CUPRINS: Cap1 Laboratorul de Microbiologie - Prof.dr.Braga Victoria 1.1. Organizarea i funcionarea laboratorului de Microbiologie 1.2.

. Principii de conduit i reguli de protecie a muncii 1.3. descrierea aparaturii specifice, a modului de funcionare i de ntreinere Cap.2 - Bazele asepsiei si ale antisepsiei - S.l.dr.Botnarciuc Mihaela 2.1.decontaminarea prin caldura: sterilizarea prin caldura umeda, caldura uscata, alte metode de sterlizare 2.2. decontaminarea Cap.3 - Recoltarea si transportul produselor patologice. - S.l.dr.Botnarciuc Mihaela Cap.4 - Cultivarea microorganismelor: - S.l.dr.Stoicescu Ramona 4.1. medii de cultura: formule, metode de preparare si conservare; 4.2.prezentarea mediilor de cultura: lichide, solide, semisolide, selective, diferentiale, de mbogatire, de conservare si transport, anaerobe, speciale 4.3. cultivarea virusurilor: ou embrionat, culturi celulare, animale de laborator Cap.5 - Tehnica examenului microscopic - S.l.dr.Botnarciuc Mihaela 5.1.coloranti si coloratii microbiologice, 5.2.examenul ntre lama si lamela, 5.3.coloratii speciale: cili, capsula, spori 5.4.examenul pe fond ntunecat. Cap.6 - Tehnici specifice Microbiologiei - S.l.dr.Stoicescu Ramona 6.1.nsamntarea pe medii de cultura 6.2.aspecte ale culturilor, 6.3.efectuarea de frotiuri din produse patologice si culturi-coloratie, 6.4.examinarea frotiurilor Cap.7 - Cercetarea sensibilitatii germenilor la antibiotice si chimioterapice S.l.dr.Botnarciuc Mihaela 7.1.antibiograma germenilor aerobi, 7.2.antibiograma germenilor anaerobi-tehnica si interpretare Cap.8 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de coci Gram pozitivi S.l.dr.Botnarciuc Mihaela Cap.9 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de coci Gram negativi. - Asist. Dr.Voineagu Lavinia Cap.10 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de parvobacterii - Asist. Dr.Voineagu Lavinia Cap.11 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacili Gram pozitivi S.l.dr.Stoicescu Ramona Cap.12 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacili Gram negativ S.l.dr.Stoicescu Ramona Cap.13 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Pseudomonas S.l.dr.Stoicescu Ramona Cap.14 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Mycobacterii - Asist. Dr.Voineagu Lavinia

Cap.15 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de bacterii anaerobe - Asist. Dr.Voineagu Lavinia Cap. 16 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Spirochete S.l.dr.Botnarciuc Mihaela Cap. 17 - Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de Mycoplasma S.l.dr.Botnarciuc Mihaela Anexa................................................................................................ Bibliografie........................................................................................

CAPITOLUL 1

ORGANIZAREA SPAIULUI DESTINAT LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE Diagnosticul microbiologic constituie un act medical extrem de important pentru pacienii cu posibile infectii. Acurateea, meticulozitatea i, deloc de neglijat, intuiia medicului microbiolog pot salva viaa pacientului. Pentru buna realizare a acestui obiectiv produsele biologice diverse trebuie supuse treptat unor etape importante de diagnostic (colorare, cultivare, identificare etc.). Spaiul n care se desfoar aceste etape are obligatorie o anumit organizare i o anumit dotare. Acest spaiu trebuie amplasat la distan de zonele n care se recolteaz probele patologice i de zonele n care se elibereaz rezultatele deoarece acestea sunt zone cu circulaie intens. Construcia trebuie prevzut cu instalaie electric inclus n perei care s suporte sarcini importante impuse de utilizarea aparatelor. Instalaia de ap i de canalizare sunt obligatorii, fiecare spaiu de lucru avnd obligatoriu cuvet cu ap rece i cu ap cald pentru splarea pe mini a tehnicienilor. Iluminarea este foarte important deoarece o prim etap n diagnostic o constituie examinarea macroscopic a produsului patologic iar etapa de interpretare a culturii microbiologice necesit de asemenea o lumin bun. Camerele laboratorului de microbiologie, de preferin orientate spre nord, trebuie s fie prevzute cu suprafee lavabile: pereii zugrvii cu vopsea lavabil, pardoseala acoperit cu rini epoxilice sau nveliuri de materiale plastice uor lavabile, fr crpturi i cu marginile rotunjite.Astfel curarea si dezinfectarea suprafetelor se face uor. Mobilierul laboratorului de microbiologie trebuie s fie simplu, din materiale lavabile (inox, blat de mas din pal melaminat, suprafee de sticl etc.).

ORGANIZAREA SPAIULUI LABORATORULUI Spaiul trebuie compartimentat n camere cu destinaie precis, complet decomandate, dispuse n jurul unei arii centrale destinate recoltrii de produse biologice. Destinaia camerelor trebuie gndit astfel nct circuitul produselor microbiologie, de la recoltare pn la nlturare (dup dezinfecie) s fie unidirecional. Alturi camerelor de lucru propriu-zis trebuie s existe spaii pentru depozitarea materialelor necesare lucrului microbiologic, spaiul pentru splarea materialelor ,vestiar, WC pentru personal. Calculul spaiului necesar este multiplicarea suprafeei de 11 m2 cu numrul de lucrtori. Compartimentele obligatorii laboratorului de microbiologie sunt: spaiul pentru primirea i nregistrarea produselor biologice, spaiul pentru pregtirea materialelor de laborator, spaiul de lucru propriu-zis ( de nsmnare i de citire a culturilor microbiologice), depo-

zitul de materiale, spaiul necesar igienei personalului laboratorului. Circuitul n laborator trebuie s aib un sens unic cel mai bun mod de comunicare ntre camere fiind un coridor n care s se deschid toate camerele. Fiecare zon cu o anumit i precis destinaie trebuie s fie organizat independent astfel nct s nu fie necesar circulaia ntre camere n timpul desfurrii activitii. Aparatele i instrumente utilizate (de exemplu microscoape, centrifugi, etc.) trebuIe s aparin unei singure zone i s nu fie deplasate dintr-o camer n alta. Rapoartele dintre diverse aparate trebuie gndite logic astfel nct acestea s nu i pericliteze funcionarea ( frigider lng termostat).

APARATURA I INSTRUMENTARUL NECESARE LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE Instrumentarul i aparatura de laborator necesar, n ordinea activitilor care au loc n laboratorul de microbiologie sunt urmtoarele: Instrumentar pentru recoltare: seringi de unic folosin, vacuumteinere, tampoane sterile, urocultoare, coprocultoare; anse bacteriologice, pipete Pasteur, tampoane sterile, microscoape, stative, set de colorani, centrifug i balane, bec Bunsen, termostate etc.; autoclav, dulap, vase de plastic,etc.; frigidere, bi de ap, distilatoare; congelatoare, tromp de aer; pupinel; distilator; instrumente variate:foarfeci, pense, sonde, etc.; cristalizoare cu materiale dezinfectante pentru lamele folosite; boxele de siguran antiepidemic. Boxele de siguran antiepidemic, obligatorii n ultima perioad, controleaz ntr-un grad mai mare sau mai mic (n funcie de complexitatea construciei acestora) circulaia aerosolilor la locul de munc, aerosoli care pot constitui un factor important infecios.

NORME DE PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Date fiind riscurile infecioase i cele de ardere fizic sau chimic existente n laboratorul de microbiologie personalul de laborator trebuie s respecte urmtoarele reguli: folosirea obligatorie a echipamentului de protecie: halate, bonete, mnui, mti, oruri speciale; aranjarea aparaturii i a materialelor de laborator astfel nct lucrul s se des-

foare cu economie maxim de micri i fr deplasri inutile; nu se pipeteaz cu gura ci cu pipete automate; nu se mnnc i nu se fumeaz n laborator ci doar n spaiul special amenajat; obiectele utilizate la nsmnare trebuie obligatoriu sterilizate, pe mesele de laborator nu se aaz haine, geni, cri, caiete; nu este permis intrarea n laborator a persoanelor strine, orice contact infectant pe suprafee umane neprotejate trebuie urmat obligatoriu de antiseptizarea atent a zonei i curirea atent urmat de dezinfecie a suprafeelor neanimate contaminate (acoperirea cu sublimat 1% pentru 2.-3 ore apoi curirea mecanic atent i, n final tergerea cu sublimat ); halatele i orurile contaminate se sterilizeaz la autoclav; pentru prevenirea arsurilor se acord atenie maxim micrilor n preajma becului Bunsen i a soluiilor dezinfectante care pot determina arsuri chimice ( amestec sulfocromic).

