate din astfel de organisme atunci cnd coninutul materialului genetic modifcat
este mai mare de 0,9%, iar pentru semine 0,3-0,7%, din masa total a produsului
(http://projects_2004.jrc.cec.eu.int). De exemplu, pentru lotul de semine de rapi i
bumbac, limita admisibil a cantitii OMG este 0,3%, pentru tomate, sfecl, cicoare,
porumb i cartof 0,5%, soia 0,7% i 0% n cazul culturilor neautorizate.
Efciena i calitatea analizelor de detecie, identifcare i cuantifcare a materi-
alului modifcat genetic, precum i a evalurii complexe a transgenelor sub aspectul
riscurilor pentru sntatea uman i mediu de ctre experi se realizeaz n baza
informaiei cunoscute. De aceea se consider c n cadrul unui laborator de testare
a OMG trebuie s existe o baz de date, necesare pentru efectuarea testrii OMG
i evalurii riscului determinat de acestea. O astfel de baz de date poate include
urmtoarele compartimente:
Detecia constatarea prezenei/ lipsei elementelor transgenice (secvena
codifcatoare sau secvenele de reglare promotor sau/ i terminator) n geno-
mul plantei. Pentru detecia PMG se recurge la un screening general bazat pe
analizele PCR, utilizndu-se primeri pentru secvene ADN frecvent utilizate n
transformare. Aceste secvene sunt promotorul 35S (CaMV), secvena termi-
nator nos (Agrobacterium tumefasciens) i gena-marker NPTII (rezisten la
kanamicin). Detecia PMG pe baza promotorului 35S poate f utilizat numai
la plantele care nu sunt infectate natural cu virusul mozaicului conopidei (cau-
lifower mosaic virus) n scopul excluderii rezultatelor fals-pozitive.
Identifcarea se identifc transgenele / elementele genetice modifca-
te genetic prin PCR cu utilizarea primerilor specifci (de ex., transgene cry,
epsps, bar/pat).
Cuantifcarea se determin coninutul elementelor modifcate genetic
n prob. n acest caz se apeleaz la metoda Real-time PCR (ADN) sau ELISA
(proteine).
64
LISTA orGANISMeLor MoDIFICATe GeNeTIC
OMG aprobate de ctre UE i la nivel internaional (SUA, Canada, Argentina etc.).
rile, suprafeele cultivate cu PMG, produciile nregistrate (tone, %) pe ani.
Companiile care desfoar activiti cu OMG sau a produselor obinute din aceste organisme.
INForMAIA PrIVIND orGANISMeLe NoN-TrANSGeNICe (reCePTor)
Denumirea complet (latin, sinonime); clasifcarea taxonomic.
Modul de reproducere (durata unei generaii; compatibilitatea sexual cu alte specii de plante
slbatice).
Supravieuirea (abilitatea de a forma structuri pentru supravieuire sau laten).
Diseminarea (cile i gradul de diseminare) i distribuia geografc.
Interaciuni semnifcative poteniale ale organismului cu alte organisme din ecosistem; informaii
despre efectele toxice asupra oamenilor, animalelor i altor organisme.
INForMAII PrIVIND DeTeCIA I IDeNTIFICAreA oMG
Documentele internaionale care reglementeaz testarea OMG.
Laboratoarele de testare a OMG i companiile care produc i comercializeaz kit-uri de detecie/
analize OMG.
Tehnici de detecie i identifcare a PMG (PCR, analiza Southern/ Western, ELISA, autoradio-
grafe, teste fenotipice).
Markeri utilizai pentru screeningul OMG n mediu.
Utilaj, echipament analitic, care asigur calitatea efecturii testelor.
INForMAII PrIVIND orGANISMeLe MoDIFICATe GeNeTIC
Caracterele noi (de interes), obinute prin tehnicile ADN-ului recombinant, inclusiv genele
care determin aceste caractere. Descrierea caracterelor care au fost induse sau modifcate (benefcii
obinute, avantaje).
Modifcarea genetic i secvenele inserate (metodele de transformare; mrimea, structura i
localizarea insertului, numrul de copii i nivelul de expresie a insertului).
Deosebirile existente ntre PMG i planta nemodifcat (fenotip, reproducere, diseminare,
supravieuire).
Informaii despre posibilele efecte asupra mediului n urma introducerii PMG (transferul potenial de
material genetic de la PMG la alte organisme; efecte toxice/ duntoare asupra sntii umane i mediului.
Interaciuni semnifcative poteniale ntre PMG i organismele-int i non-int.
eVALUAreA rISCUrILor
Informaii privind evaluarea siguranei produilor rezultai din modifcarea genetic pen-
tru sntatea uman (proteinele toxine cunoscute, teste standard de evaluare a digestibilitaii,
a potenialului alergen al proteinei modifcate, stabilitate la digestie pe modele de digestie
gastrointestinal la mamifere; concentraia proteinei n alimente).
Verifcarea echivalenei n substane a PMG cu planta nemodifcat (proteine, glucide etc.).
Impactul potenial asupra mediului (evaluarea impactului asupra mediului pozitiv/ negativ;
mare/ redus).
Modifcarea competitivitii (persisten, invazivitate), probabilitatea producerii fuxului genic i
interaciunile cu organismele vizate/ nevizate.
65
2.4. Norme i legi ce reglementeaz testarea oMG
Politica i legislaia internaional privind organismele modifcate genetic de-
vin tot mai restrictive i mai transparente. Identifcarea, detecia i cuantifcarea
OMG trebuie s se realizeze conform unor standarde autorizate.
Comitetul European de Standardizare (CEN, www.cenorm.be) prin CEN/TC
275, Food analysis Horizontal methods, n colaborare cu Organizaia Internai-
onal de Standardizare (ISO, www.iso.org), ISO/TC 34, Food products, a elaborat
standardul ISO 24276:2006/ EN ISO 24276:2006 Foodstuffs. Methods of analysis
for the detection of genetically modifed organisms and derived products. General
requirements and defnitions, care a fost publicat de ISO i CEN n februarie 2006.
Standardul prezint metode de analiz pentru detectarea organismelor modifcate
genetic i a produselor derivate.
Scopul unor astfel de analize este de a identifca i cuantifca elementele ge-
netice sau proteinele organismelor modifcate genetic. Acest standard este destinat
matricelor pentru produsele alimentare, dar poate f aplicat i altor tipuri de matrici
(de exemplu, pentru semine i plante din mediul nconjurtor). Standardul conine
defniii i cerine generale pentru nfinarea laboratoarelor, descrierea i validarea
metodelor.
Detectarea originii transgenice a ingredientelor se realizeaz prin parcurgerea
unor etape succesive (sau simultane): prelevarea probelor reprezentative pentru ma-
trice, extracia proteinelor sau acizilor nucleici din eantionul analizat, detectarea
i/sau determinarea calitativ/ cantitativ a acizilor nucleici sau a proteinelor speci-
fce obinute din organismele modifcate genetic afate n studiu. Aceste etape sunt
prezentate n urmtoarele standarde:
eN ISo 21569:2005, Foodstuffs Methods of analysis for the detection
of genetically modifed organisms and derived products .Qualitative.nu-
cleic acid based methods;
of genetically modifed organisms and derived products . Quantitative.
nucleic acid based methods;
of genetically modifed organisms and derived products Nucleic acid
extraction;
eN ISo 21572:2004, Foodstuffs Methods for the detection of geneti-
cally modifed organisms and derived products Protein based methods.
Scopul standardului eN ISo 24276:2006 este de a arta cum se aplic aceste
standarde i de a explica relaiile dintre ele n procesul de analiz a materialului
modifcat genetic din produsele alimentare.
66
2.5. Metode validate aprobate pentru testarea oMG
Necesitatea de a monitoriza i verifca prezena i cantitatea materialului mo-
difcat genetic n culturile agricole MG i n produsele derivate a generat o cerere
crescnd de metode analitice de detecie, identifcare i cuantifcare a secvenei de
nucleotide inserate i a produilor de expresie a transgenei, deoarece anume aceste
componente sunt considerate ca find contituieni de baz.
Unele laboratoare au elaborat metode de analiz bazate pe detecia ADN-ului
utiliznd tehnica de amplifcare PCR (Polymerase Chain Reaction) ori pe protei-
ne, apelnd la analizele imunoenzimatice ELISA (enzyme linked immunosorbent
assays), care se deosebesc prin unele avantaje i dezavantaje n funcie de scopul
cercetrii i de posibilitile laboratorului (tab. 2.2. i fg. 2.11.).
Tabelul 2.2.
Metodele utilizate cel mai des n testarea materialului modifcat genetic
Metoda Testul
Costul/
prob
Durata Caracteristici rezultate
Biotest
(rezistena
la erbicide)
Toleran $10-12 5-7 zile Necesit abiliti
moderate de lucru n
laborator
Constatarea rezistenei
la erbicide
ELISA Proteine $75-100

2-4 zile Necesit abiliti
moderate de lucru n
laborator i echipament
Determinarea
cantitativ a proteinelor
Lateral
Flow Strip
Proteine $8-10

10-20
min.
Training redus i nu
necesit echipament
special
Determinarea prezenei
proteinelor
PCR ADN $200-600

5-14
zile
Metod difcil, necesit
training i echipament
special
Teste calitative/ semi-
cantitative ale prezenei
OMG
Southern
Blot
ADN $100-300 4-6 zile Metod difcil, necesit
training i echipament
special
Identifcarea
secvenelor specifce de
ADN
Alte laboratoare s-au orientatat spre dezvoltarea unor tehnologii analitice care
pot oferi soluii alternative la metodele de testare a OMG existente. Acestea includ
masspectrometria, cromatografa, tehnologia ADN - chip, Electro.spray.ionisation
(ESI), spectroscopia infraroie apropiat etc. (fg. 2.11.).
Metoda cromatografc permite identifcarea OMG la nivelul metaboliilor
dizaharide (trehaloza, maltoza i izomaltoza), alcooli (maltitolul) sau al diferen-
elor depistate n proflul chimic, constatate la analiza uleiului provenit din rapia
modifcat genetic. Combinarea metodelor de cromatografe lichid i masspectro-
metrie au permis evidenierea diferenelor din cadrul paternelor de trigliceride. Ra-
piditatea, sensibilitatea nalt i analiza cantitativ a diferitor metabolii, implicai
n metabolismul carbonului (glucidele di- i trimere), azotului (aminele, aminoacizi,
acizi organici), ofer posibilitatea identifcrii simultane a diferitor metabolii ntr-o
singur prob, fr a impune o separare ulterioar a acestora.
67
Spectroscopia infraroie apropiat (SIA) are o gam larg de aplicare n
agricultur, industria farmaceutic, controlul produselor alimentare etc. i repre-
zint o metod analitic rapid, care permite msurarea compoziiei chimice a ma-
terialelor. Legturile covalente dintre atomii de C, N, H, O i P absorb energia n
regiunea infraroie, n care posed frecvene oscilatorii specifce, iar combinaiile
formate sunt detectabile la lungimea de und de 400 - 2500 nm, adic n regiunea
infraroie. Unele transgene pot modifca structura fbrelor n plante, diferene care
nu pot f evideniate dup coninutul de proteine sau ulei, ns se evideniaz cu
uurin prin SIA.
Figura 2.11. Tehnologii analitice utilizate n detecia,
identifcarea i cuantifcarea oMG
n selectarea tehnicilor de lucru se recomand ca laboratoarele s utilizeze
metode validate n acord cu criteriile internaionale recunoscute (de exemplu, ISO
5735-1/ 1994, ISO 5725), iar analizele (unde este posibil), s includ material de
referin certifcat, ntruct unele dintre aceste metode (de exemplu, testul expre-
siei fenotipice a transgenei, metode calitative, metode imunoenzimatice) sunt mai
adecvate pentru analiza seminelor i probelor din cereale, dect pentru analiza pro-
duselor procesate. De asemenea, se tie c metodele bazate pe ADN sau proteine,
precum i testul fenotipic dau uneori rezultate diferite.
Spectroscopia infraroie apropiat (SIA) are o gam larg de aplicare n agricultur, industria
farmaceutic, controlul produselor alimentare etc. i reprezint o metod analitic rapid, care permite
msurarea compoziiei chimice a materialelor. Legturile covalente dintre atomii de C, N, H, O i P
absorb energia n regiunea infraroie, n care posed frecvene oscilatorii specifice, iar combinaiile
formate sunt detectabile la lungimea de und de 400 - 2500 nm, adic n regiunea infraroie. Unele
transgene pot modifica structura fibrelor n plante, diferene care nu pot fi evideniate dup coninutul de
proteine sau ulei, ns se evideniaz cu uurin prin SIA.
DETECIA, IDENTIFICAREA I CUANTIFICAREA OMG
Expresia fenotipic
a caracterului nou
Analiza produselor
de expresie a
transgenei (proteine)
Identificarea secvenei
de nucleotide inserate
ADN/ARNm
Tehnici alternative
de analiz a OMG
Test de
germinare
(rezisten la
erbicide) Tehnici
imunoenzimatice
Testul
ELISA
Testul Lateral
Flow sticks
Analize
PCR
Calitative
(Identificare)
PCR cu
primeri specifici
Cantitative
(cuantificare)
QC-PCR,
Dublu QC- PCR
Real- time PCR
PCR-ELIZA
Detecia produilor PCR
Masspectrometrie
Electroforez
Cromatografie
Spectroscopie
infraroie
Cip-tehnologia
ADN
Electroforeza AN
Analize Southern
Electroforeza
proteinelor
Analize Western blot
Figura 2.8. Tehnologii analitice utilizate n detecia, identificarea i cuantificarea OMG
n selectarea tehnicilor de lucru se recomand ca laboratoarele s utilizeze metode validate n acord
cu criteriile internaionale recunoscute (de exemplu, ISO 5735-1/ 1994, ISO 5725), iar analizele (unde este
possibil), s includ material de referen certificat, ntruct unele dintre aceste metode (de exemplu,
71
68
Elaborarea i utilizarea metodelor analitice de testare a plantelor MG este esen-
ial n implementarea regulilor de etichetare. Strategiile adecvate de prelevare i
preparare a probelor n combinaie cu metodele de testare trebuie s fe supuse unor
criterii de validare internaional i evaluare a performanei. ntruct materialul de
referin este o parte indispensabil a oricrui protocol analitic, criteriile de pro-
ducere a unor astfel de standarde de referin trebuie, de asemenea, s fe validate.
Pentru a crea un nivel de ncredere nalt al procedurii de testare n conformitate cu
cerinele naintate a fost elaborat procedura de validare i recunoatere ofcial la
nivel internaional a tehnicilor de analiz. Pn la momentul actual, mai multe meto-
de de testare au fost naintate pentru validare proces prin care se demonstreaz c
procedura de izolare, preparare i analiz a probelor va da rezultate semnifcative i
reproductibile n cazul unei matrici i al testului dat. Succesul validrii unei metode
analitice este determinat de demonstrarea caracteristicilor performante, care inclu-
de: specifcitate, sensibilitate, limita de detecie, efeciena de extragere, precizie,
reproductibilitate n cazul activitilor de identifcare/ screening (detecia calitativ)
i suplimentar: acuratee, limita de cuantifcare, liniaritate, coefcient de variaie la
evaluarea sistemelor de detecie cantitativ (EMEA-guidelines CPMP/ICH/281/95
-. http://www.emea.eu.int/ pdfs/human/ich/ 028195en.pdf i 381/95 - http://www.
emea.eu.int/pdfs/human/ich/038195en.pdf.). Conform experilor n metodele anali-
tice, criteriile de validare reprezint:
Specifcitatea probabilitatea obinerii unui rezultat negativ n cazul lipsei
OMG i este determinat de contaminarea probei cu virusuri sau bacterii, care conin
elemente genetice similare cu cele utilizate n transgenez (promotori, terminatori).
Se recomand de testat mai multe probe de control-negativ pentru a evalua specif-
citatea primerului. Produsul de amplifcare obinut trebuie evaluat prin determinarea
exact a dimensiunii, secvenei de nucleotide, proflului restricional, hibridrii.
Sensibilitatea probabilitatea obinerii unui rezultat pozitiv n caz de prezen
a OMG. Excluderea rezultatelor fals-negative, de exemplu, calitatea joas a matricei
(ADN) poate f exclus prin coamplifcarea unui control intern. Trebuie utilizate
dou probe de control: un control negativ pentru a exclude contaminarea cu alt ma-
terial genetic i un control pozitiv cu o limit de detecie adecvat n calitate de test
de sensibilitate.
Precizia (reproductibilitatea) include nivelul de variaie (devierea standar-
d, coefcientul de variaie, intervalul de ncredere etc.) a rezultatelor n cadrul ace-
leiai experiene i gradul lor de reproductibilitate n diverse laboratoare cu diferit
echipament i diferii experimentatori.
Limita de detecie (Limit of detection LOD) este determinat prin analiza
unei probe cu o concentraie cunoscut a ADN-ului alogen i stabilirea unui nivel-
limit a cantitii, care poate f detectat cu siguran. n conformitate cu EMEA-
guideline CPMP/ICH/281/95 (http://www.emea.eu.int/pdfs /human/ich/028195en.
pdf.), LOD = (3,3 sigma): S, unde sigma este devierea standard, iar S este un
coefcient al curbei de calibrare. Limita de detecie poate f defnit drept concen-
69
traia la care 95% din experiene indic un nivel de sensibilitate de 95% i care este
experimental determinat prin cel puin trei serii de diluii ale concentraiei ADN,
iar fecare concentraie trebuie s fe analizat n 8 repetiii.
Limita de cuantifcare (Limit of Quantifcation LoQ) este determinat
prin analiza unei probe cunoscute i stabilirea unui coninut minim al transgenelor,
care poate f cuantifcat. LOQ este descris ca LOQ = (10 sigma): S, unde sigma i
S sunt defnii ca i n cazul LOD.
Utilizarea metodelor validate de testare reprezint o condiie obligatorie n
acceptarea datelor experimentale obinute de laborator. Laboratoarele implicate n
activiti de control trebuie s utilizeze metode validate, ceea ce constituie o cerin
pentru toate laboratoarele care au drept scop acreditarea lor. Fiecare metod nou,
care urmeaz a f validat este supus unei testri de ctre mai multe laboratoare pe
probe identice pentru a demonstra reproductibilitatea, sensibilitatea i specifcitatea
rezultatelor. Design-ul experimental, inclusiv modul de analiz a rezultatelor, repre-
zint un moment crucial n succesul testrii PMG. Programele de testare urmresc
s includ cele mai performante tehnologii, iar eforturile comune de colaborare a
mai multor structuri n domeniu vor facilita elaborarea i dezvoltarea unor teste
validate acceptate de utilizatori i de cei care reglementeaz activiti cu OMG.
Pn acum sunt standardizate i validate mai multe metode de detecie, identifcare
i cuantifcare a materialului MG. De exemplu, o metod de extragere a ADN-ului
din seminele de soia a fost elaborat i validat de ctre Bayer CropScience GmbH,
care ulterior a fost testat i confrmat de Community Reference Laboratory, Biote-
chnology and & GMOs Unit, 2007. Metoda de identifcare i cuantifcare a liniei de
porumb MON 863 utiliznd real-time PCR a fost elaborat de Monsanto Biotech-
nology Regulatory Sciences i validat de Joint Research Centre European Com-
mission Biotechnology & GMOs Unit, 2005. Metoda ELISA a fost validat pentru
testarea comercial a seminelor de soia Roundup ReadyTM de ctre JRC, 2000.
Baza de date COMPASS (http://gmo-crl.jrc.it) include toate dosarele i metodele
de testare a PMG (Detection methods validated in support to notifcations submitted
under Directive 2001/18/EC) (tab. 2.6). Protocoalele sunt accesibile publicului larg
pe site-ul http://www.gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm i http://gmo-crl.jrc.it/detecti-
onmethods.htm.
Principii de determinare cantitativ a oMG. Coninutul de OMG poate f
exprimat ca i cantitatea de material modifcat genetic din tot materialul analizat.
Pentru a determina aceast valoare prin metoda Real-time PCR, este necesar de
determinat numrul de secvene de ADN transgenic incluse n genom n raport cu
o gen de referin. Gena de referin trebuie aleas innd cont de specia analizat
care trebuie s fe ntr-o singur copie n genom. Ca gene de referin pentru porumb
se utilizeaz gena zeinei, iar pentru soia gena lectinei.
La moment nu este elucidat concret ce se subnelege sub noiunea de % OMG.
Coninutul MG (procentajul, %) include cantitatea de ingredient transgenic din to-
talul de ingredient (de ex., cantitatea de semine de porumb MG din tot lotul de
porumb). Determinarea coninutului de OMG se poate efectua dup curbele care
aparin secvenei transgenice i celei de referin, iar procentajul este calculat dup
raportul dintre secvenele MG i secvenele de referin (MG/referin*100).
Din punct de vedere analitic, este convenabil de calculat procentajul OMG
dup cantitatea de ADN-int raportat la secvenele specifce de taxon. ns nu se
ine cont de particulariti precum:
poliploidia (este posibil ca unele culturi de OMG s fe poliploide);
zigoia (transgenele se pot moteni homozigot sau heterozigot);
numrul de transgene integrate n genom (de obicei, o copie, n unele cazuri,
mai multe).
Capitolul
ASPECTE ALE ACTIVITII LABORATORULUI
SECURITATEA BIOLOGIC
3.1. Principii i norme de selectare a
materialului experimental pentru testare
3.2. Izolarea i purificarea proteinelor i ADN-
ului vegetal
3.3. Electroforeza proteinelor i acizilor nucleici
3.4. Estimarea coninutului de proteine i ADN
3.5. Exemple de protocoale
CAPITOLUL 3
PRELEVAREA I
OBINEREA PROBELOR
PENTRU ANALIZE
GENETICE
Training-ul practic n scopul utilizrii
i aplicrii echipamentului i a
metodologiilor pentru producerea i
analiza OMG
EXPERTIZA TEHNICA
SECURITATEA BIOLOGIC SECURITATEA BIOLOGIC
2005 - A.Port, doctor n tiine,
proiectul MTFP-04-08, UCR, SUA
2006 - A.Glijin, doctor n tiine,
proiectul MTFP-15-05, UCR, SUA
74
PRELEVAREA I OBINEREA
PROBELOR PENTRU ANALIZE
GENETICE
3.1. Principii i norme de selectare a
materialului experimental pentru testare
3.2. Izolarea i purifcarea proteinelor i
ADN-ului vegetal
3.3. Electroforeza proteinelor i a acizilor
nucleici
3.4. Estimarea coninutului de proteine i de ADN
ASPeCTe ALe ACTIVITII LABorATorULUI
SECURITATE BIOLOGIC
3
72
Capitolul 3. PreLeVAreA I oBINereA ProBeLor
PeNTrU ANALIze GeNeTICe
Testarea PMG se realizeaz efectund un numr mare de experimente, care
includ att antrenarea mijloacelor simple, ce permit detecia modifcrilor genetice,
ct i o serie de tehnici clasice i moderne, utilizate pentru identifcarea i cuantif-
carea acestora.
3.1. Principii i norme de selectare
a materialului experimental pentru testare
Prelevarea i prepararea probelor sunt doi factori determinani n testarea mate-
rialului modifcat genetic. Procedura de prelevare a eantioanelor determin nivelul
de reprezentativitate a datelor experimentale, n timp ce prepararea probei infuen-
eaz calitatea i cantitatea materialului analizat. Se consider c erorile n detecia
i cuantifcarea OMG pot interveni din cauza:
schemei de prelevare a probelor;
schemei de testare; i
preciziei metodelor analitice utilizate.
ntr-un lot de semine pot avea loc diverse contaminri sporadice i de aceea
prelevarea unui eantion mic nu va f reprezentativ statistic. Conform Organizaiei Na-
ionale Franceze de Validare (AFNOR), este necesar de a utiliza n analiz un numr
determinat de semine n conformitate cu echivalentul lor n mas (de exemplu,
10 000 semine). ns unii cercettori recomand prelevarea seminelor n cantitate de
aproximativ 1500 - 3000 g pentru a detecta un nivel foarte mic de MG. Reprezentativi-
tatea eantionului trebuie meninut n toate etapele ulterioare de analiz, ncepnd cu
prelevarea probelor n cmp i analiza lor n laborator. Modul de prelevare, dimensiu-
nea i omogenitatea eantionului trebuie s fe relevante pentru ntreg lotul de semine
sau pentru toat suprafaa cultivat i s permit identifcarea sursei de contaminare.
Aceast condiie este o particularitate esenial n detecia PMG neautorizate.
Pentru utilizarea metodelor standardizate de prelevare a seminelor, Agenia
internaional de testare a seminelor (International seed testing agency ISTA) a
elaborat un ghid de prelevare a probelor ISTA Handbook on seed. Conform acestui
ghid, principiile de prelevare a probelor n scopul controlului autorizat privind mo-
difcarea genetic sunt:
Prelevarea probelor de pe plante se efectueaz randomizat pe toat suprafaa
cmpului de cultivare. Plantele de pe care s-au colectat probele trebuie marcate pen-
tru observaii n cazul unor posibile repetri. n cazul plantelor cu cretere activ se
colecteaz frunzele apropiate de apex i se transfer n tuburi sterile, utiliznd mnui.
Numrul de probe supuse controlului n vederea unei posibile contaminri va depinde
de nivelul de contaminare suspectat sau de nivelul de siguran statistic cerut. Sunt au-
torizate urmtoarele dimensiuni ale eantionului necesare n detectarea contaminrilor
cu material modifcat genetic cu nivelul de semnifcaie de 95%:
73
100 plante pentru a detecta un nivel de contaminare de 3%;
200 plante pentru a detecta un nivel de contaminare de 1,5%;
300 plante pentru a detecta un nivel de contaminare de 1,0%;
3000 plante pentru a detecta un nivel de contaminare de 0,1% .
Prelevarea probelor din loturile de semine trebuie s se realizeze n con-
formitate cu art. 7 al directivei 66/400/EEC referitoare la regulile ISTA i conform
standardelor: ISO standard 6644; ISO standard 13690; ISO standard 5725 elaborate
de Organizaia Internaional de Standardizare.
Dimensiunea eantionului se selecteaz n funcie de cerinele metodelor de
testare utilizate n detecia MG i de certifcare a seminelor. JRC a revzut diferite mo-
daliti de prelevare a probelor pentru loturile de semine, prezentnd concluziile ntr-o
serie de documente a ISTA, USDA/GIPSA, CEN, ISO, WHO/FAO i o directiv a UE
specifc (98/53). Astfel, conform acestora, fecare eantion analizat n laborator n sco-
pul testrii OMG trebuie s includ ntre 2400 i 10 000 semine.
3.2. Izolarea i purifcarea proteinelor
i ADN-ului vegetal
Prepararea extractelor proteice. Izolarea i purifcarea proteinelor reprezint
o etap esenial n procesul de cuantifcare i studiere calitativ a acestora. Exist o
varietate larg de metode de extracie, cu diferene n etapele de lucru, n compoziia
soluiilor chimice folosite, n molaritatea i pH-ul soluiilor-tampon (Popescu, 1990;
, 1996; Reva i al., 2001). Strategia separrii i purifcrii proteinelor se
elaboreaz n funcie de scopul cercetrii, care prevede analiza proteinelor:
n condiii native, atunci cnd avem ca obiectiv activitatea proteinei (enzi-
m, antigen, anticorp, hormon, receptor etc.);
n condiii denaturante, cnd ne intereseaz structura primar, coninutul sau
diversitatea molecular a anumitor fracii proteice.
Proteinele sunt heteropolimeri cu mas molecular mare (de la 6 mii pn la
cteva mln) formai din -aminoacizi, unii prin legturi peptidice. Cantitatea de
proteine variaz n funcie de esut i organ, n frunze constituind 10-20% din masa
uscat. Proteinele vegetale sunt concentrate n citoplasm, deosebindu-se prin so-
lubilitate, proprieti fzico-chimice, dimensiuni, capaciti de interaciune specifce
cu ali polimeri etc. Pe aceste criterii se bazeaz metodele de fracionare a polime-
rilor proteici.
Solubilitatea este o particularitate esenial, dup care proteinele pot f fraci-
onate. n conformitate cu gradul de solubilitate, proteinele pot f clasifcate n apo-
solubile (albumine), salinosolubile (globuline) i alcalinosolubile (gluteline). Indi-
ferent de modul de extragere a proteinelor, urmtoarea etap este precipitarea (re-
versibil sau ireversibil) cu etanol, aceton, acid tricloracetic (ATA), tanine, sruri
ale metalelor grele, sulfat de amoniu etc. Unele din aceste componente provoac
denaturarea proteinei i sunt folosite n cazurile n care se solicit eliminarea acestor
74
compui (cercetarea componentelor neproteice din extract) sau n cazurile n care
starea nativ a proteinei nu are o mare importan (analiza proteinelor prin electro-
forez-SDS). Deoarece majoritatea proteinelor (pn la 40%) sunt concentrate n
soluia din citoplasma celulei, acestea pot f solubilizate n concentraii fziologice
ale srurilor de 0,8-1% cu valori neutre ale pH-ului.
n procesul de omogenizare a esuturilor vegetale, care preced extragerea pro-
teinelor, are loc acidularea citoplasmei ca rezultat al eliminrii sucului celular acid
din vacuole, al ptrunderii oxigenului atmosferic i al activitii oxidazelor, pero-
xidazelor etc. Pentru a pstra starea nativ a proteinelor, este necesar de meninut
acele condiii fzico-chimice care au existat n protoplasm nainte de omogenizare.
Un parametru important este pH-ul, valorile cruia pot f meninute cu ajutorul so-
luiilor-tampon cu pH 7,5-8,5 (fosfai, borai, Tris).
Flavonoizii i taninele eliberate din vacuole la omogenizarea esuturilor vege-
tale pot s inhibe unele enzime, s se uneasc cu proteina prin legturile de hidrogen
sau s formeze legturi covalente cu gruprile funcionale laterale ale unor aminoa-
cizi (serina, treonina, cisteina, lizina, arginina, acizii aspartic i glutatamic). Pentru
a prentmpina aceste efecte, este folosit polivinilpirolidonul n calitate de adaos la
soluiile-tampon, care formeaz complexe cu favonoizii i taninele, ulterior find
uor eliminate prin centrifugare. Pentru reducerea proceselor oxidative, n primul
rnd oxidarea polifenolilor de ctre oxidaze, se adaug 2-mercaptoetanol, ditiotrei-
tol, cistein, acid ascorbic etc. Mercaptoetanolul este adiionat n soluia-tampon i
n scopul protejrii grupelor sulfhidril ale proteinelor fa de oxidare. Meninerea
unei concentraii reduse a ionilor polivaleni este esenial pentru proteinele native
i se poate realiza prin adiia n extragent a etilendiamintetraacetatului (EDTA, 3-5
mM), care formeaz complexe chelatice cu metalele grele.
Denaturarea i hidroliza proteinelor poate f evitat dac izolarea se va realiza
la temperatura de 0 + 4C cu adugare de inhibitori ai proteolizei. De asemenea,
n cazul proteinelor native (mai ales n obinerea enzimelor) se utilizeaz numai ma-
terial proaspt prelevat. Dac apare necesitatea ca materialul s fe pstrat mai mult
timp, atunci el se nghea i se pstreaz la temperaturi sczute (-20 -70C) sau
n unele cazuri se lioflizeaz.
Extragerea proteinelor din omogenatul de esuturi vegetale n scopul analizei
acestor compui n condiii denaturante se poate realiza fracionat sau nefracionat
cu obinerea unui extract sumar de proteine uor solubile (Duca i al., 2001; Reva
i al., 2001). n acest caz, obinerea extractului proteic din omogenatul de esuturi
vegetale se realizeaz n soluie-tampon Tris-HCl 62,5 mM, pH-6,8 ce conine: gli-
cerin 5%, mercaptoetanol 1%, EDTA 0,1%, inhibitor al proteazelor n raport de l g
prob : 5 ml timp de 30 min. - 1 or cu agitare. n supernatantul obinut n urma
centrifugrii timp de 15 min. la o turaie de 10 000 rot/min. se adaug acid triclo-
racetic de 50% pn la o concentraie fnal de 5% pentru precipitarea proteinelor.
Sedimentul rezultat prin centrifugare 10 min. la o turaie de 10 000 rot/min. se su-
pune unor operaii de purifcare prin splri cu: etanol 70% coninnd Tris-HCl 10
75
mM de dou ori; aceton rcit de 80%, de dou ori; etanol 96%, de dou ori i n
fnal cu eter etilic, fecare dintre aceste operaii find urmat de o centrifugare de 10
min. la 10000 rot/min. Precipitatul obinut se usuc n curent de aer i se dizolv n
soluie-tampon nainte de a f supus fracionrii prin electroforez.
Izolarea i purifcarea ADN-ului. Macromolecula de ADN este o structur inert
chimic, gruprile potenial reactive find situate n centrul helixului, unite prin legturi de
hidrogen, fapt ce confer rezisten i durabilitate chimic, permind analiza macromo-
leculei de ADN i dup perioade lungi de timp de la momentul izolrii din probe.
n literatura de specialitate exist numeroase metode de izolare a ADN-ului,
diversitatea crora depinde de materialul experimental celule de tip eucariot sau
procariot, culturi de celule sau esuturi proaspete, esut de plante sau animale etc.
Izolarea i purifcarea ADN-ului este prima etap care st la baza tuturor procedee-
lor de inginerie genetic i a studiilor de genetic molecular, inclusiv n efectuarea
testrii PMG. ADN-ul genomic se obine n form fragmentat, generndu-se frag-
mente cu lungimi care variaz de la 100 kb pna la 150 kb. n aceast form, ADN-ul
ndeplinete toate condiiile pentru a f utilizat cu succes n analize de tip Southern
blot, n reacii de amplifcare prin polimerizare n lan i pentru construirea librri-
ilor de ADN genomic. ns efciena utilizrii ADN-ului n analizele ulterioare este
determinat de puritatea i de integritatea acestuia.
Procedeele clasice de izolare a ADN-ului implic digestia celulelor eucariote sau a
esuturilor cu proteinaz K, n prezen de EDTA, care leag cationii bivaleni i inhib
ADN-azele. Concomitent, are loc solubilizarea membranelor i denaturarea proteinelor
cu detergeni de tip SDS (dodecil sulfat de sodiu). Acizii nucleici sunt apoi purifcai prin
extracii cu solveni organici, ARN contaminant find eliminat prin digestie cu ARN-aze.
Succesul izolrii ADN-ului intact, indiferent de metoda utilizat, depinde de:
efciena degradrii celulelor i esuturilor;
denaturarea complexelor nucleoproteice;
inactivarea ADN-azelor;
purifcarea ADN-ului.
Majoritatea metodelor de izolare i purifcare a acizilor nucleici includ o sche-
m experimental de baz cu etape similare i utilizarea unui ir de reageni speciali.
Selectarea soluiei-tampon i a diferitor adaosuri se face n funcie de difcultile
de izolare i purifcare determinate de particularitile anatomice i biochimice ale
materialului vegetal utilizat. Se deosebesc cteva grupe de reageni indispensabili
unei proceduri de extragere i purifcare a ADN-ului soluii-tampon, detergeni,
antioxidani, chelatori de metale, ageni de precipitare i purifcare a ADN-ului.
Schema oricrui protocol de izolare a acizilor nucleici include urmtoarele eta-
pe de baz:
Liza celular. Tehnica de extragere a acizilor nucleici are ca prim etap liza
celulelor, care poate f realizat pe cale mecanic (mojarare cu nisip), fzic (ultrasoni-
76
care) sau chimic (tratare cu detergeni specifci: SDS, Triton X 100, Nonidet, Tween
i/sau enzime, care atac peretele celular: proteinaza K, pronaza E, lizozim).
Deproteinizarea. Separarea fazei organice, respectiv nlturarea prin pre-
cipitare a proteinelor i a resturilor celulare, se realizeaz prin tratamente chimice,
urmate de centrifugare. Modul standard de nlturare a proteinelor din soluiile de
acizi nucleici este extracia fenolic sau cu amestec cloroform : alcool izoamilic
(24:1), care stabilizeaz faza organic dintre cele dou faze lichide.
Extracia ADN-ului. Principiul acestei etape reprezint utilizarea solubi-
litii difereniate a moleculelor de acizi nucleici/ contaminani ntre dou faze ne-
miscibile. Soluia de acizi nucleici este viguros amestecat cu o faz non-miscibil
(fenol, cloroform, eter, izobutanol, NaCl 6M) timp de cteva minute. Faza apoas,
care conine acizii nucleici, este recuperat atent cu pipeta, dup centrifugare.
Precipitarea ADN-ului. Precipitarea se realizeaz cu izopropanol sau alcool
etilic la o for ionic nalt. n aceste condiii, acizii nucleici sunt total precipitai.
Pentru concentraiile sczute de ADN (<50 g/ml) timpul de precipitare trebuie s fe
foarte lung (> 10 ore). Alcoolul etilic trebuie s fe foarte rece, deoarece precipitrile
sunt accelerate prin rcire (de la -20C la -70 C). Precipitatul este recuperat prin cen-
trifugare. Dup ambele tipuri de precipitare, sedimentul se spal cu etanol 70%, pentru
ndeprtarea srii sau a urmelor de izopropanol, apoi se usuc.
ADN-ul obinut este resuspendat ntr-o soluie-tampon TE (Tris 10 mM i
EDTA 0,1 la l mM) sau ap bidistilat i se poate pstra la 4C. Concentraia de
EDTA poate f crescut pentru a evita riscul digestiei de ctre nucleazele conta-
minante dar, n acest caz, va f necesar ndeprtarea acestuia nainte de a analiza
ADN-ul, deoarece enzimele sunt inhibate de ctre EDTA. Preferabil este s nu s se
congeleze ADN-ul genomic, deoarece congelarea i decongelarea frecvent provoa-
c degradri mecanice ale ADN-ului.
Procedeele aplicate n extragere i reagenii utilizai condiioneaz calitatea
ADN-ului. Prezena unui ir de substane, ce se pot conine n ADN dup izolarea
acestuia, pot diminua reaciile de polimerizare sau chiar induce inhibarea complet
a reaciei PCR (tab. 3.1.).
Tabelul 3.1.
Substane cu rol de inhibare a reaciei PCr
Inhibitorul Concentraia de inhibare
SDS > 0,005%
Fenol > 0,2%
Etanol > 1%
Izopropanol > 1%
Acetat de sodiu > 5 mM
NaCl > 25 mM
EDTA > 0,5 mM
Uree > 20 mM
77
Unul din protocoalele cel mai des utilizate pentru izolarea moleculelor de ADN
cu utilizarea soluiilor-stoc se bazeaz pe utilizarea soluiei-tampon cu detergen-
tul cetiltrimetilamonium bromid (CH
3
(CH
2
)
15
N(CH
3
)
3
Br (CTAB) dup Murray i
Thompson (1980).
Principiul metodei: CTAB lizeaz celulele, formnd un complex insolubil cu
acizii nucleici la concentraie redus de sruri (mai mici de 0,5 M). n aceste condi-
ii, polizaharidele, compuii fenolici i alte substane rmn n supernatant i pot f
eliminate ulterior. ADN-ul poate f solubilizat prin creterea concentraiei de sare i
precipitat cu alcool (etanol sau izopropanol). Etapele de izolare i purifcare a ADN-
ului conform acestei metode sunt rezumate n tabelul 3.2.
Tabelul 3.2.
etapele de izolare a ADN-ului dup Murray i Thompson (1980)
etapa Descrierea etapei
1. omogenizarea i
liza celulelor
Materialul vegetal (2-5 g) se omogenizeaz n azot lichid pn la obinerea
unui praf (pudr) de culoare verde deschis, care se transfer rapid n soluia-
tampon n prealabil nclzit pn la 65
de CTAB 2X n raport de 25 ml
soluie pentru 2-5 g esut, urmat de agitare.
2. extragerea acizilor
nucleici
Extragerea ADN-ului se realizeaz prin incubarea probelor la 65
timp
de cel puin 20 minute (rezultate mai bune sunt obinute n urma incubrii
ndelungate de 1-3 ore).
3. Izolarea i operaii
multiple de
purifcare a ADN-
ului
La extractul rcit pn la temperatura camerei se adaug un volum egal
de amestec de cloroform : alcool izoamilic (24:1) i se agit 20 minute la
temperatura camerei, dup care se centrifugheaz la 5000 g timp de 10
minute. La faza apoas astfel separat se adaug 0,2 volume de CTAB 5X, se
agit i se incubeaz 10 minute la temperatura de 65
.
3.1. Purifcarea ADN-
ului.
ADN-ul se precipit cu 0,5 ml etanol absolut (100%) prin inversarea
eprubetelor de 5-8 ori, apoi se las la temperatura camerei 1-3 minute. Se
adaug un volum egal de amestec de cloroform : alcool izoamilic (24:1). Se
agit 10 minute la temperatura camerei i se centrifugheaz la 5000 g timp de
10 minute. Dac faza apoas nu este strvezie sau interfaza este mare, ultima
procedur se repet.
3.2. Obinerea
precipitatului.de.
ADN urmat de
resuspendarea lui n
soluie
La supernatant se adaug un volum egal (se admite i 2-3 volume) de soluie-
tampon de precipitare, se agit i se las la temperatura camerei pentru o
or sau peste noapte. Obinerea sedimentului se realizeaz prin centrifugare
la 8000 g timp de 20 minute. La precipitat se adaug 1-2 ml soluie tampon
TE. Uneori pentru o dizolvare complet este necesar nclzirea soluiei
pn la 65
.
3.3. Precipitarea
repetat a ADN-ului
La soluia ce conine ADN-ul solubilizat se adaug dou volume de alcool etilic
(100%). Se las pentru 1-2 ore la temperatura de -20C sau 30 minute la -70C,
dup care se centrifugheaz la 8000 g timp de 10 minute la temperatura de 4C.
La precipitat se adaug 200 l H
2
O distilat i 100 l NH
4
Ac 7,5 M (pH 7,5).
Se las pentru 20 minute la temperatura de 0
dup care se centrifugheaz la

