Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Metode PCR
Metode PCR
moleculara
Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:
Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in
vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a
unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes
sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.
Numarul de copii ale secventei tinta creste exponential cu fiecare ciclu de amplificare,
deoarece fiecare secventa nucleotidica nou sintetizata constituie o matrita pentru o noua
copie. Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este
denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor
concentratii foarte scazute ale secventei tinta.
Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler), iar amestecul de
reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente:
- ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare;
- enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic: ADN polimeraza Taq
(izolata din Thermophilus aquaticus) pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o
tinta ARN - care are activitate atat de revers-transcriptaza, cat si de ADN polimeraza (permite
realizarea in acelasi amestec de reactie, atat a transcrierii inverse a ARN tinta in ADN
complementar - ADNc- cat si amplificarea ADNc);
- cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+;
- primeri (P1 si P2): secvente scurte, monocatenare, cu lungimea maxima 20-30 nucleotide,
care se leaga de o matrita monocatenara prin imperecherea complementara a bazelor;
servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN
prin atasarea lor la capatul primerilor, complementar cu matrita (observatie: ampliconul va
contine deoxiuridina in loc de o deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ);
- amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor
de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare; catalizeaza clivarea ADN-ului
care contine deoxiuridina la inceputul primului ciclu de amplificare si nu degradeaza ADN-ul
sau ARN-ul tinta.
1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul tinta este separat
(denaturat) in 2 catene;
In cazul determinarii ARN viral hepatita C, procesul se desfasoara intr-un mod similar, dar
se adauga si etapa de transcriere inversa a ARN-ului tinta pentru a genera ADN-ul
complementar (ADNc). Aceasta etapa este realizata tot de ADN polimeraza, ceea ce permite
ca atat transcrierea inversa cat si amplificarea PCR sa se produca impreuna cu detectia in
timp real a ampliconului.
Sondele de hibridizare sunt de asemenea folosite pentru stabilirea genotipului mutatiei, prin
analiza curbei de topire efectuata dupa incheierea ciclurilor de amplificare, cand ampliconul
este prezent in concentratii crescute.
Sonda marcata cu Red 640 hibridizeaza la o secventa a tintei care nu contine situsul mutatiei
(sonda ancora); sonda marcata cu fluoresceina hibridizeaza la o secventa care include
situsul respectiv (sonda a mutatiei). In cursul analizei curbei de topire, cresterea
semnificativa a temperaturii induce scaderea fluorescentei emise, deoarece sonda cu o
secventa mai scurta (sonda mutatiei) este prima care disociaza si cei 2 fluorofori nu mai sunt
in apropiere. Daca este prezenta mutatia factorului V, nepotrivirea sondei mutatiei cu tinta va
destabiliza hibridul, astfel ca scaderea fluorescentei se va inregistra la temperaturi mai joase.
In prezenta genotipului salbatic (fara mutatie), heteroduplexul ADN este stabil si va avea o
temperatura de topire mai mare. Genotipul heterozigot prezinta o combinatie distincta de
proprietati.
Rezultatul pentru ADN-ul unei probe trebuie sa prezinte intotdeauna un profil al curbei de
topire pentru unul din cele 3 genotipuri: tipul homozigot salbatic (mutatie absenta), mutant
homozigot sau genotip heterozigot. Daca nu se produce acest lucru, testul va fi considerat
invalid si vor trebui repetate toate etapele.
In plus, pentru validarea rezultatelor se folosesc 2 controale, negativ si pozitiv, cu mentiunea
ca, pentru acesta din urma trebuie sa se obtina obligatoriu un profil de genotip heterozigot.
Pentru analiza mutatiei protrombinei se foloseste o metoda similara.
Detectia tipurilor oncogene HPV
Testul include 4 procese majore:
- pregatirea probei;
- amplificarea ADN-ului tinta cu ajutorul unor primeri complementari specifici HPV;
- hibridizarea produsilor de amplificare la sonde oligonucleotidice specifice tintei;
- detectia acestora printr-o metoda colorimetrica.
Etapa de pregatire a probei consta in extractia ADN HPV din celule cervicale recoltate in
mediu lichid, printr-o tehnica manuala. Amplificarea se realizeaza intr-un termocycler, iar
detectia pe un analizor ELISA automat. Pentru monitorizarea acuratetii acestor 4 procese, se
foloseste un control celular reprezentat de ADN-ul -globinei umane care se va amplifica
simultan cu ADN-ul tinta. Amestecul de reactie contine perechi de primeri specifici atat pentru
ADN-ul provenit de la 13 tipuri HPV cu risc inalt, cat si pentru ADN-ul -globinei. Detectia
ampliconului este efectuata cu ajutorul unor sonde oligonucleotidice specifice care permit
identificarea separata a ampliconului HPV si a celui corespunzator -globinei.
Un rezultat negativ pentru o proba este validat numai daca se obtine un rezultat pozitiv
pentru ADN-ul -globinei.
Genotiparea HPV
In cazul acestui test amestecul de reactie contine primeri pentru amplificarea ADN a 37
genotipuri HPV precum si a genei -globinei. Pentru detectie si genotipare se utilizeaza un
ADN amplificat denaturat si stripuri care includ sonde oligonucleotidice dispuse liniar (sub
forma de benzi) care permit identificarea independenta a genotipurilor HPV individuale.