CAPITOLUL 2 BAZELE ASEPSIEI I ANTISEPSIEI STERILIZAREA I DEZINFECIA Definiii: Prin sterilizare se nelege orice metod fizic sau chimic prin care sunt distruse microorganismele, att formele vegetative ct i formele de rezisten (sporii) de la nivelul unui substrat. Rezultatul unei proceduri de sterilizare este starea de sterilitate: un substrat steril, complet lipsit de microorganisme vii, att formele vegetative ct i formele de rezisten. Obinerea strii de "sterilitate", precum i meninerea ei (pn n momentul utilizrii) confer siguran maxim, probabilitatea teoretic a existenei microorganismelor fiind 106. Prin dezinfecie se nelege procesul prin care sunt distruse majoritatea microorganismelor (n proporie de pn la 99 %) de pe obiectele din mediul inert, cu excepia formelor de rezisten (sporilor bacterieni). Substanele utilizate n acest scop se numesc dezinfectante. Dezinfecia se aplic n cazurile n care curenia nu elimin riscurile de rspndire a infeciei, iar sterilizarea nu este necesar. Reducerea numrului de microorganisme de la nivelul pielii, mucoaselor i esuturilor vii se numete antisepsie. Substanele folosite n acest scop se numesc antiseptice. Unele substane pot fi folosite att ca dezinfectante, ct i ca antiseptice, n concentraii diferite. Decontaminarea se refer la procesul sau tratamentul care se aplic dispozitivelor medicale utilizate, avnd scopurile urmtoare: diminuarea populaiei de microorganisme, prevenirea uscrii produselor biologice, protecia personalului care-l manipuleaz, protecia mediului mpotriva contaminrii. Metodele de sterilizare se clasific, dup agentul sterilizant, n: a. Sterilizare prin metode fizice: Sterilizarea prin cldur Sterilizarea prin filtrare

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor b. Sterilizarea chimic 2.1 Sterilizarea prin cldur. Cldura este un agent relativ ieftin i foarte eficient. Se preteaz la sterilizarea prin cldur toate materialele termorezistente. Sterilizarea prin cldur uscat: STERILIZAREA PRIN ARDEREA N FLACR ( ARDEREA LA ROU) este utilizat n bacteriologie, pentru ansa bacteriologic metalic. Ansa se ine cu vrful n flacra becului Bunsen, pn se nroete, apoi nc 5-10 secunde. La temperatura la care metalul este incandescent, toate microorganismele sunt distruse prin carbonizare. Atenie: flacra este mai fierbinte spre vrf. Dac ansa este ncrcat ( conine produs biologic sau cultur bacterian), ea se introduce la nceput n poriunea inferioar a flcrii, pn la arderea produsului, apoi se ridic uor spre vrful flcrii. n acest mod persoana care manipuleaz ansa evit s se stropeasc cu materialul ce poate sri din ans. Instrumentele metalice tietoare sau neptoare din oel inoxidabil pot fi deteriorate dac se sterilizeaz prin aceast metod, datorit declirii oelului. STERILIZAREA LA PUPINEL, ETUV TERMOREGLABIL Sterilizatorul cu aer cald este un cuptor (cuptor Pasteur) cu perei dubli, ntre care se gsete sursa de cldur. Pereii interiori sunt perforai, pentru a permite circulaia aerului cald. Sterilizatorul poate fi cu sau fr ventilator. El are n mod obligatoriu un afiaj mecanic sau electronic pentru temperatur i timp, care permite fixarea i urmrirea parametrilor de funcionare. (Fig. 1). Agentul de sterilizare este aerul uscat i cald, la 180C, care acionea 1 or efectiv, din momentul atingerii temperaturii de sterilizare n interiorul ncrcturii. Fig. 1.a. Pupinel; b. Principiul de funcionare al pupinelului

La sterilizatorul cu aer cald se sterilizeaz sticlria i instrumentarul care nu suport sterilizarea cu aburi sub presiune (oel ne-inoxidabil: cromat). Sterilizatorul cu aer cald este contraindicat pentru materiale textile, lichide i cauciuc. Obiectele de sterilizat sunt splate, uscate i ambalate n hrtie special (sticlria de laborator) sau cutii metalice (instrumentarul metalic). Cutiile metalice cu instrumentar se introduc nchise n incinta sterilizatorului cu aer cald. Durata meninerii sterilitii materialelor ambalate n cutii metalice este de 24 de ore de la sterilizare, cu condiia meninerii cutiilor metalice nchise. Durata meninerii sterilitii materialelor n ambalaje de hrtie sudate este de 2 luni de la sterilizare, cu condiia meninerii integritii lor i a manipulrii acestora numai prin intermediul coului. La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu aer cald se folosesc mnui. Se lipete o etichet sau banderol pe capac pentru a identifica dispozitivele medicale i materialele sterilizate. Se noteaz data i ora sterilizrii. Se noteaz n caietul de sterilizare: data, coninutul cutiilor (pachetelor), temperatura la care s-a efectuat sterilizarea, durata, rezultatele indicatorilor chimici, semntura persoanei responsabilizate cu sterilizarea, observaii. Sterilizarea prin cldur umed: STERILIZAREA CU ABUR SUB PRESIUNE AUTOCLAVAREA Principiul sterilizrii cu abur sub presiune este de a expune fiecare la contactul cu aburul la temperatura i presiunea pentru timpul specificat: 121C la 1,01 atmosfere timp de 30 minute, pn la 134C la 2 atmosfere, timp de 30 minute. Timpul de sterilzare se msoar din momentul atingerii temperaturii efective n interiorul ncrcturii. Prin autoclavare se pot steriliza: instrumentar medical metalic, textile, sticlrie, cauciuc, plastic termostabil, ap i soluiilor apoase, medii de cultur. Se pot utiliza 2 tipuri de autoclave: 1. Autoclave cu pre i post vacuumare. Realizeaz sterilizarea optim a instrumentarului chirurgical din oel inoxidabil i singura metod posibil pentru sterilizarea materialului moale (textile), cauciucului, sticlriei. Este folosit i n decontaminarea deeurilor din laborator (deeuri infecioase). 2. Autoclave fr post vacuumare. Sunt folosite pentru sterilizarea mediilor de laborator i lichidelor n flacoane. Timpul de ptrundere al aburului este prelungit datorit eliminrii incomplete a aerului. La ncheierea ciclului complet de sterilizare se ateapt s se rceasc, se evacueaz aburul, apoi se deschide ua autoclavului. Nu se deschide niciodat sterilizatorul cu aur sub presiune nainte ca temperatura s fie sub 100C. La extragerea pachetelor din sterilizatorul cu abur sub presiune se folosesc mnui din bumbac. Cutiile, casoletele, i pachetele sterilizate se depoziteaz temporar pe o suprafa special destinat materialului steril i se aranjez n dulapuri special destinate depozitrii materialului steril. Cutiile, casoletele, courile, navetele cu pachetele sterilizate se eticheteaz (banderoleaz) otndu-se data, ora, sterilizatorul cu abur sub presiune la care s-a efectuat sterilizarea, persoana care a efectuat sterilizarea.

Fig.2 a. Autoclav vertical model clasic

b. Autoclav orizontal

Controlul sterilizrii se poate face prin metode fizice, chimice i biologice. a). Verificarea temperaturii: Se citete temperatura termometrului sau temperatura afiat pe monitor. Temperatura se noteaz n caietul de sterilizare.La autoclav: verificarea presiunii la manometru i a temperaturii. b). Verificarea indicatorilor fizico-chimici: - virarea culorii la benzile adezive cu indicator fizico-chimic. - virarea culorii la indicatorii fizico-chimici integratori. Indicatorul integrator plasat n interiorul cutiilor metalice indic dac au fost ndeplinite condiiile pentru o sterilizare eficient temperatura atins n interiorul pachetului i timpul de expunere. n situaia n care virajul nu s-a realizat, materialul se consider nesterilizat i nu se utilizeaz. O dat pe lun - se utilizeaz indicator biologic cu Bacillus subtillis pentru controlul eficacitii sterilizrii. Pentru sterilizarea la pupinel pot fi utilizai indicatori biologici cu Bacillus subtillis preparai industrial, comercializai, care conin 106 UFC sau preparai n laborator. Acestea se plaseaz n mijlocul incintei sterilizatorului cu aer cald, odat cu celelalte pachete