13.00 g timp de 10 minute la temperatura de 4C.
3.4. Precipitarea
repetat a ADN-ului
La soluia ce conine ADN-ul solubilizat se adaug dou volume de alcool
etilic (100%). Se las pentru 20 minute la -70C, apoi se centrifugheaz la
13 000 g timp de 10 minute la temperatura de 4C.
3.5. Ultima etap de
purifcare a ADN-ului
La sedimentul obinut se adaug 1 ml etanol 80% i se centrifugheaz la 13 000 g
timp de 10 minute la temperatura de 4C.
4. Solubilizarea i
pstrarea ADN-ului
Sedimentul de ADN se dizolv n ap bidistilat, steril sau NaOH 8 mM.
Soluia de ADN poate f pstrat la temperatura de -20C timp de mai multe
luni.
78
Pentru izolarea ADN-ului prin tehnologia descris anterior sunt necesare urm-
toarele soluii-tampon:
1. CTAB 2X (CTAB 2%, NaCl 1,4 M, Tris-Cl pH 8,0 0,1M, EDTA 20 mM).
2. CTAB 5X (CTAB 5%, EDTA 350 mM).
3. de precipitare (CTAB 1%, Tris-Cl pH 8,0 50 mM, EDTA 10 mM).
4. TE (NaCl 1 M, Tris Cl pH 8,0 10 mM, EDTA 1 mM).
Actualmente, sunt cunoscute un ir de protocoale, bazate pe utilizarea kit-urilor
speciale, care simplifc i reduc timpul izolrii ADN-ului. Izolarea ADN-ului cu
DNAzol (Plant DNAzol Reagent, SUA, patent nr. 5,945,515) combin sigurana
i efciena incluse ntr-un protocol foarte simplu i rapid (tab. 3.3.). Toate etapele de
izolare prin aceast metod decurg la temperatura camerei, iar centrifugarea poate f
realizat la temperatura de la 4C pn la 25C.
Tabelul 3.3.
etapele de izolare a ADN-ului cu DNAzol
Denumirea
etapei
Descrierea etapei
1. omogenizarea i
liza celulelor
Materialul vegetal (de obicei 0,1 g) se omogenizeaz direct n eprubeta tip Eppendorf,
care conine 0,3 ml DNAzol, utiliznd o baghet din plastic.
2. extragerea
acizilor nucleici
Extragerea ADN-ului se realizeaz prin incubarea probelor la 25
C timp de 5
minute cu agitare.
3. Izolarea i
operaii de
purifcare a
ADN-ului
La extractul ce conine ADN se adaug 0,3 ml cloroform, se agit atent timp de 5
minute la temperatura de 25
C, dup care se centrifugheaz la 12 000 g timp de 10

minute. Faza se separ i se transfer ntr-un tub nou. Pentru astfel de tehnologii,
cum ar f PCR-ul, care necesit cantiti limitate de ADN, adugarea cloroformului
este opional.
3.1. Precipitarea
ADN-ului
ADN-ul se precipit cu 0,225 ml etanol absolut (100%) i se agit foarte atent
prin inversarea tuburilor de 6-8 ori, dup care probele se incubeaz la temperatura
camerei pentru 5 minute, apoi se centrifugheaz la 5000 g timp de 4 minute la
temperatura de 4C. Uneori precipitatul nu este vizibil pn la centrifugare.
3.2. Purifcarea ADN-
ului
Pentru purifcarea ADN-ului se adaug 0,3 ml amestec DNAzol : etanol absolut (n
raport de 1 : 0,75), dup care probele se vortexeaz, se incubeaz la temperatura
camerei pentru 5 minute, apoi se centrifugheaz la 5000 g timp de 4 minute.
n cazul n care din materialul vegetal se extrag cantiti mici de ADN, soluia de
splare (DNAzol : etanol absolut) poate f redus la 50%.
3.3. Splarea repetat
a ADN-ului
La sedimentul de ADN se adaug 0,3 ml etanol 75% i se agit atent, dup care
se centrifugheaz la 5000 g timp de 4 minute. Dup centrifugare, supernatantul se
nltur prin decantare.
Pentru probele > 5g se recomand o splare suplimentar cu etanol, care este necesar
pentru a nltura excesul de cloroform i unii pigmeni din sedimentul de ADN.
4. Solubilizarea i
pstrarea ADN-
ului
Sedimentul de ADN se dizolv n 70 l soluie-tampon TE pH 8,0.
Dac sedimentul de ADN nu se dizolv, atunci precipitatul se centrifugheaz din nou
la 12 000 g timp de 4 minute i se dizolv n soluie de NaOH 8 mM.
Soluia de ADN poate f pstrat la temperatura de -20C timp de mai multe luni.
esuturile vegetale resuspendate n DNAzol pot f pstrate cel puin o sptmn la
temperatura camerei i cel puin o lun sau un an la temperatura de 4C sau -20C.
Sedimentul de ADN poate f pstrat n soluie-etanol (95%) timp de cel puin o
sptmn la temperatura camerei sau un an la 4C.
79
ADN-ul izolat cu DNAzol poate conine ARN. Pentru a evita contaminarea se
recomand de a aduga ARNase la soluia de DNAzol la etapele iniiale de extragere
a ADN-ului (100 g ARNase/ml DNAzol).
3.3. electroforeza proteinelor i a acizilor nucleici
Electroforeza reprezint o metod analitic de separare, bazat pe fenomene
fzico-chimice de migrare difereniat a diferitor specii de particule ncrcate elec-
tric sub aciunea cmpului electric. Deplasarea se face spre unul din electrozi, iar
ntre electrozi i componentele de separat nu au loc reacii. O macromolecul cu o
sarcin electric dat, n deplasarea sa ntr-un cmp electric uniform i omogen, va
f mai mult sau mai puin frnat, n funcie de dimensiunile sale i ale porilor
gelului, find caracterizat prin mobilitatea electroforetic. Mobilitatea electroforeti-
c depinde de factorii care sunt proprii macromoleculei (dimensiuni, form, sarcin
electric, concentraie, grad de hidratare i disociere), proprii mediului de separare
(viscozitate n corelaie cu dimensiunile porilor, pH, for ionic, temperatur) i, de
asemenea, depinde de intensitatea cmpului electric i de timpul de migrare (Popes-
cu, 1990; Reva i al., 2001).
n funcie de proprietile proteinei sau ale proteinelor luate n studiu, pe de o
parte, i de scopul concret urmrit, pe de alt parte, se precizeaz urmtoarele aspec-
te ale protocolului de lucru:
compoziia chimic, concentraia i structura gelului (omogen sau
gradient);
forma gelului (cilindric sau plat);
condiiile de separare (denaturante sau nedenaturante, disociative sau
nedisociative);
sistemul-tampon (continuu sau discontinuu);
fora ionic i pH-ul sistemului-tampon.
De cele mai multe ori sunt necesare experiene-test preliminare pentru a defni-
tiva procedura optim de lucru.
electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid n prezen de SDS.
Pentru fracionarea de nalt rezoluie a amestecurilor de proteine din esuturile ve-
getale n condiii disociative (denaturante), se apeleaz, de obicei, la sistemul-tam-
pon discontinuu care conine SDS, tehnic descris de Laemmli (1970).
reageni necesari: toate soluiile-stoc se prepar cu reactivi de puritate anali-
tic i cu ap bidistilat i fltrat prin fltru de 0,45 m. Soluiile-stoc, care se ps-
treaz la rece, se aduc la temperatura camerei nainte de folosire (tab. 3.4.).
Proteinele sunt separate n geluri de poliacrilamid cilindrice sau plate pe baza
masei moleculare.
Prima etap n efectuarea electroforezei este asamblarea matriei. Matria este
alctuit din dou plci de sticl (perfect plane i fr zgrieturi) i dou distana-
toare (spacers) confecionate din material plastic fexibil de diferite grosimi (gro-
80
simea gelului este determinat de grosimea distanatoarelor). Pieptenele servete la
obinerea godeurilor (sample wells) n care se aplic probele proteice.
Tabelul 3.4.
reageni utilizai n electroforeza proteinelor n geluri
de poliacrilamid n prezen de SDS
Soluii-stoc Componen i modul de preparare
reactivul 1.
Soluie-tampon pentru gelul de
separare (tris-HCl 1,88 M pH =
8,8)
Se dizolv 22,7 g Tris n 75 ml H
2
O; se ajusteaz pH-ul la 8,8 cu HCl
concentrat i se completeaz volumul fnal la 100 ml; se pstreaz
la 4C.
Soluia este stabil mai multe luni.
reactivul 2.
Soluie-tampon pentru gelul de
concentrare (Tris-HCl 0,638 M,
pH = 6,8)
16,65 ml reactivul nr. l se dilueaz n raport de 1 : 2 se ajusteaz
pH-ul la 6,8 cu HCl 6 i se completeaz volumul la 50 ml. Soluia
se pstreaz la 4
0
C.
Soluia este stabil mai multe luni.
reactivul 3.
Soluie-tampon pentru probe
5 ml reactivul nr. 2 se dilueaz n raport de 1 : 5; n soluia obinut se
dizolv succesiv 2,12 g SDS, 3 ml -mercaptoetanol, 10 g zaharoz.
0,002 g albastru de bromfenol: volumul fnal se completeaz la 50
ml cu H
2
O. Soluia este stabil mai multe luni n congelator.
reactivul 4.
Soluie de acrilamid i
bisacrilamid
n 30 ml se dizolv 24,35 g acrilamid i 0,6494 g bisacrilamid la
temperatura camerei; se aduce volumul fnal la 50 ml.
Soluia-stoc se pstreaz n sticl brun la 4C.
Soluia este stabil cel puin 30 zile.
reactivul 5.
Soluie de SDS (1%).
n 25 ml H
2
O se dizolv 250 mg de SDS.
reactivul 6.
Soluie de TEMED (0,48%)
0,48 ml de TEMED se completeaz cu H
2
O la 100 ml.
reactivul 7.
Soluie de persulfat de amoniu
(0,5 %)
n 10 ml H
2
O se dizolv 50 mg persulfat de amoniu.
reactivul 8.
Soluie-tampon de migrare pentru
rezervorul superior
n 100 ml H
2
0 se dizolv succesiv: 1,815 g Tris, 8,64 g glicin i
600 mg SDS; se completeaz volumul fnal la 600 ml; pH-ul soluiei
trebuie s fe 8,3 (nu este necesar ajustarea). Soluia este stabil mai
multe sptmni.
reactivul 9.
Soluie-tampon de migrare pentru
rezervorul inferior
n 580 ml H
2
O se dizolv 1,815 g Tris; se ajusteaz pH-ul la 8,3 cu
HC1 concentrat i se completeaz volumul fnal la 600 ml.
reactivul 10.
Soluie pentru fxarea peptidelor
n gel
La 250 ml izopropanol i 100 ml acid acetic glacial se adaug 650
ml H
2
O.
reactivul 11.
Soluie pentru colorare
n 223,1 ml H
2
O se dizolv 100 mg colorant Coomase blue G-250
prin agitare timp de 30 minute; se adaug 26,9 ml HC1O
4
32,5%, 5
min. se agit; se fltreaz.
reactivul 12.
Soluie de acid acetic de 7%
35 ml acid acetic glacial se dizolv n 465 ml H
2
O distilat.
Electroforeza n sistem-tampon discontinuu presupune pregtirea a dou geluri,
care difer ntre ele prin dimensiunea porilor, fora ionic i valoarea pH-ului.
Gelul de separare omogen. Cantitile din soluie (n ml) necesare pentru
amestecul de polimerizare, de exemplu, obinerea gelurilor de concentraia
12,5% cu utilizarea matrielor cu dimensiuni de 10 cm x 12 cm sunt urmtoa-
rele: 4 ml reactiv nr. l; 5 ml reactiv nr. 4; 5ml reactiv nr. 6; 2 ml reactiv nr. 5;
81
2 ml H
2
O distilat; 2 ml reactiv nr. 7; amestecul se agit uor. Se recomand
degazarea timp de 10 - 15 min., nainte de adugarea persulfatului de amoniu i
a TEMED. Amestecul de polimerizare se transfer n matricea asamblat, evi-
tndu-se formarea bulelor de aer; nivelul soluiei, care prin polimerizare va for-
ma gelul de separare, trebuie s fe la 1 - 1,5 cm distan de dinii pieptenelui.
Imediat, cu o pipet se acoper cu mult atenie partea superioar a viitorului
gel cu un strat (0,5 - 1 cm) de ap distilat. Apa se adaug pentru a se obine o
fa perfect plan a prii superioare a gelului de separare.
Gelul de concentrare..Gelul de concentrare se pregtete cu 45 - 60 min. nainte
de aplicarea probelor proteice. Se ndeprteaz complet stratul de lichid de la
partea superioar a gelului de separare. Se prepar 3 ml amestec de polimerizare:
0,6 ml reactiv nr. 2; 3 ml reactiv nr. 4; 0,75 ml reactiv nr. 6; 0,3 ml reactiv nr. 5;
0,45 ml H
2
O distilat; 0,6 ml reactiv nr. 7. Amestecul se pipeteaz n matrice;
polimerizarea este complet dup 30 - 45 min. Pieptenele se ndeprteaz, avnd
grij s nu se deformeze gelul de concentrare.
Pregtirea, aplicarea i separarea probelor proteice se ncepe cu dizolvarea
precipitatului proteic uscat (n raport de 10 : 1) n soluie-tampon tris-HCl pH 6,8 (re-
activul nr. 3), urmat de ferbere pe o baie de ap timp de 2 - 5 min. Extractele proteice
astfel obinute sunt stabile mai multe sptmni, dac se pstreaz la temperaturi joase
n congelator (cel puin - 10 C), totui trebuie avut n vedere c ngherile repetate
duc la degradarea proteinelor. Probele proteice ferte i rcite la temperatura camerei
se aplic sub soluia-tampon de migrare direct n godeuri (5 - 7,5 l).
Matricea cu probele proteice se introduce n cuva aparatului de electroforez cu
electrozii de platin asamblai; se umplu cu soluia-tampon de migrare rezervoarele
superior (reactivul nr. 9) i inferior (reactivul nr. 10). Electrozii din cele dou rezer-
voare se conecteaz la sursa de curent continuu; n prima or de electroforez, pn
cnd frontul colorat albastru intr n gelul de separare, se lucreaz la 15 m A i 80 V,
iar n continuare la 30 m A, 180 V pn cnd frontul colorantului a ajuns la l cm de
marginea inferioar a gelului de separare (cca 3 - 4 ore).
Se deconecteaz cuva aparatului de electroforez de la sursa de curent conti-
nuu, se detaeaz i se dezasambleaz matricea, iar gelul separat este supus operai-
ilor de fxare (reactivul nr. 9 timp de 2 ore), colorare (timp de 1-2 ore n reactivul nr.
10), decolorare (reactivul nr.11), fotografere etc.
Pentru determinarea masei moleculare relative a fraciilor polipeptidice sepa-
rate, se efectueaz electroforeza n condiii identice unor probe cu martori, avnd
mase moleculare cunoscute. Pe baza electroforegramei obinute n fecare caz, se
realizeaz o curb de calibrare n coordonate Rf i Ln Mr, cu ajutorul creia se deter-
min logaritmii normali (Ln) ai maselor moleculare relative ale fraciilor separate,
n funcie de indicii mobilitii electroforetice (Rf).
electroforeza ADN-ului se realizeaz pentru a determina calitatea ADN-lui, sepa-
rarea fragmentelor de restricie, transferul pe membran urmate de hibridri, separarea
produselor de amplifcare PCR (ampliconilor) etc. i se efectueaz n gel de:
82
agaroz (pentru fragmentele care au n medie 1 kb); i
poliacrilamid (pentru fragmentele mici pn la 500 pb).
Concentraia gelului depinde de dimensiunea fragmentului analizat. Cu ct
fragmentul este mai mare, cu att concentraia gelului va f mai mic. De exemplu,
pentru electroforeza ADN-ului total (genomic) n scop de estimare a calitii i in-
direct a calitii probei se utilizeaz gelul de agaroz cu concentraia de 0,8-1,0%,
iar electroforeza ampliconilor se realizeaz n gel de agaroz de 1,4 - 2,0%. Gelul
din poliacrilamid permite separarea i vizualizarea fragmentelor mai mici de ADN,
comparativ cu gelul din agaroz.
Separarea electroforetic a ADN-ului se efectueaz utiliznd aparate electrofo-
retice orizontale (fg. 3.1. A) n cazul gelurilor de agaroz sau verticale (fg. 3.1. B)
pentru gelurile de acrilamid.
Conform metodei standard (Sambrook i Russell, 2001) fracionarea ADN-ului
se realizeaz n cteva etape (fg. 3.2.).
n calitate de sistem-tampon de migrare de cele mai dese ori se prepar TBE
(n baz de Tris-borat) sau TAE (n baz de Tris-acetat) cu pH-ul 8,0. Este important
ca n ambele rezervoare ale cuvei de electroforez i gel s fe utilizat aceeai solu-
ie-tampon. Chiar cele mai mici diferene n tria ionic sau pH creeaz fronturi n
gel, care pot afecta semnifcativ mobilitatea electroforetic a fragmentelor de ADN.
n cazul determinrii dimensiunilor fragmentelor necunoscute de ADN, trebuie s
ne asigurm c toate probele au fost depuse n godeuri n aceeai soluie-tampon.
Concentraia mrit a srurilor n anumite soluii-tampon destinate enzimelor de
restricie (de exemplu, BamH1 i EcoRI) diminueaz mobilitatea ADN-ului.
Concentraiile agarozei necesare separrii ADN-ului de diferite dimensiuni
sunt incluse n tabelul 3.5.
Figura 3.1. Camera de electroforez
de tip orizontal (A) i vertical (B)
fragmentelor de restricie, transferul pe membran urmate de hibridri, separarea produselor de
amplificare PCR (ampliconilor) etc. i se efectueaz n gel de:
x agaroz (pentru fragmentele care au n mediu 1 kb) i
x poliacrilamid (pentru fragmentele mici pn la 500 pb).
Concentraia gelului depinde de dimensiunea fragmentului analizat. Cu ct fragmentul este mai
mare, cu att concentraia gelului va fi mai mic. De exemplu, pentru electroforeza ADN-ului total
(genomic) n scop de estimare a calitii i indirect a calitii probei se utilizeaz gelul de agaroz cu
concentraia de 0,8-1,0%, iar electroforeza ampliconilor se realizeaz n gel de agaroz de 1,4-2,0%.
Gelul din poliacrilamid permite separarea i vizualizarea fragmentelor mai mici de ADN, comparativ
cu gelul din agaroz.
Separarea electroforetic a ADN-ului se efectueaz utiliznd aparate electroforetice orizontale
(fig. 3.1. A) n cazul gelurilor de agaroz sau verticale (fig. 3.1. B) pentru gelurile de acrilamid,
conectate la sursa de curent.
Conform metodei standard (Sambrook i Russell, 2001) fracionarea ADN-ului se realizeaz n
cteva etape (fig. 3.2.).
n calitate de sistem-tampon de migrare de cele mai dese ori se prepar TBE (n baz de Tris-
borat) sau TAE (n baz de Tris-acetat) cu pH-ul 8,0. Este important ca n ambele rezervoare ale cuvei
de electroforez i gel s fie utilizat aceeai soluie-tampon. Chiar cele mai mici diferene n tria
ionic sau pH creeaz fronturi n gel care pot afecta semnificativ mobilitatea electroforetic a
fragmentelor de ADN. n cazul determinrii dimensiunilor fragmentelor necunoscute de ADN, trebuie
s ne asigurm c toate probele au fost depuse n godeuri n aceeai soluie-tampon. Concentraia
mrit a srurilor n anumite soluii-tampon destinate enzimelor de restricie (de exemplu, BamH1 i
EcoRI) diminueaz mobilitatea ADN-ului.
Figura 3.1. Camera de electroforez
de tip orizontal (A) i vertical (B)
A B
86
A
83
Concentraiile agarozei necesare separrii ADN-ului de diferite dimensiuni sunt incluse n tabelul
3.5.
Figura 3.2. Principalele etape n realizarea electroforezei orizontale
1,2 asamblarea matriei;
3 distribuirea gelului n matria asamblat;
4 fixarea pieptenului pentru obinerea godeurilor;
5 conectarea cuvei de electroforez la sursa de curent electric.
Tabelul 3.5.
Dependena dintre concentraia gelului de agaroz i
dimensiunea moleculelor de ADN
Concentraia agarozei n gel
(% [W/V])
Mrimea moleculelor fragmentelor de ADN
(kb)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Gelul se prepar prin dizolvarea agarozei n ap distilat la temperaturi nalte. Pentru aceasta se
utilizeaz cuptorul cu microunde i mnui. ntruct soluia de agaroz poate deveni foarte fierbinte i
poate ncepe fierberea brusc prin formarea bulelor mari de aer i revrsarea soluiei din vas, nclzirea
ei are loc cu precauie. nclzirea poate fi ntrerupt i repetat, pn la dizolvarea complet a agarozei.
Agitarea manual a vasului va ajuta splarea de pe pereii vasului a cristalelor de agaroz. Dizolvarea
87
Figura 3.2. Principalele etape n realizarea electroforezei orizontale
1,2 asamblarea matricei;
3 distribuirea gelului n matricea asamblat;
4 fxarea pieptenului pentru obinerea godeurilor;
5 conectarea cuvei de electroforez la sursa de curent electric.
84
Tabelul 3.5.
Dependena dintre concentraia gelului de agaroz i
dimensiunea moleculelor de ADN
Concentraia agarozei n gel
(% [W/V])
Mrimea fragmentelor de ADN (kb)
0,3 5 - 60
0,6 1 - 20
0,7 0,8 - 10
0,9 0,5 - 7
1,2 0,4 - 6
1,5 0,2 - 3
2,0 0,1 - 2
Gelul se prepar prin dizolvarea agarozei n ap distilat la temperaturi nalte.
Pentru aceasta se utilizeaz cuptorul cu microunde i mnui. ntruct soluia de aga-
roz poate deveni foarte ferbinte i poate ncepe ferberea brusc prin formarea bulelor
mari de aer i revrsarea soluiei din vas, nclzirea ei are loc cu precauie. nclzirea
poate f ntrerupt i repetat, pn la dizolvarea complet a agarozei. Agitarea manu-
al a vasului va ajuta splarea de pe pereii vasului a cristalelor de agaroz. Dizolvarea
complet este determinat de transparena soluiei. n cazul unei nclziri ndelungate
poate scdea volumul soluiei n urma evaporrii intense, mrind concentraia gelului,
de aceea se recomand de a verifca volumul soluiei i n caz de necesitate suplinirea
lui cu ap distilat. Soluia preparat se rcete la temperatura camerei pn la 55C,
dup care se adaug bromur de etidiu cu o concentraie fnal de 0,5 g/ml. Pentru
omogenizare se utilizeaz agitatorul magnetic.
Distribuirea soluiei de agaroz n matrice trebuie s fe uniform i fr bule de aer,
iar grosimea recomandat este de 3 - 5 mm. Pentru aceasta, cuva de electroforez se va
plasa pe o suprafa plan. Fixarea pieptenului n gel va contribui la formarea godeurilor,
n care vor f plasate probele de ADN. Polimerizarea deplin a gelului are loc dup
30 - 45 minute la temperatura camerei, dup care gelul este acoperit cu soluia-tampon.
La probele de ADN care urmeaz a f separate electroforetic se adaug 0,20
volume soluie-tampon pentru probe (loading buffer) 6X. Cu ajutorul micropi-
petei probele sunt plasate n godeuri. Cuva de electroforez se acoper cu capacul
i se conecteaz la sursa de curent stabilindu-se tensiunea de 1-5 V/cm (distana se
msoar dintre electrodul pozitiv i cel negativ).
ntruct ADN-ul este ncrcat negativ, migrarea moleculelor va avea loc de la
polul la polul +. Intensitatea curentului depinde de natura soluiei-tampon, de
tipul i lungimea gelului i de obicei se include n intervalul 100 i 120 V.
Timpul de migrare a ADN-ului (sau ampliconilor) depinde de intensitatea cu-
rentului, de concentraia gelului i de dimensiunile moleculelor supuse separrii.
Separarea se consider terminat atunci cnd albastrul de bronfenol sau xilen ciano-
lul ajunge la marginea opus a gelului. Cuva de electroforez se deconecteaz de la
85
sursa de curent, se scoate capacul, iar gelul se vizualizeaz la transiluminator. Pentru
vizualizarea att a ADN-ului, ct i a ampliconilor se utilizeaz colorani speciali
fuoresceni, care sunt adugai n cantiti mici n gel. Cel mai des, se aplic bromu-
ra.de.etidiu.(EtBr), care se intercaleaz cu bazele azotate ale ADN-ului i permite
detectarea prin fuorescen a fragmentelor (fg. 3.3.). EtBr posed absorbie maxi-
m n spectrul ultraviolet la lungimea de und de 300 i 360 nm. Adiional, el poate
absorbi energia de la nucleotidele excitate de absorbia radiaiei la lungimea de und
de 260 nm. EtBr reemite aceast energie ca lumin galben/ portocalie centrat la
590 nm. Fluorescena EtBr n soluii apoase este semnifcativ mai joas dect n
colorantul intercalat. Utilizarea EtBr permite vizualizarea ADN-ului n concentraie
de 1-5 ng/band electroforetic.
n scopul documentrii fnale a experimentului i posibilitii de consultare a
rezultatelor obinute, se recomand fotograferea gelurilor, utiliznd transiluminarea
cu raze UV, care faciliteaz vizualizarea. Prezena unei benzi distincte (fg. 3.4.)
denot faptul c ADN-ul extras este de calitate bun, iar benzile precedate de urme
sub form de cozi sau comete demonstreaz prezena impuritilor n ADN-ul
extras sau denaturarea acestuia.
Electroforeza ADN se realizeaz concomitent cu un amestec de fragmente de
ADN cu greutatea molecular cunoscut markeri moleculari n raport cu care se
estimeaz dimensiunea fragmentelor de ADN (exprimat n pb) (fg. 3.5.).
Catod
Gel
Plci din sticl
molecule
cu mas mic
Vizualizarea gelului
electroforetic
cu utilizarea EtBr
molecule
cu mas mare
Amestec
de molecule de ADN
de diferite dimensiuni
Sursa
de curent
Anod
Figura 3.3. Principiul separrii electroforetice
www.fg.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/mol_gen.htm
Figura 3.4. electroforeza diferitor fragmente
de ADN (rezultate obinute n cadrul LSB)
ADN genomic
ADN denaturat
amplicon
amplicon
A B
86
3.4. estimarea coninutului de proteine i de ADN
Coninutul n proteine al unui produs biologic se determin prin mai multe
metode: dup coninutul de azot constituent, tehnici foto- i spectrometrice deose-
bindu-se prin sensibilitate i specifcitate.
Dac soluiile de protein sunt pure (nu conin acizi carbonici, fenoli, alcooli,
bicarbonai, care absorb lumina n zona ultraviolet a spectrului), mai simplu, rapid
i cu o precizie mare se determin dup metoda spectrofotometric, ce se bazeaz
pe proprietatea aminoacizilor aromatici de a absorbi lumina cu lungimea de und de
280 nm, ns o atare metod depinde de coninutul acestor aminoacizi n molecula
proteic. Prezena n mediul experimental a fosfailor n concentraie de 5 mM, a
clorurii de natriu 0,9%, a sulfailor 50 mM nu infueneaz rezultatele msurrii.
De asemenea, nivelul de absorbie n ultraviolet depinde puin de pH-ul mediului n
diapazonul pH-ului de 2-10.
Densitatea optic a soluiilor proteice n care solventul este: apa, NaCl 0,1-1M
sau soluia-tampon fosfat de concentraie mic se determin la lungimea de und de
280 nm n comparaie cu proba-martor (solvent fr proteine). Probele se spectro-
fotometreaz i pe baza curbei-etalon (pentru construcia creia se utilizeaz soluie
de protein pur cu concentraia de 0,05-2,0 mg/ml) se determin concentraia de
proteine n soluie.
Densitatea optic

E
1.mg/ml
280 nm
.variaz de la 0,4 pn la 1,5, n funcie de coninutul
triptofanului i al tirozinei.
O alt metod de cuantifcare a proteinelor utilizat pe larg este metoda fo-
tometric dup Bradford, care se bazeaz pe adsorbia specifc n mediu acid a
Figura 3.5. exemple de markeri i de prezentare a rezultatelor obinute
A. Markeri PCR 100 bp Low Ladder, (Sigma) ce conine 10 benzi (100 1000 pb)
B. Exemplu de prezentare a rezultatelor unui screening OMG. M marker ADN
http://www.bioproflelabs.com/WebFlyer.htm
A B
M Proba 1 Proba 2
87
colorantului Coomassie G-250 n urma interaciunilor gruprilor amidice i sulfhi-
drilice ale proteinelor cu colorantul. Ca rezultat al adsorbiei colorantului, soluia
proteic devine de culoare albastr, a crei intensitate este proporional cu concen-
traia proteinei n soluie. Se supune analizei att extractul proteinelor sumare, ct i
cel al fraciilor proteice.
La o alicot de extract proteic, de exemplu, 0,l ml, se adaug 1/2. volume
(0,05 ml) de acid tricloracetic 15% pentru precipitarea complet a proteinelor, care
se efectueaz timp de 15 minute la rece. Soluia cu proteine denaturate se centrifu-
gheaz timp de 10 - 15 min. la 7 000 - 10 000 rot./min. Precipitatul se spal de 3 ori
cu 0,5 ml ATA 5%, centrifugnd de fecare dat. Sedimentul proteic se dizolv n
0,5 ml NaOH 0,3 N. Dup dizolvarea complet a proteinelor, pentru neutralizarea
excesului de baz se adaug 0,5 ml HC1 0,3 N.
Mediul de reacie: 0,06 ml soluie proteic, 0,24 ml NaCl 0,15 N i 3 ml
reactiv Coomassie. Se agit bine i peste 20 minute se colorimetreaz la fotoelec-
trocolorimetru la lungimea de und 595 nm. n calitate de martor servete eprubeta,
n care se introduc 0,06 ml H
2
O distilat, 0,24 ml NaCl de 0,15 N i 3 ml reactiv
Coomassie.
Atunci cnd valorile coefcientului de extincie a soluiei proteice (mediului
de reacie) se ncadreaz n limitele 0,050 - 0,600, concentraia proteinei g/ml n
prob se determin dup formula (, 1996):
=
E
595
V
1
0,060V
2
Unde: C concentraia proteinei n prob (g/ml);
E densitatea optic la =595 nm;
V
1
volumul mediului de reacie, ml;
V
2
volumul probei proteice, ml.
Concentraia proteinelor n probele care nregistreaz densiti optice mai mari
sau mai mici dect cele indicate mai sus se calculeaz reieind din curba-etalon,
construit n prealabil, utiliznd albumina seric bovin.
Pentru prepararea reactivului de colorare, se dizolv 100 mg colorant Cooma-
sie briliant G-250 n 50 ml C
2
H
5
OH (96%), apoi se adaug l00 ml H
3
PO
4
de 95% sau
111,76 ml H
3
PO
4
de 85%. Soluia obinut se completeaz pn la volumul de 1000
ml, se fltreaz i se pstreaz n vase de culoare nchis timp de dou sptmni la
temperatura camerei.
Determinarea coninutului de ADN n probe este o etap esenial n analiza
ulterioar a lui, ntruct concentraiile mici nu vor f sufciente pentru reaciile ulterioa-
re (de exemplu, PCR), iar concentraiile mari vor induce inhibarea acestora.
Concentraia de ADN poate f determinat la fuorometru sau spectrofotometru,
care permit cuantifcarea ADN-ului pn la nivel de nanograme (ng/l).
ADN-ul poate f detectat cantitativ direct n soluiile apoase cu o concentraie
slab de sruri, nregistrnd absorbia (densitatea optic DO) n spectrul ultravio-
let, la lungimea de und de 260 nm. Pentru a calcula cantitatea de ADN n soluie, se
consider c o unitate de densitate optic la 260 nm corespunde pentru:
soluia cu ADN dublu catenar 50 g/ml,
soluia cu ARN sau ADN monocatenar 40 g/ml.
n calculul fnal al cantitii de ADN se ine cont de diluie.
Pentru a evalua nivelul de contaminare a soluiei de ADN cu proteine (proteinele
absorb n lungimea de und 280 nm i 260 nm), aceleai probe se spectrofotometreaz
i la = 260 nm. Se consider c n cazul unei probe de ADN de o calitate bun, rapor-
tul A
260/280
trebuie s fe inclus n limitele 1,8 - 2,0. O contaminare cu fenol se analizea-
z la = 270 nm. Contaminrile condiioneaz o supraestimare a concentraiei reale i
pot inactiva enzimele utilizate n studiul ADN-ului. Soluia de ADN nu trebuie s fe
foarte concentrat, prezint o viscozitate nalt, cauznd erori de volum la pipetare.
Cantitatea ADN-ului poate f estimat indirect cu valori aproximative n baza
gelului electroforetic al ADN-ului utiliznd markeri cantitativi. ns n cazul Real-
time PCR sau RCR-ului semicantitativ este necesar cunoaterea concentraiei
exacte a ADN-ului.
89
3.5. exemple de protocoale