pentru sterilizat. Se realizeaz ciclul complet de sterilizare. La sfritul ciclului, indicatorii biologici se extrag din cutie i se incubeaz 48 ore la 56C, la laborator. Laboratorul va emite un buletin de analiz cu rezultatul constatat. Pentru controlul sterilizrii la autoclav sunt admii indicatorii biologici cu forme diferite de condiionare: Indicatori biologici cu Bacillus stearothermophylus impregnai pe supori de bumbac n concentraii de 106 UFC. Acetia se pun n interiorul unei cutii-test. Cutiatest se introduce n autoclav odat cu materialul de sterilizat i se realizeaz ciclul complet de sterilizare. La sfritul ciclului, indicatorul biologic este trimis la laborator, unde este extras, nsmnat i incubat; citirea se face la 7 zile. Controlul bacteriologic al sterilizrii la autoclav cu indicator tipStearotest 120, pentru controlul sterilizrii la autoclav la temperatura de 120C cu o durat de 30 minute. Acest produs este o suspensie de spori de Bacillus stearothermophyllus n soluie nutritiv, cu indicator de pH. Coninutul fiolelor de Stearotest 120 este limpede de culoare violet. Fiolele de tipStearotest 120 se introduc n autoclav printre dispozitivele medicale i materialele supuse sterilizrii. Se efectueaz sterilizarea, la 120C, timp de 30 min; dup sterilizare fiolele sunt aezate ntr-un incubator de 56C. Citirea i interpretarea rezultatelor: -meninerea aspectului (culoare, transparen) nemodificat arat o sterilizare corect; -virajul la galben al indicatorului de pH i o uoar opalescen a coninutului indic o sterilizare sub parametrii de eficien optim (au rmas spori viabili s-au cultivat i au modificat aspectul produsului). La 6 luni Se efectueaz verificarea aparatului de ctre un tehnician autorizat. STERILIZAREA PRIN FILTRARE Sterilizarea prin filtrare reprezint trecerea unui lichid printr-un filtru cu porii avnd dimensiuni mai mici dect ale bacteriilor sau ale virusurilor (ultrafiltrare). Filtrele bacteriologice sunt de mai multe tipuri: Filtre Seitz, din azbest Filtre Chamberland, din porelan poros Filtre din sticl Yena, etc Filtrele se sterilizeaz prin autoclavare. Lichidul de sterilizare este aspirat cu ajutorul unei pompe de vid. n situaiile n care n laboratoare este necesar lucrul n condiii aseptice (prelucrare produse ce conin M.tubreculosis, tehnic PCR), se utilizeaz incintele aseptice cu protecie suplimentar hote cu flux laminar. Acestea au un spaiu de lucru, cu perei de sticl i un compartiment superior metalic, care conine 2-3 filtre ( foltru din fibr poliamidic i 1-2 filtre HEPA). Circulaia aerului se face cu ajutorul unui ventilator. STERILIZAREA CU AJUTORUL RADIAIILOR Radiaiile ionizante ( , , ,X) au o bun capacitate sterilizant, dar sunt nocive pentru organismul uman. De aceea se folosesc numai n activitatea industrial i nu sunt folosite n

activitatea medical. Radiaiile neionizante UV sunt folosite pentru sterilizarea suprafeelor i aerului n laboratoare, sli de operaie, pentru sterilizarea apei n bazine. Lmpile de UV trebuie folosite n laboratorul de bacteriologie cte 10 minute, de mai multe ori pe zi, dup evacuarea prealabil a personalului din ncpere. 2.2 STERILIZAREA CHIMIC: STERILIZATOARE CU OXID DE ETILEN Sterilizarea cu oxid de etilen se utilizeaz numai atunci cnd nu exist alt mijloc de sterilizare adecvat pentru obiecte i echipamente termosensibile. Materialul medico-chirurgical care se sterilizeaz cu oxid de etilen: Obiecte din material plastic i materiale compozite, termosensibile i pentru care se cunoate perioada de timp necesar desorbiei; polielietilen, teflon, latex, silicon, acetatul de etilenvinil, poliuretan, polipropilen. Echipamentul medical constituit din pri de PVC (policlorura de vinil) sterilizat iniial cu radiaii ionizante sau raze gamma nu va fi resterilizat cu oxid de etilen, deoarece PVC elibereaz compui toxici - etilen clorhidrin. Oxidul de etilen este un gaz inodor, toxic, a crui prezen nu este perceput n aer. n amestec cu aerul, este exploziv pornind de la concentraia de 3% V-V. Prin inhalare: oxidul de etilen poate provoca iritaia cilor respiratorii i depresia sistemului nervos central, iar prin contact: reacii de iritaie a pieli i mucoaselor la personalul care efectueaz sterilizarea. Materialul supus insuficient tratamentului de desorbie utilizat la bolnavi poate cauza fenomene hemolitice, stenoze traheale, colaps cardiovascular i fenomene alergice. De aceea, sterilizatoarele cu oxidul de etilen trebuie s aib inclus n ciclul de sterilizare desorbia la sfritul programului. Sterilizarea cu oxid de etilen se va realiza n spaii ventilate, destinate numai pentru aceast activitate. DEZINFECIA 1.DEZINFECIA CHIMIC. SUBSTANE DEZINFECTANTE I ANTISEPTICE. Eficiena unei proceduri de dezinfecie depinde de natura substanei dezinfectante folosite fiind direct proporional cu concentraia acesteia i timpul de aciune, n timp ce prezena materiilor organice (snge, urin, materii fecale, culturi bacteriene) i a formelor sporulate reduc efectul dezinfectant. Spre deosebire de sterilizare, care este un termen cu semnificaie absolut (steril sau nesteril), dezinfecia poate fi de diferite grade: dezinfecie nalt, medie i slab. Dezinfecia nalt este orice procedur care reuete s inactiveze formele vegetative ale bacteriilor, virusurile, paraziii i ciupercile microscopice. Dezinfectante puternice: Glutaraldehida: soluie apoas 2% Formaldehida: soluie apoas 8%

Amestecul sulfocromic: acid sulfuric+ bicromat de potasiu+ ap Peroxidul de hidrogen 3-6% Acidul peracetic n diferite concentraii Hipocloritul de sodiu

Timpul de aciune necesar pentru ca aceste substane s realizeze o dezinfecie de nivel nalt este de minim 20 minute. Este absolut necesar s se respecte instruciunile de folosire ale fiecrui preparat comercial, aa cum sunt specificate de productor. Dac dezinfectantele puternice acioneaz un timp suficient i pe substratul respectiv nu exist spori bacterieni, se poate realiza o sterilizare chimic. Dezinfectante cu putere medie: Realizeaz distrugerea Mycobacterium tuberculosis, a bacteriilor n form vegetativ, a celor mai multe virusuri i fungi, dar nu i a sporilor bacterieni. Substanele chimice care realizeaz dezinfecia de nivel intermediar sunt: Iodofori (compui iodai): combinaii ale iodului cu o substan stabilizatoare sau transportatoare. La diluarea n ap, din aceste complexe se elibereaz iodul liber, cu aciune antimicrobian 50-150 mg /1000ml ( 5-15%). Exemple de substane transportatoare: compui cuaternari de amoniu, polivinilpirolidon, detergeni. Compui clorurai: elibereaz Cl liber i ClO2. Conin 0.5-5 g Cl /1000ml. Cloramina, hipocloritul Alcooli: etilic, izopropilic 70% vol/vol. Compui fenolici: 0.5-3% n ap Detergenii Detergeni neutri folosii pentru: mobilier, pavimente, vesel i splarea manual a textilelor. Detergeni alcalini sau decapani folosii pentru pavimente. Detergeni acizi sau detartrani utilizai pentru materiale cu depuneri de piatr: ceramic, pavimente placate cu materiale care suport acizi, sticlrie de laborator, bazine, bazinete, urinare. Detergeni-dezinfectanii sau detergenii cationici sunt produse a cror proprietate principal este cea de curare i secundar dezinfectant. Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este de 10 minute. Dezinfectante slabe: Pot distruge cele mai multe bacterii n forma vegetativ, unele virusuri, unii fungi, dar nu distrug microorganisme rezistente, ca Mycobacterium tuberculosis, sau sporii bacterieni. Compui cuaternari de amoniu. Dezinfectante care conin fenoli, iodofori i ageni de spumare; Timpul de contact necesar al substanei chimice cu substratul tratat este de sub 10 minute.