SAMPLING AND DNA exTrACTIoN oF MAIze TC15o7
report from the Validation of the
CTAB/Wizard method for DNA extraction from ground maize grain/seed
Validated method
Method development
and single laboratory validation:
GeneScan Analytics GmbH
Method testing and confrmation:
Joint Research Centre European
Commission, Biotechnology & GMOs Unit
PreLeVAreA ProBeLor I exTrAGereA ADN-ului DIN
PorUMBUL TC15o7
rezUMAT
Scop i aplicare: Metoda CTAB/Wizard pentru izolarea ADN-ului este
potrivit pentru izolarea ADN-ului genomic dintr-un numr mare de varieti i
matrice. ns aceste date snt validate pentru seminele de porumb. Aplicarea acestei
metode la alte matrice necesit optimizare i validare specifc.
Prelevarea probelor de semine de porumb TC1507 se va face n conformitate
cu ghidul tehnic i protocoalele descrise de Commission Recommendation 2004/787/
EC n contextul Regulation (EC) No 1830/2003.
Principiul de baz n izolarea ADN-ului const n obinerea extractului apos
cu o purifcare ulterioar a ADN-ului de inhibitorii reaciei PCR. Metoda CTAB/
Wizard include lizarea celulelor n prezena CTAB, EDTA i proteinazei K urmat
de nlturarea ARN-ului prin digestie cu ARN-aza A i purifcare de contaminani
cu ajutorul cloroformului. Sedimentarea ADN-ului se realizeaz prin precipitare
cu izopropanol. Acest extract este n continuare purifcat utiliznd dou produse
comerciale disponibile: Wizard DNA Clean-Up System (Promega) i gelfltrare
prin coloana S-300 HR MicroSpin Columns (Amersham Pharmacia).
EUROPEAN COMMISSION
DIRECTORATE GENERAL JOINT RESEARCH CENTRE
INSTITUTE FOR HEALTH AND CONSUMER PROTE
SAMPLING AND DNA EXTRACTION OF MAIZE TC15O7
Report from the Validation of the
"CTAB/Wizard" method for DNA extraction from ground maize grain/seed
Validated method
Method development
and single laboratory validation::
Method testing and confirmation:
PRELEVAREA PROBELOR I EXTRAGEREA ADN-ului DIN PORUMBUL TC15O7
REZUMAT
Scop i aplicare: Metoda CTAB/Wizard pentru izolarea ADN-ului este potrivit pentru
izolarea ADN-ului genomic dintr-un numr mare de varieti i matrici. ns aceste date snt validate
pentru seminele de porumb. Aplicarea acestei metode la alte matrice necesit optimizare i validare
specific.
Prelevarea probelor: prelevarea probelor de semine de porumb TC1507 se va face n
conformitate cu ghidul tehnic i protocoalele descrise de Commission Recommendation 2004/787/EC
n contextul Regulation (EC) No 1830/2003.
Principiul de baz n izolarea ADN-ului const n obinerea extractului apos cu o purificare
ulterioar a ADN-ului de inhibitorii reaciei PCR. Metoda CTAB/Wizard include lizarea celulelor n
prezena CTAB, EDTA i proteinazei K urmat de nlturarea ARN-ului prin digestie cu ARN-aza A
i purificare de contaminani cu ajutorul cloroformului. Sedimentarea ADN-ului se realizeaz prin
precipitare cu izopropanol. Acest extract este n continuare purificat utiliznd dou produse comerciale
disponibile: Wizard DNA Clean-Up System (Promega) i gelfiltrare prin coloana S-300 HR
MicroSpin Columns (Amersham Pharmacia).
93
90
DNA exTrACTIoN
exTrAGereA ADN-ului
Metod recomandat de MONSANTO, 2004. EC 1829/2003
www.gmo-crl.jrc.it/detectionmethods/MON-Art47-dnaextraction.pdf.
rezUMAT AL eTAPeLor De IzoLAre I PUrIFICAre A ADN-ului
etape Descrierea etapei i modul de lucru
I. omogenizarea, liza
esuturilor i extragerea
ADN-ului
6 g material vegetal se omogenizeaz cu 25 ml soluie de extragere ce conine:
24,25 ml soluie-tampon CTAB de extragere a ADN-ului (n prealabil nclzit
pn la 55C), 0,5 ml 2-mercaptoetanol (2-ME) i 0,25 ml soluie 10 mg/ml
proteinaza K, pentru ca concentraia fnal a 2-ME s fe 2%, iar a proteinazei
K-100 g/ml. Probele se incubeaz la temperatura de 55C, 60 min., dup
care timp de 10 min. soluia se aduce la temperatura camerei.
II. Deproteinizarea i
purifcarea de pigmeni
i polizaharide
Se realizeaz cu 20 ml amestec de fenol: cloroform: alcool izoamilic (25 : 24 : 1).
Tuburile se inverseaz sau vortexeaz atent.
Se colecteaz faza apoas n urma separrii fazelor prin centrifugare timp
de 10 min., la 13 000 g la temperatura de 20 - 25C. Aceast etap se poate
repeta de dou sau de mai multe ori, n funcie de gradul de contaminare a
ADN-ului.
III. Izolarea ADN-ului
prin sedimentare
La faza apoas se adaug 2/3 volum de izopropanol (rcit), find posibil
pstrarea n aceast form de la 30 min. pn la 3 zile. Se centrifugheaz la
13 000 g 20 min., la temperatura de 4C.
IV. resuspendarea ADN-
ului i eliminarea ArN-
ului
Sedimentul se dizolv n 4 ml tampon TE cu pH-ul 8,0 la care se adaug 40
l ARN-aze 10 mg/ml i se incubeaz la 37C, timp de 30 min.
V. Procedee repetate de
purifcare
Se adaug 4 ml soluie cloroform: alcool izoamilic (24 : 1) i se centrifugheaz
10 min. la 13 000 g la temperatura camerei. Se transfer faza apoas
superioar n alt tub.
Aceast etap se repet, apoi se adaug atent jumtate de volum de acetat de
amoniu 7,5 M i se amestec prin inversare.
VI. Ultima etap de
purifcare a ADN-ului
Se adaug 2 volume de etanol 100%, se inverseaz atent i se menine la
-20C, timp de 30 min. sau se las peste noapte.
Probele se centrifugheaz la 1 300 g timp de 20 min. la 4C pentru a precipita ADN-ul.
Sedimentul se spal de dou ori cu etanol de 70%.
VII. Solubilizarea i
pstrarea ADN-ului
ADN-ul se dizolv n 1 ml soluie-tampon TE pH 8,0 i se incubeaz la 65C
timp de 1 or cu agitare atent. Probele se centrifugheaz la 16 000 g, timp de
10 min. la 4C. Faza apoas se transfer ntr-un nou tub i se pstreaz la 4C.
reagenii necesari:
Soluie-tampon CTAB de extragere (2%): pentru 500 ml (poate f pstrat
la temperatura camerei, 5 ani): 10 g CTAB (1,5% w/v), 50 ml 1M Tris HCl,
pH 8,0 (75 mM), 20 ml 0,05 M EDTA pH 8,0 (100 mM); 140 ml NaCl (5M);
290 ml ap distilat i autoclavat.
Te, pH 8,0, pentru 250 ml (pstrare la temperatura camerei, pn la 5 ani):
2,5 ml 1M Tris HCl (10 mM), 0,5 ml 0,5 M EDTA (1 mM). Se adaug ap
pn la 250 ml, se fltreaz i se sterilizeaz.
etanol 70% (pentru 200 ml): 140 ml etanol 100% cu 60 ml ap.
Proteinaza K (10 mg/ml,) pentru 5 ml: 5 ml ap i 0,05 g proteinaza K.
ArNaze (10 mg/ml), pentru 5 ml: 5 ml ap cu 0,05 g ARNaze, fert 10 min.
91
DNA exTrACTIoN
exTrAGereA ADN-ului
Metod recomandat de JoINT reSeArCH CeNTre, 2004
(Soma M. The analysis of food samples for the presence
of genetically modifed organisms.
Extraction and purifcation of DNA. Session 4, 2004, 18 p.)
etape Descrierea etapei i modul de lucru
I. omogenizarea,
liza esuturilor i
extragerea ADN-ului
ntr-un tub Eppendorf se iau 100 mg material vegetal la care se adaug 300 l
ap steril, deionizat i se agit. Ulterior sunt adugate 500 l soluie-tampon
CTAB de extragere i se omogenizeaz, apoi se adaug 20 l proteinaza K (20
mg/ml), se agit i se incubeaz la 65C, timp de 30-90 min. Ulterior probele
se trateaz cu 20 l ARNazea A (10 mg/ml), se agit i se incubeaz la 65C,
timp de 5-10 min., dup care se centrifugheaz la 16 000 g timp de 10 min.
Supernatantul se transfer ntr-un tub nou.
II. Deproteinizarea
i purifcarea
de pigmeni i
polizaharide
La supernatant se adaug 500 l cloroform i se agit prin inversarea lent
a tuburilor timp de 30 secunde. Apoi se centrifugheaz la 16 000 g, 10 min.,
pentru a separa fazele. Se transfer 500 l faz apoas superioar ntr-un tub
nou, care conine 500 l cloroform, se inverseaz i apoi iari se centrifugheaz
timp de 5 min. la 16 000 g., colectnd faza superioar.
III. Izolarea ADN-
ului prin sedimentare
La faza superioar colectat se adaug 2 volume soluie-tampon CTAB de
precipitare i se amestec prin pipetare, dup care se incubeaz timp de 60
min. la temperatura camerei. Probele sunt supuse centrifugrii timp de 5 min.
la 16 000 g. Supernatantul se arunc.
IV. resuspendarea
ADN-ului i
eliminarea ArN-ului
Precipitatul se dizolv n 350 l NaCl (1,2 M). Se adaug 350 l cloroform i
se agit 30 secunde, dup care se centrifugheaz timp de 10 min. la 10 000 g.
Faza apoas se transfer ntr-un nou tub la care se adaug 0,6 volume de
izopropanol i se agit.
Separarea precipitatului are loc prin centrifugare timp de 10 min. la 16 000 g. Se
nltur supernatantul, iar la precipitat se adaug 500 l etanol 70% i se agit
atent.
Probele sunt supuse din nou centrifugrii timp de 10 min., la 16 000 g.
Supernatantul se arunc.
V. Solubilizarea i
pstrarea ADN-ului
Sedimentul ce conine ADN se dizolv n 100 l ap steril, deionizat. Soluia
de ADN poate f pstrat la - 4C pn la 2 sptmni, iar la temperatura -
20C, un timp mai ndelungat.
reagenii necesari:
Soluie CTAB de extragere:
20 g/l CTAB 4 g
1,4 M NaCl 16,4 g
0,1 M Tris HCl 3,15 g
20 mM Na
2
EDTA 1,5 g
Se adaug 100 ml ap, pH-ul se aduce la 8,0 cu NaOH 1M. Soluia se aduce
la 200 ml i se autoclaveaz.
Soluie CTAB de precipitare:
5 g/l CTAB 1 g
0,04 M NaCl 0,5 g
Se aduce la 100 ml cu ap, se ajusteaz pH la 8,0 cu NaOH 1M i se aduce
la cot pn la 200 ml cu ap. Se autoclaveaz.
92
THe ANALYSIS oF FooD SAMPLeS For THe PreSeNCe
oF GeNeTICALLY MoDIFIeD orGANISMS. AGAroSe GeL
eLeCTroPHoreSIS.
Metod recomandat de Soma i Querci (The analysis of food samples for the presence
of genetically modifed organisms. Agarose Gel Electrophoresis. Session 5, 2004, 18 p.).
TeSTAreA PrezeNeI orGANISMeLor MoDIFICATe GeNeTIC N
ProBe ALIMeNTAre. eLeCTroForezA N GeL De AGAroz
rezUMAT
Electroforeza ADN-ului este ultima etap n efectuarea screening-ului PMG. Ea
servete pentru determinarea puritii ADN-ului extras i electroforeza produselor
de amplifcare PCR (ampliconilor).
etapele de preparare a gelului:
1. Prepararea gelului cu concentraia 0,8 - 2,0% (0,8 - 1% ADN genomic,
2% ampliconi). Tamponul pentru gel se prepar din TBE stoc de 10X
pn la concentraia fnal de 0,5X. n funcie de concentraia gelului,
se cntrete cantitatea respectiv de agaroz omogenizat cu volumul
necesar de tampon 0,5X.
2. Amestecul se ferbe (3 ori) i se agit 3 min. Se rcete pn la temperatura
40 - 50C i se adaug 2 - 4l EtBr cu concentraia de 10 mg/ml. Amestecul
se agit lent, timp de 1 - 3 min.
3. Gelul se toarn n camera de electroforez, n prealabil asamblat i uscat.
Grosimea gelului este de 3 - 5 mm. Polimerizarea depinde de temperatur i
dureaz 30 - 60 min.
4. Pieptenele se scoate, deasupra gelului adugndu-se ap sau tampon de
migrare, ca s nu sa se deterioreze godeurile.
5. Gelul este plasat n camera de electroforez, la care se adaug tampon de
migrare 0,5X TBE.
6. Pentru electroforez se iau 10 l prob cu ADN-genomic (3 l ap, 2 l de soluie
de diluare a probei 6X (loading buffer) i 5 l ADN), iar n cazul ampliconilor
2 l SDP 6X i 8 l prob PCR i se aplic n buzunraele gelului.
7. Se recomand tensiunea de 5 - 10 V/cm.
reagenii necesari:
Soluia-tampon stoc 10x TBe (1000 ml): Tris(hidroximetil)-aminometan
(Tris) 54,0 g; acid boric 27,5 g; Na
2
EDTA 7,44 g. Dup dizolvarea complet se
aduce la 1000 ml (pH= 8,3).
Soluia-tampon pentru probe 6x (loading buffer) (10 ml): xilen cianol
FF (0,025 g) i sucros (4 g).
EUROPEAN COMMISSION
Validated method
Method development
REZUMAT
specific.
93
eUroPeAN CoMMISSIoN
JoINT reSeArCH CeNTre
World Health organization
Capitolul
4.1. Genele-marker i raportoare utilizate n
selecia PMG
4.2. Biotestul fenotipic al PMG
CAPITOLUL 4
DETECIA PMG LA
NIVEL DE EXPRESIE
FENOTIPIC A
TRANSGENELOR
ASPECTE DIN ACTIVITATEA LABORATORULUI
97
DETECIA PMG LA NIVEL
DE EXPRESIE FENOTIPIC
A TRANSGENELOR
4.1. Genele-marker i raportoare utilizate n
selecia PMG
ASPeCTe DIN ACTIVITATeA LABorATorULUI
SECURITATE BIOLOGIC
4
94
Capitolul 4. DeTeCIA PMG LA NIVeL De exPreSIe
FeNoTIPIC A TrANSGeNeLor
Efciena transformrii genetice, indiferent de metoda de transfer utilizat, este
extrem de redus. Doar o parte dintre celule pot integra n genomul su genele stri-
ne, iar dintre acestea doar celulele totipotente regenereaz o nou plant transgenic.
Reieind din aceste considerente, la fecare etap a procesului de modifcare genetic
sunt necesare sisteme efciente de selecie, bazate pe gene-marker i gene raportoare.
4.1. Genele-marker i raportoare utilizate n selecia PMG
Selecia celulelor transformate reprezint o component esenial a unui proto-
col de transformare, genele de interes find cointegrate, n construciile genetice,
cu genele-marker. n unele cazuri, genele-marker reprezint n acelai timp i gene
de interes (de exemplu, genele de rezisten la erbicide). Frecvena de cotransfer al
ambelor tipuri de gene este de 100% n cazul nlnuirii acestora i de 50%, n cazul
transferului n vectori separai. Ca i genele de interes, genele-marker sunt puse sub
controlul promotorilor constitutivi: 35S CaMV, P-nos, P-FMV etc. (fg. 4.1.).
Figura 4.1. Harta liniar a regiunii ADN-T din constructul genetic PV-BNGT04
utilizat n obinerea rapiei modifcate genetic GT73 tolerant la erbicidul glifosat
conferit de dou gene-marker, CP4 EPSPS i goxv247.
(US-Patent-N: 6 248 876) http://www.bats.ch/bats/en/index.php
Genele-marker pentru selecia transgenelor sunt genele de rezisten la an-
tibiotice sau erbicide, care permit creterea i dezvoltarea celulelor transformate.
Printre cele mai utilizate gene-marker se numr:
gena npt.II sau.neo izolat din transpozonul Tn5 de la E..coli.K12. Aceast
gen codifc neomicinfosfotransferaza II, enzim implicat n neutralizarea unor
antibiotice aminoglucozidice ca neomicina i kanamicina. Pentru selecia PMG se
recomand concentraia de 100 mg/l kanamicin;.
gena spt.izolat de la transpozonul Tn5 (Genbank: L19385) codifc streptomi-
cin-fosfotransferaza i ofer rezisten la streptomicin la concentraia de 1 mg/ml;
gena npt sau hph. (Genbank: VO1499), care codifc enzima higromicin-
fosfotransferaza, izolat de la bacteria E..coli i ofer rezisten la antibioticul ami-
noglicozidic higromicina B.la concentraia 50 mg/l;
Promotor:
RB P-FM V P-FM V C TP2 C P43PSPS CTP1 gox247 T-39 T-39 LB
Gen:
Terminator:
95
Fosfnotricin-acetiltransferaza codifcat de gena bar ofer rezisten la bi-
alafos (fosfnotricin sau PPT) (Genbank: A02804). Concentraia recomandat este
de 50 mg/l PPT.
gena epsps. codifc. enzima enolpiruvilikimat-3-fosfatintaza (EPSPS), ce
confer rezisten la glifosat. Rezistena plantelor la acest erbicid este conferit i de
gena aroA, care codifc o alt enzim EPSPS (Genbank: X63374). Selecia in.vitro a
celulelor are loc la concentraia de 0,5 mM glifosat.
Tabelul 4.1.
Principalele gene-marker folosite n selecia PMG
Agentul de
selecie
Gena-marker Markerul de selecie
kanamicin nptII (APH3II) neomicinfosfotransferaza II
gentamicin aacC3, aacC4 gentamicin-3-N-acetiltransferaza
higromicin hph, hpt (APH4) higromicinfosfotransferaza
metotrexat dhfr dihidrofolatreductaza
spectinomicin aadA aminoglicozid-3-adeniltransferaza
blasticidin bsr blasticidin S deaminaza
sulfonamid sul dihidropteratsintaza
fosfnotricin bar fosfnotricinacetiltransferaza
clorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetaz
bromoxinil bxn bromoxinilnitrilaza
glifosat gox glifosatoxidaza
2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza
ampicilin bla - lactamaza
Genele raportoare sunt gene care codifc proteine/ enzime detectabile n ce-
lule sau extracte celulare, utilizate ca markeri pentru vizualizarea expresiei spaiale
a genelor la un spectru larg de procariote i eucariote.
n calitate de gene raportoare se utilizeaz:
gena gus (uidA), care codifc enzima -glucuronidaza, izolat de la E..coli.
K12. Conform datelor lui Jefferson R. A. i col. (1987), activitatea enzimei, afat
sub controlul promotorului 35S CaMV, este mai activ n esuturile btrne compa-
rativ cu cele tinere. Reaciile catalizate de enzima GUS sunt:
1. 4-metilumbeliferil--D-glucuronida (4-MUG) 4-metilumbeliferon
(4-MU) + acid glucuronic
2. acid 5-brom-4-clor-3-indolil--glucuronic (X-gluc) + ap acid
uronic + 5-bromo-4-cloroindolil (5-bromo-4-cloro)indigo
gena luc, care codifc enzima luciferaza i scindeaz luciferina ca substrat,
rezultnd bioluminescen, care poate f cuantifcat. Gena luc.a fost izolat de la
o specie de licurici (Photinus pyralis) din America de Nord, find exprimat i n
plante. Enzima are masa molecular de 61 kDa i reprezint un monomer. Reaciile
de apariie a luminescenei, n urma oxidrii luciferinei n prezena ATP, ionilor de
calciu i enzimei luciferaza, au loc n dou etape:
96
1. luciferin + ATP luciferiladenilat + PP
i
2. luciferiladenilat + O
2
oxiluciferin + AMP + lumin
gena gfp pentru proteina cu fuorescen verde (Green Fluorescent Protein
GFP) este izolat de la meduza Aequarea victoria. Se evideniaz n esuturi intacte
in.vitro i in.vivo.n lipsa oricrui substrat datorit prezenei unui cromofor fuores-
cent, care emite luminescen verde n urma excitrii la lumina albastr sau UV (ma-
ximum de adsorbie la = 395 nm). Poate f fuzionat cu alte proteine, permind
monitorizarea transportului i metabolismului acestora. ns gena gfp, ca i gena luc,
nu se conine n PMG aprobate pentru agricultura biotehnologic, find utilizate doar
pentru atestarea transgenezei organismelor utilizate n cercetrile fundamentale.
Pentru viitor, se pune problema eliminrii complete a genelor-marker, care confer
rezisten la antibiotice i erbicide. Eventualele consecine negative ale utilizrii acestora
asupra sntii omului i proteciei mediului ambiant, precum i riscul inseriei lor n
genomul bacteriilor patogene au stimulat dezvoltarea unor strategii noi de selecie, baza-
te pe procese metabolice celulare endogene selecia pozitiv (tab. 4.2.).
Cel mai frecvent utilizat sistem de selecie pozitiv la cereale include gena-
marker, care codifc enzima fosfomanoz-izomeraza (man A sau pmi) i manoza
n calitate de factor de selecie. Celule transformate genetic posed abilitatea de a
izomeriza manoza-6-fosfat n fructozo-6-fosfat, care poate f imediat ncorporat n
cile metabolice, n timp ce cele non-transgenice acumuleaz niveluri citotoxice ale
manoza-6-fosfat, inducndu-se astfel ncetinirea creterii i n fnal moartea celule-
lor (Reed i al., 1999; Brinch-Pedersen i al., 1999).
Tabelul 4.2.
Genele-marker utilizate pentru selecia pozitiv a oMG
(Barcelo i al., 2001; Aragao i al., 2002)
Agentul de selecie Gena enzima codifcat reacia/ mecanismul de
rezisten
Manoza manA (pmi) fosfomanoz-izomeraza
Manozo-6-fosfatfructozo-
6-fosfat
Xiloza xylA xilozoizomeraza
Xiloza utilizat ca surs de
C i H
Lizina i treonina lysC aspartatkinaza
Permite supravieuirea ce-
lulelor MG datorit sintezei
metioninei
lec
Intensifcarea proceselor de
embriogenez somatic i
regenerare
Citochinine sintetizate
din izopentinil AMP
ca precursor al
acestora
ipt izopentiniltransferaza IPTizopentinilAMP
- DOG
R
1
Deoxiglucozo-6-
fosfatfosfataza (2-DOG-6-P)
DOG
R
1 ofer rezisten la
2-deoxiglucoz
97
Tabelul 4.2.
Genelemrker utilizate pentru selecia pozitiv a OMG
(Barcelo i al., 2001; Aragao i al., 2002)
Agentul de selecie Gena Enzima codificat Reacia/ mecanismul de rezisten
Manoza manA (pmi) fosfomanoz-
izomeraza
Manozo-6-fosfatfructozo-6-fosfat
Xiloza xylA xilozoizomeraza Xiloza utilizat ca surs de C i H
Lizina i treonina lysC aspartatkinaza Permite supravieuirea celulelor MG
datorit sintezei metioninei
lec Intensificarea proceselor de
embriogenez somatic i regenerare
Citochinine sintetizate
din isopentinil AMP ca
precursor al acestora
ipt isopentiniltransferaza IPTisopentinilAMP
- DOG
R
1 Deoxiglucozo-6-
fosfatfosfataza (2-
DOG-6-P)
DOG
R
1 ofer rezisten la 2-
deoxiglucoz
Pentru a evita transferul genelor de rezisten la antibiotice, a fost elaborat sistemul Cre-Lox,
care reprezint o recombinare situs-specific (Du Pont, 1980), ce permite eliminarea genelor-marker
dup obinerea PMG la aciunea unor stimuli specifici (fig. 4.2.). Mecanismul acestui proces const n
clivarea situsurilor lox P, de ctre enzima Cre, care flancheaz ADN-ul int, de exemplu gena-
marker. Acest sistem este inclus n linia de porumb LY 038, ce conine gena nptII, naintat pentru
aprobare de UE.
ADN-int
(gena marker)
Situsul
lox P
Situsul
lox P
ADN-int
(gena-marker)
Figura 4.2. Mecanismul Cre/Lox de eliminare a genei-marker din genom
(http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/CreLoxP.html)
101
Pentru a evita transferul genelor de rezisten la antibiotice, a fost elaborat
sistemul Cre-Lox, care reprezint o recombinare situs-specifc (Du Pont, 1980),
ce permite eliminarea genelor-marker dup obinerea PMG la aciunea unor stimuli
specifci (fg. 4.2.). Mecanismul acestui proces const n clivarea situsurilor lox P,
de ctre enzima Cre, care fancheaz ADN-ul-int, de exemplu gena-marker. Acest
sistem este inclus n linia de porumb LY 038, ce conine gena nptII, naintat pentru
aprobare de UE.
Prezena unor transgene introduse n genomul plantei poate f atestat la diferite
faze de dezvoltare prin utilizarea biotestelor aplicate att n condiii in vitro, ct i in.vivo..
Vizualizarea fenotipic a expresiei genelor-marker, care confer rezisten fa de erbici-
de (de exemplu, Basta, Roundup) sau antibiotice (kanamicina, neomicina etc.), precum
i a celor raportoare, prin monitorizarea produselor reaciei enzimatice cu substratul spe-
cifc (testul GUS i GFP), reprezint metode preliminare de screening al PMG.
Testul aplicat plantelor cultivate in.vitro se bazeaz pe creterea i dezvoltarea
materialului vegetal modifcat genetic (semine, explante de frunze, calus etc.) pe
medii nutritive universale sau speciale, suplimentate cu factorul de selecie (erbicid,
antibiotic etc.). n calitate de criteriu de apreciere a prezenei transgenelor servesc
plantele dezvoltate normal, datorit toleranei fa de agentul de selecie.
Aplicarea testului de expresie fenotipic a alogenelor, la care se poate apela cu
uurin n lipsa unui echipament i a reagenilor speciali sau n cazul n care acti-
vitatea alogenei se manifest la o anumit etap de dezvoltare, reprezint selectarea
plantelor cultivate.in.vivo tratate exogen cu factorul de selecie prin stropire foliar.
n acest caz, plantele susceptibile vor manifesta simptome de cloroz sau necroz.
Spre exemplu, prezena genei marker nptII este confrmat prin imersarea frunzelor
n soluii cu kanamicin, vizualiznd procesul de depigmentare a frunzelor. Pentru
selectarea seminelor transgenice se recomand germinarea lor n prezena concen-
traiei 100 mg/l kanamicin, analiza rezultatelor find efectuat dup 1-2 zile, n
baza numrului de semine germinate ale PMG fa de control.
Figura 4.2. Mecanismul Cre/Lox de eliminare a genei-marker din genom
http://www.bio.davidson.edu/COURSES/genomics/method/CreLoxP.html
98
Testele bazate pe germinarea seminelor sunt utilizate i pentru testarea i iden-
tifcarea soiei rezistente la glifosat Roundup Ready. Se recomand de germinat se-
minele timp de 16 ore la temperatura de 25C, pe un substrat cu concentraia de
0-1,5% erbicid sau timp de o or, la temperatura de 30C, pe un substrat cu con-
centraia de 0-0,48% erbicid. n calitate de indici de evaluare servesc: facultatea de
germinare, dimensiunile hipocotilului, rdcinii i ale plantei ntregi (fg. 4.3.).
Figura 4.3. Biotestul seminelor de soia rr efectuat n diferite
intervale de timp (3 i 6 zile) (Tillmann i al., 2004)
O metod fenotipic de detectare a PMG, larg rspndit n transgenez, o
reprezint identifcarea histochimic a genei gus, bazat pe evidenierea produsului
de reacie (compus albastru, stabil, bine pronunat), obinut n urma activitii enzi-
mei -glucuronidaza n prezena unui substrat cromogen acidul 5-brom-4-clor-3-
indolil--glucuronic sau X-gluc.(fg. 4.4. i fg. 4.5.).
Prezena unor transgene introduse n genomul plantei poate fi atestat la diferite faze de
dezvoltare prin utilizarea biotestelor aplicate att n condiii in vitro, ct i in vivo. Vizualizarea
fenotipic a expresiei genelor-marker, care confer rezisten fa de erbicide (de exemplu, Basta,
Roundup) sau antibiotice (kanamicina, neomicina etc.), precum i a celor raportoare, prin
monitorizarea produselor reaciei enzimatice cu substratul specific (testul GUS i GFP), reprezint
metode preliminare de screening al PMG.
Testul aplicat plantelor cultivate in vitro se bazeaz pe creterea i pe dezvoltarea materialului
vegetal modificat genetic (semine, explante de frunze, calus etc.) pe medii nutritive universale sau
speciale suplimentate cu factorul de selecie (erbicid, antibiotic etc.). n calitate de criteriu de apreciere
a prezenei transgenelor servesc plantele dezvoltate normal datorit toleranei fa de agentul de
selecie.
Aplicarea testului de expresie fenotipic a alogenelor, la care se poate apela cu uurin n lipsa
unui echipament i a reagenilor speciali sau n cazul n care activitatea alogenei se manifest la o
anumit etap de dezvoltare, reprezint selectarea plantelor cultivate in vivo tratate exogen cu factorul
de selecie prin stropire foliar. n acest caz, plantele susceptibile vor manifesta simptome de cloroz
sau necroz. Spre exemplu, prezena genei marker nptII este confirmat prin imersarea frunzelor n
soluii cu kanamicin, vizualiznd procesul de depigmentare a frunzelor. Pentru selectarea seminelor
transgenice se recomand germinarea lor n prezena concentraiei 100 mg/l kanamicin, analiza
rezultatelor fiind efectuat dup 1-2 zile, n baza numrului de semine germinate ale PMG fa de
control.
Testele bazate pe germinarea seminelor sunt utilizate i pentru testarea i identificarea soiei
rezistente la glifosat Roundup Ready. Se recomand de germinat seminele timp de 16 ore la
temperatura de 25C, pe un substrat cu concentraia de 0-1,5% erbicid sau timp de o or, la
temperatura de 30C, pe un substrat cu concentraia de 0-0,48% erbicid. n calitate de indici de
evaluare servesc: facultatea de germinare, dimensiunile hipocotilului, rdcinii i ale plantei ntregi
(fig. 4.3.).
102
Figura 4.3. Biotestul seminelor de soia RR efectuat n diferite intervale de timp (3 i 6 zile)
(Tillmann i al., 2004)
3 zile 6 zile
O metod fenotipic de detectare a PMG, larg rspndit n transgenez, o reprezint
identificarea histochimic a genei gus, bazat pe evidenierea produsului de reacie (compus albastru,
stabil, bine pronunat), obinut n urma activitii enzimei -glucuronidaza n prezena unui substrat
cromogen acidul 5-brom-4-clor-3-indolil--glucuronic sau X-gluc (fig. 4.4. i fig. 4.5.).
Figura 4.4. Detectarea histochimic a expresiei
genei gus n diferite esuturi i organe ale
tutunului
Activitatea enzimatic este localizat n meristemele
vegetative i reproductive active, a-d) la bazele florale i e)
n ramurile vegetative emergente. (http://deposit.ddb.de/cgi-
bin/dokserv?idn=965410145&do)
Figura 4.5. Testul GUS la plantele
transgenice de Arabidopsis thaliana
A. semine germinate, B. inflorescen, C.
silicv, D. frunz, E. trihom, F. celulele
stomatice.
De asemenea, monitorizarea produselor de reacie se bazeaz i pe identificarea transgenei
green fluorescent protein (GFP), care pentru prima dat a fost aplicat n practic la nematoda
Caenorhabditis elegans pentru studiul expresiei genelor in vivo (Tsien, 1998). Includerea i expresia
genei gfp s-a realizat la conifere, citrui, Arabidopsis, tutun, gru, porumb i sfecla de zahr. Aceste
proteine globulare compacte (se cunosc circa 20 tipuri de GFP cu masa molecular aproximativ de 27
kDa) servesc drept markeri fluoresceni (fig. 4.6.) ai expresiei genelor n celulele intacte, n
organismele animale, vegetale i n bacterii (, 2003).
103
O metod fenotipic de detectare a PMG, larg rspndit n transgenez, o reprezint
identificarea histochimic a genei gus, bazat pe evidenierea produsului de reacie (compus albastru,
stabil, bine pronunat), obinut n urma activitii enzimei -glucuronidaza n prezena unui substrat
cromogen acidul 5-brom-4-clor-3-indolil--glucuronic sau X-gluc (fig. 4.4. i fig. 4.5.).
Figura 4.4. Detectarea histochimic a expresiei
genei gus n diferite esuturi i organe ale
tutunului
vegetative i reproductive active, a-d) la bazele florale i e)
n ramurile vegetative emergente. (http://deposit.ddb.de/cgi-
bin/dokserv?idn=965410145&do)
A. semine germinate, B. inflorescen, C.
silicv, D. frunz, E. trihom, F. celulele
stomatice.
De asemenea, monitorizarea produselor de reacie se bazeaz i pe identificarea transgenei
green fluorescent protein (GFP), care pentru prima dat a fost aplicat n practic la nematoda
Caenorhabditis elegans pentru studiul expresiei genelor in vivo (Tsien, 1998). Includerea i expresia
genei gfp s-a realizat la conifere, citrui, Arabidopsis, tutun, gru, porumb i sfecla de zahr. Aceste
proteine globulare compacte (se cunosc circa 20 tipuri de GFP cu masa molecular aproximativ de 27
kDa) servesc drept markeri fluoresceni (fig. 4.6.) ai expresiei genelor n celulele intacte, n
organismele animale, vegetale i n bacterii (, 2003).
103
Figura 4.4. Detectarea histochimic a
expresiei genei gus n diferite esuturi
i organe ale tutunului
vegetative i reproductive active, a-d) la bazele fo-
rale i e) n ramurile vegetative emergente
A. semine germinate, B. inforescen,
C. silicv, D. frunz, E. trihom, F. celulele
stomatice
Prezena unor transgene introduse n genomul plantei poate fi atestat la diferite faze de
dezvoltare prin utilizarea biotestelor aplicate att n condiii in vitro, ct i in vivo. Vizualizarea
fenotipic a expresiei genelor-marker, care confer rezisten fa de erbicide (de exemplu, Basta,
Roundup) sau antibiotice (kanamicina, neomicina etc.), precum i a celor raportoare, prin
monitorizarea produselor reaciei enzimatice cu substratul specific (testul GUS i GFP), reprezint
metode preliminare de screening al PMG.
Testul aplicat plantelor cultivate in vitro se bazeaz pe creterea i pe dezvoltarea materialului
vegetal modificat genetic (semine, explante de frunze, calus etc.) pe medii nutritive universale sau
speciale suplimentate cu factorul de selecie (erbicid, antibiotic etc.). n calitate de criteriu de apreciere
a prezenei transgenelor servesc plantele dezvoltate normal datorit toleranei fa de agentul de
selecie.
Aplicarea testului de expresie fenotipic a alogenelor, la care se poate apela cu uurin n lipsa
unui echipament i a reagenilor speciali sau n cazul n care activitatea alogenei se manifest la o
anumit etap de dezvoltare, reprezint selectarea plantelor cultivate in vivo tratate exogen cu factorul
de selecie prin stropire foliar. n acest caz, plantele susceptibile vor manifesta simptome de cloroz
sau necroz. Spre exemplu, prezena genei marker nptII este confirmat prin imersarea frunzelor n
soluii cu kanamicin, vizualiznd procesul de depigmentare a frunzelor. Pentru selectarea seminelor
transgenice se recomand germinarea lor n prezena concentraiei 100 mg/l kanamicin, analiza
rezultatelor fiind efectuat dup 1-2 zile, n baza numrului de semine germinate ale PMG fa de
control.
Testele bazate pe germinarea seminelor sunt utilizate i pentru testarea i identificarea soiei
rezistente la glifosat Roundup Ready. Se recomand de germinat seminele timp de 16 ore la
temperatura de 25C, pe un substrat cu concentraia de 0-1,5% erbicid sau timp de o or, la
temperatura de 30C, pe un substrat cu concentraia de 0-0,48% erbicid. n calitate de indici de
evaluare servesc: facultatea de germinare, dimensiunile hipocotilului, rdcinii i ale plantei ntregi
(fig. 4.3.).
102
Figura 4.3. Biotestul seminelor de soia RR efectuat n diferite intervale de timp (3 i 6 zile)
(Tillmann i al., 2004)
3 zile 6 zile
99
203
148
205
222
:
R
OH
N
N
H
H
H
H
O
O
O
R
R
H
H
N
N
O O
65
67
R
R
O
O
R
66
De asemenea, monitorizarea produselor de reacie se bazeaz i pe identifcarea
transgenei green fuorescent protein (GFP), care pentru prima dat a fost aplicat
n practic la nematoda Caenorhabditis elegans pentru studiul expresiei genelor in.
vivo.(Tsien, 1998). Includerea i expresia genei gfp s-a realizat la conifere, citrui,
Arabidopsis, tutun, gru, porumb i sfecla de zahr. Aceste proteine globulare com-
pacte (se cunosc circa 20 tipuri de GFP cu masa molecular aproximativ de 27
kDa) servesc drept markeri fuoresceni (fg. 4.6.) ai expresiei genelor n celulele
intacte, n organismele animale, vegetale i bacteriene (, 2003).
Identifcarea GFP se bazeaz pe prezena unui cromofor fuorescent (fg. 4.7.),
format ca rezultat al modifcrii prin ciclizarea a trei aminoacizi (Ser-Tyr-Gly) din
poziiile 65 - 67 ale polipeptidului nativ, care emite luminescen verde (maximum
de absorbie la 509 nm) n urma excitrii la lumina albastr sau UV cu maximum de
absorbie la 395 nm (fg. 4.8.).
Normal Cu GFP
Identificarea GFP se bazeaz pe prezena unui cromofor fluorescent (fig. 4.7.), format ca
rezultat al modificrii prin ciclizarea a trei aminoacizi (Ser-Tyr-Gly) din poziiile 65-67 ale
polipeptidului nativ, care emite luminescen verde (maximum de absorbie la 509 nm) n urma
excitrii la lumina albastr sau UV cu maximum de adsorbie la 395 nm (fig. 4.8.).
G
e
n
e

r
e
s
p
o
n
s
a
b
i
l
e
d
e

s
i
n
t
e
z
a

d
i
f
e
r
i
t
o
r

p
r
o
t
e
i
n
e i
e

s
d
Gena
GFP
inserat
Stop
codoni
Protein
Protein cu GFP
G
e
n
e

r
e
s
p
o
n
s
a
b
i
l
e
n
t
e
z
a
d
i
f
e
r
i
t
o
r

p
r
o
t
e
i
n
e

Stop
codoni
Figura 4.6. Inserarea genei GFP i vizualizarea expresiei acestei gene
(http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm)
Figura 4.7. Structura cromoforului la GFP
(Tsien, 1998)
104
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
Normal Cu GFP
Identificarea GFP se bazeaz pe prezena unui cromofor fluorescent (fig. 4.7.), format ca
rezultat al modificrii prin ciclizarea a trei aminoacizi (Ser-Tyr-Gly) din poziiile 65-67 ale
polipeptidului nativ, care emite luminescen verde (maximum de absorbie la 509 nm) n urma
excitrii la lumina albastr sau UV cu maximum de adsorbie la 395 nm (fig. 4.8.).
G
e
n
e