n funcie de suportul tratat, se pot folosi urmtoarele metode de aplicare a dezinfectantelor chimice. Imersie (recipiente pentru recoltarea produselor patologice, instrumente, pipete, lame de microscop), tergere (mese de lucru n laborator, aparate, pavimente), stropire, pulverizare (ui, ferestre). Pregtirea n vederea sterilizrii a materialului medico-chirurgical utilizat cuprinde mai multe etape: Curarea / decontaminarea (predezinfecie) echipamentelor: realizat imediat dup utilizarea acestora, ct mai aproape de locul utilizrii. - diminueaz populaia de microorganisme - previne uscarea produselor biologice - contribuie la protecia personalului care-l manipuleaz - contribuie la protecia mediului mpotriva contaminrii Se realizeaz n dou etape: 1. faza de pretratament, realizat prin imersia dispozitivelor utilizate, n soluie de detergent - dezinfectant (cu aciune de detaare a murdriei grosiere de pe substrat i aciune bactericid) 2. faza de curare manual sau mecanic Clatire riguroas sub jet de ap potabil; Dezinfectie, utiliznd un dezinfectant adecvat, dintre cele cu putere nalt sau medie; Cltire cu ap; Uscare cu prosop curat sau aer comprimat. ANTISEPTICELE sunt preparate cu proprieti antimicrobiene, ele distrug, sau inactiveaz microorgnismele de la nivelul esuturilor vii. Ele reduc temporar de pe piele i mucoase numrul de microorganisme. Utilizarea antisepticelor permite: - realizarea ngrijirilor aseptice, - reducerea transmiterii germenilor, de la bolnav la bolnav, prin intermediul minilor, - tratarea infeciilor locale cutanate si mucoase. Substane antiseptice Alcooli: etanol, izopropanol 70% vol/vol 35% vol/vol Compui iodai 1-2%: alcool iodat, tinctur de iod, betadina:povidoneiodine 7,5-10% Compui clorurai: Clorhexidina ( 0,75-4%), Hexaclorofen (1-3%) H2O2 3% Compui colorai:Violet de geniana, albastru de metilen, fucsina Permanganat de potasiu Nitrat de argint 0,1%

Clorura de benzalkonium:soluie alcoolic 0,1-0,2% (piele), soluie apoas 0,1-0,2%(plgi) soluii oftalmice: 0,01%, instilaii vezic urinar i uretr: 0,005% Spunuri i detergeni DEZINFECIA PRIN MIJLOACE FIZICE

Dezinfecia prin cldur Cldura uscat: flambarea. Flambarea const n trecerea unui obiect prin flacr. Este utilizat n laborator, pentru eprubete de sticl, lame de microscop, etc. Nu se folosete pentru instrumente medico-chirurgicale. Cldura umed: fierberea i pasteurizarea Fierberea n ap la temperatura de 100C timp de minim 20 minute realizeaz distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor patogene. Fierberea apei i alimentelor reprezint o metod de prevenire a bolilor transmisibile cu poart de intrare digestiv. Pasteurizarea: este o metod de dezinfecie a lichidelor, la temperaturi cuprinse ntre 55 - 95C. Dup expunere, de durat variabil, sunt distruse 90 95% dintre formele vegetative ale microorganismele patogene. Dezinfecia prin splare la temperatura de 60 - 95C este un proces complex la care, pe lng aciunea cldurii umede, se adaug i aciunea detergenilor sau a altor substane, ct i aciunea mecanic de splare. Acest procedeu se folosete la splarea i dezinfecia lenjeriei, veselei, sticlriei de laborator, instrumentarului. Dezinfecia cu raze ultraviolete Indicaii: dezinfecia suprafeelor netede i aerului n boxe de laborator, sli de operaii, alte spaii nchise, pentru completarea msurilor de curenie i dezinfecie chimic. Lmpile destinate dezinfeciei pot fi fixe sau mobile, cu tuburi de UV ntre 15 i 30 W, prevzute s funcioneze n absena omului (cu radiaie direct) sau n prezena omului (cu radiaie indirect, ecranat i fr emisie de ozon). Exemple de produse comerciale de detergeni dezinfectani i dezinfectani Virkon (Antec international) detergent-dezinfectant; amestec de peroxizi, surfactant, acizi organici i sruri anorganice. Poate fi folosit pentru suprafee dure (faian, pavimente), n laboratoarele medicale pentru aparatura de laborator, cuve, centrifugi, pipete. Biguacid S (Antiseptica) dezinfectant-detergent, conine didecyl-dimethyl ammoniumchlorid i biguanin. Poate fi folosit pentru suprafee, pavimente, grupuri sanitare. Combi-instruments (Antiseptica) dezinfectant - detergent lichid pentru instrumentar chirurgical i din laboratoare (sticl, porelan, metal, cauciuc, mase plastice). Conine: glutaraldehid, clorur de benzalkonium, didecyl-dimethyl ammonium-chlorid. Big Spray (Antiseptica) amestec de ethanol propanol poyhxanide. Spray dezinfectant, utilizat prin pulverizare, pentru dezinfecia suprafeelor din sli de operaie, ambulane, mobilier, haine, saltele, perne. Mikrozid Liquid (Shulke &Meyer) - amestec de etanol i propanol. Dezinfectant pentru suprafee, grupuri sanitare. Lysetol AF (Shulke &Meyer) - conine: guanidinacetat, fenoxipropanol, clorur de benzalconiu. Dezinfectant pentru instrumentarul medico-chirurgical.

Perform FF (Shulke &Meyer) - conine peroximonosulfat de potasiu, benzoat de sodiu, acid tartric, spun. Indicat n dezinfecia i curarea suprafeelor i obiectelor de inventar lavabile. Terralin (Shulke &Meyer) - amestec de clorur de benzalconiu i propanol. Poate fi folosit pentru curirea i dezinfecia pardoselilor, peteilor, grupurilor sanitare i obiectelor de inventar lavabile. Fig.3 Simboluri pentru modul de utilizare a dezinfectantelor

Exemple de produse comerciale de antiseptice Desmanol (Shulke &Meyer) conine digluconat de clorhexidin i propanol. Utilizat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor. Desderman N (Shulke &Meyer) - conine etanol, bifenilol, polyvidone, isopropyl. Indicat pentru dezinfecia igienic i chirurgical a minilor. Primasept Med (Shulke &Meyer) conine bifenilol i propanol. Utilizat pentru dezinfecia igienic a minilor. Fig.4 Simbol pentru dezinfecia mainilor

CAPITOLUL 3 RECOLTAREA I TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE Recoltarea produselor patologice n scopul examenului microbiologic reprezint o etap extrem de important, de corectitudinea creia depinde n mare msur exactitatea diagnosticului. Recoltarea produselor patologice adecvate, n momentul corespunztor, cu respectarea regulilor de asepsie, transportul n condiii optime i ct mai rapid spre laborator sunt absolut necesare. Principii generale Recoltarea probelor trebuie fcut de medic sau sub ndrumarea acestuia. Se utilizeaz numai recoltoare sterile, pe care vor fi menionate datele de identificare: numele pacientului, secia, produsul i data recoltrii, nainte de a se face prelevarea. Recoltarea unui produs biologic n vederea evidenierii florei microbiene trebuie efectuat, pe ct posibil, naintea administrrii tratamentului cu antibiotice. Din produsul biologic se va recolta poriunea sau fragmentul cu aspect patologic, caracteristic. Prelevarea trebuie fcut n momentul optim, n sensul posibilitii prezenei unui numr ct mai mare de microorganisme i n funcie de evoluia clinic a bolii. Cantitatea de produs trebuie s fie suficient pentru a permite efectuarea mai multor examene. Transportul probelor recoltate la laborator trebuie s fie fcut n timp ct mai scurt, pentru a evita modificrile cantitative i calitative ale florei, sub aciunea deshidratrii, modificrilor de temperatur, pH, etc. n probele pstrate prea mult timp, microorganismele mor datorit deshidratrii, temperaturii prea sczute sau, din contr, altele (urina) sunt medii favorabile multiplicrii excesive a florei iniiale. n cazul n care transportul poate dura mai mult timp sau nu exist posibilitatea nsmnrii imediate a probelor, se folosesc recoltoare cu medii de conservare i transport.