r
e
s
p
o
n
s
a
b
i
l
e
d
e

s
i
n
t
e
z
a

d
i
f
e
r
i
t
o
r

p
r
o
t
e
i
n
e i
e

s
d
Gena
GFP
inserat
Stop
codoni
Protein
Protein cu GFP
G
e
n
e

r
e
s
p
o
n
s
a
b
i
l
e
n
t
e
z
a
d
i
f
e
r
i
t
o
r

p
r
o
t
e
i
n
e

Stop
codoni
(http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm)
(Tsien, 1998)
104
(Tsien, 1998)
100
Astfel, utilizarea testelor de selecie bazate pe evidenierea unui marker.gene-
tic, respectiv a unei proprieti de care este responsabil gena strin n planta-gaz-
d, prezint una din primele etape n detecia PMG, care permite stabilirea prezenei
caracterelor ce confer toleran la erbicide.
Figura 4.8. Detectarea in vivo a proteinei GFP la
A. thaliana (A) i N. tabaccum (B)
sgeile indic prezna GFP
B A
A
Astfel, utilizarea testelor de selecie bazate pe evidenierea unui marker genetic, respectiv a
unei proprieti de care este responsabil gena strin n planta-gazd, prezint una din primele etape
n detecia PMG, care permite stabilirea prezenei caracterelor ce confer toleran la erbicide.
105
Figura 4.8. Detectarea in vivo a proteinei GFP
la diferite organisme (sgeata indic prezena GFP)
C D
E F
101
GUS GeNe ASSAY IN TrANSForMeD TISSUeS
TeSTUL GUS APLICAT eSUTUrILOR TrANSForMATe GeNeTIC
Metod recomandat de Dr. Paul J. Bottino, 2001
http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html
Analiza calitativ
Principiul metodei const n identifcarea produselor de expresie a genei GUS
(uidA) printr-un test histochimic. Enzima -glucuronidaza codifcat de gena uidA
utilizeaz ca substrat acidul 5-bromo-4-cloro-3-indolil--glucuronic (X-GLUC), cu
formarea compusului (5-bromo-4-cloro) indigo de culoare albastr intens i stabil
n ap i n muli dizolvani.
rezUMAT AL eTAPeLor TeSTULUI CALITATIV GUS
I. Prepararea probei Pentru analiz sunt luate 1-2 frunze, tiate n seciuni mici, care se
incubeaz n 0,5 ml X-GLUC (5 mg X-GLUC dizolvat n 1,0 ml
dimetil-formamid, ajustat cu 50 mM NaPO
4
pH 7,0 pn la volumul
10 ml), timp de 1 or sau 24 de ore, la temperatura de 37C.
II. Splarea probei Splarea seciunilor cu etanol de 70% timp de cel puin 5 minute,
iar n cazul esuturilor lipsite de clorofl sunt necesare 4 ore.
III. evaluarea
rezultatului
Identifcarea produselor de reacie ale transgenei se efectueaz prin
prezena culorii albastre, care poate f vizualizat cu ochiul liber sau
la microscop.
GUS GENE ASSAY IN TRANSFORMED TISSUES
TESTUL GUS APLICAT ESUTURILOR TRANSFORMATE GENETIC
(http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html)
Analiza calitativ
Principiul metodei const n identificarea produselor de expresie a genei GUS (uidA) printr-un
test histochimic. Enzima -glucuronidaza codificat de gena uidA utilizeaz ca substrat acidul 5-
bromo-4-cloro-3-indolil--glucuronic (X-GLUC), cu formarea compusului (5-bromo-4-cloro) indigo
de culoare albastr intens i stabil n ap i n muli dizolvani.
REZUMAT AL ETAPELOR TESTULUI CALITATIV GUS
Etapa Descrierea etapei
I. Prepararea probei
Pentru analiz sunt luate 1-2 frunze, tiate n seciuni mici, care se incubeaz
n 0,5 ml X-GLUC (5 mg X-GLUC dizolvat n 1,0 ml dimetil-formamid,
ajustat cu 50 mM NaPO
4
pH 7,0 pn la volumul 10 ml), timp de 1 or sau 24
de ore, la temperatura de 37C.
II. Splarea probei Splarea seciunilor cu etanol de 70% timp de 5 minute cel puin, iar n cazul
esuturilor lipsite de clorofilsunt necesare 4 ore.
III. Evaluarea rezultatului Identificarea produselor de reacie ale transgenei se efectueaz prin prezena
culorii albastre care poate fi vizualizat cu ochiul liber sau la microscop.
Test pozitiv
Test negativ
Evaluarea rezultatelor testului GUS
106
GUS GeNe ASSAY IN TrANSForMeD TISSUeS
TeSTUL GUS APLICAT eSUTUrILOR TrANSForMATe GeNeTIC
http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html
http://arabi4.agr.hokudai.ac.jp/ArabiE/protocols/general/transgen/leafgus.html
Analiza cantitativ (Fluorimetric assay)
Principiul metodei const n cuantifcarea fuorometric la = 360 nm a com-
pusului fuorescent 4-metilumbeliferon (4-MU) rezultat n urma reaciei enzimatice
dintre GUS i substratul 4-metilumbeliferil--D-glucuronida (MUG).
rezUMAT AL eTAPeLor TeSTULUI CANTITATIV GUS
I. Prepararea
probei
Se omogenizeaz 100 mg esut vegetal n 100 l soluie de extragere (50
mM NaPO
4
, pH 7,0; 10 mM ditiotreitol (DTT); 1 mM Na
2
EDTA; 0,1%
Sodium Lauryl Sarcosine, 0,1% Triton X 100) n tuburil Eppendorf, care
se supun centrifugrii timp de 5 min. la 4C la 15 000 rot./min.
II. Incubarea Se incubeaz cu 0,5 ml 1mM MUG la 37C.
III. omogenizarea Se adaug 50 l extract la 0,5 ml 1mM MUG i se omogenizeaz bine. La
intervale de 30 min. - 1 or se divizeaz n alicote a cte 100 l, n tuburi
Eppendorf, care conin 0,9 ml Na
2
CO
3
0,2 M.
VI. evaluarea
rezultatelor
Se msoar fuorescena probelor la fuorimetru i se determin cantitatea
n nmol a 4-MU. Datele obinute se exprim n nmol 4-MU/mg protein/
min.).
Capitolul
ASPECTE DIN ACTIVITATEA LABORATORULUI
5.1. Analiza proteinelor prin metoda
ELISA
5.2. Analiza proteinelor prin testul Lateral
Flow Stiks
CAPITOLUL 5
ANALIZA MODIFICRILOR
GENETICE LA NIVEL DE
PROTEINE
GFP 27
kDa
Electrophoregrama proteinelor diferitor genotipuri. M-
marker, 1-Arabidopsis, 2-tomato MG, 3-tomato Fakel, 4-Tobacco
TM-2. 5-Tobacco Doina211, 6-Tobacco TM-1
M 1 2 3 4 5 6 kDa
200
150
120
100
95
70
60
50
40
30
25
20
15
10
Detectarea PMG prin metoda Detectarea PMG prin metoda
SDS SDS- -PAAGE PAAGE
SDS-PAAGE
Metode bazate
pe analiza proteinelor
ELISA
Implementarea metodei validate de alternativ ELISA va permite identificarea prezenei
modificrii genetice att la nivel calitativ, ct i cantitativ n produsele alimentare, ceea ce
nu permite urmtoarea metod....
108
ANALIZA MODIFICRILOR
GENETICE LA NIVEL
DE PROTEINE
5.1. Analiza proteinelor prin metoda ELISA
5.2. Analiza proteinelor prin testul Lateral
Flow Sticks
SECURITATE BIOLOGIC
5
104
Capitolul 5. ANALIzA MoDIFICrILor GeNeTICe
LA NIVeL De ProTeINe
Procesele de obinere a PMG includ introducerea transgenelor a cror activitate
se manifest prin codifcarea proteinelor specifce sintetizate de. novo.. Detectarea
acestora prin diverse sisteme analitice cantitative i calitative constituie o cale de
identifcare a plantelor modifcate genetic.
5.1. Analiza proteinelor prin metoda eLISA
Tehnologiile imunologice, bazate pe utilizarea anticorpilor, au devenit metode
indispensabile n monitorizarea proteinelor sintetizate de transgene. Cel mai des
utilizat este metoda bazat pe folosirea anticorpilor care recunosc proteinele spe-
cifce, formnd complexul antigen-anticorp, care poate f vizualizat prin adugarea
unui anticorp secundar sau marcat.
Testul de marcare enzimatic (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
(metoda ELISA) este unul de alternativ PCR (vezi cap. 6.) i permite identifcarea
proteinelor (enzimelor) codifcate de transgene, cum ar f, de exemplu, neomicin-
fosfotransgeraza (nptII), EPSPS, proteinele Bt, enzima PAT etc.
Metoda ELISA are ca principiu utilizarea unui marker enzimatic legat de un an-
ticorp, antigen sau hapten (substan care reacioneaz cu anticorpii, dar nu induce
sinteza de anticorpi adic nu determin un rspuns imun). Prezena markerului enzi-
matic permite detectarea reaciei antigen-anticorp. Deci antigenele sau anticorpii sunt
cuplai covalent cu o enzim (n locul radioizotopului sau fuorocromului). Cuplarea
markerului enzimatic cu antigenele sau cu anticorpii se face cu ajutorul unor molecule
Tabelul 5.1.
Substratele enzimatice utilizate n testu ELISA
Substratul primar
Soluia tampon/
Substratul secundar
Reagentul
de stopare a
reaciei
Solubilitatea
produsului
format
Culoarea
produsului
format
Lungimea
de und
pentru
cuantificare
Fosfataza alcalin
p-Nitrofenil fosfat
(pNPP)
Na
2
CO
3
, pH 9.8
cu MgCl
2
NaOH, 2M Solubil Galben 405 nm
Bromocloroindolil
fosfat-nitro albastu
Tetrazoliu (BCIP/NBT)
NaCl, MgCl
2
,
Dietanolamin
EDTA Insolubil Negru
Peroxidaza
3,3',5,5'-Tetrametil-
benzidin (TMB)
30% Peroxid de hidrogen
(H
2
O
2
)
Acid sulfuric
1 M (H
2
SO
4
)
Solubil Galben 450 nm
o-Fenil-Diamin
(OPD)
Soluie-tampon citrat-
fosfat, 0,02% H
2
O
2
Acid sulfuric
(H
2
SO
4
)
Solubil
Portocaliu-
cafeniu
492 nm
2,2'-azinodietil-
benztiazolin sulfonat
(ABTS)
Soluie-tampon citrat-
fosfat, 30% H
2
O
2
20% SDS /
50% DMF
Solubil Verde
410 nm,
650 nm
Clornaftol 30% H
2
O
2
PBS Insolubil
Albastru-
negru
3-Amino-9-etilcarbazol
(AEC)
30% H
2
O
2
PBS Insolubil Rou
S
S
S
A B
C D
Anticorp Antigen Enzim legat cu anticorp S Substrat
Figura 5.1. Prezentare schematic a principiului ELISA
A Anticorpii specifici antigenelor se ataeaz de suprafaa solid;
B Adugarea probei n care se pot conine sau pot lipsi antigenele;
C Adugarea enzimelor legate de anticorpi i conjugarea lor;
D Adugarea substratului cromogenic. n prezena enzimei se formeaz produi de reacie cu culoare
modificat, care poate fi msurat spectrofotometric.
110
Figura 5.1. Prezentare schematic a principiului testului eLISA
A Anticorpii specifci antigenelor se ataeaz de suprafaa solid;
B Adugarea probei n care se pot conine sau pot lipsi antigenele;
C Adugarea enzimelor legate de anticorpi i conjugarea lor;
D Adugarea substratului cromogenic. n prezena enzimei se formeaz produi de
reacie cu culoare modifcat, care poate f msurat spectrofotometric.
105
bifuncionale care leag cei doi compui (fg. 5.1.). Evidenierea reaciei antigen-an-
ticorp se realizeaz prin degradarea unui substrat specifc (marker enzimatic), urmat
de o modifcare de culoare, msurat spectrofotometric. De exemplu, paranitrofenil
fosfatul (galben) se utilizeaz pentru fosfataza alcalin; 3,3,5,5-tetrametil-benzidina
(galben) sau 3-Amino-9-etilcarbazolul (rou) pentru peroxidaza (tab. 5.1.).
Anticorpii proteine strine, utilizai n astfel de analize, sunt obinui n
cantiti sufciente prin sintez n celulele organismului-gazd (iepuri, oareci etc.)
drept rezultat al injectrii substanei ce urmeaz a f detectat (de exemplu, proteina
CP4 EPSPS, care confer rezisten la erbicidul Roundup). Ulterior, anticorpii sunt
purifcai i utilizai ca reageni n detectarea substanelor respective.
Tabelul 5.1.
Substratele enzimatice utilizate n testul eLISA
Substratul
primar
Soluia-
tampon/
Substratul
secundar
reagentul
de stopare a
reaciei
Solubilitatea
produsului
format
Culoarea
produsului
format
Lungimea
de und
pentru
cuantifcare
Fosfataza alcalin
p-Nitrofenil fosfat
(pNPP)
Na
2
CO
3
, pH 9,8
cu MgCl
2
NaOH, 2M Solubil Galben 405 nm
Bromocloroindolil
fosfat-nitro albastu
Tetrazoliu (BCIP/
NBT)
NaCl, MgCl
2
,
Dietanolamin
EDTA Insolubil Negru
Peroxidaza
3,3,5,5-
Tetrametil-
benzidin (TMB)
30% Peroxid de
hidrogen
(H
2
O
2
)
Acid sulfuric
1 M (H
2
SO
4
)
Solubil Galben 450 nm
o-Fenil-Diamin
(OPD)
Soluie-tampon
citrat-fosfat,
0,02% H
2
O
2
Acid sulfuric Solubil Portocaliu-
cafeniu
492 nm
2,2-azinodietil-
benztiazolin
sulfonat (ABTS)
Soluie-tampon
citrat-fosfat,
30% H
2
O
2
20% SDS /
50% DMF
Solubil Verde 410 nm,
650 nm
Clornaftol 30% H
2
O
2
PBS Insolubil Albastru-
negru
3-Amino-9-
etilcarbazol (AEC)
30% H
2
O
2
PBS Insolubil Rou
Diaminobenzidin
(DAB)
30% H
2
O
2
PBS Insolubil Cafeniu
106
Actualmente, exist mai multe tipuri ale acestei metodologii, i anume proce-
deul Sandwich ELISA i ELISA competitiv.
Metoda sandwich ELISA. O varietate a tehnicii imunoenzimatice este pro-
cedeul ELISA cu utilizarea a doi anticorpi (sandwich ELISA) (fg. 5.2.), find
unul dintre cel mai des utilizat n analiza transgenelor. Acest procedeu este rapid i
simplu n efectuare. Dac antigena standard purifcat este competent, atunci teh-
nologia permite i determinarea cantitativ a antigenului n proba cercetat. Testul
dat necesit doi anticorpi, unul numit anticorp de captare i altul de detectare.
Denumirea sandwich a acestei variante de ELISA provine de la complexul format
dintre cei doi anticorpi ntre care se af legat antigena. Produsele formate sunt
cuantifcate prin msurarea cantitii de anticorpi secundari legai de matrice, utili-
znd substrate colorimetrice.
Avantajele majore ale acestei tehnologii constau n specifcitatea nalt i n
simplifcarea etapelor de analiz, iar antigena nu necesit a f purifcat n prealabil
nainte de utilizare. Dezavantajul metodei este c nu toi anticorpii pot f utilizai.
Combinrile anticorpilor monoclonali trebuie s fe similare unei perechi compati-
bile, ceea ce nseamn c ei pot recunoate separat locurile specifce de legare cu
antigena.
Sensibilitatea testului sandwich ELISA depinde de patru factori, i anume:
1. Numrul de molecule de anticorpi de captare, care sunt legai de faza solid.
2. Reactivitatea primului anticorp fa de antigen.
3. Reactivitatea celui de al doilea anticorp fa de antigen.
4. Activitatea specifc a anticorpului de detectare.
Plac impregnat
cu anticorpi
Adugarea
antigenelor care necesit
a f cuantifcate
Msurarea DO
Adugarea
enzimei conjugate cu
anticorpul secundar
Adugarea
substratului
Msurarea intensitii
colorantului
Figura 5.2. etapele principale ale metodei sandwich eLISA
http://images.google.md/imgres?imgurl=http://www.chemicon.com/
images/ant101/A2ELIS
107
Metoda ELISA competitiv. n cazul n care o pereche de anticorpi nu sunt
potrivii pentru scopul propus, exist o alt varietate a tehnologiei imunoenzimatice,
i anume testul ELISA tip competitiv (fg. 5.3.). Pentru utilizarea acestui tip de ELI-
SA, este necesar ca un reagent s fe conjugat cu enzima de detecie. Enzima poate
f linkat cu alt imunogen sau anticorp primar.
Informaii privind diverse aspecte referitoare la metodele ELISA de testare
a PMG sunt accesibile pe site-ul http://biotech.jrc.it/home/ict/methodsdatabase.
htm#Database, care include urmtoarele secii:
1. General Data conine informaii generale despre PMG.
2. ELISA Methods Data include informaia despre metod, tipul de analiz
necesar pentru efectuarea testrii, descrierea proteinelor i anticorpilor.
3. Validation Data referin la articole sau raportul de validare.
Limita de detecie n cazul metodei ELISA variaz ntre 0,1 - 5,0% din coninu-
tul total de proteine solubile. Cel mai des, testul ELISA este utilizat n detecia soiei
RR, care conine proteina CP4-EPSPS, metod implementat n 38 laboratoare ale
UE i Elveiei, i a porumbului Mon 810, ce conine proteina Cry1(AB), implemen-
tat n 20 laboratoare din 20 de state.
Actualmente, diferite companii comercializeaz kit-uri pentru testul ELISA
n scopul detectrii proteinelor specifce din produsele agricole. Frecvent utilizate
sunt kit-urile destinate identifcrii unor proteine precum Bt, Cry1Ac, Cry1C, Cr-
y3A, Cry2A, Cry9C, CP4 EPSPS i PAT.
Figura 5.3. etapele principale ale metodei eLISA competitiv
http://images.google.md/imgres?imgurl=http://www.chemicon.com/
images/ant101/A2ELISA
Plac impregnat
cu anticorpi
Incubarea anticorpilor
cu antigene care
necesit a f cuantifcate
Adugarea enzimei
conjugate cu antigenul
Adugarea
substratului
Msurarea
intensitii colorantului
Msurarea DO
108
5.2. Analiza proteinelor prin testul Lateral Flow Sticks
Testul Lateral Flow Sticks reprezint o metod calitativ i semicantitativ
de determinare a proteinelor strine (de exemplu, CP4-EPSPS). Utilizarea acestei
analize permite cuantifcarea pn la 0,15% PMG n lotul analizat, la un nivel de
ncredere de 99%.
Metoda dat poate f utilizat pentru detectarea PMG, folosind ca material de
cercetare frunze, semine sau boabe. Panglicile din hrtie sau plastic servesc drept
suport pentru captarea anticorpului i reprezint locul de reacie. Principiul meto-
dei const n reacia de culoare obinut la interaciunea dintre complexul proteina
strin - anticorp i reagenii specifci de colorare. Apariia a dou benzi de culoa-
re roiatic denot prezena proteinei cutate (test pozitiv), iar depistarea doar a unei
benzi (linia de control) denot lipsa acesteia (test negativ) (fg. 5.4.).
Actualmente diferite companii comercializeaz kit-uri pentru testul ELISA n scopul detectrii
proteinelor specifice din produsele agricole. Frecvent utilizate sunt kit-urile destinate identificrii a
unor de proteine precum Bt, Cry1Ac, Cry1C, Cry3A, Cry2A, Cry9C, CP4 EPSPS i PAT.
5.2. Analiza proteinelor prin metoda Lateral Flow Sticks
Testul Lateral Flow Sticks reprezint o metod calitativ i semicantitativ de determinare a
proteinelor strine (de exemplu, CP4-EPSPS). Utilizarea acestei analize permite cuantificarea pn
la 0,15% PMG n lotul analizat, la un nivel de ncredere de 99%.
Metod dat poate fi utilizat pentru detectarea PMG folosind ca material de cercetare frunze,
semine sau boabe. Panglicile din hrtie sau plastic servesc drept suport pentru captarea anticorpului i
reprezint locul de reacie. Principiul metodei const n reacia de culoare obinut la interaciunea
dintre complexul proteina strin - anticorp i reagenii specifici de colorare. Apariia a dou benzi
de culoare roiatic denot prezena proteinei cutate (test pozitiv), iar depistarea doar a unei benzi
(linia de control) denot lipsa acesteia (test negativ) (fig. 5.4.).
1
2
Test pozitiv Test negativ
Figura 5.4. Rezultatul schematic al testrii prin
metoda Lateral Flow Sticks
1 linia de control.
2 linia ce denot prezena proteinei cutate.
114
Figura 5.4. rezultatul schematic al testrii prin
metoda Lateral Flow Sticks
1 linia de control.
2 linia ce denot prezena proteinei cutate.
109
VALIDATIoN oF IMMUNoASSAY For DeTeCTIoN AND
QUANTIFICATIoN oF GeNeTICALLY MoDIFIeD SoYBeAN IN FooD
AND FooD FrACTIoNS USING
IDeNTIFICAreA SoIeI TrANSGeNICe PrIN MeToDA ELISA
Metod propus de ctre Lipp, Anklam i Stave
(Reference Materials. Journal of AOAC International, 2000, 83, p. 919-927)
i descris de eyquem (The analisis of food samples for the presence of
genetically modifed organisms, Session 12, Quantitative detection of Roundup
Ready
Soybean by ELISA, 21 p.).

Principiul metodei const n detectarea imunoenzimatic a proteinei CP4-
EPSPS, care se af la linia de soia Roundup Ready
. Aceast metod permite de-

tectarea proteinelor n limitele 0,05 - 5% (w/w) n produsele alimentare, care conin
soia transgenic, procesate la temperatura nu mai mare de 65C i nu mai mult de 60
min. Pentru testare se utilizeaz kit-ul (GMO food ingredient testing soia kit users
guide strategic diagnostics, Inc. Rev., 052099, Vers. 1.8.), destinat analizei imuno-
enzimatice a mediului de incubare n limitele de temperatur 15 - 30 C.
Extragerea proteinelor se realizeaz din 0,5 g material n 4,5 ml tampon de
extracie, urmat de agitare timp de 10 secunde i de centrifugare la 5 000 rot./min.,
timp de 15 min. Colectarea supernatantului se efectueaz la temperatura de 2 - 8C.
Diluarea probelor se face n raport de 1 : 300 sau 1 : 10.
Procedura ELISA include urmtoarele etape:
probele, materialul de referin standard i soluia-tampon se adaug n go-
deurile plcii de efectuare a reaciei (volum 100 l);
incubarea probelor timp de 1 or, la 37C;
splarea de trei ori cu soluie-tampon;
prepararea i distribuia anticorpilor conjugai n fecare godeu al plcii des-
tinat testrii (volum 100 l);
incubarea probelor timp de 1 or, la 37C;
splarea de trei ori cu soluie-tampon;
distribuirea soluiei de colorare n fecare godeu (volum 100 l);
incubarea probelor timp de 10 min. la temperatura camerei;
distribuirea soluiei de stopare (stop solution) n fecare godeu (volum 100 l);
msurarea absorbiei probelor din plcile imunoenzimatice la = 450 nm.
EUROPEAN COMMISSION
DIRECTORATE GENERAL JRC
JOINT RESEARCH CENTRE
INSTITUTE FOR HEALTH AND CONSUMER PROTEC
EUROPEAN COMMISSION
Validated method
Method development
REZUMAT
specific.
93
110
PrC-eLISA For THe CAMV-35S ProMoTer AS A SCreeNING MeTHoD For
GeNeTICALLY MoDIFIeD roUNDUP reADY SoYBeANS
SCreeNING-UL oMG PrIN MeToDA PCr-eLISA DUP ProMoTorUL 35S CaMV
Metod recomandat de Brunnert, Spender i Borrchers (PCR-ELISA for the
CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modifed Roundup
Ready soybeans. Eur Food Res Technol, 213, 2001, p. 366-371).
Principiul metodei const n hibridizarea specifc a produsului de amplifcare
PCR biotinilat cu probe dioxogenilate, colorimetrate prin imunodetectare prin metoda
ELISA. Metoda permite detectarea la 0,1 ng ampliconi timp de 2 ore.
Izolarea ADN-ului se recomand de efectuat dup metoda standard CTAB sau
Wizard. Secvena primerilor 35S CaMV este accesibil n baza de date Geen Bank
(V00141) i publicaia respectiv (Brunnert, Spender i Borrchers, 2001). Primerul
35S3-Bio conine la captul 5 biotin. Produsul de amplifcare este 191 pb n cazul
combinaiei primerilor 35S3-Bio/35S2 i 136 pb n cazul combinaiei primerilor
35S3-Bio/35S4-Dig. Limita de cuantifcare este cuprins ntre 0,1-2%.
Mixul de reacie (volum fnal 25 l)
Reagentul Concentraia
AmpliTaq gold DNA polimeraza 0,5 u
tampon 10X 1X
MgCl
2
1,5 mM
dNTP 0,5 M
primer 0,4 M
ADN 1 l
Programul PCR
Etapele PCR Condiiile
1. Denaturare 95C/10 min.
2.
30-35
cicluri
Denaturare 95C/30 sec.
Extincie 55C/30 sec.
Elongare 72C/60 sec.
3. Elongare fnal 72C/5 min.
Produsele de amplifcare sunt separate n gel de agaroz de 1%, ce conine bromur
de etidiu. Produsele de amplifcare PCR sunt supuse procedeului Southern.blot i ELISA.
Pe parcursul procedurii PCR-ELISA, produsele biotinilate PCR sunt legate la streptevidina
ataat la suprafaa plcii de microtitrare. Dup hibridarea probei 35S4-Dig i imunodetec-
iei ulterioare prin metoda ELISA cu enzima conjugat anti-Dig-Fab-fragment, convertirea
p-nitrofenilfosfatului n p-nitrofenol rezult n semnal-ELISA la = 405 nm, care este
proporional cu cantitatea produselor PCR imobilizate.
111
TrAIT rUr LATerAL FLoW TeST USer GUIDe
TeSTAreA PMG DUP MeToDA LATerAL FLoW STICKS
Metod recomandat de Strategic Diagnostics Inc., 2002
www.sdix.com/PDF/Products/
/7000026%20User%20Guide%20TraitChk%20Bt1%205min%20LeafSeed%20100
T%20v1.0.pdf
Principiul metodei const n cupla-
rea anticorpilor specifci pentru proteina
transgenic CP4-EPSPS cu reagentul co-
lorat de la unul din capetele panglicii des-
tinate testului Lateral Flow Sticks. Cnd
fia este imersat ntr-o cantitate mic de
extract al PMG ce conine proteina respecti-
v, anticorpii sunt legai de colorant. Fi-
ile conin dou zone de captare, una pentru
proteinele codifcate de transgena respec-
tiv, alta pentru manifestarea colorantului
specifc. Prezena unei singure linii (linia
de control) pe membran indic testul ne-
gativ, iar prezena a dou benzi testul
pozitiv.
Prima etap a procedeului Lateral Flow Sticks este prepararea probei. Se-
minele de soia au greuti diferite (0,076 - 0,293 g). Se recomand efectuarea urmto-
rului calcul: se aleg 100 semine, care se cntresc pe cntarul cu precizia de 0,01 g i
se af media masei acestora. Se clasifc seminele dup greutate. De exemplu, 100
semine au masa de 1500 g, respectiv media va f de 0,15 g. Se nmulete cifra 0,15
cu numrul de semine din fecare grup.
Clasifcarea
Numrul de semine de soia 60 125 250 700
Greutatea 9,00 18,75 37,50 105,0
Tabelul de mai jos conine informaia privind volumul de ap adugat i timpul
necesar pentru mojararea materialului.
Numrul de semine Volumul de ap (ml) Timpul de mojarare (sec.)
60 70 10
125 70 10
250 140 20
700 350 30
1000 700 30
Se iau 0,5 ml extract din prob i se transfer ntr-un tub de 1,5 ml n care se plasea-
z un capt al fiei i se menine 5 minute. Apariia a dou linii indic testul pozitiv.

112
DoUBLe ANTIBoDY SANDWICH eLISA ProCeDUre (DAS-eLISA)
ProCeDUrA DoUBLe ANTIBoDY SANDWICH eLISA (DAS-eLISA)
Metod recomandat de GreenPeace
www.greenpeace.org/raw/content/espana/reports/que-cantidad-de-toxina-bt-pro.pdf
Principiul metodei const n determinarea cantitativ a proteinei Bt (Cry1Ab)
n porumbul MG MON810 prin metoda DAS-ELISA.
etapele de analiz includ:
Prepararea probelor. Frunzele de porumb se congeleaz la temperatura
de -20C pentru pstrare. Pentru analiz se iau 200 mg esut vegetal omogenizat cu
3 ml soluie-tampon de extragere PBST (www.agida.com, SUA). Ulterior, 1,75 ml
omogenat se toarn n tubul de reacie cu volumul de 2 ml, se centrifugheaz timp
de 10 minute la 12 mii rot./min. Supernatantul obinut, utilizat pentru analizele ulte-
rioare, este transferat n alt tub, de 1,5 ml.
Testul eLISA. La 15,5 l IgG nediluat se adaug la 25 ml tampon (50 mmol/l
carbonat, NaN
3
3 mmol/l, pH 9,6), amestecat bine. Apoi, 220 l soluie IgG i solu-
ie-tampon se pipeteaz n godeurile plcii de imunoprecipitare, find acoperite apoi
cu paraflm i incubate la 30C, pentru 4,5 ore. Dup aceasta, soluia-tampon este
transferat ntr-un alt vas destinat colectrii, placa find splat de dou ori cu ap
deionizat i apoi uscat.
Prepararea cubei de calibrare i probelor. 100 mg/ml protein standard
Cry1Ab este diluat n concentraii diferite (0,1-0,00001 g/ml). 200 l omogenat
i concentraiile de referin se adaug n godeurile plcii, acoperite apoi cu paraflm
i incubate la temperatura de 10C, timp de 16 ore.
Dup incubare, omogenatele cu proba se toarn n vase de colectare, godeurile
cltite cu ap deionizat utiliznd pipeta multicanal (fr a rmne picturi de ap).
Prepararea soluiei de conjugare (SDC) i splarea: SDC are urmtoarea
componen: 0,05 g albumin seric bovin, 0,5 g polivinilpirolidon (PVP), 0,005 g
MgCl
2
, 12,5 l Tween 20, 25 ml PBS (fosfat 10 mmol/l, NaCl 137 mmol/l, KCl 2,7
mmol/l, NaN
3
3 mmol/l, pH 7,4) i 16,5 l AP-marcat cu Ig.
200 l SDC se pipeteaz n fecare godeu, ulterior placa este acoperit cu pa-
raflm i incubat la 30C, 5,5 ore. Dup incubare, soluia este aruncat n vasul de
colectare, placa splat de 7 ori cu soluie PBST cu ajutorul pipetei multicanal. Se
recomand ca soluia PBST s stea n godeu 1 minut, dup care soluia este nltu-
rat (fr a rmne picturi de ap).
Adugarea soluiei-substrat preparat conform reetei: 25 mg 4-nitrofenil-
fosfat diluate n 25 ml soluie (DEA 1 mol/l, NaN
3
3 mmol, pH 9,8) i amestecate
3 minute. Fiecare godeu al plcii este umplut cu 200 l soluie substrat cu ajutorul
pipetei multicanal.
evaluarea rezultatelor. Dup colorarea soluiei, plcile sunt supuse analizei
la Microplate reader computer, pentru a msura densitatea optic i a determina
concentraia proteinei Bt.
Capitolul
IDENTIFICAREA OMG LA NIVEL
DE ADN ANALIZA CALITATIV
6.1. Analiza PCR
6.2. Screening-ul general al PMG
SECURITATE BIOLOGIC
6
LABorATorUL De
TeSTAre A oMG
114
Capitolul 6. IDeNTIFICAreA oMG LA NIVeL De ADN
ANALIzA CALITATIV
n detecia i identifcarea modifcrilor genetice se utilizeaz n mod prepon-
derent metode de analiz bazate pe reacia de polimerizare n lan (PCR). Metodele
date se caracterizeaz prin sensibilitate i efcien nalt.
6.1. Analiza PCr
reacia de polimerizare n lan (Polimerase Chain reaction PCR) a fost
elaborat n 1983 de ctre K. Mullis i reprezint o metod de replicare in.vitro a
unei regiuni de ADN cu o secven nucleotidic cunoscut pentru ataarea primeri-
lor n prezena ADN-polimerazei, care folosete una dintre catene ca matrice pentru
sinteza catenei complementare noi.
Iniial, molecula de ADN este denaturat prin majorarea temperaturii, apoi are
loc rcirea pn la temperatura de aliniere a primerilor la regiunile-int, iar polime-
raza asambleaz nucleotidele (dNTP) conform principiului de complementaritate
(fg. 6.1.). Astfel, n urma PCR, dintr-o molecul de ADN se pot obine milioane de
copii de fragmente specifce numite ampliconi.
Reacia PCR se realizeaz ntr-un aparat special numit amplifcator sau ter-
mocicler, n condiii de sterilitate maxim a ncperii n care se lucreaz. Soluia de
reacie (mixul) conine un complex de componente:
1. ADN-int. Cantitatea de ADN utilizat n calitate de matrice depinde de
mrimea genomului analizat (0,1 - 1 g/50 l mediu de reacie). Surplusul
de ADN poate inhiba reacia.
2. ADN-polimeraza (cel mai des se utilizeaz. Taq-polimeraza,. izolat de la
bacteria Thermus aquaticus) enzime termostabile, active la temperaturi
Capitolul 6. IDENTIFICAREA PMG LA NIVEL DE ADN ANALIZA
CALITATIV
n detecia i identificarea modificrilor genetice se utilizeaz n mod preponderent metode de
analiz bazate pe reacia de polimerizare n lan (PCR). Metodele date se caracterizeaz prin
sensibilitate i eficien nalt.
6.1. Analiza PCR
Reacia de polimerizare n lan (Polimerase Chain Reaction - PCR) a fost elaborat n 1983
de ctre K. Mullis i reprezint o metod de replicare in vitro a unei regiuni de ADN cu o secven
nucleotidic cunoscut pentru ataarea primerilor n prezena ADN-polimerazei, care folosete una
dintre catene ca matri pentru sinteza catelei complementare noi.
Iniial, molecula de ADN este denaturat prin majorarea temperaturii, apoi are loc rcirea pn la
temperatura de aliniere a primerilor la regiunile-int, iar polimeraza asambleaz nucleotidele (dNTP)
conform principiului de complementaritate (fig. 6.1.). Astfel, n urma PCR, dintr-o molecul de ADN
se pot obine milioane de copii de fragmente specifice numite ampliconi.
Figura 6.1. Schema general a reaciei PCR
1 molecul de ADN
Primer sens
Primer antisens
dNTP
dNTP
Reacia PCR se realizeaz ntr-un aparat special numit amplificator sau termocicler, n condiii
de sterilitate maxim a ncperii n care se lucreaz. Soluia de reacie (mixul) conine un complex de
componente:
119
Figura 6.1. Schema general a reaciei PCr
115
de 75 - 85C (rezistente la 95C). Pentru o reacie se utilizeaz ntre 0,5 - 2,5
uniti enzimatice.
3. Soluia-tampon pentru enzima ADN-polimeraza. Parametrii acestui
mediu depind de tipul de enzim utilizat. Soluia-stoc se comercializeaz n
concentraia de 10X i conine KCl sau MgCl
2
i Tris HCl cu pH-ul optimal
pentru activitatea enzimei (circa 8,3).. Ionii de Mg
2+
stimuleaz activitatea
enzimei, ns excesul lor (concentraia de 10 mM inhib enzima cu 40 - 50%)
poate scdea specifcitatea enzimei. Se recomand concentraia de 1,5 - 5,0
mM ioni Mg
2+
.
4. dNTP reprezint cele patru tipuri de dezoxiribonucleotide (ATP, GTP,
CTP, TTP) necesare n cantiti egale pentru sinteza ampliconilor ADN.
Concentraia recomandat este de 20-200 M (0,2 mM). Dac numrul
de cicluri este mai mare, atunci concentraia poate f majorat pn la 500
M.
5. Apa se utilizeaz pentru ajustarea volumului reaciei pn la 10 - 100 l. Se
recomand de utilizat ap bidistilat, autoclavat i trecut prin fltre speciale
(milipor). Pregtirea mediului are loc n tuburi sterile de tip Eppendorf.
6. Primerii (tab. 6.1.) sunt secvene scurte de ADN monocatenar (8 - 25
baze), complementare cu regiuni specifce ale ADN-ului, care necesit a f
replicate. Primerii sens i antisens trebuie s posede temperaturi de topire
cu valori apropiate i o succesiune a nucleotidelor terminale care s evite
alinierea lor reciproc. Pentru 30 de cicluri de amplifcare este sufcient o
cantitate de 1 M primer.
Design-ul primerilor reprezint un aspect crucial n succesul PCR i se realizea-
z cu utilizarea programelor software (Meyer, 1995), conform anumitor criterii:
specifcitatea maxim a primerilor;
lungimea primerilor nu trebuie s depeasc 18-30 nucleotide;
evitarea primerilor bogai n G i C, repetitivi sau secvene autocomplemen-
tare;
selectarea primerilor cu temperatura nalt de aliniere;
evitarea utilizrii primerilor - dimeri.
Procesul de replicare sau amplifcare decurge conform unui program cu para-
metri strict determinai (fg. 6.2.):
1. Ciclul I. Denaturarea iniial a ADN-ului, care decurge la temperatura de
95C timp de 1 - 5 minute. n aceast etap catenele de ADN se despiralizeaz.
2. Ciclul II include trei pai:
Denaturarea are loc la temperatura de 95C i dureaz de la 30 secunde pn
la 2 minute (dac raportul G/C este prea mare, atunci denaturarea decurge pe
parcursul a 3 - 4 minute).
Alinierea dureaz de la 30 secunde pn la 2 minute, iar temperatura de aliniere
(Ta) depinde de temperatura de topire a primerilor (Tm).
116
Tabelul 6.1.
Lista celor mai utilizai primeri n testarea PMG
i mrimea produselor de amplifcare (ampliconilor)
(CORESTA, Baza de date JRC)
http://www.biotech.jrc.it/home/ict/methodsdatabase.htm#Database
Nr.
d/o Denumirea primerului
Mrimea
amplico-
nului
Succesiunea nucleotidic a primerului
1.
35S CaMV 195 pb
5-GCTCCTACAAATGCCATCA-3
5-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3
2.
35S CaMV 123 pb
5-CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3
5-TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC-3
3.
35S.CaMV 207 pb
5-CCTACAAATGCCATCATTGCG-3
5-GGGTCTTGCGAAGGATAGTG-3
4.
35S CaMV 227 pb
5-AAGGGTCTTGCGAAGGATAG-3
5AGTGGAAAAGGAAGGTGGCT-3
5.
35S CaMV 195 pb
5-GCTCCTACAAATGCCATCA-3
5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3
6.
NOS-terminator 180 pb
5 GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3
5 TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3
7.
NOS-terminator 118 bp
5GCATGACGTTATTTATGAGATGGG-3
5GACACCGCGCGCGATAATTTATCC-3
8. Higromicin fosfotransferaza
(hph )
839 pb
5 CGC CGA TGG TTT CTA CAA-3
5 GGC GTC GGT TTC CAC TAT-3
9.
Higromicinfosfo-transferasa 839 pb
5-CGCCGATGGTTTCTACAA-3
5-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3
10.
CryIA (b) 211 pb
5-CTCTCGCCGTTCATGTCCGT-3
5-GGTCAGGCTCAGGCTGATGT-3
11.
Regiunea 5 de fuzionare a
genomului porumbului i 35S
CaMV promotor
170 pb
5-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG-3
5-TCCATCTTTGGGACCACTGTCG-3
12.
Fosfnotricin N-
acetiltransferaza (PAT) i 35S
CaMV terminator
209 pb
T25-F7 5-ATGGTGGATGGCATGATGTTG-3
T25-R3 5-TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC-3
13. Neomicinfosfotransfe-
raza (nptII )
173 pb
5 GGA TCT CCT GTC ATC T-3
5 GAT CAT CCT GAT CGA C-3
14.
nptII 215 pb
5-CTCACCTTGCTCCTCCGAGA-3
5-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3
15.
nptII 173 pb
5-GGATCTCCTGTCATCT-3
5-GATCATCCTGATCGAC-3
16. Poligalacturonaza (PG) i
NOS-terminator
350 pb
5-GGATCCTTAGAAGCATCTAGT-3
5-CATCGCAAGACCGGCAACAG-3
17. Poligalacturonaza i NOS-
terminator
351 pb
5-GGATCCTTAGAAGCATCTAGT-3
5-CATCGCAAGACCGGCAACAG-3
La aceast etap primerii sunt ataai la catena de ADN-matrice. De obicei, n
majoritatea cazurilor Ta este de 55 - 65C. Dac Ta va f mai mare dect cea
recomandat, atunci amplifcarea nu va avea loc, iar n cazul n care ea va f mai
mic, vor aprea ampliconi nespecifci. Se recomand ca Ta s fe cu 1 - 5C
mai mic dect Tm. Valorile Tm se calculeaz dup formula:
Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
117
Extincia (elongarea) reprezint sinteza catenelor complementare de ctre
ADN-polimeraza. De obicei, aceast reacie decurge la temperatura de 72 -
75C. Timpul de elongare depinde de lungimea fragmentului amplifcat, find
de circa 1 min. Enzima are o vitez de asamblare de 2 - 4 kb/min.
Numrul de repetri variaz ntre 25 - 40 i depinde de concentraia soluiei de amplifcare.
3. Ciclul III. Extincia fnal dureaz 5 - 15 min., la temperatura de 72 - 75C. Dac
n ADN predomin A i T, temperatura recomandat este de 60C.
n urma efecturii reaciei PCR se obin ampliconi, a cror mrime depinde
de distana la care s-au aliniat cei doi primeri i se exprim n perechi de baze (pb).
Ampliconii pot f pstrai la 4C, iar timpul de pstrare trebuie redus la minim.
Pentru confrmarea reaciei PCR, se utilizeaz dou tipuri de teste:.
testul pozitiv; i
testul-negativ.
n calitate de test pozitiv se comercializeaz diverse kit-uri cum ar f GMO Ge-
nomic DNA Standard Set, care includ ADN-ul de la porumbul transgenic GA21,
CBH-351 i NK-603. Fiecare prob conine 250 ng de ADN, ce nsumeaz diverse
elemente transgenice: 35S CaMV promotor (NK-603 i CBH-351) i NOS-termi-
nator. n calitate de test.pozitiv poate f utilizat i ADN-ul extras din linii de plante
transgenice sau vectori de transformare, utilizai n obinerea PMG, cum este, de
exemplu, pCambia 3300, care conine gena bar (fg. 6.3.).
Figura 6.2. Prezentare schematic a reaciei de polimerizare n lan
(http://images.google.com/imgres?imgurl=http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif&imgrefurl
=http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html&h=627&w=597&sz=47&hl=en&start=1&um=1&tbni
d=5Wjb1wdcRwx97M:&tbnh=136&tbnw=129&prev=/images%3Fq%3DPCR%2Bprinciple%26svnum%3
D10%26um%3D1%26hl%3Den)
30 40 cicluri
Pasul I: Denaturarea
Pasul II: Alinierea
Pasul III: Extensia
1 minut, 94C
45 secunde, 54C
Primeri sens
i antisens
2 minute, 72C
n calitate de test pozitiv se comercializeaz diverse kit-uri cum ar fi GMO Genomic DNA
Standard Set, care includ ADN-ul de la porumbul transgenic GA21, CBH-351 i NK-603. Fiecare
prob conine 250 ng de ADN, ce nsumeaz diverse elemente transgenice: 35S CaMV promotor (NK-
603 i CBH-351) i NOS-terminator. n calitate de test pozitiv poate fi utilizat i ADN-ul extras din
linii de plante transgenice sau vectori de transformare utilizai n obinerea PMG, cum este, de
exemplu, pCambia 3300, care conine gena bar (fig. 6.3.).
123
Figura 6.2. Prezentare schematic a reaciei de polimerizare n lan
118
Testul.negativ reprezint proba care conine toate componentele necesare pen-
tru PCR, cu excepia ADN-ului. Daca n urma efecturii reaciei apar ampliconi,
rezult c sunt nesterili reagenii, vesela.
n ultimul timp sunt elaborate diverse variaii ale metodei PCR de detecie a
PMG, inclusiv Multiplex PCR, care permit identifcarea mai multor secvene de
ADN n aceeai reacie de amplifcare (fg. 6.4.). ns cel mai frecvent utilizat r-
mne a f metoda clasic a reaciei PCR, cu utilizarea primerilor complementari cu
secvenele genetice incluse n genom (de obicei, promotor i/sau terminator) i ana-
liza rezultatelor n baza electroforezei
ampliconilor obinui.
n majoritatea cazurilor, n trans-
formarea genetic a plantelor se utili-
zeaz promotorii 35S CaMV, NPTII,
Act, iar n calitate de secvene termi-
nator al transcripiei NOS termina-
torul genei nopalinsintaza din plasmi-
da Ti al A. tumefaciens (vezi cap. 1.),
ceea ce a determinat utilizarea acesto-
ra pentru detectarea sau screening-ul
PMG.
Utilizarea acestor elemente
transgenice n detecia PMG posed
att avantaje, ct i dezavantaje (tab.
6.2.), care trebuie luate n considera-
ie la efectuarea analizelor.
Testarea PMG dup secvena 35S
CaMV permite detectarea tuturor liniilor de soia, orez i unele linii de porumb MG.
Testul dup dou secvene, 35S CaMV i NOS, permite identifcarea tuturor liniilor
de porumb, soia, orez, tomate, sfecl de zahr i a unor linii de bumbac. Detectarea
simultan a secvenelor NOS i 35S CaMV, n plantele supuse testrii, sporete proba-
bilitatea identifcrii alogenelor (tab. 6.3.).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 C(+)
Figura 6.3. Electroforeza produselor de amplificare ale genei bar
M Marker, C(+) control pozitiv (plasmidul pCambia 3300)
bar
Testul-negativ reprezint proba care conine toate componentele necesare pentru PCR, cu
excepia ADN-ului. Daca n urma efecturii reaciei apar ampliconi, rezult c fie reagenii, fie vesela
sunt nesterile.
n ultimul timp sunt elaborate diverse variaii ale metodei PCR de detecie a PMG, inclusiv
Multiplex PCR, care permit identificarea mai multor secvene de ADN n aceeai reacie de
amplificare (fig. 6.4.). ns cel mai frecvent utilizat rmne a fi metoda clasic a reaciei PCR cu
utilizarea primerilor complementari cu secvenele genetice incluse n genom (de obicei, promotor
i/sau terminator) i analiza rezultatelor n baza electroforezei ampliconilor obinui.
n majoritatea cazurilor, n transformarea genetic a plantelor se utilizeaz promotorii 35S
CaMV, NPTII, Act, iar n calitate de secvene terminator al transcripiei NOS terminatorul genei
nopalinsintaza din plasmida Ti al A. tumefaciens (vezi cap. 1.), ceea ce a determinat utilizarea acestora
pentru detectarea sau screening-ul PMG.
Ampliconul 1
Ampliconul 2
Multiplex
PCR
Figura 6.4. Exemplu comparativ al rezultatelor obinute prin PCR clasic
PCR simplu
124
i Multiplex-PCR
Figura 6.3. electroforeza produselor de amplifcare ale genei bar
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 C(+)
Figura 6.3. Electroforeza produselor de amplificare ale genei bar
bar
Testul-negativ reprezint proba care conine toate componentele necesare pentru PCR, cu
excepia ADN-ului. Daca n urma efecturii reaciei apar ampliconi, rezult c fie reagenii, fie vesela
sunt nesterile.
n ultimul timp sunt elaborate diverse variaii ale metodei PCR de detecie a PMG, inclusiv
Multiplex PCR, care permit identificarea mai multor secvene de ADN n aceeai reacie de
amplificare (fig. 6.4.). ns cel mai frecvent utilizat rmne a fi metoda clasic a reaciei PCR cu
utilizarea primerilor complementari cu secvenele genetice incluse n genom (de obicei, promotor
i/sau terminator) i analiza rezultatelor n baza electroforezei ampliconilor obinui.
n majoritatea cazurilor, n transformarea genetic a plantelor se utilizeaz promotorii 35S
CaMV, NPTII, Act, iar n calitate de secvene terminator al transcripiei NOS terminatorul genei
nopalinsintaza din plasmida Ti al A. tumefaciens (vezi cap. 1.), ceea ce a determinat utilizarea acestora
pentru detectarea sau screening-ul PMG.
Ampliconul 1
Ampliconul 2
Multiplex
PCR
Figura 6.4. Exemplu comparativ al rezultatelor obinute prin PCR clasic
PCR simplu
124
i Multiplex-PCR
Figura 6.4. exemplu comparativ
al rezultatelor obinute prin PCr clasic
i Multiplex-PCr
119
Tabelul 6.2.
Aspecte comparative ale elementelor transgenice coninute n PMG
www.coresta.org
Secvena Avantaje Dezavantaje
35S CaMV
promotor
Sunt n majoritatea PMG
Nu este detectat n toate cazurile posibile
Exist tehnologii de identifcare bine puse la punct
Puine culturi sunt afectate de virusul ce conine 35S Poate avea omologi endogeni
nptII
Marker utilizat des n PMG
Nu este detectat n toate cazurile posibile
Se conine n bacterii
Poate avea omologi endogeni
NOS terminator Comun pentru multe PMG Nu este detectat n toate cazurile posibile
Exist metode de detectare bine puse la punct Se conine i n Agrobacterium
Transgene specifce Sunt specifce fecrei linii de PMG Uz limitat
Tabelul 6.3.
Detectarea unor linii de PMG cu ajutorul secvenelor
35S CaMV i NoS terminator
(Elke Anklam si al., 2002)
Linia 35S CaMV NOS
Tomate
Flavr Savr + -
B, Da (TGT4)F + +
1345-4 + +
8338 + -
35 1N - -
Event 5345 + ?
Soia
Roundup Ready + +
Porumb
Bt 11 + +
MON 810 + +
NK 603 + +
Bt 176 + -
T 14, 25 + -
GA 21 - +
MON 863 + +
B 16 + -
MS 3 + +
MON 809 + +
Bt xtra + -
CBH 351 + +
MS 6 + +
MON 830 + +
Not: + secvena este prezent, secvena lipsete, ? nu se cunoate
Eforturile savanilor biologi din ntreaga lume sunt orientate spre acumularea de
rezultate i spre completarea bazelor de date, care servesc la cercetri fundamentale i
aplicative. Astfel, sunt cunoscute secvenele diferitor primeri i dimensiunea ampliconilor
obinui n urma reaciei PCR pentru detectarea mai multor PMG (tab. 6.4.).
120
Tabelul 6.4.
Secvena primerilor i dimensiunea ampliconilor obinui n urma reaciei
PCr pentru detectarea PMG (Hemmer, 1997)
Secvena-int
Primer 1 (5=> 3)
Primer 2 (5 => 3)
Amplicon
(pb)
Culturile PMG
detectate
PG antisens
P-35S
AGGGGAAAGTGGAAAACCATC
CCACTGACGTAAGGGATGACG
427
Tomate
PG antisens
P-35S
TTTGGAGCTAAGGGTGATGGA
AGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA
472
PG sens
P-35S
GAAGATCTGCATGGACCTGAAAA
AGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA
478
nptII
P-nos
GAACTCGTCAAGAAGGCGATA
GTTCAAATGCGCCTAAGGTCA
943
gena IIIA
nos 3
CTACTGATTACGGTGCTGCTA
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTG
658
P-35S
PVX cp
CCACTGACGTAAGGGATGACG
CCAGTTCCATACCACTGGAGC
502 Cartof
P-35S
CTP (CP4 epsps)
TGATGTGATATCTCCACTGACG
TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT
172 Soia
P-35S
dhfr
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGC
CTGCCTCCGACTATCCAAACCA
540
Porumb
P-35S
dhfr
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGC
AAAGCCACAAAAGTCCCAT
840
P-35S
nos 3
CAATCCCACTATCCTTCGC
CATCGCAAGACCGGCAACAG
890 Tomate
cat
lacZ
TTTGTATTCTGAGCATAGTGA
ATAGCGACGAGAGTTAG
623
Microorganisme
kat A
cat
CAGCGACTTGAGAAAAACGAGTG
TGTCAGATAGGCCTAATGACTG
1321
nptII
ocd
TATCGCCTTCTTGACGAGTTC
CTGTGGCGGGAACTCCACGA
401
Tomate
ocd
gena IIIA
CGATCCTGAGCGACAATATGA
TAGCAGCACCGTAATCAGTAG
660
als
CAGGTCAAGTGGCACGTAGGATG
GGCTGCTTGTTCTTTCCAATCT
642 Bumbac
aphIV (higromicin-
fosfotransferaza)
CGCCGATGGTTTCTACAA
GGCGTCGGTTTCCACTAT
839 Cartof
barnase
CTGGGTGGCATCAAAAGGGAACC
TCCGGTCTGAATTTCTGAAGCCTG
160
Porumb
barstar
TCAGAAGTATCAGCGACCTCCACC
AAGTATGATGGTGATGTCGCAGCC
235
gus
TCCGTAGAAACCCAACC
GCTAGCCTTGTCCATTG
674 Papaia
gus
ACGTCCTGTAGAAACCCCAA
CCCGCTTCGAAACCAATGCC
1097
Lucern
nptII
GAACAAGATGGATTGCACGC
GAAGAACTCGTCAAGAAGGC
785
nptII
GGATCTCCTGTCATCT
GATCATCCTGATCGAC
173 Tomate, cartof
nptII
GGTGCCCTGAATGAACTG
TAGCCAACGCTATGTCCT
ca. 500
Microorganisme
nptII
CTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAG
AAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCAT
489b
nptII
CCGACCTGTCCGGTGCCC
CCGCCACACCCAGCCGGCC
475 Soia
PG
(poligalacturonaza)
CGTTGGTGCATCCCTGCATGG
GGATCCTTAGAAGCATCTAGT
180 (380)a Tomate
P-TA29
CTTTTTGGTTAGCGAATGC
CTACCATGGTAGCTAATTTC
880 Tutun
T-nos ( = nos 3)
GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
TTATCCTAGTTTGCGCGCTA
180 Soia
121
Doar pentru identifcarea liniilor de porumb modifcat genetic (tab. 6.5.) sunt
selectai numeroi primeri folosii n funcie de tipul transgenelor utilizate.
Tabelul 6.5.
Lista primerilor utilizai pentru detectarea PMG
(Lih-Ching Chiueh si al., 2002)
Primerul Secvena 5-3 Transgena
Ampliconul
(pb)
CDPK-cry 03 CTC TCG CCG TTC ATG TCC GT
CDPKpro/
sens
211
CDPK-cry 04 GGT CAG GCT CAG GCT GAT GT
cryIA(b)/
antisens
HS01-cry AGT TTC CTT TTT GTT GCT CTC CT hsp70/ sens
194
CR01 GAT GTT TGG GTT GTT GTC CAT
cryIA(b)/
antisens
CM03 CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA CaMV/ sens
231
PA01 AGA TCA TCA ATC CAC TCT TGT GGT G pat/ antisens
T25 1-5 GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA pat/ sens
149
T25 1-3 TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT
35S
terminator/
antisens
Bt11 1-5 CCA TTT TTC AGC TAG GAA GTT C
adh11S
IVS6/ sens
110
cryIA 1-3 TCG TTG ATG TTK GGG TTG TTG TCC
cryIA(b)/
antisens
GA21 1-5 ACG GTG GAA GAG TTC AAT GTA TG OTP/ sens
270
GA21 1-3 TCT CCT TGA TGG GCT GCA
m-epsps/
antisens
CM03 CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA CaMV/ sens
170
CBH02 GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT
cry9C/
antisens
ZE01 TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG Ze.1/ sens
329
ZE02 GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT
Ze.1/
antisens
122
Reuita analizei PCR poate f verifcat prin mai multe ci, i anume:
1. Electroforeza ampliconilor, care permite stabilirea mrimii aproximative (uti-
liznd markeri ADN) a produselor de amplifcare i compararea ei cu mrimea
teoretic ateptat.
2. Analiza Southern Blot separarea electroforetic a ampliconilor, transferul lor
pe membran i hibridarea cu ADN-ul specifc. Analiza de hibridare permite de-
terminarea secvenelor transgenice aplicnd procedeul de hibridare a ADN-ului
cu o sond marcat pe baz de denaturare-renaturare, proprietate ce permite
formarea moleculelor hibride dintre ADN/ADN, ADN/ARN sau ARN/ARN n
baza complementaritii bazelor azotate. Principiul de hibridare permite detec-
tarea cu mare efcien a genelor ncorporate n vectorii de clonare prin teste de
hibridare, ce utilizeaz sonde moleculare marcate radioactiv (de obicei, cu
izotopi
32
P), care sunt evideniate prin autoradiografe.
3. Efectuarea PCR-ului repetat (Nested PCR). Principiul metodei const n uti-
lizarea a dou seturi de primeri i a dou programe diferite de amplifcare. n
prima etap, o pereche de primeri este utilizat pentru obinerea ampliconului,
care va servi ulterior ca matrice-int pentru sinteza ampliconului doi, con-
form programul doi de amplifcare (fg. 6.5.). Astfel, n gelul de electroforez
NESTED PCR
16S
16S
16S
23S
1.8 kpb
1.2 kpb
23S 5S
Figura 6.5. exemplu de Nested-PCr n baza genei 16S
http://www.ars.usda.gov/pandp/docs.htm?docid=11318
123
utilizat pentru obinerea ampliconului care va servi ulterior ca matrice-int pentru sinteza
ampliconului doi, conform programul doi de amplificare (fig. 6.5.). Astfel, n gelul de
electroforez se vor vizualiza doi ampliconi, unul cu mas mai mare i altul cu mas mai mic.
Aceast metod reduce substanial amplificrile nespecifice.
Figura 6.5. Exemplu de Nested-PCR n baza genei 16S
(http://www.ars.usda.gov/pandp/docs.htm?docid=11318)
4. Secvenierea nucleotidic a ampliconilor i compararea cu baza teoretic de date reprezint cea
mai eficient verificare a rezultatelor PCR. Analiza succesiunii nucleotidelor din cadrul secvenei
amplificate permite identificarea cu exactitate a tipului transgenei incluse n genom.
5. Analiza restricional a ampliconilor obinui n urma reaciei PCR cu ajutorul enzimelor
endodezoxiribonucleazice. Ca exemplu de aplicare a enzimelor de restricie n analiza PCR servete
analiza ampliconului obinut n urma PCR (130 pb) specific porumbului Bt10 (fig. 6.6.). Acesta este
digerat cu ajutorul enzimei SspI (incubat 1 or, la 37 C) i supus electroforezei n gel de agaroz de
3%. n urma digestiei sunt obinute 2 fragmente: unul de 77 pb i altul de 53 pb.
Figura 6.6. Succesiunea de nucleotide a produsului de amplificare PCR a
genei Bt10. Enzima SspI recunoate situsul AATATT
129
Figura 6.6. Succesiunea de nucleotide a produsului de amplifcare
PCr a genei Bt10. enzima SspI recunoate situsul AATATT
se vor vizualiza doi ampliconi, unul cu mas mai mare i altul cu mas mai
mic. Aceast metod reduce substanial amplifcrile nespecifce.
4. Secvenierea nucleotidic a ampliconilor i compararea cu baza teoretic de
date reprezint cea mai efcient verifcare a rezultatelor PCR. Analiza succe-
siunii nucleotidelor din cadrul secvenei amplifcate permite identifcarea cu
exactitate a tipului transgenei incluse n genom.
5. Analiza restricional a ampliconilor obinui n urma reaciei PCR cu ajutorul
enzimelor endodezoxiribonucleazice. Ca exemplu de aplicare a enzimelor de
restricie n analiza PCR servete analiza ampliconului obinut n urma PCR
(130 pb) specifc porumbului Bt10 (fg. 6.6.). Acesta este digerat cu ajutorul
enzimei SspI (incubat 1 or, la 37 C) i supus electroforezei n gel de agaro-
z de 3%. n urma digestiei sunt obinute 2 fragmente: unul de 77 pb i altul
de 53 pb.
124
EUROPEAN COMMISSION
Validated method
Method development
REZUMAT
specific.
93
DeTeCTIoN MeTHoD For eVeNT BT 10 USING A QUALITATIVe PCr ASSAY
DeTeCIA CALITATIV A PorUMBULUI BT 10 PrIN PCr
Metod elaborat de:
Syngenta Crop Protection AG
Metod validat: 22-04-2005
Joint Research Centre European Commission, Biotechnology & GMOs Unit
JRC a validat aceast metod de testare conform regulamentului EC 1829/2003 i deciziei din
18 aprilie, 2005 (2005/317/EC) privind testarea liniei neautorizate de porumb Bt10.
http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm
Principiul metodei const n testarea liniei de porumb Bt 10 prin metoda stan-
dard PCR, utiliznd primeri specifci pentru gena Bt10.
Probele de ADN utilizate n testul screening sunt obinute prin extragere dup
metoda Nucleospin Food (Macherey-Nagel GmbH, cat n.740 945.250).
Concentraia ADN-ului este determinat la fuorometru cu reactivul-kit PicoGreen
dsDNA Quantitation Kit (Molecular Probes). Soluia de lucru are concentraia de 10 ng
ADN/l. Calitatea ADN-ului este verifcat n urma efecturii electroforezei n gel de
agaroz de 1,2%, utiliznd 3 l prob. Mrimea ampliconului obinut n urma reaciei
PCR este de 130 pb. Analiza ampliconilor se face n gel de agaroz 2,7%. Sensibilitatea
metodei este de sub 0,1%, iar limita absolut de detecie este sub 20 copii.
Mixul de reacie
reagentul Concentraia-stoc
Concentraia
fnal
l la prob
Ap 15,38
MgCl
2
25 mM 1,5 mM 1,50
Soluie-tampon 10x 1X 2,50
dNTP 25 mM fecare 160 M 0,16
Primer sens 100 M 0,6 M 0,15
Primer antisens 100 M 0,6 M 0,15
Taq-polimeraz 5U/l 0,032 U/l 0,16
ADN 10 ng/l 50 ng/prob 5,00
Volumul fnal 25,00
Secvena primerilor
primer sens (JSF3) 5`-CACACAGGAGATTATTATAGGG-3`
primer antisens (JSF3) 5`- GGGAATAAGGGCGACACGG-3`
Condiiile de amplifcare
etapele PCr Condiiile
2.
40 cicluri
Extincie 62C/30 sec.
125
DeTeCTIoN oF exoGeNoUS GeNeS IN GeNeTICALLY MoDIFIeD
PLANTS WITH MULTIPLex PoLYMerASe CHAIN reACTIoN
SCreeNING-UL PMG PrIN MeToDA MULTIPLex PCr
Metod elaborat de zhen Tao, xing-Feng Cai, Sheng-Li Yang i al.
(Detection of exogenous genes in genetically modifed plants with multiplex poly-
merase chain reaction. Plant Molecular Biology Reporter, 19, 2001, p. 289-298)
Principiul metodei const n utilizarea simultan a 7 perechi de primeri, desti-
nai detectrii respectiv a 7 secvene genetice diferite, incluse n genomul PMG prin
metoda PCR. Cu ajutorul protocolului respectiv, pot f detectai n acelai timp promo-
torul, terminatorul, gena de selecie, gena raportoare i gena de interes.
Mixul de reacie
reagentul Concentraia-stoc
Soluie-tampon pentru enzim 1x
Ioni Mg
2+
2 mM
dNTP 200 M
Taq-polimeraza 2,5 U
Primerii (secvena disponibil n articolul original) 0,2; 0,4 sau 0,6 M
ADN 1 - 10 ng
Volumul total 25 l
2.
8 cicluri
95C/5 sec.
56C/15 sec.
32 cicluri
95C/5 sec.
6C/15 sec.
Produsele de amplifcare (ampliconii) au urmtoarele dimensiuni totale i di-
mensiuni ale fragmentelor de restricie tiate cu enzimele respective:
Primeri Amplicon enzima de restricie
Ampliconii obinui
n urma restriciei
P35S 210 pb Xmn.I 98 i 112 pb
PNOS 110 pb Nsi I 39 i 71 pb
TNOS 159 pb Alu I 98 i 61 pb
NPTII 295 pb Alu I 114 i 181 pb
GUS 318 pb AluI 138 i 180 pb
EPSPS 175 pb AluI 134 i 41 pb
CpTI (cowpea trypsin
inhibitor)
249 pb EcoRI 141 i 108 pb
Enzimele de restricie (10 - 15 U) sunt adugate la 15 l de ADN amplifcat,
incubat timp de 2 ore, la 37C, iar separarea fragmentelor este efectuat n gel de agaroz
de 3%.
126
SCreeNING For GeNeTICALLY MoDIFIeD orGANISMS IN FooD
SCreeNING-UL orGANISMeLor MoDIFICATe GeNeTIC N
ProDUSeLe ALIMeNTAre
Metod elaborat de Spoth i Strauss
(Screening for Genetically Modifed Organisms in Food Using Promegas Wizard
.
Resin, www.promega.com, p. 23-25).
Principiul metodei const n identifcarea OMG prin metoda PCR, utiliznd
primeri specifci pentru promotorul 35S CaMV i NOS-terminator.
Ampliconii obinui n urma reaciei PCR n cazul 35S CaMV au dimensiunile
de 195 pb, iar n cazul NOS 180 pb. Electroforezei sunt supuse 10 l volum de
reacie PCR i 2 l soluie-tampon pentru probe (loading buffer 6X). Electroforeza
este efectuat n gel de agaroz 1% cu soluie-tampon TAE 1X. Expresia benzii de-
pinde de % de ADN, ce conine aceste elemente transgenice. Utilizarea protocolului
dat permite detectarea OMG la limita de detecie 0,1%.
Mixul de reacie
o reacie o reacie 10 reacii PCr
PCR (l) Mixul (l)
ADN (510 ng/l) 5 --
Primerul 1 (50 pmol/l) 1 10
Primerul 2 (50 pmol/l) 1 10
10X tampon de reacie 10 100
MgCl
2
(25 mM soluie) 6 60
dNTP (10 mM) 2 20
Taq.ADN polimeraza (5 u/l) 0,5 5
Ap 74,5 745
Volumul total 100 950
Secvena primerilor
Primerii pentru promotorul 35S CaMV i NoS-terminator
35S CaMV
Sens: 5 GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3
Antisens: 5 GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3
NoS-terminator
Sens: 5 GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3
Antisens: 5 TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3
etapele PCr promotorul 35S CaMV NoS-terminator
1. Denaturare 98C/2-3 min. 95C/3-4 min.
2.
40
cicluri
Denaturare 95C/20-50 sec. 95C/20-65 sec.
Extincie 54C/30-40 sec. 54C/40-72 sec.
Elongare 72C/40-60 sec. 72C/40-84 sec.
3. Elongare fnal 72C/3 min. 72C/3min.
127
STUDY oN THe DeTeCTIoN MeTHoD oF SIx VArIeTIeS
oF GeNeTICALLY MoDIFIeD MAIze
DeTeCTAreA A ASe VArIeTI De PorUMB TrANSGeNIC
Metod elaborat de Lih-Ching Chiueh i al. (Study on the detection method of
six varieties of genetically modifed maize and processed foods. Journal of Food
and Drug Analysis, 2002, 10(1), p. 25-33).
Principiul metodei const n efectuarea unei simple reacii PCR, utiliznd primeri
specifci pentru detectarea liniilor de porumb: Event 176 (Novartis), Bt11 (Novartis),
MON810 (Monsanto), T25 (AgrEvo), CBH-351 (AgrEvo), i GA21 (Monsanto) la limi-
ta de detecie mai mic de 0,1% (w/w).
Mixul de reacie
Soluia stoc Cantitatea, l
Primeri (100 M) 2 (fecare primer)
ADN-polimeraza (2,5 unit/L) 2
dNTP (200 M) 8
Soluie-tampon Mg
2+
(1,5 mM) 5
Ap 21
ADN 10 (aproximativ 100 ng)
Secvena primerilor
Primerul Secvena 5-3 Transgena
Ampliconul
(pb)
CDPK-cry 03 CTC TCG CCG TTC ATG TCC GT CDPK-pro/sens
211
CDPK-cry 04 GGT CAG GCT CAG GCT GAT GT cryIA(b)/antisens
HS01-cry AGT TTC CTT TTT GTT GCT CTC CT hsp70/sens
194
CR01 GAT GTT TGG GTT GTT GTC CAT cryIA(b)/antisens
CM03 CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA CaMV/sens
231
PA01 AGA TCA TCA ATC CAC TCT TGT GGT G pat/antisens
T25 1-5 GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA pat/sens
149
T25 1-3 TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT 35S terminator/antisens
Bt11 1-5 CCA TTT TTC AGC TAG GAA GTT C adh1-1S IVS6/sens
110
cryIA 1-3 TCG TTG ATG TTK GGG TTG TTG TCC cryIA(b)/antisens
GA21 1-5 ACG GTG GAA GAG TTC AAT GTA TG OTP/sens
270
GA21 1-3 TCT CCT TGA TGG GCT GCA m-epsps/antisens
CM03 CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA CaMV/sens
170
CBH02 GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT cry9C/antisens
ZE01 TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG Ze.1/sens
329
ZE02 GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT Ze.1/antisens
Programul de amplifcare pentru primerii:
HS01-cry, CM03-PA01, ze01-ze02, Bt11/1-5-cryIA/1-3, i T25/1-5-
T25/1-3 este urmtorul: denaturare iniial 95C, 3 min., urmat de 40 cicluri
de amplifcare (95C, 1 min., 60C, 1 min. i 72C, 1 min.), elongarea fnal:
72C, 7 min.
GA21/1-5 GA21/1-3 este urmtorul: denaturare iniial: 95C, 3 min., 40
cicluri de amplifcare ( 95C, 1 min., 57C, 1 min. i 72C, 1 min.), elongarea
fnal: 72C, 7 min.
CDPK-cry include: denaturarea iniial, 95C, 12 min., urmat de 40 cicluri
de amplifcare (95C, 30 sec., 63C, 30 sec. i 72C, 30 sec.), elongare fnal:
72C, 10 min.
CM03-CBH02: denaturarea iniial 95C, 10 min., urmat de 40 cicluri (fecare
constnd din etapele: 95C, 30 sec., 60C, 30 sec. i 72C, 30 sec.), elongarea
fnal: 72C, 7 min.
128
NeSTeD MULTIPLex PoLIMerASe CHAIN reACTIoN For THe
DeTerMINATIoN oF DNA FroM GeNeTICALLY MoDIFIeD
CorN AND SoYBeANS
MeToDA NeSTeD-MULTIPLex PCr PeNTrU DeTerMINAreA
PorUMBULUI I SoIA MoDIFICATe GeNeTIC
Metod elaborat de Mark A. Jensen
http://www.iscpubs.com/articles/abl/b0403jen.pdf
Principiul metodei const n analiza produselor de amplifcare PCR cu ajuto-
rul tehnologiei LabChip, la dispozitivul Agilent 2100.
Izolarea ADN-ului este efectuat cu ajutorul DNeasy plant mini kit, Wizard sau
procedura CTAB (descris n detaliu n protocolul original). Probele ADN-ului sunt
diluate la concentraiile de 5 - 50 ng/l.
Biosmart Allin 1,0 GMO screening system este un kit multiplex PCR, care per-
mite obinerea ampliconilor cu lungimea de 118 pb (lectina), 150 pb (35S CaMV), 217
pb (amplicon, obinut n baza primului produs de amplifcare de 278 pb) i 278 pb
(zeina). Ca material de referin servete porumbul/ soia MG 0 - 5%.
Produsele de amplifcare sunt analizate cu ajutorul dispozitivului Agilent 2100
i electroforeza n gel 4% NuSieve 3:1 plus gel. Metoda este capabil de a percepe
promotorul 35S CaMV la nivelul de 0,1%.
Condiiile de amplifcare a primei etape
2. 39 cicluri
Aliniere 55C/60 sec.
Condiiile de amplifcare a ultimei etape
2. 39 cicluri