Transportul probelor se va face n containere speciale, inscripionate cu meniunea material infectant, manipulate de persoane instruite, evitndu-se rsturnarea containerelor i vrsarea materialelor. HEMOCULTURA Prelevarea unei probe de snge pentru cultivarea pe medii adecvate hemocultura are indicaie n suspiciunea de bacteriemie, septicemie sau endocardit bacterian. De asemenea hemocultura este indicat n strile febrile prelungite fr o cauz decelabil. Este foarte important ca puncia venoas s fie fcut n condiii de asepsie, folosind pentru dezinfectarea pielii la locul punciei venoase alcool 80-95% i compui iodai: tintur de iod sau betadin, ce vor fi lsai s acioneze pe piele minim 1 minut. Persoana care recolteaz va purta mnui sterile. Vor fi recoltate cel puin trei probe, fie ntr-un interval de 24 h, n suspiciunea de endocardit, fie la intervale de timp determinate de evoluia clinic, n general n plin puseu febril, timp de 2-3 zile consecutiv. O singur prob este insuficient pentru stabilirea unui diagnostic corect, indiferent de rezultatul acesteia. Volumul de snge indicat a se recolta pentru hemocultur este de 20 ml la adult i 1-5 ml la copii, n funcie de vrsta acestora. Sngele se recolteaz cu seringa i se descarc imediat n mediile de cultur lichide speciale. Se folosete de regul un set de dou medii de cultur: aerobe i anaerobe. Raportul optim snge: mediu de cultur este de 1: 10 (flacoanele cu medii pentru hemocultur au n general 100 ml, pentru aduli i 20 ml pentru copii ). n cazul n care pacienii au primit deja antibiotice, exist medii de cultur aerobe i anaerobe cu inhibitori de antibiotice. Totui este de preferat ca mcar primele prelevri s se fac naintea instituirii tratamentului antibacterian sau antifungic. Incubarea hemoculturilor se face la 370 C, timp de 7 zile. n sistem clasic, se fac treceri pe medii solide la fiecare 24 h. Hemocultoarele automate efectueaz citiri cu ajutorul unei fotocelule ce nregistreaz modificarea turbiditii mediului prin creterea bacterian, la intervale de timp de 15-30 minute. Confirmarea pozitivrii hemoculturii precum i identificarea tulpinii izolate se face tot prin trecere pe medii de cultur solide. Dac dup 7 zile hemocultura nu s-a pozitivat, rezultatul definitiv va fi negativ (hemocultur steril). Catetere intravasculare Meninerea cateterelor intravasculare mai mult de 72h reprezint o surs important de episoade de bacteriemie i de infecii la locul de inserie al cateterului. Dup scoaterea cateterului, vrful de cateter segmentul distal, de 3-5 cm, secionat aseptic i introdus ntr-un tub cu capac steril, este trimis la laboratorul de bacteriologie. Aici, peste vrful de cateter se toarn 2-3 ml bulion steril, astfel nct s fie complet acoperit i va fi meninut astfel 24 h. Din bulion vor fi fcute treceri pe medii de cultur solide. Lichidul cefalorahidian (L.C.R.) Examenul lichidului cefalorahidian este indicat n suspiciunea de meningit: febr, cefalee, fotofobie, redoarea cefei, etc. Recoltarea L.C.R. se face prin puncie lombar, n condiii de asepsie strict, dup dezinfecia pielii cu betadin sau ali compui iodai. Prelevarea se face n sering, fr a aspira, apoi se descarc n flacoane sterile cu dop, sau/i n medii de cultur lichide pentru hemocultur.

Este de preferat s existe flacoane diferite: pentru cultur, examenul biochimic i examenul microscopic. Dac nu exist dect un singur flacon, atunci mai nti se efectueaz nsmnarea (cultura), apoi examenul biochimic i cel microscopic. La examenul macroscopic LCR normal este incolor, limpede, transparent. n meningitele bacteriene apare tulbure, glbui sau verzui. Culturile se fac pe medii solide, dar pot fi fcute i n medii lichide de hemocultur, n special la analizorul automat. Apoi, din L.C.R. se numr elementele (celulele), n camera de numrat Fuchs-Rosenthal. Valoarea normal a numrului de elemente celulare este mai mic de 5 elemente la 1 ml, acestea fiind n special limfocite. Dac numrul de celule depete limitele fiziologice, este necesar efectuarea unui frotiu colorat Giemsa pentru aprecierea raportului dintre mononucleare i polinucleare. n meningitele bacteriene, numrul de celule crete la cteva sute sau chiar mii la 1ml, predominante fiind polinuclearele. n meningitele virale, fungice i n meningita tuberculoas, numrul de elemente este mai redus i chiar dac n primele ore exist o predominen a polinuclearelor, ulterior raportul se inverseaz cu predominena mononuclearelor. L.C.R. este apoi centrifugat la 1500 g timp de 15 minute. Supernatantul este separat i va fi folosit la examenul biochimic: dozarea proteinelor, glucozei, clorurilor. Din sediment se efectueaz 2-3 frotiuri, colorate A.M., Gram i la nevoie ZiehlNeelsen. Teste imunologice, de detectare a antigenelor bacteriene sau fungice n LCR sunt recomandate atunci cnd exist modificri semnificative ale LCR: leucocite, glucoz sczut, proteine crescute, dar pe frotiu nu se observ flor sau pacientul a fost tratat n prealabil. Pot fi detectate antigene de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophylus influenzae, Streptococcus agalactiae sau Cryptococcus neoformans. Alte lichide normal sterile: lichidul peritoneal, lichidul pleural, lichidul sinovial, lichidul pericardic. Aceste lichide se recolteaz de regul prin puncie transcutan, n condiii de asepsie riguroas, n cantitate de 5-20 ml. Fiind produse normal sterile, orice microorganism de pe piele care contamineaz proba duce la rezultate complet eronate. Lichidul peritoneal se poate recolta i intraoperator, cu tamponul steril. Dac lichidul este purulent, se poate efectua un frotiu colorat Gram direct din produsul patologic. n caz contrar, se fac culturi aerobe i anaerobe. Bila Recoltarea bilei se poate face prin tubaj duodenal sau, dup colecistectomie, direct din vezica biliar cu tamponul steril sau n sering.Tubajul duodenal se efectueaz dimineaa pe nemncate, cu sonda Einhorn introdus pe nas sau pe gur, dup ce bolnavul a fcut gargar cu ser fiziologic. Se introduce sonda pn la diviziune 45, apoi se culc bolnavul pe parte dreapt i se continu introducerea sondei pn la diviziunea 60. Se aspir pe sond iniial bila A, bil amestecat cu suc duodenal. Se introduc pe sond 30 ml soluie de sulfat de magneziu sau sulfat de sodiu 40%, cu efect coleretic i colagog. Se aspir apoi bila B, de culoare verde nchis, vscoas (bila vezicular), apoi bila C, mai deschis la culoare i mai fluid (bila hepatic). Pentru examenul bacteriologic se folosete bila B, 10-20 ml.Din bila B se fectueaz culturi aerobe i anaerobe.Din eantioane de bil A, B i C se efectueaz preparate ntre lam i lamel pentru examenul parazitologic. Exudatul faringian i exudatul nazal

Exudatul faringian se recolteaz cu tamponul steril, de unic folosin. Recoltarea se face dimineaa pe nemncate, nainte ca pacientul s se spele pe dini, s-i fac toaleta bucal sau s bea ceva. De asemenea, recoltarea se face naintea oricrui tratament cu antibiotice sau local (badijonri cu substane antiseptice, antifungice sau antibacteriene). Pacientul este aezat cu faa spre lumin, i se indic s deschid gura ct poate de mult i cu ajutorul unui apstor de limb se preseaz limba astfel nct s se evidenieze peretele posterior al oro-faringelui i tonsilele palatine. Se examineaz macroscopic rapid oro-faringele i cu o micare rapid, blnd dar precis se terg cu tamponul peretele faringian i tonsilele. Nu se ating peretele superior al palatului i nici limba. (Secreia lingual este o investigaie aparte, cnd se recolteaz tot cu tamponul strict de pe suprafaa limbii). Exudatul nazal se recolteaz n mod similar, cu tampon steril, din fiecare fos nazal. Exudatul faringian i cel nazal se transport la laborator i se nsmneaz n cel mai scurt timp posibil, evitndu-se uscarea tamponului i efectul temperaturii sczute, care duc la moartea florei bacteriene, n special a streptococilor i pneumococilor. Pentru a evita aceste neajunsuri se pot folosi tuburi cu medii de conservare i transport. Secreiile conjunctivale, otice, secreiile de plag Secreia conjunctival se recolteaz cu tamponul steril, dimineaa, naintea efecturii toaletei i naintea aplicrii de coliruri sau de creme oftalmice. Prelevarea se va face din sacul conjunctival intern, eventual cu tamponul umezit n ser fiziologic steril. Secreia otic se recolteaz cu tamponul steril din conductul auditiv, nainte de aplicarea oricrui tratament cu antibiotice sau antiseptice. Secreiile de plag se vor recolta cu tamponul steril, nainte de toaleta plgii. Dac plaga este profund i secreia abundent, se va recolta cu seringa steril i o prob pentru cultur n anaerobioz. Sputa Sputa poate fi recoltat prin expectoraie ntr-un recipient steril (gradat, de unic folosin). Pacientul este instruit ca dimineaa, dup un acces de tuse, s expectoreze n recipientul steril, evitnd s amestece sputa cu saliva. Acest lucru este dificil de realizat, principalul neajuns al metodei este c produsele sunt frecvent contaminate cu flor din cavitatea bucal. Probele de sput recoltate n cursul bronhoscopiei sunt ferite de acest inconvenient, contaminarea cu flor bucal fiind practic neglijabil. Aceast metod este cea mai recomandabil. La copiii mici, care nu tiu s expectoreze i nghit sputa. Aceasta poate fi recoltat prin tubaj gastric urmat de introducerea a 10-20 ml ser fiziologic, urmat de aspiraie. n lichidul aspirat va fi i sputa nghiit, dar micobacteriile i fungii coninui pot fi de origine gastric. Urina Recoltarea urinei pentru urocultur este indicat n suspiciunea de infecie urinar. Recoltarea se poate face n mai multe moduri.n majoritatea cazurilor, urina se recolteaz n timpul primei miciuni de diminea, din mijlocul jetului. Pacienii sunt instruii ca nainte de prima miciune s efectueze o toalet genital riguroas, cu ap i spun, apoi s se tearg cu tifon steril, iar femeile care au secreii genitale abundente s-i introduc un tampon intravaginal. Aceste msuri