x CDPK-cry include: denaturarea iniial, 95C timp de 12 min., urmat de 40 cicluri de
amplificare (95C timp de 30 sec., 63C timp de 30 sec., i 72C timp 30 sec..), elongare final -
72C, 10 min.
x CM03-CBH02: denaturarea iniial 95C pentru 10 min, urmat de 40 cicluri (fiecare constnd
din etapele: 95C timp de 30 sec., 60C timp de 30 sec., i 72C pentru 30 sec.), elongarea
final, 72C pentru 7 min.
NESTED MULTIPLEX POLIMERASE CHAIN REACTION FOR THE DETERMINATION
OF DNA FROM GENETICALLY MODIFIED CORN AND SOYBEANS
METODA NESTED-MULTIPLEX PCR PENTRU DETERMINAREA
PORUMBULUI I SOIA MODIFICATE GENETIC
Metod elaborat de Mark A. Jensen
(http://www.iscpubs.com/articles/abl/b0403jen.pdf)
Principiul metodei const n analiza produselor de amplificare PCR cu ajutorul tehnologiei
LabChip la dispozitivul Agilent 2100.
Izolarea ADN-ului este efectuat cu ajutorul DNeasy plant mini kit, Wizard sau procedura
CTAB (descris n detaliu n protocolul original). Probele ADN-ului sunt diluate la concentraiile de 5-
50 ng/l.
Biosmart Allin 1,0 GMO screening system este un kit multiplex PCR care permite obinerea
ampliconilor cu mas de 118 pb (lectina), 150 pb (35S CaMV), 217 pb (amplicon obinut n baza
primului produs de amplificare de 278 pb) i 278 pb (zeina). Ca material de referin servete
porumbul/ soia MG 0%-5%.
Produsele de amplificare sunt analizate cu ajutorul dispozitivului Agilent 2100 i electroforeza
n gel 4% NuSieve 3:1 plus gel. Metoda este capabil de a percepe promotorul 35S CaMV la nivelul
de 0,1%.
Condiiile de amplificare a primei etape
1.
Denaturare 95C/15 min.
2.
39 cicluri
3.
Elongare final 72C/3 min.
Condiiile de amplificare a ultimei etape
1. Denaturare
95C/15 min.
Aliniere 57C/60 sec. 2. 39 cicluri
3. Elongare final 72C/3 min.
134
Rezultatele PCR n gel 4% (a i b) i analizate la Bioanalizator Agilent 2100 (c i d)
rezultatele PCr n gel 4% (a i b) i analizate la Bioanalizator Agilent 2100 (c i d)
Capitolul
METODE PCR
DE CUANTIFICARE A PMG
7.1. Real-time PCR
7.2. RCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR)
ASPeCTe ALe ACTIVITII LABorATorULUI
SECURITATE BIOLOGIC
7
7.1. Real-time PCR
CAPITOLUL 7
METODE PCR
135
7.1. Real-time PCR
CAPITOLUL 7
METODE PCR
135
7.1. Real-time PCR
CAPITOLUL 7
METODE PCR
135
130
Capitolul 7. MeToDe PCr De CUANTIFICAre A PMG
Pentru determinarea cantitativ a prezenei modifcrilor genetice n PMG se
aplic dou metode bazate pe principiul PCR:
Real-time PCR; i
PCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR).
7.1. real-time PCr
Real-time PCR reprezint o metod rapid (20 min. - 2 ore), cu o sensibilitate i
specifcitate nalt de cuantifcare a produselor de amplifcare n timp.real. Tehnologia
permite determinarea cantitii de secvene amplifcate, evitnd etapa de electroforez,
ntruct cinetica acumulrii ampliconilor depinde direct de numrul de copii ale ADN-
matrice. Principiul metodei const n determinarea fuorimetric a probei n timpul
reaciei. Intensitatea emisiilor de fuorescen pn la atingerea etapei de saturare va
f proporional cu numrul de amplifcri. Emisia de fuorescen poate f perceput.
dup numrul minim de amplifcri Ct, iar nivelul de la care se identifc acest proces
se numete prag de fuorescen.
Astfel, cinetica reaciei este reprezentat de o curb (fg. 7.1.) ce const din trei etape:
1) iniiere (cnd produsele PCR nu pot f detectate);
2) exponenial (gradul de fuorescen este proporional cu numrul de
cicluri); i
3) saturare (gradul de fuorescen devine constant i nu depinde de
numrul de cicluri).
Realizarea cu succes a screening-ului PMG cu utilizarea Real-time PCR nece-
sit condiii specifce, cu descrierea primerilor i probelor fuorescente pentru feca-
re caz n parte (tab. 7.1.).
Capitolul 7. METODE PCR DE CUANTIFICARE A PMG
Pentru determinarea cantitativ a prezenei modificrilor genetice n PMG se aplic dou metode
bazate pe principiul PCR:
x Real-time PCR; i
x PCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR).
7.1. Real-time PCR
Real-time PCR reprezint o metod rapid (20 min. 2 ore), cu o sensibilitate i specificitate
nalt de cuantificare a produselor de amplificare n timp real. Tehnologia permite determinarea
cantitii de secvene amplificate, evitnd etapa de electroforez, ntruct cinetica acumulrii
ampliconilor depinde direct de numrul de copii ale ADN-matrice. Principiul metodei const n
determinarea fluorimetric a probei n timpul reaciei. Intensitatea emisiilor de fluorescen pn la
atingerea etapei de saturare va fi proporional cu numrul de amplificri. Emisia de fluorescen
poate fi perceput dup numrul minim de amplificri Ct, iar nivelul de la care se identific acest
proces se numete prag de fluorescen.
Astfel, cinetica reaciei este reprezentat de o curb (fig. 7.1.) ce const din trei etape:
1) iniiere (cnd produsele PCR nu pot fi detectate);
2) exponenial (gradul de fluorescen este proporional cu numrul de cicluri); i
3) saturare (gradul de fluorescen devine constant i nu depinde de numrul de cicluri).
Uniti de
fluorescen
(log)
Ct Ct Numrul de cicluri
Figura 7.1. Cinetica reaciei Real-time PCR
Ct numrul minim de amplificri la care emisia poate fi perceput
(www.molbiol.ru)
136
Figura 7.1. Cinetica reaciei real-time PCr
Ct numrul minim de amplifcri la care emisia poate f perceput.
www.molbiol.ru.
131
Tabelul 7.1.
Primerii i probele fuorescente pentru efectuarea real-time PCr
dup 35S, NoS i secvene specifce pentru soia i porumb
(http://www.biomedcentral.com/1472-6750/6/37/table/T)
inta /mrimea
ampliconului/.
Specifcitatea
Primerul
i secvena
marcat
Primerul/ secvena
Lungimea.
(pb)
Lectina
81 pb
Soia
(Nr. K00821)
TM-Lectin-F
TM-Lectin-R
Lectin-FAM
5-TCC ACC CCC ATC CAC
ATT T-3 5-GGC ATA GAA
GGT GAA GTT GAA GGA-3
5-AAC CGG TAG CGT TGC
CAG CTT CG-TAMRA-3
19
24
23
Invertaza
79 pb
Porumb
(Nr. U16123)
ivr1-TM1 ivr1-
TM2 ivr
5-TGG CGG ACG ACG ACT
TGT-3 5-AAA GTT TGG
AGG CTG CCG T-3 5-VIC-
CGA GCA GAC CGC CGT
GTA CTT CTA CC-TAMRA-3
18
19
26
p35S
82 pb
p35S
promotor
(Nr. V00141)
TM-35S-1 TM-
35S-2 35S
5-GCC TCT GCC GAC AGT
GGT-3 5-AAG ACG TGG
TTG GAA CGT CTT C-3 5-
FAM-CAA AGA TGG ACC
CCC ACC CAC G-TAMRA-3
18
22
22
tNOS
151 pb
tNOS
terminator
(Nr. V00087)
tNOSF tNOSR
tNOSpro
5-GTC TTG CGA TGA TTA
TCA TAT AAT TTC TG-3 5-
CGC TAT ATT TTG TTT TCT
ATC GCG T-3 5-FAM AGA
TGG GTT TTT ATG ATT AGA
GTC CCG CAA-TAMRA-3
29
25
30
GTS 40-3-2
soia 83 pb
construct
specifc
(Nr.
AB209952)
RRS-F RRS-R
RRS
5-GCC ATG TTG TTA ATT
TGT GCC AT-3 5-GAA GTT
CAT TTC ATT TGG AGA GGA
C-3 5-FAM-CTT GAA AGA
TCT GCT AGA GTC AGC
TTG TCA GCG-TAMRA-3
23
25
33
MoN810
porumb 115
pb
specifc
(Nr.
AF434709)
Mon810F1311
Mon810R1311
Mon810pro1311
5-CCT TCA TAA CCT TCG
CCC G-3 5-AAT AAA GTG
ACA GAT AGC TGG GCA-3
5-FAM-ACG AAG GAC TCT
AAC GTT TAA CAT CCT TTG
CCA-TAMRA-3
19
24
33
Actualmente, se disting mai multe metodologii ale procedeului Real-time
PCR. Printre acestea se numr tehnologia TaqMan Assay. Metoda respectiv este
bazat pe utilizarea ADN-polimerazei cu activitate 5-exonucleazic. n volumul de
reacie sunt adugate sonde ADN, n componena crora intr o particul marcat
fuorescent, notat ca R (dispus la captul 5) i un inhibitor al fuorescenei, notat
ca Q (dispus la captul 3), precum i o grupare fosfat n poziia 3, care blocheaz
polimeraza (fg. 7.2.). Sondele sunt complementare cu regiunea secvenei de ADN
amplifcat. Atunci cnd particula fuorescent este dispus n vecintatea inhibito-
rului, fuorescena nu este detectat. n procesul reaciei PCR, la etapele iniiale, are
132
complementar de ADN care, ajungnd la sond, ncepe scindarea acesteia, eliminnd i ndeprtnd
particulele fluorescente de la inhibitor, astfel nct concomitent cu procesul de amplificare are loc
emanarea fluorescenei, care este detectat de amplificator. Cu ct numrul de ampliconi va fi mai
mare, cu att intensitatea fluorescenei va crete.
Parametrii sondei TaqMan: raportul G/C de circa 20-80 %, Tm de 68-70 C, s nu conin
mai mult de 4 nucleotide de acelai fel care se repet consecutiv.
Parametrii primerilor: raportul G/C de 20-80%, Tm de 58-60 C, s formeze ampliconi de
circa 50 pb, lungimea primerilor de 20-30 pb.
Parametrii reaciei de amplificare: primerii (300 nM fiecare), sonda (250 nM), MgCl
2
(3,5
nM), AmliTaqGold-polimeraza (www.molbiol.ru).
Primer sens
Primer antisens
ADN
Sonda
Figura 7.2. Mecanismul reaciei Real-time PCR
dup tehnologia TaqMan Assay
(www.molbiol.ru)
O alt varietate a Real-Time PCR-ului este tehnologia Molecular Beacons, n cadrul creia se
utilizeaz sonde cu capetele terminale complementare care la temperatura de topire a primerilor se
unesc i formeaz complexe (fig.7.3.). ntruct secvena medie a sondei este complementar cu ADN-
ul amplificat, la aceast etap, sondele care nu s-au ataat la ADN matrice rmn n stare legat i nu
emit fluorescen, deoarece agentul fluorescent i atenuatorul fluorescenei sunt vecini. Sondele, care
s-au hibridat cu ADN-matrice, sunt n stare desfurat i astfel emit fluorescen, fiind nregistrate
de amplificator.
138
loc alipirea sondei la secvena complementar de ADN. Cu ct mai multe produse
de amplifcare n reacia PCR se vor forma, cu att mai multe sonde se vor lega la
ampliconul respectiv. n procesul etapei de elongare, polimeraza sintetizeaz catena
complementar de ADN care, ajungnd la sond, ncepe scindarea acesteia, elimi-
nnd i ndeprtnd particulele fuorescente de la inhibitor, astfel nct, concomitent
cu procesul de amplifcare, are loc emanarea fuorescenei, care este detectat de
amplifcator. Cu ct numrul de ampliconi va f mai mare, cu att intensitatea fuo-
rescenei va crete.
Parametrii sondei TaqMan: raportul G/C de circa 20 - 80 %, Tm de 68 - 70 C,
s nu conin mai mult de 4 nucleotide de acelai fel, care se repet consecutiv.
Parametrii primerilor: raportul G/C de 20 - 80%, Tm de 58 - 60 C, s
formeze ampliconi de circa 50 pb, lungimea primerilor de 20 - 30 nucleotide.
Parametrii reaciei de amplifcare: primerii (300 nM fecare), sonda (250
nM), MgCl
2
(3,5 nM), AmliTaqGold-polimeraza (www.molbiol.ru).
O alt varietate a Real-Time PCR-ului este tehnologia Molecular Beacons,
n cadrul creia se utilizeaz sonde
cu capetele terminale complemen-
tare, care la temperatura de topire
a primerilor se unesc i formeaz
complexe (fg.7.3.). ntruct sec-
vena medie a sondei este comple-
mentar cu ADN-ul amplifcat, la
aceast etap sondele care nu s-au
ataat la ADN matrice rmn n
stare legat i nu emit fuorescen-
, deoarece agentul fuorescent i
atenuatorul fuorescenei sunt ve-
cini. Sondele care s-au hibridat cu
ADN-matrice sunt n stare desf-
urat i astfel emit fuorescen,
find nregistrate de amplifcator.
Figura 7.2. Mecanismul reaciei real-time PCr
dup tehnologia TaqMan Assay
www.molbiol.ru
inta
Hibrid
Sonda de tip
Molecular Beacons
Atenuatorul fluorescenei Agent fluorescent
Figura 7.3. Tehnologia Real-time PCR de tip Molecular Beacons
(www.molbiol.ru)
O alt tehnologie Real-time PCR include utilizarea a dou sonde cu transfer de energie prin
rezonan (Light Cycler assay). Principiul metodei const n faptul c energia se transfer de la un
fluorofor dispus la captul 3' al primei sonde spre al doilea fluorofor, dispus la captul 5' al celei dea
doua sonde. Distana dintre sonde este de 1-3 nucleotide. La alipirea simultan a celor dou sonde la
ADN, energia eliminat de primul fluorofor este transmis celui deal doilea fluorofor, iar fluorescena
este detectat de amplificator (fig. 7.4.).
Sonda 2
Sonda 2 Sonda 1
Agentul fluorescent
Transferul de energie
Fluorescena
ADN
Figura 7.4. Tehnologia Real-time PCR Light Cycler assay
http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm
Utilizarea agenilor de intercalare reprezint o alt varietate a tehnologiei Real-Time PCR.
Metoda este bazat pe creterea semnificativ a fluorescenei odat cu includerea bromurii de etidiu
sau SYBR Green I n moleculele de acizi nucleici i astfel se poate analiza amplificarea ADN-ului la
nivel cantitativ.
139
Figura 7.3. Tehnologia real-time PCr de tip
Molecular Beacons
www.molbiol.ru.
.
133
O alt tehnologie Real-time PCR include utilizarea a dou sonde cu transfer
de energie prin rezonan (Light Cycler assay). Principiul metodei const n faptul
c energia se transfer de la un fuorofor dispus la captul 3 al primei sonde spre al
doilea fuorofor dispus la captul 5 al celei de-a doua sonde. Distana dintre sonde
este de 1 - 3 nucleotide. La alipirea simultan a celor dou sonde la ADN, energia
eliminat de primul fuorofor este transmis celui de-al doilea fuorofor, iar fuores-
cena este detectat de amplifcator (fg. 7.4.).
Utilizarea agenilor de intercalare reprezint o alt varietate a tehnologiei
Real-Time PCR. Metoda este bazat pe creterea semnifcativ a fuorescenei odat
cu includerea.bromurii.de.etidiu sau SYBR Green I n moleculele de acizi nucleici i
astfel se poate analiza amplifcarea ADN-ului la nivel cantitativ.
7.2. PCr-ul cantitativ competitiv (QC-PCr)
Tehnologia QC-PCR reprezint o metod semicantitativ bazat pe PCR, care
include coamplifcarea ADN-ului-int transgenic cu un competitor, de obicei o gen
de referin anumit, care exist n mod normal la planta respectiv (de exemplu,
gena zeinei), cantitatea iniial a fragmentului competitor find prealabil cunoscut
(fg. 7.5.). Raportul dintre cei doi produi ai PCR, determinai prin electroforez,
arat cantitatea aproximativ de secvene modifcate genetic.
Figura 7.4. Tehnologia real-time PCr Light Cycler assay
inta
Hibrid
Sonda de tip
Molecular Beacons
Atenuatorul fluorescenei Agent fluorescent
Figura 7.3. Tehnologia Real-time PCR de tip Molecular Beacons
(www.molbiol.ru)
O alt tehnologie Real-time PCR include utilizarea a dou sonde cu transfer de energie prin
rezonan (Light Cycler assay). Principiul metodei const n faptul c energia se transfer de la un
fluorofor dispus la captul 3' al primei sonde spre al doilea fluorofor, dispus la captul 5' al celei dea
doua sonde. Distana dintre sonde este de 1-3 nucleotide. La alipirea simultan a celor dou sonde la
ADN, energia eliminat de primul fluorofor este transmis celui deal doilea fluorofor, iar fluorescena
este detectat de amplificator (fig. 7.4.).
Sonda 2
Sonda 2 Sonda 1
Agentul fluorescent
Transferul de energie
Fluorescena
ADN
Figura 7.4. Tehnologia Real-time PCR Light Cycler assay
Utilizarea agenilor de intercalare reprezint o alt varietate a tehnologiei Real-Time PCR.
Metoda este bazat pe creterea semnificativ a fluorescenei odat cu includerea bromurii de etidiu
sau SYBR Green I n moleculele de acizi nucleici i astfel se poate analiza amplificarea ADN-ului la
nivel cantitativ.
139
134
7.2. PCR-ul cantitativ competitiv (QC-PCR)
Tehnologia QC-PCR reprezint o metod semicantitativ bazat pe PCR, care include co-
amplificarea ADN-ului-int transgenic cu un competitor, de obicei o gen de referin anumit, care
exist n mod normal la planta respectiv (de exemplu, gena zeinei), cantitatea iniial a fragmentului
competitor fiind prealabil cunoscut (fig. 7.5.). Raportul dintre cei doi produi ai PCR, determinai prin
electroforez arat cantitatea aproximativ de secvene modificate genetic.
Raportul 1:1
Figura 7.5. Principiul metodei QC-PCR
Primerul A
Primerul B
COMPETITORUL
(ADN standard)
Primerul A
Primerul B
PROBA
(ADN modificat genetic)
COAMPLIFICARE
ELECTROFOREZA
(gel de agaroz)
COMPETITOR
AMPLICON
SPECIFIC
140
raportul 1:1
Figura 7.5. Principiul metodei QC-PCr
135
EUROPEAN COMMISSION
Validated method
Method development
REZUMAT
specific.
93
EUROPEAN COMMISSION
Validated method
Method development
REZUMAT
specific.
93
reAL-TIMe PCr DeTeCTIoN oF GeNeTICALLY MoDIFIeD CorN MoN 863
reAL-TIMe PCr PeNTrU TeSTAreA PorUMBULUI MoDIFICAT GeNeTIC MoN 863
Metod elaborat de:
Monsanto Biotechnology Regulatory Sciences
Metod validat:
Joint Research Centre European Commission, Biotechnology & GMOs Unit
Protocol MON 863 Community Reference Laboratory 2/17 16/02/2005
http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm
Principiul metodei este bazat pe procedura TaqMan

PCR de detectare a cantitii
OMG n linia de porumb MON 863.
Procedura include urmtorii moduli: a) extragerea ADN-ului cu ajutorul CTAB
(Murray and Thompson (1980); b) cuantifcarea spectrofotometric a ADN-ului total;
c) metodologia Real-time PCR specifc pentru NK603.
Procedeul PCR a fost optimizat pentru sistemul ABI Prism

7700. Se recomand utilizarea
a 200 ng ADN per reacie. n urma reaciei PCR, ampliconul secvenei-int specifc PMG
const din 84 pb. Ca secven de referin este gena adh1.i fragmentul de 70 pb, obinut n
urma reaciei PCR. Limita minim de detecie este 0,5%, iar limita de cuantifcare 0,1%.
Mixul de reacie
Componenta
Concentraia
fnal
l/reacie
TaqMan

Universal PCR Master Mix (2X)
Primerul MON863-F/adh1-F
Primerul MON863-R/adh1-R
Probe MON863/adh1
Ap eliberat de nucleaze
ADN (maximum 280 ng)
1x
150 nM
150 nM
50 nM
25 l
-
-
-
Pn la 50 l
5 l
Secvena primerilor
Primerul Secvena de nucleotide (de la 5 spre 3)
Primerii pentru transgen
MON863 F GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC
MON863 R TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT
MON863 sond 6-FAM-TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA-TAMRA
Primerii pentru gena de referin
Adh1 F CCAGCCTCATGGCCAAAG
Adh1 R CCTTCTTGGCGGCTTATCTG
Adh1 sond 6-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-TAMRA
etapa TC Timpul Numrul de cicluri
1 50 C 120 sec. 1
2 95 C 10 min. 1
3 95 C 15 sec. 45
4 60 C 60 sec.
eUroPeAN CoMMISSIoN
DIRECTORATE GENERAL JRC
JOINT RESEARCH CENTRE
INSTITUTE FOR HEALTH AND CONSUMER PROTEC
136
A reCoMeNDeD ProCeDUre For reAL-TIMe QUANTITATIVe
TaqMAN PCr For GMo
CUANTIFICAreA DIFerITor LINII De oMG PrIN TaqMAN reAL-
TIMe PCr
Metod elaborat de:
compania Monsanto i JRC, Conform Art. 47 al CE 1829/2003
Metod optimizat de:
compania Monsanto pentru ABI Prism 7700 sequence detection system
http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm
Principiul metodei const n determinarea cantitativ a PMG (Canola RT73,
porumb NK603 i GA21) prin procedura TaqMan Real-time PCR.
Se recomand izolarea ADN-ului dup una din metodele descrise anterior,
unde cantitatea de ADN transgenic n soluiile standard trebuie s fe 50,0; 25,0; 5,0;
2,5; 0,5; 0,25; 0,05 i 0 ng/g respectiv.
Mixul de reacie
Nr. reagentul Volumul (l) Concentraia fnal
1. Ap eliberat de nucleaze 19,00 -
2. TaqMan Universal PCR Master Mix (2X) 25,00 1X
3. Primerul 1 (10 M) 0,75 150 nM
4. Primerul 2 (10 M) 0,75 150 nM
5. Proba TaqMan (5 M) 0,50 50 nM
6. ADN (50 ng/l) 4,00 200 ng
Not: se recomand pstrarea reagenilor la rece.
Secvena primerilor
Linia Primerul Secvena (5 3) Amplicon (pb)
Canola
RT73
RT73 primerul 1 CCATATTGACCATCATACTCATTGCT
108
RT73 primerul 2 GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA
RT73 proba 6-FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT-TAMRA
FatA primerul 1 GGTCTCTCAGCAAGTGGGTGAT
76
FatA primerul 2 TCGTCCCGAACTTCATCTGTAA
FatA proba 6-FAM-ATGAACCAAGACACAAGGCGGCTTCA-TAMRA
Porumb
NK603
NK603 primerul 1 ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA
108
NK603 primerul 2 AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT
NK603 proba 6-FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA
adh1 primerul 1 CCAGCCTCATGGCCAAAG
70 adh1 primer2 CCTTCTTGGCGGCTTATCTG
adh1 proba 6-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-TAMRA
Porumb
GA21
GA21 primerul 1 CTTATCGTTATGCATTTGCAACTTTAGA
112
GA21 primerul 2 TGGCTCGCGATCCTCCT
GA21 proba
6-FAM-CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAAC
AGCAGGTGGGT-TAMRA
adh1 primerul 1 CCAGCCTCATGGCCAAAG
70 adh1 primerul 2 CCTTCTTGGCGGCTTATCTG
adh1 proba 6-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-TAMRA
etapa Cicluri Temperatura, durata nscrierea datelor
1 1 50C/ 2 min. Nu
2 1 95C/ 10 min. Nu
3 45
95C/ 15 sec.
60C/ 1 min.
Nu
Da
137
QUANTITATIVe DeTeCTIoN oF THe 35S ProMoTer AND THe NoS
TerMINATor USING QUANTITATIVe CoMPeTITIVe PCr
DeTeCTAreA SeMICANTITATIV A SeCVeNeLor 35S CAMV-P I
NoS-T UTILIzND QC-PCr
Metod elaborat de Hardegger, Brodmann i Herrmann (Quantitative.
detection of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative
competitive PCR. Eur. Food Res. Technol., 1999, 209, p. 83-871999).
Principiul metodei const n identifcarea semicantitativ a secvenelor
P-35S CaMV i NOS-T prin procedeul QC-PCR.
n calitate de ADN competitor sunt construite standarde (plasmide), care
conin secvenele 35S i NOS. Oligonucleotidele utilizate pentru detectarea ADN-
competitor sunt incluse n tabelul de mai jos. Produsele PCR sunt separate n gel
de 2% agaroz. Dimensiunea produselor de amplifcare sunt 227 pb (35S), 267 pb
(competitor pBS-35Si), 187 pb (competitor pKS-35Sd), 180 pb (NOS terminator) i
220 pb (competitor pKS-NOSi).
Mixul de reacie
reagentul Soluia-stoc
Soluia-tampon pentru enzim 1x
MgCl
2
2,5 mM
BSA 2,0 mg/ml
dNTP 0,2 mM
Oligonucleotide 0,5 mM
Taq.ADN polimeraza 2,0 uniti
volum fnal 100 l
Secvena primerilor
Primerii Secvena
Primerii pentru
proba
de ADN
competitor
35Sif 5-ATCCTGAATAGATCTTGGACAAGCGTTAGGCCTATCTGGA-3
35Sir 3-TAGGACTTATCTAGAACCTGTTCGCAATCCGGATAGACCT-5
NOSif 5-CCTGAATAGATCTTGGACAAGCGTTAGGCCTATCTGTGCA-3
NOSir 3-ACGTGGACTTATCTAGAACCTGTTCGCAATCCGGATAGAC-5
Secvenele
primerilor
utilizai pentru
reacia QC-PCR
35S-A 5-AAGGGTCTTGCGAAGGATAG-3
35S-B 5-AGTGGAAAAGGAAGGTGGCT-3
NOS-1 5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3
NOS-3 5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3
Cu bold sunt date site-urile de restricie pentru enzimele BglII (AGATCT) i StuI (AGGCCT).
Condiiile de amplifcare QC-PCr
1. Denaturare 95C /3 min.
2. 40 cicluri
Denaturare 95 C / 36 sec.
Extincie 60 C (35S) / 54 C (NOS terminator) 72 sec.
Elongare 72 C / 84 sec.
3. Elongare fnal 72 C / 3 min.
138
GMo SPeCIFIC reAL-TIMe PCr SYSTeM
DeTerMINAreA PorUMBULUI BT 11 PrIN MeToDA real-Time PCr
Metod elaborat de Comisia European DG JRC (2003)
gmo-crl.jrc.it/summaries/Bt11-protocol.pdf
Principiul metodei const n determinarea cantitativ a modifcrilor genetice
ale porumbului Bt11 utiliznd procedura standard TaqMan Real-time PCR.
Ca gen de referin servete gena adh1. Se recomand utilizarea sistemului de
detecie ABI Prism 7700. Alte sisteme pot f utilizate, dar condiiile de amplifcare
trebuie revzute. Amplifcarea secvenelor adh1 i Bt11 are loc separat.
Mixul de reacie pentru sistemul adh1
Componenta Concentraia fnal l/reacie
TaqMan Universal Master Mix 2X 1x 12,5
ADH-F3 primer (20 M) 300 nM 0,375
ADH-R4 primer (20 M) 300 nM 0,375
ADH-MDO proba (10 M) 200 nM 0,5
Ap eliberat de nucleaze # 5,25
ADN (maximum 250 ng) # 6
Volumul total 25 l
Mixul de reacie pentru sistemul Bt11
Componenta
Concentraia
fnal
l/reacie
TaqMan Bufer A 10x 1x 2,5
MgCl
2
(25 mM) 4 mM 4
dNTP
a
10 mM fecare 0,2 mM fecare 0,5 fecare
dUTP 20 mM 0,4 mM 0,5
Bt 113J primer sens (20 M) 750 nM 0,9375
Bt 113J primer antisens (20 M) 750 nM 0,9375
Bt proba (10 M) 250 nM 0,625
AmpErase UNG (UNG 1 U/l) 0,3 U 0,25
Ampli Taq Gold (5 U/l) 1,5 U 0,25
Ap eliberat de nucleaze # 7,5
ADN (250 ng pentru standard, maximum 200 ng pentru ADN
necunoscut)
# 6
Volumul total 25 l
Secvena primerilor
Gena Secvena
Adh1: ADH-F3 sens 5 CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3
ADH-R4 antisens 5 CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3
ADH1- proba 5 FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3
Bt 11: Bt 113J sens 5 GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3
Bt 113J antisens 5 TCCAAGAATCCCTCCATGAG- 3
Bt 113J proba 5 FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3
Pasul etapa TC Timpul, sec. Achiziie Cicluri
1. UNG 50 120 Nu 1x
2. Denaturarea iniial 95 600 Nu 1x
3.
Amplifcarea
denaturare 95 15 Nu 50x
4.
alinierea i
extincia
60 60 msurare
Capitolul
CAPACITI NAIONALE
PENTRU TESTAREA PMG
Gln
GS
GOGAT
GS
1
(39 kDa)
GS
2
(44 kDa)
NADH-GOGAT
(225-230 kDa)
Fd-GOGAT
(164 kDa)
esuturi conductoare,
rdcin
Organe
verzi
PPT
Glu
gena bar
PAT
Mecanismul genetic propus al aciunii erbicidului
Basta
Obiectul de studiu Obiectul de studiu
13 linii de tutun tansgenic ( 13 linii de tutun tansgenic (Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum L. L. var. Xanthi var. Xanthi , 2n=48): 2, 5, , 2n=48): 2, 5,
6, 7A, 8, 10, 13, 14, 19A, 23, 24, 25 i 30, ce conin gena 6, 7A, 8, 10, 13, 14, 19A, 23, 24, 25 i 30, ce conin gena- - marker marker bar bar (0,5 (0,5
kb), r kb), responsabil esponsabil de sinteza enzimei de sinteza enzimei fosfinotricin fosfinotricin- -N N- -acetiltransferaza acetiltransferaza (PAT) (PAT)
i gena i gena leafy leafy (2,2 kb) de la (2,2 kb) de la Citrus sinensis Citrus sinensis ce codific ce codific proteina proteina CsLFY CsLFY, aflate , aflate
sub controlul promotorului constitutiv 35S CaMV i orientate sub controlul promotorului constitutiv 35S CaMV i orientate sens sens. .
Germinarea seminelor a avut loc pe mediul MS (Murashige and
Skoog, 1962), n li psa i prezena 0.005 mM erbicid Basta, la
temperatura de 21-22C, fotoperioada 8 ore.
Plantele au fost cultivate n n vase de
vegetaie, la temperatura de 21-22C i
fotoperioada de 8 ore, pn la cteva faze
de cretere (urechiu, rsad i antez)
Moldova State University Moldova State University
Center of Life's Sciences Center of Life's Sciences
Biosafety Biosafety Laboratory Laboratory
Biotechnology research in Moldova and Biotechnology research in Moldova and
capacity needs for testing of GM food and capacity needs for testing of GM food and
plant varieties plant varieties
Authors: Authors: prof prof. . DUCA Maria, DUCA Maria,
PhD. Port Angela, Ana PhD. Port Angela, Ana Capatina Capatina, , Glijin Glijin Aliona Aliona, ,
PhD students PhD students Lupascu Lupascu Victor, Victor, Levitchi Levitchi Alexei Alexei
CAPITOLUL 8
8.1. Structura i potenialul tehnico-
tiinific al laboratorului Securitatea
Biologic
8.2. Detecia PMG la nivel de expresie
fenotipic a transgenelor
8.3. Identificarea unor transgene la nivel
de proteine
8.4. Screening-ul PMG prin PCR
ASPECTE DIN ACTIVITATEA LABORATORULUI SECURITATEA
BIOLOGIC
146
CAPACITI NAIONALE
PENTRU TESTAREA PMG
Gln
GS
GOGAT
GS
1
(39 kDa)
GS
2
(44 kDa)
NADH-GOGAT
(225-230 kDa)
Fd-GOGAT
(164 kDa)
esuturi conductoare,
rdcin
Organe
verzi
PPT
Glu
gena bar
PAT
Mecanismul genetic propus al aciunii erbicidului
Basta
Obiectul de studiu Obiectul de studiu
13 linii de tutun tansgenic ( 13 linii de tutun tansgenic (Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum L. L. var. Xanthi var. Xanthi , 2n=48): 2, 5, , 2n=48): 2, 5,
6, 7A, 8, 10, 13, 14, 19A, 23, 24, 25 i 30, ce conin gena 6, 7A, 8, 10, 13, 14, 19A, 23, 24, 25 i 30, ce conin gena- - marker marker bar bar (0,5 (0,5
kb), r kb), responsabil esponsabil de sinteza enzimei de sinteza enzimei fosfinotricin fosfinotricin- -N N- -acetiltransferaza acetiltransferaza (PAT) (PAT)
i gena i gena leafy leafy (2,2 kb) de la (2,2 kb) de la Citrus sinensis Citrus sinensis ce codific ce codific proteina proteina CsLFY CsLFY, aflate , aflate
sub controlul promotorului constitutiv 35S CaMV i orientate sub controlul promotorului constitutiv 35S CaMV i orientate sens sens. .
Germinarea seminelor a avut loc pe mediul MS (Murashige and
Skoog, 1962), n li psa i prezena 0.005 mM erbicid Basta, la
temperatura de 21-22C, fotoperioada 8 ore.
Plantele au fost cultivate n n vase de
vegetaie, la temperatura de 21-22C i
fotoperioada de 8 ore, pn la cteva faze
de cretere (urechiu, rsad i antez)
Moldova State University Moldova State University
Center of Life's Sciences Center of Life's Sciences
Biosafety Biosafety Laboratory Laboratory
Biotechnology research in Moldova and Biotechnology research in Moldova and
capacity needs for testing of GM food and capacity needs for testing of GM food and
plant varieties plant varieties
Authors: Authors: prof prof. . DUCA Maria, DUCA Maria,
PhD. Port Angela, Ana PhD. Port Angela, Ana Capatina Capatina, , Glijin Glijin Aliona Aliona, ,
PhD students PhD students Lupascu Lupascu Victor, Victor, Levitchi Levitchi Alexei Alexei
CAPITOLUL 8
8.1. Structura i potenialul tehnico-
tiinific al laboratorului Securitatea
Biologic
8.3. Identificarea unor transgene la nivel
de proteine
ASPECTE DIN ACTIVITATEA LABORATORULUI SECURITATEA
BIOLOGIC
146
CAPACITI NAIONALE
PENTRU TESTAREA PMG
8.1. Structura i potenialul tehnico-tiinifc
al laboratorului Securitate Biologic
8.3. Identifcarea unor transgene la nivel de
proteine
SECURITATE BIOLOGIC
8
140
Capitolul 8. CAPACITI NAIoNALe
PeNTrU TeSTAreA PMG
Utilizarea OMG i a alimentelor noi rezultat al biotehnologiilor de ultima
or are un impact esenial asupra tiinei i mediului cu implicaii economico-so-
ciale i etice. Biosecuritatea alimentar i protecia biodiversitii reprezint unele
dintre problemele eseniale generate de introducerea n mediu a plantelor transge-
nice, fapt ce impune investigaii comparative ale OMG n raport cu cele non-OMG
(recipient) i implementarea diferitor metode de testare i monitorizare a culturilor
modifcate genetic i a produselor agroalimentare derivate din acestea.
Aceste domenii de cercetare rmn a f o prioritate i necesitate strategic att
pentru comunitatea internaional, ct i pentru Republica Moldova.
Dei n Moldova nu exist centre tiinifce care ar obine organisme modif-
cate genetic, acestea pot ajunge la consumatori prin importul n ar a produselor
alimentare, fructelor, legumelor etc., iar pe cmpurile agricole prin procurarea din
strintate a materialului semincer.
8.1. Structura i potenialul tehnico-tiinifc al laboratorului
Securitate Biologic
n temeiul prevederilor Conveniei privind securitatea biologic (Rio de Janei-
ro, 1992; http://www.cbd.int/biosafety/) i Protocolului de la Cartagena (http://bch.
biodiv.org/default.aspx) privind diversitatea biologic, semnat la New York la 14
februarie 2001, Republica Moldova a elaborat Legea privind Securitatea Biologic,
aprobat de ctre Parlamentul Republicii Moldova la 21 decembrie 2002, nr. 755-
XV. Prezenta lege reglementeaz activitile legate de obinerea, testarea, utilizarea
i comercializarea organismelor modifcate genetic. Cadrul instituional de autori-
zare i administrare a activitilor menionate are menirea s asigure desfurarea
lor n condiii de securitate biologic n care pot f prevenite, eliminate sau reduse
riscurile de producere a unor efecte negative generate de organismele modifcate
genetic asupra sntii umane, echilibrului ecologic i calitii mediului.
Reieind din aceste considerente, n cadrul USM a fost constituit Centrul de Se-
curitate Biologic (CSB), n baza deciziei senatului Universitii de Stat din Moldova
(USM) (proces-verbal nr. 8 din 27.01.2004) i ordinului interministerial ncheiat ntre
Ministerul Ecologiei, Construciilor i Dezvoltrii Teritoriului i Ministerul Educaiei
(nr. 28/61 din 18.02.2004) ca subdiviziune a Facultii de Biologie i Pedologie, ce
avea drept scop efectuarea testelor PMG i produselor derivate din acestea (semine,
fructe etc.), privind prezena transgenelor, cercetarea tiinifc i evaluarea riscurilor
legate de PMG. Importana fondrii acestui Centru a fost condiionat de lipsa unei
baze informaionale de date privind organismele modifcate genetic, a unui laborator
acreditat la nivel naional conform standardelor internaionale i europene, care s
141
testeze prezena materialului transgen n produsele alimentare componente indis-
pensabile funcionrii unui cadru de reglementare a activitilor cu OMG.
Activitile CSB au fost axate iniial pe:
Actualmente, CSB a fost reorganizat n Laboratorul Securitate Biologic (LSB), care
este parte component a Centrului de Cercetare tiine ale Vieii, organizat n baza ordi-
nului nr. 163 din 23.05.2006 din cadrul facultii, Biologie i Pedologie, USM.
n activitatea LSB sunt implicai 14 specialiti competeni n domeniu (un doctor
habilitat, 6 doctori n biologie, 3 doctoranzi etc.), care au realizat mai multe training-uri de
trei luni: proiectul COBASE, 001028-001, 2005 The infuence of GA
3
on the expresion of
genes (UCR, SUA); proiectele MTFP-04-08, 2005 i MTFP-15-05, 2006 Genetically.
modifed plants, obtaining, research, testing (MRDA-CRDF, SUA); MTFP-1017A, 2006
Some Molecular Aspects of Cell Genes at Sunfowers Different Genotypes (MRDA-
CRDF, SUA). De asemenea, colaboratorii laboratorului au participat la training-uri privind
activiti de reglementare, testare i evaluare a riscurilor asociate introducerii n mediu a
OMG, organizate la nivel internaional n Anglia, Rusia i Romnia:
Study tour Great Britain organized by British Embassy in the frames of the pro-
ject UNEP/GEF,, Support for the Development of the National Biosafety Fra-
mework for the Republic of Moldova, 16-22 November 2003.
OECD Workshop on the Assessment of Novel Foods and Feeds, Moscow, Russi-
an Federation, 16-18 September 2002.
Training workshop Handling requests for releases of GMOs into the environ-
ment, 13-15 September, 2001, Bucharest, Romania.
n cadrul colaborrii cu Universitatea din California, Riverside SUA (IA-
ASLJ-G9190241), Catedra Biologie Vegetal a fost vizitat de numeroi profesori
(I. Kaloshian, C. Lovatt, M. Orozco-Cardenas, S. Van Gundy etc.), care au realizat
seminare i au contribuit la dezvoltarea direciilor noi n cercetare i educaie, ofe-
rind donaii de cri i cursuri. Unul din rezultatele colaborrii internaionale a fost
elaborarea unui manual de laborator Tehnici de cercetare n biologie molecular
autori: profesor Maria Duca i profesor I. Kaloshian (UCR, SUA), care reprezint o
surs valoroas pentru studenii universitari i postuniversitari ce frecventeaz orele
de iniiere sau cursuri de tehnici avansate de laborator n biologia molecular.
crearea unui sistem informaional-instrumental activ prin baza de date, care s
permit acumularea i consultarea materialului tiinifc n domeniu, sub form de
cri, softuri etc.;
crearea unui laborator de testare a oMG i a produselor alimentare derivate
din acestea;
efectuarea cercetrilor ce in de evaluarea riscurilor pentru sntatea omului i
pentru mediu, asociate introducerii oMG n ecosistem.
142
Recent a ieit de sub tipar manualul Biologie molecular destinat studenilor care
studiaz la specialitatea biologie molecular. n lucrare sunt abordate diferite aspecte
legate de domeniul genetica molecular, ingineria genetic, mbtrnirea organismelor,
transducia semnalelor etc.
n urma colaborrii cu Dr. Martha Orozco-Cardenas, directorul Centrului de
Transformare Genetic a Universitii din California-Riverside (CTGUCR), SUA,
colaboratorii LSB (prof. Duca M., Dr. Port A., Dr. Glijin A.) au efectuat stagieri
pentru nsuirea metodelor de obinere i testare a PMG, iar rezultatele obinute sunt
refectate n publicaiile comune. Materialul biologic (tutun MG, ce conine genele
leafy i bar) oferit de ctre CTGUCR este utilizat ca test de referin n analize i
efectuarea cercetrilor fundamentale cu PMG n LSB, iar 13 linii de tutun transgenic
Nicotiana tabacum L., var. Xanthi (2n=48) pentru procesul de instruire a studen-
ilor i implementarea tehnicilor de testare a PMG.
Activitatea LSB a fost iniiat n 2002 prin procurarea de ctre USM a unui
minilaborator PCR, Biokom, Rusia. Dotarea cu echipament (fg. 8.1.) i reageni a
continuat n baza temelor de cercetare (Identifcarea i implementarea unor mar-
keri moleculari n ameliorarea forii-soarelui(32006C), 2003-2004; Determina-
rea gradului de hibridare n F
1
i puritii genetice a liniilor de foarea-soarelui n
baza diferitor tehnici fziologo-biochimice i moleculare de cercetare (2B17) din
cadrul Programului de Stat Biotehnologii agricole, fertilitatea solului i securitatea
alimentar, 2006-2010) i a proiectelor naionale i internaionale (BPP-0406 Tes-
tarea i identifcarea unor genotipuri de foarea-soarelui cu rezisten maxim fa
de Orobanche cumana, MTFP-04-08, MTFP-015-05, MTFP-1017A, MERL-1300
fnanate de CRDF/MRDA. n cadrul LSB sunt utilizate o serie de metode pentru
testarea PMG, bazate pe PCR cu primeri specifci i screeningul general, care sunt
validate la nivel internaional. n proces de implementare se af metoda ELISA
(fg. 8.1., G).
n prezent n laborator se efectueaz analize de testare a PMG bazate pe:
selecia plantelor rezistente fa de erbicide (biotestul fenotipic al expresiei
transgenei);
detecia produsului de expresie a transgenelor (proteinele GFP, PAT);
tehnica PCr, cu utilizarea primerilor-screening: 35S - CaMV i nos-termi-
nator.
143
Figura 8.1. Echipamentul din cadrul LSB
150
150
150
150
150
Figura 8.1. echipamentul din cadrul LSB
144
8.2. Detecia PMG la nivel de expresie fenotipic a transgenelor
Marea majoritate a culturilor agricole MG (soia, tutun, tomate, cartof, orez, porumb etc.) sunt
tolerante la erbicide sistemice, care conin n calitate de substan activ glufosinatul (de amoniu),
fosfinotricina (PPT) sau bialaphos-ul (fig. 8.2.), comercializate sub denumirea de Basta, Buster,
Dash etc. Actualmente, acest erbicid se aplic n combaterea buruienilor mono- i dicotelidonate n peste
40 de ri. n Republica Moldova, erbicidul a fost autorizat la 30.11.1995 cu numrul de nregistrare 0044.
A B
Figura 8.2. Structura fosfinotricinei (A) i bialaphos-lui (B)
(www.plant-tc.coafes.umn.edu/maize-tc/pptbial.jpg)
L-izomerul PPT este un analog structural al acidului L-glutamic (glutamatului) i neselectiv inhib
enzima glutaminsintetaza (GS) bacteriilor i plantelor superioare (fig. 8.3.). Bialaphos-ul (bialanil PPT)
este un antibiotic tripeptid, ce const dintr-un rest de PPT i dou de L-alanin. n celul, tripeptidul este
scindat de ctre peptidaze ce elibereaz forma activ a PPT care i inactiveaz enzima GS (fig. 8.3.).
GLN -cetoglutart
sau
sau
Figura 8.3. Mecanismul inhibrii enzimei GS de ctre PPT
151
(HThttp://www.uky.edu/~dhild/biochem/24/lect24.htmlTH )
GLU
GLU
L-fosfinotricina
Marea majoritate a culturilor agricole MG (soia, tutun, tomate, cartof, orez, porumb
etc.) sunt tolerante la erbicide sistemice, care conin n calitate de substan activ glu-
fosinatul (de amoniu), fosfnotricina (PPT) sau.bialaphos-ul (fg. 8.2.), comercializate
sub denumirea de Basta, Buster, Dash etc. Actualmente, acest erbicid se aplic n
combaterea buruienilor mono- i dicotelidonate n peste 40 de ri. n Republica Moldo-
va, erbicidul a fost autorizat la 30.11.1995 cu numrul de nregistrare 0044.
Figura 8.2. Structura fosfnotricinei (A) i bialaphos-lui (B)
www.plant-tc.coafes.umn.edu/maize-tc/pptbial.jpg
L-izomerul PPT este un analog structural al acidului L-glutamic (glutamatului)
i neselectiv inhib enzima glutaminsintetaza.(GS) bacteriilor i plantelor superioa-
re (fg. 8.3.). Bialaphos-ul (bialanil PPT) este un antibiotic tripeptid, ce const dintr-
un rest de PPT i dou de L-alanin. n celul, tripeptidul este scindat de ctre pepti-
daze, ce elibereaz forma activ a PPT, care i inactiveaz enzima GS (fg. 8.3.).
http://www.uky.edu/~dhild/biochem/24/lect24.html
Marea majoritate a culturilor agricole MG (soia, tutun, tomate, cartof, orez, porumb etc.) sunt
tolerante la erbicide sistemice, care conin n calitate de substan activ glufosinatul (de amoniu),
fosfinotricina (PPT) sau bialaphos-ul (fig. 8.2.), comercializate sub denumirea de Basta, Buster,
Dash etc. Actualmente, acest erbicid se aplic n combaterea buruienilor mono- i dicotelidonate n peste
40 de ri. n Republica Moldova, erbicidul a fost autorizat la 30.11.1995 cu numrul de nregistrare 0044.
A B
Figura 8.2. Structura fosfinotricinei (A) i bialaphos-lui (B)
(www.plant-tc.coafes.umn.edu/maize-tc/pptbial.jpg)
L-izomerul PPT este un analog structural al acidului L-glutamic (glutamatului) i neselectiv inhib
enzima glutaminsintetaza (GS) bacteriilor i plantelor superioare (fig. 8.3.). Bialaphos-ul (bialanil PPT)
este un antibiotic tripeptid, ce const dintr-un rest de PPT i dou de L-alanin. n celul, tripeptidul este
scindat de ctre peptidaze ce elibereaz forma activ a PPT care i inactiveaz enzima GS (fig. 8.3.).
GLN -cetoglutart
sau
sau
151
(HThttp://www.uky.edu/~dhild/biochem/24/lect24.htmlTH )
GLU
GLU
L-fosfinotricina
145
Tolerana la glufosinat a plantelor modifcate genetic este determinat de trans-
genele pat sau bar, care codifc enzima fosfnotricin-N-acetiltransferaza (PAT, E.C.
2.3.1.-), ce neutralizeaz erbicidul prin acetilare (fg. 8.4.).
Figura 8.4. Structura chimic a glufosinatului i mecanismul
de neutralizare a acestuia de ctre enzima PAT
Plantele susceptibele, non-OMG, find tratate cu acest erbicid, prezint o serie
de simptome de afectare a creterii i dezvoltrii caracteristice, care pot f depistate
cu uurin la plantele cultivate in vivo (stropiri foliare) sau cultivate in.vitro (prin
suplimentarea mediului nutritiv cu erbicidul n cauz).
Astfel, n cadrul laboratorului Securitate Biologic este implementat metoda
fenotipic de testare a PMG bazat pe detecia genei rezistenei la erbicidul Basta.
Biotestul plantelor de tutun transgenic, cultivate in.vitro n prezena a 0,005 mM er-
bicid Basta, la temperatura de 21 - 22C, fotoperioada 8 ore a pus n eviden diferite
niveluri de susceptibilitate a plantelor de tutun nemodifcate genetic fa de erbicid
exprimat prin inhibarea germinrii seminelor i ncetinirea creterii plantulelor,
inducnd necroza i moartea esuturilor (fg. 8.5. i fg. 8.6.).
Figura 8.5. Germinarea seminelor de tutun nemodifcat (control) i modifcat
genetic (N 7A, 30, 13, 19A i 5), ce conine gena bar, cultivate in vitro n prezena
erbicidului Basta (0,005 mM).
acetil
Fosfinotricin
N-acetiltransferaza
Glufosinat (fosfinotricina)
N-acetil-L-glufosinat
Tolerana la glufosinat a plantelor modificate genetic este determinat de transgenele pat sau bar
care codific enzima fosfinotricin-N-acetiltransferaza (PAT, E.C. 2.3.1.-) ce neutralizeaz erbicidul prin
acetilare (figura 8.4.).
acetil
Fosfinotricin
N-acetiltransferaza
Figura 8.4. Structura chimic a glufosinatului i mecanismul de
neutralizare a acestuia de ctre enzima PAT
Glufosinat (fosfinotricina)
N-acetil-L-glufosinat
Plantele susceptibele, non-OMG fiind tratate cu acest erbicid prezint o serie de simptome de
afectare a creterii i dezvoltrii caracteristice, care pot fi depistate cu uurin la plantele cultivate in
vivio (stropiri foliare) sau cultivate in vitro (prin suplementarea mediului nutritiv cu erbicidul n cauz).
Astfel, n cadrul laboratorului Securitatea biologic este implementat metoda fenotipic de testare
a PMG bazat pe detecia genei rezistenei la erbicidul Basta. Biotestul plantelor de tutun transgenic,
cultivate in vitro n prezena a 0,005 mM erbicid Basta, la temperatura de 21-22C, fotoperioada 8 ore a
pus n eviden diferite nivele de susceptibilitate a plantelor de tutun nemodificate genetic fa de erbicid
exprimat prin inhibarea germinrii seminelor i ncetinirea creterii plantulelelor, inducnd necroza i
moartea esuturilor (fig. 8.5. i fig. 8.6.).
Figura 8.5. Germinarea seminelor de tutun nemodificat i modificat genetic ce
conine gena bar cultivate in vitro n prezena erbicidului Basta (0,005 mM).
Control
N7A
3:1
N19A
1:1
N30
3:1
N5
13:1
N13
3:1
152
146
Figura 8.6. nlimea plantulelor de tutun cultivate in vitro
pe mediul MS, ce conine Basta (0,005 mM), peste 14 zile
Efecte de ftotoxicitate similare care demonstreaz efciena utilizrii acestui tip
de analize n testarea preventiv a PMG reprezint i aplicarea exogen a erbicidului
Basta asupra plantelor n faza de rsad. La aceast etap, erbicidul (n concentraie
100 g/ml, concentraie recomandat pentru testarea i selecia plantelor de tutun,
care poart gena pat sau bar (http://www.cambia.org/daisy/cambia/1204.html) in-
duce cloroza i necroza esuturilor soldate cu moartea ulterioar doar a plantelor
care nu posed rezisten fa de acest erbicid, adic a plantelor genomul crora nu
conine transgena bar (fg. 8.7.).
Figura 8.7. Liniile de tutun susceptibile la
aciunea erbicidului Basta (100 g/ml)
Prin urmare, rezultatele obinute au confrmat posibilitatea i veridicitatea uti-
lizrii acestei metode n detectarea PMG rezistente la erbicide.
Efecte de fitotoxicitate similare, care demonstreaz eficiena utilizrii acestui tip de analize n
testarea preventiv a PMG reprezint i aplicarea exogen a erbicidului Basta asupra plantelor n faza de
rsad. La aceast etap, erbicidul (n concentraie 100 g/ml, concentraie recomandat pentru testarea i
selecia plantelor de tutun care poart gena pat sau bar (http://www.cambia.org/daisy/cambia/1204.html)
induce cloroza i necroza esuturilor soldate cu moartea ulterioar doar a plantelor care nu posed
rezisten fa de acest erbicid, adic a plantelor, genomul crora nu conine transgena bar (fig. 8.7.).
1,53
1,4
1,9
1,83
0,43 0,43
0,37
0,33
0,5
0,47
0,2
0,6
1
1,4
1,8
2
7
A
1
3
3
0
1
0 5
1
4
1
9
A
2
4 8
h, cm
Variante
nalt tolerante
slab tolerante
Figura 8.6. nlimea plantulelor de tutun cultivate in vitro
pe mediul MS ce conine Basta (0,005 mM), peste 14 zile
153
Necroza tulpinii
Apariia necrozei esuturilor indic lipsa rezistenei plantelor
fa de erbicidului Basta
Control 19A 14 24 8 10
Figura 8.7. Liniile de tutun, susceptibile la
aciunea erbicidului Basta (100g/ml)
Cloroza esuturilor
Apariia necrozei esuturilor indic
lipsa rezistenei plantelor la erbicidul Basta
Necroza tulpinii
Control 19A 14 24 8 10
147
8.3. Identifcarea unor transgene la nivel de proteine
Ca rezultat al expresiei transgenelor are loc biosinteza de. novo a proteinelor
specifce, care modifc structural sau funcional procesele metabolice celulare, con-
tribuind la apariia unor noi caractere. Detecia diferenelor (prezena unor compui
noi) ntre paternul proteic al PMG i cel al plantelor nemodifcate genetic se rea-
lizeaz prin SDS-PAAGE, iar ulterior, pentru identifcarea acestora, se recurge la
purifcare, fracionare i analiz prin masspectrometrie a proteinei de interes.
Analiza unor proteine codifcate de transgene n scop de detecie a prezenei
transgenelor a fost implementat n cadrul LSB ca rezultat al cercetrilor efectuate
asupra proteomului diferitor linii de tutun transgenic cu trei alogene (CsLFY, bar i.
gfp), incluse n genom.
Rezultatele fracionrii n gel de poliacrilamid a proteinelor totale, uor so-
lubile, izolate din frunzele liniilor de tutun transgenic.2, 7A, 13 i 30, au relevat un
profl electroforetic al PMG diferit de cel al plantelor-martor, prin prezena poli-
peptidelor cu Mr 44 kDa i 23 kDa, care pot f considerate ca produse de expresie
ale genei CsLFY i respectiv genei bar (fg. 8.8.). Schema de prelevare a probelor a
permis efectuarea unei concluzii suplimentare, privind localizarea spaial a expre-
siei transgenelor prin identifcarea polipeptidelor, analizate n limbul foliar, peiol,
tulpin i rdcin (fg. 8.8.).
Figura 8.8. evidenierea polipeptidelor cu Mr 44 kDa i 23 kDa
n diferite organe ale tutunului transgenic i control
M markeri proteici, L limb, P peiol, T tulpin, R rdcin
O alt protein-marker, detectat n PMG efectuat n cadrul laboratorului, a
fost produsul expresiei genei gfp n genotipurile de tutun transgenic TM-1 i TM-2
ce expresau gena gfp, a relevat prezena benzii cu Mr 27 kDa, care teoretic aparine
proteinei GFP i care lipsete n tutunul nemodifcat genetic (control) (fg. 8.9.).
Prin urmare, rezultatele obinute au confirmat posibilitatea i veridicitatea utilizrii acestei metode
n detectarea PMG rezistente la erbicide.
8.3. Identificarea unor transgene la nivel de proteine
Ca rezultat al expresiei transgenelor are loc biosinteza de novo a proteinelor specifice, care modific
structural sau funcional procesele metabolice celulare, contribuind la apariia unor noi caractere. Detecia
diferenelor (prezena unor compui noi) ntre paternul proteic al PMG i cel al plantelor nemodificate
genetic se realizeaz prin SDS-PAAGE, iar ulterior pentru identificarea acestora se recurge la purificare,
fracionare i analiz prin masspectrometrie a proteinei de interes.
Analiza unor proteine codificate de transgene n scop de detecie a prezenei transgenelor a fost
implementat n cadrul LSB ca rezultat al cercetrilor efectuate asupra proteomului diferitor linii de tutun
transgenic cu trei alogene (CsLFY, bar i gfp), incluse n genom.
Rezultatele fracionrii n gel de poliacrilamid a proteinelor totale, uor solubile, izolate din
frunzele liniilor de tutun transgenic 2, 7A, 13 i 30, au relevat un profil electroforetic al PMG diferit de
cel al plantelor-martor, prin prezena polipeptidele cu Mr 44 kDa i 23 kDa, care pot fi considerate ca
produse de expresie ale genei CsLFY i respectiv genei bar (fig. 8.8.). Schema de prelevare a probelor a
permis efectuarea unei concluzii suplimentare, privind localizarea spaial a expresiei transgenelor prin
identificarea polipeptidelor, analizate n limbul foliar, peiol, tulpin i rdcin (fig. 8.8.).
kDa
200
150
120
100
95
70
60
50
40
30
25
20
15
M L P T R L P T R
44 kDa
CsLFY
Linia 23 Control
Figura 8.8. Evidenierea polipeptidelor cu Mr de 44 kDa i 23 kDa
n diferite organe ale tutunului transgenic i control
M markeri proteici, L limb, P peiol, T tulpin, R-rdcin
23 kDa
PAT
154
148
Figura 8.9. electroforegrama proteinelor izolate
din tutunul MG (1 i 3) i control (2)
Datele obinute pot f considerate ca un argument n favoarea utilizrii acestei
metode n calitate de detecie a prezenei unor transgene n genomul vegetal prin
produsul de expresie proteinele.
Recent, a fost procurat utilajul necesar screening-ului la nivel de proteine prin
tehnologia ELISA. Acest procedeu va lrgi posibilitile LSB n testarea PMG prin
metode validate i aprobate la nivel internaional.
8.4. Screening-ul PMG prin PCr
Actualmente, potenialul LSB permite realizarea screening-ului PMG bazat
pe PCR cu utilizarea primerilor necesari pentru identifcarea urmtoarelor secvene
specifce: P-35S CaMV, NOS-T, bar, nptII, GUS, LacZ, epsps-cp4, Cry IA, higro-
micinei (tab. 8.1.). n calitate de teste pozitive servete ADN-ul liniilor de porumb
MG GA21, NK603 i CBH351 (Fluka).
Secvene 35S CaMV i NOS (www.coresta.org) sunt prezente n 86% din cul-
turile aprobate de PMG (Ahmed, 2002; Kuiper, 1999). Abilitatea de a depista aceste
secvene permite detectarea majoritii culturilor de PMG.
Implementarea i optimizarea metodei de testare a PMG dup secvenele NOS i
35S CaMV n conformitate cu posibilitile laboratorului a inclus ca probe (matrice):
ADN-ul genomic extras din plantulele de porumb (oferit pentru analiz de ctre fabri-
ca de amidon din Tighina) i tomate (soi Gloria), crescute n condiii de laborator, la
temperatura 25-27C, timp de 22 zile, precum i material prelevat din fructe, procurate
de la pia: roii (din Bcioi i Ialoveni) i cartof (Criuleni). Ca test pozitiv a servit
ADN-ul liniei de porumb GA21, care conine secvena NOS-terminator.
O alt protein marker, detectat n PMG efectuat n cadrul laboratorului a fost produsul expresiei
genei gfp n genotipurile de tutun transgenic TM-1 i TM-2 ce expresau gena gfp a relevat prezena benzii
cu Mr de 27 kDa care teoretic aparine proteinei GFP i care lipsete n tutunul nemodificat genetic
(control) (fig. 8.9.).
Figura 8.9. Electroforegrama proteinelor izolate din
tutunul MG (1 i 3) i control (2)
27 kDa
1 2 3
Datele obinute pot fi considerate ca un argument n favoarea utilizrii acestei metode n calitate de
detecie a prezenei unor transgene n genomul vegetal prin produsul de expresie - proteinele.
Recent, a fost a fost procurat utilajul necesar screening-ului la nivel de proteine prin tehnologia
ELISA. Acest procedeu va lrgi posibilitile LSB n testarea PMG prin metode validate i aprobate la
nivel internaional.
Actualmente, potenialul LSB permite realizarea screeningului PMG bazat pe PCR cu utilizarea
primerilor necesari pentru identificarea urmtoarelor secvene specifice: P-35S CaMV, NOS-T, bar, nptII,
GUS, LacZ, epsps-cp4, Cry IA, higromicinei (tab. 8.1.). n calitate de teste pozitive servete ADN-ul
liniilor de porumb MG GA21, NK603 i CBH351 (Fluka).
Secvene 35S CaMV i NOS (www.coresta.org) sunt prezente n 86% din culturile aprobate de
PMG (Ahmed, 2002; Kuiper, 1999). Abilitatea de a depista aceste secvene permite detectarea majoritii
culturilor de PMG.
155
149
Tabelul 8.1.
Primerii sens i antisens pentru secvena NoS-terminator, 35S CaMV i bar
Primer Secvena de nucleotide Amplicon
NOS-sens GAATCCTGTTGCCGGTCTT
170 pb
NOS-antisens TTGCGCGCTATATTTTGTTTT
35S CaMV-sens CATGTTGGCAAGCTGCTCTA
209 pb
35S CaMV-antisens TATCCGCTCACAATTCCACA
35S CaMV-sens TGACAGATAGCGGGCAATG
175 pb
35S CaMV-antisens CAACCACGTCTTCAAAGCAA
Bar-sens GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
242 pb
Bar-antisens AGTCGACCGTGTACGTCTCC
NPTII AGTGACAACGTCGAGCACAG
176 pb
NPTII AGACAATCGGCTGCTCTGAT
Higromicin TCGCTAAACTCCCAATGTC
163 pb
Higromicin GCGAATCTCGTGCTTTC
GUS CTGATAGCGCGTGACAAAAA
208 pb
GUS GGCACAGCACATCAAAGAGA
CRY1A ACCATCAACAGCCGCTACAACGACC
184 pb
CRY1A TGGGGAACAGGCTCACGATGTCCAG
EPSPS TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGC
356 pb
EPSPS CCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGT
Rezultatele analizei PCR au atestat prezena secvenei NOS-terminator n pro-
ba-marker GA21 prin apariia unui amplicon de 170 pb i lipsa acestuia n celelalte
probe analizate (fg. 8.10.). Ca markeri moleculari au servit secvenele de 50-3000
pb (DNA Step Ladder, Sigma).
Figura 8.10. rezultatele screening-ului plantelor
dup secvena NoS-terminator
M marker, 1 test negativ, 2 GA-21 (test pozitiv), 3 porumb,
4 tomate Gloria, 5 tomate, Bcioi, 6 tomate, Ialoveni, 7 cartof Irga
200 pb
100 pb
Figura 8.10. Rezultatele screening-ului plantelor dup secvena NOS-teminator
M marker, 1 test negativ, 2 GA-21 (test pozitiv), 3 porumb, 4 tomate Gloria,
5 tomate, Bcioi, 6 tomate, Ialoveni, 7 cartof Irga
M 1 2 3 4 5 6 7
170 pb
Screening-ul dup promotorul 35S CaMV a produselor vegetale derivate de la tomate (fructe) i
cartof (tuberculi) procurate de la un supermarket din Chiinu nu a atestat prezena acestuia (fig. 8.11). n
calitate de control pozitiv a fost analizat ADN-ul extras de la diferite linii de plante transgenice. Produsul
de amplificare de 209 pb (amplicon cu dimensiune prevzut), care atest prezena promotorului 35S
CaMV, a fost atestat doar n dou cazuri linia MG 10 i linia de TM-1. n produsele alimentare secvena
promotor 35S CaMV nu a fost atestat.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 8.11. Electroforgrama ampliconilor PCR cu primerii 35S CaMV
(1-M; 2- test negativ; 3- linia de tutun Nr 6; 4- linia de tutun MG Nr 10; 5- tutun MG Nr 2;
6- linia TM-1 ; 7- tomate 1; 8 tomate 2; 9- cartof 1; 10- cartof 2)
pb
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
209 pb
Conform acestei analize de screening, produsele vegetale comercializate pe piaa republicii
Moldova (fructe de tomate i tuberculi de cartof) utilizate n calitate de matrice nu conin transgene n
genom.
157
200 pb
100 pb
Figura 8.10. Rezultatele screening-ului plantelor dup secvena NOS-teminator
M marker, 1 test negativ, 2 GA-21 (test pozitiv), 3 porumb, 4 tomate Gloria,
5 tomate, Bcioi, 6 tomate, Ialoveni, 7 cartof Irga
M 1 2 3 4 5 6 7
170 pb
Screening-ul dup promotorul 35S CaMV a produselor vegetale derivate de la tomate (fructe) i
cartof (tuberculi) procurate de la un supermarket din Chiinu nu a atestat prezena acestuia (fig. 8.11). n
calitate de control pozitiv a fost analizat ADN-ul extras de la diferite linii de plante transgenice. Produsul
de amplificare de 209 pb (amplicon cu dimensiune prevzut), care atest prezena promotorului 35S
CaMV, a fost atestat doar n dou cazuri linia MG 10 i linia de TM-1. n produsele alimentare secvena
promotor 35S CaMV nu a fost atestat.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 8.11. Electroforgrama ampliconilor PCR cu primerii 35S CaMV
(1-M; 2- test negativ; 3- linia de tutun Nr 6; 4- linia de tutun MG Nr 10; 5- tutun MG Nr 2;
6- linia TM-1 ; 7- tomate 1; 8 tomate 2; 9- cartof 1; 10- cartof 2)
pb
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
209 pb
Conform acestei analize de screening, produsele vegetale comercializate pe piaa republicii
Moldova (fructe de tomate i tuberculi de cartof) utilizate n calitate de matrice nu conin transgene n
genom.
157
Screening-ul dup promotorul 35S CaMV a produselor vegetale derivate de la
tomate (fructe) i cartof (tuberculi), procurate de la un supermarket din Chiinu,
nu a atestat prezena acestuia (fg. 8.11). n calitate de control pozitiv a fost analizat
ADN-ul extras de la diferite linii de plante transgenice. Produsul de amplifcare de
209 pb (amplicon cu dimensiune prevzut), care atest prezena promotorului 35S
CaMV, a fost atestat doar n dou cazuri linia MG 10 i linia de TM-1. n produsele
alimentare secvena promotor 35S CaMV nu a fost atestat.
Figura 8.11. electroforgrama ampliconilor
PCr cu primerii 35S CaMV
(1 - M; 2 test negativ; 3 linia de tutun Nr 6; 4 linia de tutun MG Nr 10;
5 tutun MG Nr 2; 6 linia TM-1 ; 7 tomate 1; 8 tomate 2;
9 cartof 1; 10 cartof 2)
Conform acestei analize de screening, produsele vegetale comercializate pe
piaa Republicii Moldova (fructe de tomate i tuberculi de cartof) utilizate n calitate
de matrice nu conin transgene n genom.
151
GLOSAR DE TERMENI
Agaroz gel coloidal format de ctre o polizaharid (agar-agar) extras
din alge roii. Este utilizat pentru obinerea de medii de
cultur solide (geloze), sau ca faz staionar n cromatografe
i electroforez.
Agricultur durabil agricultur care presupune creterea sau meninerea produciei
agricole timp ndelungat, odat cu conservarea resurselor
naturale i a mediului.
Alel (alelomorf) form alternativ a unei gene care se gsete n acelai locus
pe cromozomi omologi.
Alele multiple existena a mai mult de dou alele pentru un locus specifc
dintr-o populaie.
Alogene gene de alt origine introduse ntr-un organism (transgen).
Aminoacid un compus organic care conine att gruparea carboxil
(-COOH), ct i grupri amino (-NH
2
), reprezentnd
monomerul polipeptidelor.
Amplifcarea genelor proces din cadrul celulelor tumorale, n care se produc copii
multiple ale anumitor gene; echivalentul citogenetic este
reprezentat de regiunile colorate omogen i cromozomii
dublu-minute.
Amplifcator secvena de ADN care amplifca transcripia unei gene
(enhancer). Dispozitiv destinat pentru efectuarea reaciei PCR
(thermocycler).
Amprenta ADN modelul unui tandem de repetri ADN hipervariabil ale unei
secvene din nucleu, unic pentru fecare individ.
Amprentare fenomen n care o gen sau o regiune a unui cromozom
prezint exprimare diferit n funcie de printele de la care
provine.
Amprentare genomic expresia diferit a materialului genetic, dependent de sexul
printelui transmitor.
Analiz cromozomial procesul de numrare i analiz a modului de bandare a
cromozomilor unui individ.
Aneuploid un numr de cromozomi care nu este un multiplu exact al
numrului haploid, de exemplu, 2N-1 sau 2N+1, unde N este
numrul haploid de cromozomi.
Antibiotice substane care mpiedic dezvoltarea sau omoar
microorganismele n a cror celul ptrund, prin perturbarea
anumitor ci metabolice, ca de ex. anabolismul componentelor
peretelui celular. Sunt produse de ctre microorganisme.
Ex. penicilina, streptomicina, tetraciclina, eritromicina,
kanamicina.
Anti-codon tripletul complementar din molecula de ARNt.
Anticorp (imunoglobulina) protein seric, format ca rspuns la un stimul antigenic i
care reacioneaz specifc cu antigenul respectiv.
Anticorpi monoclonali anticorpi omogeni, care descind dintr-o clon celular unic i
recunosc numai o anumit structur chimic specifc. Putnd f
produi n cantiti mari i avnd o specifcitate deosebit, sunt
mult utilizai n scopuri medicale. Se obin prin culturi de celule
sau din ascite induse la oareci.
Antigen substan care induce producerea de anticorpi.
Antiparalel orientare opus a celor dou spirale ale unui duplex ADN,
unul n direcia de la 3 la 5, cellalt n direcia de la 5 la 3.
152
Antiser ser sangvin care conine anticorpi provenii de la animale inoculate
cu antigen, care prin administrare la alte animale produce imunitate
pasiv.
Apoptoz involuia sau moartea programat a celulelor dintr-un esut n
dezvoltare sau dintr-un organ al unui corp.
ARN mesager (ARNm) o singur caten spiralat complementar cu una din catenele
ADN-ului dublu catenar, sintetizat n procesul de transcripie
i care transmite informaia genetic din ADN la ribozomi
pentru sinteza proteinelor.
ATP adenozin-trifosfat, nucleotid constituit dintr-o baz azotat
adenin, o pentoz riboza i trei grupri fosfat, ataate de al
cincilea atom de carbon. Prin hidroliza legturilor de fosfat se
elibereaz cantiti mari de energie. Este transportator de acid
fosforic n reaciile de transfosforilare.
Autozomi cromozomii non-sex. Genotipul uman posed 22 autozomi.
Bacteriofag virus care infecteaz bacteriile.
Baz azotat prescurtare de la baze azotate din molecule de acid nucleic
(A = Adenin; T = Timin; U = Uracil; C = Citozin; G =
Guanin).
Biblioteca ADN colecie de molecule de ADN recombinante de la o
surs specifc, de exemplu ADN genomic sau ADN
complementar.
Bioetic tiina care, utiliznd o metodologie interdisciplinar, are
drept obiect examenul sistematic al comportamentului uman
n domeniul tiinelor vieii i al sntii, examinat n lumina
valorilor i principiilor umane.
Bioinginerie ansamblu de concepte, metode i mijloace materiale prin care
se realizeaz biotehnologiile.
Caractere input caractere care genereaz valoare, asigurnd creterea produciei
prin protejarea culturilor (ex. rezisten la erbicide, insecte,
virusuri etc.).
Caractere output produse vegetale cu nsuiri nutritive ameliorate (ex. modifcri
ale coninutului de amidon, proteine, uleiuri, modifcarea
nsuirilor de panifcaie la gru etc.).
Cariograma aranjarea cromozomilor n ordinea descresctoare a mrimii
acestora.
Cariotip aranjarea cromozomilor unui individ conform schemei
standard; se pot evidenia astfel numrul, mrimea, forma
i modelul de benzi al cromozomilor, permind astfel
diagnosticul citogenetic.
Ce abreviere de la Comunitatea European.
Celule blastice celule sangvine afate n stadiu timpuriu al dezvoltrii celulare,
nainte de apariia caracteristicilor defnitive ale celulei.
Celule competente capacitatea celulelor bacteriene de a capta ADN exogen i de
a-l integra n propriul lor genom, celula-gazd devenind o ce-
lul transformat.
Celule eucariote din gr. eu. adevrat, karyion nucleu celule difereniate
cu nucleu bine defnit, ADN organizat n cromozomi, perei
celulari cu structur complex i variat (celuloz la plante,
chitin la unele specii de insecte), mitocondrii i cloroplaste,
organite celulare difereniate. Celulele eucariote se divid
prin mitoz i meioz. Organisme eucariote sunt plantele i
animalele.
Celule germinative celule ale corpului care transmit informaia genetic generaiei
urmtoare.
153
Celule procariote din gr. pro.nainte, karyion nucleu celule fr nucleu, cu
o structur genetic simpl, un flament de ADN n citoplasm,
cu perete celular format din zaharuri i peptide. Principalele
organisme procariote sunt bacteriile, algele cianofte. Se
nmulesc asexuat.
Celule somatice celulele non-germinative ale corpului. Ex. celulele epiteliale,
nervoase, musculare.
Celule totipotente celule nedifereniate sau difereniate, crora li se poate
reorienta diferenierea printr-un aport de factori de cretere n
mediul lor de dezvoltare. Fenomenul de totipoten mpreun
cu fenomenul de difereniere asigur regenerarea plantelor.
Centimorgan unitate folosit la msurarea distanelor pe harta genic
a cromozomilor, echivalent cu o ans de recombinare
(ncruciare) de 1%.
Centrifugare tehnic de sedimentare, care folosete acceleraia centrifug
produs ntr-un rotor, permind separarea fraciilor solide sau
moleculelor organice dintr-o suspensie.
Centromer punctul n care se unesc cele dou cromatide ale unui
cromozom, precum i regiune a cromozomului care se ataeaz
de fusul de diviziune n timpul diviziunii celulare.
CI abreviere, de la Consumers International, Federaia Mondial
a Asociaiilor de Consumatori.
Citocinetic divizarea citoplasmei pentru a forma dou celule-fice n meioz
i mitoz.
Citogenetic ramur a geneticii care se ocup, n principal, de studiul
cromozomilor.
Citogenetic de interfaz studiul cromozomilor n decursul interfazei, de obicei prin
metoda FISH.
Citoplasm - substana de baz a celulei n care se af nucleul, reticulul
endoplasmatic, mitocondriile etc.
Clon grup de celule, derivate dintr-o singur celul prin mitoze
repetate i avnd aceeai informaie genetic.
Clonare amplifcarea fragmentelor ADN, a genelor.
Cod genetic triplete de nucleotide ale ADN-ului, care codifc diferii
aminoacizi ai proteinelor.
Cod tripletic o serie de trei baze azotate din molecula de ADN sau ARN,
care codifc un aminoacid specifc.
Codominan cazul n care ambele alele sunt exprimate la un individ
heterozigot.
Codon secvena de trei nucleotide adiacente, care codifc un
aminoacid sau terminarea unui lan.
Codon terminator unul din cei trei codoni (UAG, UAA i UGA), care determin
oprirea sintezei proteinelor n procesul de translaie.
Colonie grupare de celule, derivat dintr-una singur, care se dezvolt
n/ sau pe un mediu solid.
Cromatid n timpul diviziunii celulare, fecare centromer se divide,
longitudinal, n dou spirale sau cromatide, inute la un loc
de centromer.
Cromatin nfurarea teriar a nucleosomilor cromozomilor cu proteine
asociate.
Cromozom artifcial
Yeast
vector care conine secvene ADN pentru centromer, telomer
i locusuri pentru replicare cromozomial autonom; permite
clonarea fragmentelor mari de ADN cu o lungime de pn la 2 - 3
milioane perechi de baze.
154
Cromozomi corpusculi de culoare nchis, de form fbrilar, afai n
nucleu, alctuii din ADN i proteine, care poart informaia
genetic.
Cromozomi omologi cromozomi care se mperecheaz n meioz i conin locusuri
identice.
Culturi Bt plante transgenice cu rezisten la insecte mediat de proteina
Bt de la Bacillus.thuringiensis. n celulele plantelor modifcate
genetic, care exprim o gen modifcat de la aceast bacterie,
se sintetizeaz o prototoxin inactiv care, dup ingerarea
ei de ctre larvele sensibile, este clivat de proteazele din
intestinul insectei ntr-un fragment activ. Toxina acioneaz
prin legarea de ctre receptorii de la suprafaa celulelor
intestinale blocndu-le funcionarea.
De novo traducere cuvnt cu cuvnt a termenului nou, opus termenului
ereditar.
Deleie tip de aberaie sau mutaie cromozomial la nivelul ADN-ului,
n care se pierde parial un cromozom, unul sau mai multe
nucleotide.
Denaturarea ADN proces reversibil de separare a celor dou catene de ADN sub
aciunea unor factori fzici (temperatur, pH etc.).
Diploid starea n care celula conine dou seturi de cromozomi; starea
normal a celulelor somatice la om n care numrul diploid
(2N) este 46.
Dogma central conceptul conform cruia informaia genetic este, de obicei,
transmis numai de la ADN sau ARN la protein.
Dominan caracteristic (trstur) exprimat la indivizi heterozigoi
pentru o alel specifc.
Dominant autosomal gen de pe unul din cromozomii autozomi (non-sex), care se
manifest n stare heterozigot.
efect de poziie efect pe care l are o gen n funcie de poziia sa n cromozom.
O gen care are activitate normal ntr-o regiune eucromatic
este inactivat sau i modifc efectul n ipoteza n care este
translocat n apropierea unei regiuni heterocromatice. Se
manifest mai multe tipuri de efect de poziie: variegat, difuz,
stabil.
efect pleiotropic totalitate a efectelor fenotipice ale unei singure gene
(mutante).
electroforez deplasarea particulelor cu sarcin electric printr-un
lichid staionar situat ntr-un cmp, care permite separarea
moleculelor pe baza vitezei de migrare determinat de sarcina,
volumul i forma lor.
electroporaie tehnic de utilizare a unui curent electric pulsatoriu de intensitate
mic pentru a fragiliza membrana unei celule n vederea fe a
transformrii ei cu fragmente de ADN - heterolog, fe a realizrii
de fuziuni ntre celule.
eLISA
(Enzyme.Linked.Immuno.
Sorbent Assay)
test de detectare a unei proteine, utiliznd un marker enzimatic
legat de un antigen sau anticorp.
embriogenez din gr. embryon embrion i genesis descenden
procese de formare i dezvoltare a embrionului; dezvoltarea
embrionului din zigot.
enzim proteina care acioneaz ca un catalizator n sistemele
biologice.
erbicid agent chimic care inhib selectiv dezvoltarea plantei (ex.
Basta).
155
ereditate mitocondrial transmiterea unei trsturi mitocondriale exclusiv pe linie
feminin.
eucariot celule cu nucleu bine difreniat.
eucromatine regiuni ale cromozomilor active genetic.
eugenie tiina care promoveaz mbuntirea nsuirilor ereditare
ale unei rase sau ale unei specii.
evaluarea riscurilor evaluarea efectelor, directe sau indirecte, imediate sau
ntrziate, ale introducerii n mediu a organismelor modifcate
genetic sau a prilor componente ale acestora asupra sntii
umane i mediului.
exon (secven exprimat) regiune a unei gene care nu este eliminat n transcripie,
formnd parte a ARN-mesager matur i deci codifcnd
structura primar a produsului genetic proteina.
expansiune creterea numrului secvenelor repetitive ale unor trinucleotide
n diferite boli, din cauza mutaiilor dinamice sau instabile.
expresia genei ansamblu de mecanisme care asigur transcripia unei gene
i traducerea ei ntr-o protein, reprezentnd o informaie
transportat, reglabil la diferite niveluri.
Factori de cretere substana care trebuie s fe prezent n mediul de cultur
pentru a permite multiplicarea celulelor sau substane implicate
n promovarea creterii anumitor tipuri de celule, esuturi sau
pri ale corpului n dezvoltare, de exemplu, factor de cretere
fbroblastic.
Fag abreviere pentru Bacteriofag.
Fals negativ cazuri afectate ratate de un test de diagnostic sau de
screening.
Fals pozitiv cazuri neafectate diagnosticate incorect ca afectate printr-un
test de diagnostic sau de screening.
Familii multigene gene cu similaritate funcional i/sau de secven.
FAo organizaiei pentru alimentaie i agricultur (Food and
Agriculture Organization); reprezint cea mai mare agenie
a Naiunilor Unite care coordoneaz agricultura, silvicultura,
piscicultura i dezvoltarea rural. Include 183 ri membre.
Fenocopie condiie cauzat de factori de mediu, dar care se aseamn cu
una genetic.
Fenotip trsturile (fzice, biochimice i fziologice) ale unui individ,
rezultate n urma interaciunii mediului cu genotipul.
Fitoestrogeni compui naturali, prezeni n multe produse alimentare
legumicole, care pot avea un impact considerabil asupra
sntii. Se consider c acetia au i efecte asupra estrogenilor
umani prin competiie cu cei mamari: estradiol i estron, prin
legarea la receptorii lor.
Flux de gene schimbul de gene la o rat joas ntre dou populaii, ca
rezultat al dispersiei gameilor sau migrrii indivizilor.
Fracie de recombinare msur a distanei care separ dou locusuri i care este
determinat de posibilitatea de apariie a unui crossing-over
ntre ele.
Gen o parte din molecula de ADN a unui cromozom, care conine
informaia genetic pentru sinteza unui lan polipeptidic
specifc.
156
Gene antisens gene care sunt orientate cu 180 fa de gena sens. ARNm
antimesager find complementar cu ARNm sens, se hibrideaz
i astfel neavnd loc translarea. Strategia antisens se aplic
pentru silenierea (inactivarea) expresiei unei gene.
Gen recesiv
autosomal
gen localizat pe unul din cromozomii autozomi, care se
manifest n stare homozigot.
Gen reglatoare o gen reglatoare sintetizeaz o substan represoare, care
inhib aciunea unei anumite gene operatoare.
Gen-marker secven detectabil de ADN. Detectarea se poate efectua fe
prin observarea acestui segment de ADN, care conine una
sau mai multe gene cu expresie fenotipic cunoscut (de ex.
rezistena la antibiotice), fe prin hibridarea acestei secvene
cu o sond complementar.
Genele raportoare spre deosebire de genele-marker, nu confer celulelor rezisten la
un anumit compus i codifc proteine care pot f detectate direct
sau catalizeaz reacii specifce ai cror produi pot f detectai
prin metode relativ simple. Cele mai importante gene-marker
sunt: gus, gfp, luc.
Genom totalitatea genelor purtate de o celul.
Genotip structura genetic a unui individ, totalitatea caracterelor.
Haploid condiia n care celula conine un set njumtit de cromozomi,
de ex., 23 la om. Acesta este numrul de cromozomi ntr-un
gamet.
Hapten molecul de mici dimensiuni lipsit, ca atare, de imunogenitate,
dar de dimensiuni mai mari denumit PURTTOR
(CARRIER).
Heterocromatin regiune a cromozomilor inert sau inactiv genetic.
Heteromorfsm polimorfsm structural ereditar al unui cromozom.
Heterozigot (= purttor) individ cu dou alele diferite pentru un locus specifc de pe o
pereche de cromozomi omologi.
Heterozigot dublu un individ care este heterozigot pentru dou locusuri diferite.
Hibridare molecular mperecherea unor lanuri de acizi nucleici complementari
(ADN i ARN), formarea zonelor de dublare constituind un
indiciu asupra complementaritii lanurilor. Rezultatul acestei
mperecheri este un hibrid ADN-ARN.
Hibridizare in situ prin
fuorescen (Fluorescent in situ
hybridisation FISH)
utilizarea unei singure secvene ADN, marcate fuorescent
pentru a se hibridiza cu secvena-int complementar existent
n cromozomi, permind vizualizarea ei la raze ultraviolete.
Himer individ cu dou populaii celulare cu genotipuri diferite.
Histocompatibilitate similaritatea testului la indivizi diferii. Nivelul de
histocompatibilitate prezint gradul de compatibilitate dintre
gazd i donor. Determinanii principali ai histocompatibilitaii
sunt antigenii leucocitari umani (HLA). Tipizarea HLA se
realizeaz ntre donorul de mduva osoas potenial i receptor,
pentru a determina ct de compatibili sunt. Cu ct este mai
mare gradul de compatibilitate, cu att mai puin vor reaciona
mduva donat i corpul gazdei unul mpotriva celuilalt.
Histone tip de proteine bogate n lizin i arginin, care se gsesc n
asociaie cu ADN-ul din cromozomi.
Homozigot individ care are dou alele identice ntr-un locus specifc de pe
o pereche de cromozomi omologi.
157
Idiogram reprezentare idealizat a unui obiect, de exemplu, idiograma
unui cariotip.
Inciden rata la care se petrec cazuri noi, raportat la 1000 de cazuri.
Incompatibilitate donorul i gazda sunt incompatibili dac gazda refuz grefa
de la donor.
Inginerie genetic ansamblul de concepte, metode i tehnici care permit efectuarea
de modifcri ale patrimoniului ereditar al unei celule prin
manipularea i transferul genelor, determinnd introducerea
unor anumite caracteristici ntr-o celul.
Instabilitate
cromozomial
prezena unor rupturi sau unor locuri optic goale n cromozomii
indivizilor care sufer de mai multe boli asociate cu un risc de
neoplazie.
Introducere deliberat
n mediu
orice introducere intenionat n mediu a unui organism
modifcat genetic sau a unei combinaii de astfel de organisme,
care se caracterizeaz printr-un grad nalt de securitate pentru
oameni i mediu, fr s fe necesare msurile specifce de
izolare.
Introducere pe pia furnizarea organismelor modifcate genetic sau a produselor
rezultate din acestea, contra plat sau gratuit, ctre teri.
Inversie tip de aberaie sau mutaie cromozomial, n care o parte
dintr-un cromozom sau dintr-o secven ADN are ordinea
inversat.
In vitro (din latin. . n sticl), experiene efectuate n afara
organismului, n condiii de laborator. Culturile de celule in.
vitro.se efectueaz pe medii artifciale.
In vivo experiene din cadrul sistemului viu.
Kilobaz unitate de msur pentru lungimea fragmentelor de ADN,
egal cu o mie de perechi de baze.
Lipozomi structuri de tip celular preparate artifcial, n care unul sau mai
multe straturi bimoleculare de fosfolipide conin unul sau mai
multe compartimente lichidiene, care pot include proteine.
Locus poziia ocupat de o gen sau marker genetic n cromozom.
Marker termen larg folosit pentru o grup de snge, polimorfsm
biochimic sau ADN, care, dac se demonstreaz c este legat
de locusul de interes al bolii, se poate folosi n diagnosticul
presimptomatic, determinarea statusului de purttor de gen
patologic i n diagnosticul prenatal.
Meioz tip de diviziune celular n care are loc formarea gameilor prin
njumtirea numrului de cromozomi din celula somatic,
astfel nct fecare gamet este haploid.
Microdeleie o mic deleie cromozomial, detectabil prin analiza
cromozomial de rezoluie nalt n prometafaz.
Minicromozomi cromozomi creai artifcial, ce conin elemente centromerice i
telomerice, care permit replicarea ADN-ului strin ca entitate
separat.
Mitoz tip de diviziune celular care are loc n replicarea celulelor
somatice.
Mutagen radiaie ionizant natural sau artifcial, ageni chimici sau
fzici, care induc modifcri n ADN.
Mutaie modifcare a materialului genetic, fe a unei singure gene, fe
a numrului sau a structurii cromozomului; mutaia care apare
n gamei (mutaie germinal) este ereditar, n timp ce mutaia
din celulele somatice (mutaie somatic) nu este ereditar.
158
MVKGID () Comisia intern care reglementeaz activitile n domeniul
ingineriei genetice.
Nucleotid monomerul acizilor nucleici ce const dintr-o baz azotat,
pentoz i un grup fosfat.
Nucleu organit bimembranar, specifc celulei de tip eucariot, care
conine cromozomii i nucleolul.
oeCD Organizaia pentru Cooperare Economic i Dezvoltare.
OMS Organizaia Mondial a Sntii.
ONU Organizaia Naiunilor Unite, organizaie internaional, care
include 185 de ri. A fost creat la 24 octombrie 1945 n scopul
asigurrii pcii i securitii la nivel internaional, promovrii
progresului social i drepturilor omului, dezvoltrii relaiilor de
prietenie dintre naiuni.
organogenez gr. organon; genesis..descenden formarea, diferenierea,
dezvoltarea organelor.
pb perechi de baze azotate (1000 pb = 1 kb (kilobaz).
reacia de polimerizare n
lan
(Polymerase Chain Reaction PCR) reacie repetitiv n
serie, care presupune utilizarea primerilor oligonucleotidici
i a enzimei ADN-polimeraza folosit la amplifcarea unei
secvene ADN de interes.
Pictarea cromozomial (Chromosome painting) variant a metodei de hibridizare
in situ, folosind probe marcate cu fuorocromi, care permit
colorarea diferit a fecrei perechi de cromozomi.
Pierderea heterozigoiei
constituionel (PHC)
pierderea unei alele motenite de la un printe, deseori
considerat drept un pas necesar n tumorigenez.
Pirimidin baz azotat de tipul citozin, uracil, timin.
Plasmid formaiune extracromozomial, capabil de replicare
independent. Conine 0,5 - 2% din totalul ADN-lui celular.
ADN-ul plasmidic este un duplex circular, lipsit de histone.
Sunt caracteristice bacteriilor, dar au fost gsite i la porumb
etc. Plasmidele difer de la o specie la alta prin dimensiuni i
coninut n ADN. Conin un numr redus de gene implicate n
unele procese metabolice i n rezistena la antibiotice. Sunt
folosite ca vectori n ingineria genetic.
Polilinker secven din cadrul plasmidei, ce conine situsuri unicale de
restricie pentru enzimele de restricie. Pentru fecare tip de
restrictaz exist un singur situs de restricie.
Polimorfsm prezena, n cadrul unei populaii, a dou sau mai multe forme
determinate genetic n asemenea frecven nct cea mai rar
dintre ele nu poate f meninut numai prin mutaie.
Poliploid orice multiplu al numrului haploid de cromozomi, de
exemplu, 3N, 4N etc.
Primer secven scurt de nucleotide, complementar unui fragment
de ADN. De sonda de hibridare se deosebete prin faptul c nu
este marcat i are dimensiuni mai mici.
Probabilitate de cte ori are loc un rezultat ntr-o serie de evenimente.
Procedeul BLoTT transferul moleculelor de ADN (Southern), ARN (Northern)
sau proteine (Western) din gel pe o membran de nailon sau
nitroceluloz.
Procesare modifcarea ARN-mesager, care se petrece n transcripie,
inclusiv mbinarea, capp-ing i poliadenilarea.
Produse rezultate din
organisme modifcate genetic
produse, constnd dintr-un organism modifcat genetic sau
dintr-o combinaie de asemenea organisme, care se introduc
pe pia.
159
Protein compus organic complex, alctuit din sute sau mii de
aminoacizi, cu conformaie structural defnit.
Purin baz azotat de tipul adenina sau guanina.
radiaii ionizante unde electromagnetice de lungime foarte scurt (raze X i )
i particule cu energie crescut.
rata mutaiei numrul de mutaii dintr-un locus specifc, care au loc ntr-un
gamet ntr-o generaie.
recombinare crossing-over (ncruciare) ntre dou locusuri legate (se
transmit mpreun n meioz).
reparare ADN ADN-ul deteriorat printr-o varietate de mecanisme poate f
ndeprtat i reparat printr-un set complex de procese.
replicare procesul de copiere a ADN-ului dublu catenar al
cromozomilor.
replicare ADN procesul de copiere a secvenei de nucleotide a genomului;
permite transmiterea informaiei genetice de la o celul la
alta.
represor produsul unei gene reglatoare a unui operon, care inhib gena
operatoare.
restrictaze enzime care diger specifc molecula de ADN, n anumite
locusuri (site-uri de restricie) de tip palindromic (secvene
inversate).
reverstranscripie sinteza catenei ADNc de pe ARNm cu ajutorul enzimei
revertazei sau reverstranscriptazei.
ribozomi structuri sferice mici, din citoplasm formate din dou
subuniti, bogate n ARN ribosomal; locul sintezei
proteinelor.
Screening identifcarea PMG dintr-o prob utiliznd primeri specifci
secvenelor 35S i NOS prin metoda PCR.
Segregare separarea alelelor n meioz, astfel nct fecare gamet s
conin numai un membru al fecrei perechi de alele.
Sensibilitate termen referitor la proporia de cazuri detectate; msurarea
sensibilitii se poate face prin determinarea proporiei
rezultatelor fals negative, adic numrul de cazuri
nedetectate.
Serviciul de consiliere a
consumatorilor
serviciu prestat de un organ de stat sau o organizaie de
consumatori.
Situs (site) de restricie secvene specifce de nucleotide, recunoscute i clivate (tiate)
de endonucleaze sau restrictaze. Fiecare enzim posed
propriul situs specifc de restricie.
Sond de hibridare secven de nucleotide, complementar unei secvene din ADN
sau ARN, marcat radioactiv (sonde calde) sau neradioactiv
(sonde reci).
Southern BLoT tehnic utilizat n ingineria genetic pentru efectuarea
testelor de hibridare ADN-ADN, constnd