sunt absolut necesare pentru a evita contaminarea probei de urin cu flor de la nivelul mucoasei genitale. Recoltarea se face n flacoane steile, de unic folosin. Pacientul va ncepe s urineze, pentru ca prima poriune a jetului s elimine flora existent la nivelul uretrei terminale; apoi va ntrerupe voluntar miciunea; va deuruba flaconul steril i a doua parte a jetului (mijlocul jetului) o va urina direct n flacon 2-3 ml. Va astupa flaconul. Va termina miciunea normal, n toalet. La bolnavii care nu-i pot controla miciunea (copii mici, aduli incontieni) i la cei la care oricum se efectueaz sondaj vezical evacuator (adenom de prostat, etc.) recoltarea urinii pentru urocultur se face pe sond. Aici exist ns pericolul introducerii n vezica urinar a florei de la nivelul uretrei terminale sau chiar flor exogen. Puncia suprapubian transcutanat permite recoltarea unei probe de urin direct din vezica urinar. Urina fiind un excelent mediu de cultur, ea va fi pstrat la temperatura camerei maximum 2h pn la nsmnare, sau la frigider maxim cteva ore. Materiile fecale Materiile fecale se recolteaz n scopul efecturii coproculturii sau a examenului coproparazitologic. Coprocultura este indicat n bolile diareice, n febra tifoid i paratifoid i pentru depistarea portajului de enterobacterii obligat patogene. Recoltarea se face n coprorecoltoare sterile, cu mediu de conservare i transport. La bolnavii cu diaree, materiile fecale se recolteaz din scaunul emis spontan, ntr-un recipient steril, fr urme de detergeni sau dezinfectani. Cu linguria cu care este prevzut coprorecoltorul special, pacientul va recolta o cantitate mic din prob, n special cu snge sau mucus, dac exist. Proba va fi introdus n coprorecoltor, n mediul de conservare i transport Carry-Blair. Materiile fecale mai pot fi recoltate prin sondal rectal, cu sonda Nelaton, introdus 10-12 cm la copil i 16-18 cm la adult, i aspirnd prin presare la captul distal al sondei. Aceasta va fi apoi descrcat n ser fiziologic steril sau n mediul Carry-Blair din coprorecoltor. Pentru suspecii de portaj de enterobacterii patogene, recoltarea materiilor fecale se va face dup administrarea unui purgativ salin (sulfat de sodiu i de magneziu). Pentru examenul coproparazitologic, recoltarea se face n mod similar, proba introducndu-se ntr-un coprorecoltor de unic utilizare fr mediu de conservare i transport. Secreiile genitale: secreia vaginal i secreia uretral. Secreia vaginal se recolteaz pe masa ginecologic. Este de preferat ca femeia s se afle n primele 5-10 zile dup menstruaie, pentru a evidenia mai bine parazitul Trichomonas vaginalis. Ca tamponul steril se recolteaz secreie din vagin i din fundul de sac posterior, iar din secreia acumulat pe valv, se depun probe pe 2-3 lame de microscop, pentru preparatul proaspt i pentru frotiuri. Pentru preparatul proaspt lamele i serul fiziologic folosit trebuie inute la termostat la 37 O C, iar examinarea microscopic s fie fcut n 10-15 minute de la recoltare. Frotiurile se coloreaz Albastru de metilen i Gram. Culturile se fac pe geloz-snge, geloz chocolat, Muller-Hinton sau Thayer-Martin i AABTL.

Secreia uretral la bolnavii cu uretrite acute este de obicei abundent. La bolnavii cu uretrite cronice este mult mai redus. Ea se recolteaz dimineaa, nainte de miciune. Dup un masaj uor al uretrei anterioare, ca s se exprime cteva picturi de secreie (pictura matinal). Cu un tampon steril se recolteaz pentru cultur, apoi se depune cte o pictur pe 2-3 lame de microscop, pentru examenul direct i pentru frotiuri. n vederea depistrii parazitului Trichomonas se poate examina sedimentul urinar al primului jet de urin recoltat de diminea. Scuame cutanate, fire de pr Scuamele cutanate se recolteaz prin raclare uoar, cu o lam de bisturiu, din regiunea periferic a leziunii, apoi se introduc ntr-o eprubet steril. Firele de pr modificate se recolteaz cu pensa prin smulgere, apoi se introduc ntr-o plac Petri steril. Unghiile parazitate se taie cu o foarfec dezinfectat i se introduc ntr-o plac petri steril. Aceste produse vor fi supuse unor examene micologice i eventual bacteriologice.

CAPITOLUL 5 EXAMENUL MICROSCOPIC Microscopul permite observarea corpurilor foarte mici, sub limita de vizibilitate a ochiului liber, ntre care i microorganismele.

A. Microscopul fotonic posed o surs de iluminat, un condensor care regleaz intensitatea luminii, un sistem de lentile care amplific imaginea, i platina, suprafaa pe care se aeaz preparatul microscopic. Lentila obiectiv (numit n mod curent obiectivul ), este cea din apropierea platinei . Un microscop are mai multe lentile obiectiv, cu putere de amplificare diferit (10X, 20X, 40X, 100X) fixate pe un dispozitiv mobil numit revolver. n funcie de necesiti, prin rotirea revolverului se utilizeaz obiectivul dorit. Lentilele ocular (sau ocularele), sunt cele din apropierea persoanei care face examinarea. Ele sunt de obicei 7X sau 10X. Fig. 5 Schema unui microscop optic
O c u l a r e

v o

l v e

i e

c t i v

o D S u

d i a

s o g d e m

r a l u m i n a C o n t r o i n p l a n lu o l m i s c a r i i r i z o n t a l M M a c r o v i z a i c r o v i z a

f r a

r s a

Mrirea obinut cu ajutorul microscopului optic (puterea de mrire a microscopului) este egal cu puterea de mrire a lentilei obiectiv nmulit cu puterea de mrire a lentilei ocular: Obiectiv Ocular Mrire 20 X 7X 140 40 X 280 100 X 700 20 X 10 X 200 40 X 400 100 X 1000 O alt caracteristic a unui microscop este limita de rezoluie, distana cea mai mic ntre dou puncte necesar pentru ca acestea s fie vizibile. Microscopul optic folosete o surs de lumin cu radiaii din spectrul vizibil, iar fasciculul de raze are un sens ascendent, paralel cu axul optic principal i strbate direct preparatul microscopic. Limita sa de rezoluie este de 0,2 m.