din dou faze:
transferul fragmentelor de ADN separate prin electroforez pe
gel de agaroz ntr-o membran de nitroceluloz; hibridarea
membranei astfel ncrcate cu o soluie de acid nucleic
monocatenar n cazul n care acesta din urm este radiomarcat.
Zona de hibridare poate f vizualizat prin autoradiografe.
Splicing-ul ArN-ului mesager excizia secvenelor necodante ale intronilor din ARN-mesager
primar, ducnd la aranjarea exonilor nonadiaceni (non-
contigui), pentru a forma un ARN-mesager matur mai scurt
nainte de a f transportat la ribozomii din citoplasm, pentru
translaie.
Substituie nlocuirea unui nucleotid prin altul.
160
Superfamilii de gene familii de multigene care au o omologie secvenial limitat,
dar sunt legate din punct de vedere funcional.
T-capete secvene specifce de nucleotide care fancheaz capetele T-
ADN-lui ce permite integrarea ultimului n cadrul genomului
vegetal.
Tehnologia FISH
(Fluorescence In Situ
Hibridization)
marcarea sondelor de hibridare cu ageni fuoresceni.
Principiul metodei se bazeaz pe legarea de ADN-ul sondei,
fe a biotinei, fe a unei heptane, care le face vizibile dup
hibridare, de pild cu un anticorp marcat cu un fuorocrom.
Telomer poriunea distal a braelor cromozomiale.
Terminator secvena de nucleotide n ADN, care codifc terminarea
transcripiei ARN-mesager.
Testare n cmp experiment constnd n studierea organismelor modifcate
genetic n cmp, n condiii de mediu afate sub control,
avndu-se certitudinea c aceste organisme nu vor persista n
mediu dup ncheierea experimentului.
Transcripia invers PCr
(rTPCr)
utilizarea unui primer special care conine un promotor i un
iniiator de translaie i folosind PCR-ul se poate obine ADN
complementar plecnd de la ARN-mesager.
Transcripie copierea nucleotidelor de pe matria ADN pe catena ARN
n formare, n succesiune complementar: adenin-uracil,
guanin-citozin. De pe catena ADN informaia genetic se
transmite pe ARNm.
Transfer orizontal al genelor proces care implic transferul informaiei genetice ntre
organisme aparinnd unor taxoni diferii, orict de diveri ar
f.
Transformare recombinare genetic n bacterii n care ADN-ul strin introdus
n bacterie este ncorporat n cromozomul bacteriei recipient;
de asemenea, transformarea unei celule normale ntr-o celul
malign, de exemplu, aa cum rezult la infecia celulelor
normale cu virusuri oncogene.
Translaie conversiune a informaiei genetice, coninut n ARNm, ntr-o
secven de aminoacizi. Sinteza se desfoar n mai multe
etape: activarea aminoacizilor de ctre aminoacil-sintetaze
pentru a forma aminoacizi adenilai, n care grupul carboxil
se leag de un grup de acid adenilic; ataarea aminoacidului
activat de ARNt, transferul find asigurat de aceeai enzim,
care are astfel dubla proprietate de a recunoate un aminoacid
i un ARNt la extremitatea 3 a ARNt, de adenin terminal.
Sinteza are loc n ribozomi.
Translocaie transferul materialului genetic de la un cromozom la altul; dac
exist i un schimb de material genetic ntre doi cromozomi,
atunci acesta este denumit translocaie reciproc; translocaia
dintre doi cromozomi acrocentrici prin fuziune la centromeri
se numete translocaie robertsonian.
Vector plasmid, bacteriofag sau cosmid n care se poate insera ADN
strin pentru clonare.
Virion particul viral infecioas.
Virus organism care conine ADN sau ARN nvelit n capsula
proteic i care este capabil de replicare numai n cadrul
celulelor bacteriene sau eucariote.
zigot ovul fertilizat.
161
Bibliografe
1. ABEBE T. GUENZI A.C., MARTIN B. et al. Tolerance of mannitol-accumulating
transgenic. wheat. to. water. stress. and. salinity. Plant Physiology, 2003, 131, p. 1748-
1755.
2. AHEMD F.E. Detection of Genetically Modifed Organisms in Foods. Trends in Biotech-
nology, 2002, 20 (5), p. 2215-2223.
3. AHOKAS H. Transfection of germinating barley seed electrophoretically with exogeno-
us DNA. Theor. Appl. Genet., 1989, 77, p.469-472.
4. AKHILESH K. TYAGI. Plant genes and their expression. Current Science, 25 January,
2001, 80(2), p. 161-169.
5. ALBAN C., JOB D., DOUCE R. Biotin metabolism in plants. Annu. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol., 2000, 51, p. 17-47.
6. ANKLAM E., GADANI F., HEINZE P. et al. Analytical methods for detection and de-
termination of genetically modifed organisms in agricultural crops and plant-derived
food products. Eur Food Technol, 2002, 214, p. 3-26.
7. Autorizarea activitilor legate de Organismele Modifcate Genetic (OMG) (Ghid prac-
tic), Chiinu, 16 p. 2004.
8. ARAGAO F.J.L, BRASILEIRO C.M.B. Positive, negative and marker-free strategies
for transgenic plant selection. Braz. J. Plant Physiol., 2002, 14(1), p. 1-10.
9. Australian Pilot Survey of GM Food Labeling of Corn and Soy Food Products. The TAG
Working Group on GM Food Labeling. June, 2003, 24 p.
10. BADEA E.M., SNDULESCU D. Biotehnologii.vegetale, Bucureti, 2001, 295 p.
11. BARCELO P., RASCO-GAUNT S., THORPE C. et al. Transformation and gene expre-
ssion..Advances in Botanical Research, 2001, 34, p. 60-125;
12. BERTHEAUX Y. Programme de recherche. Pertinence conomique et faisabilit dune
fire, sans utilisation dOMG, INRA, 2001, 48 p.
13. BIDNEY D., SCELONGE C., MARTICH J. et al. Microprojectile bombardment of
plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. Plant
Molec. Biol., 1992, 18, p. 301-313.
14. Biosecuritatea n Republica Moldova. Aspecte instituional-legislative, Chiinu, 2003.
15. BONFINI L., HEINZE P., KAY S., et al. Review of GMO detection and quantifcation
techniques. Italy, 2001, 67 p.
16. BRAY E.A., BAILEY-SERRES J. and WERETILNYK E. Responses to abiotic stresses.
2000, p. 1158-1249. In W. Gruissem et al. (ed.) Biochemistry and molecular biology of
plants. Am. Soc. of Plant Physiol., Rockville, MD.
17. BRINCH-PERESEN H., OLSEN O., KNUDSEN S. i al. An evaluation of feed-back
insensitive aspartate kinase as a selectable marker for barley (Hordeum vulgare L.)
transformation, Hereditas, 131, 1999, p. 239-245.
18. BRUNNERT H-J., SPENDER F., BORRCHERS T. PCR-ELISA for the CaMV-35S pro-
moter as a screening method for genetically modifed Roundup Ready soybeans. Eur
Food Res Technol, 213, 2001, p. 366-371.
19. CADRUL NAIONAL N DOMENIUL SECURITII BIOLOGICE, Chiinu,
2004, 47 p.
20. CHOMCZYNSKI P., MACKEY K., DREWS R. and WILFINGER W. DNAzol: A rea-
gent for the rapid isolation of genomic DNA. BioTechniques, 1997, 22, p. 550-553.
21. CLIVE J. Global status of commercialized Biotech/GM crops. www.isaaa.org.
22. CONKLIN P. Recent advances in the role and biosynthesis of ascorbic acid in plants.
Plant Cell Environ 2001, 24, p. 383-394.
23. CORESTA Task Force Genetically Modifed Tobacco-Detection Methods. www.cores-
ta.org, 41 p.
162
24. CORPILLO D., GARDINI G., VAIRA A.M. et al. Proteomics as tool to improve investi-
gation of substantial equivalence in genetically modifed organisms: The case of a virus
.resistant.tomato. Proteomics, 2004, 4, p. 193-200.
25. CROSSWAY A., OAKES J.V., IRVINE J.M., et al. Integration of foreign DNA follow-
ing microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Molecular and General Genetics,
1986, 202, p. 179-185.
26. CUNNINGHAM F.X., GANTT E. Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in
plants. Annu. Rev. Plant Physiol., 1998, 49, p. 557-583.
27. DATTA K., BAISAKH N., THET K.M. et al. Pyramiding transgenes for multiple resis-
tance in rice against bacterial blight, yellow stem borer and sheath blight. Theor. Appl.
Genet. 2002, 106, p.1-8.
28. DAVEY M.R., RECH E.L., MULLIGAN B.J. Direct DNA transfer to plant cells. Plant
Mol. Biol., 1989, 13, p. 273-285.
29. DE BLOCK M., BOTTERMAN J., VANDEWIELE M. et al. Engineering. herbicide.
resistance in plants by expression of a detoxifng enzyme. EMBO J., 1987, 6(8), p. 2513-
2518.
30. De WET J.M.J., De WET A.E., BRINK D.E. et al. Gametophyte transformation in mai-
ze. (Zea.Mays, Gramineae.). In Biotechnology and Ecology of Pollen, edited by D.C.
Mulcahy, 1986, Heidelberg: Springer-Verlag, p. 59-64.
31. DUCA M., GLIJIN A., LUPACU V., PORT A., LEVICHI A. Genetic control of
GMP using NOS terminator, The Third International Conference Ecological Chemistry,
Chiinu, 2005, p. 398-399.
32. DUCA M., GLIJIN A., LUPACU V., PORT A., LEVICHI A. The evidence of marker
GFP in transgenic plants, The Third Internaional Conference Ecological Chemistry,
Chiinu, 2005, p. 398.
33. DUCA M., KALOSHIAN I. Tehnici de cercetare n biologia molecular, Chiinu, CE
USM, 2002, 71 p.
34. DUCA M., SAVCA E., PORT A. Fiziologia vegetal. Tehnici speciale de laborator,
USM, 2001, 173 p.
35. DUCA M., TELEU A., PORT A. Plante modifcate genetic. Benefcii i riscuri, Chi-
inu, 2003, 96 p.
36. DUCA M., TELEU A., PORT A., Organismele modifcate genetic. Prezent i viitor,
Chiinu, 2004, 31 p.
37. DUCA M., LUPACU V., GLIJIN A., PORT A., CARDENAS-OROZCO M. Expre-
sia i motenirea genei Basta la tutunul transgenic, Buletinul AM, tiine ale vieii,
2(299), Chiinu, 2006, p. 70-76.
38. DUCREUX L.J.M., MORRIS W.L., HEDLEY P.E. et al. Metabolic engineering of high
carotenoid potato tubers containing enhanced levels of -carotene and lutein. J. Exp.
Bot. 2004, 56, p. 81-89.
39. EBINUMA H., SUGITA K., MATSUNAGA E. and YAMAKADO M. Selection of
marker-free transgenic plants using the isopentenyl transferase gene. Proceedings of
the National Academy of Sciences USA., 1997, 94, p. 2117-2121.
40. EYQUEM F. The analisis of food samples for the presence of genetically modifed orga-
nisms, Session 12, Quantitative detection of Roundup Ready
Soybean by ELISA, 21 p.
41. FISCHER R., EMANS N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic
Res. 2000, 9, p. 299.
42. FLOWERS T.J. Improving.crop.salt.tolerance. J. Exp. Bot. 2004, 55, p. 307-319.
43. Genetically modifed GM (crops) molecular and regulatory details. Version 2,
30/06/2003, BATS, 199 p.
44. GIDDINGS G., ALLISON G., BROOKS D., CARTER A. Transgenic plants as facto-
ries for biopharmaceuticals. Nat Biotechnol. 2000, 18, p. 1151-1155.
163
45. GILBERT B., ERIC J., FREDERIC D. Dtection, identifcation et quantifcation des
transgnes dans les aliments par amplifcation gnique. Biotechnol. Agron. Soc. Envi-
ron. 2000, 4 (4), p. 208-213.
46. GONSALVES D. Transgenic. papaya:. a. cause. study. on. the. theoretical. and. practical.
application of virus resistance. 2003, p. 115-118. In I.K. Vasil (ed.) Plant biotechnology
2002 and beyond. Kluwer Academic Publ., Dordrecht, the Netherlands.
47. GRIFFITHS K., et al. Review of Technologies for Detecting Genetically Modifed Mate-
rials in Commodities and Food, Australian Government Analytical Laboratories, 2002.
48. GRUSAK M.A., DELLA PENNA D. Improving the nutrient composition of plants to
enhance.human.nutrition.and.health. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999,
50, p. 133-161.
49. GUILIANO G., AQUILANI R., DHARMAPURI S. Metabolic engineering of plant
carotenoids. Trends Plant Science, 2005, 10, p. 406-409.
50. HARDEGGER M., BRODMANN P., HERRMANN A. Quantitative detection of the
35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR. Eur. Food
Res. Technol., 1999, 209, p. 83-87.
51. HEMMER W. Foods Derived from Genetically Modifed Organisms and Detection
Methods, BATS, http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php..
52. HERBES K., SONNEWALD U. Production of new/modifed proteins in transgenic
plants. Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10, p. 163-168.
53. ISHIDA, Y., SAITO, H., OHTA, S. et al. High effciency transformation of maize (Zea.mays.
L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnology, 1996, 14, p. 745-750.
54. JAIN A.K., NESSLER C.L. Metabolic engineering of an alternative pathway for ascor-
bic.acid.biosynthesis.in.plants. Mol Breeding, 2000, 6, p. 73-78.
55. JAUHAR P.P. Cytogenetic architecture of cereal crops and their manipulation to ft
human.needs:.opportunities.and.challenges. 2006, p. 1-25.
56. JEFFERSON R. A. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system.
Plant Mol. Biol. Rep., 1987, 5, p. 387-405.
57. JEFFERSON R.A., KAVANAGH T.A., BEVAN M.W. GUS fusions: -glucuronidase
as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J., 1987, 6, p.
3901-3907.
58. JOERSBO M., OKKELS T. A novel principle for selection of transgenic plant cells:
positive.selection. Plant Cell Rep., 1996, 16, p. 219-221.
59. JOERSBO M. and OKKELS F.T. A novel principle for selection of transgenic plant
cells:.positive.selection. Plant Cell Reports, 1996, 16, p. 219-221.
60. KAEPPLER, H.F., SOMERS, D.A., RINES, H.W. et al. Silicon carbide fber-mediated sta-
ble transformation of plant cells. Theoretical and Applied Genetics, 1992, 84, p. 560-566.
61. KAPUSTA J, MODELSKA A, FIGLEROWICZ M. et al. A plant-derived edible vac-
cine.against.hepatitis.B.virus. FASEB J., 1999, 13, p. 1796-1799.
62. KRENS F.A., MOLENDIJK L., WULLEMS G.J., SCHILPEROORT R.A. In. vitro
transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature, 1982, 296, p. 72-74.
63. KUIPER H.A. Summary report of the ILSI Europe Workshop on detection methods for
novel foods derived from genetically modifed organisms. Food control, 1999, 10 (6), p.
339-343.
64. KUIPER H.A., GIJS A.K. HUB P.J. et al. Assessment of the food safety issues related to
genetically modifed foods. The Plant Journal, 2001, 27(6), p. 503-528.
65. LAEMLI U.K. Cleavage of structural proteins during the assemble of the head of bac-
teriophage T4, Nature, 1970, 227, p. 680-685.
66. LANGRIDGE P., BRETTSCHNEIDER R., LAZZERI P. and LOERZ H. Transforma-
tion of cereals via Agrobacterium and the pollen pathway: A critical assessment. The
Plant Journal, 1992, 2, p. 631-638.
164
67. LI F., DEY M., HE C. et al. Rapid PCR-based determination of transgene copy number
rice. Plant Molecular Biology Reporter, March 2003, 21, p. 73-80.
68. LIPP M., ANKLAM E i STAVE J.W. Reference Materials. Journal of AOAC Interna-
tional, 2000, 83, p. 919-927.
69. LIN-CHING C., YEN-LING C., DANIEL Y.S. Study on the detection method of six
varieties of genetically modifed maize and processed foods. Journal of Food and Drug
Analysis, 2002, 10(1), p. 25-33.
70. LOZAN A., CLDRU V., MEREU N. i al. Suport.pentru.dezvoltarea.cadrului.
naional de biosecuritate al Republicii Moldova, Chiinu, 2005, 40 p.
71. LUBECK M. Detection of genetically modifed plants-methods to sample and analyze
GMO. content. in. plants. and. plant. products. www.sns.dk/erhvogadm/biotek/detection.
htm, 32 p.
72. LUO Z. and WU R. A simple method for the transformation of rice via the pollen tube
pathway. Plant Molecular Biology Reporter, 1988, 6, p. 165-174.
73. LUPACU V. Detectarea plantelor modifcate genetic utiliznd secvena NOS-termi-
nator. Lucrri tiinifce, Universitatea Agrar de Stat din Moldova, vol. 13., 2005 p.
138-141.
74. LUPACU V. Aspecte n evaluarea plantelor modifcate genetic (Nicotina tabacum var.
Xanthi) i metode de identifcare a acestora. Autoreferat al tezei de doctor n biologie,
Chiinu, 2007 p. 24 (www.cnaa.acad.md)
75. MAYER J., SHARPLES J., NOTTEMBURG C. Resistance.to.phosphinothricin, The
Team, Cambia, 2004, 43 p.
76. MAYNE S.T. -carotene, carotenoids and disease prevention in humans. FASEB J
1996, 10, p. 690-701.
77. MEYER R. Nachweis gentechnologisch vernderter Lebensmittel mittels Polymerase
Kettenreaktion (PCR). Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., 1995, 86, p. 648-656.
78. MIELE L. Plants as bioreactors for biopharmaceuticals: regulatory considerations.
Trends Biotechnol., 1997, 15, p. 45-50.
79. MILIC C. I. Biotehnologiile.viitorului. Iai, Ed. Ion Ionescu de la Brad, 1999, 351 p.
80. MOLDOVEANU D., MILITARU C., MOLDOVEANU I. Microbiologie i inginerie
genetic, Ed. FIAT LUX, 2001, 351 p.;
81. MURRAY M.G. and THOMPSON W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant
DNA. Nucleic Acids Research, 8(19), 1980, p. 4321-4325.
82. NAUERBY B., BILLING K. and WYNDAELE R. Infuence of the antibiotic timentin on
plant regeneration compared to carbenicillin and cefotaxime in concentrations suitable
for elimination of Agrobacterium tumefaciens. Plant Science, 1997, 123, p. 169-177.
83. Organisme modifcate genetic: benefcii i riscuri (brour), 8 p.
84. Organisme modifcate genetic opinii privind biosecuritatea, Chiinu, 2004, 20 p.
85. PALII A., COMAROV G., LOZAN A. i al. Biotehnologii moderne n ftotehnie i
biosecuritate. Chiinu, 2004, 229 p.
86. PATTON D. Transgenic.plants.having.increased.biotin.content. US 5869719 (Novartis)
1997.
87. PERL A., LOTAN O., ABU-ABIED M. and HOLLAND D. Establishment of an Agro-
bacterium-mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of anti-
oxidants during grape-Agrobacterium interactions. Nature Biotechnology, 1996, 14, p.
624-628.
88. POPESCU O.V. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Bucureti, Ed.
Tehnic, 1990, 268 p.
89. PICARD E., JACQUEMIN J.M., GRAINER F., et al. Genetic transformation of wheat
(Triticum aestivum) by plasmid DNA uptake during pollen tube germination. In Proceed-
ings of the 7
th
International Genetics Symposium, IPSR, Cambridge, 1988, p. 779-787.
165
90. Primul raport naional cu privire la diversitatea biologic, Chiinu, 2000.
91. RAICU P. Genetica: genetic molecular i inginerie genetic. Partea II, Bucureti,
1997, 250 p.
92. RAKOSY-TICAN L. Progrese recente n cercetrile de transformare genetic a plan-
telor. Progrese n biotehnologie. Ars Docendi, 2002, vol. 2. p. 37-50.
93. REED J.N., CHANG Y.F., McNAMARA D.D. i al. High frequency transformation
of wheat with the selectable marker mannose-6-phosphate isomerase (PMI). In vitro,
1999, 35, p. 57.
94. REVA V., CIOBANU V., MUELLER-URI F. Strategia i tactica izolrii i purifcrii
proteinelor. USM. 2001, p. 40-44.
95. ROA-RODRIGUEZ C. Promoters used to regulate gene expression, The Team, Cam-
bia, 2003, 210 p.
96. ROESSNER U., WAGNER C., KOPKA J. et al. Simultaneous analysis of metabolites
in. potato. tuber. by. gas. chromatography-mass. spectrometry. The Plant Journal, 2000,
23(1), p. 131-142.
97. SAHRAWAT A.K., BECKER D., LUTTICKE S. et al. Genetic improvement of wheat
via alien gene transfer, an assessment. Plant Sci. 2003, 165, p. 1147-1168.
98. SALA F., RIGANO M.M., BARBANTE A., et al. Vaccine antigen production in trans-
genic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 2003, 21, p. 803-808;
99. SAMBROOK J., FRITSCH E.F. and MANIATIS T. Molecular. cloning:. a. laboratory.
manual. New York chapter 6, 1989.
100. SAMBROOK J., RUSSELL D., Molecular cloning. A laboratory manual., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, Vol. I-III, 2001.
101. SANDMANN G. Genetic manipulation of carotenoid biosynthesis: strategies, prob-
lems.and.achievements. Trends Plant Science, 2001, 6(1), p. 14-17.
102. SANFORD J.C., KLEIN T.M., WOLF E.D. and ALLEN N. Delivery of substances
into.cells.and.tissues.using.a.particle.bombardment.process. Particulate Science and
Technology, 1987, 5, p. 27-37.
103. SANGWAN R.S., BOURGEOIS Y., BROWN, S. et al. Characterization of competent
cells and early events of Agrobacterim-mediated genetic transformation in Arabidop-
sis.thaliana. Planta, 1992, 188, p. 439-456.
104. SCORPAN V., LOZAN A. Dicionar de termeni biotehnologici, Chiinu, 2005, 182 p.
105. SHARMA H.C., SHARMA K., and CROUCH J. Genetic transformation of crops for
insect.resistance:.potential.and.limitations. Crit. Rev. Plant Sci., 2004, 23, p.47-72.
106. SOMA M. The analysis of food samples for the presence of genetically modifed orga-
nisms. Extraction and purifcation of DNA. Session 4, 2004, 18 p.
107. SOMA M., QUERCI M. The analysis of food samples for the presence of genetically
modifed organisms. Agarose Gel Electrophoresis. Session 5, 2004, 18 p.
108. SPOTH B., STRAUSS E. Screening for Genetically Modifed Organisms in Food Us-
ing Promegas Wizard
.Resin, www.promega.com, p. 23-25.

109. STANTON B.G. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and inte-
gration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 2000, 51, p. 223-256.
110. Strategia Naional i Planul de Aciune n domeniul Conservrii Diversitii Biologi-
ce, Chiinu, 2002.
111. STRATAN N., LOZAN A., CIOBANU S. Protocolul de la Cartagena privind biose-
curitatea.(compendium), Chiinu, 2004, 19 p.
112. STRATAN N., LOZAN A., CLDRU V., CIOBANU S. Autorizarea activitilor
legate de organismele modifcate genetic (OMG) (Ghid practic), Chiinu, 2004, 16 p.
113. STOGER E., SACK M., PERRIN Y. et al. Practical considerations for pharmaceuti-
cal antibody production in different crop systems. Mol Breed, 2000, 9, p. 149-158.
114. The analysis of food samples for the presence of genetically modifed organisms. Joint
Research Centre. Sessions 1-12, 2004.
166
115. THION L., VOSSEN C., COUDERC B. et al. Detection of genetically modifed orga-
nisms in food by DNA extraction and PCR amplifcation. Biochemistry and Molecular
Biology Education, 2002, 30(1), p. 51-55.
116. TILLMANN M. . A., WEST S. Identifcation of geneticaly modifed soybean seeds
resistant.to.glyphosate, Sci. agric. (Piracicaba, Braz.), 61(3), Piracicaba May/June 2004,
p. 336-341.
117. TRAPMANN S. and EMONS H. Reliable.GMO.analysis. Anal Bioanal Chem. 2005,
381, p. 72-74.
118. TSIEN R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annu. Rev. Biochem., 1998, 67, p. 509-544.
119. TWYMAN RM, STPGER E, SCHILLBERG S. et al. Molecular farming in plants:
host.systems.and.expression.technology. Trends Biotechnol., 2003, 21, p. 570-578.
120. VAN DER GRAAFF E., den DULK-RAS A. and HOOYKAAS P.J.J. Deviating T-
DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants. Plant Molecular Biology,
1996, 31, p. 677-681.
121. VAN ERD L.L., HOAGLAND R. E., ZABLOTOWICZ R. M. et al. Pesticide metabo-
lism in plants and microorganisms. Weed Science, 2003, 51, p. 472-495;
122. VAN HAAREN M.J.J., SEDEE, N.J.A., KRUL M., et al. Function of hetero-logous
and pseudo border repeats in T region transfer via the octopine virulence system of
Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology, 1988, 11, 773-781.
123. VLAIC A. Inginerie genetic. Realizri, sperane i neliniti. Cluj-Napoca, 1997.
124. WANG K., HERRERA-ESTRELLA A. and VAN MONTAGU, M. Over expression of
virD
l
and virD
2
genes in Agrobacterium tumefaciens enhances T-complex formation
and plant transformation. Journal of Bacteriology, 1990, 172, p. 4432-4440.
125. WANG K., HERRERA-ESTRELLA L., VAN MONTAGU M. and ZAMBRYSKI, P. Right.
25-bp terminus sequences of the nopaline T-DNA is essential for and determines direction of
DNA transfer from Agrobacterium to the plant genome. Cell, 1984, 38, p. 455-462.
126. WATERS V.L. and GUINEY D.G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA
transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology, 1993, 9, p. 1123-1130.
127. WILMINKAND J.J.M. Dons Selective Agents and Marker Genes for Use in Transfor-
mation of Monocotyledonous Plants. Plant Molecular Biology Reporter, 1993, 11 (2),
p. 165-185.
128. WOLFRAM HEMMEZ. Foods derived from genetically modifed organisms and de-
tection.methods. BATS, 59 p.
129. ZENG J., WANG D., WU Y., et al. Transgenic.wheat.plants.obtained.with.pollen.tube.
pathway.method. Science in China, 1994, 37(3), p. 319-325.
130. ZHEN TAO, XING-FENG CAI, SHENG-LI YANG et al. Detection of exogenous
genes in genetically modifed plants with multiplex polymerase chain reaction. Plant
Molecular Biology Reporter, 2001, 19, p. 289-298.
131. .. . ,
cep , 1998, 6, c. 3-8.
132. .., . ., .. -
(GFP) (drFP583)
. , 2003, 43, c. 163-224.
133. C. ., POAO . A. -
. . -
, 2000, T. 47. 3, c. 479-488.
134. ., ., ., . -
. , 1984. 500 .
135. . . .. -,
1996, 197 .
136. .. . ., , 1989, 464 .
167
Pagini WeB
136..http://www.aberdeen.k12.sd.us/dsc/departments/foundation/
wish%20list%20images/SPECTROPHOTOMETER.jpg..
137..http://www.agbios.com/dbase.php.
138..http://www.aphis.usda.gov.
139..http://www.ars.usda.gov/pandp/docs.htm?docid=11318.
140. http://www.biomedcentral.com/1472-6750/6/37/table/T4.
141..http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html.
142..http://www.biosafety.md
143..http://www.bats.ch/bats/en/index.php.
144..http://biotech.jrc.it/home/ict/methodsdatabase.htm#Database.
145..http://www.cambia.org/daisy/cambia/1204.html.
146..www.cenorm.be.
147..http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm.
148..http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=965410145&do.
149..http://engl.jrc.it/designated.htm.
150. http://www.emea.eu.int/ pdfs/human/ich/ 028195en.pdf i 381/95.
151..http://www.emea.eu.int/pdfs/human/ich/038195en.pdf.
152. http://www.emea.eu.int/pdfs/human/ich/028195en.pdf.
153..http://www.emediawire.com/prfles/2005/03/08/216266/
AdvancedInstrumentsFLM
154..www.fg.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/mol_gen.htm.
155..http://gmo-crl.jrc.it/detectionmethods.htm.
156..http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm.
157..http://gmo-crl.jrc.it.
158. gmo-crl.jrc.it/summaries/Bt11-protocol.pdf.
159..www.gmo-crl.jrc.it/detectionmethods/MON-Art47-dnaextraction.pdf.
160..http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/.
161..http://www.gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm.
162..www.greenpeace.org/raw/content/espana/reports/que-cantidad-de-toxina-bt-
pro.pdf.
163. www.monsanto.com/monsanto/content/products/technicalAndSafety/
yieldgard_corn/dna_dm.pdf.
164..http://projects_2004.jrc.cec.eu.int.
165..www.plant-tc.coafes.umn.edu/maize-tc/pptbial.jpg.
166..http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm.
167..www.isaaa.org.
168..www.molbiol.ru..
169..http://www.mun.ca/biology/scarr/Gr13-16b.htm.
170..http://www.iscpubs.com/articles/abl/b0403jen.pdf.
171..www.iso.org.
172..http://www.life.uiuc.edu/biochem/355/articles/GMObeansPCR.pdf.
173..http://www.olis.oecd.org/bioprod.nsf.
174..http://www.uky.edu/~dhild/biochem/24/lect24.html..
168
Abrevieri
BAC Bacterial artifcial chromosome
BATS Centre for biosafety and sustainability
BPP Business Partnership Program
CaMV Caulifower Mosaic Virus
CoBASe Collaboration in Basic Science and Engineering
CrDF Civilian Research and Development Foundation
CSB Centrul de Securitate Biologic
CTAB cetiltrimetilamonium-bromid
eLISA enzyme linked immunosorbent assays
eNGL The European Network of GMO Laboratories
ePSPS 5-enolpiruvil-ikimat-3-fosfat sintaza
GFP green fuorescent protein
GUS -glucoronidaza
ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications
JRC European Commissions Joint Research Centers
LUC luciferaza
MerL Major Equipment for Research Laboratories
MG modifcat genetic
MRDA Moldovan Research and Development Association
MTFP Moldovan Travel Fellowship Program
NOS nopalinsintetaza
NPTII neomicin-fosfotransferaza II
NSF National Science Foundation
oeCD Organization for Economic Cooperation and Development
OMG organisme modifcate genetic
PAT fosfnotricin-acetiltransferaza
PCR Polymerase Chain Reaction
PeG polietilenglicol
PMG plante modifcate genetic
PPT fosfnotricin
Ri root inducing
RR Roundup Ready
Ti tumor inducing
USM Universitatea de Stat din Moldova
YAC Yeast Artifcial Chromosome

Metode de Detectie A Plantelor Transgenice

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Metode de Detectie A Plantelor Transgenice

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Maria DUCA, Angela LOZAN, Angela PORT,

Aliona GLIJIN, Victor LUPACU

dup care se centrifugheaz la

C, dup care se centrifugheaz la 12 000 g timp de 10

Soybean by ELISA, 21 p.).

. Aceast metod permite de-

.Resin, www.promega.com, p. 23-25.

S-ar putea să vă placă și