Microscopul cu fond ntunecat (ultramicroscopul) realizeaz luminarea din lateral a preparatului; n obiectiv nu ptrund dect razele reflectate de marginile celulelor (bacteriilor, de exemplu), care apar albe, strlucitoare, refringente, iar fondul este negru ( ntunecat). Aceste microscoape pot fi realizate din microscoape optice, prin nlocuirea condensorului cu un condensor special, prevzut cu un disc opac central. Microscopul cu fond ntunecat permite examinarea preparatelor proaspete, necolorate (Treponeme, Leptospire) i permite studiul obiectelor transparente. Microscopul cu contrast de faz folosete transformarea diferenei de faz a luminii care traverseaz un preparat n diferen de intensitate, sesizabil cu ochiul liber. Este folosit la studiul preparatelor cu celule vii, preparatelor proaspete necolorate i al celor slab colorate: Ricketsii, Treponeme, Leptospire. Microscopul cu fluorescen la care sursa de lumin folosete radiaii din domeniul U.V. apropiat spectrului vizibil i vizibil. Se bazeaz pe fenomenul de fluorescen - fenomenul de emitere a unor radiaii luminoase din spectrul vizibil de ctre o celul sau substan, dac aceasta este supus aciunii unei radiaii excitante externe, cu durata mai mic de 107 sec. Fluorescena celulelor sau microorganismelor poate fi: - primar ( natural), proprie celulei respective - secundar, sau rezultat prin cuplarea celulei respective cu o substan fluorescent numit fluorocrom. Cei mai importani fluorocromi sunt: Izotiocianatul de fluorescein, Rhodamina, Auramina, Eozina. Un preparat colorat cu fluorocromi trebuie examinat ntotdeauna n paralel cu un preparat similar necolorat (martor), pentru a face diferena ntre fluorescena preparatului colorat de cea natural a unor celule. Microscopul cu fluorescen este folosit n bacteriologie, virusologie, parazitologie i imunologie ( imunofluorescena). Microscopul electronic folosete lentile electronice: cmpuri magnetice, electrice sau electromagnetice, care acioneaz asupra unui fascicul de electroni accelerai, pe care l poate focaliza sau defocaliza. Un astfel de microscop are o putere de rezoluie de 100.000 ori mai mare dect a unui microscop optic. Principalele tipuri de microscoape electronice sunt : - M.E. prin transmisie folosit pentru examinarea unor preparate transparente la trecerea unui fascicul de electroni. Schematic, este format dintr-o surs de electroni accelerai (tub electronic), sistem de lentile condensor (cmpuri electrice sau magnetice), portobiect, lentil obiectiv, lentil proiector (tot electromagnetic) i ecran de observaie fluorescent sub aciunea electronilor. - M.E. prin baleiaj, folosit pentru observarea suprafeelor obiectelor solide. Este format dintr-o surs de electroni accelerai, un sistem de baleiere a fasciculului de electroni pe suprafaa preparatului de examinat, un sistem de detecie a electronilor emii de pe suprafaa preparatului, un sistem de amplificare video i un tub cinescopic. Ambele tipuri de M. E. Sunt dotate cu un sistem ce asigur vid naintat pe tot traiectul parcurs de electroni, traiect ce se gsete ntr-o structur nchis numit coloana microscopului electronic. Preparatele microscopice pentru microscopia fotonic utilizate n microbiologie. n vederea examenului microbiologic, preparatele microscopice pot fi efectuate att din produsele patologice, ct i din culturi. Preparatele microscopice pot fi de dou feluri: - preparate proaspete (native), ntre lam i lamel - preparate uscate, fixate i colorate frotiurile

Preparatul proaspt Materiale necesare: lame de microscop curate,degresate i uscate, lamele de microscop, pipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic steril, soluie Lugol. Tehnica de execuie: dac produsul patologic este lichid sau cultura bacterian este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur din acestea i se depune pe o lam de microscop. Se acoper cu o lamel. Se examineaz cu obiectivul 40 X. - Dac produsul patologic este solid sau cultura bacterian este pe mediu solid, pe lama de microscop se depune o pictur de ser fiziologic steril, apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene, se emulsioneaz n pictura de ser fiziologic, apoi se acoper cu lamel i se examineaz cu obiectivul 40X. Este folosit pentru examinarea bacteriilor, paraziilor, fungilor Avantajele preparatului proaspt: - este uor de executat i se efectueaz rapid - evideniaz forma i mobilitatea microorganismelor (viabilitatea celor mobile). - preparatul poate fi examinat i la microscopul cu cu cmp ntunecat sau la microscopul cu contrast de faz. Dezavantaje: - microorganismele sunt vii, deci exist posibilitatea contaminrii. - dac examinarea nu se face n 10-15 minute, preparatul se usuc i examinarea devine imposibil. - nu poate fi pstrat. FROTIUL Materiale necesare Lame de microscop curate,degresate i uscate Pipete, ans bacteriologic, bec Bunsen, ser fiziologic steril Tehnica de execuie: Etapele efecturii unui frotiu sunt: a. ntinderea frotiului b. uscarea c. fixarea d. colorarea a. ntinderea frotiului: dac produsul patologic este lichid sau cultura bacterian este n mediu lichid, cu pipeta steril se ia o pictur din acestea i se depune pe o lam de microscop. Dac produsul patologic este solid sau cultura bacterian este pe mediu solid, pe lama de microscop se depune o pictur de ser fiziologic steril, apoi ansa steril se ncarc cu produs sau cu 2-3 colonii microbiene i se emulsioneaz n pictura de ser fiziologic urmrind s se obin o suspensie omogen i nu prea dens . Apoi, cu ansa, prin micri concentrice, se ntinde pictura n strat subire. b. Uscarea frotiului se face la temperatura camerei. Uscarea brusc, la temperaturi ridicate, produce fierberea apei din frotiu , cu distrugerea morfologiei i structurii celulelor. c. Fixarea se face la cald, prin trecerea lamei, cu frotiul n sus peste flacra becului Bunsen de 3-4 ori. Fixarea realizeaz aderarea frotiului de lam ,

astfel nct nu se va desprinde cu ocazia procedurilor de splare din timpul colorrii, asigur omorrea microorganismelor i crete susceptibilitatea acestora la colorani. d. Colorarea este o etap esenial n executarea unui frotiu. Coloraiile cel mai frecvent folosite n bacteriologie se clasific n : - coloraii simple: coloraia cu albastru de metilen ( A.M.) - coloraii duble: coloraia Gram - coloraii speciale: coloraia Ziehl-Neelsen, Coloraia Del Vechio, coloraia pentru capsul, coloraia pentru spori, coloraia pentru flageli, etc. Coloraia cu albastru de metilen este o coloraie simpl, rapid, neagresiv asupra bacteriilor prin lipsa unor timpi de decolorare i recolorare, i care permite o orientare rapid asupra prezenei i morfologiei baceriilor. De asemenea, permite vizualizarea capsulei bacteriene sub forma unui halou clar n jurul acestora. Tehnica coloraiei albastru de metilen: - frotiul bine uscat i fixat se acoper cu soluie albastru de metilen 1%, timp de 2-3 minute - se scurge colorantul i se spal cu ap - se usuc n stativ, la temperatura camerei La examenul microscopic bacteriile i levurile apar colorate albastru nchis, iar celulele eucariote: leucocite, celule epiteliale, etc, n albastru deschis, cu nucleii mai nchii. Coloraia Gram este cea mai utilizat coloraie n bacteriologie. Imaginat n 1884 de danezul Hans Christian Gram, a suferit mici adaptri de-a lungul anilor, dar n esen a rmas neschimbat. Permite vizualizarea marii majoriti a bacteriilor, cu ncadrarea n categoriile morfologice: coci, bacili, etc. i diferenierea lor n cele dou mari clase: bacterii Gram-pozitive i bacterii Gram-negative. Timpii coloraiei Gram ( modificat de Hucker): - frotiul uscat i fixat se acoper cu soluie de Violet de geniana sau Cristal violet , 1-3 minute - se scurge colorantul i se spal cu ap - se acoper frotiul cu soluie Lugol, 1 minut - se scurge Lugolul i se spal cu ap - decolorare cu alcool-aceton 25 secunde (strict) - se spal cu ap - se acoper frotiul cu soluie fuxin 10% diluat extemporaneu, 1 minut - se scurge colorantul i se spal cu ap - se usuc n stativ, la temperatura camerei La examenul microscopic, unele bacterii apar colorate n violet Gram pozitive, altele apar colorate n roz- Gram negative. Diferena de colorabilitate se datoreaz structurii diferete a peretelui celular la cele dou categorii de bacterii: Unele au peretele format din mai multe straturi de peptidoglican, impenetrabil pentru alcool-aceton, astfel nct violetul nu este extras din celul. Altele au peretele format din puine straturi de peptidoglican i bogate n lipide, care se solubilizeaz n alcool-aceton, permind decolorarea violetului i colorarea cu fuxin.

Coloraia Ziehl-Neelsen evideniaz bacterii acid-alcoolo rezistente, din genurile Mycobacterium i Nocardia. Reactivi necesari: -Fuxin fenicat Ziehl 1% -Soluie alcool-acid (alcool 96% i acid aclorhidric sau azotic) Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen: - frotiul uscat i fixat se acoper cu fuxin Ziehl 1% i se nclzete dosul lamei ( cu flacr de alcool) pn la emisia de vapori, de 3 ori cte 5 minute. Nu se aduce la temperatura de fierbere a colorantului - se las s se rceasc - se vars colorantul i se spal cu ap - de colorare cu acid-alcool timp de 2-3 minute - se spal cu ap - se acoper cu albastru de metilen pentru recolorare 1 minut - se spal, se usuc n stativ la temperatura camerei La examinarea la microscop, bacilii acid-alcoolo-rezisteni apar colorai n rou. Celelalte bacterii, precum i celulele eucariote din frotiurole efectuate din produsele patologice, apar colorate n albastru. Mecanismul coloraiei este ptrunderea fuxinei fenicate n bacterii la cald i legarea acesteia de acizii micolici din peretele celular. La temperatura camerei, peretele celular al acestor bacterii este impenetrabil att la amestecul decolorant, ct i la colorarea cu A.M.

CAPITOLUL 7 TESTAREA SENSIBILITII IN VITRO LA SUBSTANELE ANTIBACTERIENE I ANTIFUNGICE Testarea sensibilitii in vitro la substanele antibacteriene se numete antibiogram. Testarea sensibilitii in vitro la substanele antifungice poart numele de antifungigram. Efectuarea lor reprezint un moment important al activitii n laboratorul de microbiologie iar utilizarea rezultatelor acestor testri permite un tratament intit, corect i eficient. Antibiograma difuzimetric standardizat (metoda Kirby-Bauer) Materiale necesare Mediul de cultur utilizat este de regul Muller-Hinton, mediu nutritiv i fr substane inhibitoare, cu pH 7,2-7,4. Mediul se toarn n plci Petri n strat de 4 mm grosime. O excepie o reprezint antibiograma pentru streptococi, la care mediul utilizat este geloza-snge. Inoculul bacterian este reprezentat de o suspensie cu densitatea de 0,5 Mc Farland ( aproximativ 108 microorganisme / ml ), efectuat din cultura pur a tulpinii ce urmeaz a fi testate. Aceast densitate se realizeaz cu aproximativ 2-3 colonii la 2 ml bulion, dar obligatoriu se verific i se ajusteaz la un densitometru. Discurile cu antibiotice conin cantiti standardizate din fiecare antibiotic. Vor fi folosite 2-3 antibiotice din fiecare clas i cteva antibiotice de rezerv. Ele vor fi alese n funcie de tulpina bacterian testat i eventual de sediul infeciei, de exemplu: setul de antibiotice la care se testeaz stafilococii, setul de antibiotice la care se testeaz streptococii, setul de antibiotice pentru bacilii Gram-negativi, setul de antibiotice pentru bacteriile izolate din infeciile urinare. Tehnica de lucru: Suspensia bacterian este nsmnat uniform pe toat suprafaa mediului, fie cu ajutorul unui tampon steril, fie prin inundarea plcii urmat de ndeprtarea excesului de inocul prin aspirare cu o pipet steril. Se las mediul 15-20 minute s se usuce. Se aplic comprimatele cu antibiotice, fie manual cu o pens steril fie cu aplicatorul mecanic, la distan de minim 30 mm ntre discuri i 25 mm de marginea plcii. Se las pe masa de lucru nc 15 minute, dup care se incubeaz la 37 0 C, cu capacul n jos, 24 h. Citire i interpretare n timpul incubrii antibioticele difuzeaz radiar n mediu. Un antibiotic eficient asupra tulpinii bacteriene testate realizeaz o zon de inhibiie a creterii cu att mai mare cu ct aciunea sa se manifest i la concentraii mai mici, dar i n funcie de mrimea moleculei acestuia i de capacitatea de difuziune. Cu ajutorul unei rigle gradate se msoar n mm diametrul zonei de inhibiie a fiecrui antibiotic. Prin compararea cu datele din tabele furnizate de productorii discurilor utilizate, se face evaluarea rezultatelor, pentru fiecare antibiotic fiind apreciat sensibilitatea tulpinii ca sensibil ( S), intermediar sensibil ( I ) sau rezistent ( R).

Prezena de colonii n interiorul zonei de inhibiie semnific dezvoltarea rezistenei secundare, interpretarea fiind R indiferent de mrimea diametrului zonei respective. Posibile surse de eroare: nerespectarea densitii inoculului, nerespectarea puritii culturii, excesul de umiditatea al mediului. Metoda diluiilor Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu lichid Metod cantitativ, ce permite determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i concentraiei minime bactericide (CMB) a unui antibiotic fa de tulpina testat. Este o metod laborioas, rezervat cercetrii i situaiilor n care este necesar administrarea de doze mari de antibiotice (endocardite, septicemii). Tehnica de lucru: I: Se pregtete o serie de eprubete cu cantiti egale de mediu Muller-Hinton lichid ce conin diluii crescnde dintr-un antibiotic. Se folosete un martor de cretere eprubet cu mediu dar fr antibiotic. n eprubete se adaug cantiti egale din suspensia bacterian standard de testat. Se incubeaz peste noapte la 37O C. Citire i interpretare: n tubul martor, fr antibiotic trebuie s existe cretere bacterian ) (tulburarea mediului); eprubetele n care mediul este limpede semnific, prin lipsa multiplicrii bacteriene, sensibilitatea la antibioticul testat. Ultima diluie care a inhibat creterea corespunde CMI. II: Din epubetele cu mediu clar se nsmneaz cte un sector de mediu Muller-Hinton solid, fr antibiotic. Dup incubare, se noteaz ultima diluie la care bacteriile nu au crescut pe mediul solid, aceasta corespunznd CMB. Antibiograma prin diluia antibioticului n mediu solid Se prepar soluiile stoc de antibiotic, cu concentraii de 5,120 g/ml, din care se vor face diluii binare, apoi diluia final 1:10 n geloz topit Muller Hinton. Apoi geloza se toarn n plci Petri n strat de 4 mm grosime, obinndu-se medii solide cu diferite concentraii de antibiotic. Pentru testarea streptococilor, la geloza topit se adaug 5% snge defibrinat de cal sau de berbec. nsmnarea mediului se va face cu ansa calibrat de 0,001 ml, care se ncarc cu suspensie dun cultura de testat cu densitatea de 0.5 McFarland. Se nsmneaz i un mediu fr antibiotic, pentru controlul creterii. CMI este dat de cea mai mic concentraie de antibiotic la care nu se observ colonii bacteriene pe suprafaa de inoculare. Metoda miniaturizat API de diluii n mediu lichid folosete galerii de testare a sensibilitii, ce conin antibiotice n stare deshidratat. Exist diferite tipuri de teste

 antibiograme convenionale, cu dou concentraii limit i incubare de 18-24h. antibiograme rapide, Rapid ATB, cu incubare de 4h, pentru stafilococi i enterobacterii. Principiul metodei Testele se bazeaz pe determinarea ratei de cretere a bacteriilor n prezena antibioticului. Galeriile sunt confecionate din material plastic transparent i conin 32 godeuri. Primele dou godeuri nu conin antibiotic i servesc drept martor de cretere. Lipsa creterii sau creterea insuficient n acestea invalideaz rezultatele. Celelalte godeuri conin antibiotice n form deshidratat, n diferite concentraii. n funcie de tipul de antibiogram, tulpina izolat poate fi testat la una sau mai multe concentraii ale unui antibiotic. Godeurile trebuie inoculate cu o suspensie bacterian n mediu special ATB medium sau NaCl 0,85%. Galeriile sunt apoi incubate un interval de timp corespunztor - 4h sau 24h la O 37 C. Citirea automat a galeriilor Msurarea creterii se face turbidimetric. Cititorul face msurtorile i le transfer apoi n computer, care stabilete profilul corespunztor (Rezistent, Sensibil, Intermediar sensibil). Interpretarea rezultatelor n general sunt testate dou concentraii limit, stabilite pe baze bacteriologice, farmacocinetice i terapeutice. Aceste concentraii permit aprecierea sensibilitii unei tulpini astfel: Sensibil - creterea bacterian este inhibat la ambele concentraii; Intermediar - creterea bacterian este inhibat numai de concentraia mai mare. Rezistent - creterea bacterian nu este inhibat de nici una din concentraii. Cnd antibioticele sunt testate la o singur concentraie, rezultatul se exprim n Sensibil sau Rezistent.

Figura nr. 6: Schema de utilizare a galeriei Rapid ATB STAPH E-Test este o tehnic cantitativ de determinare a sensibilitii la substanele antimicrobiene. E-Test se bazeaz pe o combinaie ntre metodele diluiei i difuziei, cuantificnd direct sensibilitatea prin determinarea valorii CMI (concentraia minim inhibitorie). E Test const n stripuri de plastic poros ce conin un antibiotic n concentraii descresctoare, calibrat cu o scal de citire a CMI n g/ml. Stripul se aplic pe suprafaa mediului inoculat n prealabil cu o suspensie standard din tulpina de testat. Incubarea: la 370C 24 de ore. Citirea: CMI se citete la punctul de inhibiie complet a creterii.

Exemplu: Testarea stafilococilor la Vancomicin prin metoda E-Test n conformitate cu normele NCCLS: Mediul: Muller-Hinton Inoculul: suspensie bacterian cu densitatea de 1 McF Interpretare: S 4 g/ml I 8-16 g/ml R 32 g/ml

Figura 7: Determinarea CMI prin E-test